MX2007009963A

MX2007009963A - Mutaciones del receptor del factor de crecimiento epidermico.

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Publication number: MX2007009963A
Application number: MX2007009963A
Authority: MX
Inventors: Todd Juan; Daniel Freeman; Robert Radinsky
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2005-02-24
Filing date: 2006-02-23
Publication date: 2007-09-26
Also published as: US20070048754A1; CN101208354A; BRPI0607235A2; EA200701804A1; AU2010241462A1; EA013617B1; CA2601936A1; JP2008535477A; US8546107B2; IL185210A0; KR20070106029A; ZA200707379B; US20120328620A1; WO2006091899A3; CA2601936C; WO2006091899A2; JP2012149070A; NO20074826L; CR9390A; EP1851243A2

Abstract

Se describen mutaciones del factor de crecimiento epidermico (EGFr), de la fosfatidilinositol 3'-cinasa ("PI3K"), y de B-Raf. Se describen metodos para el tratamiento de tumores que contienen el EGFr mutado con anticuerpos humanos monoclonales contra EGFr. Tambien se describen metodos y kits para determinar la presencia de uno o mas EGFr mutantes, PI3K mutantes, y/o B-Raf mutantes en una muestra y para el tratamiento de trastornos o condiciones relacionados con la presencia de EGFr mutante, PI3K mutante, y/o B-Raf mutante. Tambien se describen metodos para el tratamiento de tumores que contienen EGFr mutantes, PI3K mutantes, y/o B-Raf mutantes.

Description

MUTACIONES DEL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente solicitud se refiere a mutaciones del receptor del factor de crecimiento epidérmico ("EGFr", por sus siglas en inglés) , para polinucleótidos qµe codifican los polipéptidos EGFr mutantes, para vectores que contienen estos polinucleótidos, células que expresan estos polinucleótidos, y anticuerpos que enlazan a estos polipéptidos. La presente solicitud también se refiere a mutaciones de fosfatidilinositol 3 '-cinasa ("PI3K"), para polinucleótidos que codifican polipéptidos PI3K mutantes, para vectores que contienen estos polinucleótidos, células que expresan estos polinucleótidos, y anticuerpos que enlazan a estos polipéptidos. La presente solicitud también se refiere a Mutaciones B-Raf, para polinucleótidos que codifican los polipéptidos B-Raf mutantes, para vectores que contienen estos polinucleótidos, células que expresan estos polinucleótidos, y anticuerpos que enlazan a estos polipéptidos. La presente solicitud también se refiere a métodos para diagnosticar cáncer; métodos para tratar cáncer usando compuestos reactivos con polipéptidos EGFr mutantes, polipéptidos PI3K mutantes, o polipéptidos B-Raf mutantes; y métodos y kits para predecir la utilidad de agentes de enlace específicos anti-EGFr, agentes de enlace específicos anti-PI3K, o agentes de enlace específicos anti-B-Raf en el tratamiento de tumores. REF. : 185387 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Ciertas aplicaciones de los anticuerpos monoclonales en la terapia de cáncer dependen de la habilidad del anticuerpo para suministrar específicamente a los tejidos cancerosos funciones efectoras citotóxicas tales como isotipos que aumentan lo inmune, toxinas o fármacos. Un enfoque alternatural es utilizar los anticuerpos monoclonales para afectar directamente al sobreviviente de las células de tumor por despojar las señales de proliferación extracelulares esenciales, tales como aquellas mediadas por los factores de crecimiento a través de sus receptores celulares. Uno de los agentes atractivos en este enfoque es el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFr) , el cual enlaza a EGF y al factor de crecimiento transformador a (TGFa) (ver, por ejemplo, Ullrich et al., Cell 61: 203-212, 1990; Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., in Biologic Therapy of Cáncer 607-623, Philadelphia: J. B. Lippincott Co . , 1995; Fan et al., Curr. Opin. Oncol. 10: 67-73, 1998). El enlace de EGF o TGFa a EGFr, una glicoproteína de superficie de células de transmembrana de 170 kDa, desencadena una cascada de eventos de bioquímica celular, que incluyen autofosforilación EGFr e internalización, la cual culmina en la proliferación celular (ver, por ejemplo, Ullrich et al., Cell 61:203-212, 1990) . Diversas observaciones implican EGFr en soportar el desarrollo y progresión de tumores sólidos humanos. El EGF-r demuestra la sobre expresión en muchos tipos de tumores sólidos humanos (ver, por ejemplo, Mendelsohn Cáncer Cells 7:359 (1989), Mendelsohn Cáncer Biology 1:339-344 (1990), Modjtahedi and Dean Int ' 1 J. Oncology 4:277-296 (1994)). Por ejemplo, la sobre-expresión de EGF-r se observó en ciertos carcinomas de pulmón, mama, colón, gástrico, vejiga, cabeza y cuello, ovarios y próstata (ver, por ejemplo, Modjtahedi and Dean Int ' 1 J. Oncology 4:277- 296 (1994)). El incremento en los niveles receptores se reporta asociado con una prognosis clínica pobre (ver, por ejemplo, Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., Biologic Therapy of Cáncer pp . 607-623, Philadelphia: J. B. Lippincott Co . , 1995; Modjtahedi et al., Intl. J. of Oncology 4:277-296, 1994; Gullick, Br . Medical Bulletin, 47:87-98, 1991; Salomón et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 19: 183-232, 1995). Tanto el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor alfa de crecimiento transformador (TGF-a) demuestran que se enlazan a EGF-r y cargan a la proliferación celular y crecimiento de tumor. En muchos casos, la expresión de EGFr de la superficie incrementada se acompaña por la producción de TGFa o EGF por células de tumor, se sugiere el involucramiento de un control de crecimiento autocrino en la progresión de estos tumores (ver, por ejemplo, Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., Biologic Therapy of Cáncer pp. 607-623, Philadelphia: J. B. Lippincott Co., 1995; Modjtahedi et al., Intl. J. of Oncology 4:277-296, 1994; Salomón et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 19: 183-232, 1995). Así, ciertos grupos proponen que anticuerpos contra EGF, TGF-a, y EGF-r pueden ser útiles en la terapia de tumores que expresan o sobreexpresan EGF-r (ver, por ejemplo, Mendelsohn Cáncer Cells 7:359 (1989), Mendelsohn Cáncer Biology 1: 339-344 (1990), Modjtahedi and Dean Int ' 1 J. Oncology 4:277-296 (1994), TOSÍ et al. Int ' 1 J. Cáncer 62:643-650 (1995)). Efectivamente, sea demostrado que los anticuerpos anti-EGF-r bloquean el enlace EGF y TGF-a al receptor que aparece para inhibir la proliferación células de tumor. Al mismo tiempo sin embargo, los anticuerpos anti-EGF-r no parecen inhibir el crecimiento células independientes de EGF y TGF-a (Modjtahedi and Dean Int ' 1 J. Oncology 4:277-296 (1994)). Los anticuerpos monoclonales específicos para el EGFr humano, capaces de neutralizar el enlace de EGF y TGFa a células de tumor y de inhibir la proliferación de células mediadas por el ligando in vitro, se han generado de los anticuerpos monoclonales de ratones y ratas (ver, por ejemplo, Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., in Biologic Therapy of Cáncer 607-623, Philadelphia: J. B. Lippincott Co . , 1995; Fan et al., Curr.

Opin. Oncol. 10: 67-73, 1998; Modjtahedi et al., Intl. J. Oncology 4: 277-296, 1994). Algunos de estos anticuerpos, tales como el ratón 108, 225 (ver, por ejemplo, Aboud-Pirak et al., J. Nati. Cáncer Inst. 80: 1605-1611, 1988) y 528 (ver, por ejemplo, Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., in Biologic Therapy of Cáncer 607-623, Philadelphia: J.B. Lippincott Co . , 1995) o la rata ICR16, ICR62 y ICR64 (ver, por ejemplo, Modjtajedi et al., Intl. J. Oncology 4: 277-296, 1994; Modjtahedi et al., Br. J. Cáncer 67:247-253, 1993; Modjtahedi et al., Br. J. Cáncer 67: 254-261, 1993), se evaluaron extensivamente para su habilidad para afectar el crecimiento de tumor en modelos xenoinjerto de ratón. La mayoría de los anticuerpos monoclonales anti-EGFr fueron eficaces en prevenir la formulación de tumor en ratones atímicos cuando se administraron junto con las células de tumor humanas (Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Modjtahedi et al., Br . J. Cáncer 67: 254-261, 1993) . Cuando se inyectaron en ratones en presencia de xenoinjertos de tumor humano estables, los anticuerpos monoclonales de ratón 225 y 528 causaron regresión de tumor parcial y requieren la co-administración de agentes quimioterapéuticos, tales como doxorubicina o cisplatina, para la erradicación de los tumores (Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., in Biologic Therapy of Cáncer 607-623, Philadelphia: J.B.

Lippincott Co., 1995; Fan et al., Cáncer Res. 53: 4637-4642, 1993; Baselga et al., J. Nati. Cáncer Inst. 85: 1327-1333, 1993). Una versión quimérica del anticuerpo monoclonal 225 (C225) , en el cual las regiones variables del anticuerpo de ratón se ligan a regiones constantes humanas, que exhiben una mejora de la actividad anti-tumor in vivo pero solamente en dosis altas (ver, por ejemplo, Goldstein et al., Clinical Cáncer Res. 1: 1311-1318, 1995; Prewett et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol . 19: 419-427, 1996). Los anticuerpos de rata ICR16, ICR62, y ICR64 causan la regresión de los tumores establecidos pero no su erradicación completa (Modjtahedi et al., Br. J. Cáncer 67: 254-261, 1993). Estos resultados establecen el EGFr como un prometedor objetivo para la terapia del anticuerpo contra los tumores sólidos que expresan el EGFr y guían a los ensayos clínicos humanos con el anticuerpo monoclonal C225 en cánceres sólidos humanos múltiples (ver, por ejemplo, Baselga et al. Pharmacol. Then 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., Biologic Therapy of Cáncer pp. 607-623, Philadelphia: J. B. Lippincott Co . , 1995; Modjtahedi et al., Intl. J. of Oncology 4:277-296, 1994). Ciertos avances en el arte de la biología se hacen posibles para producir un anticuerpo anti-EGFr completamente humano. Usando ratones transgénicos para genes de inmunoglobulina humana (Xenomouse™ technology, Abgenix, Inc.), anticuerpos humanos específicos para el EGFr humano se desarrollaron (ver, por ejemplo, Méndez, Nature Genetics, 15: 146-156, 1997; Jakobovits, Advanced Drug Delivery Reviews, 31(1-2): 33-42, 1998; Jakobovits, Expert Opinión on Investigational Fármacos, 7(4): 607-614, 1998; Yang et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38(1) :17- 23, 2001; W098/24893; WO 98/50433). Tal anticuerpo, el panitumumab, un anticuerpo monoclonal lgG2 humano con una afinidad de 5 x 10"11 M para el EGFr humano, se muestran para bloquear el enlace de EGF al EGFr, para bloquear el receptor de señal, y para inhibir la activación de la células de tumor y proliferación in vitro (ver, por ejemplo, WO98/50433; Patente de E.U.A. No. 6,235,883). Los estudios en ratones atímicos demostraron que el panitumumab también tiene actividad in vivo, no solamente previene la formación de carcinoma epidermoide humano en los xenoinjertos A431 en ratones atímicos, pero también erradica los xanoinjertos de tumor A431 grandes establecidos (ver, por ejemplo, Yang et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38(1): 17-23, 2001; Yang et al., Cáncer Res. 59 (6 ): 1236-43 , 1999). El Panitumumab también se considera para el tratamiento de carcinoma renal, adenocarcinoma colorectal, cáncer de próstata, y carcinoma de pulmón escamoso de célula no pequeña, entre otros cánceres (ver, por ejemplo, Solicitud de patente de E.U.A. No. 2004/0033543), y tríales clínicos en movimiento con aquel anticuerpo. En ciertos tipos de células, el enlace de los factores de crecimiento, tales como EGFr, previene la apoptosis por la estimulación de fosfatidilinositol 3-cinasa ("PI3K") y B-Raf. La activación de PI3 desencadena una cascada molecular que carga a la subregulación de las trayectorias centrales que controlan la muerte celular programada (Yao, R., Science 267:2003-2006, 1995). Los miembros de la familia Raf también se identifican como reguladores de la muerte celular programada en mamíferos (Hunter, Cell 80:225-236, 1995). En los Raf de genes inactivados, los ratones B-Raf defectuosos mostraron alteraciones en la supervivencia celular, mientras los ratones Raf-1 o A-Raf defectuosos no mostraron tales alteraciones (ver, por ejemplo, Pritchard, Curr. Biol. 6:614-617, 1996; Wojnowski, Nat. Genet. 16:293-297, 1997), indicando que el B-Raf posee funciones específicas en la regulación de la muerte celular. Tanto PI3K y B-Raf son de interés en los trastornos de proliferación celular, particularmente cáncer. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En ciertas modalidades, un polipéptido aislado comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, y SEQ ID NO: 13 se proporciona. En ciertas modalidades, un polipéptido aislado consiste de al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 12, y SEQ ID NO: 13 se proporciona. En ciertas modalidades, un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, y SEQ ID NO: 13 se proporciona. En ciertas modalidades, un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido consiste de al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 12, y SEQ ID NO: 13 se proporciona. En ciertas modalidades, un polipéptido aislado que comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17 se proporciona. En ciertas modalidades, un polipéptido aislado que consiste de al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17 se proporciona. En ciertas modalidades, un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17 se proporciona. En ciertas modalidades, un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que consiste de al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17 se proporciona. En ciertas modalidades, un polipéptido aislado que comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 se proporciona. En ciertas modalidades, un polipéptido aislado que consiste de al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 se proporciona. En ciertas modalidades, un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 se proporciona. En ciertas modalidades, un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido consiste de al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 se proporciona. En ciertas modalidades, un vector que comprende al menos un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y SEQ ID NO: 20 se proporciona. En ciertas modalidades, una célula hospedera que comprende el vector se proporciona. En ciertas modalidades, una célula transformadora con al menos un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO : 19, y SEQ ID NO: 20 se proporciona. En ciertas modalidades, un método para preparar un polipéptido se proporciona. En ciertas modalidades, el método comprende cultivar una célula hospedera que comprende un vector que comprende al menos un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido bajo condiciones efectivas para la producción del polipéptido. En ciertas modalidades, el método comprende cultivar una célula que comprende al menos un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido bajo condiciones efectivas para la producción del polipéptido. En ciertas modalidades, el método además comprende aislar el polipéptido. En ciertas modalidades, un polipéptido preparado por el método se proporciona. En ciertas modalidades, una proteína de fusión que comprende un polipéptido aislado que comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y SEQ ID NO: 20 fusionada a un polipéptido heterólogo, se proporciona. En ciertas modalidades, un agente de enlace específico el cual es capaz de enlazar a un polipéptido aislado que comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y SEQ ID NO: 20 se proporciona. En ciertas modalidades, el agente de enlace especifico se selecciona de al menos una molécula selecciona de: un anticuerpo, un anticuerpo en donde la cadena pesada y la cadena ligera se conectan por un ligador, un anticuerpo Fv sencillo, un fragmento de inmunoglobulina inmunologicamente funcional, un anticuerpo Fab, un anticuerpo Fab J un anticuerpo (Fab')2, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo anti-idiotípico, un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerop quimérico, un anticuerpo de injerto CDR, y un anticuerpo que inhibe el enlace de EGF a un polipéptido aislado que comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20. En ciertas modalidades, un método para obtener un anticuerpo capaz de enlazar al menos un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12, y SEQ ID NO: 13 se proporciona. En ciertas modalidades, el método comprende administrar al menos un polipéptido que comprende al menos una secuencia selecciona de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y SEQ ID NO: 13 a un animal. En ciertas modalidades, el método además comprende obtener un anticuerpo capaz de enlazar al menos un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, y SEQ ID NO: 13 del animal. En ciertas modalidades, un animal no humano transgénico comprende al menos un polinucleótido que codifica al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y SEQ ID NO: 20 se proporciona. En ciertas modalidades, un polinucleótido que codifica al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y SEQ ID NO : 20 enlazada a un soporte sólido se proporciona. En ciertas modalidades, un polipéptido comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO : 19, y SEQ ID NO: 20 enlazada a un soporte sólido se proporciona. En ciertas modalidades, una configuración de polinucleótidos comprende al menos un polinucleótido que codifica al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y SEQ ID NO: 20 se proporciona. En ciertas modalidades, una configuración de polipéptidos comprende al menos un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y SEQ ID NO: 20 se proporciona. En ciertas modalidades, una sonda de ácido nucleico la cual hibridiza a un polinucleótido que codifica una región de un polipéptido EGFr mutante se proporciona. En ciertas modalidades, la región comprende al menos una mutación EGFr selecciona de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A. En ciertas modalidades, la sonda de ácido nucleico hibridiza a un complemento del polinucleótido.

En ciertas modalidades, un método para diagnosticar una enfermedad o condición la cual se relaciona a una o más mutaciones EGFrs en un sujeto se proporciona. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar una susceptibilidad a una enfermedad o condición la cual se relaciona a una o más mutaciones EGFrs en un sujeto se proporcionan. En ciertas modalidades, el método comprende determinar la presencia o cantidad de la expresión de un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 12, y SEQ ID NO: 13 en una muestra del sujeto. En ciertas modalidades, el método además comprende diagnosticar una enfermedad o condición la cual se relaciona a una o más mutaciones EGFrs basadas en la presencia o cantidad de la expresión del polipéptido. En ciertas modalidades, el método además comprende diagnosticar una susceptibilidad a una enfermedad o condición la cual se relaciona a una o más mutaciones EGFrs basadas en la presencia o cantidad de la expresión del polipéptido. En ciertas modalidades, un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido EGFr mutante en una muestra se proporciona. En ciertas modalidades, un método para determinar la presencia o ausencia de un polipéptido EGFr mutante en una muestra se proporciona. En ciertas modalidades, el método comprende exponer una muestra a una sonda la cual hibridiza a un polinucleótido que codifica una región de un polipéptido EGFr mutante, en donde la región comprende al menos una mutación EGFr selecciona de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A. En ciertas modalidades, el método además comprende determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido EGFr mutante en la muestra. En ciertas modalidades, el método comprende determinar la presencia o ausencia de un polipéptido EGFr mutante en la muestra. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar un cáncer relacionado al EGFr en un sujeto se proporciona. En ciertas modalidades, el método comprende determinar la presencia o ausencia de al menos un polipéptido EGFr mutante que comprende al menos una mutación selecciona de: L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A en una muestra del sujeto. En ciertas modalidades, el método comprende determinar la presencia o ausencia de al menos un polinucleótido EGFr mutante que codifica un polipéptido que comprende al menos una mutación selecciona de: L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A en una muestra del sujeto. En ciertas modalidades, la presencia de al menos un polipéptido EGFr mutante diagnostica un cáncer relacionado con el EGFr en el sujeto. En ciertas modalidades, la presencia de al menos un polinucleótido EGFr mutante diagnostica un cáncer relacionado con el EGFr en el sujeto . En ciertas modalidades, un método para determinar una probabilidad de desarrollar un cáncer relacionado con el EGFr en un sujeto se proporciona. En ciertas modalidades, el método comprende determinar la presencia o ausencia de al menos un polipéptido EGFr mutante que comprende al menos una mutación selecciona de: L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A en una muestra del sujeto. En ciertas modalidades, el método comprende determinar la presencia o ausencia de al menos un polinucleótido EGFr mutante que codifica un polipéptido comprende al menos una mutación selecciona de: L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A en una muestra del sujeto. En ciertas modalidades, la presencia de al menos un polipéptido EGFr mutante es indicativa de una probabilidad de desarrollar un cáncer relacionado con el EGFr en el sujeto. En ciertas modalidades, la presencia de al menos un polinucleótido EGFr mutante es indicativa de una probabilidad de desarrollar un cáncer relacionado con el EGFr en el sujeto. En ciertas modalidades, un cáncer relacionado con el EGFr es carcinoma de pulmón de célula no pequeña. En ciertas modalidades, un método para la detección sistemática para modular la actividad de al menos un polipéptido EGFr mutante que comprende al menos una mutación selecciona de L688P, Q701 H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A se proporciona. En ciertas modalidades, el método comprende poner en contacto una célula con un compuesto de prueba y detectar si el compuesto de prueba modula la actividad del polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, un compuesto identificado por el método se proporciona. En ciertas modalidades, un método para tratar una enfermedad o condición la cual relaciona al menos una mutación EGFr selecciona de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A se proporciona. En ciertas modalidades, el método comprende administrar el compuesto a un sujeto que necesite del tratamiento para la enfermedad o condición la cual relaciona al menos una mutación EGFr. En ciertas modalidades, un método para tratar a un sujeto por una enfermedad o condición la cual relaciona al menos una mutación EGFr se proporciona. En ciertas modalidades, el método comprende detectar al menos una mutación EGFr en un polinucleótido del sujeto, en donde la detección de al menos una mutación EGFr indica que el paciente incrementa la susceptibilidad para desarrollar una enfermedad o condición la cual relaciona al menos una mutación EGFr. En ciertas modalidades, el método comprende detectar al menos una mutación EGFr en un polinucleótido del sujeto, en donde la detección de al menos una mutación EGFr indica que el paciente tiene una enfermedad o condición la cual relaciona al menos una mutación EGFr. En ciertas modalidades, el método además comprende administrar un anticuerpo al sujeto que específicamente enlaza un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En ciertas modalidades, el anticuerpo es panitumumab o una región de enlace al antígeno del mismo. En ciertas modalidades, una mutación EGFr se selecciona de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A. En ciertas modalidades, una enfermedad o condición la cual relaciona al menos una mutación EGFr, es carcinoma de pulmón de célula no pequeña. En ciertas modalidades, un método para tratar una enfermedad o condición la cual relaciona al menos una mutación EGFr se proporciona. En ciertas modalidades, el método comprende administrar un polinucleótido antisentido al polinucleótido que codifica al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y SEQ ID NO: 20 a un sujeto que necesite de tal tratamiento. En ciertas modalidades, un método para estabilizar un perfil de población EGFR mutante en una población específica de individuos se proporciona. En ciertas modalidades, el método comprende determinar la presencia de al menos una mutación EGFr en un perfil genético de los individuos en una población. En ciertas modalidades, el método además comprende establecer una relación entre los perfiles genéticos del EGFR mutante y características específicas de los individuos. En ciertas modalidades, las características específicas de los individuos incluyen una susceptibilidad para desarrollar una enfermedad o condición la cual se relaciona a una mutación EGFr. En ciertas modalidades, las características específicas de los individuos incluyen exhibir una enfermedad o condición la cual se relaciona a una mutación EGFr. En ciertas modalidades, un método para predecir la eficacia del tratamiento de gefitinib en una enfermedad o condición en un sujeto se proporciona. En ciertas modalidades, el método comprende determinar la presencia o ausencia de mutación EGFr T790M en un polipéptido EGFr mutante del sujeto. En ciertas modalidades, la presencia de la mutación EGFr T790M en uno o más polipéptidos EGFr mutantes indica la resistencia para el tratamiento con gefitinib. En ciertas modalidades, un método para determinar las respuestas para el tratamiento con un anticuerpo anti-EGFr en un sujeto que padece de cáncer se proporciona. En ciertas modalidades, el método comprende determinar la presencia o ausencia de la mutación EGFr T790M en el sujeto. En ciertas modalidades, el anticuerpo es panitumumab o cetuximab.

En ciertas modalidades, un kit para detectar un polinucleótido que codifica un polipéptido EGFr mutante en un sujeto se proporciona. En ciertas modalidades, el kit comprende una sonda la cual hibridiza a un polinucleótido que codifica una región de un polipéptido EGFr mutante, en donde la región comprende al menos una mutación EGFr selecciona de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A. En ciertas modalidades, el kit además comprende dos o más cebadores de amplificación. En ciertas modalidades, el kit además comprende una detección del componente. En ciertas modalidades, el kit además comprende un componente de la muestra del ácido nucleico. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una tabla que muestra un análisis mutacional de muestras de tumor de carcinoma de pulmón de célula no pequeña ("NSCLC", por sus siglas en inglés) de veinte pacientes, de conformidad al trabajo descrito en el ejemplo 1. Los exones EGFr 18, 19, 20, 21, y 23, los exones PI3K 9 y 20, y el exón B-Raf 15 del ADN genómico de cada tumor se amplificaron, se hicieron en secuencia y se compararon al EGFr de tipo silvestre, PI3K, o secuencia B-Raf . La figura 2 es una tabla que muestra un análisis mutacional de muestras de tumor de adenocarcinoma colorectal ("CRC", por sus siglas en inglés) de veinte pacientes, de conformidad al trabajo descrito en el ejemplo 1. Los exones EGFr 18, 19, 20, 21, y 23, los exones PI3K 9 y 20, y el exón B-Raf 15 del ADN genómico de cada tumor se amplificaron, se hicieron en secuencia y se compararon al EGFr de tipo silvestre, PI3K, o secuencia B-Raf. La figura 3 es una tabla que muestra un análisis mutacional de las muestras de tumor NSCLC de treinta y nueve pacientes, de conformidad al trabajo descrito en el ejemplo 2. Los exones EGFr 18, 19, 20, 21, y 23 y los exones B-Raf 11 y 15 del ADN genómico de cada tumor se amplificaron, se hicieron en secuencia y se compararon al EGFr de tipo silvestre o secuencia B-Raf. La figura 4 muestra el análisis de electroforesis del gel radioactivo de la actividad inhibidora de gefitinib y panitumumab de tipo silvestre y autofosforilación T790M EGFr, de conformidad al trabajo descrito en el ejemplo 3. Las figuras 5A-5F muestran alineaciones de ciertas secuencias del polinucleótido EGFr mutante y polipéptido y ciertas secuencias de polinucleótido PI3K y polipéptido con las secuencias de tipo silvestre correspondientes. Las figuras 6A-6Z muestran secuencias de polinucleótido y polipéptido para las moléculas de EGFr mutantes y de tipo silvestre. Las figuras 7A-7H muestran secuencias de polinucleótido y polipéptido para las moléculas de PI3K mutantes y de tipo silvestre. Las figuras 8A-8F muestran secuencias de polinucleótido y polipéptido para las moléculas B-Raf mutantes y de tipo silvestre. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las referencias citadas en la presente, incluyen patentes, solicitudes de patentes, documentos, libros de texto, y similares y las referencias citadas en la presente, al grado de que ya no estén, se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. Los títulos de la sección como se usan en la presente son para propósitos solamente organizacionales y no se construyen como limitantes para la materia sujeta descrita. Definiciones A menos de que se defina de otra manera, los términos científicos y técnicos se usan en conexión con la presente invención deberán tener los significados que se conocen comúnmente por aquellos de habilidad ordinaria en el arte. Además, a menos de que se requiera de otra manera por el contexto, los términos singulares deberán incluir pluralidades y los términos plurales deberán incluir el singular. Generalmente, las nomenclaturas se utilizan en conexión con, y las técnicas de, cultivo celular y tejido, biología molecular, y proteína y química de oligo o polinucleótido e hibridización descritas en la presente son aquellas conocidas y comúnmente usadas en el arte. Las técnicas estándar se usaron para el ADN recombinante, síntesis de oligonucleótido, y cultivo de tejido y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se llevaron a cabo de conformidad a las especificaciones de la manufactura o como se completan comúnmente en el arte o como se describen en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriores generalmente se llevan a cabo de conformidad a los métodos convencionales conocidos en el arte y como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y discuten a través de la presente especificación. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), la cual se incorpora en la presente para referencia. Las nomenclaturas se utilizan en conexión con, y los procedimientos del laboratorio y las técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descrita en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en el arte. Las técnicas estándar se usan para la síntesis química, análisis químico, preparación farmacéutica, formulación y liberación y tratamiento de pacientes.

En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" al menos de que se indique de otra manera. Además, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no se limitan. También, los términos tales como "elemento" o "componente" abarcan ambos elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad al menos de que se anote especialmente de otra manera. Como se utiliza de conformidad con la presente descripción, los siguientes términos, a menos de que se indique de otra manera, deberán entenderse que tienen los siguientes significados: Los términos "polinucleótido aislado" y "ácido nucleico aislado" se usan intercambiablemente, y como se usa en la presente deberán significar un polinucleótido de oriden genómico, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, en la cual en virtud de este origen (1) no se asocia con todo o una porción de un polinucleótido en el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en naturaleza, (2) es ligada operablemente a un polinucleótido el cual no se liga en la naturaleza, o (3) no se presenta en la naturaleza como parte de una secuencia grande. Los términos "proteína aislada" y "polipéptido aislado" se usan intercambiablemente, y como se refiere en la presente significa una proteína de oriden de ADNc, ARN recombinante o sintético, o alguna combinación de los mismos, en la cual en virtud de este origen, o fuente de derivación, (1) no se asocia con las proteínas encontradas en la naturaleza, (2) es libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas de murina, (3) se expresan por una célula de una especie diferente, o (4) no se presentan en la naturaleza. Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan intercambiablemente y se usan en la presente como un término genérico para referirse a proteína nativa, fragmentos, péptidos, o análogos de una secuencia de polipéptido. En la presente, la proteína natural, fragmentos, y análogos son especies del genero del polipéptido. La terminología "X#Y" en el contexto de una mutación en una secuencia de polipéptido es reconocida en el arte, donde "#" indica la localización de la mutación en los términos del número de aminoácidos del polipéptido, "X" indica el aminoácido encontrado en la posición en la secuencia de aminoácido de tipo silvestre, e "Y" indica el aminoácido mutante en esa posición. Por ejemplo, la anotación "L688P" con referencia al polipéptido EGFr indica que esa es una leucina en el número de aminoácido 688 de la secuencia EGFr de tipo silvestre, y esa leucina se reemplaza con una prolina en la secuencia EGFr mutante.

Los términos "polipéptido EGFr mutante" y "proteína EGFr mutante" se usan intercambiablemente, y se refieren a un polipéptido EGFr que comprende al menos una mutación EGFr seleccionada de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A. Ciertos polipéptidos EGFr mutantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, variantes alelicas, variantes de empalme, variantes derivadas, variantes de substitución, variantes de eliminación, y/o variantes de inserción, polipéptido de fusión, ortólogos, y homólogos interespecies . En ciertas modalidades, un polipéptido EGFr mutante incluye residuos adicionales en las terminales C o N, tales como pero no se limitan a, residuos de secuencia líder, residuos objetivos, residuos de metionina de terminal amino, residuos de lisina, residuos de etiqueta y/o residuos de proteína de fusión. Los términos "polipéptido PI3K mutante" y "proteína PI3K mutante" se usan intercambiablemente, y se refieren a un polipéptido PI3K que comprende al menos una mutación PI3K seleccionada de E542K, E545A, y H1047L. Ciertos polipéptidos PI3K mutantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, variantes alelicas, variantes de empalme, variantes derivadas, variantes de substitución, variantes de eliminación, y/o variantes de inserción, polipéptido de fusión, ortólogos, y homólogos interespecies. En ciertas modalidades, un polipéptido PI3K mutante incluye residuos adicionales en las terminales C o N, tales como pero no se limitan a, residuos de secuencia líder, residuos objetivos, residuos de metionina de terminal amino, residuos de lisina, residuos de etiqueta y/o residuos de proteína de fusión. Los términos "polipéptido B-Raf mutante" y "proteína B-Raf mutante" se usan intercambiablemente, y se refieren a un polipéptido B-Raf que comprende al menos una mutación B-Raf seleccionada de V600E y K601E. Ciertos polipéptidos B-Raf mutantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, variantes alelicas, variantes de empalme, variantes derivadas, variantes de substitución, variantes de eliminación, y/o variantes de inserción, polipéptido de fusión, ortólogos, and homólogos interespecies. En ciertas modalidades, un polipéptido B-Raf mutante incluye residuos adicionales en las terminales C o N, tales como pero no se limitan a, residuos de secuencia líder, residuos objetivos, residuos de metionina de terminal amino, residuos de lisina, residuos de etiqueta y/o residuos de proteína de fusión. El término "proteína de fusión EGFr mutante" se refiere a una fusión de uno o más aminoácidos (tales como un polipéptido heterologo) en las terminales amino o carboxilo de un polipéptido EGFr mutante. El término "proteína de fusión PI3K mutante" se refiere a una fusión de uno o más aminoácidos (tales como un polipéptido heterologo) en las terminales amino o carboxilo de un polipéptido PI3K mutante. El término "proteína de fusión B-Raf mutante" se refiere a una fusión de uno o más aminoácidos (tal como un polipéptido heterologo) en las terminales amino o carboxilo de un polipéptido B-Raf mutante. El término "que se presenta naturalmente" como se usa en la presente como se aplica a un objeto que se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que esta presente en un organismo (incluyendo virus) que pueden aislarse de una fuente en la naturaleza y los cuales pueden modificarse intencionalmente por el hombre en el laboratorio o a menos de que se presente naturalmente de otra manera. El término "ligada operablemente" como se usa en la presente se refiere a la posición de los componentes que están en una manera que permite su función en su manera propuesta. Una secuencia de control "ligada operablemente" a una secuencia codificada se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificada se lleva a cabo bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. El término "secuencia de control" como se usa en la presente se refiere a secuencias de polinucleótido la scuales son necesarias para efectuar la expresión y procesos de las secuencias codificadas las cuales se ligan. La naturaleza de tales secuencias de control difieren dependiendo del organismo hospedero; en los eucariotes, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminación de transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir, un mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesoy pueden también incluye los componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias del compañero de fusión. El término "polinucleótido" como se refiere en la presente significa una forma polímerica de nucleótidos de al menos 10 bases en longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de ya sea tipo de nucleótido. El término incluye formas de hebra doble y sencilla de ADN. El término "oligonucleótido" referido en la presente incluye nucleótidos modificados y que se presentan naturalmente ligados junto con ligaduras de oligonucleótido que se presentan naturalmente o que no se presentan naturalmente. Los oligonucleótidos son un subconjunto polinucleótido que generalmente comprende una longitud de 200 bases o algunos. Preferiblemente los oligonucleótidos son 10 hasta 60 bases en longitud y más preferiblemente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 hasta 40 bases en longitud. Los oligonucleótidos son usualmente de hebra sencilla, por ejemplo, para las sondas, a través de los oligonucleótidos pueden ser hebras dobles, por ejemplo, por el uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser ya sea oligonucleótidos sentido o antisentido. Los términos "polinucleótido EGFr mutante", "oligonucleótido EGFr mutante, " y "ácido nucleico EGFr mutante" se usan intercambiablemente, y se refieren a un polinucleótido que codifica un polipéptido EGFr que comprende al menos una mutación EGFr seleccionada de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A. Los términos "polinucleótido PI3K mutante" , "oligonucleótido PI3K mutante, " y "ácido nucleico PI3K mutante" se usan intercambiablemente, y se refieren a un polinucleótido que codifica un polipéptido PI3 que comprende al menos una mutación PI3K seleccionada de E542K, E545A, y H1047L. Los términos "polinucleótido B-Raf mutante" , "oligonucleótidos B-Raf mutante, " y "ácido nucleico B-Raf mutante" se usan intercambiablemente, y se refieren a un polinucleótido que codifica un polipéptido B-Raf que comprende al menos una mutación B-Raf seleccionada de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A. El término "nucleótidos que se presentan naturalmente" referido en la presente incluye desoxiribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" referido en la presente incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o substituidos y similares. El término "ligaduras de oligonucleótido" referido en la presente incluye ligaduras de oligonucleótido tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y similares. Ver, por ejemplo, LaPlanche et al. Nucí. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucí. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed. , Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. Patente de E.U.A. No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), las descripciones de los cuales se incorporan en la presente para referencia. Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta para la detección, si se desea. El término "hibridiza selectivamente" referido en la presente significa un enlace detectable y específico. Los polinucleótidos, oligonucleótidos, y fragmentos de los mismos hibridizan selectivamente a las hebras de ácido nucleico bajo hibridización y condiciones de lavado que minimizan las cantidades apreciables del enlace detectable a los ácidos nucleicos no específicos. Las condiciones de severidad altas pueden usarse para llevar a cabo las condiciones de hibridización selectivas como se conoce en el arte y se discuten en la presente. Generalmente, la homología de secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos, y fragmentos y una secuencia de ácido nucleico de interés será de al menos 80%, y más típicamente con incremento en la homología preferiblemente de al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100%. Dos secuencias de aminoácido son homologas si tienen una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85% de la homología significa que 85% de los aminoácidos son idénticos cuandos las dos secuencias se alinean por parejas iguales. Los espacios (en cualquiera de las dos secuencias que coinciden) se permiten en máximos iguales; el espacio de longitud de 5 o menos se prefieren con 2 o menos más preferidas. Alternativamente y preferiblemente, dos secuencias de proteína (o secuencias de polipéptido derivadas de al menos 30 aminoácidos en longitud) son homologas, como este término se usa en la presente, si estos tienen un registro alineado de más de 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa de ALIGN con la matriz de datos de mutación y una sanción de espacio de 6 o más. Ver Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y suplemento 2 para este volumen, pp. 1-10. Las dos secuencias o partes de los mismos son más preferiblemente homologas si sus aminoácidos son mayores que o iguales a 50% de identidad cuando ligan óptimamente usando el programa ALIGN. El término "que corresponde a" usado en la presente significa una secuencia de polinucleótido que es homologa (esto es, idéntico, no estrictamente evolucionarmente relacionado) a todo o una porción de una secuencia de polinucleótido de referencia, o una secuencia de polipéptido que es idéntica a una secuencia del polipéptido de referencia. En contraste, el término "complementario a" usado en la presente significa la secuencia complementaria que es homologa a toda o una porción de una secuencia del polinucleótido de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótido "TATAC" que corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA" . Los siguientes términos se usaron para describir la secuencia en relación entre dos o más polinucleótidos o secuencias de aminoácido: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia", e "identidad substancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como una base para una comparación de secuencia; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de un ADNc de longitud completa o secuencia de gen dada en un listado de secuencias o puede comprende un ADNc completo o secuencia de gen. Generalmente, una secuencia de referencia es de al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos en longitud, frecuentemente al menos 24 nucleótidos o 8 aminoácidos en longitud, y frecuentemente al menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos en longitud. Ya que dos polinucleótidos o secuencias de aminoácido puede cada una (1) comprender una secuencia (esto es, una porción de la secuencia de polinucleótido o aminoácido completa) que es similar entre las dos moléculas, y (2) pueden además comprende una secuencia que es divergente entre las dos secuencias de polinucleótido o aminoácido, las secuencias de comparación entre dos (o más) moléculas se llevan a cabo típicamente por comparar las secuencias de las dos moléculas sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de la similaridad de la secuencia. Una "ventana de comparación", como se usa en la presente, se refiere a un segmento conceptual de al menos 18 posiciones de nucleótidos contiguos o 6 aminoácidos en donde una secuencia de polinucleótido o secuencia de aminoácido puede compararse a una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos contiguos o 6 secuencias de aminoácido y en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones, eliminaciones, substituciones, y similares (esto es, espacios) de 20% o menos como se compara a la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de las secuencias para alinear una ventana de comparación puede conducirse por el algoritmo de homología local de Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineación de homlogía de Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por la búsqueda del método de similitud Pearson and Lipman Proc. Nati. Acad. ScL (U.S.A.) 85:2444 (1988) , por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr . , Madison, Wis.), Geneworks , or MacVector software packages) , o por inspección y el mejor alineamiento (esto es, resulta en el porcentaje alto de homología sobre la ventana de comparación) generada por los diversos método se selecciona. El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótido o aminoácido son idénticas (esto es, en una base de nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) sobre la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula por comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre la ventana de comparación para determinar el número de posiciones en las cuales la base del ácido nucleico es idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U, o I) o el residuo que se presenta en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones iguales, dividir el número de posiciones iguales por el número total de posiciones en la ventana de comparación (esto es, el tamaño de la ventana), y multiplicar el resulado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. El término "identidad substancial" como se usa en la presente significa una característica de una secuencia de polinucleótido o aminoácido, en donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 hasta 95 por ciento de identidad de secuencia, más usualmente al menos 96, 97, 98, ó 99 por ciento de identidad de secuencia cuando se compara a una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos), frecuentemente sobre una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótidos (8-16 aminoácidos), en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula por comparar la secuencia de referencia a la secuencia la cual puede incluir eliminaciones o adiciones en la cuales el 20 por ciento o menos del total de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia grande. Como se usa en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), las cuales se incorporan en la presente para referencia. El término "aminoácido" o "residuo de aminoácido, " como se usa en la presente, se refiere a aminoácidos L o a aminoácidos D que se presentan naturalmente. Las abreviaturas de una y tres letras comúnmente usadas para los aminoácidos se usan en la presente (Bruce Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., New York (4th ed. 2002)). Los estereoisómeros (por ejemplo, aminoácidos D) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a- , -disubstituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales pueden también ser componente adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-N,N,N-trimetil lisina, e-N-acetil lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina, y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la anotación polipéptido que se usa en la presente, la dirección del lado izquierdo es la dirección de la terminal amino y la dirección del lado derecho es la dirección de la terminal carboxi, de conformidad con uso estándar y convención. Similarmente, a menos de que se especifique de otra manera, el extremo de lado izquierdo de las secuencias de polinucleótido de hebra sencilla es el extremo 5'; la dirección del lado izquierdo de las secuencias de polinucleótido de hebra doble se refiere como la dirección 5'. La dirección de la adición 5' hasta 3' de los transcriptos de ARN nacientes se refieren como la dirección de transcripción. Las regiones de secuencia en la hebra de AD? tienen la misma secuencia como el ARN y en el cual son 5' al extremo 5 ' del transcripto de ARN se refieren como "secuencia de cadena arriba". Las regiones de la secuencia en la hebra de AD? tienen la misma secuencia como el AR? y en el cual son 3' hasta el extemo 3' del transcriptote ARN se refieren como "secuencias cadena abajo". Como se aplica a los polipéptidos, el término "identidad substancial" significa que dos secuencias de péptido, cuando se alinean óptimamente, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando un peso por omisión del espacio, comparten al menos 80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 95, 96, 97, ó 98 por ciento de identidad de secuencia, y más preferiblemente al menos 99 por ciento de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones del residuo que no son idénticas difieren por las substituciones de aminoácido conservadoras. Como se discute en la presente, variaciones menores en las secuencias de aminoácido de los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se contemplan como se abarca por la presente invención, con la condición de que las variaciones en la secuencia de aminoácido se mantienen al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, 90%, 95%, y más preferiblemente 99%. Las substituciones de aminoácido conservadoras son aquellas que toman lugar dentro de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas lateraes . Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen generalmente en familias: (1) ácido=aspartato, glutamato; (2) básico=lisina, arginina, histidina; (3) no-polar=alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polar no cargado=glicina, asparagina, glutamina, cisteina, serina, treonina, tirosina. Las familias más preferidas son: serina y treonina son familias hidroxi alifáticas; asparagina y glutamina son una familia que contiene amida; alanina, valina, leucina y isoleucina son una familia alifática; fenilalanina, triptofano, y tirosina son una familia aromática, y cisteina y metionina como una familia de cadena lateral que contiene azufre. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no deberá tener un mayor efecto en el enlace o propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no involucra un aminoácido dentro de un sitio de la estructura. Los grupos de substitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido glutámico-ácido aspártico, cisteina-metionina, y asparagina-glutamina. Las substituciones de aminoácido preferidas son aquellas en las cuales: (1) se reduce la susceptibilidad a la proteolisis, (2) se reduce la susceptibilidad a la oxidación, (3) se altera la afinidad de enlace para formar complejos de proteína, (4) se altera la afinidad de enlace y (5) se otorgan o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteinas de una secuencia a otra secuencia de péptido que se presenta naturalmente. Por ejemplo, substituciones de aminoácido sencillas o múltiples (preferiblemente, substituciones de aminoácido conservadoras) pueden hacerse en la secuencia que se presenta naturalmente (preferiblemente en la porción del polipéptido fuera de los dominios formados por los contactos intermoleculares. Una substitución de aminoácido conservadora no deberá cambiar substancialmente las características estrucrales de la secuencia precursora (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no deberá tender a dividir una hélice que se presenta en la secuencia precursora, o romper otros tipos de estructuras secundarias que caracterizan la secuencia precursora) . Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en el arte se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed. , W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et at . Nature 354:105 (1991), las cualas cada una se incorpora en la presente para referencia. El término "análogo" como se usa en la presente se refiere a polipéptidos los cuales comprenden un segmento de al menos 25 aminoácidos que son substancialmente idénticos a una porción de una secuencia de aminoácido de un polipéptido que se presenta naturalmente y la cual tiene al menos una de las actividades del polipéptido que se presenta naturalmente. Típicamente, los análogos del polipéptido comprenden una substitución de aminoácido conservada (o adición o eliminación) con respectoa la secuencia que se presenta naturalmente. Los análogos típicamente son de al menos 20 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 50 aminoácidos de longitud o de largo, y pueden frecuentemente tener longitud como un el polipéptido que se presenta naturalmente de longitud completa. Los análogos del péptido se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no péptidos con propiedades análogas a aquellas del péptido modelo. Aquellos tipos de compuestos no péptidos son los términos "péptido mimético" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), los cuales se incorporan en la presente para referencia. Tales compuestos se desarrollan frecuentemente con ayuda del modelo molecular computarizado. Los péptidos miméticos que son estructuralmente similares a los péptidos útiles terapéuticamente pueden usarse para producir un efecto terapéutico equivalente o profiláctico. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (esto es, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica) , tal como anticuerpo humano, pero tiene una o más ligaduras de péptido opcionalmente reemplazadas por una ligadura seleccionada del grupo que consiste de: --CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-, por los métodos bien conocidos en el arte. La substitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un aminoácido D del mismo tipo (por ejemplo, lisina D en lugar de lisina L) pueden usarse para generar más péptidos estables. Además, los péptidos forzados comprenden una secuencia de consenso o una variación de la secuencia de consenso substancialmente idéntica puede generarse por los métodos conocidos en el arte (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), incorporado en la presente para referencia); por ejemplo, por agregar residuos de cisterna internos capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares los cuales ciclizan el péptido. Las terminaciones amino y carboxi preferidas de fragmentos o análogos se presentan cercanamente enlazadas de los dominios funcionales . Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse por comparación de los datos de la secuencia de nucleótido y/o aminoácido para las bases de datos de secuencias publicadas o propias. Preferiblemente, los métodos de comparación computarizada se usan para identificar las porciones de secuencia o predecir los dominios de conformación de la proteína que se presentan en otras proteínas de las estructuras y/o funsión conocidas. Los métodos para identificar las secuencias de proteína que se doblan en una estructura tri-dimensional se conocen (ver Bowie et al. Science 253:164 (1991)). Aquellos de habilidad en el arte pueden reconocer porciones de secuencia y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales de conformidad con la invención. El término "agente de enlace específico" se refiere a una molécula natural o no natural que enlaza específicamente a un objetivo. Los ejemplos de agentes de enlace específicos incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, ácido nucleico, carbohidratos, lípidos, y compuestos de molécula pequeña. En ciertas modalidades, un agente de enlace específico es un anticuerpo. En ciertas modalidades, un agente de enlace específico es una región de enlace de antígeno. El término "agente de enlace específico para un polipéptido EGFr mutante" se refiere a un agente de enlace específico que enlaza específicamente cualquier porción de un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, un agente de enlace específico a un polipéptido EGFr mutante es un anticuerpo para un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, un agente de enlace específico a un polipéptido EGFr mutante es una región del enlace del antígeno. El término "agente de enlace específico para un polipéptido PI3K mutante" se refiere a un agente de enlace específico que enlaza específicamente cualquier porción de un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, un agente de enlace específico a un polipéptido PI3K mutante es un anticuerpo para un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, un agente de enlace específico a un polipéptido PI3K mutante es una región de enlace del antígeno. El término "agente de enlace específico para un polipéptido B-Raf mutante" se refiere a un agente de enlace específico que enlaza específicamente cualquier porción de un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, un agente de enlace específico para un polipéptido B-Raf mutante es un anticuerpo para un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, un agente de enlace específico para un polipéptido B-Raf mutante es una región de enlace de antígeno. El término "enlace específicamente" se refiere a la habilidad de un agente de enlace específico para enlazar a un objetivo con mayor afinidad que el enlazar a un no objetivo. En ciertas modalidades, el enlace específico se refiere a un enlace para un objetivo con una afinidad que es al menos 10, 50, 100, 250, 500, o 1000 veces mayor que la afinidad de un no objetivo. En ciertas modalidades, la afinidad se determina por un ensayo ELISA de afinidad. En ciertas modalidades, la afinidad se determina por un ensayo BIAcore. En ciertas modalidades, la afinidad se determina por una metido cinético. En ciertas modalidades, la afinidad se determina por un método de equilibrio/solución. En ciertas modalidades, un anticuerpo es el enlace específicamente un antígeno cuando la disociación constante entre el anticuerpo y uno o más de sus epítopos reconocidos es <1 µM, preferiblemente < 100 nM u más preferiblemente < 10 nM. Los "anticuerpos naturales e immunoglobulinas" son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de alrededor de 150,000 daltones, puestas de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H) . Cada cadena ligera se liga a una cadena pesada por un enlace de disulfuro covalente, mientras que el número de ligaduras de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de immunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tienen espacios regularmente entre los puentes de disulfuro de la cadena. Cada cadena pesada tiene un extremo, un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes.

Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en el otro extremo; el dominio constate de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Los residuos de aminoácido particulares se creen para formar una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Chothia et al. J. Mol. Biol. 186:651 (1985; Novotny and Haber, Proc. Nati. Acad. ScL U.S.A. 82:4592 (1985); Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)). El término "anticuerpo" se refiere a tanto a un anticuerpo intacto y un fragmento de enlace de antígeno del mismo el cual compite con el anticuerpo intacto para el enlace específico. El "fragmento de enlace de antígeno del mismo" se refiere a una porción o fragmento de una molécula de anticuerpo intacta, en donde el fragmento retiene la función de enlace del antígeno. Los fragmentos de enlace se producen por técnicas de ADN recombinante, o por desdoblamiento químico o enzimático de anticuerpos intactos tales como por desdoblamiento con papaína. Los fragmentos de enlace incluyen Fab, Fabl, F(ab')2, Fv, anticuerpos de cadena sencilla ("scFv"), fragmentos Fdl y Fd. Los métodos para producir los diversos fragmentos de los anticuerpos monoclonales son bien conocidos por aquellos de habilidad en el arte (ver, por ejemplo, Pluckthun, 1992, Immunol . Rev. 130:151-188). Un anticuerpo diferente a un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" se entenderá cada uno tiene sus sitios de enlace idénticos. Un anticuerpo inhibe substancialmente la adhesión de un receptor para un contrareceptor cuando un exceso del anticuerpo reduce la cantidad del enlace del receptor para un contrareceptor por al menos alrededor de 20%, 40%, 60%, ó 80%, y más usualmente mayor de aldedor de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% (como se mide en un ensayo de enlace competitivo in vitro) .

Un anticuerpo "aislado" es uno el cual se identifica y se separa y/o recupera de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales los cuales deberán interferir con el diagnóstico o usos terapéuticos para el anticuerpo, y muchos incluyen enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En las modalidades preferidas, el anticuerpo deberá purificarse (1) para ser mayor que 95% por en peso del anticuerpo como se determina por el método Lowry y terminal o secuencia del aminoácido interno por el uso de un secuenciador de depósito giratorio, o (2) para la hoomogenicidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, teñido de plata. Un anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinante desde al menos un componente del anticuerpo de ambiente natural no deberá presentarse. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado deberá prepararse por al menos una etapa de purificación. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en los anticuerpos entre la secuencia y se usan en el enlace y específicamente de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no es igualmente distribuida a través de los dominios variables de los anticuerpos. Esto se concentra en tres segmentos llamados regiones que determinan la complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables ambas en los dominios variavles de cadena pesada y cadena ligera. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman la estructura (FR) . Los dominios variables de las cadenas ligeras y presadas cada una comprende cuatro regiones FR, adoptando a lo largo una configuración ß-de la hoja, conectada por tres CDRs, los cuales forman rizos conectados, y en algunos casos forma parte de, la estructura ß-de la hoja. Los CDR en cada cadena se mantienen juntos en la proximidad cercana por las regiones FR y, con los CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace al antígeno de los anticuerpos (Ver Kabat et al. (1991). Los dominios constantes no se involucran directamente en el enlace a un anticuerpo para un antígeno, pero exhiben diversas funciones al efector, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo. El "Fv" es el fragmento del anticuerpo mínimo el cual contiene un reconocimiento del antígeno y sitio de enlace. En una especie Fv de dos cadenas, esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y ligera en asociación no covalente, estrecha. En una especie Fv de cadena sencilla, un dominio variable de cadena ligera y pesada puede ligarse covalentemente por un ligador de péptido flexible tal que la cadena ligera y pesada puede asociarse en un análogo de estructura "dimérica" a una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que los tres CDRs de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, los seis CDRs otorgan la especificidad del enlace al antígeno en el anticuerpo. Sin embargo, aun un dominio variable sencillo (o mitad de un Fv comprende solvamente los tres CDRs específicos para un antígeno) tiene la habilidad para reconocer e enlazar al antígeno, a través de una afinidad baja que el sitio de enlace completo. El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente se refiere al residuo de aminoácidos de un anticuerpo el cual responde al enlace de antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos de aminoácidos de una "región para determinar la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, residuos 24-34 (Ll) , 50-62 (L2), y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-55 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "rizo hipervariable" (por ejemplo, residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 ((Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol 196:901-917 (1987)). Los residuos de "región de estructura " o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los resifuod de región hipervariable como se definen en la presente. El término "regiones para determinar la complementariedad" o "CDRs," cuando se usa en la presente, se refiere a partes de los receptores inmunológicos que hacen contacto con un ligando específico y determinan su especificidad. Los CDRs de los receptores inmunológicos son la parte más variable de la proteína receptora, da a los receptores su diversidad, y se llevan a cabo en seis rizos en el extremo distal de los dominios variables receptores, tres rizos llegan a ser cada uno de los dos dominios variables del receptor. La "citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo" y "ADCC" se refiere a una reacción mediada por la célula en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan los receptores Fc (FcRs) (por ejemplo, células exterminadoras naturales (NK) , neutrófilos, y macrófagos) reconocen el anticuerpo enlazado en una célula objetivo y subsecuentemente causan lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresar solamente FcyRIll, mientras los monocitos expresan Fc?RI, Fc?RII y FcyRIII . La expresión Fc en células hematopoyeticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para valorar la actividad ADCC de una molécula de interés, un ensayo in vitro ADCC, tal como aquel descrito en la patente de E.U.A. No. 5,500,362, ó 5,821,337 puede llevarsa a cabo. Las células del efector útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periféricas (PBMC) y células eliminadoras naturales (NK) . Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede valorarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como aquel descrito en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1988) . El término "epítopo" incluye cualquier proteína determinante capaz de enlazar específicamente a un receptor de inmunoglobulina y/o célula T. Los determinantes epitópicos usualmente consisten de agrupamientos de superficie químicamente activa de las moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen tres características estructurales de dimensiones, así como características de carga específicas. El término "agente" usado en la presente significa un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos . Como se usa en la presente, los términos "etiqueta" o "etiquetado" se refiere a la incorporación de una marca detectable, por ejemplo, por la incorporación de un aminoácido radioetiquetado o enlazado a un polipéptido de las porciones biotiniladas que pueden detectarse por marcar la avidina (por ejemplo, la estreptavidina contiene una marca fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por métodos ópticos o colorimétricos) . En ciertas situaciones, la etiqueta o marcado pueden también ser terapéuticos . Diversos métodos de etiquetado de polipéptidos y glicoproteínas se conocen en el arte y pueden usarse. Los ejemplos de etiquetas para los polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionuclidos (por ejemplo, 3H, 1C, 15N, 35S, 90Y, "Te, U1ln, 125I, 131I), etiquetas fluorescentes (por ejemplo, fósforos de FITC, rodamina, lantanida) , etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de raíz de rábano, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) , grupos quimioluminiscentes, grupos biotinilados, y epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidoz por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias pares de cremallera de leucina, sitios de enlace para los anticuerpos secundarios, dominios de enlace de metal, etiquetas de epítopo) . En algunas modalidades, las etiquetas se enlazan por extremidades espaciadoras para reducir la obstrucción estérica potencial. El término "agente farmacéutico o fármaco " como se usa en la presente se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadadamente a un paciente. Otros términos químicos en la presente se usan de conformidad al uso convencional en el arte, como se ejemplifica por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed. , McGraw-Hill, San Francisco (1985)), incorporado en la presente para referencia) . El término "agente antineoplástico" se usa en la presente para referirse a agentes que tienen propiedad funcional para inhibir un desarrollo o progresión de un neoplasma en un humano, particularmente una lesión maligna (cancerosa) , tal como un carcinoma, sarcoma, limfoma, o leuceimia. La inhibición de la metástasis es frecuentemente una propiedad del agente antineoplásticos. Como se usa en la presente, "substancialmente puro" significa una especie objeto es la presente especie predominante (esto es, una base nomolar es más abundanteque cualquier otra especie individual en la composición) , y preferiblemente una fracción substancialmente purificada es una composición en donde las especies objeto comprende al menos alrededor de 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición substancialmente pura comprende más de alrededor de 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferiblemente más alrededor de 85%, 90%, 95%, 96, 97, 98, ó 99%. Más preferiblemente, las especies objeto se purifican hasta homogeneidad esencial (especies contaminantes no pueden detectarse en la composición por métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente de una especie macromolecular. El término paciente incluye sujetos humanos y animales . Los términos "mamífero" y "animal" para propósitos de tratamiento se refieren para cualquier animal clasificado como un mamífero, que incluye humanos, animales domésticos y de granja y de zoológico, deportivos o animales de mascotas tales como perro, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano. El término "estado de enfermedad" se refiere a un estado fisiológico de una célula o de un mamífero completo en el cual una interrupción, cese, o trastorno de funciones celulares o del cuerpo, sistemas u orgánicos se presenta. Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a medidas de tratamiento terapéutico, profiláctico o preventivo, en donde el objeto es prevenir o retardar (disminuir) un cambio fisiológico indeseado o trastorno, tal como el desarrollo o extensión del cáncer. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estabilización (esto es, sin empeoramiento) estado de la enfermedad, retraso o disminución de la progresión de la enfermedad, alivio o atenuación del estado de enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable. El "tratamiento" puede también significar supervivencia prolongada como se compara para la expectativa de supervivencia no se lleva a cabo el tratamiento. Aquellos que necesitan del tratamiento incluyen aquellos ya sea con la condición o trastorno, así como aquellos propuestos que tienen la condición o trastorno o aquellos en los cuales la condición o trastorno se previene. Un "trastorno" es cualquier condición que debería ser benéfica de uno o más tratamientos. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas que incluyen aquellas condiciones patológicas las cuales predisponen el mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos tratados en la presente incluyen tumores malignos y benignos, leucemias, y malignidades linfoides, en particular cáncer de mama, rectal, de ovarios, estómago, endometrial, glándula salival, riñon, colón, tiroides, pancreático, próstata o vejiga. Un trastorno preferido para tratarse de conformidad con la presente invención es un tumor maligno, tal como carcinomas cervicales y escamas intraepiteliales cervicales y neoplasia glandular, carcinoma de célula renal (RCC) , tumores esofagales y línea de célula derivadas de tumor . Una "enfermedad o condición relacionada a un polipéptido EGFr mutante" incluye uno o más de los siguientes: una enfermedad o condición causada por un polipéptido EGFr mutante; una enfermedad o condición contribuida por un polipéptido EGFr mutante; una enfermedad o condición que causa un polipéptido EGFr mutante; y una enfermedad o condición que se asocia con la presencia de un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, la enfermedad o condición se relaciona a un polipéptido EGFr mutante que puede existir en la ausencia del polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, la enfermedad o condición relacionada a un polipéptido EGFr mutante puede exacerbarse por la presencia de un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, una enfermedad o condición relacionada a un polipéptido EGFr mutante es un cáncer. Los cánceres ejemplares incluyen, pero no se limitan a, carcinomas de pulmón de célula no pequeña, mama, colón, gástrico, cerebro, vejiga, cabeza y cuello, ovario y próstata. Una "enfermedad o condición relacionada a un polipéptido PI3K mutante" incluye uno o más de los siguientes: una enfermedad o condición causada por un polipéptido PI3K mutante; una enfermedad o condición contribuida por un polipéptido PI3K mutante; una enfermedad o condición que causa un polipéptido PI3K mutante; y una enfermedad o condición que se asocia con la presencia de un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, la enfermedad o condición se relaciona a un polipéptido PI3K mutante que puede existir en la ausencia de la mutación. En ciertas modalidades, la enfermedad o condición se relaciona a un polipéptido PI3K mutante que puede exacerbarse por la presencia de un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, una enfermedad o condición relacionada a un polipéptido PI3K mutante es un cáncer. Los cánceres ejemplares incluyen, pero no se limitan a, carcinomas de pulmón de célula no pequeña, mama, colón, gástrico, cerebro, vejiga, cabeza y cuello, ovario, y próstata. Una "enfermedad o condición relacionada a un polipéptido B-Raf mutante" incluye uno o más de los siguientes: una enfermedad o condición causada por un polipéptido B-Raf mutante; una enfermedad o condición contribuida por un polipéptido B-Raf mutante; una enfermedad o condición que causa un polipéptido B-Raf mutante; y una enfermedad o condición que se asocia con la presencia de un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, la enfermedad o condición relacionada a un polipéptido B-Raf mutante puede existir en la ausencia de la mutación. En ciertas modalidades, la enfermedad o condición relacionada un polipéptido B-Raf mutante puede exacerbarse por la presencia de un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, una enfermedad o condición relacionada a un polipéptido B-Raf mutante es un cáncer. Los cánceres ejemplares incluyen, pero no se limitan a, carcinomas de pulmón de célula no pequeña, mama, colón, gástrico, cerebro, vejiga, cabeza y cuello, ovario, y próstata. En "terapia combinada", los pacientes se trataron con un agente de enlace específico para un antígeno objetivo en combinación con un agente quimioterapéutico o antineoplástico y/o terapia de radiación. El cáncer se trata bajo protocolo por la adición de un agente de enlace específico a un polipéptido EGFr mutante, un agente de enlace específico a un polipéptido PI3K mutante, y/o un agente de enlace específico a un polipéptido B-Raf mutante para terapia de primera y seguna línea estándar. Los diseños de protocolo se dirigen a la eficiencia cuando se evalúan por la reducción en masa de tumor así como la habilidad para reducir dosis usuales de quimioterapia estándar. Estas reducciones de dosis deberán permitir la terapia adicional y/o prolongada por reducir la toxicidad de dosis relacionada del agente quimioterapéutico. La "monoterapía" se refiere al tratamiento de un trastorno por administrar la inmunoterapia a pacientes sin un agente quimioterapéutico o antineoplástico de acompañamiento. Ciertas Modalidades Polipéptidos, Fragmentos, y Proteínas de Fusión En ciertas modalidades, una variante de eliminación es un fragmento de un polipéptido EGFr mutante de longitud completa. En ciertas modalidades, tal fragmento que corresponde a un epítopo de un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, tal fragmento se presenta naturalmente (por ejemplo, debido a la actividad de proteasa in vivo). En ciertas modalidades, tal fragmento es químicamente sintetizado. En ciertas modalidades, tal fragmento puede ligarse a un polipéptido para formar una proteína de fusión EGFr mutante. En ciertas modalidades, tal fragmento es de al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud. En ciertas modalidades, tal fragmento es de al menos 14, al menos 20, al menos 50, o al menos 70 aminoácidos de longitud. En ciertas modalidades, se proporciona una variante de eliminación que es un fragmento de un polipéptido PI3K mutante de longitud completa. En ciertas modalidades, tal fragmento corresponde a un epítopo de un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, tal fragmento es el que se presenta naturalmente (por ejemplo, debido a la actividad de proteasa in vivo). En ciertas modalidades, tal fragmento se sintetiza químicamente. En ciertas modalidades, tal fragmento puede ligarse a un polipéptido para formar una proteína de fusión PI3K mutante. En ciertas modalidades, tal fragmento es de al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de largo. En ciertas modalidades, tal fragmento es de al menos 14, al menos 20, al menos 50, ó al menos 70 aminoácidos de largo. En ciertas modalidades, se proporciona una variante de eliminación que es un fragmento de un polipéptido B-Raf mutante de longitud completa. En ciertas modalidades, tal fragmento corresponde a un epítopo de un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, tal fragmento es uno que se presenta naturalmente (por ejemplo, debido a la actividad de proteasa in vivo). En ciertas modalidades, tal fragmento se sintetiza químicamente. En ciertas modalidades, tal fragmento puede ligarse a un polipéptido para formar una proteína de fusión B-Raf mutante. En ciertas modalidades, tal fragmento es de al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de largo. En ciertas modalidades, tal fragmento es de al menos 14, al menos 20, al menos 50, ó al menos 70 aminoácidos de largo. En ciertas modalidades, un polipéptido mutante puede ligarse a al menos uno no proteínico. Tales grupos incluyen, pero no se limitan a, cadenas de carbohidratos ligadas a N o ligadas a 0, polímeros solubles en agua tales como polietilen glicol (PEG) , y derivados de los mismos (ver por ejemplo Patente de E.U.A. No. 4,179,337). Otras modificaciones químicas dentro del significado de este término incluyen, pero no se limitan a, copolímeros de etilen glicol/propilen glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, y moléculas relacionadas. En ciertas modalidades, un polipéptido EGFr mutante puede modificarse en posiciones aleatorias dentro de la molécula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y puede incluir una, dos, tres o más porciones químicas enlazadas. En ciertas modalidades, un polipéptido EGFr mutante también puede modificarse en posiciones predeterminadas en el polipéptido, tal como en la terminación amino, o en un residuo de lisina o arginina seleccionado dentro del polipéptido. Otras modificaciones químicas incluyen, pero no se limitan a, una etiqueta detectable, tal como una etiqueta enzimática, fluorescente, isotópica o de afinidad para permitir la detección y aislado del polipéptido EGFr mutante . En ciertas modalidades, el polipéptido PI3K mutante puede modificarse en posiciones aleatorias dentro de la molécula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y puede incluir una, dos, tres o más porciones químicas enlazadas. En ciertas modalidades, el polipéptido PI3K mutante también puede modificarse en posiciones predeterminadas en el polipéptido, tal como en la terminación amino, o en un residuo de lisina o arginina seleccionado dentro del polipéptido. Otras modificaciones químicas incluyen, pero no se limitan a, una etiqueta detectable, tal como una etiqueta enzimática, fluorescente, isotópica o de afinidad para permitir la detección y aislado del polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, el polipéptido B-Raf mutante puede modificarse en posiciones aleatorias dentro de la molécula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y puede incluir una, dos, tres o más porciones químicas enlazadas. En ciertas modalidades, el polipéptido B-Raf mutante también puede modificarse en posiciones predeterminadas en el polipéptido, tal como en la terminación amino, o en un residuo de lisina o arginina seleccionado dentro del polipéptido. Otras modificaciones químicas incluyen, pero no se limitan a, una etiqueta detectable, tal como una etiqueta enzimática, fluorescente, isotópica o de afinidad para permitir la detección y aislado del polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se proporciona la proteína de fusión EGFr mutante. En ciertas modalidades, un polipéptido EGFr mutante puede fusionarse a un polipéptido homólogo para formar un homodímero o al polipéptido heterólogo para formar un heterodímero. Los polipéptidos y péptidos heterólogos ejemplares incluyen, pero no se limitan a: un epítopo para permitir la detección y/o aislado de la proteína de fusión; una proteína del receptor de transmembrana o una porción del mismo, tal como un dominio extracelular, un dominio de transmembrana, o un dominio intracelular; un ligando o una porción del mismo que se enlaza a una proteína del receptor de transmembrana; una enzima o porción de la misma que se activa catalíticamente; un polipéptido que promueve la oligomerización, incluyendo, pero no se limita a un dominio de cremallera de leucina; un polipéptido que incrementa la estabilidad de la proteína de fusión, incluyendo, pero no se limita a, una región constante de inmunoglobulina; y un polipéptido que tiene una actividad terapéutica diferente de la del polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, un polipéptido EGFr mutante o proteína de fusión EGFr mutante puede ligarse a una metionina de terminal N, que puede ser útil para permitir la expresión en células procarióticas tales como E. coli . En ciertas modalidades, se proporciona la proteína de fusión PI3K mutante. En ciertas modalidades, el polipéptido PI3K mutante puede fusionarse a un polipéptido homólogo para formar un homodímero o al polipéptido heterólogo para formar un heterodímero. Los polipéptidos y péptidos heterólogos ejemplares incluyen, pero no se limitan a: un epítopo para permitir la detección y/o aislado de la proteína de fusión; una proteína del receptor de transmembrana o una porción del mismo, tal como un dominio extracelular, un dominio de transmembrana, o un dominio intracelular; un ligando o una porción del mismo que se enlaza a una proteína del receptor de transmembrana; una enzima o porción de la misma que se activa catalíticamente; un polipéptido que promueve la oligomerización, incluyendo, pero no se limita a un dominio de cremallera de leucina; un polipéptido que incrementa la estabilidad de la proteína de fusión, incluyendo, pero no se limita a, una región constante de inmunoglobulina; y un polipéptido que tiene una actividad terapéutica diferente de la del polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, el polipéptido P13K mutante o proteína de fusión P13K mutante puede ligarse a una metionina de terminal N, que puede ser útil para permitir la expresión en células procarióticas tales como E. coli . En ciertas modalidades, se proporciona la proteína de fusión B-Raf mutante. En ciertas modalidades, el polipéptido B-Raf mutante puede fusionarse a un polipéptido homólogo para formar un homodímero o al polipéptido heterólogo para formar un heterodímero. Los polipéptidos y péptidos heterólogos ejemplares incluyen, pero no se limitan a: un epítopo para permitir la detección y/o aislado de una proteína de fusión B-Raf mutante; una proteína del receptor de transmembrana o una porción del mismo, tal como un dominio extracelular, un dominio de transmembrana, o un dominio intracelular; un ligando o una porción del mismo que se enlaza a una proteína del receptor de transmembrana; una enzima o porción de la misma que se activa catalíticamente; un polipéptido que promueve la oligomerización, incluyendo, pero no se limita a un dominio de cremallera de leucina; un polipéptido que incrementa la estabilidad de la proteína de fusión, incluyendo, pero no se limita a, una región constante de inmunoglobulina; y un polipéptido que tiene una actividad terapéutica diferente de la del polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, el polipéptido B-Raf mutante o proteína de fusión B-Raf mutante puede ligarse a una metionina de terminal N, que puede ser útil para permitir la expresión en células procarióticas tales como E. coli . En ciertas modalidades, un polipéptido heterólogo u homólogo se fusiona a la terminal amino de un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, un polipéptido heterólogo u homólogo se fusiona a la terminal carboxi de un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, uno o más polipéptidos o péptidos heterólogos u homólogos se fusiona tanto a la terminal amino como carboxi de un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, un polipéptido se fusiona directamente a un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, un polipéptido se fusiona a un polipéptido EGFr mutante por medio de una molécula ligadora o adaptadora, como se conoce en la técnica. En ciertas de tales modalidades, la molécula ligadora o adaptadora se diseña para contener un sitio de desdoblamiento para una proteasa para permitir la separación de los polipéptidos fusionados. En ciertas modalidades, un polipéptido heterólogo u homólogo se fusiona a la terminal amino del polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, un polipéptido heterólogo u homólogo se fusiona a la terminal carboxi del polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, uno o más polipéptidos o péptidos heterólogos u homólogos se fusiona tanto a la terminal amino como carboxi del polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, un polipéptido se fusiona directamente al polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, un polipéptido se fusiona al polipéptido PI3K mutante por medio de una molécula ligadora o adaptadora, como se conoce en la técnica. En ciertas de tales modalidades, la molécula ligadora o adaptadora se diseña para contener un sitio de desdoblamiento para una proteasa para permitir la separación de los polipéptidos fusionados . En ciertas modalidades, un polipéptido heterólogo u homólogo se fusiona a la terminal amino del polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, un polipéptido heterólogo u homólogo se fusiona a la terminal carboxi del polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, uno o más polipéptidos heterólogos u homólogos se fusionan tanto a la terminal amino como carboxi del polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, un polipéptido se fusiona directamente al polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, un polipéptido se fusiona al polipéptido B-Raf mutante por medio de una molécula ligadora o adaptadora, como se conoce en la técnica. En ciertas de tales modalidades, la molécula ligadora o adaptadora se diseña para contener un sitio de desdoblamiento para una proteasa para permitir la separación de los polipéptidos fusionados. Vectores, Células Hospederas, Animales Transgénicos, y Producción y Purificación de Proteínas En ciertas modalidades, se proporciona un vector que comprende al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido EGFr mutante. En ciertas de tales modalidades, el polipéptido EGFr mutante comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12, y SEQ ID NO: 13. En ciertas modalidades, polipéptido EGFr mutante comprende al menos una mutación EGFr selecciona de: L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A. En ciertas modalidades, el vector es un vector de expresión.

En ciertas modalidades, se proporciona un vector que comprende al menos un polinucleótido que codifica el polipéptido PI3K mutante. En ciertas de tales modalidades, el polipéptido PI3K mutante comprende al menos una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17. En ciertas modalidades, el polipéptido PI3K mutante comprende al menos una mutación PI3K seleccionada de: E542K, E545A, y H1047L. En ciertas modalidades, el vector es un vector de expresión. En ciertas modalidades, se proporciona un vector que comprende al menos un polinucleótido que codifica el polipéptido B-Raf mutante. En ciertas de tales modalidades, el polipéptido B-Raf mutante comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20. En ciertas modalidades, el polipéptido B-Raf mutante comprende al menos una mutación B-Raf seleccionada de: V600E y K601E. En ciertas modalidades, el vector es un vector de expresión.

En ciertas modalidades, el vector de expresión puede contener un promotor que se reconoce por el organismo hospedero y se liga operablemente a una molécula de ácido nucleico que codifica un EGFr mutante. En ciertas modalidades, un promotor natural o heterólogo puede usarse dependiendo de la célula hospedera usada para la expresión y el rendimiento de la proteína deseada. Los promotores ejemplares para usarse con hospederos 7 procarióticos incluyen, pero no se limitan a, sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa; fosfatasa alcalina; un sistema promotor de triptofano (trp) ; y promotores híbridos tales como el promotor tac. En ciertas modalidades, pueden usarse otros promotores bacteriales conocidos. Las secuencias de promotores bacteriales conocidos se han publicado, por ello permitiendo que alguien experto en la técnica los ligue a las secuencias de ácido nucleico deseadas, usando ligadores o adaptadores como sea necesario para suministrar cualesquiera de los sitios de restricción deseados . Los promotores apropiados para usarse con hospederos de levadura también son bien conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, los potenciadores de levadura se usan ventajosamente con promotores de levadura. Los promotores apropiados para usarse con células hospederas de mamíferos son bien conocidos. Los promotores ejemplares para usarse con las células hospederas de mamífero incluyen, pero no se limitan a, aquellos obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, virus de viruela, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma de bovino, virus del sarcona de aves, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis B y más preferiblemente virus 40 de simio (SV40) . Los promotores mamíferos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, promotores mamíferos heterólogos. Los promotores mamíferos heterólogos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, promotores del choque de calor y el promotor de actina. Los promotores ejemplares que pueden usarse para expresar los polinucleótidos EGFr mutantes incluyen, pero no se limitan a, la región promotora temprana SV40 (Benoist and Chambón (1981), Nature, 290:304-310); el promotor CMV; el promotor contenido en la repetición de terminal de 3 ' de longitud del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al. (1980), Cell, 22: 787-97); el promotor de la timidina cinasa del herpes (Wagner et al. (1981), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 78: 1444-5); las secuencias reguladoras del gen de metalotionina (Brinster et al. (1982), Nature, 296: 39-42); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al. (1978), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 75: 3727-31); y el promotor tac (DeBoer, et al. (1983), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-25). En ciertas modalidades, una secuencia potenciadora puede incluirse en un vector para incrementar la transcripción en células hospederas eucarióticas . Las secuencias potenciadoras ejemplares de los genes de mamífero incluyen, pero no se limitan a, globina, elastasa, albúmina, proteína alfa-feto, e insulina. En ciertas modalidades, se usa un potenciador de un virus. Las secuencias potenciadoras ejemplares para la activación de promotores eucarióticos incluyen, pero no se limimtan a, el potenciador SV40, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma, y potenciadores de adenovirus. En ciertas modalidades, un potenciador puede dividirse en el vector en la posición 5' ó 3' para la región que codifica el polipéptido. En ciertas modalidades, el potenciador se localiza en el sitio 5' del promotor. En ciertas modalidades, el potenciador se localiza en el sitio 3' desde el extremo de la región que codifica el polipéptido . En ciertas modalidades, los vectores son aquellos que son compatibles con al menos una de las células hospederas de bacterias, insectos, y mamíferos. Los vectores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, pCRII, pCR3 , y pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, CA) , pBSII (Stratagene Company, La Jolla, CA) , pETl5 (Novagen, Madison, Wl) , pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA) , pETL (BlueBacll; Invitrogen), pDSR-alfa (Publicación PCT No. WO90/14363) y pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, NY) . Los vectores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cósmidos, plásmidos y virus modificados compatibles con la célula hospedera seleccionada. En ciertas modalidades, los vectores pueden incluir plásmidos incluyendo, pero no se limita a, derivados del plásmido Bluescript® (un fagémido basado en ColEl de número de copia superior, Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla CA) , plásmidos de clonación PCR diseñados para clonar productos PCR amplificados por Taq (por ejemplo, kit TOPO™ TA Cloning®, derivados de plásmido PCR2.1®, Invitrogen, Carlsbad, CA) , y vectores de mamíferos, levadura o virus tales como un sistema de expresión de baculovirus (derivados del plásmido pBacPAK, Clontech, Palo Alto, CA) . En ciertas modalidades, las moléculas recombinantes pueden introducirse en células hospederas por medio de transformación, transfección, infección, electroporación, u otras técnicas conocidas. El término "transfección" se refiere a la toma de un vector de expresión por una célula hospedera este expresada o no cualquier secuencia de codificación. Se conocen numerosos métodos de transfección para el técnico de habilidad ordinaria, incluyendo, pero no se limitan a, precipitación y electroporación CaP0 . En ciertas modalidades, la transfección exitosa se reconoce cuando cualquier indicación de la operación del vector transfectado se presenta dentro de la célula hospedera. En ciertas modalidades, las células hospederas pueden ser células hospederas procarióticas (tal como E. coli ) o células hospederas eucarióticas (tal como una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de vertebrado) . En ciertas modalidades, las células hospederas procarióticas tales como E. coli producen proteína no glicosilada; por ejemplo shBCMA no glicosilado y shTACI no glicosilado, que pueden poseer ventajas sobre las moléculas eucarióticas glicosiladas. En ciertas modalidades, la célula hospedera, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, expresa el polipéptido de la invención que puede posteriormente colectarse del medio de cultivo (si la célula hospedera secreta en el medio) o directamente de la célula hospedera que lo produce (si no se secreta) . En ciertas modalidades, la selección de una célula hospedera apropiada tomará en cuenta varios factores, tales como los niveles de expresión deseados, modificación de polipéptido que son deseables o necesarias para la actividad, tales como glicosilación o fosforilación, y/o facilidad de pliegue en una molécula biológicamente activa. Se conocen un número de células hospederas apropiadas en la técnica y muchas están disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. Las células hospederas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, células de mamíferos, tales como células de ovarios de hámster chino (CHO) (ATCC No. CCL61) células CHO DHFR (Urlaub et al. (1980), Proc. Nati. Acad. ScL USA 97, 4216-20), células de riñon embriónicas de humano (HEK) 293 ó 293T (ATCC No. CRL1573), y células 3T3 (ATCC No. CCL92). La selección de células hospederas de mamífero apropiadas y métodos para transformación, cultivo, amplificación, separación por exclusión y producción de producto y purificación se conocen en la técnica. Las células hospederas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, las líneas de células COS-7 y COS-1 (ATCC No. CRL1650) de mono (ATCC No. CRL1651) , y la línea celular CV-1 (ATCC No. CCL70) . Las células hospederas de mamífero ejemplares incluyen, pero no se limitan a, líneas de células de primate y líneas de células de roedores, incluyendo líneas de células transformantes. Las células hospederas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, células diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, líneas de células madre, y explantos primarios. En ciertas modalidades, las células candidato pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección que actúa dominantemente. Las células hospederas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, células N2A de neuroblastoma de ratón, HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones, Suizos, Balb-c o NIH, líneas de células de hámster BHK o HaK, que están disponibles de la American Type Culture Collection, Manassas, VA) . Cada una de estas líneas celulares se conoce por, y están disponibles para aquellos de experiencia en la técnica de la expresión de proteína. En ciertas modalidades, las células hospederas pueden ser células bacteriales. Las células hospederas bacteriales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, varias cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, (ATCC No. 33694) DH5a, DH10, y MC1061 (ATCC No. 53338)). Las células hospederas ejemplares también incluyen, pero no se limitan a, varias cepas de especies Pseudomonas, B. subtilis, otras especies Bacillus, y especies Streptomyces . Muchas cepas de células de levadura conocidas por aquellos expertos en la técnica también están disponibles como células hospederas para la expresión de polipéptidos. Ciertas de tales modalidades usan sistemas de expresión comercialmente disponibles, por ejemplo, el sistema de expresión Pichia (Invitrogen, San Diego, CA) , siguiendo las instrucciones del fabricante. En ciertas modalidades, tal sistema se apoya en la secuencia pre-pro-alfa para dirigir la secreción. En ciertas modalidades, la transcripción del inserto se conduce por el promotor de oxidasa de alcohol (AOXl) durante la inducción por metanol. En ciertas modalidades, la célula hospedera puede ser Saccharomyces cerivisae . En ciertas modalidades, los sistemas de células de planta pueden usarse como células hospederas . En ciertas de tales modalidades, los sistemas de células de planta transfectados con los vectores de expresión del virus (por ejemplo, virus de mosaico de la coliflor, CaMV, o virus de mosaico de tabaco) se usan. En ciertas modalidades, un polinucleótido que codifica un polipéptido EGFr mutante, el polipéptido PI3K mutante, y/o el polipéptido B-Raf mutante se clona en un vector de expresión de baculovirus, tal como pVLl393 (PharMingen, San Diego, CA) . En ciertas modalidades, tal vector puede usarse de conformidad con las direcciones del fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda en medio libre de proteína sF9 y para producir polipéptido recombinante. En ciertas modalidades, un polipéptido EGFr mutante, el polipéptido PI3K mutante, y/o el polipéptido B-Raf mutante se purifica y concentra de tal medio usando una columna de heparina-Sefarosa (Pharmacia) . En ciertas modalidades, los sistemas de células de insecto pueden usarse como células hospederas . Ciertos de tales sistemas se describen, por ejemplo, en Kitts et al. (1993), Biotechniques, 14: 810-7, Lucklow (1993), Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-72, y Lucklow et al. (1993), J. Virol., 67: 4566-79. Las células de insecto ejemplares incluyen, pero no se limitan a, Sf-9 y Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . En ciertas modalidades, la transformación o transfección de un polinucleótido que codifica un polipéptido EGFr mutante, el polipéptido PI3K mutante, y/o el polipéptido B-Raf mutante en células hospederas seleccionadas puede realizarse por métodos bien conocidos incluyendo métodos tales como cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección o el método DEAE-dextrano . En ciertas modalidades, el método seleccionado será parte de una función del tipo de célula hospedera a usarse. Estos métodos y otros métodos apropiados son bien conocidos por el técnico experto, y se establecen, por ejemplo, en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las células hospederas que comprenden (como por transformación o transfección) un vector de expresión que codifica un polipéptido EGFr mutante, el polipéptido PI3K mutante, y/o el polipéptido B-Raf mutante pueden cultivarse usando medio estándar bien conocido por el técnico experto. En ciertas modalidades el medio puede contener todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y supervivencia de las células. En ciertas modalidades, las células de E. coli pueden cultivarse en Caldo Luria (LB) y Caldo Terrífico (TB) . El medio ejemplar para cultivar células eucarióticas incluye, pero no se limitan a, RPMl 1640, MEM, DMEM, todos los cuales pueden complementarse con suero y/o factores de crecimiento de conformidad con la línea celular particular a cultivarse. En ciertas modalidades, las células de insecto pueden cultivarse en medio Grace complementado con levadurolato, hidrolisado de lactalbúmina, y/o suero de becerro fetal. En ciertas modalidades, un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de células transfectadas o transformadas se agrega como un complemento al medio. En ciertas modalidades, el compuesto a usarse se elige en vista del elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el cual la célula hospedera se transformó. En ciertas modalidades, donde el elemento marcador seleccionable es resistencia a la canamicina, el compuesto agregado al medio de cultivo será canamicina. Los compuestos ejemplares para crecimiento selectivo incluyen, pero no se limitan a, ampicilina, tetraciclina y neomicina. En ciertas modalidades, la cantidad del polipéptido EGFr mutante, el polipéptido PI3K mutante, y/o el polipéptido B-Raf mutante producida por la célula hospedera puede evaluarse usando métodos estándar conocidos en la técnica. Los métodos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, análisis Western blot, electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación CLAR, inmunoprecipitación, y ensayos de actividad. En ciertas modalidades, los polipéptidos EGFr mutantes, polipéptidos PI3K mutantes, y/o polipéptidos B-Raf mutantes que se expresan en células hospederas procarióticas pueden presentarse en forma soluble ya sea en el espacio periplásmico o en el citoplasma o en una forma insoluble como parte de cuerpos de inclusión intracelular. En ciertas modalidades, los polipéptidos EGFr mutantes, polipéptidos PI3K mutantes, y/o polipéptidos B-Raf mutantes pueden extraerse de la célula hospedera usando cualquier técnica estándar conocida por el técnico experto. En ciertas modalidades, las células hospederas pueden lisarse para liberar los contenidos del periplasma/citoplasma por prensa francesa, homogenización, y/o sonicación seguido por centrifugación. En ciertas modalidades, las formas solubles de polipéptidos EGFr mutantes, polipéptidos PI3K mutantes, y/o polipéptidos B-Raf mutantes presentes ya sea en el citoplasma o liberación del espacio periplásmico pueden además purificarse usando métodos conocidos en el arte. En ciertas modalidades, los polipéptidos EGFr mutantes, polipéptidos PI3K mutantes, y/o polipéptidos B-Raf mutantes se liberaron del espacio periplásmico bacterial por técnicas de choque osmótico. Si un polipéptido EGFr mutante, el polipéptido PI3K mutante, y/o el polipéptido B-Raf mutante forman cuerpos de inclusión, estos pueden frecuentemente enlazarse a las membranas celulares internas y/o externas y así deberán encontrarse primariamente en el material granulado después de la centrifugación. En ciertas modalidades, el material granulado puede luego tratarse a pH extremo o con un compañero caotrópico tal como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea, o derivados de urea en la presencia de un compañero reductor tal como ditiotreitol a un pH alcalino o tris carboxietil fosfina a pH ácido para liberar, romper y solubilizar los cuerpos de inclusión. En ciertas modalidades, el polipéptido EGFr mutante, el polipéptido PI3K mutante, y/o el polipéptido B-Raf mutante puede luego analizarse usando la electroforesis de gel, immunoprecipitación o similares. En ciertas modalidades, un polipéptido EGFr mutante, un polipéptido PI3K mutante, y/o un polipéptido B-Raf mutante puede aislarse usando métodos estándar tales como aquellos establecidos a continuación y en Marston et al. (1990), Meth. Enz . , 182: 264-75. En ciertas modalidades, un polipéptido EGFr mutante, un polipéptido PI3K mutante, y/o un polipéptido B-Raf mutante no pueden ser biológicamente activos durante el aislado. En ciertas modalidades, los métodos para "replegar" o convertir el polipéptido para sus estructuras terciarias y generar ligaduras de disulfuro, pueden usarse para restaurar la actividad biológica. En ciertas modalidades, la actividad biológica puede restaurarse por exponer la solubilidad del polipéptido hasta un pH usualmente arriba de 7 en la presencia de una concentración particular de un caotropo. La selección del caotropos es muy similar a la elección usada para la inclusión de la solubilización del cuerpo, pero, en ciertas modalidades, el caotropo se usa a una concentración baja y no es necesariamente la misma como los caotropos usados para la solubilización. En ciertas modalidades, la solución de replegado/oxidación deberá también contener un compañero de reducción o el compañero de reducción más su forma oxidada en un rango específico para generar un potencial redox particular permite que el mezclado de disulfuro se presente en la formulación de los puentes de cisteina de la proteína. Los acoplamiento redox ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cisteina/cistamina, glutationa (GSH) /ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol (DTT) /ditiano DTT, y 2-mercaptoetanol (bME) /ditio-b(ME) . En ciertas modalidades, un cosolvente puede usarse o puede necesitarse para incrementar la eficacia del replegado y los recompañeros ejemplares usados para este propósito incluyen, pero no se limitan a, glicerol, polietilen glicol de diversos pesos moleculares, arginina, y moléculas relacionadas . En ciertas modalidades, los polipéptidos EGFr mutantes, polipéptidos PI3K mutantes, y/o polipéptidos B-Raf mutantes pueden prepararse por los métodos de síntesis química. En ciertas modalidades, el método de síntesis química puede incorporar síntesis de péptido de fase sólida. En ciertas modalidades, los métodos de síntesis química puede usar técnicas conocidas en el arte tales como aquellas establecidas por Merrifield et al. (1963), J. Am. Chem. Soc, 85: 2149; Houghten et al. (1985), Proc Nati Acad. ScL USA, 82: 5132; and Stewart and Young (1984), Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. En ciertas modalidades, los polipéptidos pueden sintetizarse con o sin una metionina en la terminal amino. En ciertas modalidades, los polipéptidos EGFr mutantes, polipéptidos PI3K mutantes, y/o polipéptidos B-Raf mutantes químicamente sintetizados pueden oxidarse usando métodos establecidos en estas referencia para formar puentes de disulfuro. En ciertas modalidades, los polipéptidos EGFr mutantes, polipéptidos PI3K mutantes, y/o polipéptidos B-Raf mutantes se preparan reteniendo al menos una actividad biológica asociada con un polipéptido EGFr mutante, polipéptido PI3K mutante, y/o polipéptido B-Raf mutante producido por la naturaleza o recombinantemente . En ciertas modalidades, los animales transgénicos pueden usarse para expresar los polipéptidos EGFr mutantes, polipéptidos PI3K mutantes, y/o polipéptidos B-Raf mutantes. En ciertas modalidades, uno puede usar un animal transgénico que produce leche (una vaca o cabra, por ejemplo) y obtener un polipéptido EGFr mutante glicosilado, un polipéptido PI3K mutante glicosilado, y/o un polipéptido B-Raf mutante glicosilado en la leche del animal. En ciertas modalidades, las plantas se usaron para producir un polipéptido EGFr mutante glicosilado, un polipéptido PI3K mutante glicosilado, y/o un polipéptido B-Raf mutante glicosilado, como se conoce en la técnica. En ciertas modalidades, se purifica substancialmente un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se purifica substancialmente el polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, se purifica substancialmente el polipéptido B-Raf mutante. Ciertas técnicas de purificación de proteína se conocen por aquellos de habilidad en el arte. En ciertas modalidades, la purificación de la proteína involucra la fracción cruda de las fracciones del polipéptido a partir de las fraccione sin polipéptido. En ciertas modalidades, los polipéptidos se purifican usando técnicas cromatográficas y/o electroforéricas . Los métodos de purificación ejemplares incluyen, pero no se limitan a, precipitación con sulfato de amonio; precipitación con PEG; immunoprecipitación; desnaturalización con calor seguido por centrifugación; cromatografía; incluyendo, pero no limitando a, cromatografía de afinidad (por ejemplo, Proteína-A-Sefarosa) , cromatografía de intercambio de aniones, cromatografía de exclusión y cromatografía de fase inversa; filtración por gel; cromatografía de hidroxiapatita, enfoque isoeléctrico; electroforesis de poliacrilamida de gel; y combinaciones de tales y otras técnicas. En ciertas modalidades, un polipéptido se purificó por cromatografía líquida de proteína rápida opor cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) . En ciertas modalidades, las etapas de purificación pueden cambiarse o ciertas etapas pueden omitirse, y todavía resultar en un método adecuado para la preparación de un polipéptido substancialmente purificado.

En ciertas modalidades, un polipéptido EGFr mutante, un polipéptido PI3K mutante, y/o un polipéptido B-Raf mutante pueden prepararse con una o más etiquetas de afinidad, tales como hexahistidina u otros péptidos pequeños tales como FLAG (Eastman Kodak Co . , New Haven, CT) o myc (Invitrogen) ya sea en la terminal carboxilo o amino y se purifica por una columna de afinidad de una etapa. En ciertas modalidades, la polihistidina se enlaza con una mayor afinidad y especificidad al níquel, de esta manera una columna de afinidad de níquel (tal como las columnas de Qiagen® nickel) pueden usarse para purificación de compañeros de enlace específicos etiquetados con polihistidina. Ver por ejemplo, Ausubel et al., eds. (1993), Current Protocols in Molecular Biology, Sección 10.11.8, John Wiley & Sons, New York. En ciertas modalidades, más de una etapa de purificación puede usarse. En ciertas modalidades, se cuantifica el grado de purificación de una preparación de polipéptido. Ciertos métodos para cuantificar el grado de purificación se conocen por aquellos expertos en la técnica. Ciertos métodos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, determinar la actividad de enlace especifica de la preparación y evaluar la cantidad del polipéptido dentro de la preparación por análisis SDS/PAGE. Ciertos métodos ejemplares para evaluar la cantidad de purificación de la preparación de polipéptido comprende calcular la actividad de enlace de la preparación y compararla con la actividad de enlace de un extracto inicial . En ciertas modalidades, los resultados de tal calculo se expresan como "purificación de pliegue" . Las unidades usadas para representar la cantidad de actividad enlazada depende del ensayo particular relalizado. En ciertas modalidades, el polipéptido se purifica parcialmente. En ciertas modalidades, la purificación parcial puede relizarse al usar algunas etapas de purificación o al utilizar diferentes formas del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, en ciertas modalidades, una cromatografía de columna de intercambio de cationes realizada utilizando un aparato CLAR, generalmente resultara en una mayor "purificación de pliegue" que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía de baja presión. En ciertas modalidades, los métodos que resultan en un grado más bajo de purificación pueden tener ventaja en la recuperación total del polipéptido, o en mantener la actividad de enlace de un polipéptido. En ciertos casos, la migración electroforética del polipéptido puede variar, algunas veces de forma importante, con diferentes condiciones de SDS/PAGE. Ver, por ejemplo, Capaldi et al., Biochem Biophys\Res Comm, 76: 425 (1977). Se apreciara que bajo las condicionesde electroforesis diferentes, los pesos moleculares aparentes de polipéptidos parcialmente purificados o purificados pueden ser diferentes. Animales Transgénicos En ciertas modalidades, los animales no humanos transgénicos que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican a uno o más polipéptidos EGFr mutantes, uno o más polipéptidos PI3K mutantes, y/o uno o más polipéptidos B-Raf mutantes. En ciertas modalidades, los animales transgénicos no humanos incluyen, pero no se limitan a, roedores tales como ratones o ratas, conejos, cabras, ovejas, y otros animales de granja. Ciertos animales transgénicos pueden prepararse usando los métodos bien conocidos que incluyen, pero que no se limitan a, aquellos descritos en la Patente U.S. No. 5,489,743 y en la WO 94/28122. En ciertas modalidades, las regiones de control transcripcional animal que exhiben la especificidad del tejido pueden usarse para crear animales transgénicos. Las regiones de control transcripcional ejemplares para usarse con la expresión específica del tejido en animales transgénicos incluyen, pero no se limitan a, la región de control del gen elastasa I que es activa en las células acinar pancreáticas (Swift et al. (1984), Cell, 38: 639-46; Ornitz et al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol. 50: 399-409; MacDonald (1987), Hepatology, 7: :425-515); la región de control del gen de la insulina que es activa en las células beta pancreáticas (Hanahan (1985), Nature, 315: 115- 122) ; la región de control del gen de la inmunoglobulina que es activo en las células linfoides (Grosschedl et al. (1984), Cell, 38: 647-58; Adames et al. (1985), Nature, 318: 533-8; Alexander et al. (1987), Mol. Cell. Biol., 7: 1436-44); la región de control del virus del tumor mamario de ratón que es activo en mastocitos y células linfoide, de mama y testiculares (Leder et al. (1986), Cell, 45: 485-95); región de control del gen de albúmina que es activo en el hígado (Pinkert et al. (1987), Genes and Devel ., 1 : 268-76) ; la región de control del gen de alfafetoproteína que es activo en el hígado (Krumlauf et al. (1987), Mol. Cell. Biol., 5: 1639-48; Hammer et al., (1987), Science, 235: 53-58); la región de control del gen alfa 1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al. (1987), Genes and Devel ., 1 : 161-171); la región de control del gen beta-globina que es activo en las células mieloides (Mogram et al. (1985), Nature, 315: 338-340; Kollias et al. (1986), Cell, 46: 89-94); la región de control del gen de la proteína básica mielina que es activo en las células de oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al. (1987), Cell, 48:703-712); la región de control del gen 2 de cadena ligera de miosina que es activo en el músculo esquelético (Sani (1985), Nature, 314: 283-286); y la región de control del gen de la hormona que libera la gonadotropina que es activa en el hipotálamo (Masón et al . (1986), Science, 234: 1372-8).

En ciertas modalidades, se proporciona un animal no humano en el que un polinucleótido que codifica a un polipéptido EGFr del tipo silvestre se ha fragmentado (es decir, se ha "inactivado en un gen") y reemplazado con uno o más polinucleótidos que codifican a un polipéptido EGFr mutante tal que el nivel de expresión del polipéptido de tipo silvestre disminuya significativamente o se suprima completamente en el animal y el polipéptido EGFr mutante se exprese en el animal. En ciertas modalidades, los animales pueden prepararse usando técnicas y métodos tales como aquéllos descritos en la Patente U.S.. No. 5,557,032 u otras técnicas bien conocidas en el arte. En ciertas modalidades, se proporciona un animal no humano en el que la actividad del promotor para uno o más polipéptidos mutantes EGFr se modula (por ejemplo, usando métodos de recombinación homólogos conocidos en el arte) para alterar el nivel de expresión de uno o más polipéptidos EGFr mutantes. En ciertas tales modalidades, el nivel de expresión de un polipéptido EGFr mutante se incrementa. En ciertas modalidades, el nivel de expresión del polipéptido EGFr mutante disminuye. En ciertas modalidades, se proporciona un animal no humano en el que un polinucleótido que codifica a un polipéptido PI3K del tipo silvestre ha sido fragmentado (es decir, se ha "inactivado en un gen") y reemplazado con uno o más polinucleótidos que codifican a un polipéptido PI3K mutante tal que el nivel de expresión del polipéptido PI3K del tipo silvestre se disminuye significativamente o suprime completamente en el animal y el polipéptido PI3K mutante se expresa en el animal. En ciertas modalidades, los animales pueden prepararse usando técnicas y métodos como aquéllos descritos en la Patente U.S. No. 5,557,032 u otras técnicas bien conocidas en el arte. En ciertas modalidades, se proporciona un animal no humano en el que la actividad del promotor para uno o más polipéptidos PI3K mutantes isomodulados (por ejemplo, usando métodos de recombinación homólogos conocidos en el arte) para alterar el nivel de expresión de uno o más polipéptidos PI3K mutantes. En ciertas modalidades, el nivel de expresión del polipéptido PI3K mutante se incrementa. En ciertas modalidades, el nivel de expresión del polipéptido PI3K mutante se disminuye. En ciertas modalidades, ee proporciona un animal no humano en que un polinucleótido que codifica a un polipéptido del tipo silvestre B-Raf se ha fragmentado (es decir, se ha "inactivado en un gen") y reemplazado con uno o más polinucleótidos que codifican a un polipéptido B-Raf mutante tal que el nivel de expresión del polipéptido B-Raf de tipo silvestre se disminuye significativamente o se suprime completamente en el animal y el polipéptido B-Raf mutante se expresa en el animal. En ciertas modalidades, los animales pueden prepararse usando técnicas y métodos como los descritos en la Patente U.S. No. 5,557,032 u otras técnicas bien conocidas en el arte. En ciertas modalidades, se proporciona un animal no humano en el que la actividad del promotor para uno o más polipéptidos B-Raf mutantes se modula (por ejemplo, usando métodos de recombinación homólogos conocidos en el arte) para alterar el nivel de expresión de uno o más polipéptidos B-Raf mutantes. En ciertas modalidades, el nivel de expresión del polipéptido de B-Raf mutante se incrementa. En ciertas modalidades, el nivel de expresión del polipéptido B-Raf mutante se disminuye. En ciertas modalidades, un animal transgénico no humano puede usarse para separar por exclusión fármacos candidatos. En ciertas modalidades, se mide el impacto de un fármaco candidato en el animal transgénico no humano. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para incrementar la expresión de un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato de disminuir o prevenir la expresión de un polipéptido de EGFr mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato de aumentar la actividad de un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para disminuir o prevenir la actividad de un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para disminuir o prevenir la activación de un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para aumentar la activación de un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para disminuir o prevenir la autofosforilación de un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para incrementar la autofosforilación de un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para disminuir o prevenir el enlace de uno o más agentes de enlace específicos a un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para incrementar el enlace de uno o más agentes de enlace específicos a un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para mejorar una enfermedad o condición relacionada con el polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para mejorar un cáncer relacionado con el polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para incrementar la expresión de un polipéptido de PI3K mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para disminuir o prevenir la expresión de un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para incrementar la actividad de un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para disminuir o prevenir la actividad de un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para disminuir o prevenir activación de un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para incrementar activación de un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para disminuir o prevenir la autofosforilación de un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para incrementar autofosforilación de un polipéptido de PI3K mutante . En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para disminuir o prevenir el enlace de uno o más agentes de enlace específicos a un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para incrementar el enlace de uno o más agentes de enlace específicos a un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para mejorar una enfermedad o condición relacionada con un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para mejorar un cáncer relacionado con el polipéptido PI3K mutante.

En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para incrementar la expresión de un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para disminuir o prevenir la expresión de un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para incrementar la actividad de un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para disminuir o prevenir la actividad de un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para disminuir o prevenir activación de un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para incrementar la activación de un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para disminuir o prevenir autofosforilación de un polipéptido de B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para incrementar la autofosforilación de un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para disminuir o prevenir el enlace de uno o más agentes de enlace específicos a un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para incrementar el enlace de uno o más agentes de enlace específicos a un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para mejorar una enfermedad o condición relacionada con el polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se mide la capacidad de un fármaco candidato para mejorar un cáncer relacionado con el polipéptido B-Raf mutante. Agentes de enlace específicos y Anticuerpos En ciertas modalidades, se proporciona un agente de enlace específico a un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se proporciona un agente de enlace específico a un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, se proporciona un agente de enlace específico a un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, los agentes de enlace específicos son anticuerpos o fragmentos de los mismos que enlazan al antígeno. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales pueden hacerse usando el método del hibridoma descrito primero por Kohier et al., Nature 256: 495 (1975). En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales pueden hacerse mediante métodos de ADN recombinante (Patente U.S. No. 4,816,567) . En ciertas modalidades del método del hibridoma, un ratón u otro animal hospedero apropiado, que incluye, pero que no se limita a, un hámster o mono macaco, se inmuniza para extraer linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que enlazarán específicamente a la proteína usada para la inmunización. En ciertas modalidades, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. En ciertas modalidades, los linfocitos o linfocitos enriquecidos por células B se fusionan con las células del mieloma mediante un proceso de fusión electrolítica o usando un agente de fusión adecuados, tales como el polietilen glicol, para formar una célula del hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103, [Academia Press, 1996]). En ciertas modalidades, las células del hibridoma se siembran y se cosechan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más substancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células del mieloma paternal no fusionadas. En ciertas modalidades, si las células del mieloma paternales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de la cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT) , cuyas substancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT. En ciertas modalidades, las células del mieloma son seleccionadas de tal forma que puedan fusionarse eficazmente, sostengan la producción de anticuerpos en un nivel alto y estable mediante las células que producen el anticuerpo seleccionado y sean sensibles a un medio tal como el medio HAT. Ejemplos de líneas celulares del mieloma incluyen, pero no se limitan a, líneas de mieloma de murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOP-21 y MC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la Colección de Cultivo del Tipo Americano, Rockville, Maryland USA. En ciertas modalidades, el mieloma humano y/o líneas celular del heteromieloma de ratón humano se usan para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J., Immunol . 133: 3001 (1984); Brodeur et al . , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp . 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, [1987] ) . En ciertas modalidades, el medio de cultivo en el que las células del hibridoma se hacen crecer se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. En ciertas modalidades, la especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producidos por las células del hibridoma se determinan por la inmunoprecipitación o por un ensayo de enlace in vitro. Los ensayos de enlace ejemplares incluyen, pero no se limita a, un radioinmunoensayo (RÍA) , un ensayo inmunosorbente enlazado a la enzima (ELISA) , y el análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220 (1980) . En ciertas modalidades, después de que se identifican las células del hibridoma, que producen anticuerpos de la especificidad deseada, afinidad, y/o actividad, las células pueden ser subclonadas limitando los procedimientos de dilución y de crecimiento mediante métodos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103, Academia Press, 1996). Ejemplos de medio de cultivo para este propósito incluyen, pero no se limitan a, DMEM y medio RPMI-1640. En ciertas modalidades, las células del hibridoma pueden hacerse crecer in vivo como tumores por ascitis en un animal. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones están adecuadamente separados del medio de cultivo, fluido de ascitos, o suero mediante procedimientos de purificación de la inmunoglobulina convencionales como por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis por gel, diálisis, o cromatografía de afinidad. En ciertas modalidades, un polinucleótido que codifica a los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se forman secuencias usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas del oligonucleótido que son específicamente capaces de enlazar específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales) . En tales modalidades, las células del hibridoma sirven como una fuente preferida de tal polinucleótido. En ciertas modalidades, los polinucleótido aislados pueden colocarse en los vectores de expresión. En ciertas modalidades, los vectores de expresión se transfectan en células hospedadoras para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. Ejemplos de células hospedadoras incluyen, pero no se limitan a, células E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) , o células del mieloma que por el contrario no producen la proteína de la inmunoglobulina. En ciertas modalidades, los polinucleótidos pueden modificarse, por ejemplo, mediante la unión covalente a toda o parte de la secuencia que codifica a un polipéptido sin inmunoglobulina, creando un anticuerpo "quimérico" o "híbrido". En ciertas modalidades, los polipéptidos sin inmunoglobulina se sustituyen para los dominios constantes de un anticuerpo. En ciertas modalidades, los polipéptidos sin inmunoglobulina se sustituyen para los dominios variables de uno de los sitios que combinan antígenos, de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio que combina antígenos, que tiene especificidad para un antígeno dirigido y sitio que combina antígenos, que tiene especificidad para un antígeno diferente. En ciertas modalidades, pueden prepararse anticuerpos quiméricos o híbridos in vitro usando métodos conocidos en la química de las proteínas sintéticas, que incluyen, pero que no se limitan a, aquellos que incluyen agentes de reticulación. En ciertas modalidades, las inmunotoxinas pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace de tioéter. Ejemplos de reactivos para este propósito incluyen, pero no se limitan a, iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato. En ciertas modalidades, se proporcionan anticuerpos humanos a un antígeno objetivo. En ciertas modalidades, la tecnología del hibridoma se extiende para crear anticuerpos humanos que usan heteromielomas (mielomas híbridos ratón x humanos) como los compañeros de fusión (ver por ejemplo, Kozbor, J., Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987). En ciertas modalidades, las células que secretan anticuerpos humanos pueden inmortalizarse mediante la infección con el virus de Epstein-Barr (EBV) (James y Campanilla, J., Immunol . Methods 100: 5-40 [1987]). En ciertas modalidades, la inmortalización de las células B humanas puede lograrse mediante la introducción de una combinación definida de genes que se transforman (Hahn et al., Nature 400: 464-468 [1999]). En ciertas modalidades, los animales transgénicos (por ejemplo, los ratones) que son capaces, luego de la inmunización, de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena se usan para elaborar anticuerpos humanos (ver, por ejemplo, Jakobovits et al, Nature 362: 255 - 258 [1993]; Lonberg y Huszar, Int. Rev. Immunol . 13: 65-93 [1995]; Fishwild et al., Nat. Biotechnol. 14: 845-851 [1996]; Méndez et al, Nat. Genet. 15: 146-156 [1997]; Green, J., Immunol . Methods 231: 11-23 [1999]; Tomizuka et a I., Proc. Nati. Acad. Sci USA. 97: 722-727 [2000]; revisada en Little et al., Immunol . Today 21: 364-370 [2000]). Se ha descrito que la supresión de homocigoto del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes de línea germinal y quimérica resulta en una inhibición completa de producción del anticuerpo endógena (Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. ScL USA 90: 2551-2555 [1993]). La transferencia de la matriz de gen de inmunoglobulina de línea germinal humana en tal línea germinal del ratón mutante resulta en la producción de anticuerpos humanos luego de la prueba inmunogénica del antígeno (Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 [1993]). Méndez et al. (Nature Genetics 15: 146-156 [1997]) ha generado una línea de ratones transgénicos designada como "Xenomouse®ll" que, cuando se somete a una prueba inmunogénica con un antígeno, genera una alta afinidad completa en anticuerpos humanos . Esto se logró por la integración de la línea germinal de la megabase de los lugares cromosomales de cadena pesada y ligera humano en ratones con supresión en el segmento JH endógeno. El XenoMouse® II alberga 1,020 kb de lugares de cadena pesada humana que contienen aproximadamente 66 genes de VH, regiones JH y DH completas y tres regiones constantes diferentes (µ, d y ?) , también alberga 800 kb del lugar K humano que contiene 32 genes VK, segmentos JK y genes CK. En ciertas modalidades, los anticuerpos producidos en esos ratones se parecen mucho a aquéllos vistos en humanos en todos los respectos, incluyendo la reestructuración del gen, ensamble y repertorio. En ciertas modalidades, los anticuerpos humanos se expresan preferencialmente sobre anticuerpos endógenos debido a una supresión en el segmento JH endógeno que evita la reestructuración del gen en el lugar murino. En ciertas modalidades, un animal transgénico que comprende los genes de la inmunoglobulina humana (por ejemplo, el Xenomouse® II (Abgenix, Inc.)) puede inmunizarse con un antígeno de interés particular, tal como un polipéptido mutante EGFr, un polipéptido PI3K mutante, y/o un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, el suero de aquellos animales inmunizados se separa por exclusión para la reactividad del anticuerpo contra el antígeno inicial. En ciertas modalidades, los linfocitos se aislan de los ganglios linfáticos o células del bazo y pueden enriquecerse además por células B seleccionando células CDl38-negativas y células CD19+. En ciertas modalidades, aquellos cultivos celulares B (BCCs) se fusionan a las células del mieloma para generar hibridomas como se detalla anteriormente. En ciertas modalidades, esos cultivos celulares B se separan por exclusión además para la reactividad contra el antígeno inicial. Tal separación por exclusión incluye pero no se limita a, ELISA, un ensayo de competición con anticuerpos conocidos que enlazan al antígeno de interés, e in vitro que enlaza a células CHO transfectadas temporalmente que expresan al antígeno. En ciertas modalidades, únicamente las células B que secretan anticuerpos de interés son identificadas por un ensayo de placa hemolítico específico. En ciertas modalidades, las células dirigidas por lisis son células sanguíneas rojas de ovejas (SRBCs) cubiertas con el antígeno. En ciertas modalidades, la formación de una placa indica la lisis mediada por el antígeno específico de las células dirigidas, y por lo tanto, la presencia de un cultivo celular B que secreta la inmunoglobulina de interés y su complemento. En ciertas modalidades, la única célula del plasma de antígeno específico en el centro de la placa puede aislarse y usarse para el aislamiento del mRNA . En ciertas modalidades, los polinucleótidos que codifican a la región variable del anticuerpo secretada puede clonarse usando PCR de transcriptasa inversa. En ciertas modalidades, el polinucleótido clonado se inserta además en un vector de expresión adecuado, tal como un cásete vector tal como un pcD?A, o un vector pcD?A que contiene los dominios constantes de la cadena ligera y pesada de la inmunoglobulina. En ciertas modalidades, el vector generado se transfecta en las células hospedadoras, (es decir, las células CHO) , y cultivadas en medios nutrientes convencionales modificados como sea apropiado para inducir a los promotores, seleccionando los transformantes, o amplificando a los genes que codifican las secuencias deseadas. En ciertas modalidades, la tecnología de despliegue de fagos se usa para producir los anticuerpos humanos y los fragmentos del anticuerpo in vitro, a partir de los repertorios del gen dominio (V) variable de inmunoglobulina (V) de los donadores no inmunizados (ver, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552-553 [1990]; revisar en Kipriyanov and Little, Mol. Biotechnol. 12: 173-201 [1999]; Hoogenboom and Chames, Immunol . Today 21: 371-378 [2000]). En ciertas modalidades, los genes del dominio V del anticuerpo se clonan en la estructura ya sea en un gen de proteína de cubierta mayor o menor a partir de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se muestra como fragmentos del anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula del fago. En ciertas modalidades, la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola hebra del genoma del fago y selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la selección del gen que codifica al anticuerpo que exhibe esas propiedades. El despliegue de fagos puede realizarse en una variedad de formatos, qµe incluyen, pero no se limitan a, aquéllos identificados en los siguientes documentos: Johnson y Chiswell, Current Opinión in Structural Biology 3: 564-571 [1993)]; Winter et al., Annu. Rev. Immunol . 12: 433-455 [1994]; Dall'Acqua y Cárter, Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 443-450 [1998]; y Hoogenboom y Chames, Immunol . Today 21: 371-378 [2000] . Fuentes de segmentos del gen V para el despliegue de fagos incluyen, pero no se limita a, una colección combinatoria aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados (Clackson et al., (Nature 352: 624-628 [1991]) y un repertorio de genes V de donadores humanos no inmunizados (Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), o Griffiths et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)). En ciertas modalidades, en una respuesta inmune natural, los genes del anticuerpo acumulan mutaciones en una alta proporción (hipermutación somática) . En ciertas modalidades, algunos de los cambios introducidos confieren afinidad superior. En ciertas modalidades, las células B que despliegan inmunoglobulina en la superficie de alta afinidad preferentemente se replican y se diferencian durante la prueba inmunogénica del antígeno subsiguiente. En ciertas modalidades, el proceso natural puede imitarse empleando la técnica conocido como "mezclado de la cadena" (Marks et al., Bio/Technol. 10: 779-783 [1992]). En ciertas modalidades, la afinidad de los anticuerpos humanos "primarios" obtenida por el despliegue de fagos puede ser mejorada reemplazando secuencialmente los genes de región V de cadena ligera y pesada con los repertorios de variantes qµe ocurren naturalmente (repertorios) de genes de dominio V obtenidos de donadores no inmunizados, permitiendo la producción de anticuerpos y fragmentos del anticuerpo con las afinidades en el rango nM. En ciertas modalidades, se construye un repertorio de anticuerpos de fago muy grande (también conocido como "la madre de todas las colecciones") como se describe en Waterhouse et al., Nucí. Acid. Res. 21: 2265-2266 (1993). En ciertas modalidades, un anticuerpo humano de afinidad alta se aisla directamente de una colección de fago amplia (ver, por ejemplo, Griffiths et al., EMBO J. 13: 3245-3260 (1994)). En ciertas modalidades, puede usarse el mezclado de genes para derivar los anticuerpos humanos de anticuerpos roedores dónde el anticuerpo humano tiene afinidades similares y especificidades al anticuerpo roedor de inicio. En ciertas modalidades, el gen de dominio V de cadena pesada o ligera de anticuerpos roedores obtenido por la técnica de despliegue de fagos se reemplaza con un repertorio de genes de dominio V humanos, creando quimeras de roedor humanas (también llamadas "impresión del epítopo"). En ciertas modalidades, la selección de regiones variables por el antígeno resulta en el aislamiento de regiones variables humanas capaces de restaurar un sitio que enlaza al antígeno funcional, es decir, el epítopo gobierna (las impresiones) la elección del compañero. En ciertas modalidades, cuando el proceso se repite para reemplazar el dominio V roedor restante, se obtiene un anticuerpo humano qué no tiene ninguna estructura o residuos CDR de origen roedor (ver la Solicitud de patente PCT WO 93/06213, publicada el 1 de Abril de 1993) . Configuraciones En ciertas modalidades, se proporcionan microconfiguraciones que comprenden uno o más polinucleótidos, que codifican a uno o más polipéptidos EGFr mutantes. En ciertas modalidades, se proporcionan microconfiguraciones que comprenden uno o más polinucleótidos complementarios a uno o más polinucleótidos que codifican a uno o los polipéptidos de EGFr más mutante. En ciertas modalidades, se proporcionan microconfiguraciones que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican a uno o más polipéptidos PI3K mutantes. En ciertas modalidades, se proporcionan microconfiguraciones que comprenden uno o más polinucleótidos complementarios a uno o más polinucleótidos que codifican a uno o más polipéptidos PI3K mutantes. En ciertas modalidades, se proporcionan microconfiguraciones qµe comprenden uno o más polinucleótidos que codifican a uno o más polipéptidos B-Raf mutantes. En ciertas modalidades, se proporcionan microconfiguraciones que comprenden uno o más polinucleótidos complementarios a uno o más polinucleótidos que codifican a uno o más polipéptidos B-Raf mutantes. En ciertas modalidades, la presencia o ausencia de uno o más polinucleótidos EGFr mutantes en dos o más células o muestras de tejido se evalúan usando la tecnología de la microconfiguración. En ciertas modalidades, la cantidad de uno o más polinucleótidos EGFr mutantes en dos o más células o muestras de tejido se evalúan usando la tecnología de la microconfiguración. En ciertas modalidades, la célula o el tejido se trata previo a la valoración, y la capacidad del tratamiento para afectar la cantidad de uno o más polinucleótidos EGFr mutantes también se evalúa. En ciertas modalidades, la presencia o ausencia de uno o más polinucleótidos PI3K mutantes en dos o más células o muestras de tejido se evalúan usando la tecnología de la microconfiguración. En ciertas modalidades, la cantidad de uno o más polinucleótidos PI3K mutantes en dos o más células o muestras de tejido se evalúan usando la tecnología de la microconfiguración. En ciertas modalidades, la célula o el tejido se trata anterior a la valoración, y la capacidad del tratamiento para afectar la cantidad de uno o más polinucleótidos PI3K mutantes también se evalúa. En ciertas modalidades, la presencia o ausencia de uno o más polinucleótidos B-Raf mutante en dos o más células o muestras de tejido se evalúan usando la tecnología de la microconfiguración. En ciertas modalidades, la cantidad de uno o más polinucleótidos B-Raf mutante en dos o más células o muestras del tejido se evalúan usando la tecnología de la microconfiguración. En ciertas modalidades, la célula o el tejido se trata previo a la valoración, y la capacidad del tratamiento para afectar la cantidad de uno o más polinucleótidos B-Raf mutante también se evalúa. En ciertas modalidades, la presencia o ausencia de uno o más polipéptidos EGFr mutantes en dos o más células o muestras de tejido se evalúan usando la tecnología de la microconfiguración. En ciertas modalidades, el mRNA se extrae primero de una célula o muestra de tejido y se convierte subsecuentemente a un cDNA qµe se hibridiza a la microconfiguración. En ciertas modalidades, la presencia o ausencia de cDNA qµe se enlaza específicamente a la microconfiguración es indicativo de la presencia o ausencia del polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, el nivel de la expresión de uno o más polipéptidos EGFr mutantes se evalúa por la cuantificación de la cantidad de cDNA que se enlaza específicamente a la microconfiguración. En ciertas modalidades, la célula o el tejido se trata previo a la valoración, y la capacidad del tratamiento para afectar la expresión de uno o más polipéptidos EGFr mutantes también se 2 evalúa . En ciertas modalidades, la presencia o ausencia de uno o más polipéptidos PI3K mutantes en dos o más células o muestras de tejido se evalúan usando la tecnología de la microconfiguración. En ciertas modalidades, el mRNA se extrae primero de una célula o muestra del tejido y se convierte subsecuentemente a cD?A que hibridiza a la microconfiguración. En ciertas modalidades, la presencia o ausencia de cD?A que se enlaza específicamente a la microconfiguración es indicativo de la presencia o ausencia del polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, el nivel de la expresión de uno o más polipéptidos PI3K mutantes se evalúa por la cuantificación de la cantidad de cD?A qµe se enlaza específicamente a la microconfiguración. En ciertas modalidades, la célula o el tejido se tratan previos a la valoración, y la capacidad del tratamiento para afectar la expresión de uno o más polipéptidos PI3K mutantes también se evalúa . En ciertas modalidades, la presencia o ausencia de uno o más polipéptidos B-Raf mutantes en dos o más células o muestras del tejido se evalúan usando la tecnología de la microconfiguración. En ciertas modalidades, el mRNA se extrae primero de una célula o muestra del tejido y se convierte subsecuentemente a cD?A qµe se hibridiza a la microconfiguración. En ciertas modalidades, la presencia o ausencia de cDNA que se enlaza específicamente a la microconfiguración es indicativo de la presencia o ausencia del polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, el nivel de expresión de uno o más polipéptidos B Raf mutantes se evalúa por la cuantificación de la cantidad de cDNA que se enlaza específicamente a la microconfiguración. En ciertas modalidades, la célula o tejido se trata previo a la valoración, y la capacidad del tratamiento para afectar la expresión de uno o más polipéptidos B-Raf mutante también se evalúa. En ciertas modalidades, se proporcionan microconfiguraciones que comprenden uno o más polipéptidos EGFr mutantes (ver, por ejemplo, McBeath et al., Science, 289:1760-1763, 2000). En ciertas modalidades, agentes candidato específicos que se enlazan a uno o más polipéptidos EGFr mutantes se separan por exclusión usando una microconfiguración del polipéptido mutante EGFr. En ciertas modalidades, los compuestos candidato qµe modulan la actividad de un polipéptido EGFr mutante se protegen usando una microconfiguración del polipéptido mutante EGFr. En ciertas modalidades, se evalúa la capacidad de compuestos candidato para disminuir o prevenir la autofosforilación de polipéptidos EGFr mutante. En ciertas modalidades, se evalúa la capacidad de compuestos candidato para incrementar la autofosforilación de polipéptidos de EGFr mutante.

En ciertas modalidades, se proporcionan microconfiguraciones que comprenden uno o más polipéptidos PI3K mutantes (vea, por ejemplo, McBeath et al., Science, 289:1760-1763, 2000). En ciertas modalidades, los agentes candidato específicos se enlazan a uno o más polipéptidos PI3K mutantes separados por exclusión usando una microconfiguración del polipéptido mutante PI3K. En ciertas modalidades, los compuestos candidato para modular la actividad de un polipéptido PI3K mutante se separa por exclusión usando una microconfiguración del polipéptido mutante PI3K. En ciertas modalidades, se evalúa la capacidad de compuestos candidato para disminuir o prevenir la autofosforilación de polipéptidos PI3K mutante. En ciertas modalidades, se evalúa la capacidad de compuestos candidato para incrementar la autofosforilación de polipéptidos PI3K mutantes . En ciertas modalidades, se proporcionan microconfiguraciones que comprenden uno o más polipéptidos B-Raf mutantes (ver, por ejemplo, McBeath et al., Science, 289:1760-1763, 2000). En ciertas modalidades, los agentes candidato específicos que se enlazan a uno o más polipéptidos B-Raf mutantes se separan por exclusión usando una microconfiguración del polipéptido mutante B-Raf. En ciertas modalidades, los compuestos candidato que modulan la actividad de un polipéptido B-Raf mutante se separan por exclusión usando una microconfiguración del polipéptido mutante B-Raf. En ciertas modalidades, se evalúa la capacidad de compuestos candidato para disminuir o prevenir la autofosforilación de polipéptidos B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se evalúa la capacidad de compuestos candidato para incrementar la autofosforilación de polipéptidos B-Raf mutantes . En ciertas modalidades, se proporcionan las microconfiguraciones que comprenden uno o más agentes específicos que se enlazan a uno o más polipéptidos EGFr mutantes. En ciertas modalidades, se evalúa la presencia o ausencia de uno o más polipéptidos EGFr mutantes en una célula o tejido. En ciertas modalidades, se evalúa la cantidad de uno o más polipéptidos EGFr mutantes en una célula o el tejido. En ciertas modalidades, se proporcionan microconfiguraciones qµe comprenden uno o más agentes de enlace más específicos a uno o más polipéptidos PI3K mutantes. En ciertas modalidades, se evalúa la presencia o ausencia de uno o más polipéptidos PI3K mutantes en una célula o tejido. En ciertas modalidades, se evalúa la cantidad de uno o más polipéptidos PI3K mutantes en una célula o el tejido. En ciertas modalidades, se proporcionan microconfiguraciones que comprenden uno o más agentes específicos que se enlazan a uno o más polipéptidos B-Raf mutantes. En ciertas modalidades, se evalúa la presencia o ausencia de uno o más polipéptidos B-Raf mutantes en una célula o tejido. En ciertas modalidades, se evalúa la cantidad de uno o más polipéptidos B-Raf mutantes en una célula o el tejido. Ciertos Métodos En ciertas modalidades, se proporciona un método para obtener un anticuerpo capaz de enlazar al menos un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se proporciona un método para obtener un anticuerpo capaz de enlazar por lo menos un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, se proporciona un método para obtener un anticuerpo capaz de enlazar por lo menos un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se proporciona un método para obtener un anticuerpo capaz de enlazar por lo menos un polipéptido EGFr mutante, que comprende administrar por lo menos un polipéptido EGFr mutante a un animal, y obtener un anticuerpo capaz de enlazar por lo menos un polipéptido EGFr mutante del animal. En ciertas modalidades, se proporciona un método para obtener un anticuerpo capaz de enlazar por lo menos un polipéptido PI3K mutante, que comprende administrar por lo menos un polipéptido PI3K mutante a un animal, y obtener un anticuerpo capaz de enlazar por lo menos a un polipéptido PI3K mutante del animal. En ciertas modalidades, se proporciona un método para obtener un anticuerpo capaz de enlazar por lo menos un polipéptido B-Raf mutante, que comprende administrar por lo menos un polipéptido B-Raf mutante a un animal, y obtener un anticuerpo capaz de enlazar a por lo menos un polipéptido B-Raf mutante del animal. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En ciertas modalidades, un método para obtener un anticuerpo capaz de enlazar por lo menos a un polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y se proporciona la SEQ ID NO: 20, que comprende administrar por lo menos a un polipéptido que comprende por lo menos una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y la SEQ ID NO: 20 a un animal; y se proporciona obtener un anticuerpo capaz de enlazar a por lo menos un polipéptido que comprende al menos una secuencia del aminoácido seleccionado de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y la SEQ ID NO: 20 del animal. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En ciertas modalidades, un método para obtener un anticuerpo capaz de enlazar a por lo menos un polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y se proporciona la SEQ ID NO: 20, que comprende administrar por lo menos un fragmento de por lo menos un polipéptido que comprende por lo menos una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y la SEQ ID NO: 20 a un animal, en donde por lo menos un fragmento comprende por lo menos una mutación; y se proporciona obtener un anticuerpo capaz de enlazar por lo menos a un polipéptido que comprende por lo menos una secuencia del aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, y la SEQ ID NO: 20 del animal. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En ciertas modalidades, se proporciona un método para diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada con una o más mutaciones EGFr en un sujeto. En ciertas modalidades, se proporciona un método para diagnosticar una enfermedad o condición qµe está relacionada con uno o más mutaciones PI3K en un sujeto. En ciertas modalidades, se proporciona un método para diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada con uno o más mutaciones B-Raf en un sujeto. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada con una o más mutaciones EGFr en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión de un polipéptido EGFr mutante en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada con una o más mutaciones EGFr basadas en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar una enfermedad o condición qµe está relacionada a uno o más mutaciones EGFr en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de transcripción o traducción de un polinucleótido EGFr mutante en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones EGFr basadas en la presencia o cantidad de transcripción o traducción del polinucleótido. En ciertas modalidades, la enfermedad o la condición es el cáncer. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones EGFr en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión de un polipéptido que comprende por lo menos una secuencia del aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, y la SEQ ID NO: 13 en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar una enfermedad o condición qµe está relacionada a uno o más mutaciones EGFr basadas en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a uno o más mutaciones EGFr en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de transcripción o traducción de un polinucleótido que codifica a por lo menos una secuencia del aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, y la SEQ ID NO: 13 en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a uno o más mutaciones EGFr basadas en la presencia o cantidad de transcripción o traducción del polinucleótido. En ciertas modalidades, la enfermedad o condición es el cáncer.

En ciertas modalidades, se proporciona un método para diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones PI3K en un sujeto. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones de PI3K en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión de un polipéptido PI3K mutante en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a uno o más mutaciones PI3K basadas en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a uno o más mutaciones PI3K en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de transcripción o traducción de un polinucleótido PI3K mutante en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a uno o más mutaciones PI3K basadas en la presencia o cantidad de transcripción o traducción del polinucleótido. En ciertas modalidades, la enfermedad o la condición es el cáncer. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar una enfermedad o condición qµe está relacionada a una o más mutaciones PI3K en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión de un polipéptido que comprende por lo menos una secuencia del aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y la SEQ ID NO: 17 en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones PI3K basadas en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a uno o más mutaciones PI3K en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de transcripción o traducción de un polinucleótido que codifica por lo menos a una secuencia del aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y la SEQ ID NO: 17 en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones PI3K basadas en la presencia o cantidad de transcripción o traducción del polinucleótido. En ciertas modalidades, la enfermedad o la condición es el cáncer. En ciertas modalidades, se proporciona un método para diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf en un sujeto. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión de un polipéptido B-Raf mutante en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar una enfermedad o condición qµe está relacionada a una o más mutaciones B-Raf basadas en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de transcripción o traducción de un polinucleótido B-Raf mutante en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf basadas en la presencia o cantidad de transcripción o traducción del polinucleótido. En ciertas modalidades, la enfermedad o la condición es el cáncer. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión de un polipéptido que comprende por lo menos una secuencia del aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO : 19, y la SEQ ID NO: 20 en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf basadas en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar una enfermedad o condición qµe está relacionada a una o más mutaciones B-Raf en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de transcripción o traducción de un polinucleótido que codifica a por lo menos una secuencia del aminoácido seleccionadas de la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20 en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar una enfermedad o condición qµe está relacionada a una o más mutaciones B-Raf basadas en la presencia o cantidad de transcripción o traducción del polinucleótido. En ciertas modalidades, la enfermedad o la condición es el cáncer. En ciertas modalidades, se proporciona un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición qµe está relacionada a una o más mutaciones EGFr en un sujeto. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones de EGFr en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión de un polipéptido EGFr mutante en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones EGFr basadas en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones EGFr en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de transcripción o traducción de un polinucleótido EGFr mutante en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones EGFr basadas en la presencia o cantidad de transcripción o traducción del polinucleótido. En ciertas modalidades, la enfermedad o la condición es el cáncer. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones EGFr en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión de un polipéptido qµe comprende por lo menos una secuencia del aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, y SEQ ID NO: 13 en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición qµe está relacionada a una o más mutaciones EGFr basadas en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que se relaciona a una o más mutaciones EGFr en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de transcripción o traducción de un polinucleótido qµe codifica por lo menos a una secuencia del aminoácido seleccionadas de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 12, y SEQ ID NO: 13 en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones EGFr basadas en la presencia o cantidad de transcripción o traducción del polipéptido. En ciertas modalidades, la enfermedad o la condición es el cáncer. En ciertas modalidades, se proporciona un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones PI3K en un sujeto. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones de PI3K en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión de un polipéptido PI3K mutante en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones PI3K basadas en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones PI3K en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de transcripción o traducción de un polinucleótido PI3K mutante en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones PI3K basadas en la presencia o cantidad de transcripción o traducción del polinucleótido. En ciertas modalidades, la enfermedad o la condición es el cáncer. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones PI3K en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión de un polipéptido que comprende por lo menos una secuencia del aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y la SEQ ID NO: 17 en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones PI3K basadas en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición qµe está relacionada a una o más mutaciones PI3K en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de transcripción o traducción de un polinucleótido que codifica por lo menos a una secuencia del aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y la SEQ ID NO: 17 en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones PI3K basadas en la presencia o cantidad de transcripción o traducción del polipéptido. En ciertas modalidades, la enfermedad o la condición es el cáncer. En ciertas modalidades, se proporciona un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf en un sujeto. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión de un polipéptido B-Raf mutante en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf basadas en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de transcripción o traducción de un polinucleótido B-Raf mutante en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf basadas en la presencia o cantidad de transcripción o traducción del polinucleótido. En ciertas modalidades, la enfermedad o la condición es el cáncer. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión de un polipéptido que comprende por lo menos una secuencia del aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20 en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf basadas en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido. En ciertas modalidades, un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf en un sujeto comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de transcripción o traducción de un polinucleótido que codifica por lo menos a una secuencia del aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20 en una muestra del sujeto; y (b) diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad o condición que está relacionada a una o más mutaciones B-Raf basadas en la presencia o cantidad de transcripción o traducción del polipéptido. En ciertas modalidades, la enfermedad o la condición es el cáncer. En ciertas modalidades, se proporciona un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica a un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica a un polipéptido EGFr mutante en una muestra comprende (a) exponer una muestra a una sonda que hibridiza a un polinucleótido, que codifica a una región de un polipéptido EGFr mutante, en donde la región comprende por lo menos una mutación EGFr seleccionada de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A, y (b) determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica a un polipéptido EGFr mutante en la muestra. En ciertas modalidades, un método para determinar la presencia o ausencia de un polipéptido EGFr mutante en una muestra comprende (a) exponer una muestra a una sonda que hibridiza a un poli nucleótido, que codifica a una región de un polipéptido EGFr mutante, en donde la región comprende por lo menos una mutación EGFr seleccionada de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A, y (b) determinar la presencia o ausencia de un polipéptido EGFr mutante en la muestra. En ciertas modalidades, se proporciona un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica a un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica a un polipéptido PI3K mutante en una muestra comprende (a) exponer una muestra a una sonda que hibridiza a un polinucleótido, que codifica una región de un polipéptido PI3K mutante, en donde la región comprende por lo menos una mutación PI3K seleccionada de E542K, E545A, y H1047L, y (b) determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica a un polipéptido PI3K mutante en la muestra. En ciertas modalidades, un método para determinar la presencia o ausencia de un polipéptido PI3K mutante en una muestra comprende (a) exponer una muestra a una sonda que hibridiza a un polinucleótido que codifica a una región de un polipéptido PI3K mutante, en donde la región comprende por lo menos una mutación PI3K seleccionada de E542K, E545A, y H1047L, y (b) determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido qµe codifica a un polipéptido PI3K mutante en la muestra. En ciertas modalidades, se proporciona un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido qµe codifica a un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica a un polipéptido B-Raf mutante en una muestra comprende (a) exponer una muestra a una sonda que hibridiza a un polinucleótido que codifica a una región de un polipéptido B-Raf mutante, en donde la región comprende por lo menos una mutación B-Raf seleccionada de V600E y K601 E, y (b) determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido que codifica a un polipéptido B-Raf mutante en la muestra. En ciertas modalidades, un método para determinar la presencia o ausencia de un polipéptido B-Raf mutante en una muestra comprende (a) exponer una muestra a una sonda que hibridiza a un polinucleótido, que codifica a una región de un polipéptido B-Raf mutante, en donde la región comprende por lo menos una mutación B-Raf seleccionada de V600E y K601 E s, y (b) determinar la presencia o ausencia de un polipéptido B-Raf mutante en la muestra. En ciertas modalidades, se proporciona un método de separación por exclusión para un modulador de la actividad de por lo menos un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, un método de separación por exclusión para un modulador de actividad de por lo menos un polipéptido EGFr mutante comprende poner en contacto una célula que expresa por lo menos a un polinucleótido qµe codifica a un polipéptido EGFr mutante con un compuesto de la prueba; y detectar si el compuesto de prueba modula la actividad del polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, el compuesto de prueba incrementa la actividad del polipéptido EGFr. En ciertas modalidades, el compuesto de prueba disminuye la actividad del polipéptido EGFr. En ciertas modalidades, un compuesto de prueba identificado para disminuir la actividad del polipéptido EGFr puede usarse para tratar una enfermedad o condición que está relacionada a por lo menos un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, un compuesto de prueba identificado para incrementar la actividad del polipéptido EGFr puede usarse para tratar una enfermedad o condición que está relacionada a por lo menos un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, se proporciona un método de separación por exclusión para un modulador de actividad de por lo menos un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, un método de separación por exclusión para un modulador de actividad de por lo menos un polipéptido PI3K mutante comprende poner en contacto una célula que expresa por lo menos un polinucleótido que codifica a un polipéptido PI3K mutante con un compuesto de prueba; y detectar si el compuesto de prueba modula la actividad del polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, el compuesto de prueba incrementa la actividad del polipéptido PI3K. En ciertas modalidades, el compuesto de prueba disminuye la actividad del polipéptido PI3K. En ciertas modalidades, un compuesto de la prueba identificado para disminuir la actividad del polipéptido PI3K puede usarse para tratar una enfermedad o condición que está relacionada a por lo menos un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, un compuesto de prueba identificado para aumentar la actividad del polipéptido PI3K puede usarse para tratar una enfermedad o condición que está relacionada a por lo menos un polipéptido PI3K mutante. En ciertas modalidades, se proporciona un método de separación por exclusión para un modulador de actividad de por lo menos un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, un método de separación por exclusión para un modulador de actividad de por lo menos un polipéptido B-Raf mutante comprende poner en contacto una célula que expresa por lo menos un polinucleótido qµe codifica a un polipéptido B-Raf mutante con un compuesto de prueba; y detectar si el compuesto de prueba modula la actividad del polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, el compuesto de prueba incrementa la actividad del polipéptido B-Raf. En ciertas modalidades, el compuesto de prueba disminuye la actividad del polipéptido B-Raf. En ciertas modalidades, un compuesto de prueba identificado para disminuir la actividad del polipéptido B-Raf puede usarse para tratar una enfermedad o condición que está relacionada a por lo menos un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, un compuesto de prueba identificado para aumentar la actividad del polipéptido B-Raf puede usarse para tratar una enfermedad o condición que está relacionada a por lo menos un polipéptido B-Raf mutante. En ciertas modalidades, se proporciona un método por tratar a un sujeto con una enfermedad o condición que está relacionada a por lo menos una mutación EGFr. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar a un sujeto con una enfermedad o condición que está relacionada a por lo menos una mutación EGFr, el método comprende: (a) detectar por lo menos una mutación EGFr en un polinucleótido del sujeto, en donde la detección de por lo menos una mutación EGFr indica que el paciente tiene la susceptibilidad incrementada para desarrollar una enfermedad o condición que está relacionada a por lo menos una mutación EGFr; y (b) administrar un anticuerpo al sujeto que enlaza específicamente a un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En ciertas modalidades, el anticuerpo es panitumumab o un antígeno que enlaza a la misma región. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar a un sujeto con una enfermedad o condición qµe está relacionada a por lo menos una mutación EGFr, el método comprende : (a) detectar por lo menos una mutación EGFr en un polinucleótido del sujeto, en donde la detección de por lo menos una mutación EGFr indica que el paciente tiene una enfermedad o condición que está relacionada a por lo menos una mutación de EGFr; y (b) administrar un anticuerpo al sujeto que se enlaza específicamente a un polipéptido EGFr mutante. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En ciertas modalidades, el anticuerpo es panitumumab o un antígeno que enlaza a la misma región. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar a un sujeto con una enfermedad o condición que está relacionada a por lo menos una mutación EGFr, en donde por lo menos una de las mutaciones EGFr se selecciona de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar un sujeto con una enfermedad o condición que está relacionada a por lo menos una mutación EGFr, en donde la enfermedad o condición que está relacionada a por lo menos una mutación EGFr es un carcinoma pulmonar de células no pequeñas. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar a un sujeto con una enfermedad o condición que está relacionada a por lo menos una mutación EGFr, que comprende administrar un polinucleótido antisentido a un polinucleótido EGFr mutante para un sujeto que necesita de tal tratamiento.

En ciertas modalidades, se proporciona un método para establecer un perfil de población EGFr mutante en una población específica de individuos que comprende: (a) determinar la presencia de por lo menos una mutación EGFr en un perfil genético de los individuos en una población; y (b) establecer una relación entre los perfiles EGFr mutantes genéticos y los individuos. En ciertas modalidades, las características específicas de los individuos incluyen la susceptibilidad a desarrollar una enfermedad o condición que está relacionada con una mutación de EGFr. En ciertas modalidades, las características específicas de los individuos incluyen exhibir una enfermedad o condición qµe está relacionada a una mutación de EGFr. En ciertas modalidades, se proporciona un método para predecir la eficacia del tratamiento gefitinib en una enfermedad o condición en un sujeto, que comprende determinar la presencia o ausencia de la mutación EGFr T790M en un polipéptido EGFr mutante del sujeto, en donde la presencia de la mutación EGFr T790M en uno o más polipéptidos EGFr mutantes indica la resistencia al tratamiento con el gefitinib . En ciertas modalidades, se proporciona un método para determinar la sensibilidad al tratamiento con un anticuerpo anti-EGFr en un sujeto que padece cáncer, que comprende determinar la presencia o ausencia de la mutación EGFr T790M en el sujeto. En ciertas modalidades, el anticuerpo es panitumumab o cetuximab. En ciertas modalidades, se proporciona un kit para detectar un polinucleótido que codifica a un polipéptido EGFr mutante en un sujeto. En ciertas modalidades, el kit comprende una sonda que hibridiza a un polinucleótido que codifica a una región de un polipéptido EGFr mutante, en donde la región comprende por lo menos una mutación EGFr seleccionada de L688P, Q701 H, K745N, C781 R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A. En ciertas modalidades, el kit comprende además, dos o más cebadores de amplificación. En ciertas modalidades, el kit comprende además, un componente de detección. En ciertas modalidades, el kit comprende además, un componente que obtiene muestras de los ácidos nucleicos. Los siguientes ejemplos, que incluyen los experimentos dirigidos y resultados obtenidos se proporcionan únicamente para propósitos ilustrativos y no serán traducidos como una limitante en la presente invención. EJEMPLOS EJEMPLO 1 IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES EGFR, PI3K, Y B-RAF EN CARCINOMA PULMONAR DE CÉLULAS NO PEQUEÑAS Y MUESTRAS DE TUMOR DE ADENOCARCINOMA COLORECTAL Para identificar las mutaciones en EGFr , el fosfatidilinositol 3 ' -cinasa ( " PI3K" ) y B-Raf asociado con el carcinoma pulmonar de células no pequeñas ( "NSCLC " ) , exones especí ficos de EGFr, PI3K, y B-Raf se aislaron y amplificaron a partir de muestras de tumor NSCLC . Las muestras del tumor de doble ciego de veinte pacientes enrolados en un primer ensayo en línea NSCLC se coppararon únicamente con el tratamiento quimioterapéutico (carboplatina/paclitaxel) contra el tratamiento quimioterapéutico combinado con panitumumab, un anticuerpo anti -EGFr humano (A gen) , se obtuvieron previo al tratamiento del paciente con quimioterapia y/o panitumumab. Para identificar las mutaciones en EGFr y PI3K asociadas con el adenocarcinoma colorectal ("CRC"), se aislaron exones específicos de EGFr y PI3K y amplificaron de veinte tumores CRC de pacientes. Las muestras de tumor de doble ciego de veinte pacientes enrolados en un primer ensayo CRC en línea se compararon con únicamente el tratamiento quimioterapéutico (carboplatina/paclitaxel) contra el tratamiento quimioterapéutico combinado con el panitumumab, un anticuerpo anti-EGFr humano (A gen) , que se obtuvo previo al tratamiento del paciente con quimioterapia y/o panitumumab. Cada uno de los exones aislados, se sometieron a una secuencia para identificar cualquier alteración de las secuencias del tipo silvestre para esos exones . Se reunieron las muestras de tumor NSCLC de veinte pacientes (Tabla 1) y las muestras del tumor CRC de veinte pacientes (Tabla 2) . Una porción de cada muestra del tumor fue manchada o teñida para identificar la cantidad de expresión de EGFr del tumor y se valoró para manchar en una escala de tres puntos (donde 3 es el grado mayor de manchado) . Por lo menos 10% de cada muestra del tumor demostró un nivel de manchado de tres o mayor. El tejido del tumor se separó del tejido normal adyacente, desechos necróticos, y el estroma mediante una macro disección fija en formalina, las secciones del tejido se incrustaron con parafina. Las muestras arregladas se fijaron en transparencias del microscopio y se almacenaron a la temperatura ambiente.

Tabla 1: Muestras NSCLC del Paciente Tabla 2 : Muestras CRC del Paciente El ADN genómico se preparó a partir de los portaobjetos de la muestra usando el Sistema de Aislamiento de ADN de Transparencia Precisa (Zymo Research, Orange, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El producto de ADN genómico aislado final se disolvió en 500 µL de agua. Las secuencias que corresponden a los exones 18, 19, 20, 21, y 23 de EGFr humano, exones 9 y 20 de PI3K humano, y exones 15 de B-Raf humano fueron amplificados por PCR usando cebadores específicos para cada exón. Se diseñaron secuencias del cebador para cada exón usando las secuencias intron 5 ' y 3 ' a cada exón en la secuencia EGFr cDNA del tipo silvestre (Acceso al Genbank No. AC006977; SEQ ID NO: 55). La secuencia del nucleótido EGFr del tipo silvestre genómico se encuentra en el Acceso Genbank No. AC073324. La secuencia del polipéptido de tipo silvestre EGFr se encuentra en el Acceso Genbank No. AAS83109 (SEQ ID NO: 1) . El cebador delantero para el exón 18 EGFr fue 5 ' -GGG CCA el TGT CTG GCA CTG CTT TCC - 31 (SEQ ID NO: 22), y el cebador inverso para el exón 18 EGFr fue 5 ' -GAA ATA TAC AGC TTG CAÁ GGA CTC -3' (SEQ ID NO: 23). El cebador delantero para el exón 19 EGFr fue 5 ' -AAT ATC AGC CTT AGG TGC GGC TCC -31 (SEQ ID NO: 24), y el cebador inverso para el exón 19 EGFr fue 5 ' -AAA AGG TGG GCC TGA GGT TC-3 (SEQ ID NO: 25) . El cebador delantero para el exón 20 EGFr fue 5 ' -CTG CGT AAA CGT CCC TGT GCT AGG TC-3 (SEQ ID NO: 26) y el cebador inverso para el exón 20 EGFr fue 5 ' -GCA CGC el ACÁ CAC ATA el TCC CCA TGG C-31 (SEQ ID NO: 27). El cebador delantero para exón 21 EGFr fue 5 ' -GCA TGA ACÁ TGA CCC TGA ATT CGG-31 (SEQ ID NO: 28) y el cebador inverso para exón 2lEGFr fue 5 ' -CCT GCA TGT GTT AAA CAÁ TAC AGC-31 (SEQ ID NO: 29). El cebador delantero para exón 23GFr fue 5 ' -TCA TTC ATG ATC CCA CTG CCT TC-31 (SEQ ID NO: 30), y el cebador inverso para el exón 23GFr fue 5 ' -CAG CTG TTT GGC TAA CAG CAG CC-3 ' (SEQ ID NO: 31) . La secuencia del polipéptido PI3K de tipo silvestre se encuentra en el Acceso de Genbank No. U79143 (SEQ ID NO: 14) . La secuencia cDNA PI3K de tipo silvestre se muestra en la Figura 7 (SEQ ID NO: 58) . El cebador delantero para el exón 9PI3K fue 5 ' -CTG TAA ATC ATC TGT GAA TCC AGA GGG G-3 (SEQ ID NO: 32), y el cebador inverso para el exón 9 PI3K fue 5 ' -GTA AAT TCT GCT TTA TTT ATT CCA ATA GGT ATG G-31 (SEQ ID NO : 33) . El cebador delantero para el exón 20PI3K fue 5 ' -CTA CGA AAG CCT CTC TAA TTT TGT GAC ATT TGA GC-3 (SEQ ID NO : 34), y el cebador inverso para el exón 20PI3K fue 5 ' -CTT GCT GTA AAT TCT AAT GCT GTT CAT GGA TTG TGC-31 (SEQ ID NO : 35) . La secuencia del polipéptido B-Raf de tipo silvestre se encuentra en el Acceso de Genbank No. NM004333 (SEQ ID NO: 18) . La secuencia de cADN B-Raf de tipo silvestre se muestra en la Figura 8 (SEQ ID NO: 60) . El cebador delantero para el exón 11 B-Raf fue 5 ' -GGG GAT CTC TTC CTG TAT CCC TCT CAG GC -3" (SEQ ID NO : 36), y el cebador inverso para el exón 11 B-Raf fue 5 ' -GTT TAT TGA TGC GAA CAG TGA ATA TTT CC-3' (SEQ ID NO: 37). El cebador delantero para el exón 15 B-Raf fue 5'-CAT AAT GCT TGC TCT GAT AGG - 3' (SEQ ID NO: 38), y el cebador inverso para el exón 15 B-Raf fue 5 ' -GTA ACT CAG CAG CAT CTC AG-31 (SEQ ID NO : 39) . La PCR se realizó usando la polimerasa de ADN Taq (Roche Diagnostics Corp) y las siguientes condiciones: 5 µl_ de lOx solución amortiguadora Taq, 0.5 µL de 24 imM MgCl2, 1 µL de ADN genómico (aproximadamente 0.5 ng) , 7 µL de 2.5 dNTPs mM, 1 µL de polimerasa Taq (5U) y 29.5 ddH20 de µL se combinaron y se mezclaron. Seis µL de solución de reserva del cebador combinada (10 uM de cada una) se agregó a cada tubo. El protocolo del ciclo se realizó en 1 ciclo de 4 minutos a 93 °C, 10 segundos a 93 °C, 30 segundos a 62 °C, 30 segundos a 72 °C durante 35 ciclos, y 1 ciclo de 4 min a 72 °C. Al final de la reacción la temperatura se mantuvo a 4°C. Los productos del PCR para cada exón individual se agruparon y se purificaron con gel. Las secuencias del exón amplificadas y purificadas se subclonaron en un vector pCR2.1 usando un kit de clonación TOPO-TA (Invitrogen Corp) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las colonias de E. coli que contenían el vector y exón de la inserción de interés fueron escogidas por un recogedor de Colonias Genetix. Esas colonias se hicieron crecer durante toda la noche en un medio líquido. El ADN de plásmido de cada cultivo bacteriano de toda la noche se aisló usando un QIAGEN 9600, 3000, o Bio-robot 8000 (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN del plásmido aislado que contenía cada exon fue formado en secuencias usando un kit BigDye 3.1 Terminator (Applied Biosystems, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos de la secuencia se reunieron usando un Analizador genético 3700, 3100, o 3730 (Applied Biosystems Inc.), y se analizó usando el programa SeQuencher (GeneCodes Corp.) . Se compararon las secuencias del exón de las muestras de pacientes con las secuencias del exón de tipo silvestre. Los resultados se muestran esquemáticamente en las Figuras 1 Y 2. El análisis mutacional NSCLC de las muestras del paciente con tumor (Figura 1) identificó varias mutaciones en EGFr: dos mutaciones diferentes en el exón 18 EGFr en dos pacientes diferentes (Q701 H (SEQ ID NO: 40 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 3) y L688P (la SEQ ID NO: 41 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 2)); una supresión de 15 pares base (SEQ ID NO: 42 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 4) y una mutación (K745N (SEQ ID NO: 43 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 5)) en el exón 19 EGFr en dos pacientes diferentes; tres mutaciones diferentes en el exón 20 EGFr en tres pacientes diferentes (C781 R (SEQ ID NO: 44 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 6) , T790M (SEQ ID NO: 45 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 8) , y una inserción de la histidina entre los aminoácidos 771 y 772 (SEQ ID NO: 46 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 7)); una mutación (Q849R (SEQ ID NO: 47 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 10)) en el exón 21 de EGFr en un solo paciente; y dos mutaciones diferentes en el exón 23 EGFr en dos pacientes diferentes (V948A (SEQ ID NO: 48 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 13) y F910L (SEQ ID NO: 49 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 12)). El análisis de los exones PI3K en las muestras de pacientes NSCLC identificaron una sola mutación (E545A (SEQ ID NO: 50 que codifican al polipéptido de la SEQ ID NO: 16)) en el exón 9 de PI3K que se observó en siete pacientes diferentes y ninguna mutación en el exón 20 de PI3K. El análisis del exón 15 B-Raf también identificó una sola mutación (V600E (SEQ ID NO: 51 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 19)) en dos pacientes diferentes. El análisis mutacional de las muestras CRC del tumor del paciente, en contraste, no identificó ninguna mutación de EGFr en los veinte pacientes CRC (Figura 2). Trece de los veinte pacientes tenían la misma mutación E545A (SEQ ID NO: 50 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 16) en el exón 9 PI3K que se había identificado previamente en las muestras NSCLC de los pacientes. Además, la mutación E542K (SEQ ID NO: 53 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 15) se identificó en otros tres pacientes en ese exon. Una mutación (H1047L (SEQ ID NO: 54 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 17)) se identificó en el exón 20 PI3K, en un solo paciente. Así, se identificaron doce mutaciones EGFr diferentes, una mutación PI3K, y una mutación B-Raf se identificó en las muestras de tumor NSCLC del paciente, mientras que se identificaron tres mutaciones PI3K y no se identificó ninguna mutación EGFr en las muestras CRC del tumor del paciente. EJEMPLO 2 ANÁLISIS MUTACIONAL DE CARCINOMA PULMONAR DE CÉLULAS NO PEQUEÑAS Se realizó un estudio expandido de treinta y nueve muestras de tumor NSCLC adicionales en los pacientes. Las muestras de tumor de doble ciego de los treinta y nueve pacientes enrolados en un primer ensayo en línea NSCLC comparando únicamente el tratamiento quimioterapéutico (carboplatina/paclitaxel) contra el tratamiento quimioterapéutico combinado con el panitumumab, un anticuerpo anti humano - EGFr (Amgen) , se obtuvo previo al tratamiento del paciente con la quimioterapia y/o panitumumab. Usando los procedimientos del aislamiento de ADN idéntico, amplificación, subclonación, y procedimientos de análisis establecidos en el Ejemplo 1, los exones 18, 19, 20, 21, y 23, EGFr y exones B-Raf 11 y 15 que se analizaron para la presencia de mutaciones. Las treinta y nueve muestras se detallan en la Tabla 3, y los resultados de los análisis de esas muestras aparecen en la Figura 3. Tabla 3 : Muestras NSCLC de Pacientes para el Estudio Expandido Los resultados del análisis no identificaron ninguna mutación en los exones 20 o 23 EGFr. Una sola mutación se identificó en el exón 18 EGFr (L688P (SEQ ID NO: 41 que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 2) ) en cuatro muestras de pacientes diferentes. Una sola supresión de par base (SEQ ID NO: 42 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 4) en el exón 19 EGFr se identificó en una sola muestra del paciente. Se identificaron dos mutaciones en el exón 2lEGFr (L858R (SEQ ID NO: 61 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 11) y L828paro (SEQ ID NO: 56 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 9)), cada una en dos pacientes diferentes. Ninguna mutación se identificó en el exón 11B-Raf. Una mutación, K601 E (SEQ ID NO: 57 que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 20) , se identificó en el exón 15 B-Raf en una sola muestra del paciente. De las mutaciones observadas, se habían identificado previamente dos en el Ejemplo 1 (L688P en el exón 18EGFr y la supresión en el par base 15 y el exón 19 EGFr) , y se identificaron tres recientemente (L858R y L828paro en el exón 21 EGFr, y K601 E en el exón 15B-Raf ) . En todos, se identificaron nueve mutaciones confirmadas en el gen BGFr en ocho muestras NSCLC de pacientes, y una mutación confirmada en el gen B-Raf se identificó en un paciente NSCLC. EJEMPLO 3 ANÁLISIS DE CAPACIDAD DE AUTOFOSFORILACIÓN DEL POLIPÉPTIDO MUTANTE EGFR Típicamente, EGFr sufre un evento de autofosforilación como un precursor para la internalización luego de enlazar a un ligando como EGF o TGF-a. Por consiguiente , se estudiaron ciertos polipéptidos mutantes EGFr identificados en el Ej emplo 2 para determinar la inhibición de la fosforilación EGFr inducida por EGF in vitro. Se construyeron líneas celulares de ovarios de hámster chino que sobreexpresan el tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) o polipéptidos EGFr mutados . Las células de cada línea se colocaron en placas y se trataron con 0-2 uM de panitumumab o gefitinib (Iressa™, 4-q^inazolinamina, N-(3-cloro-4-f luorof enil ) -7-metoxi- 6- [3-4-morfolin) propoxi] , un inhibidor de cinasa de moléculas pequeñas) previo al estímulo con EGF. El IC50 para la autofosforilación inducida por EGF se calculó para el gefitinib y las muestras tratadas con panitumumab (Tabla 4) . Los datos de la electroforesis cruda para el EGFr tipo silvestre y los polipéptidos EGFr T790M mutante se muestran en la Figura 4. Tabla 4 : IC50 para Autofosforilación EGFr después del Tratamiento con Gefitinib o Panitumumab Como se muestra en la Tabla 4, ambos, gefitinib y panitumumab fueron eficaces al prevenir la autofosforilación EGFr en una concentración baja para el EGFr de tipo silvestre, la supresión 15 par base y los mutantes EGFr L858R. Sin embargo, la autofosforilación del polipéptido EGFr mutante T790M, no se inhibió por el gefitinib (IC50 > 2000 NM) , aún después de que se inhibió eficazmente con el panitumumab (IC50 de 0.23 NM) . Así, el pañitumumab puede ser un tratamiento más eficaz que el gefitinib para pacientes NSCLC que tienen una mutación de T790M en el exón 20EGFr que el gefitinib. EJEMPLO 4 CORRELACIÓN DEL ANLISIS MUTACIONAL CON EFICACIA DE PANITUMUMAB Después del análisis mutacional del Ejemplo 2, los resultados del estudio se descubrieron para los pacientes en los cuales se observaron las mutaciones (Tabla 5) . Se evaluaron los datos clínicos por un investigador cada seis semanas al usar los Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST) , los que proporcionan lineamientos para identificar mejora, enfermedad estable o enfermedad progresiva con base en el tamaño del tumor (ver Therasse et al., Febrero 2000, "Nuevos lineamientos para Evaluar la Respuesta en el Tratamiento en Tumores Sólidos,", J. Nati. Cáncer Inst. 92 (3 ): 205-216) .

Tabla 5: Muestra de pacientes con NSCLC Los resultados demuestran que panitumumab en combinación con la quimioterapia produjo una enfermedad estable por al menos 12 semanas para aquellos pacientes con una mutación de T790M en EGFr Exon 20 y una mutación de L858R en EGFr Exon 21. Al usar la terapia de combinación de quimioterapia/panitumumab, se observó una respuesta parcial en un paciente con una eliminación de 15 pares de base en el exon EGRFr 19. En contraste un paciente con la misma eliminación de 15 pares de base en el exon EGFr 19 alcanzó solo una enfermedad estable con el tratamiento quimioterapéutico solo.

Los estudios recientes han identificado varias mutaciones de EGFr en tumores a partir de NSLC que despliegan sensibilidad a los inhibidores de la tirosina EGFr sinasa gefitinib (Iressa™ (AstraZeneca) y erlotinib (Tarceva™ (Genentech), N- (3-etilnilfenil) -6 , 7-bis (2-metoxietoxi) -4-quinazolinamina) .Lynch et al. (2004, "Activating Mutations in the Epidérmico Growth Factor Receptor Underlying Responsiveness of Non-Small-Cell Lung Cáncer to Gefinib, " New England J. Med. 350(21): 2129-39), encontraron que las siguientes mutaciones EGFr se asociaron con la susceptibilidad de los tumores con pacientes NSCLC para el tratamiento con gefitinib: las eliminaciones en la región de amino ácidos 746-753, L858R, L861Q y G719C. Paez et al. (2004, "EGFR Mutations in Lung Cáncer: Correlation with Clinical Response to Gefitinib Therapy", Science 304: 1497-1500) tuvo hallazgos similares a Lynch et al., al identificar tumores con mutaciones EGFr L858R, G719S, y diversas mutaciones por eliminación entre los aminoácidos 746 y 459 por ser susceptibles al tratamiento con gefitinib. Pao et al., 2004 ("mutaciones del gen receptor EGf son comunes en canceres de pulmón de los nunca fumadores y se asocian con la sensibilidad de tumores a gefitinib y erlotinib, " Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(36): 13306-13311), encontraron que las mutaciones similares de EGFr (eliminación E746-A750, eliminación L747-S752, L858R y R776C/L858R) se asocian con la susceptibilidad de tumores NSCLC para el tratamiento con gefitinib o erlotinib. Como aquellos estudios, los estudios discutidos en los ejemplos 1 y 2 también identifican el mutante con eliminación de 15 pares de bases en el exon 19 y L858R en el exon 21 como mutaciones EGFr asociadas con los tumores NSCLC. De los datos para los cuales estuvieron disponibles los resultados de pacientes sin segar, los tumores que contienen cualquiera de esas dos mutaciones o T190M se inhibieron por panitumumab en combinación con quimioterapia. La mutación de T790M, sin embargo, no se identifico previamente en los experimentos de gefitinib/erlotinib. Los estudios in vitro demuestran que aunque la auto fosforilación de los mutantes de T790M EGFr se inhiben efectivamente a concentraciones muy bajas de panitumumab, gefitinib no es un inhibidor efectivo de la auto fosforilación de ese mutante EGFr. Así, la terapia de combinación con panitumumab y no el gefitinib pueden ser un tratamiento efectivo para los mutantes T790M EGFr. Otras modalidades serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la consideración de la especificación y la practica de la invención aquí descrita. Se pretende que la especificación y los ejemplos se consideren solamente como ejemplares con un alcance verdadero y un espíritu de la invención que se indica por las siguientes reivindicaciones.

APÉNDICE A Identificación y Caracterización Preclínica de las Mutaciones del Gen Somático EGFr a partir de un Ensayo Clínico de NSCLC en Fase 2 con Panitumumab. Descubrimiento de una Mutación Novedosa con resistencia para Gefitinib y Sensibilidad para Panitumumab Freeman D,1* Juan T, 1* Sarosi I, x Crawfor J, 2 Sandler A, 3 Schiller J, 4 Prager D, 5 Johnson D, 3 Jerian S, 1 Radinsky R1 (* Estos autores contribuyeron igualmente) . xAmgen Inc., Thousand Oaks, CA; 2Duke University Medical Center, Durham, NC; 3 Vanderbilt-Ingram Cáncer Center, Nashville, TN; 4 University of Wisconxin, Madison, Wl; 5UCLA Medical Center, Los Angeles, CA. Antecedentes: El entendimiento de los mecanismos diferentes entre los inhibidores de EGFr tirosina cinasa y los anticuerpos monoclonales pueden conducir a una visión en la trayectoria de EGFr y la modalidad de tratamiento probablemente resulta en un beneficio clínico. Panitumumab, un anticuerpo monoclonal humano completo, dirigido contra el dominio extracelular EGFr se estudia actualmente en un ensayo de primera línea de NSCLC que compara la quimioterapia (carboplatin/paclitaxel) contra la quimioterapia mas panitumumab (n=175; punto final primario igualal tiempo para el avance) . Se evaluaron 60 pacientes para las mutaciones de genes EGFr . El obj etivo de este estudio fue determinar si el panitumumab tiene una actividad di ferencial contra gef itinib contra las mutaciones novedosas de EGFr . Métodos : El ADN genómico se aisló de secciones de tumor FEPP diseccionadas (pretratamiento) , la PCR se efectuó en los exones de los genes EGFr 18, 19 , 20, 21 y 23 , se acumularon, subclonaron productos por PCR y >30 colonias por exon se formaron en secuencias y se resolvieron en un analizador genético. La PCR posterior y la formación de secuencias de ADN genomico confirmaron la existencias de mutaciones . Estos datos se ligaron a los datos de resultados clínicos (investigador evaluado por RECIST cada 6 semanas) . Para determinar la inhibición de la autofosforilación in vitro de EGFr inducida por EGF, células CHO que sobre expresan EGFr mutante y WT se trataron con 0-2 uM de ya sea panitumumab o gefitinib previo a la estimulación de EGF . Resultados : Sesenta pacientes con NSCLC revelaron 5 mutaciones de genes EGFr somáticas diferentes en 8 pacientes .

* PR= Respuesta Parcial SD = Enfermedad estable, PD= Enfermedad progresiva La auto fosforilación inducida por EGF en el IC50 de la eliminación del exon 19 de tipo silvestre EGFr, la mutación de punto del exon 21 y la mutación novedosa del exon 20 fue de 14.6, 1.4, 3.2 y >2000nM para las células pretratadas con gefitinib y de 0.23, 0.18 y 0.23nM para las células prettratadas con panitumumab. Conclusiones: Las mutaciones de genes somáticos EGFr alojaron ocho puntos. En las células CHO que sobre expresan EGFr, panitumumab inhibió la auto fosforilación de EGFr inducida por EGF independientemente del estado mutacional. Una mutación novedosa de EGFr en el exon 20 se asocia con la sensibilidad in vitro para panitumumab, la resistencia para gefitinib y el beneficio clínico en un paciente que experimento una enfermedad estable para dos ciclos (-12 semanas) en respuesta al tratamiento con panitumumab + quimioterapia.

APÉNDICE B Análisis de las Mutaciones de los Genes EGFr en Pacientes con NSCLC Tratados con Panitumumab más Paclitaxel y Carboplatina o Quimioterapia Solamente Freeman D, x* Juan T,1* Sarosi I,1 Crawford J,2 Sandler A,3 Schiller J,4 Prager D,5 Johnson D,3 Moss S1, Radinsky R1 (*Estos autores contribuyeron igualmente) 1Amgen Inc., Thousand Oaks, CA; 2Duke University Medical Center, Durham, NC; 3Vanderbilt-Ingram Cáncer Center, Nashville, TN; University of Wisconsin, Madison, Wl; 5UCLA Medical Center, Los Angeles, CA Antecedentes : Panitumumab es un anticuerpo monoclonal completamente humano dirigido contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFr) . Los datos recientes sugieren que las mutaciones de genes somáticos en el dominio de la EGFr cinasa se asocian con la sensibilidad a inhibidores de tirosina cinasa de molécula pequeña (TKIs) en un subconjunto de pacientes (pts) con carcinoma de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) . Para determinar la asociación, si la hay, de las mutaciones del gen EGFr con el resultado de pt para el tratamiento con panitumumab, el gen EGFr se formó en secuencias en tumores de 60 pacientes con NSCLC enrolados en un estudio de fase 2 aleatorio al comparar la eficacia y seguridad del paclitaxel y carboplatina (quimioterapia) contra panitumumab más quimioterapia. Los pacientes elegibles tuvieron enfermedad y tumores de etapa IlIb/IV con expresión de EGFr de 1+, 2+ o 3+ en > 10% de las células de tumor como se muestra por inmunohistoquímica. Se evaluó la respuesta del tumor por los investigadores cada 6 semanas usando los criterios RECIST . Este estudio ha completado el enrolamiento (n=175) , y el tratamiento es continuo. Métodos: Se separó el tejido del tumor (pretratamiento) del tejido normal adyacente, desechos necróticos y estroma por disección de secciones de tejido alojadas en parafina y fijadas en formalrna bajo un microscopio de luz. El ADN genómico se aisló y se efectuó la PCR sobre los exones 18, 19, 20, 21, y 23 del gen EGFr. Se acumularon y subclonaron los productos por PCR, y se analizó un mínimo de 30 colonias por exón por paciente. La PCR posterior y formación de secuencias del ADN genómico purificado se usó para confirmar la existencia de una mutación. El análisis de la mutación del EGFr se efectuó al usar química de terminador por colorante fluorescente y se resolvió en un Analizador Genético. Resultados: La formación de secuencias de AND de los 60 pacientes con NSCLC reveló mutaciones de genes EGFr en 8 pacientes en total, 4 del extremo de la quimioterapia y 4 pacientes de quimioterapia más el extremo de panitumumab.

*PR=respuesta parcial, SD=enfermedad estable, PD=enfermedad progresiva Conclusiones: Sesenta pacientes con NSCLC se evaluaron para las mutaciones del gen somático EGFr. Ocho pacientes se encontraron que alojaban mutaciones del gen EGFr, 3 pacientes se observaron que tenían respuesta parcial o enfermedad estable con panitumumab más quimioterapia, 1 paciente no respondió a panitumumab más quimioterapia. Cuatro pacientes se observaron que tenían respuesta parcial o enfermedad estable con la quimioterapia sola. El resultado de los 60 pacientes se presentará. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, y SEQ ID NO: 13.
2. Un polipéptido aislado caracterizado porque consiste de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, y SEQ ID NO: 13.
3. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 12, y SEQ ID NO: 13.
4. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica un polipéptido que consiste de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 12, y SEQ ID NO: 13.
5. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17. 6. Un polipéptido aislado caracterizado porque consiste de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ
ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17.
7. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17.
8. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica un polipéptido que consiste de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17.
9. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20.
10. Un polipéptido aislado caracterizado porque consiste de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20.
11. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20.
12. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica un polipéptido que consiste de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20.
13. Un vector caracterizado porque comprende al menos un polinucleótido aislado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7, 8, 11, y 12.
14. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 13.
15. Una célula caracterizada porque es transformada con el polinucleótido aislado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7, 8, 11, y 12.
16. Un método para la preparación de un polipéptido, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 14 bajo condiciones efectivas para la producción de polipéptidos.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende además aislar el polipéptido.
18. Un método para la preparación de un polipéptido, caracterizado porque comprende cultivar la célula de conformidad con la reivindicación 15 bajo condiciones efectivas para la producción de polipéptidos.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende aislar el polipéptido.
20. El polipéptido caracterizado porque es preparado por el método de conformidad con la reivindicación 16.
21. El polipéptido caracterizado porque es preparado por el método de conformidad con la reivindicación 18.
22. Una proteína de fusión caracterizada porque comprende el polipéptido aislado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5, 6, 9, y 10, fusionado a un polipéptido heterólogo.
23. Un agente de enlace específico caracterizado porque puede enlazarse al polipéptido aislado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5, 6, 9, y 10.
24. El agente de enlace específico de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque se selecciona de al menos una molécula seleccionada de: un anticuerpo, un anticuerpo en donde la cadena pesada y la cadena ligera se conectan por una ligadura, un anticuerpo Fv sencillo, un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional, un anticuerpo Fab, un anticuerpo Fab', un anticuerpo (Fab')2, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo anti-idiotípico, un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, y un anticuerpo que inhibe el enlace de EGF a un polipéptido aislado que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20.
25. Un método para la obtención de un anticuerpo que puede enlazar a al menos un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ
ID NO: 12, y SEQ ID NO: 13, caracterizado porque comprende: administrar al menos un polipéptido que comprende al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, y
SEQ ID NO: 13 a un animal; y obtener un anticuerpo capaz de enlazar a al menos un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y SEQ ID NO: 13 del animal. 26. Un animal transgénico no humano caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7, 8, 11, y 12. 27. El polinucléotido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7, 8, 11, y 12, caracterizado porque está unido a un soporte sólido.
28. El polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5, 6, 9, y 10, caracterizado porque está unido a un soporte sólido.
29. Un arreglo de polinucleótidos caracterizado porque comprende al menos un polinucléotido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3, 4, 7, 8, 11, y 12.
30. Un arreglo de polipéptidos, caracterizado porque comprende al menos un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5, 6, 9, y 10.
31. Una sonda de ácidos nucleicos que hibridiza a un polinucléotido que codifica una región de un polipéptido mutante EGFr, caracterizada porque la región comprende al menos una mutación de EGFr seleccionada de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A, o hibridiza a un complemento del polinucléotido.
32. Un método de diagnóstico de una enfermedad o condición la cual se relaciona con una o más mutaciones de EGFr en un sujeto, caracterizado porque comprende: (a) determinar la presencia o cantidad de expresión del polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 y 2 en una muestra de un sujeto; y (b) diagnosticar una enfermedad o condición la cual se relaciona con una o más mutaciones de EGFr con base en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido.
33. Un método para el diagnóstico de una susceptibilidad a una enfermedad o condición que se relaciona con una o más mutaciones de EGFr en un sujeto caracterizado porque comprende : (a) determinar la presencia o cantidad de expresión del polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 y 2 en una muestra; y (b) diagnosticar una susceptibilidad a una enfermedad o condición la cual se relaciona a una o más mutaciones de EGFr con base en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido .
34. Un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucléotido que codifica a un polipéptido mutante EGFr en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) exponer una muestra a una sonda la cual hibridiza a un polinucléotido que codifica una región de un polipéptido mutante EGFr, en donde la región comprende al menos una mutación EGFr seleccionada de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A; y; (b) determinar la presencia o ausencia de un polinucléotido que codifica un polipéptido mutante EGFr en la muestra.
35. Un método para determinar la presencia o ausencia de un polipéptido mutante EGFr en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) exponer una muestra a una sonda la cual hibridiza a un polinucléotido que codifica una región de un polinucléotido mutante EGFr, en donde la región codifica al menos una mutación EGFr seleccionada de L688P, Q701 H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A; y; (b) determinar la presencia o ausencia de un polipéptido mutante EGFr en la muestra.
36. Un método para diagnosticar un cáncer relacionado con EGFr en un sujeto, caracterizado porque comprende determinar la presencia o ausencia de al menos un polipéptido mutante EGFr que comprende al menos una mutación seleccionada de: L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V 48A en una muestra de un sujeto, en donde la presencia del al menos polipéptido mutante EGFr diagnostica un cáncer relacionado con EGFr en el sujeto.
37. Un método para diagnosticar un cáncer relacionado con EGFr en un sujeto, caracterizado porque comprende determinar la presencia o ausencia de al menos un polinucléotido mutante EGFr que codifica un polipéptido que comprende al menos una mutación seleccionada de: L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A en una muestra de un sujeto, en donde la presencia del al menos un polinucléotido mutante EGFr diagnostica un cáncer relacionado con EGFr en el sujeto.
38. Un método para determinar la probabilidad de desarrollo de un cáncer relacionado con EGFr en un sujeto, caracterizado porque comprende determinar la presencia o ausencia de al menos un polipéptido mutante EGFr, que comprende al menos una mutación seleccionada de: L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A en una muestra de un sujeto, en donde la presencia del al menos polipéptido mutante EGFr es indicativa de la probabilidad de desarrollo de un cáncer relacionado con el EGFr en el sujeto.
39. Un método para determinar la probabilidad de desarrollo de un cáncer relacionado con EGFr en un sujeto, caracterizado porque comprende determinar la presencia o ausencia de al menos un polinucléotido mutante EGFr que codifica un polipéptido que comprende al menos una mutación seleccionada de: L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A en una muestra de un sujeto, en donde la presencia del al menos un polinucléotido mutante EGFr es indicativa de la probabilidad de desarrollo de un cáncer relacionado con EGFr en el sujeto.
40. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 36, 37, 38, y 39, caracterizado porque el cáncer relacionado con EGFr es un carcinoma de pulmón de célula no pequeña.
41. Un método para seleccionar un modulador de la actividad de al menos un polipéptido mutante EGFr que comprende al menos una mutación seleccionada de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto la célula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 14 o 15 con un compuesto de prueba; y (b) detector si el compuesto de prueba modula la actividad del polipéptido mutante EGFr.
42. Un compuesto caracterizado porque se identifica por el método de conformidad con la reivindicación 41.
43. Un método de tratamiento de una enfermedad o condición que se relaciona con al menos una mutación EGFr seleccionada de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A, caracterizado porque comprende administrar el compuesto de conformidad con la reivindicación 42 a un sujeto que necesita de tratamiento de la enfermedad o condición la cual se relaciona con al menos una mutación EGFr.
44. Un método para el tratamiento de un sujeto para una enfermedad o condición que se relaciona con al menos una mutación EGFr, caracterizado porque comprende: (a) detectar al menos una mutación EGFr en un polinucléotido del sujeto, en donde la detección de al menos una mutación EGFr indica que el paciente tiene una susceptibilidad incrementada para desarrollar una enfermedad o condición la cual se relaciona con al menos una mutación EGFr ; y (b) administrar un anticuerpo al sujeto que se enlaza específicamente a un polipéptido mutante EGFr.
45. Un método para el tratamiento de un sujeto para una enfermedad o condición que se relaciona a al menos una mutación EGFr, caracterizado porque comprende: (a) detectar al menos una mutación EGFr en un polinucléotido del sujeto, en donde la detección de al menos una mutación EGFr indica que el paciente tiene una enfermedad o condición la cual se relaciona con al menos una mutación EGFr; y (b) administrar un anticuerpo al sujeto que se enlaza específicamente a un polipéptido mutante EGFr.
46. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano.
47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el anticuerpo es panitumumab o una región de enlace a antígenos del mismo. 7
48. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque al menos una de las mutaciones de EGFr se selecciona de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A.
49. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la enfermedad o condición la cual se relaciona con al menos una mutación EGFr es carcinoma de pulmón de célula no pequeña.
50. Un método de tratamiento de una enfermedad o condición la cual se relaciona con al menos una mutación EGFr, caracterizado porque comprende administrar un polinucléotido antisentido al polinucléotido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3 y 4 a un sujeto que necesita de tal tratamiento.
51. Un método para establecer un perfil de una población mutante EGFr en una población específica de individuos, caracterizado porque comprende: (a) determinar la presencia de al menos una mutación EGFr en un perfil genético de los individuos en una población; y (b) establecer una relación entre los perfiles genéticos mutantes EGFr y las características específicas de los individuos .
52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque las características específicas de los individuos incluyen una susceptibilidad de desarrollar una enfermedad o condición que se relaciona a una mutación EGFr.
53. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque las características específicas de los individuos incluyen mostrar una enfermedad o condición la cual se relaciona con una mutación EGFr.
54. Un método para predecir la eficacia del tratamiento con gefitinib en una enfermedad o condición en un sujeto, caracterizado porque comprende determinar la presencia o ausencia de la mutación de EGFr T790M en un polipéptido mutante EGFr del sujeto, en donde la presencia de la mutación EGFr T790M en uno o más polipéptidos mutantes EGFr indica la resistencia al tratamiento con gefitinib.
55. Un método para determinar la respuesta al tratamiento con un anticuerpo anti-EGFr en un sujeto que padece de cáncer, caracterizado porque comprende determinar la presencia o ausencia de la mutación de EGFr T790M en el sujeto.
56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el anticuerpo es panitumumab o cetuximab.
57. Un kit para detectar un polinucléotido que codifica un polipéptido mutante EGFr en un sujeto, caracterizado porque comprende una sonda la cual hibridiza a un polinucléotido que codifica una región de un polipéptido mutante EGFr, en donde la región comprende al menos una mutación EGFr seleccionada de L688P, Q701H, K745N, C781R, una inserción de histidina entre los aminoácidos 771 y 772, T790M, L828paro, Q849R, F910L, y V948A.
58. El kit de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque además comprende dos o más cebadores de amplificación.
59. El kit de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque además comprende un componente de detección.
60. El kit de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque además comprende un componente de muestreo de ácidos nucleicos.