MX2007008497A

MX2007008497A - Ensayos inmunosorbentes enlazados a enzimas usando reactivos de peptidos especificos de prion.

Info

Publication number: MX2007008497A
Application number: MX2007008497A
Authority: MX
Inventors: David Y Chien; Melissa D Michelitsch; Celine Hu; Michael D Connolly; Ronald N Zuckermann; David Peretz; Xuemei Wang; Man Gao; Thomas Horn
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2005-01-13
Filing date: 2006-01-13
Publication date: 2007-09-14
Also published as: JP2008527382A; AU2006204705B2; WO2006076687A3; CN101166976A; NZ560535A; BRPI0606529A2; JP2012181210A; EP1848831A4; US20090130774A1; NZ587255A; JP2009115815A; CA2594840A1; AU2006204705A1; EP1848831A2; HK1118336A1; JP5162250B2; WO2006076687A2; CN101166976B; AU2006204705C1

Abstract

Se describen reactivos de peptidos que interactuan preferencialmente con la forma PrPsc de la proteina prionica para el uso en la deteccion de PrPsc en muestras biologicas. En particular, se describen ensayos de ELISA.

Description

ENSAYOS INMUNOSORBENTES ENLAZADOS A ENZIMAS USANDO REACTIVOS DE PEPTIDOS ESPECÍFICOS DE PRION CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a reactivos de péptidos que interactúan con proteínas priónicasicas, polinucleótidos que codifican para estos reactivos de péptido, métodos para generar anticuerpos usando estos reactivos de péptidos y polinucleótidos, y a anticuerpos generados usando estos métodos. La invención se refiere adicionalmente a métodos para usar estos reactivos de péptidos para detectar la presencia de priones patógenos en una muestra y métodos para usar estos reactivos de péptidos como componentes en una composición terapéutica o profiláctica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades conformacionales de proteínas incluyen una variedad de enfermedades no relacionadas, que incluyen encefalopatías espongiformes transmisibles, que surgen de la transición conformacional anormal de una proteína (una proteína de enfermedad conformacional) que conduce a su vez a la auto-asociación de las formas anormales de proteína, con el consecuente depósito y daño de tejido. Estas enfermedades también comparten similitudes notables en presentaciones clínicas, típicamente un rápido progreso de REF. : 184200 diagnosis a muerte después de duraciones variables de incubación . Un grupo de enfermedades conformacionales se llama "enfermedades de priones" o "encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE)". En humanos, estas enfermedades incluyen la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) , síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) , insomnio familiar fatal, y Kuru (ver, por ejemplo, Harrison' s Principies of Infernal Medicine, Iseelbacher et al., eds., McGraw-Hill, Inc. New York, (1994); Medori et al. (1992) N. Engl. J. Med. 326:444-9). En animales, las TSE incluyen tembladera de oveja, encefalopatía espongiforme bovina (BSE) , encefalopatía de visón transmisible, y enfermedad de desaprovechamiento crónico de ciervos y cariacús cautivos (Gajdusek, (1990) Subacute Spongiform Encephalopathies : Transmisible Cerebral Amyloidoses Caused by Unconventional Viruses. Págs. 2289-2324 en: Virology, Fields, ed. New York: Raven Press, Ltd.) . Las encefalopatías espongiformes transmisibles se caracterizan por las mismas características distintivas: la presencia de la conformación anormal (resistente a proteinasa K, beta-rica) de la proteína priónica que transmite la enfermedad cuando se inocula experimentalmente en animales de laboratorio incluyendo primates, roedores y ratones transgénicos . Recientemente, la rápida extensión de la encefalopatía espongiforme bovina y su correlación con ocurrencia elevada de encefalopatías espongiformes en humanos ha conducido a un incremento significativo del interés en la detección de encefalopatía espongiformes transmisibles en mamíferos no humanos. Las consecuencias trágicas de la transmisión accidental de estas enfermedades (ver, por ejemplo, Gajdusek, Infectious Amyloids, y Prusiner Prions In Fields Virology. Fields, et al., eds. Lippincott-Ravin, Pub. Philadelphia (1996); Brown et al. (1992) Lancet, 349: 24-27), las dificultades de descontaminación (Asher et al. (1986) páginas 59-71 en: Laboratory Safety: Principies and Practices Miller ed. Am. Soc. Microb.), y el interés reciente acerca de la encefalopatía espongiforme bovina (British Med. J. (1995) 311:1415-1421) fundamentan la urgencia de tener tanto una prueba de diagnóstico que identificaría humanos y animales con encefalopatías espongiformes transmisibles y terapias para sujetos infectados. Los priones son el patógeno infeccioso que provoca encefalopatía espongiformes (enfermedades de priones). Los priones difieren significativamente de las bacterias, virus y tiroides. La hipótesis dominante es que, diferente de todos los patógenos infecciosos, la infección se provoca por una conformación anormal de la proteína priónica, que actúa como una plantilla y convierte las conformaciones normales de los priones en conformaciones anormales. Una proteína priónica se caracteriza primero a principios de 1980. (Ver, por ejemplo, Bolton, McKinley et al. (1982) Science 218: 1309-1311; Prusiner, Bolton et al. (1982) Biochemistry 21: 6942-6950; McKinley, Bolton et al. (1983) Cell 35:57-62). La codificación completa de las proteínas priónicasicas entonces se ha clonado, secuenciado y expresado en animales transgénicos. Ver, por ejemplo, Basler, Oesch et al. (1986) Cell 46: 417-428. La característica clave de las enfermedades de priones es la formación de una proteína anormalmente formada (PrPSc), también referida como una proteína de tembladera, de la forma normal (celular o no patógena) de la proteína priónica (PrPc). Ver, por ejemplo, Zhang et al. (1997) Biochem. 36(12): 3543-3553; Cohén & Prusiner (1998) Ann Rev. Biochem. 67:793-819; Pan et al. (1993) Proc Nat'l Acad Sci EUA 90: 10962-10966; Safar et al. (1993) J Biol Chem 268: 20276-20284. Los estudios de cristalografía y espectroscopia óptica han revelado que las formas de los priones relacionadas a la enfermedad están sustancialmente enriquecidas en la estructura de la beta-hoja en comparación a las formas de no enfermedad, plegadas, predominantemente alfa-helicoidales. Ver, por ejemplo, Wille et al. (2001) Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 99:3563-3568; Peretz et al. (1997) J. Mol. Biol. 273:614-622; Cohén & Prusiner, Capítulo 5: Structural Studies of Prión Proteins in PRIÓN BIOLOGY AND DISEASES, ed. S. Prusiner, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, Págs. 191-228). Los cambios estructurales parecen ser seguidos por alteraciones en las propiedades bioquímicas: la PrPc es soluble en detergentes no desnaturalizantes, la PrPSc es insoluble; la PrPc se digiere fácilmente por proteasas, en tanto que la PrPSc es parcialmente resistente, dando por resultado la formación de un fragmentó N-terminalmente truncado conocido como la forma "PrPres" (Baldwin et al. (1995); Cohén & Prusiner (1995); Safar et al. (1998) Nat. Med. 4 ( 10 ): 1157-1165) , "PrP 27-30" (27-30 kDa) o "resistente a PK" (resistente a proteinasa K) .

Además, la PrPSc puede convertir la PrPc a la conformación patógena. Ver, por ejemplo, Kaneko et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 92:11160-11164; Caughey (2003) Br Med Bull. 66:109-20. Ha probado ser difícil la detección de las isoformas patógenas de las proteínas de enfermedad conformacional en sujetos vivos y muestras obtenidas de sujetos vivos. De esta manera, la diagnosis definitiva y los tratamientos paliativos para estas condiciones que contienen amiloides y transmisibles antes de la muerte del sujeto permanecen como un reto sustancialmente sin cumplir. El examen histopatológico de las biopsias cerebrales es riesgoso al sujeto y las lesiones y depósitos amiloides se pueden perder dependiendo de dónde se tome la muestra de biopsia.

Sin embargo, existen aún riesgos comprendidos con las biopsias a animales, pacientes y personal de cuidado de la salud. Adicionalmente, los resultados de las pruebas cerebrales en animales usualmente no se obtienen hasta que el animal ha entrado al abastecimiento de alimento. Además, muchos anticuerpos generados contra péptidos de priones reconocen tanto la PrPSc como la PrPc desnaturalizadas aunque ha habido reportes de anticuerpos que son específicos para la PrPSc natural. (Ver, por ejemplo, Matsunaga et al. (2001) PROTEINS: Structure, Function and Genetics 44:110-118; patentes de los Estados Unidos números 5,846,533 y 6,765,088) . Están disponibles varias pruebas para la TSE (Ver, Soto, C. (2004) Nature Reviews Microbiol. 2:809, Biffiger et al. (2002) J. Virol. Meth. 101:79; Safar et al. (2002) Nature Biotech. 20:1147, Schaller et al. Acta Neuropathol . (1999) 98:437, Lañe et al. (2003) Clin. Chem. 49:1774). Sin embargo, todos estos utilizan muestras de tejido cerebral y son susceptibles sólo como pruebas post-mortem. La mayoría de éstas requieren tratamiento con proteinasa K de las muestras así como que pueden ser consumidoras de tiempo, la digestión incompleta de la PrPc puede conducir a resultados positivos falsos, y la digestión de PrPSc sensible a proteasa puede conducir a resultados negativos falsos. De esta manera, permanece la necesidad de composiciones y métodos para detectar la presencia de proteínas priónicasicas patógenas en varias muestras, por ejemplo en muestras obtenidas de sujetos vivos, en suministros sanguíneos, en animales de granja y en otros suministros alimenticios de animales y humanos. Además, permanece la necesidad de métodos y composiciones para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades relacionadas a priones .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han desarrollado un método sensible para la detección de proteínas priónicasicas patógenas. El método es suficientemente sensible para detectar bajos niveles de priones patógenos que pueden estar presentes en los fluidos biológicos de individuos afligidos con una enfermedad relacionada a priones. El método de esta manera es útil, inter alia , como una prueba de diagnóstico ante-mortem o para la detección de muestras sanguíneas donadas . La presente invención se refiere, en parte, a reactivos de péptidos que interactúan con las proteínas priónicasicas. De manera más específica, los reactivos de péptidos interactúan preferencialmente con las isoformas patógenas de las proteínas priónicasicas. Estos reactivos de péptidos se han descrito en las solicitudes de patente co- poseídas de los Estados Unidos número de serie 10/917,646, presentada el 13 de agosto de 2004; número de serie 11/056,950, presentada el 11 de febrero de 2005; y solicitud PCT número PCT/US2004/026363, presentada el 13 de agosto de 2004, todas estas solicitudes se incorporan en la presente como referencia. Los reactivos de péptidos se usan para concentrar y separar la proteína priónica patógena en muestras de prueba. Diferente de los ensayos anteriormente descritos para la PrPSc, el presente método no requiere ningún tratamiento con proteasa de las muestras para remover la PrPc. En el método de la presente invención, los reactivos de péptidos se usan en combinación con un ELISA sensible para la detección de la proteína priónica concentrada y separada. En una modalidad, la invención proporciona un método para detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra, que comprende: (a) proporcionar un primer soporte sólido que comprende un reactivo de péptido que interactúa preferencialmente con la forma patógena de un prión; (b) poner en contacto el primer soporte sólido con una muestra bajo condiciones que permitan que las proteínas priónicasicas patógenas, cuando están presentes en la muestra, se unan al reactivo de péptido; (c) remover la muestra no unida; (d) disociar las proteínas priónicasicas patógenas del reactivo de péptido; y (e) detectar los priones patógenos desasociados usando un reactivo de unión a prion. Los reactivo de péptidos se derivan de manera preferente de un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 12-260 y se describen en detalle en la solicitudes de patente de los Estados Unidos co-poseídas número de serie 10/917,646, presentada el 13 de agosto de 2004; número de serie 11/056,950, presentada el 11 de febrero de 2005; y solicitud PCT número PCT/US2004/026363, presentada el 13 de agosto de 2004. Después de la remoción de cualquier muestra no unida, la proteína priónica patógena se disocia del reactivo de péptido. Típicamente, la proteína priónica patógena se desnaturaliza en el proceso de disociación. La disociación se logra a través del uso de un agente caotrópico (por ejemplo, tiocianato de guanidinio o guanidinio-HCl ) o altas concentraciones de sal, o de manera preferente, al cambiar el pH . Se puede usar ya sea pH bajo (por ejemplo, por debajo de pH 2) y pH alto (por arriba de pH 12) aunque se prefiere pH alto. La proteína priónica disociada y desnaturalizada se detecta usando un inmunoensayo, de manera preferente un ELISA, de manera más preferente un ELISA de intercalación, usando anticuerpos anti-prion . La invención también proporciona kits para llevar a cabo el método, kits que incluyen uno o más reactivos de péptido, reactivos de péptidos que se pueden proporcionar en un soporte sólido, y opcionalmente, uno o más anticuerpos anti-prion. Los anticuerpos anti-prión se pueden marcar y/o se pueden proporcionar en un soporte sólido. Los amortiguadores, soluciones de lavado, desnaturalizantes y otros componentes usados en el método se pueden incluir opcionalmente en el kit, como son las instrucciones para el uso. Estos reactivos de péptidos se pueden usar en una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo como herramientas para aislar priones patógenos o para detectar la presencia de priones patógenos en una muestra, como componentes de una composición terapéutica o profiláctica y/o para generar anticuerpos específicos de prion. Por ejemplo, los reactivos de péptidos que interactúan preferencialmente con PrPSc en comparación a PrPc son útiles para la detección directa de formas patógenas en muestras obtenidas de sujetos vivos, por ejemplo, para la diagnosis de una enfermedad o para la detección de muestras sanguíneas donadas o detección de órganos para la donación de órganos. Los reactivos de péptidos descritos en la presente pueden ser parcial o completamente sintéticos, por ejemplo, pueden comprender una o más de las siguientes porciones: residuos o péptidos ciclizados, multímeros de péptidos, marcas, y/u otras porciones químicas. Los ejemplos de reactivos de péptidos adecuados incluyen aquéllos derivados de los péptidos de la SEQ ID NO: 12-260, por ejemplo, los péptidos tal como aquéllos representados en SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 56, 57, 65, 82, u 84, y análogos o derivados de los mismos. Los reactivos de péptidos descritos en la presente pueden interactuar con cualquier proteína de enfermedad conformacional, por ejemplo, proteínas priónicasicas (por ejemplo, la proteína patógena PrPSc, y la forma no patógena PrPc) . En ciertas modalidades, los reactivos de péptidos interactúan preferencialmente con PrPSc en comparación a PrPc. Los reactivos de péptidos en general serán específicos para PrPSc para más de una especie, pero pueden ser específicos para PrPSc de una especie individual . En otra modalidad, se proporcionan reactivos de péptidos derivados de los péptidos mostrados en cualquiera de las secuencias descritas en la presente. En ciertas modalidades, los reactivos de péptidos se derivan de regiones de una proteína priónica, por ejemplo, se emplean aquéllas regiones que corresponden a los residuos 23-43 u 85-156 (por ejemplo, 23-30, 86-111, 89-112, 97-107, 113-135, y 136-156 numeradas de acuerdo a la secuencia prión de ratón mostrada en SEQ ID NO: 2) . Por conveniencia, los números de los residuos de aminoácidos expuestos anteriormente son aquéllos que corresponden a la secuencia de proteína priónica de ratón en SEQ ID NO: 2; un experto en la técnica puede identificar fácilmente regiones correspondientes en las proteínas priónicasicas de otras especies en base a las secuencias conocidas en la técnica y a las enseñanzas proporcionadas en la presente. Los reactivos de péptidos de ejemplo incluyen aquéllos derivados de péptidos que tienen SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 134 o 135; o de péptidos que tienen SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 129, 130, 131, 132, 133 o 128; o de péptidos que tienen SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82, 84, o 136. En un aspecto, se proporcionan métodos para detectar la presencia de proteínas priónicasicas. Los métodos de detección se pueden usar, inter alia, en unión con métodos para diagnosticar una enfermedad relacionada a los priones (por ejemplo, en sujetos animales no humanos o humanos), asegurando un suministro sanguíneo sustancialmente libre de PrPSc, suministro de productos sanguíneos, o suministro de alimento, analizando las muestras de tejido y órganos para trasplante, monitorizando la descontaminación de herramientas y kit quirúrgico, así como cualquier otra situación en la cual sea importante el conocimiento de la presencia o ausencia del prión patógeno. Los métodos de detección dependen de la interacción preferencial de los reactivos de péptidos con la isoforma del prión patógeno. En ciertas modalidades, se proporciona un método para detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra biológica. En una modalidad, el método comprenden poner en contacto la muestra sospechosa de contener un prión patógeno con uno o más de los reactivos de péptidos descritos en la presente bajo condiciones que permiten la interacción de los reactivos de péptidos y el prión patógeno, si está presente; y detectar la presencia o ausencia del prión patógeno en la muestra por su unión a los reactivos de péptido. La interacción de los reactivos de péptidos y el prión patógeno se pueden llevar a cabo en solución, se pueden proporcionar uno o más de los reactivos en o sobre una fase sólida. Se pueden llevar a cabo ensayos tipo intercalación en los cuales se pueden usar reactivos de péptidos como un reactivo de captura, un reactivo de detección o ambos. En modalidades preferidas, se pueden usar otros reactivos de unión a prión (por ejemplo, anticuerpos y otras moléculas de unión que puedan unirse a la proteína priónica desnaturalizada) en este aspecto en combinación con los reactivos de péptidos de la invención . En un aspecto de esta modalidad, se proporcionan uno o más reactivos de péptidos de la presente invención en un soporte sólido y se ponen en contacto con una muestra sospechosa de contener un prión patógeno, bajo condiciones que permitan la unión del prión patógeno, si está presente, al reactivo de péptido. Los materiales de muestra no unidos, incluyendo cualquier prión no patógeno, se pueden remover y se puede detectar el prión patógeno, ya sea en tanto que permanece unido al reactivo de péptido o después de la disociación del reactivo de péptido. El prión patógeno se puede detectar usando un reactivo de péptido detectablemente marcado (ya sea el mismo reactivo de péptido usado para "capturar" el prión patógeno o un segundo reactivo de péptido de la invención) o un anticuerpo anti-prión detectablemente marcado u otro reactivo de unión a prion. Este anticuerpo o reactivo de unión a prión no necesita ser específico para la forma patógena del prion. En un aspecto adicional de esta modalidad, el prión patógeno se disocia del reactivo de péptido, se desnaturaliza y detecta usando un ensayo tipo intercalación con anticuerpos anti-prion . En una modalidad adicional, el método comprende poner en contacto la muestra sospechosa de contener un prión patógeno con uno o más reactivos de péptidos seleccionados del grupo que consiste de péptidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 12-260, y análogos y derivados de los mismos, bajo condiciones que permiten la unión de los reactivos de péptidos al prión patógeno, si está presente; y detectar la presencia o ausencia del prión patógeno en la muestra por su unión a los reactivos de péptido. En modalidades preferidas, la muestra se pone en contacto con uno o más reactivos de péptidos seleccionados del grupo que consiste de péptidos que tienen las secuencia de SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 56, 57, 65, 82, 136 u 84, y análogos y derivados de los mismos. Se puede usar cualquiera de los métodos anteriores de detección de un prión patógeno en un método para diagnosticar una enfermedad relacionada a prion. En todas las modalidades anteriores que proporcionan un soporte sólido que comprende uno o más reactivos peptídicos de la invención, se contemplan modalidades alternaturals en las cuales el reactivo de péptido se pone en contacto con la muestra antes de que el reactivo de péptido se ponga en contacto al soporte sólido. En estas modalidades, el reactivo de péptido comprende un miembro de un par de unión y el soporte sólido comprende el segundo miembro del par de unión. Por ejemplo, el reactivo de péptido de la invención puede contener o ser modificado para contener biotina. El reactivo de péptido biotinilado se pone en contacto con una muestra sospechosa de contener un prión patógeno bajo condiciones que permitan la unión del reactivo de péptido al prión patógeno. Un soporte sólido que comprende avidina o estreptavidina entonces se pone en contacto con el reactivo de péptido biotinilado. Se describen en la presente otros pares de unión adecuados. En cualquiera de los métodos que usa un soporte sólido descrito en la presente, el soporte sólido puede ser, por ejemplo, nitrocelulosa, poliestireno, polipropileno, látex, fluoruro de polivinilo, papel diazotizado, membranas de nailon, cuentas activadas, y/o cuentas magnéticamente sensibles, polivinilcloruro; polipropileno, látex de poliestireno, policarbonato, nailon, dextrano, quitina, arena, sílice, piedra pómez, agarosa, celulosa, vidrio, metal, poliacrilamida, silicio, caucho, polisacáridos, papel diazotizado; cuentas activadas, cuentas magnéticamente sensibles, y cualquier material comúnmente usado para la síntesis en fase sólida, separaciones por afinidad, purificaciones, reacciones de hibridación, inmunoensayos y otras de estas aplicaciones. El soporte puede estar en partículas o puede estar en la forma de una superficie continua e incluye membranas, malla, placa, granulos, portaobjetos, discos, capilares, fibras huecas, agujas, espigas, trozos, fibras sólidas, geles (por ejemplo, geles de sílice) y cuentas o partículas, (por ejemplo, cuentas de vidrio en poro, geles de sílice, cuentas de poliestireno opcionalmente reticuladas con divinilbenceno, cuentas de co-poli insertadas, cuentas de poliacrilamida, cuentas de látex, cuentas de dimetilacrilamida opcionalmente reticuladas con N-N ' -bis-acriloiletilendiamina, cuentas magnéticas de óxido de hierro, y partículas de vidrio revestidas con un polímero hidrófobo) . Los términos "soporte sólido" y "superficie sólida" se usan de manera indistinta en la presente. Además, en cualquiera de los métodos descritos en la presente, la muestra puede ser una muestra biológica, es decir, una muestra obtenida o derivada de un organismo vivo o antiguamente vivo, por ejemplo, órganos, sangre entera, fracciones sanguínea, componentes de sangre, plasma, plaquetas, suero, fluido cerebroespinal (CSF), tejido cerebral, tejido de sistema nervioso, tejido de músculo, médula ósea, orina, lágrimas, tejido de sistema no nervioso, órganos y/o biopsias o necropsias. En modalidades preferidas, la muestra biológica comprende sangre, fracciones sanguíneas o componentes de sangre. La muestra puede ser una muestra no biológica. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para diagnosticar una enfermedad relacionada a priones en un sujeto al detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra biológica de un sujeto por cualquiera de los métodos de detección descritos en la presente. En otro aspecto, la invención incluye métodos para preparar un suministro sanguíneo que está sustancialmente libre de priones patógenos, el método que comprende los pasos de detectar alícuotas de sangre (por ejemplo, sangre entera, plasma, plaquetas o suero) de las muestras sanguíneas recolectadas por cualquiera de los métodos descritos en la presente; eliminar cualquier muestra en la cual se detecten los priones patógenos; y combinar muestras donde no se detecten priones patógenos para proporcionar un suministro sanguíneo sustancialmente libre de priones patógenos. En aún otro aspecto, la invención incluye métodos para preparar un suministro sanguíneo, en particular, un suministro de carne (por ejemplo, carne de vaca, carne de cordero, carne de carnero, o carne de puerco usadas para consumo humano o animal) que está sustancialmente libre de priones patógenos, el método que comprende los pasos de detectar, usando cualquiera de los métodos de detección descritos en la presente, muestras recolectadas de organismos muertos o vivos que entrarán en el suministro de alimentos o muestras recolectadas del alimento propuesto para entrar en el suministro de alimento; identificar muestras en las cuales se detecten priones patógenos; y remover del suministro de alimento cualquier organismo vivo o muerto o alimento propuesto para entrar en el suministro de alimento, en muestras de las cuales, se detectan los priones patógenos; proporciona de este modo un suministro de alimento que está sustancialmente libre de priones patógenos. En otro aspecto, la invención incluye varios kits para detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra, para aislar un prión patógeno de una muestra, para eliminar un prión patógeno de una muestra, el kit que comprende: uno o más de los reactivos de péptidos descritos en la presente; y/o cualquiera de los soportes sólidos que comprenden uno o más de los reactivos de péptidos descritos en la presente, anticuerpos anti-prión y otros reactivos necesarios, y opcionalmente, controles positivos y negativos y/o controles positivos sustitutos. La invención también proporciona moléculas útiles como control positivo sustituto para los ensayos descritos en la presente. Éstas y otras modalidades de la presente invención se presentarán fácilmente a aquéllos expertos en la técnica en vista de la descripción de la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa la secuencia de aminoácidos de las proteínas priónicasicas de humano (SEQ ID NO: 1) y de ratón (SEQ ID NO: 2) .

La Figura 2 representa una alineación de las proteínas priónicasicas de humano (SEQ ID NO: 3), hámster sirio (hámster) (SEQ ID NO: 4), bovino (SEQ ID NO: 5), oveja (SEQ ID NO: 6), ratón (SEQ ID NO: 7), alce (SEQ ID NO: 8), corzo (corzo) (SEQ ID NO: 9), cariacú (cariacú) (SEQ ID NO: 10), y corzo de cola blanca (blanco) (SEQ ID NO: 11). El alce, corzo, cariacú y ciervo de cola blanca variaron sólo entre sí en dos residuos, S/N 128 y Q/E 226 (mostrados en negritas ) . Las Figuras 3A-3F representan sustituciones peptoides de ejemplo que se pueden hacer para preparar cualquiera de los reactivos de péptidos descritos en la presente. Los peptoides están en círculo en cada figura y se muestran en un reactivo de péptido de ejemplo como se describe en la presente (SEQ ID NO: 14, QWNKPSKPKTN) , en el cual se reemplaza un residuo de prolina (residuo 8 de SEQ ID NO: 14) con un residuo de glicina N-sustituido (peptoide). La fig. 3A muestra un reactivo de péptido en el cual se sustituye un residuo de prolina con el residuo de peptoide: N- (S) - (1-feniletil) glicina; la fig. 3B muestra un reactivo de péptido en el cual se sustituye un residuo de péptido con el residuo de peptoide: N- ( 4-hidroxifenil ) glicina; la fig. 3C muestra un reactivo de péptido en el cual se sustituye un residuo de prolina con el residuo peptoide: N-(ciclopropilmetil) glicina; la fig. 3D muestra un reactivo de péptido en el cual se sustituye un residuo de prolina con el residuo peptoide: N- ( isopropil) glicina; la fig. 3E muestra un reactivo de péptido en el cual se sustituye un residuo de prolina con el residuo de peptoide: N-(3,5-dimetoxibencil) glicina; y la fig. 3F muestra un reactivo de péptido en el cual se sustituye un residuo de prolina con el residuo de peptoide: N-amino-butilglicina . La Figura 4 representa los resultados de los experimentos de Western Blot como se describe en el Ejemplo 2. Las sendas 1 y 2 muestran la presencia de proteínas priónicasicas en homogenados de cerebro de ratón normal (senda 1, marcada "C") y en homogenados de cerebro de ratón infectado desnaturalizados (senda 2, marcada "Sc"). Las sendas 3, 4 y 5 muestran la unión específica de un reactivo de péptido como se describe en la presente (SEQ ID NO: 68) a formas de priones patógenos en la presencia de plasma humano. En particular, la senda 3 es un control de plasma humano y la senda 4 es una muestra de homogenado de cerebro de ratón normal. La senda 5 muestra la fuerte unión por el reactivo de péptido a PrPSc en muestras de homogenado de cerebro de ratón infectado. La Figura 5 representa las estructuras de los reactivos de péptidos enlazados a PEG como se describe en la presente . La Figura 6 representa la estructura de (QWNKPSKPKTN)2K (SEQ ID NO: 133). Las Figuras 7A, 7B y 7C representan un ensayo de detección de PrPSc de ejemplo. La Figura 7A muestra la captura de PrPSc usando cuentas magnéticas revestidas con un reactivo de péptido específico a PrPSc como se describe en la presente. Las cuentas y la PrPSc unida se rebajan en un campo magnético y se lavan. La Figura 7B muestra la elusión, desnaturalización de PrPSc y el revestimiento de la PrPSc desnaturalizada a la cavidad para ELISA. La Figura 7C muestra la detección de la PrPSc revestida a las cavidades por ELISA de dos anticuerpos. La Figura 8 es una gráfica que representa la detección por ELISA del homogenado de cerebro de ratón de PrPSc a varias diluciones en homogenados de cerebro de ratón normal. Las Figuras 9A y 9B representan la detección por ELISA de la PrPSc de ratón introducida en muestras de plasma humano. La Figura 9A representa la detección por ELISA con QWNKPSKPKTN-biotina (SEQ ID NO: 14). La Figura 9B representa la detección por ELISA con biotina-GGGKRPKPGG (SEQ ID NO: 68) . Las Figuras 10A y 10B, representan la detección por ELISA y Western Blot, respectivamente, de la Figura 10A representa la detección por ELISA de PrPSc en hámster sirios normales e infectados con tembladera (SHa) . La Figura 10A representa la detección por ELISA de PrPSc rebajada sin digestión con proteinasa K usando QWNKPSKPKTN-biotina (SEQ ID NO: 14) (barras oscuras) o biotina-GGGKRPKPGG (SEQ ID NO: 68) (barras blancas) . La Figura 10B representa el análisis por Western Blot de las muestras digeridas con PK. "PM" se refiere al peso molecular. Las sendas 1 y 2 muestran análisis de dos diferentes muestras de homogenados de cerebro de SHa normales. Las sendas 3 y 4 muestran análisis de dos diferentes muestras de homogenados de cerebro de SHa de PrPsc. La senda 5 muestra análisis de los homogenados de cerebro de ratón normal. La senda 6 muestra el análisis de homogenados de cerebro de ratón de PrPs7 La Figura 11 es una gráfica que representa los resultados de ELISA en muestras obtenidas de ratones normales e infectados transgénicos para el gen de PrP de ciervo. La PrPSc se rebajó usando QWNKPSKPKTN-biotina (SEQ ID NO: 14) (rectángulos negros y gris claro) , biotina-KKKAGAAAAGAVVGLGG-CONH2 (SEQ ID NO: 136) (rectángulos gris claro), y GGGKRPKPGG (SEQ ID NO: 68) (rectángulos gris oscuro) y se detectó por ELISA. Las Figuras 12A y 12B, representan la detección por Western Blot y ELISA, respectivamente, de la Figura 12A representa la detección por análisis de Western Blot de CJD (sCJD, vCJD, SHa infectado) . La Figura 12B representa la detección por ELISA de CJD rebajado con digestión con Proteinasa K. La Figura 13 es una gráfica que representa la detección por ELISA de PrPSc de homogenados de cerebro de vCJD humano usando varios reactivos de péptidos como se describe en la presente. Los reactivos específicos de prión son como sigue: QWNKPSKPKTN-biotina (SEQ ID NO: 14); QWNKPSKPTKTNGGGQWNKPSKPKTN-biotina (SEQ ID NO: 51); biotina-QWNKPSKPKTN, en donde P5 está sustituida con N-(3,5-dimetoxibencil) glicina (SEQ ID NO: 117); biotina-QWNKPSKPKTN, donde P5 está sustituida con N-amino-butilglicina (SEQ ID NO: 118); biotina-QWNKPSKPKTN, donde P8 está sustituida con N-(ciclopropilmetil) glicina (SEQ ID NO: 111); biotina-QWNKPSKPKTN, donde P8 está sustituida con N-amino-butilglicina (SEQ ID NO: 114); biotina-QWNKPSKPKTN, donde P5 está sustituida con N- (ciclopropilmetil) glicina y P8 está sustituida con N-amino-butilglicina (SEQ ID NO: 131); biotina-QWNKPSKPKTN, donde P5 está sustituida con N-(isopropil) glicina y P8 está sustituida con N-(ciclopropilmetil) glicina (SEQ ID NO: 132); QWNKPSKPKTN2K-biotina (SEQ ID NO: 133); biotina-GGGKKRPKPGG (SEQ ID NO: 68); biotina-KKRPKPGG, donde P6 está sustituida con N- (ciclopropilmetil) glicina (SEQ ID NO: 122); biotina-GGGKKRPKPGGGQWNKPSKPKTN (SEQ ID NO: 81); 4-ramificación MAPS-GGGKKRPKPGGWNTGGG-biotina (SEQ ID NO: 134); 8-ramificación MAPS-GGGKKRPKPGGWNTGGG-biotina (SEQ ID NO: 135) ; biotina- KKKAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM (SEQ ID NO: 57); biotina-KKKAGAAAAGAVVGGLGG-CONH2 (SEQ ID NO: 136); y biotina-GGGKKKKKKKK (SEQ ID NO: 85) . La Figura 14 representa la detección cuando el reactivo de péptido se reviste sobre la cuenta antes de la incubación con la muestra sospechosa de contener un prión patógeno en comparación a la detección cuando el reactivo de péptido se reviste en la cuenta después de la incubación con la muestra. Pre-revestido (círculos negros) fue aproximadamente 100 veces más eficiente en la detección que el revestimiento post-incubación (círculos blancos).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para la detección de proteínas priónicas patógenas que combina el uso de reactivos de péptidos que interactúan preferencialmente con las proteínas priónicas patógenas (en comparación a las proteínas priónicasicas no patógenas) conjuntamente con un procedimiento de ELISA mejorado. La invención se refiere al descubrimiento sorprendente e inesperado que los péptidos relativamente pequeños (menos de 50 a 100 aminoácidos de longitud, de manera preferente menos de 50 aminoácidos de longitud y de manera aún más preferente menos de aproximadamente 30 aminoácidos de longitud) se pueden usar para discriminar entre proteínas priónicasicas no patógenas y patógenas. De esta manera, la presente descripción se refiere al hallazgo sorprendente que estos péptidos y derivados de los mismos (colectivamente "reactivos de péptidos"), pueden unirse a las formas de proteínas patógenas y no patógenas en diferente especificidad y/o afinidad, y por consiguiente, se pueden usar, y, en y por sí mismos, como reactivo de diagnóstico/detección o como componentes de composiciones terapéuticas. Antes de la presente descripción, se creyó que sólo se podrían usar moléculas más grandes (por ejemplo, anticuerpos, PrPc, rPrP de a-forma y plasminógeno) para diferenciar las formas patógenas y no patógenas. Como tales, los péptidos antigénicos descritos anteriormente se usaron para generar anticuerpos que se evaluaron para su capacidad para discriminar entre formas patógenas y no patógenas. Sin embargo, debido a la naturaleza relativamente no inmunogénica de las proteínas priónicas, ha probado ser difícil generar anticuerpos específicos para las formas patógenas. Ver, por ejemplo, R.A. Williamson et al. "Antibodies as Tools to Probé Prión Protein Biology" en PRIÓN BIOLOGY AND DISEASES, ed . S. Prusiner, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, Págs. 717-741. El descubrimiento que ciertos péptidos como se describe en la presente interactúan preferencialmente con las proteínas priónicas patógenas (PrPSc) permite el desarrollo de nuevos reactivos para diagnóstico, ensayos de detección y productos terapéuticos, inter alia. De esta manera, la invención se refiere a reactivos de péptidos y además, se refiere a ensayos de detección y ensayos de diagnóstico que utilizan estos reactivos de péptido, a métodos de purificación o aislamiento que utilizan estos reactivos de péptidos y composiciones terapéuticas que comprenden estos reactivos de péptido. También se proporcionan polinucleótidos que codifican para estos reactivos de péptido, y anticuerpos generados usando estos reactivos de péptido. Los reactivos de péptido, polinucleótidos y/o anticuerpos descritos en la presente son útiles en composiciones y métodos para detectar la presencia de priones patógenos, por ejemplo en una muestra biológica. Además, la invención se refiere adicionalmente a métodos para usar estos reactivos de péptido, anticuerpos y/o polinucleótidos como un componente en una composición terapéutica o profiláctica. Estos reactivos de péptidos usados en la invención comprenden un péptido que interactúa preferencialmente con las isoformas patógenas en comparación a las isoformas no patógenas. Por ejemplo, en ciertas modalidades, los reactivos de péptidos como se describen en la presente se unen de manera específica a las formas de la proteína patógena de la enfermedad conformacional y no se unen (o se unen a un menor grado) a las formas no patógenas. Los reactivos de péptidos descritos en la presente se pueden usar, por ejemplo, para generar anticuerpos. Estos anticuerpos pueden reconocer formas patógenas, formas no patógenas o ambas. Estas moléculas son útiles, solas o en varias combinaciones, en ensayos de diagnóstico y/o en composiciones profilácticas o terapéuticas. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. ver, por ejemplo, Remington ' s Pharma ceuti cal Sciences , 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); and Handbook of Experimen tal Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Labora tory Manual (2nd Edition, 1989) ; Handbook of Surfa ce and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997); Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed. (Ausubel et al. Eds., 1999, John Wiley & Sons); Molecular Biology Techniques : An In tensive Labora tory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press); PCR ( In troduction to Biotechniques Series ) , 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag) ; Peteres y Dalrymple, Fields Virology (2d ed) , Fields et al. (eds.), B.N. Raven Press, New York, NY. Se entiende que los reactivos de péptido, anticuerpos y métodos de esta invención no se limitan a formulaciones o parámetros particulares de proceso puesto que como tales por supuesto pueden variar. También se va a entender que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares de la invención únicamente, y no se propone que sea limitante. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan de este modo como referencia en su totalidad.

I. Definiciones A fin de facilitar un entendimiento de la invención, se analizarán más adelante términos seleccionados usados en la solicitud. Los términos "prión", "proteína priónica", "proteína PrP" y "PrP" se usan de manera indistinta en la presente para referirse tanto a la forma de proteína patógena (referida de manera variada como una proteína de tembladera, forma de proteína patógena, isoforma patógena, prión patógeno y PrPSc) y la forma no patógena (referida de manera variada como forma de proteína celular, isoforma celular, isoforma no patógena, proteína priónica no patógena, y PrPc) , así como la forma desnaturalizada y varias formas recombinantes de la proteína priónica que no pueden tener ya sea la conformación patógena o la conformación cerebral normal. La forma de proteína patógena se asocia con el estado de enfermedad (encefalopatías espongiformes) en humanos y animales; la forma no patógena está normalmente presente en células animales y se puede convertir, bajo condiciones apropiadas, a la conformación PrPSc patógena. Los priones se producen de manera natural en una amplia variedad de especies de mamífero, incluyendo humano, oveja, ganado y ratones. Una secuencia de aminoácidos representativa de una proteína priónica humana se expone en SEQ ID NO: 1. Una secuencia de aminoácidos representativa de una proteína priónica de ratón se expone como SEQ ID NO: 2. En la Figura 2 se muestran otras secuencias representativas. Como se usa en la presente, el término "patógeno" puede significar que la proteína provoca realmente la enfermedad o puede significar simplemente que la proteína se asocia con la enfermedad y por lo tanto está presente cuando se presenta la enfermedad. De esta manera, una proteína patógena como se usa con respecto a esta descripción no es necesariamente una proteína que es el agente causante específico de una enfermedad. Las formas patógenas pueden ser o no infecciosas. El término "forma de prión patógeno" se usa de manera más específica para referirse ala conformación y/o la conformación rica en la beta-hoja de las proteínas priónicas de mamífero, aviar o recombinante. En general, la conformación rica en beta-hoja es resistente a proteinasa K. Los términos "no patógeno" y "celular" cuando se usan con respecto a las formas de la proteína de enfermedad conformacional se usan de manera indistinta para referirse a la isoforma normal de la proteína cuya presencia no se asocia con enfermedad. Adicionalmente, una "proteína priónica" o "proteína de enfermedad conformacional" como se usa en la presente no se limita a un polipéptido que tiene la secuencia exacta a aquélla descrita en la presente. Es fácilmente evidente que los términos abarcan las proteínas de enfermedad conformacional de cualquiera de las especies o enfermedades identificadas sobre enfermedades (por ejemplo, Alzheimer, Parkinson, etc.) . Un experto en la técnica en vista de las enseñanzas de la presente invención y de la técnica pueden determinar las regiones que corresponden a la secuencias mostradas en las figuras en cualquier otra proteína prión, usando por ejemplo, los programas de comparación de secuencias (por ejemplo, BLAST y otros descritos en la presente) o la identificación y alineación de las características o porciones estructurales. El término "gen PrP" se usa en la presente para describir cualquier material genético que exprese proteínas priónicas incluyendo polimorfismos conocidos y mutaciones patógenas conocidas. El término "gen PrP" se refiere en general a cualquier gen de cualquier especie que codifique para cualquier forma de una proteína PrP. Algunas secuencias de PrP comúnmente conocidas se describen en Gabriel et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89: 9097-9101 (1992) y en las patente de los Estados Unidos números 5,565,186; 5,763,740; 5,792,901; y la WO 97/04814, incorporadas en la presente como referencia para describir y revelar estas secuencias. El gen PrP puede ser de cualquier animal, incluyendo los animales "hospedadores" y "de prueba" descritos en la presente y cualquiera y todos los polimorfismos y mutaciones del mismo, que se reconozcan que los términos incluyan otros genes PrP que aún se van a descubrir. La proteína expresada por este gen puede asumir ya sea una forma PrPc (no enfermedad) o PrPSc (enfermedad) . La "enfermedad relacionada a prión" como se usa en la presente se refiere a una enfermedad provocada en totalidad o en parte por una proteína priónica patógena (PrPSc). Las enfermedades relacionadas a prión incluyen, pero no se limitan a, tembladera, encefalopatía espongiformes bovinas (BSE) , enfermedad de las vacas locas, encefalopatía espongiformes felinas, kuru, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) , nueva enfermedad variante de Creutzfeldt-Jakob (nvCJD) , enfermedad de desaprovechamiento crónico (CWD) , enfermedad de Gertsmann-Strassler-Scheinker (GSS) , e insomnio familiar fatal (FFI) . El término "reactivo de péptido" como se usa en la presente se refiere en general a cualquier compuesto que comprende polímeros sintéticos o que se presentan de forma natural de moléculas de aminoácido o tipo aminoácido, incluyendo pero no limitado a, compuestos que comprenden sólo moléculas amino y/o imino. Los reactivos de péptidos de la presente invención interactúan de manera preferencial con una proteína priónica patógena y se derivan típicamente de fragmentos de una proteína priónica. El término "péptido" se usará de manera indistinta con "oligopéptido" o "polipéptido" y no implica tamaño particular por el uso de estos términos. Incluidos dentro de la definición están, por ejemplo, péptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, peptoides, etc.), péptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto que se presentan de manera natural como que no se presentan de manera natural (por ejemplo, sintéticas) . De esta manera, se incluyen dentro de esta definición los péptidos sintéticos, dímeros, multímeros (por ejemplo, repeticiones en tándem, formas de péptidos antigénicos múltiples (MAP) , péptidos linealmente enlazados), moléculas ramificadas, ciclizadas y similares. Los términos también incluyen moléculas que comprenden uno o más residuos de glicina N-sustituidos (un "peptoide") y otros aminoácidos o péptidos sintéticos. (Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos números 5,831,005; 5,877,278; y 5,997,301; Nguyen et al. (2000) Chem Biol . 1 ( 1 ) : 463-473; y Simón et al. (1992) Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA 89(20): 9367-9371 para descripciones de peptoides). Las longitudes no limitantes de los péptidos adecuados para el uso en la presente invención incluyen péptidos de 3 a 5 residuos de longitud, de 6 a 10 residuos de longitud (o cualquier número entero entre estos), de 11 a 20 residuos de longitud (o cualquier número entero entre estos), de 21 a 75 residuos de longitud (o cualquier número entero entre estos), de 75 a 100 (o cualquier número entero entre estos) , o polipéptidos de más de 100 residuos de longitud. Típicamente, los péptidos útiles en esta invención pueden tener una longitud máxima adecuada para la aplicación propuesta. De manera preferente, el péptido es entre aproximadamente 3 y 100 residuos de longitud. En general, un experto en la técnica puede seleccionar fácilmente la longitud máxima en vista de las enseñanzas en la presente. Adicionalmente, los reactivos de péptidos como se describen en la presente, por ejemplo, péptidos sintéticos, pueden incluir moléculas adicionales tal como marcas, ligadores, u otras porciones químicas (por ejemplo, biotina, tintes específicos amiloides tal como rojo de control o tioflavina). Estas porciones pueden mejorar adicionalmente la interacción de los péptidos con las proteínas priónicas y/o la detección adicional de las proteínas priónicasicas. Los reactivos de péptidos también incluyen derivados de las secuencias de aminoácidos de la invención que tienen una o más sustituciones, adiciones y/o supresiones, incluyendo uno o más aminoácidos que no se presentan de manera natural. De manera preferente, los derivados exhiben al menos 50 % de identidad a cualquier secuencia de referencia o tipo silvestre, de manera preferente al menos aproximadamente 70 % de identidad, de manera más preferente al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ó 100 % de identidad de secuencia a cualquier secuencia de referencia o tipo silvestre descrita en la presente. La identidad de secuencia (o por ciento) se puede determinar como se describe más adelante. Estos derivados pueden incluir modificaciones post-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación, y similares . Los derivados de péptidos también pueden incluir modificaciones a la secuencia natural, tal como supresiones, adiciones y sustituciones (en general de naturaleza conservadora) , en tanto que el polipéptido mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones del hospedador que produzcan las proteínas o errores debido a la amplificación por PCR. Adicionalmente, se pueden hacer modificaciones que tengan uno o más de los siguientes efectos: reducción de toxicidad; incremento de afinidad y/o especificidad para proteínas priónicas; facilitación del procesamiento celular (por ejemplo, secreción, presentación de antígeno, etc.); y facilitación de la presentación a células B y/o células T. Los polipéptidos descritos en la presente se pueden elaborar de manera recombinante, de forma sintética, purificar de fuentes naturales, o en cultivo de tej ido. Un "fragmento" como se usa en la presente se refiere a un péptido que consiste de sólo una parte de la proteína intacta de longitud completa y la estructura como se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, un fragmento puede incluir una supresión C-terminal y/o una supresión N-terminal de una proteína. Típicamente, el fragmento retiene una, alguna o todas las funciones de la secuencia de polipéptido de longitud completa de la cual se deriva. Típicamente, un fragmento comprenderá al menos 5 residuos consecutivos de aminoácido de la proteína natural; de manera preferente, al menos aproximadamente 8 residuos consecutivos de aminoácido; de manera más preferente, al menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 residuos consecutivos de aminoácidos de la proteína natural. El término "polinucleótido", como se conoce en la técnica, se refiere en general a una molécula de ácido nucleico. Un "polinucleótido" puede incluir secuencias tanto de doble hebra como de hebra individual y se refiere a, pero no se limita a, secuencias procarióticas, ARNm eucariótico, ADNc de viral, ARNm procariótico o eucariótico, secuencias genómicas de ARN y ADN de viral (por ejemplo, virus y retrovirus de ARN y ADN) , ARN procariótico y ADN eucariótico (por ejemplo de mamífero), y especialmente secuencias sintéticas de ADN. El término también captura secuencias que incluyen cualquiera de los análogos base conocidos de ADN y ARN, e incluye modificaciones tal como supresiones, adiciones y sustituciones (en general de naturaleza conservadora) , a la secuencia natural. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de la mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de los hospedadores incluyendo polinucleótidos que codifican para priones. Las modificaciones de los polinucleótidos pueden tener cualquier número de efectos que incluyen, por ejemplo, facilitación de la expresión del producto polipeptídico en una célula hospedadora. Un polinucleótido puede codificar para una proteína o polipéptido biológicamente activo (por ejemplo, inmunogénico o terapéutico) . Dependiendo de la naturaleza del polipéptido codificado por el polinucleótido, un polinucleótido puede incluir tan poco como 10 nucleótidos, por ejemplo, donde el polinucleótido codifique para un antígeno o epítopo. Típicamente, el polinucleótido codifica para péptidos de al menos 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 o aún más aminoácidos. Una "secuencia de codificación de polinucleótido" o una secuencia que "codifica para" un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso del ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas (o "elementos de control"). Los límites de la secuencia de codificación se determinan por un codón de inicio en el término 5' (amino) y un codón finalizador de traducción en el término 3' (carboxi). Una secuencia de terminación de trascripción se puede localizar 3' a la secuencia de codificación. Los "elementos de control" típicos, incluyen, pero no se limitan a, reguladores de trascripción, tal como promotores, elementos mejoradores de trascripción, señales de terminación de trascripción, y secuencias de poliadenilación; y reguladores de traducción, tal como secuencias para optimización de iniciación de traducción , por ejemplo, secuencias de Shine-Dalgarno (sitio de unión a ribosoma), secuencia Kozak (es decir, secuencias para la optimización de traducción, localizadas, por ejemplo, 5' a la secuencia de codificación), secuencias guía (heterólogas o naturals), codón de iniciación de traducción (por ejemplo, ATG), y secuencias de terminación de traducción. Los promotores pueden incluir promotores inducibles (donde la expresión de una secuencia de polinucleótido enlazada operablemente al promotor se induce por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), promotores reprensibles (donde la expresión de una secuencia de polinucleótido enlazada operablemente al promotor se induce por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), y promotores constitutivos. "Enlazado operablemente" se refiere a un arreglo de elementos en donde los componentes descritos de este modo se configuran para realizar su función usual. De esta manera, un promotor determinado enlazado operablemente a una secuencia codificante es capaz de efectuar la expresión de la secuencia codificante cuando están presentes las enzimas apropiadas. El promotor no necesita estar contiguo con la secuencia codificante, en tanto que funcione para dirigir la expresión de la misma. De esta manera, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias de intervención, no traducidas, aún trascritas, entre la secuencia promotora y la secuencia codificante y la secuencia promotora se puede considerar aún "enlazada operablemente" a la secuencia codificante.

Una molécula de ácido nucleico "recombinante" como se usa en la presente para describir una molécula de ácido-nucleico significa un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, semisintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no se asocia con todos o una porción de polinucleótido con el cual se asocia en el naturaleza; y/o (2) se enlaza a un polinucleótido diferente al cual se enlaza la naturaleza. El término "recombinante" como se usa con respecto a una proteína o polipéptido significa un polipéptido producido por la expresión de un polinucleótido recombinante. Las "células hospedadoras recombinantes", "células hospedadoras", "células", "líneas de células", "cultivos celulares" y otros de estos términos denotan microorganismos procarióticos o líneas de células eucarióticas cultivados como entidades unicelulares, se usa de manera indistinta, y se refiere a células que se pueden usar, o se han usado, como receptores de vectores recombinantes u otro ADN de transferencia, e incluye la progenie de la célula original que se ha transfectado. Se entiende que la progenie de una célula individual de origen no puede ser necesariamente idéntica de forma completa en la morfología o en el complemento de ADN total o genómico al original, debido a la mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula de origen que es suficientemente similar al origen que se va a caracterizar por al propiedad pertinente, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido deseado, se incluyen en la progenie propuesta por esta definición, y se convierten por los términos anteriores. Por "aislado" se quiere decir, cuando se refiere a un polinucleótido o un polipéptido, que la molécula indicada se separa y es discreta del organismo completo con el cual se encuentra la molécula en la naturaleza, o cuando el polinucleótido o polipéptido no se encuentra en la naturaleza, está suficientemente libre de otras macromoléculas biológicas de modo que el polinucleótido o polipéptido se puede usar para su propósito propuesto. "Anticuerpo" como se conoce en la técnica incluye una o más porciones biológicas que, a través de un medio químico o físico, puede unirse a, o asociarse con, un epítopo de un polipéptido de interés. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden interactuar preferencialmente con (por ejemplo, unirse específicamente a), conformaciones de priones patógenos. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos obtenidos tanto de preparaciones policlonales como monoclonales, así como lo siguiente: moléculas de anticuerpos híbridos (quiméricos) (ver, por ejemplo, Winter et al. (1991) Nature 349 : 293-299; y patente de los Estados Unidos número 4,816,567; fragmentos F(ab')2 y F(ab); moléculas Fv (heterodímeros no covalentes, ver, por ejemplo, Inbar et al. (1972) Proc Na ti Acad Sci EUA 69: 2659-2662; y Ehrlich et al. (1980) Biochem 19: 4091-4096); moléculas Fv de cadena individual (sFv) (ver, por ejemplo, Huston et al. (1988) Proc Na ti Acad Sci EUA ¡35: 5897-5883) ; construcciones de fragmentos de anticuerpo dimérico y trimérico; minicuerpos (ver, por ejemplo, Pack et al. (1992) Biochem 31: 1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B: 120-126); moléculas de anticuerpos humanizados (ver, por ejemplo, Riechmann et al. (1988) Na ture 332: 323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239 : 1534-1536; y publicación de patente del Reino Unido número GB 2,276,169, publicada el 21 de septiembre de 1994); y, cualquier fragmento funcional obtenido de estas moléculas, en donde estos fragmentos retienen las propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo de origen. El término "anticuerpo" incluye adicionalmente anticuerpos obtenidos a través de procesos no convencionales, tal como exhibición en fagos. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpo que tiene una población homogénea de anticuerpos. El término no se limita con respecto a la especie o fuente del anticuerpo, ni se propone que se limite por la manera en la cual se hace. De esta manera, el término abarca anticuerpos obtenidos de hibridomas murinos, así como anticuerpos monoclonales humanos obtenidos usando hibridomas humanos en lugar de murinos.

Ver, por ejemplo, Cote, et al. Monoclonal An tibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, 1985, Pág. 77. Si se desean anticuerpos policlonales, un mamífero seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) se inmuniza en general con una composición inmunogénica (por ejemplo, un reactivo de péptido como se describe en la presente) . Se recolecta el suero del animal inmunizado y se trata de acuerdo a procedimientos conocidos. Si el suero que contiene los anticuerpos policlonales al reactivo de péptido seleccionado contiene anticuerpos a otros antígenos, los anticuerpos policlonales se pueden purificar por cromatografía de afinidad. Las técnicas para producir y procesar antisueros policlonales se conocen en la técnica, ver por ejemplo, Mayer y Walter, eds. (1987) IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, Londres) . Un experto en la técnica puede producir también fácilmente anticuerpos monoclonales dirigidos contra reactivos de péptidos descritos en la presente. Es bien conocida la metodología general para elaborar anticuerpos monoclonales por hibridomas. Las líneas celulares que producen anticuerpos inmortales se pueden emplear por fusión celular, y también por otras técnicas tal como transformación directa de B-linfocitos con ADN oncogénico, o transfección con virus de Epstein-Barr. Ver, por ejemplo, M. Schreier et al. (1980) HYBRIDOMA TECHNIQUES; Hammerling et al. (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS; Kennett et al. (1980) MONOCLONAL ANTIBODIES; ver también, patentes de los Estados Unidos números 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; y 4,493,890. Como se usa en la presente, un "anticuerpo de dominio individual" (dAb) es un anticuerpo que está comprendido de un dominio VH, que se une de manera específica con un antígeno designado. Un dAb no contiene un dominio VL, pero puede contener otros dominios de unión a antígeno conocidos como que existen en los anticuerpos, por ejemplo, los dominios kappa y lambda. Los métodos para preparar dAb se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Ward et al, Nature 341: 544 (1989) . Los anticuerpos también pueden estar comprendidos de los dominios VH y VL, así como otros dominios conocidos de unión a antígeno. Los ejemplos de estos tipos de anticuerpos y métodos para su preparación se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos número 4,816,467, que se incorpora en la presente como referencia) , e incluye lo siguiente. Por ejemplo, los "anticuerpos vertebrados" se refieren a anticuerpos que son tetrámeros o agregados de los mismos, que comprenden cadenas ligeras y pesadas que usualmente se agregan en una configuración "Y" y que pueden tener o no enlaces covalentes entre las cadenas. En los anticuerpos vertebrados, las secuencias de aminoácidos de las cadenas son homologas con aquéllas secuencias encontradas en los anticuerpos producidos en los vertebrados, ya sea in situ o in vitro (por ejemplo, en hibridomas). Los anticuerpos vertebrados incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales purificados y anticuerpos monoclonales, los métodos para la preparación de los cuales se describen infra. "Anticuerpos híbridos" son anticuerpos donde las cadenas son homologas de manera separada con referencia a las cadenas de anticuerpo de mamífero y representan nuevos montajes de ésta, de modo que son precipitables dos antígenos diferentes por el tetrámero o agregado. En los anticuerpos híbridos, un par de cadenas pesada y ligera son homologas a aquéllas encontradas en un anticuerpo formulado contra un primer antígeno, en tanto que un segundo par de cadenas son homologas a aquéllas encontradas en un anticuerpo formado contra un segundo anticuerpo. Esto da por resultado en la propiedad de "divalente", es decir, la capacidad para unirse simultáneamente a dos antígenos. Estos híbridos también se pueden formar usando cadenas quiméricas, como se expone más adelante . "Anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos en los cuales en las cadenas pesada y/o ligera son proteínas de fusión. Típicamente, una porción de las secuencias de aminoácido de la cadena es homologa a las secuencias correspondientes en un anticuerpo derivado de una especie particular o una clase particular, en tanto que el segmento restante de la cadena es homólogo a las secuencias derivadas de otra especie y/o clase. Usualmente, la región variable de las cadenas tanto ligeras como pesadas imita las regiones variables o anticuerpos derivados de una especie de vertebrados, en tanto que las porciones constantes son homologas a las secuencias en los anticuerpos derivados de otra especie de vertebrados. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo particular. También se incluye cualquier anticuerpo en el cual cualquiera o ambas de las cadenas pesada o ligera se componen de combinaciones de secuencias que imitan las secuencias en los anticuerpos de diferentes fuentes, ya sea que estas fuentes sean de diferentes clases o de diferente especie de origen, y si o no el punto de fusión esté en el límite variable/constante. De esta manera, es posible producir anticuerpos en los cuales ni la región constante ni la región variable imitan las secuencias conocidas de anticuerpos. Entonces llega a ser posible, por ejemplo, construir anticuerpos cuya región variable tenga una mayor afinidad específica para un antígeno particular, o cuya región constante pueda producir fijación mejorada de complemento, o hacer otras mejoras en las propiedades poseídas por una región constante particular. Otro ejemplo son "anticuerpos alterados", que se refieren a anticuerpos en los cuales la secuencia de aminoácidos que se presentan de forma natural en un anticuerpo vertebrado se ha variado. Utilizando técnicas de ADN recombinante, se pueden rediseñar los anticuerpos para obtener características deseadas. Las variaciones posibles son muchas, y varían desde el cambio de uno o más aminoácidos al rediseño completo de una región, por ejemplo, la región constante. Los cambios en la región constante, en general, logran características deseadas del proceso celular, por ejemplo, cambios en la fijación del complemento, interacción con membranas, y otras funciones efectoras. Los cambios en la región variable se pueden hacer para alterar las características de unión a antígeno. El anticuerpo también se puede manejar para ayudar en la distribución específica de una molécula o sustancia a una célula o sitio de tejido específico. Las alteraciones deseadas se pueden hacer por técnicas conocidas en biología molecular, por ejemplo, técnicas recombinantes, mutagénesis dirigida al sito, etc. Aún otro ejemplo son los "anticuerpos univalentes", que son agregados comprendidos de un dímero de cadena pesada/cadena ligera unido a la región Fe (es decir, de estirpe) de una segunda cadena pesada. Este tipo de anticuerpo escapa de la modulación antigénica. Ver, por ejemplo, Glennie et al. Nature 295: 712 (1982). Incluidos dentro de la definición de los anticuerpos están los fragmentos "Fab" de anticuerpos. La región "Fab" se refiere a aquéllas porciones de las cadenas pesada y ligera que son bastante equivalentes, o análogas, a las secuencias que comprenden la porción de ramificación de las cadenas pesada y ligera, y que se han mostrado que exhiben unión inmunológica a un antígeno específico, pero que carecen de la porción "Fe" efectora. "Fab" incluye agregados de una cadena pesada y una cadena ligera (conocida comúnmente como Fab'), así como tetrámeros que contienen las cadenas 2H y 2L (referida como F(ab)2), que son capaces de reaccionar selectivamente con un antígeno designado o familia de antígenos. Los anticuerpos de Fab se pueden dividir en subconjuntos análogos a aquéllos descritos anteriormente, es decir, "Fab de vertebrado", "Fab híbrido", "Fab quimérico", y "Fab alterado". Los métodos para producir fragmentos de Fab de los anticuerpos se conocen dentro de la técnica e incluyen, por ejemplo, proteólisis, y síntesis por técnicas recombinantes. El "complejo antígeno-anticuerpo" se refiere al complejo formado por un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo en un antígeno. Un péptido (o reactivo de péptido) se dice que "interactúa" con otro péptido o proteína si se une específicamente, de manera no específica o en alguna combinación de unión específica y no específica. Un péptido (o reactivo de péptido) se dice que "interactúa preferencialmente" con una proteína priónica patógena si se une con mayor afinidad y/o mayor especificidad a la forma patógena que a las isoformas no patógenas. Un reactivo de péptido que interactúa preferencialmente con una proteína priónica patógena también se refiere en la presente como un reactivo de péptido específico al prión patógeno. Se va a entender que una interacción preferencial no requiere necesariamente interacción entre los residuos específicos de aminoácido y/o las porciones de cada péptido. Por ejemplo, en ciertas modalidades, los reactivos de péptidos descritos en la presente interactúan preferencialmente con isoformas patógenas pero, sin embargo, pueden ser capaces de la unión a las isoformas no patógenas a un nivel débil, pero aún detectable, (por ejemplo, 10 % o menos de la unión mostrada al polipéptido de interés). Típicamente, la unión débil, o unión de fondo, es fácilmente discernible de la interacción preferencial con el compuesto o polipéptido de interés, por ejemplo, por el uso de controles apropiados. En general, los péptidos de la invención se unen a priones patógenos en la presencia de un exceso de 106 de formas no patógenas. El término "afinidad" se refiere a la fuerza de unión y se puede expresar cuantitativamente como una constante de disociación (Kd) . De manera preferente, un péptido (o reactivo de péptido) que interactúa preferencialmente con una isoforma no patógena interactúa preferentemente con la isoforma patógena con al menos una afinidad 2 veces mayor, de manera más preferente al menos una afinidad 10 veces mayor y de manera aún más preferente una afinidad al menos 100 veces mayor que lo que interactúa con la isoforma no patógena. La afinidad de unión (es decir, Kd) se puede determinar usando técnicas normales. Las técnicas para determinar la "similitud" o "por ciento de identidad" de la secuencia de aminoácidos son bien conocidas en la técnica. En general, "similitud" significa la comparación aminoácido a aminoácido de dos o más polipéptidos en el lugar apropiado, donde los aminoácidos son idénticos o poseen propiedades químicas y/o físicas similares tal como carga o hidrofobicidad. Un llamado "por ciento de identidad" entonces se puede determinar entre las secuencias de polipéptido comparadas. Las técnicas para determinar la identidad de las secuencia de aminoácidos y de ácido nucleico también son bien conocidas en la técnica e incluye determinar la secuencia de nucleótidos del ARNm para este gen (usualmente mediante un intermedio de ADNc) y determinar la secuencia de aminoácidos codificada de este modo, y comparar ésta a una secuencia de aminoácidos. En general, la "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias de polipéptido, respectivamente. Se pueden comparar dos o más secuencias de aminoácidos o polinucleótidos al determinar su "por ciento de identidad". El por ciento de identidad se puede determinar por una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas (la secuencia de referencia y una secuencia con % de identidad desconocido a la secuencia de referencia) al alinear las secuencias, contando el número exacto de correspondencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia de referencia, y multiplicando el resultado por 100. Se pueden usar programas de computadora fácilmente disponible para ayudar en el análisis, tal como ALIGN, Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3_: 353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Advances in Appl . Ma th . 2 : 482-489, 1981 para el análisis de péptidos. Los programas para determinar la identidad de la secuencia de nucleótidos están disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, Wl) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que dependen del algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas se utilizan fácilmente con los parámetros por omisión recomendados por el fabricante y se describen en el paquete de análisis de secuencia Wisconsin referido anteriormente. Por ejemplo, se puede determinar el por ciento de identidad de una secuencia de nucleóticos particular a una secuencia de referencia usando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por omisión y una penalidad de separación de seis posiciones de nucleótidos. Otro método para establecer el por ciento de identidad en el contexto de la presente invención es usar el paquete MPSRCHMR de programas poseídos por la Universidad de Edinburgn, desarrollados por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y disponible de numerosas fuentes, por ejemplo en la Internet. De esta suite de paquetes, el algoritmo de Smith-Waterman se puede emplear donde se usen los parámetros por omisión para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalidad de abertura de separación de 12, penalidad de extensión de separación de uno, y una separación de seis) . De los datos generados, el valor de "correspondencia" refleja la "identidad de secuencia". En general se conocen en la técnica otros programas adecuadas para calcular el por ciento de identidad o la similitud entre las secuencias, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, usado con parámetros por omisión o por defecto. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP se pueden usar usando los siguientes parámetros por defecto: código genético = normal; filtro = ninguno; hebra = ambas; corte = 60; escisión = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificado por = alta puntuación; base de datos = no redundante, BenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS traducciones + proteína suiza + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas están fácilmente disponibles. Una "composición inmunogénica" como se usa en la presente se refiere a cualquier composición (por ejemplo, péptido, anticuerpo y/o polinucleótidos) donde la administración de la composición a un sujeto da por resultado el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmunitaria celular y/o humoral. La composición inmunogénica se puede introducir directamente en un sujeto receptor, tal como por inyección, inhalación, oral, intranasal o cualquier otra ruta parenteral o mucosal (por ejemplo, de manera intra-rectal o intra-vaginal) de administración. Por "epítopo" se quiere decir un sitio en un antígeno en el cual las células B y/o células T específicas responden, volviendo a la molécula que incluye este epítopo capaz de producir una reacción inmunológica o capaz de reaccionar con anticuerpos presentas en una muestra biológica. El término también se usa de manera indistinta con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Un epítopo puede comprender 3 o más aminoácidos en una conformación espacial única al epítopo. En general, un epítopo consiste de al menos 5 de estos aminoácidos y más usualmente, consiste de al menos 8-10 de estos aminoácidos. Se conocen en la técnica los métodos para determinar la conformación espacial de los aminoácidos e incluyen, por ejemplo, cristalografía por rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional. Adicionalmente, la identificación de los epítopos en una proteína determinada se logra fácilmente usando técnicas bien conocidas, tal como por el uso de estudios de hidrofobicidad y por serología dirigida al sitio. Ver, también, Geysen et al., Proc . Na ti . Acad. Sci EUA (1984) 81 : 3998-4002 (método general para sintetizar rápidamente péptidos para determinar la ubicación de epítopos inmunogénicos en un antígeno determinado) ; patente de los Estados Unidos número 4,708,871 (procedimientos para identificar y sintetizar químicamente epítopos de antígenos); y Geysen et al., Molecular Immunology (1986) 2_3: 709-715 (técnica para identificar péptidos con alta afinidad para un anticuerpo determinado) . Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo se pueden identificar en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno objetivo. Una "respuesta inmunológica" o "respuesta inmunitaria" como se usa en la presente es el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmunitaria humoral y/o celular a un péptido como se describe en la presente cuando el polipéptido está presente en una composición de vacuna. Estos anticuerpos también pueden neutralizar la infectividad, y/o mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo o del anticuerpo-complemento para proporcionar protección a un hospedador inmunizado. Se puede determinar la reactividad inmunológica en inmunoensayos normales, tal como ensayos de competición, bien conocidos en la técnica. La "transferencia génica" o "distribución génica" se refieren a métodos o sistemas para insertar de manera confiable ADN de interés en una célula hospedadora. Estos métodos pueden dar por resultado expresión momentánea del ADN transfectado no integrado, replicación y expresión extracromosómica de replicones transfectados (por ejemplo, episomas), o integración del material genético transferido en el ADN genómico de las células hospedadoras. Los vectores de expresión de distribución génica incluyen, pero no se limitan a, vectores derivados de alfa-virus, virus de viruela y virus de vacccinia. Cuando se usan para inmunización, estos vectores de expresión de distribución génica se pueden referir como vacunas o vectores de vacuna. El término "muestra" incluye múltiples biológicas y no biológicas. Las muestras biológicas son aquéllas obtenidas o derivadas de un organismo vivo o antiguamente vivo. Las muestras no biológicas no se derivan de organismos vivos o antiguamente vivos. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, muestras derivadas de un animal (vivo o muerto) tal como órganos (por ejemplo, cerebro, hígado, riñon, etc.), sangre entera, fracciones sanguíneas, plasma, fluido cerebroespinal (CSF) , orina, lágrimas, tejido, órganos, biopsias. Los ejemplos de muestras no biológicas incluyen productos farmacéuticos, alimentos, cosméticos y similares. Los términos "marca" y "marca detectable" se refieren a una molécula capaz de detección, incluyendo, pero no limitada a, isótopos reactivos, agentes fluorescentes, agentes luminiscentes, agentes quimioluminiscentes, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, cromóforos, tintes, iones metálicos, soluciones coloidales metálicas, ligandos (por ejemplo, biotina o hapteno) y similares. El término "agente fluorescente" se refiere a una sustancia o una porción de la misma que es capaz de exhibir fluorescencia en el intervalo detectable. Los ejemplos particulares de las marcas que se pueden usar con la invención incluyen, pero no se limitan a fluoresceína, rodamina, dansilo, umbeliferota, rojo de Texas, luminol, esteres de acridinio, NADPH, beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano, glucosa-oxidasa, fosfatasa alcalina y ureasa. Le marca también pueden ser una marca de epítopo (por ejemplo, marca de His-His), un anticuerpo o un oligonucleótido amplificable o detectable de otro modo.

II. Apreciación General Se describen en la presente métodos para detectar un prión patógeno en una muestra usando un reactivo de péptido en el cual el reactivo de péptido es capaz de distinguir entre isoformas patógenas y no patógenas de proteínas priónicas, por ejemplo al interactuar preferencialmente con una forma y no con la otra. Utilizando estos reactivos de péptido, los presentes inventores han desarrollado un método sensible para detectar la presencia de priones patógenos en una muestra. Los reactivos de péptidos se describen en la presente y también se describen en las solicitudes co-poseídas de patente de los Estados Unidos número de serie 10/917,646, presentada el 13 de agosto de 2004; número de serie 11/056,950, presentada el 11 de febrero del 2005; y solicitud PCT número PCT/US2004 /026363, presentada el 13 de agosto de 2004. Debido a que los reactivos de péptidos interactúan preferencialmente con la forma patógena del prión, se pueden usar para separar y concentrar de manera efectiva los priones patógenos de muestras que contienen tanto proteínas priónicas celulares (es decir, no patógenas) como proteínas priónicas patógenas. Diferente de los métodos descritos anteriormente para detectar PrPSc, no es necesaria la digestión con proteinasa K u otra proteasa. Los reactivos de péptidos se proporcionan típicamente en un soporte sólido, de manera preferente una cuenta magnética, a fin de lograr fácilmente la separación de las proteínas priónicas patógenas, que se unen al reactivo de péptido, de otros componentes de la muestra, especialmente de proteínas priónicasicas no patógenas. Los priones patógenos unidos se pueden lavar opcionalmente para remover cualquier traza de los materiales no unidos. Los priones patógenos unidos entonces se pueden disociar del reactivo de péptido por la adición de agentes caotrópicos o de manera preferente al cambiar el pH .

III. A. Reactivos de Péptidos La invención depende en parte del descubrimiento por los presentes inventores que fragmentos relativamente pequeños de una proteína priónica pueden interactuar preferencialmente con la forma patógena del prión. Estos fragmentos no necesitan ser parte de una estructura de proteína más grande u otro tipo de molécula de núcleo molecular a fin de exhibir esta interacción preferencial con la isoforma de prión patógeno. En tanto que no se desea que se mantenga ninguna teoría particular, parece que los fragmentos de péptido toman espontáneamente una conformación que permite la unión a la isoforma de prión patógeno pero no a la isoforma de prión no patógeno, quizá al imitar una conformación que está presente en la isoforma no patógena. Este principio general, que ciertos fragmentos de una proteína de enfermedad conformacional interactúan preferencialmente con la forma patógena de esa proteína de enfermedad conformacional, aquí demostrado para priones, se puede aplicar fácilmente a otras proteínas de enfermedad conformacional para producir reactivos de péptidos que interactúan preferencialmente con las formas patógenas. Será evidente para un experto en la técnica que, en tanto que los fragmentos proporcionan un punto de inicio (en términos del tamaño o características de secuencia, por ejemplo), que se pueden hacer muchas modificaciones en los fragmentos para producir reactivos de péptidos con atributos más deseables (por ejemplo, mayor afinidad, mayor estabilidad, mayor solubilidad, menos sensibilidad a proteasa, mayor especificidad, más fácil de sintetizar, etc.). En general, los reactivos de péptidos descritos en la presente son capaces de interactuar preferencialmente con formas patógenas de las proteínas priónicasicas. De esta manera, estos reactivos de péptidos permiten la fácil detección de la presencia de proteínas priónicas patógenas, y por lo tanto, la diagnosis de enfermedades relacionadas a priones en virtualmente cualquier muestra, biológica o no biológica, incluyendo tejido de cerebro, médula espinal, u otro sistema nervioso, vivo o muerto, así como sangre. Además, se puede usar cualquier sistema adecuado de amplificación de señal para facilitar adicionalmente la detección, incluyendo pero no limitado a, el uso de ADN ramificado para la amplificación de señales (ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos números 5,681,697; 5,424,413; 5,451,503; 5,4547,025; y 6,235,483); aplicación de técnicas de amplificación de objetivo tipo PCR, amplificación de círculo rodante, invasor de tercera onda (Arruda et al. 2002 Expert. Rev. Mol. Diagn. 2: 487; patentes de los Estados Unidos números 6,090,606; 5,843,669; 5,985,557; 6,090,543; 5,846,717), NASBA, TMA, etc. (patente de los Estados Unidos número 6,511,809; EP 0544212A1); y/o técnicas de inmuno-PCR (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos número 5,665,539; publicaciones internacionales WO 98/23962; WO 00/75663; y WO 01/31056) . Se describen en la presente, reactivos de péptidos que interactúan con formas patógenas de una proteína de enfermedad conformacional. Las proteínas de enfermedad conformacional se ejemplifican en la presente por proteínas priónicasicas . Lo siguiente es una lista no limitante de enfermedades con proteínas asociadas que asumen dos o más conformaciones diferentes.

Adicionalmente, las proteínas de enfermedad conformacional listadas anteriormente incluyen cada una varias variantes y mutaciones que dan por resultado diferentes variedades que se abarcan todas por la presente invención. Se da más adelante el análisis funcional de las varias regiones y secuencias de una proteína priónica de ratón. Ver, también, Priola (2001) Adv. Protein Chem. 57: 1- 27. Las regiones y residuos que corresponden a aquéllos expuestos más adelante para ratón (Mo) , hámster (Ha), humano (Hu) , aviar (A) y oveja (Sh) se pueden determinar fácilmente para otras especies siguiendo procedimientos normales y las enseñanzas en la presente.

También se debe señalar que las proteínas priónicas (y otras proteínas de enfermedad conformacional) tienen dos diferentes conformaciones tridimensionales con la misma secuencia de aminoácido. Una conformación se asocia con características de enfermedad y en general es insoluble en tanto que la otra conformación no se asocia con las características de enfermedad y es soluble. Ver, por ejemplo, Wille, et al., "Structural Studies of the Scrapie prión Protein by Electrón Crystallography", Proc. Nati. Acad. Sci EUA, 99 (6) : 3563-3568 (2002) . Aunque se ejemplifica con respecto a las proteínas priónicas, la presente invención no se limita a estas enfermedades, proteínas y cepas listadas. De esta manera, en ciertos aspectos, los reactivos de péptidos descritos en la presente comprenden una secuencia de aminoácidos derivada de una proteína que se presenta de forma natural, por ejemplo una proteína de enfermedad conformacional (por ejemplo, proteína prión) o una proteína que contiene porciones o secuencias que exhiben homología a proteínas priónicasicas. En particular, los reactivos de péptidos de la invención se derivan típicamente de una proteína priónica que se presenta de forma natural. Los reactivos de péptidos se derivan de manera preferente de las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones de las proteínas priónicasicas. Estas regiones preferidas se ejemplifican con respecto a la secuencia de prión de ratón (SEQ ID NO: 2), en regiones de los residuos 23-43 y 85-156 de aminoácidos, y sub-regiones de las mismos. La invención no se limita a los reactivos de péptidos derivados de las secuencias de ratón pero incluye reactivos de péptidos derivados de manera similar como se describe en la presente, de secuencias de prión de cualquier especie, incluyendo humana, bovina, de oveja, de venado, alce, hámster. Cuando se derivan de proteínas priónicas, los reactivos de péptidos descritos en la presente pueden incluir una porción de hélice tipo II de poliprolina. Esta porción contiene típicamente la secuencia general PxxP (por ejemplo, los residuos 102-105 de SEQ ID NO: 1), aunque se han sugerido otras secuencias, en particular tetrapéptidos de alanina, para formar también hélices tipo II de poliprolina (ver, por ejemplo, Nguyen et al. Chem Biol. 2000 7: 463; Nguyen et al. Science 1998 282: 2088; Schweitzer-Stenner et al. J. Am. Chem. Soc. 2004 126: 2768) . En la secuencia PxxP, "x" puede ser cualquier aminoácido y "P" es prolina en la secuencia que se presenta de forma natural pero se puede reemplazar por un sustituto de prolina en los reactivos de péptidos de la invención. Estos sustitutos de prolina incluyen glicinas N-sustituidas referidas comúnmente como peptoides. De esta manera, en los reactivos de péptidos de la invención que incluyen una hélice tipo II de poliprolina en base a la secuencia de PxxP, "P" representa una prolina o un residuo de glicina N-sustituido y "x" representa cualquier aminoácido o análogo de aminoácido. Se describen en la presente glicinas N-sustituidas particularmente preferidas. Adicionalmente, el polinucleótido y la secuencia de aminoácidos para las proteínas priónicas producidas por muchas especies diferentes se conocen, incluyendo humana, de ratón, oveja y ganado. También existen dentro de cada especie variantes a estas secuencias. De esta manera, los reactivos de péptidos usados en la invención pueden comprender fragmentos o derivados de las secuencias de aminoácidos de cualquier especie o variante. Por ejemplo, en ciertas modalidades, los reactivos de péptidos descritos en la presente se derivan de cualquiera de las secuencias expuestas en la Figura 2 (SEQ ID NOs: 3-11) . Las secuencias de los reactivos de péptidos que se describen de manera específica en la presente se basan en general en la secuencia de prión de ratón, sin embargo, un experto en la técnica puede sustituir fácilmente las secuencias correspondientes de otras especies cuando sea apropiado. Por ejemplo, si se desean productos terapéuticos o de diagnóstico humanos, se puede hacer fácilmente el reemplazo de las secuencias de ratón con aquéllas de las secuencias humanas correspondientes. En un ejemplo particular, los reactivos de péptidos derivados de la región desde aproximadamente el residuo 85 a aproximadamente el residuo 112 (por ejemplo, SEQ ID NO: 35, 36, 37, 40), la leucina en la posición que corresponde al residuo 109 se puede reemplazar con una metionina, la valina en la posición que corresponde al residuo 112 se puede reemplazar con metionina, y la asparagina en la posición que corresponde a 97 se puede reemplazar con serina. Igualmente, si se desea un diagnóstico bovino, se puede hacer las sustituciones apropiadas en las secuencias peptídicas descritas para reflejar la secuencia de prión bovina. De esta manera, continuando con el ejemplo anterior para los reactivos de péptidos derivados de la región desde aproximadamente el residuo 85 a aproximadamente el residuo 112, la leucina en la posición que corresponde al residuo 109 se puede reemplazar con una metionina y la asparagina en la posición que corresponde a 97 se puede reemplazar con glicina. Los derivados de proteínas priónicas, incluyendo reemplazos, supresiones, adiciones y otras mutaciones de aminoácidos a estas secuencias también se pueden usar. De manera preferente, cualquier reemplazo, adiciones y supresiones de aminoácidos en comparación a una secuencia de proteína priónica no afecta la capacidad del reactivo de péptido para interactuar con la forma patógena. Se debe entender que no importa qué fuente se use para los reactivos de péptidos descritos en la presente, estos reactivos de péptidos no exhibirán necesariamente la identidad de secuencia a las proteínas priónicas conocidas. De esta manera, los reactivos de péptidos descritos en la presente pueden incluir uno o más reemplazos, adiciones y supresiones de aminoácidos con relación a la proteína priónica que se presenta de forma natural o las secuencias descritas en la presente, en tanto que retengan la capacidad para interactuar preferencialmente con formas patógenas de proteínas de enfermedad conformacional. En ciertas modalidades, se prefieren reemplazos conservadores de aminoácidos. Los reemplazos conservadores de aminoácidos son aquéllos que toman lugar dentro de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas laterales. Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen en general en cuatro familias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) no polar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polares no cargados = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, triptofano y tirosina se clasifican algunas veces de manera conjunta como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo conservador similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto mayor en la actividad biológica. También será evidente que cualquier combinación de los aminoácidos naturales y análogos de aminoácidos no naturales se puede usar para elaborar los reactivos de péptidos descritos en la presente. Los análogos de aminoácidos comúnmente encontrados que no se codifican genéticamente incluyen, pero no se limitan a, ornitina (Orn) ; ácido aminoisobutírico (Aib) ; benzotiofenilalanina (BtPhe) ; albiziina (Abz); t-butilglicina (Tie); fenilglicina (PhG); ciclohexilalanina (Cha) ; norleucina (Nle) ; 2-naftilalanina (2-Nal); 1-naftilalanina (I-Nal); 2-tienilalanina (2-Thi); ácido 1 , 2 , 3, 4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico (Tic); N-metilisoleucina (N-Melle) ; homoarginina (Har) ; Na-metilarginina (N-MeArg) ; fosfotirosina (PTyr o pY) ; ácido pipecolínico (Pip); 4-clorofenilalanina (4-ClPhe); 4-fluorofenilalanina (4-FPhe); ácido 1-aminociclopropanocarboxílico (1-NCPC); y sarcosina (Sar). Cualquiera de los aminoácidos usados en los reactivos de péptidos de la presente invención puede ser ya sea el D-isómero, o más típicamente, el L-isómero. Otros análogos que no se presentan de manera natural de los aminoácidos que se pueden usar para formar los reactivos de péptidos descritos en la presente incluyen peptoides y/o compuestos peptidomiméticos tal como análogos de ácido sulfónico y borónico de aminoácidos que son equivalentes biológicamente funcionales también son útiles en los compuestos de la invención e incluyen compuestos que tienen uno o más enlaces de amida opcionalmente reemplazados por un isóstero. En el contexto de la presente invención, por ejemplo, -CONH- se puede reemplazar por -CH2NH-, -NHCO-, - S02NH-, -CH20-, -CH2CH2-, -CH2S-, -CH2SO-, -CH-CH- (cis o trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- y tetrazol 1, 5-disustituido tal que los radicales enlazados por estos isópteros se mantendrán en orientaciones similares a los radicales enlazados por -CONH-. Uno o más residuos en los reactivos de péptidos descritos en la presente pueden comprender peptoides. De esta manera, los reactivos de péptidos también pueden comprender uno o más residuos de glicina N-sustituidos (péptidos que tienen uno o más residuos de glicina N-sustituidos se pueden referir como "peptoides"). Por ejemplo, en ciertas modalidades, uno o más residuos de prolina de cualquiera de los reactivos de péptidos descritos en la presente se reemplazan con residuos de glicina N-sustituidos. Las glicinas N-sustituidas particulares que son adecuadas a este respecto incluyen, pero no se limitan a, N-(S) -( 1-feniletil) glicina; N- (4-hidroxifenil) glicina; N-(ciclopropilmetil ) glicina; N- (isopropil ) glicina; N-(3-5-dimetoxibencil ) glicina; y butilglicina N-amino. (Por ejemplo, Figuras 3A-3F) . Otras glicinas N-sustituidas también pueden ser adecuadas para reemplazar uno o más residuos de aminoácidos en las secuencias de los reactivos de péptidos descritos en la presente. Para una revisión general de estos y otros análogos de aminoácidos y peptidomiméticos, ver, Nguyen et al. (2000) Chem Biol. 7(7): 463-473; Spatola, A.F., en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, Pág. 267 (1983). Ver también, Spatola, A.F., Peptide Backbone Modifications (revisión general), Vega Data, Vol. 1, Issue 3, (marzo de 1983) ; Morley, Trenes Pharm Sci (revisión general), Págs. 463-468 (1980); Hudson D. et al., Int J Pept Prot Res, 14: 177-185 (1979) (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola et al., Life Sci, 38: 1243-1249 (1986) (-CH2-S); Hann J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 307-314 (1982) (-CH-CH-, cis y trans); Almquist et al., J Med Chem, 23: 1392-1398 (1980) (-COCH2-); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett, 23: 2533 (1982) (-COCH2-) ; Szelke et al., solicitud europea EP 45665 CA: 97:39405 (1982) (-CH (OH) CH2-) ; Holladay et al., Tetrahedron Lett, 24: 4401-4404 (1983) (-C (OH) CH2-) ; y Hruby, Life Sci, 31: 189-199 (1982) (-CH2-S-); cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. El ácido carboxílico C-terminal se puede reemplazar por un ácido borónico -B(OH)2 o éster borónico -B(OR)2 u otro derivado de ácido borónico como se describe en la patente de los Estados Unidos número 5,288,707, incorporada en la presente como referencia. Los reactivos de péptidos descritos en la presente pueden comprender monómeros, multímeros, moléculas ciclizadas, moléculas ramificadas, ligadores y similares. Los multímeros (es decir, dímeros, trímeros y similares) de cualquiera de las secuencias descritas en la presente o equivalentes biológicamente funcionales de los mismos también se contemplan. El multímero puede ser un homomultímero, es decir, compuesto de monómeros idénticos, por ejemplo, cada monómero es la misma secuencia peptídica. De manera alternatural, el multímero puede ser un heteromultímero, por lo cual se quiere decir que no todos los monómeros que constituyen el multímero son idénticos. Los multímeros se pueden formar por la unión directa de los monómeros entre sí o a un sustrato, incluyendo, por ejemplo, múltiples péptidos antigénicos (MAPS) (por ejemplo, MAPS simétrico), péptidos unidos a núcleos moleculares de polímeros, por ejemplo, un núcleo molecular de PEG y/o péptidos enlazados en tándem con o sin unidades separadoras. De manera alternatural, se pueden adicionar grupos de enlace a las secuencias monoméricas para unir los monómeros conjuntamente y formar un multímero. Los ejemplos no limitantes de multímeros que usan grupos de enlace incluyen repeticiones en tándem usando ligadores de glicina; MAPS unidos vía un ligador a un sustrato y/o péptidos linealmente enlazados unidos vía ligadores a un núcleo molecular. Los grupos de enlace pueden comprender el uso de unidades separadoras bifuncionales (ya sea homobifuncionales o heterobifuncionales) como se conoce por un experto en la técnica. A manera de ejemplo y no de limitación, muchos métodos para incorporar estas unidades separadoras en los péptidos de enlace conjuntamente usando reactivos tal como succinimidil-4- (p-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , succinimidil-4- (p-maleimidofenil) butirato y similares se describen en el Pierce Immunotechnology Handbook (Pierce Chemical Co., Rockville, III) y también están disponibles de Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo . ) y Aldrich Chemical Co.

(Milwaukee, Wis.) y se describen en "Comprehensive Organic Transformations" , VCK-Verlagsgesellschaft , Weinheim/Alemania (1989) . Un ejemplo de un grupo de enlace que se puede usar para enlazar las secuencias monoméricas conjuntamente es -Y?~ F-Y2, en donde Yi y Y2 son idénticos o diferentes y son grupos alquileno de 0-20, de manera preferente 0-8, de manera más preferente 0-3 átomos de carbono, y F es uno o más grupos funcionales tal como -O-, -S-, -S-S-, -C(0)-0-, -NR-, -C(O)-NR-, -NR-C(0)-0-, -NR-C (O) -NR-, -NR-C (S) -NR-, -NR-C(S)-0-. Yi y Y2 se pueden sustituir opcionalmente hidroxi, alcoxi, hidroalquilo, alcoxialquilo, amino, carboxilo, carboxialquilo y similares. Se entenderá que cualquier átomo apropiado del monómero se puede unir al grupo de enlace. Adicionalmente, los reactivos de péptidos de la invención pueden ser lineales, ramificados o ciclizados. Las unidades monoméricas se pueden ciclizar o se pueden enlazar conjuntamente para proporcionar los multímeros de una manera lineal o ramificada, en la forma de un anillo (por ejemplo, un macrociclo) , en la forma de una estrella (dendrímeros) o en la forma de una bola (por ejemplo, fullerenos) . Los expertos reconocerán fácilmente una multitud de polímeros que se pueden formar de secuencias monoméricas descritas en la presente. En ciertas modalidades, el multímero es un dímero cíclico. Usando la misma terminología como antes, el dímero puede ser un homodímero o un heterodímero . Se pueden elaborar formas cíclicas, ya sea de monómero o multímero, por cualquiera de los enlaces descritos anteriormente, tal como pero no limitado a, por ejemplo: (1) ciclizar la amina N-terminal con el ácido carboxílico C-terminal vía formación de enlace directo de amida entre el nitrógeno y el carbonilo C-terminal, o mediante la intervención del grupo separador tal como por ejemplo por condensación con un ácido epsilon-amino-carboxílico; (2) ciclizar mediante la formación de un enlace entre las cadenas laterales de los dos residuos, por ejemplo, al formar un enlace de amida entre una cadena lateral de aspartato o glutamato y una cadena lateral de lisina, o por formación de enlace de disulfuro entre dos cadenas laterales de cisteína o entre una cadena lateral de penicilamina y cisteína o entre dos cadenas laterales de penicilamina; (3) ciclizar vía la formación de un enlace de amida entre una cadena lateral (por ejemplo, aspartato o lisina) y ya sea la amina N-terminal o el carboxilo C-terminal respectivamente; y/o (4) enlazar dos cadenas laterales mediante la intervención de un grupo separador corto de carbonos. De manera preferente, los reactivos de péptidos descritos en la presente no son patógenos y/o infecciosos. Los reactivos de péptidos de la invención pueden ser donde quiera de 3 a aproximadamente 100 residuos de largo (o cualquier valor entre estos), o aún más largos, de manera preferente de aproximadamente 4 a 75 residuos (o cualquier valor entre estos), de manera preferente de aproximadamente 5 a aproximadamente 63 residuos (o cualquier valor entre estos), y de manera aún más preferente desde aproximadamente 8 a aproximadamente 30 residuos (o cualquier valor entre estos), y de manera más preferente el reactivo de péptido será de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 residuos. Los ejemplos no limitantes de reactivos de péptidos útiles en las composiciones y métodos descritos en la presente se derivan de las secuencias mostradas en la Tabla y en la Tabla 4. Los reactivos de péptidos en las tablas se representan por códigos convencionales de aminoácidos de una letra y se representan con su N-término a la izquierda y el C-término a la derecha. Los aminoácidos en corchetes indican residuos alternativos que se pueden usar en esa posición en diferentes reactivos de péptido. Los paréntesis indican los residuos que pueden estar presentes o ausentes del reactivo de péptido. Cualquier residuo de prolina se puede sustituir con residuos de glicina N-sustituidos para formar peptoides. Cualquiera de las secuencias en las tablas pueden incluir opcionalmente ligadores de Gly (Gn en donde N = 1,2,3 ó 4) o la N- y/o C-terminal.

Tabla 1 En un aspecto, el reactivo de péptido usado en el método de la invención incluye cada uno de los péptidos descritos en la presente y derivados (como se describe en la presente) de los mismos. La invención incluye de esta manera un reactivo de péptido derivado de un péptido de cualquiera de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, ó 260 y análogos (por ejemplo, sustitución de uno o más prolinas con una glicina N-sustituida) y derivados de los mismos. El método de la invención utiliza de manera preferente un reactivo de péptido derivado y un péptido de SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 72, 74, 76, 77, 78, 81, 82, 84, 89, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, ó 260 y análogos (por ejemplo, sustitución de uno o más prolinas con una glicina N-sustituida) y derivados de los mismos . En ciertas modalidades, los reactivos de péptidos usados en los métodos se une de manera específica a priones patógenos, por ejemplo reactivos de péptidos derivados de los péptidos de SEQ ID NO. SEQ ID NOs : 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, 84, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, ó 260, y análogos (por ejemplo sustitución de uno o más prolinas con una glicina N-sustituida) y derivado de los mismos. Como se describe anteriormente, los reactivos de péptidos descritos en la presente pueden incluir una o más sustituciones, adiciones y/o mutaciones. Por ejemplo, se puede reemplazar uno o más residuos en los reactivos de péptidos con otros residuos, por ejemplo residuos de alanina o con un análogo de amino ácido o residuo de glicina N-sustituido a fin de elaborar un peptoide (ver, por ejemplo Nguyen et al. (2000) Chem Biol. 7 (7) : 463-473) . Adicionalmente, los reactivos de péptidos descritos en la presente también pueden incluir componentes de péptido o no péptido adicionales. Los ejemplos no limitantes de componentes adicionales de péptido incluyen residuos separadores, por ejemplo, dos o más residuos de glicina (naturales o derivatizados) o ligadores de ácido aminohexanoico en uno o ambos extremos o residuos que pueden ayudar en la solubilización de los reactivos de péptido, por ejemplo residuos ácidos tal como ácido aspártico (Asp o D) como se representa por ejemplo en SEQ ID NO: 83, 86. En ciertas modalidades, por ejemplo, los reactivos de péptidos se sintetizan como múltiples péptidos antigénicos (MAP) . Típicamente, se sintetiza múltiples copias de los reactivos de péptidos (por ejemplo 2-10 copias) directamente sobre un portador de MAP tal como una lisina ramificada u otro núcleo portador de MAP. Ver, por ejemplo, Wu et al. (2001) J Am Chem Soc. 2001 123(28): 6778-84; Spetzier et al. (1995) Int J Pept Protein Res. 45(1): 78-85 y SEQ ID NO: 134 y 135. Los ejemplos no limitantes de los componentes no de péptido (por ejemplo, porciones químicas) que se pueden incluir de los reactivos de péptidos descritos en la presente incluyen, una o más marcas detectables, marbetes (por ejemplo, biotina, His-Tags, oligonucleotidos), tintes, miembros y un par de unión, y similares, en cualquier termino o internos al reactivo de péptido. Los componentes no de péptidos también se pueden unir (por ejemplo, mediante unión covalente de una o más marcas) directamente o a través de un separador (por ejeplo, un grupo de amida), a posiciones en el compuesto que se predicen por datos cuantitativos de estructura-actividad y/o modelado molecular para que no sean de interferencia. Los reactivos de péptidos como se describen en la presente también pueden incluir porciones químicas específicas de prión tal como tintes específicos de amiloide (por ejemplo, Rojo Congo, Tioflavina, etc.). La derivatización (por ejemplo, marcación, ciclización, unión de porciones químicas, etc.) de los compuestos no debe interferir sustancialmente con (y puede aún mejorar) las propiedades de unión, la función biológica y/o actividad farmacológica del reactivo de péptido. Los reactivos de péptidos tendrán típicamente al menos aproximadamente 50 % de identidad de secuencia a los fragmentos de proteína priónica o a las secuencias de péptido expuestas en la presente. De manera preferente, los reactivos de péptidos tendrán al menos 70 % de identidad de secuencia; de manera más preferente al menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100 % de identidad de secuencia a los fragmentos de proteína de prión o a la secuencias de péptido expuestas en la presente. Los reactivos de péptidos como se describen en la presente interactúan preferencialmente con las formas patógenas, y por consiguiente, son útiles en una amplia variedad de aplicaciones de aislamiento, purificación, detección, diagnóstico y terapéuticas. Por ejemplo, en modalidades en las cuales el reactivo de péptido interactúa preferencialmente con las formas patógenas, los reactivos de péptidos por sí mismos se pueden usar para detectar formas patógenas en una muestra, tal como sangre, tejido de sistema nervioso (cerebro, médula espinal, CSF, etc.) u otra muestra de tejido u órgano. Los reactivos de péptidos también son útiles para diagnosticar la presencia de enfermedad asociada con las formas patógenas, para aislar las formas patógenas y para descontaminar muestras al remover las formas patógenas. La interacción de los reactivos de péptidos con las proteínas priónicas se puede probar usando cualquier ensayo de unión conocido, por ejemplo inmunoensayos tal como ELISA, Western Blots y similares (ver, ejemplos). Un método conveniente para probar la especificidad de los reactivos de péptidos de la presente invención es seleccionar una muestra que contiene priones tanto patógenos como no patógenos. Estas muestras típicas incluyen tejido de cerebro o médula espinal de animales enfermos. Los reactivos de péptidos como se describen en la presente que se unen de manera específica a las formas patógenas se unen a un soporte sólido (por métodos bien conocidos en la técnica y como se describe adicionalmente más adelante) y se usan para separar ("rebajar") el prión patógeno de los otros componentes de la muestra y obtener un valor cuantitativo directamente relacionado al número de interacciones de unión péptido-prión en el soporte sólido. También se pueden usar variaciones y otros ensayos conocidos en la técnica para demostrar la especificidad de los reactivos de péptidos de la invención. Ver, por ejemplo, ejemplos. Aunque no se requiere en el método de la invención el uso de los reactivos de péptidos como se describe en la presente, otros ensayos de priones pueden utilizar el hecho que los priones que tienen una conformación patógena en general son resistentes a ciertas proteasas, tal como proteinasa K. Las mismas proteasas son capaces de degradar los priones en una conformación no patógena. Por lo tanto, cuando se usa una proteasa, la muestra se puede separar en dos volúmenes iguales. Se puede adicionar proteasa a la segunda muestra y se realiza la misma prueba. Debido a que la proteasa en la segunda muestra degradará cualquier prión no patógeno, cualquier interacción de unión péptido-prión en la segunda muestra se puede atribuir a priones patógenos. De esta manera, los ejemplos no limitantes de los métodos para evaluar la especificidad de unión y/o la afinidad de los reactivos de péptidos descritos en la presente incluyen procedimientos de Western Blot normal y Western distante; péptidos marcados; ensayos tipo ELISA; y/o ensayos basados en células. Las transferencias Western, por ejemplo, emplean típicamente un anticuerpo primario marcado que detecta la proteína priónica desnaturalizada a partir de un gel de SDS-PAGE, en muestras obtenidas de un ensayo de "rebaja" (como se describe en la presente), que se ha electrotransferido en nitrocelulosa o PVDF. Se han descrito anticuerpos que reconocen la proteína priónica desnaturalizada (descrito, ínter alia, en Peretz et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 614; Peretz et al. 2001 Nature 412:739; Williamson et al. 1998 J. Virol. 72: 9413; patente de los Estados Unidos número 6,765,088; patente de los Estados Unidos número 6,537,548) y algunos están comercialmente disponibles. Se han descrito otras moléculas de unión a priones, por ejemplo, polipéptidos híbridos injertados con porciones (ver, WO 03/085086), ciertos polímeros catiónicos o aniónicos (ver, WO 03/073106) , ciertos péptidos que son "catalizadores de propagación" (ver, WO 02/0974444) y plasminógeno. El anticuerpo primario entonces se detecta (y/o amplifica) con una sonda para la marca (por ejemplo, fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina, peroxidasa de rábano, reactivo de ECL, y/o oligonucleótidos amplificables) . La unión también se puede evaluar usando reactivos de detección tal como un péptido con una marca de afinidad (por ejemplo, biotina) que se marca y amplifica con una sonda para la marca de afinidad (por ejemplo, fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina, peroxidasa de rábano, reactivo de ECL, u oligonucleótidos amplificables) . Además, los procedimientos de placas de microtítulo similares a ELISA de intercalación se pueden usar, por ejemplo, un reactivo de péptido específico de prión como se describe en la presente se usa para inmovilizar proteína (s) prión en un soporte sólido (por ejemplo, cavidad de placa de microtítulo, cuenta, etc.) y un reactivo de detección adicional que puede incluir, pero no se limita a, otro reactivo de péptido específico de prión con una marca de afinidad y/o detección tal como fosfatasa alcalina conjugada, peroxidasa de rábano, reactivo de ECL, u oligonucleótidos amplificables . Ver, ejemplos. También se pueden emplear ensayos basados en células, por ejemplo, donde la proteína priónica se detecte directamente en células individuales (por ejemplo, usando un reactivo de péptido, específico de prión, fluorescentemente marcado que permite la clasificación, cuenta o detección de células en base a fluorescencia de las células específicamente marcadas) .

III. B. Producción de Reactivo de Péptido Los reactivos de péptidos de la presente invención se pueden producir de varias maneras, cualquiera de las cuales son bien conocidas en la técnica. En una modalidad, en la cual el reactivo de péptido es, en totalidad o en parte, un péptido genéticamente codificado, el péptido se puede generar usando técnicas recombinantes, bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las secuencias de nucleótidos que codifican para el péptido deseado usando metodología normal y las enseñanzas en la presente. Una vez aislado, el péptido recombinante, opcionalmente, se puede modificar para incluir componentes no genéticamente codificados (por ejemplo, marcas detectables, miembros de par de unión, etc.) como se describe en la presente y como es bien conocido en la técnica, para producir los reactivos de péptido. Las sondas de oligonucleótidos se pueden diseñar en base a las secuencias conocidas y usadas para sondear bibliotecas de ADNc o genómicas. Las secuencias entonces se pueden aislar adicionalmente usando técnicas normales y, por ejemplo, enzimas de restricción empleadas para truncar el gen en las porciones deseadas de la secuencia de longitud completa. De manera similar, se pueden aislar las secuencias de interés directamente de células y tejidos que contienen los mismos, usando técnicas conocidas, tal como extracción con fenol y la secuencia manipulada adicionalmente para producir los truncamientos deseados. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra, para una descripción de las técnicas usadas para obtener y aislar ADN. Las secuencias que codifican para el péptido también se pueden producir de manera sintética, por ejemplo, en base a las secuencias conocidas. La secuencia de nucleótidos se puede diseñar con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos particular deseada. La secuencia completa se monta en general de oligonucleótidos de traslape preparados por métodos normales y montados en una secuencia completa de codificación. Ver, por ejemplo, Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair et al. (1984) Science 223: 1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311; Stemmer et al. (1995) Gene 164: 49-53. Se usan fácilmente técnicas recombinantes para clonar secuencias que codifican para polipéptidos útiles en los reactivos de péptidos reivindicados que entonces se pueden mutagenizar in vi tro por el reemplazo de los pares de bases apropiados para dar por resultado el codon para el aminoácido deseado. Este cambio puede incluir tan poco como un par de base, que efectúa un cambio en un aminoácido individual, o puede abarcar varios cambios de pares de bases. De manera alternatural, las mutaciones se pueden efectuar usando un cebador mal apareado que hibridiza a la secuencia de nucleótidos de origen (en general ADNc que corresponde a la secuencia de ARN) , a una temperatura por abajo del punto de fusión del dúplex mal apareado. El cebador se puede hacer específico al mantener la longitud y la composición de base del cebador dentro de límites relativamente estrechos y al mantener la base mutante localizada de manera central. Ver, por ejemplo, Innis et al, (1990) PCR Applications: Protocols for Functional Genomics; Zoller y Smith, Methods Enzymol. (1983) 100: 468. La extensión del cebador se efectúa usando ADN-polimerasa, el producto se clona y se selecciona los clones que contienen el ADN mutado, derivado por segregación de la hebra extendida del cebador. Se puede lograr la selección usando el cebador mutante como una sonda de hibridación. La técnica también es aplicable para generar múltiples mutaciones de punto. Ver, por ejemplo, Dalbie-McFarland et al. Proc. Nati. Acad. Sci EUA (1982) 79: 6409. Una vez que se han aislado y/o sintetizado las secuencias codificantes, se pueden clonar en cualquier vector adecuado o replicón para la expresión. (Ver también, ejemplos) . Como será evidente a partir de las enseñanzas en la presente, se puede generar una amplia variedad de vectores que codifican para los polipéptidos modificados al crear construcciones de expresión que enlazan de manera operable, en varias combinaciones, polinucleótidos que codifican para polipéptidos que tienen supresiones o mutaciones en los mismos. Se conocen por aquéllos expertos en la técnica, numerosos vectores de clonación, y es materia de elección la selección de un vector apropiado de clonación. Los ejemplos de vectores de ADN recombinantes para la clonación y las células hospedadoras que se pueden transformar incluyen el bacteriófago ? ( E . coli ) , pBR322 (£. coli ) , pACYC177 ( E . coli ) , pKT230 (bacterias gram-negativas ) , pGV1106 (bacterias gram-negativas ) , pLAFRl (bacterias gram-negativas), pME290 (bacterias gram-negativas no de E . coli ) , pHV14 ( E . col i y Bacill us subtilis ) , pBD9 ( Ba ci ll us ) , pIJ61 ( Streptomyces ) , pUC6 ( Streptomyces) , YIp5 ( Sa ccharomyces) , YCpl9 ( Sa ccharomyces) y virus de papiloma bovino (células de mamífero) . Ver, en general, DNA Cloning: Vols. I & II, supra; Sambrook et al., supra; B. Perbal, supra. Los sistemas de expresión de células de insecto, tal como sistemas de baculovirus, también se pueden usar y se conocen por aquéllos experto en la técnica y se describe en, por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Los materiales y métodos para los sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto están comercialmente disponibles en forma de kit a partir de, inter alia, Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac") . También se pueden usar sistemas de expresión de planta para producir los reactivos de péptidos descritos en la presente. En general, estos sistemas usan vectores en base a virus para transfectar células de planta con genes heterólogos. Para una descripción de estos sistemas ver, por ejemplo, Porta et al., Mol. Biotech. (1996) 5: 209-221; y Hackland et al., Arch Virol. (1994) 139: 1-22. Los sistemas virales, tal como sistemas de infección/transfección basados en vaccinia, como se describe en Tomei et al., J. Virol. (1993) 67: 4017-4026 y Selby et al., J. Gen. Virol. (1993) 74: 1103-1113, también encontrarán uso con la presente invención. En este sistema, las células se transfectan primero in vi tro con un virus de vaccinia recombinante que codifica para la ARN-polimerasa de bacteriófagos T7. Esta polimerasa exhibe especificidad delicada ya que sólo transcribe plantillas que tienen los promotores T7. Después de la infección, las células se transfectan con el ADN de interés, accionado por un promotor T7. La polimerasa expresada en el citoplasma del virus de vaccinia recombinante transcribe el ADN transfectado en ARN que entonces se traduce en proteína por la maquinaria de traducción del hospedador. El método proporciona producción a alto nivel, transiente y citoplásmica de grandes cantidades de ARN y sus productos de traducción. El gen se puede colocar bajo el control de un promotor, sitios de unión a ribosoma (para la expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador (referido colectivamente en la presente como elementos de "control"), de modo que la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido deseado se transcribe en ARN en la célula hospedadora transformada por un vector que contiene esta construcción de expresión. La secuencia codificante puede contener o no una secuencia guía o péptido de señal. Con la presente invención, se pueden usar tanto los péptidos de señal que se presentan de manera natural, como las secuencias heterólogas. Se pueden remover las secuencias guía por el hospedador en el procesamiento post-transduccional . Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos números 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397. Estas secuencias incluyen, pero no se limitan a, la guía TPA, así como la secuencia de señal de melitina de abeja mielera. También pueden ser deseables otras secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de la secuencia de proteína con relación al crecimiento de la célula hospedadora. Estas secuencias reguladoras se conocen por aquéllos expertos en la técnica, y los ejemplos incluyen aquéllas que provocan la expresión de un gen para que se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. También pueden estar presentes otros tipos de elementos reguladores en el vector, por ejemplo, secuencias intensificadoras . Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras se pueden ligar a la secuencia codificante antes de la inserción en un vector. De manera alternatural, la secuencia codificante se puede clonar directamente en un vector de expresión que contiene ya las secuencias de control y un sitio apropiado de restricción. En algunos casos, puede ser necesario modificar la secuencia codificante de modo que se puede unir a la secuencia de control con la orientación apropiada; es decir, para mantener el cuadro apropiado de lectura. Se pueden preparar mutantes o análogos por la supresión de una porción de la secuencia que codifica para la proteína, por la inserción de una secuencia, y/o por la sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos, tal como mutagénesis dirigida al sitio, son bien conocidos por aquéllos experto en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra; DNA Cloning, Vols. I y II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra . El vector de expresión entonces se usa para transformar una célula hospedadora apropiada. Se conocen en la técnica varias líneas de células de mamífero e incluyen líneas de células inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) , tal como, pero no limitadas a, células de ovario de hámster chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster neonato (BHK) , células de riñon de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células Vero293, así como otras. De manera similar, los hospedadores bacterianos tal como E . coli , Ba cill us subtilis, y Streptococcus spp. , encontrarán uso con las presentes construcciones de expresión. Los hospedadores de levadura útiles en la presente invención incluyen, ín ter alia , Sa ccharomyces cerevisiae, Candida albi cans , Candida mal tosa , Hansenula polymorpha , Kluyveromyces fragilis , Klyveromyces la ctis , Pichia gui l lerimondii , Pi chia pastoris , Schizosa ccharomyces pombe e Yarrowia lipolyti ca . Las células de insecto para el uso con los vectores de expresión de baculovirus incluyen, in ter alia , Aedes aegypti , Autographa cali forni ca , Bombix mori , Drosophila melanogaster , Spodoptera frugiperda , y Tri chopl usia ni . Dependiendo del sistema de expresión y del hospedador seleccionado, las proteínas de la presente invención se producen al cultivar células hospedadoras transformadas por un vector de expresión descrito anteriormente bajo condiciones por las cuales se expresa la proteína de interés. La selección de las condiciones de crecimiento apropiadas está dentro de la habilidad de la técnica . En una modalidad, las células transformadas segregan el producto de polipéptido en el medio circundante. Se pueden incluir ciertas secuencias reguladoras en el vector para mejorar la secreción del producto de proteína, por ejemplo usando una secuencia guía del activador de plasminógeno de tejido (TPA), una secuencia de señal de interferón (? o a) u otras secuencias de péptido de señal de proteínas secretoras conocidas. El producto de polipéptido segregado entonces se puede aislar por varias técnicas descritas en la presente, por ejemplo, usando técnicas normales de purificación, tal como, pero no limitadas a, resinas de hidroxiapatita, cromatografía de columna, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de tamaño, electroforesis, HPLC, técnicas inmunoadsorbentes, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación, y similares. De manera alternatural, las células transformadas se interrumpen, usando medios químicos, físicos o mecánicos, que listan las células y aún mantienen los polipéptidos recombinantes sustancialmente intactos. También se pueden obtener proteínas intracelulares al remover los componentes de la pared o membrana celular, por ejemplo, por el uso de detergentes o solventes orgánicos, tal que se presente la fuga de los polipéptidos. Estos métodos son conocidos por aquéllos expertos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Protein Purification Applications: A Practical Approach, (E.L.V. Harris y S. Angal, Eds., 1990). Por ejemplo, los métodos para romper células para el uso con la presente invención incluyen pero no se limitan a: tratamiento con sonido o ultrasonido; agitación; extrusión de líquidos o sólidos; tratamiento térmico; congelación-descongelación; desecación; descompresión explosiva; choque osmótico; tratamiento con enzimas líticas incluyendo proteasas tal como tripsina, neuraminidasa y lisozima; tratamiento alcalino, y el uso de detergentes y solventes tal como sales biliares, dodeciisulfato de sodio, Tritón, NP40 y CHAPS. La técnica particular usada para romper las células es en su mayor parte una materia de elección y dependerá del tipo de célula en la cual se expresa el polipéptido, las condiciones de cultivo y cualquier pre-tratamiento usado. Después del rompimiento de las células, se remueven los desechos celulares, en general por centrifugación, y se purifican adicionalmente los polipéptidos intracelularmente producidos, usando técnicas normales de purificación tal como, pero no limitada a, cromatografía de columna, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de tamaño, electroforesis, HPLC, técnicas inmunoadsorbentes, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación, y similares. Por ejemplo, un método para obtener los polipéptidos intracelulares de la presente invención comprende la purificación por afinidad, tal como por cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anteriormente generados), o por cromatografía de afinidad de lectina. Las resinas de lectina particularmente preferidas son aquéllas que reconocen porciones de mannosa tal como pero no limitadas a resinas derivadas de aglutinina de Galan thus nivales (GNA) , aglutinina de Lens culinaris (LCA o lectina de lenteja), aglutinina de Pisum sa tivum (PSA o lectina de guisante), aglutinina de Narcissus pseudonarcissus (NPA) y aglutinina de Alli um ursinum (AUA) . La elección de una resina de afinidad adecuada está dentro de la habilidad de la técnica. Después de la purificación por afinidad, los polipéptidos se pueden purificar adicionalmente usando técnicas convencionales bien conocidas en la técnica, tal como por cualquiera de las técnicas descritas anteriormente. Los reactivos de péptidos se pueden sintetizar convenientemente de forma química, por ejemplo por cualquiera de las varias técnicas que son conocidas por aquéllos expertos en la técnica de los péptidos. En general, estos métodos emplean la adición secuencial de uno o más aminoácidos a una cadena de péptido de crecimiento. Normalmente, se protege ya sea el grupo amino o carboxilo del primer aminoácido por un grupo protector adecuado. El aminoácido protegido o derivatizado entonces ya sea se puede unir a un soporte sólido inerte o utilizar en solución al adicionar el siguiente aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido, bajo condiciones que permiten la formación de un enlace de amida. El grupo protector entonces se remueve del residuo de aminoácido recién adicionado y entonces se adiciona el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido) y así sucesivamente. Después de que se han enlazado los aminoácidos deseados en la secuencia apropiada, se remueve cualquier grupo protector restante (y cualquier soporte sólido, si se usan técnicas de síntesis en fase sólida) de manera secuencial o concurrente, para producir el polipéptido final. Por la modificación simple de este procedimiento general, es posible adicionar más de un aminoácido a la vez a una cadena en crecimiento, por ejemplo, al acoplar (bajo condiciones que no racemerizan los centros quirales) un tripéptido protegido con un dipéptido apropiadamente protegido para formar, después de la desprotección, un pentapéptido. Ver, por ejemplo, J.M. Stewart y J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co . , Rockford, IL 1984) y G. Barany y R.B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross y J. Meienhofer, Vol. 2, (Academia Press, New York, 1980), Págs. 3-254, para técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida; y M. Bodansky, Principies of Peptide Synthesis, (Springer-Verlag, Berlin 1984) y E. Gross and J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1, para síntesis clásica de solución. Estos métodos se usan típicamente para polipéptidos relativamente pequeños, es decir, hasta aproximadamente 50-100 aminoácidos de longitud, pero también son aplicables a polipéptidos más grandes. Los grupos protectores típicos incluyen t-butiloxicarbonilo (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), benciloxicarbonilo (Cbz); p-toluenosulfonilo (Tx) ; 2,4-dinitrofenilo; bencilo (Bzl); bifenilisopropiloxicarboxi-carbonilo, t-amiloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, o-bromobenciloxicarbonilo, ciciohexilo, isopropilo, acetilo, o-nitrofenilsulfonilo y similares. Los soportes sólidos típicos son soportes poliméricos reticulados. Estos pueden incluir polímeros a base de estireno reticulado de divinilbenceno, por ejemplo, copolímeros de divinilbenceno-hidroximetilestireno, copolímeros de divinilbenceno-clorometilestireno y copolímeros de divinilbenceno-benzhidrilaminopoliestireno . La síntesis de los polímeros que contienen peptoide se puede llevar a cabo de acuerdo a por ejemplo, patentes de los Estados Unidos números 5,877,278; 6,033,631; Simón et al. (1992) Proc. Nati Acad. Sci. EUA 89: 9367. El reactivo de péptido de la presente invención también se puede preparar de manera química por otros métodos tal como por el método de síntesis simultánea de múltiples péptidos. Ver, por ejemplo, Houghten Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1985) 82: 5131-5135; patente de los Estados Unidos número 4,631,211.

IV. Ensayos Los presentes inventores han desarrollado un ensayo sensible para detectar priones patógenos en una muestra. El ensayo combina la potencia de los reactivos de péptidos para discriminar entre la forma patógena y la no patógena de las proteínas priónicas con una técnica de ELISA mejorada. Debido a que los reactivos de péptidos interactúan preferencialmente con las proteínas priónicas patógenas, estos reactivos se usan para separar y concentrar cualquier prión patógeno presente en la muestra. Diferente de los métodos que utilizan digestión con proteinasa K para discriminar entre las isoformas patógenas y no patógenas, que típicamente dará por resultado alguna digestión N-terminal aún de la isoforma patógena, el uso de los reactivos de péptidos en el método de la invención da por resultado la separación de las proteínas priónicas patógenas de longitud completa. De esta manera, se pueden usar anticuerpos anti-prión que reconocen epítopos en el extremo N-terminal de la proteína prión, así como anticuerpos anti-prión que reconocen epítopos de otras regiones de la proteína priónica. Una vez que la proteína priónica patógena se separa de la isoforma no patógena (que está presente en la mayoría de las muestras) usando los reactivos de péptido, la proteína priónica patógena se puede disociar del reactivo de péptido y detectar en varios formatos de ELISA, descritos en la presente. El prión patógeno se desnaturaliza típicamente en el proceso de disociación del reactivo de péptido. Es preferible el uso de una proteína priónica desnaturalizada en el ELISA puesto que muchos anticuerpos anti-prión que se unen a la PrP desnaturalizada se conocen y están comercialmente disponibles. La disociación y desnaturalización del prión patógeno se puede lograr usando altas concentraciones de agentes caotrópicos, por ejemplo, 3M a 6M de una sal de guanidinio tal como tiocianato de guanidinio o guanidinio-HC1. El agente caotrópico se debe remover o diluir antes de que se lleve a cabo el ELISA debido a que interferirá con la unión de los anticuerpos anti-prión usados en el ELISA. Esto da por resultado pasos adicionales de lavado o la generación de grandes volúmenes de muestra, ambos de los cuales son indeseables para ensayos rápidos de alto rendimiento. Los presentes inventores han descubierto que una alternatural preferible al uso de un agente caotrópico para la disociación/desnaturalización de la proteína priónica patógena del reactivo de péptido es el uso de pH alto o bajo. La proteína priónica patógena se disocia fácilmente del reactivo de péptido y se desnaturaliza al adicionar componentes que incrementan el pH a por arriba de 12 (por ejemplo, NaOH) o por debajo de 2 (por ejemplo, H3P04). Adicionalmente, el pH se puede reajustar fácilmente a neutral por la adición de pequeños volúmenes de ácido o base adecuada, permitiendo de esta manera el uso directamente en el ELISA sin ningún lavado adicional y sin incrementar los volúmenes de muestra de manera significativa. La invención proporciona de esta manera un método para detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra que comprende: poner en contacto la muestra sospechosa de contener un prión patógeno con un reactivo de péptido que interactúa preferencialmente con la forma patógena de la proteína priónica bajo condiciones que permiten la unión del reactivo de péptido a la proteína priónica patógena, si está presente, para formar un primer complejo; remover el material de muestra no unido; disociar el prión patógeno del reactivo de péptido; y detectar la presencia del prión patógeno disociado usando un reactivo de unión a prión. Un "reactivo de unión a prión" es un reactivo que se une a una proteína priónica en cualquier conformación, típicamente el reactivo de unión a prión se unirá a una forma desnaturalizada de la proteína priónica. Estos reactivos se han descrito e incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-prión (descritos inter alia, en Peretz et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 614; Peretz et al. 2001 Nature 412: 739; Williamson et al. 1998 J. Virol. 72: 9413; patente de los Estados Unidos número 6,765,088; patente de los Estados Unidos número 6,537,548), polipéptidos híbridos injertados con porción (ver, WO 03/085086) , ciertos polímeros catiónicos o aniónicos (ver, WO 03/073106) , ciertos péptidos que son "catalizadores de propagación" (ver, WO 02/0974444) y plasminógeno. Será evidente que si el reactivo particular de unión a prión usado se une a una forma desnaturalizada del prión que la proteína priónica patógena "capturada" se deba desnaturalizar antes de la detección del reactivo de unión a prión. De manera preferente, el reactivo de unión a prión es un anticuerpo anti-prión . En ciertas modalidades, se usan anticuerpos anti-PrP para detectar proteínas priónicasicas. Se han descrito anticuerpos, anticuerpos modificados y otros reactivos, que se unen a priones, particularmente a PrPc o a la PrP desnaturalizada, y algunos de estos están disponibles de manera comercial (ver, por ejemplo, anticuerpos anti-prión descritos en Peretz et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 614; Peretz et al. 2001 Nature 412: 739; Williamson et al. 1998 J.

Virol. 72: 9413; patente de los Estados Unidos número 6,765,088. Algunos de estos y otros están comercialmente disponibles de, inter alia, InPro Biotechnology, South San Francisco, CA, Cayman Chemicals, Ann Arbor MI; Prionics AG, Zurcí; ver también, WO 03/085086 para la descripción de anticuerpos modificados). Los anticuerpos adecuados para el uso en el método incluyen sin limitación, 3F4, D18, D13, 6H4, MAB5242, 7D9, BDI115, SAF32, SAF53, SAF83, SAF84, 19B10, 7VC, 12F10, PRI308, 34C9, Fab HuM-P, Fab HuM-Rl, y Fab HuM-R72. De manera preferente, se desnaturaliza la proteína priónica patógena disociada. El término "desnaturalizar" o "desnaturalizado" tiene el significado convencional como se aplica a la estructura de proteína y significa que la proteína pierde su estructura secundaria y terciaria natural. Con respecto a la proteína priónica patógena, una proteína priónica patógena "desnaturalizada" no retiene por más tiempo la conformación patógena natural y de esta manera la proteína no es por más tiempo "patógena". La proteína priónica patógena desnaturalizada tiene una conformación similar o idéntica a la proteína priónica no patógena desnaturalizada. Sin embargo, para los propósitos de claridad en la presente, el término "proteína priónica patógena desnaturalizada" se usará para referirse a la proteína priónica patógena que se captura por el reactivo de péptido como la isoforma patógena y se desnaturaliza de manera subsiguiente.

En modalidades preferidas, el reactivo de péptido se proporciona en un soporte sólido. El reactivo de péptido se puede proporcionar en un soporte sólido antes de poner en contacto la muestra o el reactivo de péptido se puede adaptar para la unión al soporte sólido después de poner en contacto con la muestra y la unión a cualquier prión patógeno en la misma (por ejemplo, al usar un reactivo de péptido biotinilado y un soporte sólido que comprende una avidina o estreptavidina) . La invención proporciona de esta manera adicionalmente un método para detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra que comprende: (a) proporciona un primer soporte sólido que comprende un reactivo de péptido; (b) poner en contacto el primer soporte sólido con una muestra bajo condiciones que permitan que las proteínas priónicas patógenas, cuando están presentes en la muestra, se unan al reactivo de péptido para formar un primer complejo; (c) remover el material de muestra no unido; (d) disociar las proteínas priónicas patógenas del primer complejo; y (e) detectar los priones patógenos disociados usando un reactivo de unión a prión. El reactivo de péptído se deriva de manera preferente de un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 12-260. Son convencionales en la técnica los métodos para elaborar un soporte sólido que comprende un reactivo de péptido y se describen en otra parte de la presente e incluyen métodos bien conocidos para unir proteínas y péptidos a varias superficies sólidas. La muestra se pone en contacto con el soporte sólido que comprende el reactivo de péptido bajo condiciones que permiten la unión de cualquier proteína priónica patógena en la muestra para que se una al reactivo de péptido, formando un primer complejo. Estas condiciones de unión se determinan fácilmente por un experto en la técnica y se describen adicionalmente en la presente. Típicamente, el método se lleva a cabo en las cavidades de una placa de microtítulo o en tubos de plástico de volumen pequeño, pero será adecuado cualquier recipiente conveniente. La muestra en general es una muestra líquida o suspensión y se puede adicionar al recipiente de reacción antes o después del reactivo de péptido. Una vez que se establece el primer complejo, se puede remover el material de muestra no unido (es decir, cualquier componente de la muestra que no se haya unido al reactivo de péptido, incluyendo cualquier proteína priónica patógena no unida) al separar el soporte sólido de la solución de reacción (que contiene los materiales de muestra no unidos), por ejemplo, por centrifugación, precipitación, filtración, fuerza magnética, etc. El soporte sólido con el primer complejo se puede someter opcionalmente a uno o más pasos de lavado para remover cualquier material de muestra residual antes de llevar a cabo los siguientes pasos del método. Después de la remoción de los materiales de muestra no unidos y cualquier lavado opcional, las proteínas priónicas patógenas unidas se disocian del primer complejo. Esta disociación se puede lograr de varias maneras. En una modalidad, se adiciona un agente caotrópico, de manera preferente un compuesto de guanidinio, por ejemplo, tiocianato de guanidinio o clorhidrato de guanidinio, a una concentración de entre 3M y 6M. La adición del agente caotrópico provoca que la proteína priónica patógena se disocie del reactivo de péptido y también provoca que se desnaturalice la proteína priónica patógena. En otra modalidad, la disociación se logra al aumentar ya sea el pH a 12 o por arriba ("pH alto") o al disminuir el pH a 2 o por abajo ("pH bajo"). La exposición del primer complejo a ya sea pH alto o bajo da por resultado la disociación de la proteína priónica patógena del reactivo de péptido y provoca que se desnaturalice la proteína priónica patógena. En esta modalidad, se prefiere la exposición del primer complejo a pH alto. En general es suficiente un pH de entre 12.0 y 13.0; de manera preferente, se usa un pH de entre 12.5 y 13.0; de manera más preferente, un pH de 12.7 a 12.9; de manera más preferente, un pH de 12.9. De manera alternatural, se puede usar la exposición del primer complejo a un pH bajo para disociar y desnaturalizar la proteína priónica patógena del reactivo de péptido. Para esta alternatural, es suficiente un pH de entre 1.0 y 2.0. Se lleva a cabo la exposición del primer complejo a ya sea un pH alto o un pH bajo durante sólo un tiempo corto, por ejemplo 60 minutos, de manera preferente por no más de 15 minutos, de manera más preferente por no más de 10 minutos. Las exposiciones más prolongadas que esto puede dar por resultado deterioro significativa de la estructura de la proteína priónica patógena tal que los epítopos reconocidos por los anticuerpos anti-prión usados en los pasos de detección se destruyen. Después de la exposición durante tiempo suficiente para disociar la proteína priónica patógena, se puede ajustar fácilmente el pH a neutral (es decir, pH de entre aproximadamente 7.0 y 7.5) por la adición de ya sea un reactivo ácido (si se usan condiciones de disociación de pH alto) o un reactivo básico (si se usan condiciones de disociación de pH bajo) . Un experto en la técnica puede determinar fácilmente protocolos apropiados, y los ejemplos se describen en la presente. En general, para efectuar una condición de disociación de pH alto, es suficiente la adición de NaOH a una concentración de aproximadamente 0.05 N a aproximadamente 0.2 N. De manera preferente, se adiciona NaOH a una concentración de entre 0.05 N a 0.15 N; de manera más preferente, se usa NaOH 0.1 N. Una vez que la disociación del prión patógeno del reactivo de péptido se logra, el pH se puede reajustar a neutral (es decir, entre aproximadamente 7.0 y 7.5) por la adición de cantidades adecuadas de solución acida, por ejemplo, ácido fosfórico, fosfato de sodio monobásico . En general, para efectuar una condición de disociación de pH bajo, es suficiente la adición de H3P04 a una concentración de aproximadamente 0.2 M a aproximadamente 0.7 M. De manera preferente, se adiciona H3P04 a una concentración de entre 0.3 M y 0.6 M; de manera más preferente, se usa H3P04 0.5 M. Una vez que se logra la disociación del prión patógeno del reactivo de péptido, el pH se puede reajustar a neutral (es decir, entre aproximadamente 7.0 y 7.5) por la adición de cantidades adecuadas de una solución básica, por ejemplo NaOH o KOH. La proteína priónica patógena disociada entonces se separa del soporte sólido que comprende el reactivo de péptido. Por "separar" se quiere decir que el prión disociado y el soporte sólido (con el reactivo de péptido unido) no están presentes conjuntamente en el mismo recipiente. Esta separación se puede lograr de manera similar para la remoción de los materiales de muestra no unidos descritos anteriormente. La proteína priónica patógena disociada se puede detectar usando reactivos de unión a prión. Se conocen varios agentes de unión a prión y se describen en otra parte de la presente. Los reactivos preferidos de unión a prión para la detección de la proteína priónica patógena disociada son anticuerpos anti-prión. Se han descrito varios anticuerpos anti-prión y muchos están comercialmente disponibles, por ejemplo, Fab D18 (Peretz et al. (2001) Nature 412: 739-743), 3F4 (disponible de Sigma Chemical St Louis MO; ver también, patente de los Estados Unidos número 4,806,627), SAF-32 (Cayman Chemical, Ann Arbor MI), 6H4 (Prionic AG, Suiza; ver también, patente de los Estados Unidos número 6,765,088). Las proteínas priónicas patógenas disociadas se pueden detectar en un ensayo tipo ELISA, ya sea como un ELISA directo o un ensayo tipo ELISA de intercalación de anticuerpo, que se describe más completamente más adelante. Aunque el término "ELISA" se usa para describir la detección con anticuerpos anti-prión, el ensayo no se limita a unos en los cuales los anticuerpos se "enlazan a enzima". Los anticuerpos de detección se pueden marcar con cualquiera de las marcas detectables descritas en la presente y bien conocidas en la técnica de inmunoensayos. En una modalidad del método, la proteína priónica patógena disociada se reviste pasivamente sobre la superficie de un segundo soporte sólido. Son bien conocidos los métodos para este revestimiento pasivo y se llevan a cabo típicamente en NaHC03 100 mM a pH 8 durante varias horas a aproximadamente 37°C o durante la noche a 4°C. Son bien conocidos otros amortiguadores de revestimiento (por ejemplo, carbonato 50 mM, pH 9.6, Tris 10 mM, pH 8, o PBS 10 mM, pH 7.2). El segundo soporte sólido puede ser cualquiera de los soportes sólidos descritos en la presente o bien conocidos en la técnica; de manera preferente el segundo soporte sólido es una placa de microtítulo, por ejemplo, una placa de poliestireno de 96 cavidades. Donde la disociación se ha llevado a cabo usando una alta concentración de agente caotrópico, la concentración del agente caotrópico se reducirá por dilución por aproximadamente 2 veces antes del revestimiento en el segundo soporte sólido. Donde la disociación se ha llevado a cabo usando un pH alto o bajo, seguido por neutralización, la proteína priónica patógena disociada se puede usar para revestimiento sin ninguna dilución adicional. Una vez que la proteína priónica patógena disociada se reviste sobre el segundo soporte sólido, el soporte se puede lavar para remover cualquier componente que no se haya adherido al soporte sólido. Se adicionan anticuerpos anti-prión bajo condiciones que permiten la unión de los anticuerpos a la proteína priónica elegida en el segundo soporte sólido. Si la proteína priónica patógena disociada se ha desnaturalizado antes del revestimiento en el segundo soporte sólido, los anticuerpos usados serán los que se unen a la forma desnaturalizada de la proteína priónica. Estos anticuerpos incluyen unos que son bien conocidos (tal como aquéllos descritos anteriormente) así como anticuerpos que se generan por métodos bien conocidos, por ejemplo, al usar rPrP, PrPC o fragmentos de los mismos, para producir una reacción inmunitaria en ratones, conejos, ratas, etc. (ver, patentes de los Estados Unidos números 4,806,627; 6,165,784; 6,528,269; 6,379,905; 6,261,790; 6,765,088; 5,846,533; EP 891552B1 y EP 909388B1) . Los anticuerpos anti-prión que reconocen los epítopos en el extremo N-terminal de la proteína priónica son particularmente preferidos, por ejemplo, anticuerpos que reconocen epítopos dentro de la región de los residuos 23-90. De esta manera, la invención en una modalidad proporciona un método para detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra que comprende: (a) proporcionar un primer soporte sólido que comprende un reactivo de péptido; (b) poner en contacto el primer soporte sólido con una muestra bajo condiciones que permitan que las proteínas priónicas patógenas, cuando están presentes en la muestra, se unan al reactivo de péptido para formar un primer complejo; (c) remover el material de muestra no unido; (d) disociar las proteínas priónicasicas patógenas del primer complejo; (e) separar las proteínas priónicasicas patógenas disociadas del primer soporte sólido; (f) poner en contacto las proteínas priónicasicas patógenas disociadas con un segundo soporte sólido bajo condiciones que permitan que la proteína priónica disociada se adhiera al segundo soporte sólido; y (g) detectar los priones patógenos adheridos en el segundo soporte sólido usando un reactivo de unión a prion. Los reactivos de péptidos preferidos son aquellos que se derivan de un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ. ID. Nos.: 12-260. En esta modalidad, el primer soporte sólido es de manera preferente una cuenta magnética; el segundo soporte sólido es de manera preferente una placa de microtítulo; el reactivo de unión a prión es de manera preferente un anticuerpo anti-prión, de manera particular 3F4, 6H4, SAF32. El reactivo de unión a prión se marca de manera detectable. En otra modalidad del método, las proteínas priónicasicas patógenas disociadas se detectan usando un ELISA tipo intercalación de anticuerpo. En esta modalidad, la proteína priónica disociada se "recaptura" en un segundo soporte sólido que comprende un primer anticuerpo anti-prión.

El segundo soporte sólido con la proteína priónica recapturada, se lava opcionalmente para remover cualquier material no unido, y luego se pone en contacto con un segundo anticuerpo anti-prión bajo condiciones que permiten que el segundo anticuerpo anti-prión se una a la proteína priónica recapturada. El primero y segundo anticuerpos anti-prión serán típicamente anticuerpos diferentes y reconocerán de manera preferente diferentes epítopos en la proteína priónica. Por ejemplo, el primer anticuerpo anti-prión reconocerá un epítopo en el extremo N-terminal de la proteína priónica y el segundo anticuerpo anti-prión reconocerá un epítopo en otra que la N-terminal, o viceversa. El primer anticuerpo puede se, por ejemplo, SAF32 que reconoce un epítopo en la región de otra repetición (residuos 23-90) y el segundo anticuerpo puede ser 3F4, que reconoce el epítopo en los residuos 109-112; de manera alternatural, el primer anticuerpo puede ser 3F4 y el segundo anticuerpo puede ser SAF32. Se pueden seleccionar fácilmente otras combinaciones del primero y segundo anticuerpo. En esta modalidad, el segundo anticuerpo anti-prión, pero no el primer anticuerpo anti-prión, se marcarán de manera detectable. Cuando se lleva a cabo la disociación de la proteína priónica patógena del reactivo de péptido usando un agente caotrópico, se debe remover el agente caotrópico o diluir por al menos 15 veces antes de llevar a cabo el ensayo de detección. Cuando la disociación se recubre usando un pH alto o bajo y neutralización, el prión disociado se puede usar sin dilución adicional. Cuando la proteína priónica patógena disociada se desnaturaliza antes de llevar a cabo la detección, el primero y segundo anticuerpos se unirán ambos a la proteína priónica desnaturalizada. La invención proporciona de esta manera un método para detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra, que comprende: (a) proporcionar un primer soporte sólido que comprende un reactivo de péptido; (b) poner en contacto el primer soporte sólido con una muestra bajo condiciones que permiten que las proteínas priónicasicas patógenas, cuando están presentes en la muestra, se unan al reactivo de péptido para formar un primer complejo; (c) remover el material de muestra no unido; (d) disociar las proteínas priónicasicas patógenas del primer complejo, por lo que se desnaturaliza la proteína priónica patógena; (e) separar las proteínas priónicasicas patógenas desnaturalizadas, disociadas del primer soporte sólido; (f) poner en contacto las proteínas priónicasicas patógenas desnaturalizadas disociadas con un segundo soporte sólido, en donde el segundo soporte sólido comprende un primer anticuerpo anti-prión, bajo condiciones que permiten que la proteína priónica disociada se una al primer anticuerpo anti-prión; y (g) detectar las proteínas priónicasicas unidas en el segundo soporte sólido con un segundo anticuerpo anti-prión. Los reactivos de péptidos preferidos son aquellos que se derivan de un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ. ID. Nos.: 2-260. En esta modalidad, el primer soporte sólido es de manera preferente una cuenta magnética; el segundo soporte sólido es de manera preferente una placa de microtítulo o una cuenta magnética; el primero y segundo anticuerpos anti-prión son de manera preferente diferentes anticuerpos; el primero y segundo anticuerpos se unen a la proteína priónica desnaturalizada; de manera preferente, al menos uno del primero o segundo anticuerpos anti-prión reconocen un epítopo de la región N-terminal de la proteína priónica. Para el uso en el método de la invención, la muestra puede ser cualquier cosa conocida que, o sospechosa de, contener una proteína priónica patógena. La muestra puede ser una muestra biológica (es decir, una muestra preparada de un organismo vivo o antiguamente vivo) o una muestra no biológica. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, órganos, sangre entera, fracciones sanguíneas, componentes sanguíneos, plasma, plaquetas, suero, fluido cerebroespinal (CSF), tejido cerebral, tejido del sistema nervioso, tejido muscular, médula ósea, orina, lagrimas, tejido del sistema no nervioso, órganos, y/o biopsias o necropsias. En general, la muestra será una muestra líquida a una suspensión. Las muestras biológicas preferidas incluyen sangre entera, fracciones de sangre, componentes de sangre, plasma, plaquetas y suero. La muestra se pone en contacto con uno o más reactivos de péptidos de la invención bajo condiciones que permiten la unión de los reactivos de péptidos a la proteína priónica patógena si está presente en la muestra. Está bien dentro de la competencia de un experto en la técnica determinar las condiciones particulares en base a la descripción en la presente. Típicamente, la muestra y los reactivos de péptidos se incuban conjuntamente en un amortiguador adecuado a aproximadamente pH neutral (por ejemplo, un amortiguador de TBS a pH 7.5) a una temperatura adecuada (por ejemplo, aproximadamente 4°C), durante un periodo de tiempo adecuado (por ejemplo, aproximadamente 1 hora a durante la noche) para permitir que se presente la unión. Los pasos de detección y captura descritos anteriormente se pueden llevar a cabo en solución o se pueden llevar a cabo en o sobre un soporte sólido, o alguna combinación de solución y fase sólida. Se describen en la presente los formatos adecuados de ensayo de fase sólida. En general, para los formatos de fase sólida, el reactivo de captura (que puede ser uno o más de los reactivos de péptidos de la invención, o uno o más de los reactivos de unión a prion) se une, o se adapta para la unión, a un soporte sólido. El reactivo de captura se puede adaptar para la unión a un soporte sólido por cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, el reactivo de captura y el soporte sólido pueden comprender cada uno un miembro de un par de unión, tal que cuando el reactivo de captura se pone en contacto con el soporte sólido, el reactivo de captura se une al soporte sólido a través de la unión de los miembros del par de unión. Por ejemplo, el reactivo de captura puede comprender biotina y el soporte puede comprender avidina o estreptavidina. Además de la biotina-avidina y de biotina-estreptavidina, otros pares de unión adecuados para esta modalidad incluyen, por ejemplo, antígeno-anticuerpo, hapteno-anticuerpo, mimetopo-anticuerpo, receptor-hormona, receptor-ligando, agonista-antagonista, lectina-carbohidrato, proteína A-anticuerpo Fe. Son bien conocidos estos pares de unión (ver por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,551,843 y 6,586,193) y un experto en la técnica será competente para seleccionar los pares adecuados de unión y adaptarlos para el uso con la presente invención. Cuando el reactivo de captura se adapta para la unión al soporte como se describe anteriormente, la muestra se puede poner en contacto con el reactivo de captura antes o después de que se una el reactivo de captura al soporte. De manera alternatural, los reactivos de péptidos y los anticuerpos anti-prión se pueden unir de manera covalente al soporte sólido usando químicas de conjugación que son bien conocidas en la técnica. Los reactivos de péptidos que contienen prión se unen directamente a soportes sólidos, por ejemplo, cuentas magnéticas, usando métodos normales conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Chrisey, L.A., Lee, G.U. y O'Ferrall, CE. (1996). Unión covalente de ADN sintético a películas de monocapa auto-montadas. Nucleic Acids Research 24(15), 3031-3039; Kitagawa, T., Shimozono, T., Aikawa, T., Yoshida, T. y Nishimura, H. (1980). Preparación y caracterización de reactivos de reticulación etero-bifuncionales para modificaciones de proteína. Chem . Pharm . Bull . 29(4), 1130-1135). Primero, se acoplan las cuentas magnéticas carboxiladas a un reticulador heterobifuncional que contiene una funcionalidad de maleimida (BMPH) de Pierce Biotechnology Inc.) usando la química de carbodiimida . El péptido tiolado o el peptoide entonces se acopla covalentemente a la funcionalidad de maleimida de las cuentas revestidas con BMPH. El reactivo de péptido usado en el método de la invención es como se describe en la presente y en las solicitudes de Patente de los Estados Unidos co-poseídas No. de serie 10/917,646, presentada el 13 de agosto del 2004; No. de Serie 11/056,950, presentada el 11 de febrero del 2005-, y solicitud PCT No. PCT/US2004/026363, presentada el 13 de agosto del 2004. El reactivo de péptido se puede derivar de fragmentos de péptido de una proteína priónica. De manera preferente, el reactivo de péptido se deriva de un péptido que tiene una SEQ. ID. Nos.: 12-260, es decir, el reactivo de péptido se deriva de un péptido que tiene una secuencia de SEQ. ID. No.: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 16* 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259 o 260. De manera más preferente, el reactivo de péptido usado en el método se deriva de un péptido que tiene una secuencia de una de SEQ. ID. Nos.: 66, 67, 68, 721, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 134 o 135; o de péptidos que tienen SEQ. ID. Nos.: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128 o 133; de péptidos que tienen SEQ. ID. Nos.: 56, 57,65, 82, 84 o 136; de manera más preferente, el reactivo de péptido se deriva de un péptido que tiene una secuencia de SEQ. ID. Nos.: 68, 50 o 14. El reactivo de péptido puede estar biotiniliado . El reactivo de péptido se puede unir a un soporte sólido. En algunas modalidades, el reactivo de péptido se puede marcar de manera detectable. En general, se usan reactivos de péptidos como se describe en la presente para la unión a proteínas priónicasicas en una muestra (por ejemplo, como un reactivo de captura) y/o para detectar la presencia de proteínas priónicasicas (por ejemplo, como un reactivo de detección). El reactivo de captura y el reactivo de detección pueden ser moléculas separadas, o de manera alternatural una molécula puede servir para funciones tanto de captura como de detección. En ciertas modalidades, los reactivos de captura y/o detección son reactivos de péptidos descritos en la presente que interactúan perifericialmente con priones patógenos (es decir, son específicos del prión patógeno) . En otras modalidades, el reactivo de captura es específico para priones patógenos y el reactivo de detección se une tanto a las formas patógenas como no patógenas, por ejemplo anticuerpos que se unen a las proteínas priónicasicas. Se han descrito anteriormente en la presente estos reactivos de unión a prion. De manera alternatural, en otras modalidades, el reactivo de captura no es específico para los priones patógenos y el reactivo de detección es específico para priones patógenos. Entonces se puede usar cualquier medio adecuado de detección para identificar la unión entre un reactivo de péptido como se describe en la presente y una proteína priónica. Por ejemplo, los ensayos como se describe en la presente pueden comprender el uso de reactivos de péptidos o anticuerpos marcados. Las marcas detectables adecuadas para el uso en la invención incluyen cualquier molécula capaz de detección, incluyendo, pero no se limita a, isótopos radioactivos, agentes de fluorescencia, agentes quimioluminiscentes, cromóforos, nanocristales semiconductores fluorescentes, enzimas, substratos enzimáticos, con factores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, cromóforos, tintes, iones metálicos, soluciones coloidales de metales, ligandos (por ejemplo, biotina, estreptavidina o hapteno) y similares. Las marcas adicionales incluyen, pero no se limitan a, aquellas que usan fluorescencia, incluyendo aquellas sustancias o porciones de las mismas que son capaces de exhibir fluorescencia en el intervalo detectable. Los ejemplos particulares de marcas que se pueden usar esta invención incluyen, pero no se limitan a, fosfataza alcalina (AP) , peroxidasa de rábano (HRP), fluoresceína, FIAC, rodamina, dansilo, umbelliferona, éster de dimetil-acridinio (DMAE) , rojo Texas, luminol, NADPH y ß-galactosidasa. Además, la marca detectable puede incluir una marca de oligonucleótido, marca que se puede detectar por cualquier método conocido de detección de ácido nucleico que incluye PCR, TMA, b-ADN, NASBA, etc. Se pueden llevar a cabo uno o más de los pasos de los ensayos descritos en la presente en solución (por ejemplo, un medio líquido) o en un soporte sólido. Un soporte sólido, para propósitos de la invención, puede ser cualquier material que es una matriz insoluble y puede tener una superficie rígida o semirigida a la cual se puede enlazar o unir una molécula de interés (por ejemplo, reactivos de péptidos de la invención, reactivos prión, anticuerpos, etc.). Los soportes sólidos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, substratos tal como nitrocelulosa, cloruro de polivinilo, polipropileno, poliestireno, látex, policarbonato, nylon, dextrano, quitina, arena, sílice, piedra pómez, agarosa, celulosa, vidrio, metal, poliacrilamida, silicio, caucho, polisacáridos, cloruro de polivinilo, papel diazotisado; cuentas activadas, cuentas magnéticamente sensibles, y cualquier material comúnmente usado para síntesis de fase sólida, separaciones para afinidad, purificaciones, reacciones de hibridación, inmunoensayos y otras aplicaciones. El soporte puede ser en partículas o puede estar en la forma de una superficie continua e incluye membranas, mallas, placas, granulos, portaobjetos, discos, capilares, fibras huecas, agujas, espigas, trozos, fibras sólidas, geles (por ejemplo, geles de sílice) y cuentas (por ejemplo, cuentas de poro-vidrio, geles de sílice, cuentas de poliestireno opcionalmente reticuladas con divinilbenceno, cuentas de co-poli-injertadas, cuentas de poliacrilamida, cuentas de látex, cuentas de dimetilacrilamida opcionalmente reticuladas con N-N' -bis-acriloiletilendiamina, cuentas magnéticas de óxido de hiero, y partículas de vidrio revestidas con un polímero hidrófobo. Los soportes sólidos particularmente preferidos son placas de micro titulo de poliestireno y/o partículas magnéticas de poliestireno, por ejemplo, Dynabeads M-270 (Dynal Biotech). Los reactivos de péptidos como se describe en la presente se pueden acoplar fácilmente al soporte sólido usando técnicas normales. Se puede mejorar la inmovilización al soporte al acoplar primero el reactivo de péptido a una proteína (por ejemplo, cuando la proteína tiene mejores propiedades de unión a la fase sólida) . Las proteínas de acoplamiento adecuadas incluyen, pero no se limitan a, macromoléculas tal como albúminas de suero que incluyen albúmina de suero bovino (BSA) , hemocianina de lapa, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina, y otras proteínas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Otros reactivos que se pueden usar para unir moléculas al soporte incluyen polisacáridos, ácidos polilácticos, ácido poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y similares. Estas moléculas y métodos de acoplamiento de estas moléculas a proteínas, son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Brinkley, M.A., (1992) Bioconj uga te Chem . , 3:2-13; Hashida et al. (1984) J. Appl . Biochem . , 6:56-63 y Anjaneyulu y Staros (1987) In terna tional J. of Peptide and Protein Res . 30:117-124. Si se desea, las moléculas que se van adicionar al soporte sólido se pueden funcionalizar fácilmente para crear porciones de estireno o acrilato, permitiendo de este modo la incorporación de las moléculas en poliestireno, poliacrilato u otros polímeros tal como poliamida, poliacrilamida, polietileno, polivinilo, polidiacetileno, polifenilen-vinileno, polipéptido, polisacárido, polisulfona, polipirrol, poliimidazol, politiiofeno, poliéter, epóxidos, vidrio de sílice, gel de sílice, siloxano, polifosfato, hidrogel, agarosa, celulosa y similares. Los reactivos de péptidos se pueden unir al soporte sólido a través de la interacción de un par de unión de moléculas. Estos pares de unión son bien conocidos y los ejemplos se describen en otra parte de la presente. Se acopla un miembro del par de unión por técnicas descritas anteriormente al soporte sólido y el otro miembro del par de unión se une al reactivo de péptido (antes, durante o después de la síntesis) . El reactivo de péptido modificado de esta manera se puede poner en contacto con la muestra y puede presentarse la interacción con el prión patógeno, si está presente, en solución, después de lo cual el soporte sólido se puede poner en contacto con el reactivo de péptido (o complejo de péptido-prion) . Los pares de unión preferidos para esta modalidad incluyen biotina y avidina, y biotina y estreptavidina . También se pueden usar controles adecuados en los ensayos de la invención. Por ejemplo, se puede usar un control negativo de PrPc en los ensayos. También se puede usar un control positivo de PrPSc (o PrPres) en los ensayos. Los controles sustitutos, descritos más adelante, también encuentran uso en la invención. Los reactivos de ensayo descritos anteriormente, incluyendo los reactivos de péptidos descritos en la presente, se pueden proporcionar en kits, con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios, a fin de llevar a cabo los ensayos de detección como se describe anteriormente. Donde el reactivo de péptido se conjuga sobre un soporte sólido, el kit puede comprender adicionar o de manera alternatural estos reactivos de péptidos conjugados en uno o más soportes sólidos. El kit puede contener adicionalmente uno o más anticuerpos anti-prión. Este anticuerpo anti-prión se puede marcar de manera detectable o se puede proporcionar en un soporte sólido. El kit puede contener adicionalmente controles positivos y negativos adecuados, como se describe anteriormente. El kit también puede contener, dependiendo del ensayo de detección particular usado, marcas adecuadas y otros reactivos y materiales envasados (por ejemplo, amortiguadores de lavado, amortiguadores de incubación) .

V. Controles Sustitutos Se describen en la presente moléculas de control sustitutas útiles en los ensayos de detección de priones. También se proporcionan composiciones que comprenden los controles sustitutos para usar estos sustitutos. Aunque se han descrito anteriormente controles artificiales para inmunoensayos (ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,846,738; 5,491,218; 6,015,662; 6,281,004 y Publicación de Patente Internacional WO 99/33965), estas moléculas no son aplicables a ensayos de priones y no pueden servir como controles. En ciertos aspectos, el control sustituto se une a un reactivo de péptido que ínteractúa de manera preferencial con una proteína priónica patógena. De esta manera, en estos aspectos, la invención (controles sustitutos y métodos para usar los mismos) depende en parte del descubrimiento, como se expone en las solicitudes de patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/917,646, presentada el 13 de Agosto de 2004; No. de Serie 11/056,950, presentada el 11 de Febrero de 2005; y Solicitud PCT, PCT No. US/2004/026363, presentada el 13 de Agosto de 2004, que los fragmentos relativamente pequeños de una proteína priónica pueden interactuar de manera preferencial con la forma patógena del prión. Estos fragmentos no necesitan ser parte de una estructura de proteína más grande u otro tipo de molécula de núcleo molecular a fin de exhibir su interacción preferencial con la isoforma del prión patógeno. En tanto que no se desea mantener ninguna teoría particular, parece que los fragmentos de péptido toman espontáneamente una conformación que permite la unión a la isoforma del prión patógeno pero no a la isoforma del prión no patógeno, quizá al imitar la conformación que esta presente en la isoforma no patógena. Este principio general, que ciertos fragmentos de una proteína de enfermedad conformacional interactúan preferencialmente con la forma patógena de esa proteína de enfermedad conformacional, aquí demostrada para los priones, se puede aplicar fácilmente a otras proteínas de enfermedad conformacional para producir reactivos de péptidos que interactúen preferencialmente con las formas patógenas. Será evidente para un experto en la técnica que, en tanto que los fragmentos proporcionan un punto de inicio, (en términos del tamaño o características de secuencia, a manera de ejemplo), se pueden hacer muchas modificaciones en los fragmentos para producir reactivos de péptidos con atributos más deseables por ejemplo, mayor afinidad, mayor estabilidad, mayor solubilidad, menos sensibilidad a proteasa, mayor especificidad, más fácil de sintetizar, etc.). De esta manera, los controles sustitutos descritos en la presente se unen a reactivos de unión a priones, incluyendo reactivos de péptidos como se describe en la Solicitud Internacional No. PCT/US2004/026363, presentada el 13 de Agosto de 2004 así como anticuerpos (o fragmentos de los mismos) a estos reactivos de péptidos y/o otros anticuerpos de priones. Por consiguiente, estos controles sustitutos proporcionan controles de calidad y/o positivos no infecciosos simples y eficientes para los ensayos de priones y se pueden usar para confirmar una diagnosis de enfermedades relacionadas a priones en virtualmente cualquier muestra, biológica y no biológica, incluyendo tejido de cerebro vivo o muerto, médula espinal, u otro tejido del sistema nervioso así como sangre. Además, se puede usar cualquier sistema adecuado de amplificación de señal para facilitar adicionalmente la detección de los controles sustitutos en los ensayos, incluyendo pero no limitados a, el uso de múltiples sitios de reconocimiento, ADN ramificado para la amplificación de señales (ver, por ejemplo Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,681,697; 5,424,413; 5,451,503; 5,4547,025; y 6,235,483); aplicación de técnicas de amplifación objetivo tal como PCR, amplificación de circo rodante, invasor de tercera onda (Arruda et al. 2002 Expert. Rev. Mol. Diagn. 2:487; Patentes de los Estados Unidos Nos. 6090606, 5843669, 5985557, 6090543, 5846717), NASBA, TMA etc. (Patente de los Estados Unidos No. 6,511, 809; EP 0544212A1); y/o técnicas de inmuno-PCR (ver, por ejemplo Patente de los Estados Unidos No. 5,665,539; Publicaciones Internacionales WO 98/23962; WO 00/75663; y WO 01/31056) . Se describen en la presente moléculas no infecciosas que interactúan con controles sustitutos para ensayos de detección de priones, particularmente para ensayos que detectan priones patógenos en una muestra. Los controles sustitutos descritos en la presente son útiles como controles positivos para confirmar la exactitud de los métodos de detección/aislamiento de priones y/o como controles de calidad para asegurar que los reactivos de ensayo y los métodos se ajustan a las normas bajo las cuales se califica el ensayo. En general, los ensayos para los cuales los controles sustitutos descritos son más útiles y utilizan un reactivo de unión a prión, que puede ser, inter alia, un reactivo de péptido que interactúa preferencialmente con una proteína priónica patógena, para "capturar" el prión que se va a detectar. Por "capturar" se propone decir inmovilización o localización del prión por el reactivo de péptido. El reactivo de unión a prión y la proteína priónica "capturada" forman típicamente el complejo que se puede detectar por los métodos que se describen adicionalmente en la presente. Frecuentemente, la detección del complejo se logra por el uso de un reactivo de detección. El reactivo de detección es típicamente un reactivo de unión a prión y usualmente se marca de manera detectable (o marcable, por ejemplo, en el caso de un anticuerpo de detección primario y un anticuerpo secundario marcado) . Los controles sustitutos de la invención comprenden un primer dominio que se une al reactivo de unión a prión de un ensayo de priones. Por ejemplo, en un aspecto, el primer dominio se une a un reactivo de péptido que interactúa preferencialmente con PrPSc. El control sustituto también puede comprender una o más marcas detectables tal que se pueda detectar fácilmente la unión del control sustituto al reactivo de unión a prión (por ejemplo, reactivo de péptido) . En un aspecto, los controles sustitutos son bifuncionales (o, en algunos casos, trifuncionales) ya que comprenden el primer dominio del reactivo de unión a prión y un segundo dominio, el segundo dominio que comprende una molécula que se une al reactivo de detección del ensayo de prión. Por ejemplo, si el reactivo de detección comprende un anticuerpo, el segundo dominio puede comprender un epítopo (o mimotopo) reconocido por el anticuerpo. De manera alternatural, el segundo dominio y el reactivo de detección pueden comprender cada uno un miembro de un par de unión de moléculas (por ejemplo, biotina y estreptavidina, etc.). De esta manera, el primero y segundo dominios son típicamente moléculas diferentes entre sí pero pueden, en algunos casos, ser la misma molécula. El segundo dominio de un sustituto bifuncional puede unirse directamente a un reactivo de detección detectablemente marcado. De manera alternatural, el segundo dominio puede reconocer un componente de un sistema de detección. Por ejemplo, en ciertos inmunoensayos (tal como ELISA), el analito (por ejemplo, prión o control sustituto) se detecta por la unión a un anticuerpo primario, anticuerpo primario que se une a su vez a un anticuerpo secundario detectablemente marcado. De esta manera, en ciertas modalidades, el segundo dominio reconoce un anticuerpo primario de un sistema de reactivo de detección de dos anticuerpos . Los controles sustitutos bifuncionales (o trifuncionales) de la invención pueden ser moléculas individuales (por ejemplo, una proteína de fusión o quimérica que comprende dos dominios) o dos (o más) moléculas sintetizadas de manera separada que se enlazan subsiguientemente de forma covalente o no covalente entre sí. Las moléculas se pueden enlazar de cualquier manera conocida en la técnica con tal que se conserven las funciones de unión de los dominios. Los controles sustitutos bifuncionales que comprenden dos dominios pueden comprender uno o más ligadores entre los dos dominios. Los controles sustitutos bifuncionales descritos en la presente se usan de manera ventajosa en ensayos de detección de priones que emplean como el reactivo de unión a prión uno o más reactivos de péptidos que interactúan preferencialmente con PrPSc. Se conocen muchos anticuerpos anti-PrP y los epitopes de PrP que los reconocen, por ejemplo como se expone en la Tabla A.

Tabla A: Anticuerpos y Epítopos de PrP Ab Epítopo/Péptido de Fuente de Referencia Inmunógeno Material Fab 226-231 de proteína InPro 1) Peretz et HuM-Rl priónica de hámster Sirio al . , Nature, YYDGRRS (SEQ ID NO: 274) 412: 739-743, 2001 2) Peretz et al., J. Mol. Biol., 273: 614- 622, 1997. 3) Williamson et al . , J. Virol . , 72: 9413-9418 4) Matsunaga et al . , Proteins, 44: 110-118, 2001 5) Leclerc et al., J. Mol. Biol., 326: 475- 483, 2003 Fab 152-163 de proteína InPro 1) Williamson et HuM- priónica de hámster al . , J. Virol . , R72 ENMNRYPNQVYY (SEQ ID NO: 72: 9413-9418, 275) 1998. 2) Peretz et al., J. Mol. Biol., 273: 614- 622, 1997. 3) Matsunaga et al . , Proteins, 44: 110-118, 2001.

Además de los anticuerpos y epítopos listados anteriormente, también se puede usar, en los controles sustitutos de la invención los anticuerpos generados contra reactivos de péptidos como se describe en la presente, fragmentos de estos anticuerpos, o epítopos o mimotopos de estos anticuerpos. Como se señala anteriormente, el primero y segundo dominios de los controles sustitutos se seleccionan dependiendo del reactivo de unión a prión y los reactivos de detección que se van a usar en el ensayo. Las Tablas B, C y D proporcionan ejemplos no limitantes de los controles sustitutos de ejemplo. En particular, la tabla B muestra los controles sustitutos de ejemplo cuando el reactivo de unión a prión del ensayo es un reactivo de péptido como se describe en la presente el primer dominio reconoce el reactivo de péptido.

Tabla B: Controles Sustitutos Bifuncionales para el Uso con Inmunoensayos de Reactivo de Péptido La Tabla C muestra controles sustitutos de ejemplo donde el reactivo de unión a prión del ensayo comprende un reactivo de péptido como se describe en la presente y el primer dominio reconoce una porción auxiliar en el péptido. La porción auxiliar puede ser, por ejemplo, una marca detectable, un miembro del par de unión (por ejemplo, biotina, His-6) , etc., péptido que se puede reconocer independiente de la secuencia peptídica de rebaja de PrP. El primer dominio del sustituto comprende una molécula que reconoce la porción auxiliar del reactivo de péptido, por ejemplo, un anticuerpo (o fragmento del mismo) , un aptámero, una protema, etc.

Tabla C: Controles Sustitutos Bifuncionales para el Uso con Inmunoensayos de Reactivos de Peptido-Porcion Auxiliar La Tabla D se presenta a controles sustitutos de ejemplo en los cuales el primer dominio comprende un epítopo reconocido por el anticuerpo usado como el reactivo de unión a prión en el ensayo. El segundo dominio sustituto comprende a su vez un epítopo reconocido por el reactivo de detección (anticuerpo que reconoce PrP) .

Tabla D: Controles Sustitutos Bifuncionales para el Uso con Inmunoensayos de Priones En cualquiera de los controles sustitutos descritos en uno o más dominios pueden incluir múltiples sitios de reconocimiento. Cuando el método de detección utiliza una ELISA tipo intercalación de dos anticuerpos, el control sustituto comprenderá un tercer dominio, tercer dominio que se une al anticuerpo de "recaptura". Por ejemplo, si el anticuerpo SAF32 se usa para recaptura de la proteína priónica patógena disasociada y el anticuerpo 3F4 se usa como el anticuerpo de detección, el control sustituto comprenderá los epítopos de reconocimiento tanto para los anticuerpos SAF32 como 3F4 además de un dominio que se une al reactivo de péptido usado en el paso de "rebaja".

VI. Aplicaciones Adicionales A. Detección Como se describe anteriormente, el método para detectar proteínas priónicas patógenas descritas en la presente se puede usar para diagnosticar enfermedad por prión en un sujeto. Además, el método descrito anteriormente también se puede usar para detectar contaminación de priones patógenos en sangre y/o suministros alimenticios. De esta manera, se puede preparar un suministro sanguíneo que este sustancialmente libre de priones patógenos al detectar alícuotas de muestras recolectadas individuales o muestras mezcladas usando cualquiera de los métodos de detección descritos en la presente. Las muestras o muestras mezcladas que están contaminadas con priones patógenos se pueden eliminar antes de que se combinen. De esta manera, se puede proporcionar un suministro sanguíneo sustancialmente libre de contaminación por priones patógenos. Por "sustancialmente libre de priones patógenos" se quiere decir que no se detecta la presencia de priones patógenos usando cualquiera de los ensayos descritos en la presente. De manera importante, los reactivos de péptidos descritos en la presente, que se ha mostrado ya para detectar formas de proteínas patógenas en tejido cerebral diluidas 106 veces por tejido normal, son el único reactivo demostrado que puede ser capaz de detectar priones patógenos en sangre. La invención proporciona de esta manera un método para preparar un suministro sanguíneo que este sustancialmente libre de priones patógenos, el suministro sanguíneo que comprende sangre entera, células sanguíneas rojas, plasma, plaquetas o suero, el método que comprende: (a) detectar alícuotas de sangre entera, células sanguíneas rojas, plasma, plaquetas o suero de muestras sanguíneas recolectadas por cualquiera de los métodos de detección proporcionados en la presente para la detección; y (b) combinar solo las muestras en los cuales no se detecten priones patógenos para proporcionar suministro sanguíneo que este sustancialmente libre de priones patógenos. De manera similar, el suministro sanguíneo se puede detectar para la presencia de priones patógenos a fin de proporcionar alimento que este sustancialmente libre de priones patógenos. De esta manera, usando cualquiera de los métodos descritos en la presente, se puede detectar, para la presencia de priones patógenos, muestras de organismos vivos propuestos como alimento para consumo humano o de animales. También se pueden detectar muestras tomadas del producto alimenticio propuesto para entrar en el suministro alimenticio. Se identifican las muestras en las cuales se detectan los priones patógenos y se remueven del suministro alimenticio del organismo vivo o el alimento propuesto para entrar en el suministro alimenticio del cual se detectaron las muestras en las cuales están los priones patógenos. De esta manera, se puede proporcionar un suministro alimenticio que esta sustancialmente libre de priones patógenos. La invención proporciona de esta manera un método para preparar suministro alimenticio que esta sustancialmente libre de priones patógenos, el método que comprende: (a) detectar una muestra recolectada de organismos vivos que entrará al suministro alimenticio o una muestra recolectada de alimento propuesto para entrar al suministro sanguíneo por cualquiera de los métodos de detección proporcionados en la presente para detectar priones patógenos; y (b) combinar solo muestras en las cuales no se detecten los priones patógenos para proporcionar un suministro sanguíneo que este sustancialmente libre de priones patógenos.

Ejemplos A continuación están ejemplos de modalidades específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos únicamente, y no se proponen que limiten el alcance de la presente invención de ninguna manera. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero por supuesto, se permitirá algún error experimental y desviación.

Ejemplo 1: Producción de Reactivo de Péptido Los fragmentos de péptido de las proteínas priónicas se sintetizaron químicamente usando técnicas normales de síntesis de péptidos, esencialmente como se describe en Merrifield (1969) Advan. Enzymol. 32:221 y Holm and Medal (1989). Múltiple column peptide synthesis, P. 208E, Bayer y G. Jung (ed.), Peptides 1988, Walter de Gruyter & Co . Berlin-N.Y. Los péptidos se purificaron por HPLC y la secuencia se verificó por espectroscopia de masas. En ciertos casos, los péptidos sintetizados incluyeron residuos adicionales en el término N o C, por ejemplo, los residuos GGG y/o incluyeron una o más sustituciones de aminoácidos en comparación a las secuencias tipo silvestre.

A. Sustituciones de Peptoides También se hicieron sustituciones de peptoides en el péptido presentado en SEQ ID NO: 14 (QWNKPSKPKTN, que corresponde a los residuos 97 a 107 de SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO: 67 (KKRPKPGGWNTGG, que corresponde a los residuos 23-36 de SEQ ID NO: 2) y SEQ ID NO: 68 (KKRPKPGG, que corresponde a los residuos 23-30 de SEQ ID NO: 2) . En particular, se sustituyeron uno o más residuos de prolina de estos péptidos con varios peptoides N-sustituidos. Ver, Figuras 3A-3F para peptoides que se pueden sustituir para cualquier prolina. Se prepararon peptoides y se sintetizaron como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,877,278 y 6,033,631, ambas de las cuales se incorporan como referencia en sus totalidades en la presente; Simón et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:9367.

B. Multimerización También se prepararon ciertos reactivos de péptidos como multímeros, por ejemplo al preparar repeticiones en tándem (múltiples copias de enlace de un péptido mediante ligadores tal como GGG) , múltiples péptidos antigénicos (MAPS) y/o péptidos enlazados de manera lineal. En particular, se prepararon MAPS usando técnicas normales, esencialmente como se describe en Wu et al. (2001) J Am Chem Soc. 2001 123(28): 6778-84; Spetzier et al. (1995) Int J Pept Protein Res. 45(l):78-85. También se prepararon péptidos lineales y ramificados (por ejemplo, multimerización de ligadores de PEG) usando ligadores de polietilenglicol (PEG) , usando técnicas normales. En particular, se crearon núcleos moleculares de PEG de multipéptidos ramificados con las siguientes estructuras: Biotina-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys (sin péptido de control) y Biotina-PEG-Lys (Péptido) -PEG-Lys (Péptido) -PEG-Lys (Péptido) -PEG-Lys ( Péptido) -PEG-Lys ( Péptido) . Además, se prepararon enlaces de péptido a Lys: Lys-epsilon-NH-CO- (CH2 ) 3-Mal-S-Cys-Péptido . Ver Figura 5.

C. Biotinilación Se biotinilaron péptidos usando técnicas normales después de la síntesis y purificación. Se adicionó biotina a la N- o C-terminal del péptido.

Ejemplo 2: Ensayos de Unión A. Rebaja Se probaron los reactivos de péptidos como se describe en la presente para su capacidad para unirse específicamente a proteínas priónicas usando un ensayo de rebaja con cuentas magnéticas. Para este ensayo, los reactivos de péptidos ya sea se marcaron con biotina, lo que permitió la unión a cuentas magnéticas revestidas con estraptavidina o se unieron covalentemente a cuentas magnéticas . Se prepararon homogenados de cerebro de ratones Balb-c PrP?c+ y PrPc+ RML. En el resumen, se adicionaron 5 mL de amortiguador TBS (Tris-HCl 50 mM, pH 7.5 y NaCl 37.5 mM) con TW20 al 1 % y tritón 100 al 1 % a cerebros que pesan aproximadamente 0.5 g para producir un homogenizado al 10 %. La suspensión espesa de los cerebros se homogeneizó hasta que han desaparecido las partículas grandes. Se adicionaron alícuotas de 200 µl diluidas 1:1 en amortiguador a tubos eppendorf pre-enfriados y las muestras se trataron con ultrasonido durante varias repeticiones de varios segundos cada uno. Se centrifugaron las muestras 10-15 minutos a 500x y los sobrenadantes se removieron. Para probar el efecto de la digestión con proteinasa K, ciertos sobrenadantes se dividieron en dos muestras y se adicionaron 4 µl de proteinasa K a una muestra y se giraron a 37 °C durante 1 hora. Se adicionaron ocho microlitos de PMSF a los tubos de proteinasa K para detener la digestión y los tubos se incubaron durante un mínimo de 1 hora a 4°C. Además, también se probaron diferentes formatos de la rebaja con péptidos biotinilados y cuentas magnéticas con estreptavidina. En un primer conjunto de experimentos, se mezcló homogenizado cerebral infeccioso con péptidos biotinilados y se adicionaron subsiguientemente cuentas con estreptavidina. En un segundo conjunto de experimentos, las cuentas magnéticas con estreptavidina se revistieron con péptidos biotinilados y luego se mezclaron con homogenados cerebrales infecciosos. En ambos conjuntos de experimentos, después de la incubación de los tres componentes (cuentas, péptidos y homogenados cerebrales) de forma conjunta, las mezclas se lavaron y se trataron con GdnSCN durante 15 minutos a temperatura ambiente y los ensayos ELISA se realizaron como se describe más adelante. Como se muestra en la Figura 14, el segundo formato (cuentas revestidas con péptidos biotinilados antes del mezclado con homogenados cerebrales) fue aproximadamente 100 veces más eficiente en el aislamiento (rebajas) de PrPSc que el primer formato (cuentas adicionadas después de que los péptidos biotinilados se mezclaron con homogenados cerebrales) . En base a estos resultados, se llevaron a cabo experimentos adicionales de detección siguiendo el segundo formato. Los homogenados se almacenaron a 4°C hasta el uso adicional y se trataron con ultrasonido nuevamente como se describe anteriormente si se necesita. Una preparación de PrPc+ o PrPSc+ al 10 % p/v de los homogenados cerebrales se incubó durante la noche a 4°C con un reactivo de péptido marcado con biotina, como sigue. Se prepararon tubos que contienen 400 µl de amortiguador, 50 µl de extracto y 5 µl de reactivo de péptido marcado con biotina (solución concentrada 10 mM) . Los tubos se incubaron durante un mínimo de 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C en un mecedor de plataforma. Después de la incubación, se adicionaron 50 µl (de cuentas SA (Dynal M280, Streptavidina 112.06) y los tubos se mezclaron por vórtice. Los tubos se incubaron, con oscilación (VWR, Rocking platform, Model 100) , durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C. Las muestras se removieron del agitador, se colocaron en campo magnético para recolectar las cuentas magnéticas con el reactivo de péptido unido y el prión y se lavó 5-6 veces usando 1 mL de amortiguador de ensayo. Las muestras se usaron inmediatamente o se almacenaron a -20°C hasta la Western Blot o ELISA, descritas más adelante.

B. Western Blot Se realizó el análisis de Western Blot como sigue. Complejos de cuenta-pépt ido-prión precipitados como se describe anteriormente se desnaturalizaron después del lavado final al adicionar 25-30 µl del amortiguador de SDS (Novex Tris-Glicina SDS-Muestra 2X) a cada tubo. Los tubos se mezclaron por vórtice hasta que se suspendieron todas las cuentas. Los tubos se hirvieron hasta que las partes superiores empezaron a abrirse, se recorrieron en un gel de SDS-PAGE normal y se transfirieron a una membrana sólida para análisis WB. La membrana se bloqueó durante 30 minutos en 5 % de leche/TBS-T [50 mL de Tris 1 M, pH 7.5; 37.5 mL de NaCl 4 M, 1-10 mL de Tween, llevar volumen a 1 L con leche] a temperatura ambiente. Entre 10-15 mL de anticuerpos policlonales anti-prión, como se describe en la Solicitud Internacional No. PCT/US03/21057 , presentada el 30 de septiembre del 2003, titulada "Quimeras de Priones y Usos de las Mismas", solicitud que se incorpora en la presente como referencia, se adicionaron a una dilución de 1:50 veces a la membrana y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana se lavó múltiples veces en TBS-T. Después del lavado, el anticuerpo secundario (anticuerpo anti-lgG de conejo (H+L) (Pierce) conjugado a fosfatasa alcalina (AP) se adicionó a dilución 1:1000 (en TBS-T) y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. La membrana se lavó múltiples veces en TBS-T. Se adicionó el reactivo de precipitación de fosfatasa alcalina (1 paso NBT/BCIP (Pierce) y se reveló hasta que el fondo apareció o fue evidente la señal.

C. ELISA Se realizó ELISA indirecto como sigue. (Figuras 7A-7C) . (ELISA indirecto usa placas revestidas con antígeno, en este caso placas revestidas con PrP del paso de rebaja, con un anticuerpo primario no marcado específico para el antígeno y un anticuerpo secundario marcado que se une al anticuerpo primario) . La rebaja de PrPSc en varias muestras se realizó como se describe anteriormente. En forma breve, se revistieron cuentas magnéticas con uno o más reactivos de péptidos como se describe en la presente y se pusieron en alícuota en una placa de 96 cavidades. Las muestras de los homogenados de cerebro de ratón, plasma humano mezclado con PrPSc, homogenados de cerebro de hámster sirio (SHa) de cerebros normales y con tembladera, cerebro humano con vCJD, y homogenados de cerebros de ratones normales y enfermos (PrPSc de CWD) transgénicos para el gen PrP de venado se incubaron con las cuentas revestidas con el reactivo de péptido durante 4 horas a temperatura ambiente, para permitir que cualquier PrPSc en la muestra se una a las cuentas revestidas con el reactivo de péptido. Después de la captura de la PrPSc por las cuentas con reactivo de péptido, las cavidades se lavaron para remover las rutinas no unidas al exponer las placas a un campo magnético y al remover el sobrenadante. La PrPSc unida al péptido entonces se desasoció de la cuenta de péptido.

Debido a que ningún anticuerpo está aún disponible para reconocer la PrPSc natural (no desnaturalizada) , la PrPSc se desasoció bajo condiciones desnaturalizantes, es decir, por incubación con tiocianato de guanidina 3M o 6M (GdnSCN) . Ver, por ejemplo, Peretz et al., (1997) J. Mol . Biol . 273 (3) : 614-622; Ryou et al., (2003) Lab Invest . 83 ( 6) : 837-43. La PrPSc desasociada se revistió en las placas por incubación con NaHC03 0.1M, pH 8.9 (110 µl/cavidad) y las cuentas se removieron de las cavidades por aspiración y lavado (3x con 200 µl de TBS con TW20 al 0.05 %). Después del lavado, las cavidades (revestidas con cualquier PrPSc en la muestra) se bloquearon con 200 µl de BSA al 3 % en TBS durante 1 hora a 37°C. La solución de bloqueo entonces se aspiró de las cavidades y se adicionaron 100 µl de una solución 0.5 µg/mL de Fab D18 primario (Peretz et al., (2001) Na ture 412 ( 6848 ): 739-743) en TBS con BSA al 1 % a cada cavidad y se incubaron durante 2 horas a 37°C. Las cavidades entonces se lavaron (9x con 300 µl de TBC con TW2 al 0.05 %). Se adicionó anticuerpo de cabra anti-humano conjugado con fosfataza alcalina (AP) a cada cavidad (100 µl a una dilución 1:5000) y la placa se incubó durante 1 hora a 37°C. Después del lavado (9x con 300 µl de TBC con TW2 al 0.05 %) , se adicionaron 100 µl de substrato de AP a cada cavidad, las placas se incubaron a 37 °C durante 0.5 horas y se leyó la densidad óptica (OD) de las placas.

Los resultados de ELISA indirectos se muestran en la Tabla 2 y las Figuras 7A-7C, 8, 9A-9B, 10A-10B, 11, y 12A-12B. La Tabla 2 muestra los valores de O.D. para varios reactivos de péptido. Los valores de O.D. sobre los controles en blanco (que varían de 0.172-0.259) se consideraron positivos. La Figura 8 muestra la detección por ELISA de PrPSc de los homogenados de cerebro de ratón mezclados con partículas priónicas infecciosas a varias diluciones. Se realizaron los ensayos ELISA como se describe anteriormente. La LD50 se define como la dosis letal para PrP?c que aniquila al 50 % de los animales, y se ha determinado para muchos modelos de roedores incluyendo ratones. Ver, por ejemplo, Klohn et al., (2003) Proc Na ti Acad Sci U S A 100 (20) : 11666-11671. El ensayo de ELISA detectó menos de 100 unidades de LD50 de infectividad de prión en plasma y capa leucocitaria, la sensibilidad requerida para detectar priones en muestras sanguíneas . Las Figuras 9A-9B muestran los resultados de ELISA de PrPSc de ratón mezclada en plasma humano usando QWNKPSKPKTN-biotina (SEQ. ID. No.: 14) (Figura 9A) y biotina-GGGKKRPKPGG (SEQ. ID. No.: 68) (Figura 9B) como reactivo de captura (rebaja). La Figura 10A muestra la detección por ELISA de 1 µl de homogenados de cerebro al 10 % de hámsteres Sirios (SHa) normales e infectados con PrPSc (comprados de VA Medical Center, Baltimore, Maryland) rebajados usando QWNKPSKPKTN-biotina (SEQ. ID. No.: 14) y biotina-GGGKKRPKPGG (SEQ. ID. No.: 68) y sin digestión con proteinasa K (PK). La Figura 10B muestra el análisis por Western Blot de muestra sometidas a digestión con PK. La Figura 11 muestra la detección por ELISA de PrPSc en ratones transgénicos que tienen el gen PrP de venado obtenido de Glenn Telling, University of Kentucky, ver Browning et al., (2004) J. Virol . 78 (23) : 13345-13350 ) . La PrPSc se rebajó usando QWNKPSKPKTN-biotina (SEQ. ID. No.: 14), biotina-KKKAGAAAAGAVVGLGG-CONH2 (SEQ. ID. No.: 136), y GGGKRPKPGG (SEQ. ID. No.: 68) y se detectó por ELISA como se describe anteriormente. Las Figuras 12A-12B muestran la detección de PrPSc en varias muestras de CJD por Western Blot (Figura 12A) y ELISA (Figura 12B) . La Figura 13 muestra la detección de PrPSc en homogenados de cerebro de vCJD usando varios péptidos descritos en la presente como sigue: QWNKPSKPKTN-biotina (SEQ. ID. No.: 14); QWNKPSKPTKTNGGGQWNKPSKPKTN-biotina (SEQ. ID. No.: 51); biotina-QWNKPSKPKTN, en donde P5 está sustituido con N- (3, 5-dimetoxibencil) glicina (SEQ. ID. No.: 117); biotina-QWNKPSKPKTN, en donde P5 está sustituido con N-butilglicina (SEQ. ID. No.: 118); biotina-QWNKPSKPKTN, en donde P8 está sustituido con N- (ciclopropilmetil) glicina (SEQ. ID. No.: 111); biotina-QWNKPSKPKTN, en donde P8 está sustituido con N-butilglicina (SEQ. ID. Nos.: 114); por biotina-QWNKPSKPKTN, en donde P5 está sustituido con N-(ciclopropilmetil) licina y P8 está sustituido con N-butilglicina (SEQ. ID. No.: 131); biotina-QWNKPSKPKTN, en donde P5 está sustituido con N- (isopropil) glicina y P8 está sustituido con N- (ciclopropilmetil) glicina (SEQ. ID. No.: 132); QWNKPSKPKTN2K-biotina (SEQ. ID. Nos.: 113; Figura 6) ; biotina-GGGKKRPKPGG (SEQ. ID. No.: 68); biotina-KKRPKPGG, en donde P6 está sustituido con N- (ciclopropilmetil) -glicina (SEQ. ID. No.: 122); biotina-GGGKKRPKPGGGQWNKPSKPKTN (SEQ. ID. No.: 81); 4-ramificaciónMAPS-GGGKKRPKPGGWNTGGG-biotina (SEQ. ID. No.: 134); 8-ramificaciónMAPS-GGGKKRPKPGGWNTGGG-biotina (SEQ. ID. No.: 135); biotina-KKKAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM (SEQ. ID. No.: 57); biotina-KKKAGAAAAGAVVGGLGG-CONH2 (SEQ. ID. No.: 136); y biotina-GGGKKKKKKKK (SEQ. ID. No.: 85).

D. Resultados En la Tabla 2 y Figuras 8 hasta 14 se resumen los resultados de la Western Blot y los ensayos de unión de ELISA indirecto. En resumen, la digestión con proteinasa K de los homogenados de cerebro no es necesaria a fin de detectar la unión específica de los reactivos de péptidos como se describe en la presente al unirse con PrPs . Como se muestra en la Figura 4, en ningún caso se observó la unión a los homogenados de cerebro tipo silvestre, indicando que los reactivos de péptidos se unieron específicamente a PrPsc. Las Figuras 8, 9A-9B, 10A-10B, 11, 12A-12B, 13 y 14 demuestran la sensibilidad y especificidad a través de diferentes especies. Adicionalmente, el análisis de Western Blot descrita anteriormente detectó PrPSc a una dilución de cuatro logaritmos en tanto que ELISA fue al menos 10X más sensible que la Western Blot. De esta manera, los reactivos de péptidos descritos en la presente permiten un ensayo de alto rendimiento, de una cavidad, simple, que detecta de manera eficiente la presencia de PrPSc de varias especies en una muestra biológica a sensibilidades menores de 100 LD50 y sin la necesidad de digestión con proteinasa K.

Tabla 2 1.: Intensidad de señal relativa visualmente evaluada 2. : Ciclizado 3.: Residuos GGGG adicionados/insertados en posición indicada 4.: Residuos GGG adicionados/insertados en posición indicada 5.: Residuos GG adicionados/insertados en posición indicada 6.: Residuos KKK adicionados/insertados en posición indicada ND = No determinado También se realizó la exploración con alanina para identificar los residuos comprendidos en la unión. Los resultados se muestran en la Tabla 3 Tabla 3 Además, como se muestra en la Tabla 4, la unión a PrPSc por los reactivos de péptidos que tienen SEQ. ID. No.: 14, SEQ. ID. No.: 67 y SEQ. ID. No.: 68 se mejora adicionalmente por sustituciones en los residuos de prolina por un número de glicinas N-sustituidas (peptoides) . Ver, también, Figura 13.

Tabla 4 1 El ligador GGG opcional no estuvo presente en los reactivos de péptidos en los experimentos mostrados en esta tabla. Adicionalmente, la multimerización de los reactivos de péptidos de unión a PrPSc también mejoró la afinidad para PrP?c. En particular, las repeticiones en tándem dieron señales más fuertes (cornos e mide por Western Blot) en las copias individuales. Las formas de MAP pre-derivatizadas en las cuentas incrementaron la unión en ciertos casos hasta dos veces. Sin embargo, las formas de MAP provocaron precipitación en el péptido en solución. Los péptidos linealmente enlazados también se probaron en su capacidad para mejorar la unión sin provocar precipitación.

Experimento 3.- ELISA intercalación y disociación por pH Los agentes caotrópicos tal como sales de guanidinio son efectivos para la disociación de la PrPSc capturada en el paso de rebaja y desnaturalización como se muestra en el Ejemplo 2. Sin embargo, el guanidinio se debe remover o disminuir de manera significativa a fin de exponer la proteína priónica desnaturalizada de los anticuerpos anti-prión (que se usaron, por ejemplo, para la detección de la PrP. Esto no es problemático para ELISA (directo o indirecto) (en el cual la PrP se reviste directamente en la placa de microtítulo en un volumen bastante grande) pero puede ser un problema para ELISA de intercalación. Se ha desarrollado un protocolo alternativo para la desnaturalización de la PrPSc capturada del reactivo de péptido que no usa Gdn y no requiere lavados adicionales o introducción de volúmenes grandes para dilución. Este método usa un tratamiento de pH, a ya sea pH alto o pH bajo, para la desnaturalización de PrPSc. La PrP desnaturalizada se disocia del reactivo de péptido. Las condiciones de desnaturalización se pueden remover fácilmente al neutralizar la solución. Se llevaron a cabo ELISA de intercalación usando dos diferentes anticuerpos anti-prión (uno para "recaptura" y uno para detección) para detectar PrPSc después de la disociación del reactivo de péptido. Estos ensayos se llevaron a cabo usando ya sea GdnSCN 3M o tratamiento con pH a pH alto o bajo para disociar y desnaturalizar la proteína priónica. Los protocolos para estos experimentos se resumen posteriormente. Se mezclaron cuentas magnéticas de estreptavidina (Dynabeads M-280) con reactivo de péptido biotinilado que tiene SEQ. ID. No.: 68 y se lavaron para remover el reactivo de péptido no unido. Las cuentas revertidas con péptido se usaron para reducir 0.025 µl de homogenizado de cerebro al 10 % de vCJD humano mezclados en 100 µl de solución que contiene plasma humano al 70 %. Después del mezclado durante 1 hora a 37°C, las cuentas se lavaron y se trataron con soluciones de diferente pH . Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, las soluciones se pusieron a pH neutral de aproximadamente 7. Los sobrenadantes, que contienen la proteína priónica desasociada y desnaturalizada, se adicionaron a una placa de microtítulo que se ha revestido anteriormente con el anticuerpo anti-prión SAF32, seguido por la incubación de las placas durante 2 horas a 37°C, las placas se lavaron y el anticuerpo 3F4 AP-marcado se adicionó como el anticuerpo de detección. Las placas se incubaron durante aproximadamente 2 horas a 37°C, se lavaron nuevamente, y se adicionó el substrato AP quimioluminiscente (LumiphosPlus) , se incubó durante 30 minutos a 37°C y se leyó A4o5 por Luminoskan Ascent (Thermo Labsytems) . Los resultados se muestran en la Tabla 5. Las condiciones óptimas en este experimento para la disociación por pH y desnaturalización fueron NaOH 0.1 N (pH aproximadamente 13) o ácido fosfórico 0.5 M (pH aproximadamente 1) durante 10 minutos. Se repitieron los ELISA de intercalación descritos anteriormente con muestras que tienen cuatro veces más de BH (es decir, que tienen 100 ni de BH de vCJD o BH normal) mezclado en plasma humano usando tratamiento de pH 13 o pH 1 en comparación a Gdn. Estos resultados se muestran en la Tabla 6 y son similares a los resultados anteriores Tabla 5. Datos de ELISA de intercalación para PrP desnaturalizado por pH y Gdn para rebaja.

Tabla 6: ELISA de intercalación con 100 ni de BH Se llevó a cabo una ELISA de intercalación similar a aquel descrito anteriormente usando un anticuerpo anti-prión diferente como el anticuerpo de captura. Se usó AP-3F4 para la detección como se describe anteriormente. Se usó 6H4 (comercialmente disponible de Prionics AG) para la captura. También se usaron otros dos anticuerpos anti-prión, C2 y C17 como anticuerpos de captura. C2 reconoce un epítopo en la N-terminal de la proteína priónica en la octarepetición . C17 reconoce un epítopo en la región C-terminal entre los residuos 121-231. Solo el tratamiento con pH alto se usó en este experimento y se llevó a cabo durante 60 minutos seguido por neutralización a pH 7 como se describe anteriormente. El tratamiento con GdnSCN 3 M durante 10 minutos se usó para comparación. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Datos de ELISA de intercalación usando 3 diferentes anticuerpos de captura.

Ejemplo 4: Producción de Control Sustituto A. Sustituco Reconoce Reactivo de Péptido Se prepara un control sustituto que reconoce el reactivo de péptido QWNKPSKPKTNMKHMGGG ( SEQ ID NO : 198 con ligador GGG C-terminal ) como sigue . Se prepara una secuencia peptídica de epítopo 6H4 (DWEDRYYRE, SEQ ID NO: 264) con una cisteina terminal (DWEDRYYREC, SEQ ID NO: 265 o CDWEDRYYRE, SEQ ID NO: 266) usando técnicas normales y se conjuga el anticuerpo 3F4 usando un reactivo de reticulación tal como Sulfo-SMCC (4- [N-maleimidometil] -ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidal) . Se realiza la diálisis extensiva para remover el reticulador sin reaccionar y el péptido libre . El control sustituto preparado de esta manera se puede usar en unión con ensayos de detección de prión que utilizan reactivos de péptidos que comprenden la secuencia "MKHM" (SEQ ID NO: 261 ) , por ejemplo, reactivos de péptidos como se representa en o deriva de cualquiera de SEQ ID Nos : 183, 188, 193, 198, 206, 211, 216, 224, 229, 234 , 243 ó 244 .

B . Sust ituto que Reconoce Porción Auxi liar en Reactivo de Péptido Un control sustituto que se une al reactivo de péptido GGGKKRPKPGG ( SEQ I D NO : 14 con el ligador GGG N-terminal ) , donde el reactivo de péptido incluye además biotina , se prepara como sigue . Una secuencia peptídica de epítopo 6H4 ( DWEDRYYRE , SEQ I D NO : 264 ) se prepara con una ci steina terminal ( DWEDRYYREC, SEQ I D NO : 265 ó CDWEDRYYRE , SEQ I D NO : 266 ) usando técnicas normales y se conj uga a estreptalina usando un reactivo de reticulación tal como Sulfo-SMCC ( 4 - [N-maleimidometil ] -ciclohexano-1-carboxilato de s ulf osuccinimidal ) . Se realiza la diálisis extensiva para remover el reticulador sin reaccionar y el péptido libre .

C . Sustituto de Dominio de Dos Péptidos para Ensayo de Intercalación . Un control sustituto bifuncional que reconoce el reactivo 3F4 de unión a prión y el anticuerpo primario 6H4 se preparar como sigue . Un péptido que incluye un epítopo 3F4, un epítopo 6H4 y un ligador se prepara usando técnicas normales de síntesis de péptido en fase sólida . En particular, se sintetiza MKHMGGGGGDWEDRYYRE (SEQ ID NO. 267 ) donde MKHM (SEQ ID NO: 261) es un epítopo reconocido por 3F4, GGGGG (SEQ ID NO: 268 ) es un ligador y DWEDRYYRE (SEQ ID NO: 264 ) es un epitope reconocido por 6H4. Aunque se han descrito en algún detalle modalidades preferidas de la presente invención, se entiende que se pueden hacer variaciones obvias sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención como se define en la presente. Se hace constar que con relación a esta fecha , el mej or método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención , es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Método para detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un primer soporte sólido que comprende un reactivo de péptido derivado de un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 12-260: (b) poner en contacto el primer soporte sólido con una muestra bajo condiciones que permitan que las proteínas priónicas patógenas, cuando están presentes en la muestra, se unan al reactivo de péptido para formar un primer complejo; (c) remover el material de muestra no unido; (d) disasociar las proteínas priónicas patógenas del primer complejo; y (e) detectar los priones patógenos disasociados usando un reactivo de unión a prión. 2. Método para detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un primer soporte sólido que comprende un reactivo de péptido derivado de un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 12-260; (b) poner en contacto el primer soporte sólido con una muestra bajo condiciones que permitan que las proteínas priónicas patógenas, cuando están presentes en la muestra, se unan al reactivo de péptido para formar un primer complejo; (c) remover el material de muestra no unido, (d) disasociar las proteínas priónicas patógenas del primer complejo; (e) separar las proteínas priónicas patógenas disasociadas del primer soporte solíde(f) poner en contacto las proteínas priónicas patógenas disasociadas con un segundo soporte sólido bajo condiciones que permitan que la proteína priónica disasociada se adhiera al segundo soporte sólido; y (g) detectar los priones patógenos adheridos en el segundo soporte sólido usando un reactivo de unión a prión. 3. Método para detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un primer soporte sólido que comprende un reactivo de péptido derivado de un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 12-260; (b) poner en contacto el primer soporte sólido con una muestra bajo condiciones que permitan que las proteínas priónicas patógenas, cuando están presentes en la muestra, se unan al reactivo de péptido para formar un primer complejo; (c) remover el material de muestra no unido, (d) disasociar las proteínas priónicas patógenas de la primera muestra, por lo que la proteína priónica patógena se desnaturaliza; (e) separar las proteínas priónicas patógenas desnaturalizadas disasociadas del primer soporte sólido; (f) poner en contacto las proteínas priónicas patógenas desnaturalizadas disasociadas con un segundo soporte sólido, en donde el segundo soporte sólido comprende un primer anticuerpo anti-prión, bajo condiciones que permitan que la proteína priónica disasociada se una al primer anticuerpo anti-prión; y (g) detectar las proteínas priónicas unidas en el segundo soporte sólido con un segundo anticuerpo anti-prión. . Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque el paso de disociación comprende poner en contacto la proteína priónica patógena unida con una sal o un agente caotrópico. 5. Método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el agente caotrópico comprende tiocionato de guanidio (GdnSCN) o clorhidrato de guanidinio (GdnHCl) . 6. Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la concentración de GdnSCN o de GdnHCl esta entre aproximadamente 3M y aproximadamente 6M. 7. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque el paso de disociación comprende exponer la proteína priónica patógena unida a pH alto o bajo, por lo que se desnaturaliza la proteína prión-patógena disasociada. 8. Método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el pH esta por arriba de 12 o por abajo de 2. 9. Método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el pH esta entre 12.5 y 13.0. 10. Método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la proteína priónica patógena unida se expone a pH alto por la adición de NaOH a una concentración de 0.5 a 0.15 N. 11. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7, 8, 9 ó 10, caracterizado porque el paso de concentración se lleva a cabo durante no más de 15 minutos . 12. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el paso de exposición se lleva a cabo durante no más de 10 minutos. 13. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7, 8, 9 ó 10, caracterizado porque además comprende el paso de neutralizar el pH de la proteína priónica patógena, disasociada, desnaturalizada entre 7.0 y 7.5. 14. Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el pH se neutraliza por la adición de ácido fosfórico o una sal de sodio del mismo. 15. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el primer soporte sólido comprende cuentas magnéticas. 16. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el reactivo de unión a prión es un anticuerpo anti-prión. 17. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el primero o segundo soporte sólido comprende una placa de microtítulo o una cuenta magnética. 18. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el primero o segundo anticuerpo anti-prión se une a la forma desnaturalizada de la proteína priónica. 19. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque uno del primero o segundo anticuerpo anti-prión reconoce un epítopo en la amino-terminal de la proteína priónica. 20. Método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque uno del primero o segundo anticuerpo anti-prión reconoce un epítopo dentro de los residuos 23-90 de la proteína priónica. 21. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo anti-prión se selecciona del grupo que consiste de Fab D18, 3F4, SAF-32, 6H4. 22. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque el reactivo de péptido se deriva de un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de una o más de SEQ ID NOs: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 56, 57, 65, 82 y 84. 23. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el reactivo de péptido se deriva de un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de una o más de SEQ ID NOs: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 127, 134 y 135. 24. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el reactivo de péptido se deriva de un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de una o más de SEQ ID NOs: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 129, 130, 131, 132, 133 ó 128. 25. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el reactivo de péptido se deriva de un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de una o más de SEQ ID NOs: 56, 57, 65, 82, 84 y 136. 26. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el reactivo de péptido se deriva de un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de una o más de SEQ ID NOs: 14, 51, 117, 118, 111, 114, 131, 132, 133, 68, 122, 81, 134, 135, 57, 136 y 85. 27. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el reactivo de péptido comprende SEQ ID NO: 14. 28. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el reactivo de péptido comprende SEQ ID NO: 51. 29. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el reactivo de péptido comprende SEQ ID NO: 68. 30. Control sustituto para el uso en un ensayo de detección de priones, caracterizado porque comprende: un primer dominio sustituto que se une a un reactivo de péptido derivado de un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12-260, y un segundo dominio sustituto que se une a un reactivo de detección usado en el ensayo de priones, en donde el ensayo de detección de priones utiliza un reactivo de péptido y un reactivo de detección para detectar la presencia de una proteína priónica patógena en una muestra. 31. Método para detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto, en un recipiente de prueba, una muestra sospechosa de contener un prión patógeno con un primer reactivo de péptido que interactúa preferentemente con una proteína priónica patógena, bajo condiciones que permiten la unión del primer reactivo de péptido a la proteína priónica patógena, si esta presente, para formar un primer complejo; (b) poner en contacto, en un recipiente de control, el primer reactivo de péptido con el control sustituto de la reivindicación 20, bajo condiciones que permiten la unión del control sustituto al primer reactivo de péptido; (c) detectar la presencia del prión patógeno, si la hay, en la muestra por su unión al primer reactivo de péptido; y (d) confirmar la presencia del prión patógeno detectado al detectar la presencia del control sustituto unido al primer reactivo de péptido .