MX2007012570A - Terapia de anticuerpo anti-egfr basada en un numero de copia creciente del gen egfr en tejidos de tumor. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un diagnostico individualizado y personalizado y terapia de cancer basada en alteraciones moleculares especificas las cuales se presentan en el tejido de tumor especifico de poblaciones de pacientes de tumor especifico. La terapia y diagnostico se basan en los hallazgos de que la proliferacion y crecimiento de tumor de tejido de tumor que porta EGFR especifico que expresa un numero de copias del gen EGFR amplificado puede abolirse por los anticuerpos anti-EGFR, mientras que otras alteraciones moleculares individuales tales como mutaciones que se presentan en tejidos de tumor no son afectados por el mismo tratamiento del anticuerpo anti-EGFR.

Description

TERAPIA DE ANTICUERPO ANTI-?GFR BASADA EN UN NUMERO D? COPIA CRECIENTE DEL GEN EGFR EN TEJIDOS DE TUMOR CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al diagnóstico y terapia de tumores que expresan niveles más altos de receptor de factor de crecimiento epidermal (EGFR, por sus siglas en inglés) por medio de anticuerpos anti-EGFR. La invención se refiere además a un diagnóstico y terapia individualizada y personalizada de cáncer que expresa EGFR, basado en alteraciones moleculares específicas que se presentan en tejido de tumor específico de poblaciones de pacientes de tumor específico. La terapia y el diagnóstico se basan en los resultados que la proliferación y el crecimiento de tumor de tejido de tumor que porta EGFR específico exhibiendo un número de copia de gen EGFR amplificado se pueden suprimir por anticuerpos anti-EGFR, mientras otras alteraciones moleculares individuales se presentan en tejidos de tumor, tal como mutaciones de gen específico, no se afectan por el mismo tratamiento de anticuerpo anti-EGFR. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las moléculas biológicas, tal como anticuerpos monoclonales (MAbs) u otras proteínas/polipéptidos, así como compuestos químicos pequeños dirigidos contra diversos REF. :185785 receptores y otros antígenos en la superficie de células de tumor son conocidos por ser adecuados para terapia de tumor por más de veinte años. Con respecto al enfoque del anticuerpo, la mayoría de éstos MAbs se quimerizan o humanizan para mejorar la tolerabilidad con el sistema inmune humano. Los MAbs o entidades químicas anteriormente mencionadas enlazan específicamente a sus estructuras objetivo en células de tumor y en la mayoría de los casos también en tejidos normales y pueden causar efectos diferentes que dependen de su especificidad de epítopo y/o características funcionales del antígeno particular. Los receptores ErbB son tirosinas cinasas del receptor típico que se implicaron en cáncer en los 1980. Las tirosina cinasas son una clase de enzimas que catalizan la transferencia del fosfato terminal de adenosina trifosfato a residuos de tirosina en substratos de proteína. Las tirosinas cinasas se consideran, a modo de fosforilación de substrato, que juegan papeles críticos en la transducción de señal por un número de funciones celulares. Aunque los mecanismos exactos de transducción de señal siguen sin ser claros, las tirosina cinasas se han mostrado que son factores importantes que contribuyen en la proliferación celular, carcinogénesis y diferenciación celular. Las tirosina cinasas tipo receptor tienen una porción extracelular, una transmembrana, y una porción intracelular, mientras que las tirosina cinasas tipo no receptor son completamente intracelulares. Las tirosina cinasas ligadas al receptor son proteínas de transmembrana que contienen un dominio enlazado al ligando extracelular, una secuencia de transmembrana, y un dominio de tirosina cinasa citoplásmica. Las tirosinas cinasas tipo receptor están comprendidas de un gran número de receptores de transmembrana con actividad biológica diversa. Diferentes subfamilias de tirosina cinasas tipo receptor se han identificado. Las tirosina cinasas implicadas incluyen receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) , receptores del factor de crecimiento epidermal (EGF) de la familia de clase mayor ErbB, y receptores de factor de crecimiento derivados de la plaqueta (PDGF) . También están implicados receptores de factor de crecimiento de nervios (NGF) , receptores de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , y receptores de neurotrofina 3 (NT-3) , y receptores de neurotrofina 4 (NT-4) . El EGFR, codificado por el gen erbBl, se ha implicado casualmente en malignidades humanas. En particular, la expresión incrementada de EGFR se ha observado en cáncer de mama, vejiga, pulmón, cabeza, cuello y estómago así como glioblastomas. La expresión del receptor EGFR incrementada se asocia frecuentemente con la producción incrementada del ligando EGFR, factor alfa de crecimiento transformante (TGF-a) , por las mismas células de tumor que resultan en la activación del receptor por una trayectoria estimulante autocrina (Baselga and Mendelsohn, Pharmac . Then 64:127-154 (1994) ) . El receptor EGF es una glicoproteína de transmembrana que tiene un peso molecular de 170.000, y se encuentra en muchos tipos de células epiteliales. Este se activa por al menos tres ligandos, EGF, TGF-a (factor alfa de crecimiento transformante) y amfiregulina. Tanto el factor de crecimiento epidermal (EGF) como el factor alfa de crecimiento transformante (TGF-a) han demostrado que se enlazan al receptor EGF y para llevan a la proliferación celular y crecimiento de tumor. Se ha demostrado que los anticuerpos del receptor anti-EGF aunque bloquean EGF y TGF-a enlazados al receptor, parecen inhibir la proliferación celular de tumor. En vista de estos hallazgos, un número de anticuerpos monoclonales de murino y rata contra el receptor EGF se han desarrollado y probado para su capacidad de inhibir el crecimiento de células de tumor in vitro e in vivo (Modjtahedi and Dean, 1994, J. Oncology 4, 277). El anticuerpo 425 monoclonal humanizado (hMAb 425, matuzumab; US 5,558,864; EP 0531 472) y anticuerpo 225 monoclonal quimérico (cMAb 225) , ambos dirigidos al receptor EGF, han mostrado su eficacia en ensayos clínicos. El anticuerpo C225 (cetuximab) se demostró que inhibe el crecimiento de células de tumor mediado por EGF in vitro y que inhibe la formación de tumor humano in vivo en ratones atímicos sin pelo. El anticuerpo así como en general todos los anticuerpos anti-EGFR, parecen actuar, sobre todo, en sinergia con ciertos agentes quimioterapéuticos (esto es, doxorubicina, adriamicina, taxol, y cisplatina) para erradicar tumores humanos in vivo en modelos de ratón de xenoinjerto (ver, por ejemplo, EP 0667165). Ye et al. (1999, Oncogene 18, 731) han reportado que células de cáncer de ovario humano se pueden tratar exitosamente con una combinación de tanto mAb 225 quimérico como mAb 4D5 humanizado el cual se dirige al receptor HER2. También una combinación de matuzumab y cetuximab produce una respuesta anti-tumor sinérgica (WO 04/32960) . Otro anticuerpo anti-EGFR completamente humano es el panitumumab (mAb ABX) (por ejemplo, WO 98/50433, US 6,235,883) desarrollado por tecnología XenoMouse®. Los anticuerpos monoclonales (EGFR) del receptor de factor de crecimiento anti-epidermal , tales como el anticuerpo monoclonal quimérico c225 (cetuximab) y el anticuerpo panitumumab completamente humano han mostrado una actividad clínica notable en alrededor del 10% de pacientes con cáncer colorectal metastático resistente a la quimioterapia (mCRC) . Los mecanismos moleculares fundamentales de respuesta clínica o resistentes a estos agentes son actualmente desconocidos. El armamento terapéutico contra el cáncer colorectal metastático (mCRC) , la tercera causa más frecuente de las muertes por cáncer, se ha reforzado recientemente con anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos contra el dominio extracelular del receptor de factor de crecimiento epidermal (EGFR) (Erlichman and Sargent ; 2004, N Engl J Med 351; 303) . Entre los mAbs anti-EGFR, el anticuerpo quimérico cetuximab (Erbitux®) y el anticuerpo completamente humano panitumumab tienen cada uno actividad clínica importante demostrada en alrededor del 10% de pacientes con mCRC resistente a la quimioterapia, pero los mecanismos moleculares fundamentales con sensibilidad o resistencia clínica fundamental son actualmente desconocidos. Ni las características de diagnóstico ni el grado de expresión EGFR de tumor se evalúa por inmunohistoquímica, correlacionado con la respuesta clínica (Saltz et al, 2004, J Clin Oncol 22: 1201-1208; Cunningham et al, 2004, N Engl J Med 351: 337-345; Hecht et al, 2004, Journal of Clinical Oncology, ASCO Annual Meeting Proceedings, Post-Meeting Edition) . Entendiendo la base molecular de sensibilidad o resistencia clínica a moAbs anti-EGFR puede permitirse la identificación de pacientes quienes probablemente se beneficien del tratamiento con cetuximab o panitumumab. La biología del EGFR se ha estudiado en detalle usando enfoques tanto genéticos como bioquímicos (Ciardiello et al, 2003, Eur J Cáncer 39: 1348-1354; Holbro et al, 2004, Annu Rev Pharmacol Toxicol 44: 195-217). La etapa inicial de enlace de un ligando a la porción extracelular del receptor, promueve la dimerización y activación del receptor de su actividad enzimática, resultando así en la fosforilación del dominio intracelular. Posteriormente, los efectores celulares se enlazan a los residuos fosforilados del dominio intracelular y se vuelven activados, principalmente a través de su relocalización a la membrana de plasma. La proteína G pequeña Ras, la proteína cinasa Raf, y el lípido cinasa P13K juegan papeles centrales como los mediadores intracelulares de la señalización EGFR. Las alteraciones genéticas del EGFR y sus efectores se han encontrado previamente en una variedad de cánceres (Bardelli et al., 2003, Science 300: 949; Vogelstein et al., 2004, Nat Med 10: 789-799; Bardelli et al, 2005, Curr Opin Genet Dev 15: 5-12). Por lo tanto, la hipótesis puede llevar a que la respuesta clínica a ciertos anticuerpos anti-EGFR específicos tales como cetuximab, panitumumab o matuzumab se podría asociar a las alteraciones moleculares que afectan EGFR o sus transductores de señal intracelular inmediatos . En muchos cánceres, tal como mCRC ni las características diagnósticas del tumor ni el grado de expresión EGFR evaluado por inmunohistoquímica, se correlacionan con la respuesta clínica a antagonistas EGFR, especialmente anticuerpos antiEGFR, tales como cetuximab, matuzumab (hMab 425) o panitumumab. Actualmente, por lo tanto, la mayoría de los pacientes tratados se exponen al riesgo de terapia ineficaz con efectos colaterales indeseados. La eficacia del tratamiento de pacientes mCRC con mAbs anti-EGFR tales como cetuximab, matuzumab o panitumumab representan un progreso médico importante. Sin embargo, el tratamiento con mAbs antiEGFR resulta en respuestas objetivas solamente en una fracción de pacientes en los estudios clínicos que involucran pacientes quimiorefractarios, y no son herramientas de diagnóstico para identificar aquellos quienes probablemente se beneficien de esta terapia. Como un resultado, la mayoría de los pacientes tratados se exponen al riesgo de terapia ineficaz con efectos colaterales indeseados. Las terapias no personalizadas también resultan en enormes cargas financieras para los sistemas de salud. Por lo tanto, hay una necesidad de explicar la respuesta diferenciada en pacientes a anticuerpos monoclonales antiEGFR y para desarrollar una estrategia con objeto de identificar pacientes con cáncer tales como pacientes CRC que posiblemente se beneficien de la terapia de anticuerpo anti-EGFR. Los mecanismos moleculares fundamentales que responden o se refraccionan de las células de cáncer que expresan EGFR a mAbs anti-EGFR se desconocen. Por lo tanto, hay una necesidad adicional para proporcionar herramientas de diagnóstico que muestren si la respuesta a mAbs anti-EGFR en cáncer se correlaciona con predictores o marcadores biológicos que incluyen (i) mutaciones que afectan el dominio catalítico del gen EGFR, (ii) mutaciones que afectan los efectores de señalización en dirección descendente EGFR; o (iii) amplificación de la ubicación del gen EGFR. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se encontró ahora de conformidad con esta invención que el número de copia de gen EGFR exhibido por células de tumor en pacientes con tumor incluyendo pacientes quimiorefractarios se incrementa en alrededor del 89% de pacientes que producen una respuesta objetivo al tumor y en solamente alrededor de 5.0% de pacientes con enfermedad estable o progresiva. De tal modo, el estatus mutacional del dominio catalítico de EGFR y de sus efectores en dirección descendentes inmediatos PI3K, RAS, RAF no se correlaciona con la respuesta. De conformidad con la invención la misma concentración de anticuerpos anti-EGFR específicos, tales como cetuximab, matuzumab o panitumumab que deterioran completamente la proliferación de células que exhiben un número de copia de gen EGFR amplificado en modelos celulares de cánceres específicos, tales como cáncer colorectal, no afectan las células que no exhiben el número de copia EGFR amplificado. De conformidad con la invención, en pacientes que padecen de cánceres específicos, preferiblemente mCRC, la respuesta al tratamiento con anticuerpos anti-EGFR específicos, tipo panitumumab, cetuximab o matuzumab (o cualquier fragmento inmunológicamente efectivo o proteína de fusión del mismo) se puede asociar significativamente con la presencia de un número de copia amplificado del gen EGFR. En otras palabras: aquellos pacientes que responden o son sensibles al tratamiento anti-EGFR tienen un número de copia del gen EGFR incrementado como se compara con aquellos pacientes que no responden al tratamiento con el mismo anticuerpo en la misma dosis. Además, se puede observar que un aumento en el número de copia de gen EGFR se correlaciona con un encogimiento del tumor en pacientes y con una supervivencia prolongada por tratamiento con los mAbs. En estos pacientes, el crecimiento de tumor es posiblemente conducido predominantemente por la trayectoria EGFR. El número de copia de gen EGFR amplificado se puede medir de conformidad con la presente invención al determinar la relación de los genes EGFR por núcleos y/o la relación definida por el número de copias de gen EGFR y CEP7 (sonda de centrómero de cromosoma 7) . Se ha encontrado que, de conformidad con la invención, en sondas de tumor, en donde la relación: copias del gen EGFR / núcleo es > 4, preferiblemente en el rango entre 5.7 y 7.1, y/o las copias del gen EGFR / CEP7 > 2, la administración de un anticuerpo anti-EGFR a un paciente, de quien la sonda de tumor se deriva, es más efectiva que en pacientes que tienen relaciones de número de copia como se define más debajo de lo indicado. Los pacientes que tienen células de tumor que exhiben números de copia de gen EGFR no amplificado o solamente ligeramente amplificados (relaciones: 1 o < 2) no responden o no responden suficientemente a la terapia de anticuerpo anti-EGFR. Esta observación representa el primer paradigma para una terapia objetivo personalizada de cánceres específicos, tal como cáncer colorectal, con base en una alteración molecular específica. Con objeto de administrar los fármacos en un paciente más efectivamente, se proporciona ahora una herramienta para identificar aquellos pacientes la mayoría posiblemente para beneficiarse. Se encontró además que hay una mutación somática novedosa en el dominio catalítico EGFR y un número de mutaciones en sus efectores en dirección descendente inmediatos (tal como KRAS y PI3KCA) , estas alteraciones no se correlacionan con sensibilidad a mAbs anti-EGFR. Estos hallazgos tienen un número de implicaciones clínicas y biológicas. En cáncer que expresa y sobre-expresa EGFR la respuesta a mAbs anti-EGFR está probablemente menos asociada con mutaciones del gen EGFR pero al contrario con su número de copia incrementado/amplificado. Estos resultados sugieren que los tratamientos con base en anticuerpos anti-EGFR son posiblemente para trabajar más eficientemente contra objetivos que se amplifican en vez de afectarse por mutaciones en el punto. Sin embargo, las alteraciones genéticas tales como mutaciones en el punto puede contribuir a la efectividad y eficacia del tratamiento de anticuerpo anti-EGFR. Con respecto a CRC, en particular; la proliferación de células CRC con número de copia de gen EGFR amplificado se suprime por anticuerpos anti-EGFR, tal como cetuximab, mientras las células CRC con número de copia EGFR no amplificado no son afectados por la misma dosis del anticuerpo monoclonal anti-EGFR. Esto indica que las células de cáncer, especialmente células CRC, con genes EGFR amplificados son dependientes y aun adictas a esta alteración molecular para su proliferación. Los datos presentes también indican que la medida FISH (hibridación fluorescente in situ) del número de copia de gen EGFR podría representar una herramienta experimental para identificar pacientes con mCRC y otros cánceres quienes posiblemente respondan a mAbs direccionados anti-EGFR. Por otra parte, contrario a ensayos semi-cuantitativos tales como qPCR y Western blotting, en el caso de sobre-exprésion de proteína EGFR e incremento de número de copia de gen EGFR localizado en ubicaciones discretas dentro del mismo tumor (Figura 3), el análisis FISH no está influenciado por la presencia concomitante de células de tumor disómicas o contaminantes estromales normales. Así, un posible patrón no homogéneo de expresión EGFR se debe tomar en cuenta para explicar la carencia de correlación entre IHC y respuesta clínica a mAbs (Figura 3) . En otras palabras : de conformidad con la presente invención, se muestra además por primera vez que aquellos pacientes con cáncer, preferiblemente pacientes mCRC, que muestran una respuesta clínica a la administración de mAbs anti-EGFR tales como cetuximab, matuzumab o panitumumab, que se basa significativamente en un aumento en el número de copia de gen EGFR, se pueden seleccionar y evaluar al usar análisis FISH de muestras de tumor individuales de los pacientes. En otras palabras: los pacientes que son positivos para FISH tienen un número de copia de genes mayores que pacientes quienes son negativos para FISH. Así, se puede concluir que los pacientes que exhiben un número de copia EGFR incrementado como se analiza por FISH tienen una mejor predicción de supervivencia que aquellos pacientes que muestran un número de copia de gen inferior. Para resumir de una manera más general la invención se refiere a las siguientes materias objeto. * Un método para tratar tumores que expresan el receptor EGF (EGFR) en un paciente al administrarle al paciente un anticuerpo anti-EGFR en una cantidad que es suficiente para suprimir la proliferación de las células de tumor que tienen un número de copia de gen EGFR amplificado.

* Un método correspondiente, en donde el tratamiento es más efectivo comparado a un tratamiento con el mismo anticuerpo en la misma dosis aplicada a células de tumor que no presentan un número de copia de gen EGFR amplificado. * Un método correspondiente, en donde las células de tumor adicionalmente presentan alteraciones moleculares o mutaciones genéticas. * Un método correspondiente, en donde el número de copia de gen EGFR amplificado es específico para el tumor. * Un método correspondiente, en donde el número de copia de gen EGFR amplificado es específico para el perfil del tejido de cáncer individual del paciente. * Un método correspondiente, en donde el perfil del tejido de cáncer individual es la base de las alteraciones moleculares. * Un método correspondiente, en donde el tumor que expresa EGFR es cáncer colorectal (CRC) . * Un método correspondiente, en donde el cáncer colorectal es metastático (mCRC) . * Un método correspondiente, en donde el anticuerpo anti-EGFR se selecciona del grupo de Mab 225 y Mab 425 en sus versiones murina, quimérica y humanizada. * Un uso de un anticuerpo anti-EGFR para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cáncer, el cual se basa en células de tumor que expresan EGFR que tienen un número de copia de gen EGFR amplificado, en donde el tratamiento es más efectivo comparado con un tratamiento con el mismo anticuerpo en la misma dosis aplicada a células de tumor que no presentan un número de copia de gen EGFR amplificado. * Un uso correspondiente de un anticuerpo anti-EGFR, en donde las células de tumor adicionalmente presentan alteraciones moleculares o mutaciones genéticas * Un uso correspondiente, en donde el número de copia de gen EGFR amplificado es específico para el tumor. * Un uso correspondiente, en donde el número de copia de gen EGFR amplificado es específico para el perfil del tejido de cáncer individual del paciente. * Un uso correspondiente, en donde el perfil del tejido de cáncer individual es la base de la alteración molecular. * Un uso correspondiente, en donde el tumor que expresa EGFR es cáncer colorectal (CRC) . * Un uso correspondiente, en donde el cáncer colorectal es metastático (mCRC) . * Un uso correspondiente, en donde el anticuerpo antiEGFR se selecciona del grupo de Mab 225 y Mab 425 en sus versiones murina, quimérica y humanizada. * Un método para detectar y medir in vitro el número de copia de gen EGFR de tejido de tumor al usar hibridización fluorescente in situ (FISH) .

* Un uso de hibridización fluorescente in situ (FISH) para identificación in vitro de pacientes que tienen tumores que responden a anticuerpos anti-EGFR. * Un uso de hibridización fluorescente in situ (FISH) para identificación in vitro de pacientes que tienen tumores que presentan un aumento en el número de copia de gen EGFR * Un uso correspondiente, en donde el tumor es cáncer colorectal (CRC), preferiblemente CRC metastático. * Un uso correspondiente, en donde el anticuerpo es 225 o 424 en sus versiones murina, quimérica o humanizada. * Un método in vitro para detectar y analizar si un paciente que padece de un cáncer que sobre-expresa el receptor EGF (EGFR) , responde positivamente a la administración de un anticuerpo anti-EGFR o un fragmento inmunológicamente efectivo del mismo, el método comprende determinar in vitro el número de copia de gen EGFR en una sonda de células de tumor obtenidas del paciente y seleccionar el paciente para la administración con el anticuerpo anti-EFFR si las células de tumor del paciente exhiben un número de copia amplificado de gen EGFR. * Un método correspondiente, en donde el número de copia de gen EGFR se mide como relación al número de genes EGFR por núcleo. * Un método correspondiente, en donde la relación está en el rango entre 4.0 y 8.2.

* Un método correspondiente, en donde la relación está en el rango entre 5.7 y 7.1. * Un método correspondiente, en donde el número de copia de gen EGFR se mide como relación del número de genes EGFR por CEP7. * Un método correspondiente, en donde la relación es > 2. * Un método correspondiente, en donde el número de copia de gen EGFR se mide por análisis FISH (hibridización fluorescente in situ) . * Un método correspondiente, en donde el número de copia de gen EGFR amplificado es específico para el tumor. * Un método correspondiente, en donde el número de copia de gen EGFR amplificado es específico para el perfil del tejido de cáncer individual del paciente. * Un método correspondiente, en donde el perfil del tejido de cáncer individual es la base de la alteración molecular adicional. * Un método correspondiente, en donde la alteración molecular es una mutación del punto dentro del gen EGFR. * Un método correspondiente, en donde el anticuerpo anti-EGFR se selecciona del grupo que consiste de cetuximab (mAb c225) , matuzumab (mAb h425) y panitumumab (mAb ABX) o sus versiones murina, quimérica o humanizada particulares. * Un método correspondiente, en donde el cáncer es cáncer colorectal (CRC) , cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de mama. * El uso de un anticuerpo anti-EGFR, o un fragmento inmunológicamente efectivo del mismo, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cáncer en un paciente, en donde el cáncer sobre-expresa EGFR y exhibe un número de copia de gen EGFR amplificado. * Un uso correspondiente, en donde el número de copia de gen EGFR se mide como relación del número de genes EGFR por núcleo, y el valor de esta relación está en el rango entre 4.0 y 8.2. * Un uso correspondiente, en donde el valor de la relación es en el rango entre 5.7 y 7.1. * Un uso correspondiente, en donde el tratamiento del cáncer es más efectivo comparado con el tratamiento de un paciente con cáncer con el mismo anticuerpo en la misma dosis, en donde las células de cáncer no exhiben un número de copia EGFR amplificado. * Un uso correspondiente, en donde el número de copia de gen EGFR amplificado es específico para el tumor. * Un uso correspondiente, en donde el número de copia de gen EGFR amplificado es específico para el perfil del tejido de cáncer individual del paciente. * Un uso correspondiente, en donde el perfil del tejido de cáncer individual es la base de mutaciones genéticas. * Un uso correspondiente, en donde el tumor que expresa EGFR es cáncer colorectal (CRC) , cáncer de pulmón, cáncer de mama o cáncer de cabeza y cuello. * Un uso correspondiente, en donde el anticuerpo antiEGFR se selecciona del grupo que consiste de cetuximab (mAb c225) , matuzumab (mAb h425) y panitumumab (mAb ABX) , o sus versiones murina, quiméricas o humanizadas particulares. * Un método para detectar y medir in vitro el número de copias del gen EGFR del tejido de tumor, que sobre-expresa EGFR, por usar hibridización fluorescente in situ (FISH) en el ensayo para determinar la respuesta de un paciente con cáncer para la administración con un anticuerpo anti-EGFR.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras ÍA y IB- La mutación heterozigota en sentido erróneo en el exón 21 (G857R) encontrada en el tumor del paciente 13 (ver también Tabla 2) . La mutación afecta un residuo crítico localizado en el circuito de activación del dominio de cinasa EGFR. El G857R es un aminoácido separado de la mutación L858R recientemente descrita encontrada en las respuestas de gefitinib y eriotinib en cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (Lynch et al., 2004, N Engl J Med 350: 2129-2139.; Paez et al., 2004, Science 304: 1497-1500; Pao et al., 2004, Proc Nati Acad Sci USA 101: 13306-13311).

Una mutación que afecta el residuo análogo en el gen BRAF (G595R) se detectó previamente en el cáncer colorectal (CRC) (Wiley, Diaz, 2004, Jama 291: 2019-2020) . Figuras 2A-2D - Ensayos de hibridización in situ de fluorescencia de color doble para sondas del gen EGFR (rojo) y cromosoma 7 (CEP7; verde). (Fig.2A) Disomia de balance en la mucosa colorectal normal; (Fig.2B) Disomia de balance en el tumor del paciente 27; (Fig.2C) Polisomia de balance en el tumor del paciente 3; (Fig.2D) Amplificación en el tumor del paciente 5. Figuras 3A-3C - Amplificación EGFR y expresión de la proteína en el tumor del paciente 10. (Fig.3A) histología convencional por teñido de hematoxilina y eosina. (figuras 3B y 3C) Amplificación del gen EGFR y sobreexpresión de la proteína por inmunohistoquímica (Moroni et al., 2001, Clin Cáncer Res 7:2770-5) en áreas correspondientes del mismo tumor. Figuras 4A-4D - Alteraciones del gen EGFR moleculares y respuesta clínica observada en el paciente 1. (Fig.4A) Ensayos de hibridización in situ de fluorescencia de color doble para el gen EGFR y (rojo) y cromosoma 7 (CEP7; verde) las sondas muestran incremento en el número de copias; (Fig.4B) Cantidad relativa de las copias del gen EGFR medidas por el PCR cuantitativo en el tumor del paciente 1, línea celular de cáncer A431 (gen EGFR/núcleo 8.00; gen EGFR/CEP7 2.57) y RPE no maligno (gen EGFR/núcleo 1.60; gen EGFR/CEP7 0.86) controles celulares epiteliales; (Figuras 4C y 4D) Mediciones de la metástasis del hígado por CT antes de (diámetro más grande, L línea 4.4 cm) y después de (diámetro más grande, M línea 2.3 cm) tratamiento con moAb en el paciente 1. Figuras 5A-5D - Inhibición de la proliferación de línea celular de cáncer colorectal por cetuximab. (Fig.5A) Proliferación de líneas celulares de cáncer colorectal en tres experimentos separados (medio ± SD) en la presencia de concentraciones incrementadas de cetuximab. (Fig.5B) Niveles de la proteína EGFR medidos por Western blot en líneas celulares individuales. (Fig.5C) Número de copia del gen EGFR evaluado por FISH en líneas celulares de cáncer colorectal. (Fig.5D) Ensayos de hibridización in situ de fluorescencia de color doble para el gen EGFR (rojo) y cromosoma 7 (CEP7; verde) las sondas muestran número de copias incrementado en la línea celular DiFi.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El término "número de copia" se define usualmente como el número de genes por genoma. De conformidad con la invención el término "número de copia del gen EGFR" significa la relación del número de genes EGFR por núcleo. De conformidad con la invención este número varía desde 1.0 hasta 8.2 ó más preferiblemente desde 1.5 hasta 7.9. De conformidad con la invención el término "incrementado o amplificado número de copias del gen EGFR" significa que, en una perspectiva relativa, la relación definida arriba en las células de un tumor específico correlacionado a un paciente específico (quien responde al tratamiento del anticuerpo anti-EGFR) es mayor o se amplifica comparada a la relación particular en las células de un tumor específico correlacionado a otro paciente específico. En una perspectiva más absoluta, el término significa que la relación (número del gen EGFR/núcleo) está entre 4.0 y 8.2, ó 4.8 y 8.2, ó 4.8 y 7.9, ó 4.8 y 7.1, ó 4.8 y 6.8, ó 4.8 y 5.7. Preferiblemente la relación está entre 5.7 y 8.2 y más preferiblemente 5.7 y 6.8, y más preferiblemente entre 5.7 y 7.1.

De conformidad con estos valores mencionados arriba los valores aplicables a un número de copias del gen EGFR "incrementado o amplificado", los valores de relación para un número de copias relativamente disminuido o inferior o no amplificado presentes por células de tumor de pacientes, en los cuales no responde o no responde efectivamente o positivamente al tratamiento con anticuerpos anti-EGFR está en el rango desde 1.65 y 2.0, ó 1.7 y 1.9. El número de copias del gen EGFR o la relación: copias del gen EGFR/núcleo se asocian con la relación de copias del gen EGFR/sonda de centromero de cromosoma 7 (CEP7) . De conformidad con la invención esta relación gen EGFR/CEP7 está en pacientes que claramente responden al tratamiento del anticuerpo anti-EGFR > 2, mientras que la relación en los pacientes que no responden usualmente es de aproximadamente 1. "Mutación heterozigota en sentido erróneo" significa de conformidad con la invención una mutación que cambia un codón por un aminoácido en un codón que especifica otro aminoácido que se presenta en uno de los dos alelos de un gen. El término "eliminación en la estructura" significa de conformidad con la invención una mutación que cambia la estructura de lectura de un mARN por la eliminación de nucleótidos. "FISH (siglas en inglés de hibridación in situ de fluorescencia) significa de conformidad a la invención una hibridación del ADN clonado para cromosomas intactos, en donde el ADN clonado se etiqueta con un pigmento fluorescente. Este es un método general para asignar la ubicación cromosomal, número de copias del gen (tanto incrementado como disminuido) , o reconfiguraciones cromosomales . Los tumores de los pacientes (31) con mCRC que alcanzan una respuesta objetiva, enfermedad estable o enfermedad progresiva después del tratamiento con cetuximab o panitumumab se separan por exclusión para alteraciones genéticas en el gen EGFR o sus efectores intracelulares inmediatos. Específicamente, el número de copia del gen EGFR y el perfil mutacional del dominio catalítico EGFR puede determinarse así como los exones en los genes KRAS, BRAF, y PI3KCA donde las mutaciones se presentan más frecuentemente en mCRC.

Análisis mutacional del dominio de tirosina cinasa EGFR Para identificar la base molecular de la respuesta fundamental para matuzumab, panitumumab o cetuximab en mCRC, el estatus mutacional de la región se evalúa correspondiendo al dominio catalítico del gen EGFR en especímenes de tumor de pacientes con diversos efectos clínicos después del tratamiento con estos mA s. El procesado por secuencia de los exones EGFR 18, 19 y 21 no revela mutaciones somáticas con la excepción de un paciente con enfermedad estable durante 24 semanas (Tablas 1 y 2) . Este paciente exhibe una mutación heterozigota en sentido erróneo en el exón 21 (G857R) afectando un residuo localizado en el circuito de activación, una región que es crítica para catalizar (Figuras ÍA y IB) . La mutación G857R es un aminoácido apartado de la mutación activada L858R descrita recientemente encontrada en las respuestas de gefitinib y eriotinib en el cáncer de pulmón (Lynch et al, 2004; N Engl J Med 350: 2129-2139; Paez et al., 2004, Science 304: 1497-1500; Pao et al., 2004, Proc Nati Acad Sci USA 101: 13306-13311) . Interesantemente, una mutación que afecta el residuo análogo en el gen BRAF (G595R) se ha detectado previamente en cánceres colorectales (Figuras ÍA y IB) (Rajagopalan et al., 2002, Nature 418: 934). Con base en los hallazgos actuales, parece claro que la principal respuesta fundamental del mecanismo molecular a la terapia mAb no son mutaciones en el dominio catalítico EGFR. Por lo tanto, se considera que las alteraciones en el número de copias del gen EGFR puede ser responsable para la respuesta del anticuerpo observada. Análisis mutacional de los factores intracelulares EGFR Al menos tres moléculas intracelulares (KRAS, BRAF, y PI3KCA) involucradas en el señalamiento EGFR pueden activarse por mutaciones de punto en cánceres colorectales. De conformidad con esta invención se evalúa si el estatus mutacional de los genes correspondientes se correlaciona con la respuesta clínica a los anticuerpos anti-EGFR, tales como cetuximab, matuzumab o panitumumab. Para cada uno de estos tres genes, los exones se analizaron donde las mutaciones se presentan con las frecuencias más altas en los cánceres colorectales (KRAS exón 2, BRAF exón 15, PI3KCA exónes 9 y 20) . La secuencia de nucleótido correspondiente a cada exón puede amplificarse de ADN genómico extraído de tumor y directamente procesado en secuencia. No obstante que las mutaciones activadas pueden identificarse en el gen KRAS (G12V, G12D, G12S, y G13D) , gen PI3KCA (E545K, H 1047R) y BRAF (E599V) , no se correlacionan con la respuesta clínica a mAbs anti-EGFR (RAS exón-2: p=0.675; PI3K exÓn-9: p=0.3; PI3K exón-20: p=l; BRAF exón-15: p=l; todas estas mutaciones: p=0.44) (Tablas 1 y 2) . Análisis del número de copia del gen EGFR por análisis FISH Puede mostrarse que en mCRC no hay correlación entre los niveles de expresión de proteína EGFR medida por inmunohistoquímica (IHC) y respuesta clínica a mAbs anti-EGFR. Estos resultados, junto con la carencia de correlación con el estado mutacional del EGFR y sus efectos en dirección descendente, puede llevar a la hipótesis de que la respuesta a panitumumab, cetuximab o matuzumab puede asociarse con amplificación del gen EGFR. Como se detalla en la Tabla 2, y Figuras 2A-2B, entre 10 pacientes con respuestas objetivas 9 se evalúan por FISH y 8/9 (88.8%) muestran incremento en el número de copia del gen EGFR (relación media de gen EGFR/núcleo 6.80, rango 1.65-35) entre los 21 pacientes sin respuesta, 20 se evaluaron por FISH y 1/20 (5.0%) tiene incremento en el número de copia en el gen EGFR (relación media del gen EGFR/núcleo 1.925) y esta diferencia puede encontrarse estadísticamente importante. Entre los que responden, el incremento del número de copia en el gen EGFR puede asociarse con una relación de gen EGFR/CEP/ >2 en siete de los nueve pacientes evaluables por FISH, de esa manera indicando una amplificación del gen EGFR empleando el criterio utilizado para la evaluación HER2 (Wiley, Díaz, 2004, Jama 291:2019-2020). En los pacientes 3 y 9, una relación de gen EGFR/núcleo de 7.10 y 3.38 puede asociarse con una relación de gen EGFR/CEP7 de 1.46 y 1.19, respectivamente, de esta manera indicando la presencia de copias extras del cromosoma completo 7 (polisomia 7) (Figura 2C) . El tumor del paciente 10 muestra una amplificación sorprendente del gen EGFR que puede localizarse en ubicaciones discretas que otras áreas malignas son disómicas francamente. Notablemente, las áreas que exhiben amplificación del gen GEGFR también muestran expresión intensa de la proteína EGFR evaluado por IHC; en contraste, las áreas exhiben el gen EGFR disómico no expresan la proteína correspondiente (Figuras 3A-3C) . Análisis del número de copia del gen EGFR por PCR cuan ti ta tiva (PCRq) El número de copia del gen EGFR incrementado puede observarse en paciente con respuesta a cetuximab, matuzumab o panitumumab por FISH. Para obtener una medición independiente del estado de la ubicación del gen EGFR en especímenes con tumor, el análisis PCRq puede usarse. Un incremento en el número de copia del gen EGFR puede observarse en el paciente 1 con enfermedad que responde (Figuras 4A-4D) . La detección del número de copia del gen EGFR incrementado por PCRq en muestras de pacientes con una relación gen/cromosoma debajo de 3 no es conclusivo. Esto posiblemente se debe a los números del gen EGFR limitados que no pueden detectarse consistentemente con este método como se reporta previamente (Layfield et al., 2003, J Surg Oncol 83:227-231; Yang et al., 2004, Gut 53(1): 123-129). Adicionalmente, la detección de PCRq puede afectarse negativamente por la extracción concomitante de ADN contaminante estromal normal que puede solamente evitarse parcialmente durante la disección de muestras colocadas en parafina. Por otro lado, el análisis in situ del número de copia del gen tal como el que se obtiene por el análisis FISH no se afecta por estas limitaciones técnicas. Esta medición del número de copia del gen PCRq confirma la amplificación. Efectos de cetuximab en líneas celulares con copias de gen EGFR incrementadas o normales Los estudios previos usando modelos de cáncer celular sugieren que la respuesta para cetuximab puede asociarse con (i) sobreexpresión del receptor EGFR, (ii) fosforilación constitutiva del receptor, (iii) amplificación del .gen correspondiente, y (iv) alteración de otros miembros de la familia del gen. Los datos presentes muestran que panitumumab, matuzumab o cetuximab que responden en mCRC se correlacionan con el número de copia del gen incrementado de la ubicación EGFR. Esto impulsa a los inventores a evaluar el efecto de cetuximab en un panel de líneas de célula de cáncer colorectal que exhiben el número de copia del gen EGFR incrementado o normal como se mide por FISH (Figura 5) . La proliferación de célula medida por el ensayo de incorporación BrdU se evalúan en presencia de concentraciones cetuximab incrementadas. La proliferación de la línea de célula DiFi que porta las copias más altas del gen EGFR se inhiben dramáticamente por cetuximab y la concentración de cetuximab que imparte completamente la proliferación de células DiFi no afecta las células sin número de copia EGFR amplificado. De forma interesante, la línea de célula SW620 tiene 3 copias del gen EGFR y no expresa la proteína EGFR como se muestra por Western blot (Figuras 5A-5D) . Las células SW620 por lo tanto representan un agénico funcional del gen EGFR y en consecuencia su proliferación no se afecta virtualmente por cetuximab. El término "an tagonista/inhibidor del receptor ErbB" se refiere a una molécula biológicamente efectiva, que enlaza y bloquea o inhibe el receptor ErbB. De esta manera, al bloquear el receptor el antagonista previene el enlace del ligando ErbR (agonista) y la activación del complejo del receptor agonista/ligando. Los antagonistas ErbB puede dirigirse a HERÍ (ErbBl, EGFR), HER2 (ErbB2) y ErbB3 y ErbB4. Los antagonistas preferidos de la invención se dirigen al receptor EGF (EGFR, HERÍ) . El antagonista del receptor ErbB puede ser un anticuerpo, una proteína de fusión de anticuerpo (inmunoconjugado) o un fragmento inmunoterapéuticamente efectivo de un anticuerpo o una proteína de fusión de anticuerpo. Los antagonistas del receptor ErbB, los cuales se prefieren de acuerdo a la presente invención, son anticuerpos anti-EGFR, especialmente y preferiblemente los anticuerpos anti-EGFR mencionados arriba y a continuación: cetuximab, panitumumab y matuzumab en sus versiones murina, ciméricas o humanizadas incluyendo sus fragmentos inmunológicamente efectivos (Fab, Fv) e inmunoconjugados, especialmente inmunocitoquinas . El término ^an ticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para mutaciones posibles que se presentan naturalmente que pueden presentarse en cantidades menores . Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, se dirigen contra un sitio antigénico sencillo. Adicionalmente, en contraste con preparaciones de anticuerpo policlonal que incluye anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra una determinante sencilla en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos pueden sintetizarse sin contaminarse por otros anticuerpos. Los métodos para hacer anticuerpos monoclonales incluyen el método de hibridoma descrito por Kohier and Milstein (1975, Nature 256, 495) y en "Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" (1985, Burdon et al., Eds, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Ámsterdam) , o puede hacerse por métodos de ADN recombinante bien conocidos (ver, por ejemplo US 4,816,567). Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse de colecciones de anticuerpo de fago usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991), por ejemplo. El término ^an ti cuerpo quimérico" significa anticuerpos en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de especies particulares o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a una clase o subclase de otro anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, de manera que exhiben la actividad biológica deseada (por ejemplo: US 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nat. Acad. ScL USA, 81:6851-6855 (1984)). Los métodos para hacer anticuerpos quiméricos y humanizados también son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos para hacer anticuerpos quiméricos incluyen aquellos descritos en patentes por Boss (Celltech) y por Cabilly (Genentech) (US 4,816,397; US 4,816, 567). "Anticuerpos humanizados" son formas de anticuerpos quiméricos no humanos (por ejemplo, roedores) que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable (CDRs) del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo, o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para desempeñar el anticuerpo refinado adicional. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o substancialmente todos de los rizos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o substancialmente todos de los FRs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , típicamente que de una inmunoglobulina humana. Los métodos para hacer anticuerpos humanizados se describen, por ejemplo, por Winter (US 5,225,539) y Boss (Celltech, US 4,816,397) . "Fragmentos de anti cuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente que comprende el enlace al antígeno o región variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab' , F(ab')2, Fv y Fc, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. Un anticuerpo "intacto" es uno en el cual comprende una región variable enlazado al antígeno así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene uno o más funciones efectoras. La digestión de papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de enlace a antígeno idénticos, nombrados fragmentos "Fab", cada uno comprende un sitio de enlace a antígeno sencillo y una región CL y CH1, y un fragmento "Fc" residual, cuyos nombres reflejan su capacidad para cristalizarse fácilmente. La región "Fc" de los anticuerpos comprende, como una regla, un CH2, CH3 y la región de articulación de una clase mayor de anticuerpo IgGl o IgG2. La región de articulación es un grupo de alrededor de 15 residuos de aminoácido los cuales combinan la región CH1 con la región CH2-CH3. El fragmento "Fab" también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada y tiene solamente un sitio de enlace al antígeno. Los fragmentos "Fab'" difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos a la terminal carboxi del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo. Los fragmentos del anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' los cuales tienen cisteínas de articulación entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo también se conocen (ver, por ejemplo Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996; US 4,342,566). Los fragmentos de anticuerpo " Fv de cadena sencilla" o " scFv" comprenden la V, y dominios V de anticuerpo, en donde estos dominios se presentan en una cadena de polipéptido sencillo. Preferiblemente, los polipéptidos Fv comprenden además un ligador de polipéptido entre los dominios VH y VL los cuales facilitan los scFv para formar la estructura deseada para el enlace al antígeno. Los anticuerpos FV de cadena sencilla se conocen, por ejemplo de Plückthun (The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)), W093/16185; US 5,571 ,894; US 5,587,458; Huston et al. (1988, Proc. Nati. Acad. Sci. 85, 5879) o Skerra and Plueckthun (1988, Science 240, 1038) . Aunque la invención se refiere preferiblemente a cáncer de colon o colorectal (CRC) se aplica principalmente a otros cánceres y tumores, los cuales expresan o sobreexpresan EGFR y se presentan en pacientes con números de copia de gen EGFR y se tratan con otros antagonistas ErbB (por ejemplo, cáncer de pulmón tratado con IRESSA®: por ejemplo, Cáncer Biology 2005, 4) . Por ello, los términos " cáncer" y " tumor" se refiere a o describe la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento de célula no regulado. Por medio de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, los tumores pueden tratarse tales como tumores de mama, corazón, pulmón, intestino delgado, colon, bazo, riñon, vejiga, cabeza y cuello, ovario, próstata, cerebro, páncreas, piel, hueso, medula ósea, sangre, timo, útero, testículos, cérvico e hígado. Los tumores que pueden tratarse preferiblemente con las moléculas del anticuerpo de acuerdo a la invención son tumores sólidos o metástasis de tumor que expresan los receptores ErbB, especialmente receptores ErbBl (EGFR) , en cantidades altas, tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, SCLC, cáncer de páncreas . El término "biológicamente/ funcionalmente efectivo" o " ( cantidad) terapéuticamente efectiva" se refiere a un fármaco/molécula que provoca una función biológica o un cambio de una función biológica in vivo o in vitro, y el cual es efectivo en una cantidad específica para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero, preferiblemente en un humano. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir el número de células de cáncer; reducir el tamaño del tumor; inhibir (esto es, retardar en alguna extensión y preferiblemente detener) la infiltración de célula de cáncer en órganos periféricos; inhibir (esto es, retardar en alguna extensión y preferiblemente detener) la metástasis del tumor; inhibir, en alguna extensión, crecimiento del tumor; y/o aliviar en alguna extensión uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. El término " inmuno terapéu ti camen te efectiva" se refiere a moléculas biológicas las cuales provocan una respuesta inmune en un mamífero. Más especialmente, el término se refiere a moléculas las cuales pueden reconocer y enlazar un antígeno. Típicamente, los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y proteínas de fusión de anticuerpo que comprenden sus sitios de enlace al antígeno (regiones determinantes complementarias, CDRs) son inmunoterapéuticamente efectivas . Típicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-EGFR o un fragmento del mismo es una cantidad de tal manera que, cuando se administran en composición fisiológicamente tolerable, es suficiente para alcanzar una concentración de plasma desde alrededor de 0.01 microgramo (µg) por mililitro (ml) hasta alrededor de 100 µg/ml, preferiblemente desde alrededor de 1 µg/ml hasta alrededor de 5 µg/ml y usualmente alrededor de 5 µg/ml. Establecido de manera diferente, la dosis puede variar desde alrededor de 0.1 mg/kg hasta alrededor de 300 mg/kg, preferiblemente desde alrededor de 0.2 mg/kg hasta alrededor de 200 mg/kg, más preferiblemente desde alrededor de 0.5 mg/kg hasta alrededor de 20 mg/kg, en uno o más administraciones de dosis diariamente durante uno o varios días. Una concentración de plasma preferida en molaridad es desde alrededor de 2 micromolares (µM) hasta alrededor de 5 millimolares (mM) y preferiblemente, alrededor de 100 µM hasta 1 mM de antagonista del anticuerpo. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender frases que abarcan el tratamiento de un sujeto con agentes que reducen o evitan los efectos colaterales asociados con la terapia de combinación de la presente invención ("terapia adjunta"), incluyendo, pero no se limita a, aquellos agentes, por ejemplo, que reducen el efecto tóxico de fármacos anticáncer, por ejemplo, inhibidores de la resorción del hueso, agentes cardioprotegidos . Los agentes adjuntos previenen o reducen la incidencia de nauseas y vómito asociado con quimioterapia, radioterapia u operación, o reduce la incidencia de infección asociada con la administración de fármacos anticáncer mielosupresivos . Los agentes adjuntos son bien conocidos en la técnica. Los agentes inmunoterapéuticos de acuerdo con la invención pueden administrarse adicionalmente con adjuvantes tipo BCG y estimuladores del sistema inmune. Adicionalmente, las composiciones pueden incluir agentes inmunoterapéuticos o agentes quimioterapéuticos incluyendo tales, los cuales contienen isótopos radio-etiquetados efectivos citotóxicos, u otros agentes citotóxicos, tales como péptidos citotóxicos (por ejemplo, citoquinas) o fármacos citotóxicos y los similares . Otras características y ventajas de la presente invención se volverán aparentes de los siguientes Ejemplos más detallados, los cuales ilustran, a manera de ejemplo, los principios de la invención. Especialmente, los valores específicos o términos indicados arriba y a continuación, no limitan la invención y pueden extrapolarse si un trabajador experimentado ve razón para ello.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Pacientes y tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-EGFR. Entre los pacientes enrolados en el Hospédale Niguarda Ca' Granda en ensayos clínicos de moAbs anti-EGFR panitumumab o cetuximab para el tratamiento de mCRC que expresan EGFR, se evaluaron 31 pacientes con sensibilidad de tumor radiológicamente demostrada o resistencia a esta terapia (Tabla 1) . Los pacientes se seleccionan con base en la disponibilidad de tejido de tumor suficiente para los estudios presentes. Todos los pacientes tienen mCRC que expresa EGFR, exhiben 1% de células malignas teñidas para EGFR evaluadas por IHC usando el kit DAKO EGFRPharmDX en laboratorios centrales de cada protocolo clínico (Cunningham et al., 2004, N Engl J Med 351: 337-345). El Cetuximab (IgGl moAb quimérico; Erbitux®, Merck, Milán, Italia) y panitumumab (IgG2 moAb completamente humano; Amgen, Thousand Oaks, CA, USA) direccionan ambos el dominio enlazado al ligando del EGFR. Sus actividades clínicas se espera que sean comparables excepto para la incidencia reducida de reacciones de infusión apreciadas con la panitumumab completamente humana, y de esta manera los pacientes tratados con cualquier moAb se analizan juntos en este estudio. El tratamiento con moAbs anti-EGFR consiste de monoterapia de cetuximab (n=12) , cetuximab más irinotecano (Camptó®; Aventis, Milán, Italia) con base en la quimioterapia (n=9) , o monoterapia de panitumumab (n=10) . En particular, el agente sencillo cetuximab (400 mg/m2 iv dosis cargada y luego 250 mg/m2 semanalmente hasta el progreso) se dio ya sea como terapia de primera línea en ensayo de fase II EMR 202-600 o como tercera línea en la extremidad de la monoterapia del ensayo de fase II BOND para pacientes refractarios de irinotecano. Cetuximab (misma dosis y programa como en monoterapia) más irinotecano (mismas dosis y programas para los cuales mCRC demuestra individualmente ser resistente) se dieron hasta el progreso como terapia de tercera línea en la extremidad de combinación de ensayo BOND y en ensayo de fase II MABEL para pacientes refractarios de irinotecano. En los últimos protocolos, la refracción a irinotecano se definió como el progreso de enfermedad documentado durante o dentro de 3 meses después del régimen de irinotecano. El agente sencillo panitumumab (6 mg/kg iv cada 2 semanas hasta el progreso) se dio como terapia de tercera línea o cuarta línea para pacientes que resisten tanto a los regímenes que contienen oxaliplatina como irinotecano en los ensayos ABX-EGF 20020408 y fase III y ABX-EGF 20020194 cruzado. El Institutional Ethics Committee aprueba los protocolos de tratamiento, y los pacientes dan consentimiento informado por escrito para el análisis de EGFR así como recibir terapia de estudio. La respuesta del tumor se evalúa con técnicas formadoras de imágenes consistentes (CT o MRI) empleando criterio RECIST (Criterio de evaluación de respuesta en tumores sólidos) por el instituto así como radiólogos independientes de acuerdo a protocolos clínicos. Ejemplo 2 : Análisis mutacional El ADN se extrae de muestras colocadas en parafina. Para cada paciente, se prepararon secciones de 10. Una sección representativa adicional se retiró de la parafina, se tiñó con eosina hematoxilina y se analizan para morfología detallada. Las regiones que exhiben tejidos de tumor se marcaron y el tejido se extrajo con NaOH 0.2M/EDTA lmM y luego se neutraliza con 100 mM Tris-TE. Después de la extracción, el ADN se purificó usando un kit de purificación Qiagen PCR (Cat. No. 28104) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los cebadores de exón específico y de procesado por secuencia se diseñaron usando el software Primer3 (http: //frodo. wi . mit . edu/cgi-bin/primer3/primer3 www. cgi) y se sintetizan por Invitrogen™. Las secuencias de cebador fueron: cebadores delantero, inversos y de secuencia para cada exón fueron como sigue: EGFR-Exl8 GCTGAGGTGACCCTTGTCTC; ACAGCTTGCAAGGACTCTGG; TGGAGCCTCTTACACCCAGT; ?GFR-Exl9 CCCAGTGTCCCTCACCTTC; CCACACAGCAAAGCAGAAAC; GCTGGTAACATCCACCCAGA; ?GFR-Ex21 TGATCTGTCCCTCACAGCAG; TCAGGAAAATGCTGGCTGAC; TTCAGGGCATGAACTACTTGG; PI3K CA-Ex9 GGGAAAAATATGACAAAGAAAGC; CTGAGATCAGCCAAATTCAGTT; TAGCTAGAGACAATGAATTAAGGGAA ; PI3K CA-Ex20 CTCAATGATGCTTGGCTCTG; TGGAATCCAGAGTGAGCTTTC ; TTGATGACATTGCATACATTCG Ras ex2 GGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACC; AGAATGGTCCTGCACCAGTAA; TCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTG . Las condiciones para amplificar las regiones específicas de exón por PCR de ADN genómico de tumor y para identificar las mutaciones se han descrito previamente (Bardelli et al., 2003, Science 300: 949) . El PCR se llevó a cabo en un volumen de 20 µL usando un programa PCR de toque como se describe previamente (Pao et al., 2004, Proc Nati Acad Sci USA 101:13306-13311). Los productos PCR purificados se procesaron por secuencia usando kit de secuencia de ciclo BigDye® terminator v3.1 (Applied Biosystems) y se analiza con un sistema de electroforesis capilar 3730 ABI . El análisis mutacional se llevó a cabo como se describe previamente. El tejido del tumor del paciente 13 se limitó en cantidad y el análisis mutacional no fue posible técnicamente para todos los exones . Ejemplo 3 : Análisis del gen EGFR por hibridización in situ fluorescente (FISH) Las secciones de tejido se trataron siguiendo el procedimiento usado para el kit de detección Her2 FISH (Dakocytomation, Glostrup, DK) . Las muestras se colocaron en una solución de pretatamiento durante 30 min a 96°C y luego se digieren con solución de pepsina durante 30 min a temperatura ambiente. Los ensayos FISH de objetivo doble, de color dual se llevaron a cabo usando solución de sonda verde de espectro CEP7/anaranjada de espectro LSI EGFR, se incubaron a 75°C durante 5 min hasta co-desnaturalizar las sondas EGFR y CEP 7 y se permiten hibridizar durante la noche a 37°C. Tanto la co-desnaturalización como la hibridización se llevaron a cabo secuencialmente en un sistema controlado por microprocesador (Hybridizer, Dakocytomation, Glostrup, DK) . El lavado de severidad posterior a la hibridización se llevó a cabo en baño de agua a 65°C durante 10 min. Después de lavar dos veces y secado a temperatura ambiente durante 15 min, las secciones de tejidos se cubrieron con 4 ' 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI II, Vysis) para contrateñido por cromatina y examinado por microscopio. El análisis se llevó a cabo con microscopio de fluorescencia (Zeiss Axioskop, Gottingen, Alemania) equipado con la estación de trabajo Chromowin (Amplimedical, Milán, Italia) . El gen EGFR se visualizó como una señal roja con un filtro de isotiocianato de tetrametil-rodamina (TRITC) , la secuencia -centromérica del cromosoma 7 (CEP7) como señal verde con un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y el núcleo como una señal azul con un filtro DAPI . Las imágenes representativas de cada espécimen se adquirieron con una cámara CCD congelada Hamamatsu C5895 (Upstate Technical Equipment Co., Nueva York, EUA) en capas monocromáticas que se combinaron posteriormente por el software Casti Imaging FISH Multicolor (Amplimedical) . Dos observadores independientes (SMV y RB) registran al menos 200 núcleos de interfase no traslapados usando líneas guía de registro predefinidas. Las características clínicas de los pacientes se les ocultó a los observadores y cada otra evaluación y registro de los especímenes. En cada núcleo, el número de copias de EGFR y sondas de cromosoma 7 se evaluaron independientemente. El estado del gen EGFR se registró como relaciones EGFR/núcleo y EGFR/CEP7. Los controles normales consisten de línea de célula epitelial de pigmento de retina cultivado (RPE) y mucosa colorectal normal contigua a las malignidades individuales. El control de gen EGFR amplificado consiste de línea de célula de carcinoma epidermoide humano A431. El número de copia del gen EGFR se definió arbitrariamente como el número de copia del gen EGFR/núcleo >3. Los especímenes de los pacientes 4 y 15 estuvieron disponibles solamente como secciones lOµ y a pesar de múltiples intentos, el análisis FISH no fue conclusivo debido al espesor del tejido excesivo. Ejemplo : Análisis del gen EGFR por reacción de cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR) El número de copias correspondientes a la ubicación EGFR se determinó por PCR de tiempo real usando un aparato ABI PRISM® 7900HT (Applied Biosytems) . El contenido de ADN se normalizó a la línea 1, un elemento repetitivo para el cual los números de copias por genoma diploide son similares entre todas las células humanas (normales o malignas) como se describe previamente (Wang et al., 2002, Proc Nati Acad Sci USA 99: 16156-16161) . Los cambios del número de copia se calcularon al usar la fórmula 2<D " Dünßi- (Nt-Niine) donde Dt es el numero de ciclo de umbral promedio observado por el cebador experimental en ADN extraído de células de tumor, y un cebador experimental Dline es el número de ciclo de umbral promedio observado para el cebador de línea 1 en ADN extraído de célula de tumor y Nt es el número de ciclo de umbral observado por el ADN de referencia normal extraído de células RPE, Nline es el número de ciclo de umbral observado para un cebador de línea 1 en el ADN de referencia normal extraído de células RPE. Las condiciones para la amplificación fueron como sigue: un ciclo de 95°C durante 10 min, seguido por 45 ciclos de 95°C durante 15 seg, 60°C durante 1 min. Los números de ciclo de umbral se obtuvieron al usar el software ABI PRISM® 7900HT Sequence Detection System. Los PCRs para cada conjunto de cebador se realizaron en triplicado y los números de ciclo de umbral se promediaron. Los cebadores (diseñados para abarcar una región no repetitiva de 100 hasta 200 bp) para el gen EGFR fueron: delantero GAATTCGGATGCAGAGCTTC e inverso GACATGCTGCGGTGTTTTC . Los cebadores para el elemento repetitivo de línea 1 fueron: delantero AAAGCCGCTCAACTACATGG e inverso TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG . Ejemplo 5 : Ensayo de inhibición de proliferación de célula y Western blotting Las líneas de célula de cáncer colorectal (células HT-29, HCT-116, DLD-1, SW48, SW480, y LoVo) fueron del depositario ATCC; las células DiFi fueron un regalo de José Baselga, Valí d'Hebron University, Barcelona, E) . Las células se hicieron crecer en DMEM complementado con suero de becerro fetal (FCS) al 10% y antibióticos, excepto para células DiFi las cuales se hicieron crecer en medio F-12 complementado con FCS al 10% y antibióticos. Para el ensayo de inhibición de proliferación de célula, las células se hicieron crecer en DMEM complementado con 2% de FBS en placas negras de 96 pozos (Culture Píate™ 96F Packard Bioscience) y se incuban durante 5 días con 0.01-100 nM de cetuximab (adquirido de Ko tur Pharmaceuticals, Freiburg, D) . La proliferación de célula se midió por la incorporación de BrdU usando un método ELISA quimioluminescente (Roche Cat. No. 1 669 915) . La densidad de sembrado celular por pozo fue como sigue: DiFi, 4000; LoVo, 4000; DLD , 500; HCT116, 1000; HT29, 1000; SW480, 1000; SW387, 4000; SW48, 500; SW620, 500. El ensayo BrdU se llevó a cabo de acuerdo a las instrucciones del fabricante y se finaliza 20 hrs después de la adición de la solución etiquetada. Tres experimentos separados en triplicado se establecen para cada línea de célula. El porcentaje de la proliferación de célula a cada concentración de cetuximab (prueba) se calculó usando la siguiente fórmula: (prueba-blanco) / (Control-blanco) x 100, donde el control indica el crecimiento de las células en medio solamente (sin fármaco) y blanco indica el crecimiento de células en 0.02% Tritón X en DMEM. El Western blotting se llevó a cabo como se describe previamente (Lynch and Yang, 2002, Semin Oncol 29: 47-50) .

Tabla 1 - Características clínicas relevantes y alteraciones moleculares en el gen EGFR en tumores de pacientes con mCRC Quimioterapia (CT) consiste de tratamiento basado en irinotecano (ver texto para detalles) ; b número de copia de gen EGFR incrementado consiste de polisomia de balance en el caso 3 y 9 y amplificación del gen en los otros (ver resultados); c intentos múltiples FISH fueron inconclusos por razones técnicas (ver métodos) . Hibridación in situ fluorescentes FISH; PR, respuesta parcial; SD, enfermedad estable; PD, enfermedad progresiva; UPN, número de paciente único; WT, tipo silvestre; + significa respuesta mantenida en el tiempo que se somete a este artículo (Febrero 2005) . El estado mutacional del gen EGFR, exónes 18, 19 y 21.

Tabla Ib - Características clínicas adicionales de paciente con mCRC evaluado en este estudio.

No: Número de regímenes de quimioterapia previos a la enfermedad metastática a Estado de desempeño (ECOG) al tiempo de terapia anticuerpo monoclonal anti-EGFR inicial, b regímenes de quimioterapia que consisten de 5-FU/FA: 5-fluoroacilo + ácido folínico (programas variados) ; FOLFOX: Oxaliplatina + 5-fluorouracilo + ácido folínico; FOLFIRI: Irinotecano + 5-fluorouracilo + ácido folínico. Tabla 2 - Alteraciones moleculares encontradas en tumores de pacientes con mCRC a Las mediciones de los análisis FISH y mutacional fueron inconclusas por razones técnicas (ver métodos) ; WT, tipo silvestre; PR, respuesta parcial; SD, enfermedad estable; PD, enfermedad progresiva; UPN, número de paciente único; n.e., no evaluable. °° Número de copia del gen EGFR incrementado se demostró tanto en tumor colorectal primario previo al tratamiento moAb como en metástasis en el hígado obtenido en el tiempo de enfermedad progresiva después del tratamiento moAb. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método in vitro para detectar y analizar si un paciente padece de cáncer, que sobreexpresa el receptor EGF (EGFR) , responde positivamente a la administración de un anticuerpo anti-EGFR o un fragmento inmunológicamente efectivo del mismo, caracterizado porque comprende la determinación in vitro del número de copia del gen EGFR en una sonda de células de tumor obtenidas del paciente y seleccionadas del paciente para administración con el anticuerpo anti-EFFR si las células de tumor del paciente despliegan un número de copia amplificado del gen EGFR.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el número de copia del gen EGFR se mide como la relación del número de genes EGFR por núcleo.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la relación está en el rango entre 4.0 y 8.2.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque la relación está en el rango entre 5.7 y 7.1.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el número de copia del gen EGFR se mide como la relación del número de genes EGFR por CEP7.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la relación es > 2.
7. 7. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el número de copia del gen EGFR se mide por análisis FISH (hibridación in situ fluorescente) .
8. 8. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el número de copia del gen EGFR amplificado es específico para el tumor.
9. 9. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el número de copia del gen EGFR amplificado es específico para el perfil de tejido de cáncer individual del paciente.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el perfil del tejido de cáncer individual subyace además alteración molecular.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la alteración molecular es una mutación de punto dentro del gen EGFR.
12. 12. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque el anticuerpo anti-EGFR se selecciona del grupo que consiste de cetuximab (mAb c225) , matuzumab (mAb h425) y panitumumab (mAb ABX) o sus versiones de murina, quimérica o humanizada particular.
13. 13. El método de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones 1-12, caracterizado porque el cáncer es cáncer colorectal (CRC) , cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de mama.
14. 14. El uso de un anticuerpo anti-EGFR, o un fragmento inmunologícamente efectivo del mismo, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cáncer en un paciente, en donde el cáncer sobreexpresa EGFR y exhibe un número de copia del gen EGFR amplificado.
15. 15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, en donde el número de copia del gen EGFR se mide como la relación del número de genes EGFR por núcleo, y el valor de esta relación está en el rango entre 4.0 y 8.2.
16. 16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde el valor de la relación está en el rango entre 5.7 y 7.1.
17. 17. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 14-16, en donde el tratamiento del cáncer es más efectivo comparado con el tratamiento de un paciente con cáncer con el mismo anticuerpo en la misma dosis, en donde las células de cáncer no exhiben un número de copia EGFR amplificado .
18. 18. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 14-17, en donde el número de copia del gen EGFR amplificado es específico para el tumor.
19. 19. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 14-18, en donde el número de copia del gen EGFR amplificado es específico para el perfil de tejido de cáncer individual del paciente.
20. 20. El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde el perfil de tejido de cáncer individual subyace las mutaciones genéticas.
21. 21. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 14-20, en donde el tumor que expresa EGFR es cáncer colorectal (CRC) , cáncer de pulmón, cáncer de mama y cáncer de cabeza y cuello.
22. 22. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 14-21, en donde el anticuerpo anti-EGFR se selecciona del grupo que consiste de cetuximab (mAb c225) , matuzumab (mAb h425) y panitumumab (mAb ABX) , o sus versiones murina, quimérica o humanizada particular.
23. 23. Un método para detectar y medir in vitro el número de copia del gen EGFR del tejido de tumor, que sobreexpresa EGFR, caracterizado porque se usa hibridación in situ fluorescente (FISH) en un ensayo para determinar la respuesta de un paciente con cáncer para la administración con un anticuerpo anti-EGFR.