MX2007008344A

MX2007008344A - Virus de planta designado virus torrado del tomate.

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Publication number: MX2007008344A
Application number: MX2007008344A
Authority: MX
Inventors: Johannes Franciscus Johanna Maria Van De Heuvel; Paulus Cornelis Maris; Marinus Verbeek
Original assignee: De Ruiter Seeds R & D Bv
Priority date: 2005-01-07
Filing date: 2006-01-09
Publication date: 2007-09-06
Also published as: ES2589582T3; KR20070110287A; AU2006213170A1; MA29174B1; BRPI0812428A2; US20080044427A1; IL218289A0; US20120117680A1; AU2008260731A1; IL184473A; WO2006085749A1; IL184473A0; RU2007130086A; US20100146659A1; JP2008526224A; BRPI0606260A2; EP1838847B1; EP1838847A1; US9080142B2; RU2411290C2

Abstract

La invencion se refiere al campo de la virologia. La invencion proporciona un virus de planta aislado (ToTV) llamado virus torrado del tomate (ToTV), y los componentes del mismo. La invencion se refiere ademas a los metodos para producir una planta resistente a ToTV, que comprende los pasos de identificar una planta donadora resistente a ToTV, cruzar dicha planta donadora resistente a ToTV con una planta recipiente, y seleccionar de una planta de progenie, una planta resistente.

Description

VIRUS DE PLANTA DESIGNADO VIRUS TORRADO DEL TOMATE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está en el campo de las enfermedades de las plantas. Más en particular, la invención se refiere a un nuevo virus de planta aislado del tomate, a los métodos para detectar dicho virus, a los métodos para detectar las plantas resistentes y a los métodos para producir plantas resistentes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El tomate Solanum lycopersi cum (antiguamente Lycopersi con esculen tum) es susceptible a un gran número de especies virales. Algunos de los virus del tomate más prominente incluyen el virus del marchitamiento punteado del tomate (TSWV; género Tospovirus) ; virus mosaico del pepino (PepMV; género Potexvirus) , y virus del rizo de la hoja amarilla del tomate (TYLCV; género Begomovirus) . El daño que estas enfermedades infligen a la planta van desde la decoloración de las hojas y lesiones necróticas, hasta pérdida severa de la cosecha y muerte de la planta. La habilidad para proporcionar plantas resistentes es de la mayor importancia para los productores comerciales, y para algunos de los virus económicamente más dañinos, han sido producidas variedades de plantas resistentes. No REF. :184009 obstante, de cuando en cuando, surgen nuevos virus que pueden infligir daño considerable a las cosechas. En 1996 fue reportado un nuevo virus del tomate que habia infectado plantas de tomate en los Estados Unidos y en Italia desde 1993, y fue nombrado virus de la clorosis infecciosa del tomate (TICV; género Crinivirus ; Duffus et al., 1996) . Otro virus nuevo del tomate del mismo género fue reportado en 1998. Este virus mostró que habia infectado plantas de tomate en los Estados Unidos desde 1989 y fue nombrado virus de la clorosis del tomate (ToCV; isler et al., 1998). Estos dos nuevos virus probaron ser difundidos por una mosca blanca, el insecto que es un vector de transmisión de enfermedades muy efectivo. Se cree en general que la distribución geográfica de los virus conocidos se incrementará, y que nuevos virus continuarán apareciendo, parcialmente como resultado de la recombinación de diferentes virus para formar nuevas cepas y nuevos virus. El desarrollo de cultivos resistentes puede jugar un papel importante en el manejo exitoso de estas enfermedades.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Recientemente, fue descubierto un nuevo virus sobre las plantas del tomate en España, el cual provocaba síntomas que no pudieron ser atribuidos a ningún virus conocido. Las plantas mostraron lesiones necróticas sobre las hojas y anillos cafés sobre las frutas, y mostraron crecimiento reducido. Las pruebas serológicas (ELISA) indicaron la presencia del virus mosaico del pepino (PepMV). Investigaciones de microscopía electrónica revelaron más bien partículas en forma de varilla típicas de los potexvirus. No obstante, también fueron encontradas partículas virales de forma esférica en el tejido infectado de la hoja. Los inventores fueron capaces de separar el nuevo virus del complejo con PepMV. El nuevo virus fue tentativamente nombrado virus torrado del tomate (ToTV) . Para ser capaces de rastrear su origen, de monitorizar su epidemiología y prevenir la posible dispersión de la enfermedad, es de mayor importancia ser capaces de reconocer la enfermedad en una etapa temprana. Únicamente entonces pueden ser tomadas medidas suficientes para aislar las plantas e iniciar precauciones fitosanitarias . En este momento no están disponibles herramientas de diagnóstico. En consecuencia, existe una necesidad para desarrollar herramientas de diagnóstico para esta enfermedad. Además, a la fecha no existen plantas conocidas que alberguen resistencia especifica a este nuevo virus, mientras que exista una necesidad para desarrollar tales plantas resistentes . La invención proporciona en un primer aspecto un virus de planta tentativamente nombrado virus torrado del tomate (ToTV) , depositado con la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) en Braunschweig, Alemania, el 24 Noviembre de 2004 bajo el número de referencia de los depositantes ToTV-EOl (DSM 16999) . El virus provoca síntomas de enfermedad en plantas de tomate asi como en otras plantas, y puede provocar los síntomas por si mismo o en un complejo con otros virus o enfermedades . Los primeros síntomas sistémicos consisten de manchas necróticas en la parte superior de la planta, comenzando en las base de las hojas de una hojuela. Las manchas necróticas se expanden y son rodeadas por un área verde claro o amarilla (ver Figura 1) . No todas las hojas infectadas sistémicas muestran síntomas, no obstante, el virus puede ser detectado en estas hojas, por ejemplo, mediante electroscopia electrónica. Las frutas infectadas con ToTV muestran anillos necróticos. El desarrollo de las plantas infectadas puede ser reducido en comparación a las plantas no infectadas. La descripción anterior se refiere a las plantas recién infectadas con el virus aislado, y necesariamente no reflejan los síntomas exactos encontrados en el campo. Factores tales como la raza o variedad de la planta, la etapa de desarrollo, la presión adicional de la enfermedad, y factores abióticos (por ejemplo, la temperatura y humedad relativa) eventualmente determinarán la expresión y características de los síntomas. Las partículas virales son de forma esférica (icosahédricas) con un diámetro de aproximadamente 28 nm (ver Figura 2) . Las partículas virales consisten de al menos tres proteínas de cápside de aproximadamente 23, 26 y 35 kDa (ver Figura 3) . Después de la purificación, el virus muestra al menos dos bandas visibles en un gradiente de sulfato de cesio. La banda visible superior (fracción superior del virus) contiene una molécula de ARN (ácido ribonucleico) de aproximadamente 5.5 kb (más preferentemente 5.2 kb) y la banda visible inferior (fracción inferior) contiene una molécula de ARN de aproximadamente 8 kb (más precisamente 7.7 kb) (ver Figura 4) . La inoculación de ambas bandas combinadas sobre las plantas del tabaco da como resultado una infección. ToTV es mecánicamente transmisible a varias especies de Ni cotiana . Un amortiguador de inoculación estándar (por ejemplo, un amortiguador de fosfato 0.03 M a pH 7.7) es adecuado. Para la propagación a ToTV, se prefieren N. glutinosa , N. taba cum y N. ben thamina . La especie de tabaco N. hesperis "67A" y N. occiden tales "Pl" son muy sensibles a ToTV y muestran síntomas sistémicos después de 3-4 dias. Estas especies de tabaco se vuelven muy necróticas en corto tiempo y son por lo tanto adecuadas para el uso de planta indicadora que como hospedero de propagación. N. gl utinosa reacciona con lesiones locales cloróticas y una clorosis sistémica y deformación leve de las hojas. N. ben thamiana no muestra síntomas locales y reacciona con clorosis sistémica y deformación de las hojas. La invención proporciona además un virus que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID ?o.: 1 y la SEQ ID ?o.: 2 y secuencias que tienen una homología de secuencia de nucleótidos de al menos 30, preferentemente al menos 40, preferentemente al menos 50%, preferentemente al menos 60%, más preferentemente al menos 70%, más preferentemente al menos 80%, todavía más preferentemente al menos 90%, todavía más preferentemente al menos 95%, todavía más preferentemente al menos 98%, y lo más preferentemente al menos 99% a ésta. Tales virus son también abarcados por el término ToTV como se utiliza en la presente. En una modalidad preferida de un virus de la invención que tiene la homología de secuencia anteriormente referida, el virus está asociado con las enfermedades del tomate conocidas bajo los nombres "Torrado", "Marchitez" y/o "enfermedad de la mancha del chocolate", y/o el virus muestra, con base en el análisis taxonómico numérico de los descriptores taxonómicos esencialmente como se definen en la tabla 1, que está más estrechamente relacionado al virus como se define en la reivindicación 1 que cualquier otro aislado viral disponible en colecciones públicas, y dicho virus tiene una característica esencial de que está asociado con una enfermedad que provoca lesiones necróticas en el tomate. En otro aspecto más, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 2, secuencias que tienen una homología de secuencia de nucleótido de al menos 50%, preferentemente al menos 70%, más preferentemente al menos 80%, todavía más preferentemente al menos 90%, todavía más preferentemente al menos 95%, todavía más preferentemente al menos 98%, y lo más preferentemente al menos 99% a la SEQ ID No: 1 o a la SEQ ID No: 2, y sus hebras complementarias a fragmentos específicos de ToTV de las mismas. Tal ácido nucleico puede ser obtenido a partir de un virus de acuerdo a la invención. En otro aspecto más, la invención proporciona un polinucleótido capaz de hibridarse bajo condiciones estrictas o severas al ácido nucleico aislado recombinante de la invención como se describe anteriormente. En otro aspecto más, la presente invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante obtenible a partir de un virus de acuerdo a la invención, a un fragmento especifico de ToTV del mismo. En una modalidad preferida el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de las proteínas de cápside 23, 26 y 35 kDa de ToTV y fragmentos específicos de ToTV de las mismas. En otro aspecto más, la invención proporciona un antigeno que comprende un polipéptido o Fragmento especifico de ToTV del mismo de acuerdo a la invención. En otro aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo específicamente dirigido contra un antigeno de acuerdo a la invención. En otro aspecto más, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo contra ToTV que comprende los pasos de: a) proporcionar un virus ToTV, o una (recombinante) proteina o fragmento peptidico de la misma; b) la inmunización de un hospedero vertebrado apropiado con el virus, la proteina o el fragmento peptidico, y c) cosechar de la sangre (incluyendo el suero) o los esplenocitos del hospedero vertebrado, los anticuerpos contra el virus, la proteina o el fragmento peptidico. En una modalidad preferida, el método comprende además los pasos de d) seleccionar un esplenocito productor de anticuerpo, e) fusionar dicho esplenocito a una linea celular de hibridoma inmortalizada y f) permitir que la fusión de hibridomas produzca anticuerpos monoclonales. En otro aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo obtenible mediante un método para producir un anticuerpo contra ToTV de acuerdo a la invención. En otro aspecto más, la invención proporciona un método para identificar un aislado viral como un virus ToTV, que comprende hacer reaccionar el aislado viral o un componente del mismo con un anticuerpo de acuerdo a la invención . En otro aspecto más, la invención proporciona un método para identificar un aislado viral como un virus ToTV que comprende hacer reaccionar el aislado viral o un componente del mismo con un polinucleótido de acuerdo a la invención. En otro aspecto más, la invención proporciona un método para detectar la presencia de ToTV en una muestra, que comprende determinar en la muestra, la presencia de un virus ToTV o un componente del mismo, al hacer reaccionar dicha muestra con un polinucleótido o un anticuerpo de acuerdo a la invención . En otro aspecto más, la invención proporciona un método para identificar una planta resistente a ToTV que comprende los pasos de: a) exponer una planta o parte de la planta a una dosis infecciosa de ToTV, y b) identificar la planta como una planta resistente a ToTV cuando, después de la exposición, ya sea i) los síntomas de la enfermedad en la planta o parte de la planta permanecen ausentes o son retrasados en la expresión o son al menos reducidos en severidad con relación a una planta control susceptible, y/o ii) el virus ToTV o las secuencias genómicas de ToTV no están presentes en la planta o la parte de la planta o la presencia de virus ToTV es al menos cuantitativamente reducida en la planta con relación a una planta control susceptible. El paso a) incluye un periodo de incubación por una duración suficientemente larga para permitir el establecimiento de síntomas detectables de la enfermedad en plantas control susceptibles expuestas a una dosis infecciosa comparable del virus. Mediante la realización de este método todas las formas de resistencia, incluyendo la resistencia completa, la resistencia parcial, hipersensibilidad y tolerancia pueden ser identificadas en una planta. Con el fin de confirmar la tolerancia, la presencia (sistémica) del virus en la planta (células) debe ser confirmada. El paso b) puede involucrar la realización de un método para detectar la presencia de ToTV en una muestra de la planta o parte de la planta, de acuerdo a la presente invención, en donde se hace uso de un anticuerpo o polinucleótido de acuerdo a la invención en método estándares para ensayos de hibridación de nucleótidos o inmunoensayos, bien conocidos para las personas expertas en la técnicas. Alternativamente, el paso b) puede comprender la puesta en contacto de una parte de la planta expuesta, con una planta indicadora susceptible. De esta manera, se puede detectar la presencia de una infección sistémica local en la planta expuesta, a través de una observación de la emergencia de la enfermedad en la planta indicadora, o incluso una planta indicadora contactada posteriormente, puesta en contacto con la primera planta indicadora contactada. En otro aspecto más, la invención proporciona un método para producir una planta resistente a ToTV, que comprende los pasos de identificar una planta donadora resistente a ToTV mediante la realización de cualquiera de los métodos anteriores para identificar una planta resistente a ToTV de acuerdo a la invención, el cruce de la planta donadora resistente a ToTV con una planta recipiente (cuya planta recipiente puede ser ya susceptible a ToTV o resistente a ToTV, pero es adecuadamente una planta resistente a ToTV en el caso en que el fenotipo resistente sea originado por un gen recesivo) , y la selección a partir de una planta de progenie (por ejemplo, una Fi, una F2, y una planta autopolinizada) una planta resistente mediante la realización de un método para identificar la resistencia a ToTV en una planta como se describe anteriormente. En el caso en que el rasgo de resistencia sea un rasgo recesivo, las plantas resistentes pueden ser encontradas entre las plantas de progenie de las autopolinizaciones de las generaciones Fl o F2 o generaciones posteriores. En modalidades preferidas de este aspecto, la planta donadora resistente a ToTV y la planta recipiente son plantas de la familia Solana ceae o familia Cucurbi ta ceae . En otras modalidades preferidas de este aspecto, la planta recipiente es una planta de tomate, por ejemplo, berenjena, planta de pimiento, planta de melón, planta de sandia o planta de pepino, más preferentemente, una planta de la especie Solanum lycopersicum, más preferentemente una linea de S. lycopersi cum que posee características comercialmente deseables . En otro aspecto más, la invención proporciona una planta resistente a ToTV, preferentemente una planta de tomate, una planta de berenjena, planta de pimiento, planta de melón, planta de sandia o planta de pepino, o una parte de las mismas, tal como una semilla, obtenible mediante un método de producción de una planta resistente a ToTV de acuerdo a la invención. En otro aspecto más, la invención proporciona un kit de diagnóstico para detectar la presencia de ToTV en una muestra, o para identificar la resistencia a ToTV en una planta que comprende un virus, un polinucleótido, un polipéptido, un antigeno y/o un anticuerpo de acuerdo a la invención. En otro aspecto más, la invención proporciona el uso de un virus, un polinucleótido, un polipéptido, un antigeno o un anticuerpo de acuerdo a la invención, para la producción de una composición de diagnóstico. En otro aspecto más, la invención proporciona una composición de diagnóstico que comprende un virus, un polinucleótido, un polipéptido, un antigeno o un anticuerpo de acuerdo a la invención. En otro aspecto más, la invención proporciona el uso de ToTV, o partes del genoma viral de ToTV, como un vector de expresión. En otro aspecto más, la invención proporciona el uso de ToTV, o partes del genoma viral de ToTV, para producir resistencia en plantas, derivada de patógenos. En otro aspecto más, la invención se refiere al uso de una forma atenuada de un virus ToTV, o su genoma, o parte del mismo, para la premunición de una planta.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Como se utiliza en la presente, el término "parte de planta" indica una parte de una planta, incluyendo las células simples o tejidos celulares tales como células vegetales que están intactas en las plantas, grupos de células y cultivos de tejidos entre los cuales pueden ser regeneradas las plantas. Los ejemplos de partes de plantas incluyen, pero no están limitados a, células simples y tejidos provenientes de polen, óvulos, hojas, embriones, raices, puntas de raiz, anteras, flores, frutos, brotes de los tallos y semillas; asi como polen, óvulos, hojas, embriones, raices, puntas de raiz, anteras, flores, frutos, tallos, brotes, retoños, reservas de raiz, semillas, protoplastos, callos y similares. El término "muestra" incluye una muestra proveniente de una planta, de una parte de planta o de un vector de expresión, o una muestra de suelo, de agua, o de aire . El término "vector de transmisión" como se utiliza en la presente, se refiere al agente o sustancia que difunde la enfermedad. Los vectores de transmisión del ToTV en el campo pueden comprender, pero no están limitados a animales tales como artrópodos (en particular a aquellos de las clases Insecta y Ara chnida ) , Nemátodos (en particular aquellos de la clase adenoforeas) , pero también animales superiores tales como por ejemplo, aves, conejos y ratones, hongos (por ejemplo, phylum Eumycota , en particular hongos de la clases Phycomycota ) , plantas (parasitarias) (incluyendo miembros de la familia Cuscu ta ceae) , polen, semillas, agua, partículas de suero, incluso manos humanas, kit y zapatos. El término planta de "progenie" se refiere a cualquier planta resultante como progenie de una reproducción vegetativa o sexual de una o más plantas progenituras o descendientes de las mismas. Por ejemplo, una planta de progenie puede ser obtenida mediante la clonación o autopolinización de una planta progenitora o mediante el cruce de dos plantas progenitoras e incluyen las autopolinizaciones asi como las generaciones Fl o F2 o generaciones posteriores. Una generación Fl es una progenie de primera generación producida a partir de los progenitores al menos uno de los cuales es utilizado por primera vez como donador de un rasgo, mientras que la progenie de la segunda generación ( F2 ) o generaciones subsiguientes (F3, F4 , etc.) son especímenes producidos a partir de las autopolinizaciones de Fl's, F2's, etc. Un Fl puede ser de este modo (y usualmente es) un híbrido que resulta de una cruza entre dos progenitores de crianza verdaderos (la crianza o producción verdadera es homocigota para un rasgo) , mientras que un F2 puede ser (y usualmente es) una progenie que resulta de la autopolinización de dichos híbridos Fl . El término "resistente", como se utiliza en la presente, se refiere a una planta que es capaz de resistir la multiplicación en sus células y/o el movimiento (sistémico) del virus hacia otras células y/o el desarrollo de los síntomas de la enfermedad después de la infección con el virus, cuyo virus es capaz de infectar y multiplicarse en variedades correspondientes no resistentes o susceptible de dicha planta. El término es utilizado para incluir formas separadamente identificables de resistencia tales como "resistencia completa", "inmunidad", "resistencia parcial ", "hipersensibilidad" y "tolerancia". "Resistencia completa" se refiere a una falla completa del virus para desarrollarse después de la infección, y puede ser ya sea el resultado de la falla del virus para entrar a la célula (sin infección inicial) o puede ser el resultado de la falla del virus para multiplicarse en la célula e infectar células subsiguientes (sin infección subliminal, ni difusión) . La presencia de resistencia completa puede ser determinada por el establecimiento de la ausencia de partículas virales o ARN viral en las células de la planta, asi como la ausencia de cualesquiera síntomas de la enfermedad en dicha planta, después de exposición de la planta a una dosis infecciosa del virus (por ejemplo, después de la "infección") . Entre los productores, este fenotipo es a menudo denominado como "inmune". "Inmunidad" como se utiliza en la presente se refiere de este modo a una forma de resistencia caracterizada por ausencia de replicación viral incluso cuando el virus es activamente transferido hacia las células mediante, por ejemplo, electroporación. Una "dosis infecciosa" es definida como una dosis de partículas virales o ácido nucleico capaz de infectar una planta, cuya dosis puede variar entre las plantas y entre los aislados de ToTV probados. Teóricamente, una cantidad de aproximadamente 1 a 10 hasta una cantidad de aproximadamente 500-5000 partículas virales del virus o de los ácidos nucleicos del mismo será suficiente. La infección de esta manera puede ser lograda mediante inoculación mecánica de las partículas virales purificadas o el ácido nucleico viral sobre las plantas. "Resistencia parcial" es denominada como la multiplicación reducida del virus en la célula, como el movimiento reducido (sistémico) del virus, y/o como el desarrollo reducido de los síntomas después de la infección. La presencia de resistencia parcial puede ser determinada mediante el establecimiento de la presencia sistémica de bajo titulo de las partículas virales o el ARN viral en la planta y la presencia de síntomas de la enfermedad disminuidos o retardados en la planta, después de la exposición de la planta a una dosis infecciosa del virus. Los títulos virales pueden ser determinados mediante el uso de un método de detección cuantitativo (por ejemplo, como un método de ELISA o una reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa, cuantitativa [RT-PCR], por sus siglas en inglés). Entre los productores, este fenotipo es a menudo denominado como "resistente intermedio". El término "hipersensible" se refiere a una forma de resistencia mediante la cual la infección permanece local y no se difunde sistémicamente, por ejemplo, debido a la necrosis local del tejido infectado, o la falta de movimiento sistémico más allá del tejido inoculado. Las plantas hipersensibles muestran síntomas de la enfermedad locales, pero severos, y la presencia local del virus puede ser establecida en tales plantas. "Tolerante" se utiliza en la presente para indicar un fenotipo de una planta en donde los síntomas de la enfermedad permanecen ausentes después de la exposición de la planta a una dosis infecciosa del virus, mediante la cual la presencia de la infección viral sistémica o local, la multiplicación del virus, al menos la presencia de las secuencias genómicas virales en las células de la planta y/o la integración genómica de las mismas, puede ser establecida. Las plantas tolerantes son por lo tanto resistentes para la expresión sintomática, pero son portadores asintomáticos del virus. Algunas veces, las secuencias virales pueden estar presentes o incluso multiplicarse en plantas sin provocar síntomas de la enfermedad. Este fenómeno es también conocido como "infección latente". Algunos virus de ADN y ARN, pueden volverse no detectables después de una infección primaria únicamente para reaparecer posteriormente y producir enfermedad aguda. En infecciones latentes, el virus puede existir en una forma oculta, no infecciosa, verdaderamente latente, posible como un genoma integrado o un agente episódico (de modo que las partículas virales no pueden ser encontradas en el citoplasma, mientras que los protocolos de PCT pueden indicar la presencia de secuencias de ADN viral) o como un agente infeccioso o que se replica continuamente. Un virus reactivado puede difundirse e iniciar una epidemia entre contactos susceptibles. La presencia de una "infección latente" es indistinguible de la presencia de un fenotipo "tolerante" en una planta. El término "susceptible" es utilizado en la presente para referirse a una planta que no tiene resistencia al virus, dando como resultado la entrada del virus a las células de la planta y la multiplicación y dispersión sistémica del virus, dando como resultado síntomas de la enfermedad. El término "susceptible" es por lo tanto equivalente a "no resistente". Una planta susceptible muestra títulos virales normales en sus células después de la infección. La susceptibilidad puede ser de este modo determinada por el establecimiento de la presencia de títulos normales (por ejemplo, con relación a otras infecciones virales en plantas) de las partículas virales o del ARN viral en células de la planta, y la presencia de síntomas normales de la enfermedad (por ejemplo, con relación a los síntomas de la enfermedad como se describe en la presente para la planta de la cual fue primeramente aislado el ToTV) en la planta después de la exposición de la planta a una dosis infecciosa del virus. El término "sensible" refleja la reacción sintomática de una planta susceptible después de la infección del virus. La reacción o los síntomas pueden ser más o menos severas dependiendo del nivel de sensibilidad de la planta. Si la planta es dañada o incluso muerta por el virus, la planta es calificada como "sensible". Las plantas artificialmente inoculadas con cepas virales atenuadas son subsecuentemente protegidas de los virus virulentos estrechamente relacionados. Como virus protectores, las cepas leves de origen natural o una cepa atenuada (un mutante leve artificialmente inducido) pueden ser utilizadas. Preferentemente, con el fin de lograr la premunición de una planta contra ToTV, puede ser utilizada una cepa atenuada de ToTV que sea asintomática o que muestre al menos expresión reducida de los síntomas en una planta infectada, con relación a una cepa virulenta de ToTV. Los métodos de producción de virus atenuados pueden incluir por ejemplo la mutagénesis aleatoria del genoma de ToTV y la selección de cepas con atenuación sintomática. Se hace referencia expresa a los métodos para producir virus de plantas atenuados como se describe en los articulo de Takeshita et al, 2001; Lu et al, 2001; Hagiwara, et al, 2002; e Hirata et al, 2003. Como se utiliza en la presente, el término "tomate" significa cualquier planta, linea o población de Lycopers i cón o So l a r i um que incluye, pero no está limitada a, aquellas presentadas en la lista siguiente. Recientemente, ha sido cambiada la nomenclatura del Lycopers i con . La nueva nomenclatura para Lycopers i con es proporcionada en el siguiente listado (de: Peralta, Knapp y Spooner, monografía no publicada (ver: http://www.sgn.cornell.edu "Guide to revised Sol a n um nomenclat ur e " ) ) .

Un "vector de expresión" es definido como una molécula de ácido nucleico que contiene un gen, usualmente un gen heterólogo, que es expresado en una célula hospedera. Típicamente, este gen comprende una secuencia de codificación de la proteina. La expresión del gen es siempre colocada bajo el control de un promotor, y se dice que tal gen es "operablemente enlazado al" promotor. El término "heterólogo" se refiere a una molécula de ADN (ácido desoxirribonucleico) o una población de moléculas de ADN que no existen, de manera natural dentro de una célula hospedera dada . El término "polinucleótido" como se utiliza en la presente, es intercambiable con el término, "ácido nucleico" y se refiere a un multimero de nucleótidos o forma polimérica de nucleótidos que tienen cualquier número de nucleótidos, por ejemplo, desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o compuestos producidos sintéticamente (por ejemplo, PNA como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,948,902 y las referencias citadas en ésta) y puede ser ya sea de doble hebra o de una sola hebra. Un polinucleótido puede hibridarse con los polinucleótidos de origen natural en una manera especifica de secuencia, análoga a aquella de dos polinucleótidos de origen natural, por ejemplo, puede participar en las interacciones de apareamiento de pares de Watson-Crick. El término también incluye las formas modificadas, por ejemplo, mediante metilación y/o mediante encasquetamiento, y las formas no modificadas del polinucleótido . Los términos "ácido ribonucleico" y "ARN" como se utilizan en la presente, significan un polímero compuesto de ribonucleótidos. Los términos "ácido desoxirribonucleico" y "ADN" como se utilizan en la presente, significan un polímero compuesto de desoxirribonucleótidos.

El término "oligonucleótido" se refiere a una secuencia corta de monómeros de nucleótidos (usualmente de 6 a 100 nucleótidos) unidos por enlaces de fósforo (por ejemplo, fosfodiéster, alquil- y aril-fosfato, fosforotioato), o enlaces no de fósforo (por ejemplo, peptidicos, sulfamato y otros). Un oligonucleótido puede contener nucleótidos modificados que tienen bases modificadas (por ejemplo, 5-metil-citosina) y grupos azúcar modificados (por ejemplo, 2 ' -0-metil-ribosilo, 2 ' -O-metoxietil-ribosilo, 2 ' -fluoro-ribosilo, 2 ' -amino-ribosilo, y similares). Los oligonucléotidos pueden ser moléculas de origen natural o sintéticas de ADN de doble hebra, o de una sola hebra, y ARN de doble hebra y de una sola hebra, con formas circulares, ramificadas o lineales, y que incluyen opcionalmente dominios capaces de formar estructuras secundarias (por ejemplo, tallo-bucle, pseudo nudo y estructuras de bucle que se besan) . El término "homología de secuencia de nucleótidos" como se utiliza en la presente, denota la presencia de homología entre dos polinucleótidos. Los polinucleótidos tienen secuencias "homologas" si la secuencia de nucleótidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinea con correspondencia máxima. La comparación de secuencia entre dos o más polinucleótidos es generalmente realizada mediante la comparación de las porciones de las dos secuencias sobre una ventana de comparación, para identificar y comparar las regiones locales de similitud secuencial. La ventana de comparación es en general de aproximadamente 20 a 200 nucleótidos contiguos. El "porcentaje de homología de secuencias" para los polinucleótidos, tales como 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 ó 100 por ciento de homología secuencial pueden ser determinados por la comparación de dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia polinucleotidica en la ventana de comparación puede incluir adiciones o supresiones (por ejemplo, espacios vacios) en comparación a la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje es calculado mediante: (a) la determinación del número de posiciones en las cuales aparecen bases de ácidos nucleicos idénticas en ambas secuencias, para producir el número de posiciones acopladas o con concordancia; (b) la división del número de las posiciones con concordancia entre el número total de posiciones en la ventana de comparación; y (c) la multiplicación del resultado por 100 para producir el porcentaje de homología secuencial. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede ser conducida mediante implementaciones computarizadas de algoritmos conocidos, o mediante inspección visual. La comparación de secuencia fácilmente disponible y los algoritmos de alineación de secuencias múltiples son, respectivamente, la herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST, por sus siglas en inglés) (Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997) y los programas ClustalW, ambos disponibles en la Internet. Otros programas adecuados, incluyen, pero no están limitados a, GAP, BestFit, PlotSimilarity, y FASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI, USA) (Devereux et al., 1984). Como se utiliza en la presente "sustancialmente complementario (a) " significa que dos secuencias de ácido nucleico tienen al menos aproximadamente 65%, preferentemente aproximadamente 70%, más preferentemente aproximadamente 80%, aún más preferentemente 90%, y lo más preferentemente aproximadamente 98%, de complementariedad de secuencia una con la otra. Esto significa que los cebadores y las sondas deben mostrar suficiente complementariedad a su ácido nucleico plantilla diana u objetivo, respectivamente, para hibridarse bajo condiciones severas o exigentes. Por lo tanto, las secuencias del cebador y la sonda no necesitan reflejar la secuencia complementaria exacta de la región de enlace sobre la plantilla y los cebadores degenerados pueden ser utilizados. Por ejemplo, un fragmento nucleotidico no complementario puede ser acoplado al extremo 5' del cebador, con el resto de la secuencia del cebador que es complementaria a la hebra. Alternativamente, las bases no complementarias o las secuencias más largas pueden ser intercaladas dentro del cebador, con la condición de que el cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de una de las hebras que van a ser amplificadas para hibridarse con ésta, y formar por ende una estructura dúplex que puede ser extendida por medios de polimerización. Las secuencias nucleotidicas no complementarias de los cebadores pueden incluir sitios de enzimas de restricción. La anexión de un sitio de enzima de restricción al o a los extremos de la secuencia objetivo podria ser particularmente de auxilio para la clonación de la secuencia objetivo. Una secuencia cebadora sustancialmente complementaria es una que tiene suficiente complementariedad de secuencia a la plantilla de amplificación, para dar como resultado el enlace del cebador y la sintesis de la segunda hebra. La persona experta en la técnica está familiarizada con los requerimientos de los cebadores para tener suficiente complementariedad de secuencia a la plantilla de amplificación. El término "híbrido" en el contexto de los ácidos nucleicos se refiere a una molécula de ácido nucleico de doble hebra o dúplex, formada mediante puentes de hidrógeno entre las bases nucleotidicas complementarias. Los términos "hibridarse" o "recocer o recocerse" se refieren al proceso mediante el cual las hebras simples de las secuencias de ácido nucleico forman segmentos de doble hélice a través de puentes de hidrógeno entre las bases complementarias. El término "híbrido" en el contexto de la producción de plantas se refiere a una planta que es la progenie de progenitores genéticamente no similares, producidos mediante cruce de plantas de diferentes lineas o razas o especies. El término "sonda" se refiere a una secuencia oligonucleotidica de una sola hebra que reconocerá y formará un dúplex enlazado por hidrógeno con una secuencia complementaria en un analito de secuencia de ácido nucleico objetivo o su derivado de cADN . El término "cebador" como se utiliza en la presente, se refiere a un oligonucleótido que es capaz de recocerse al objetivo de amplificación, permitiendo que se adhiera una ADN-polimerasa, para servir con esto como un punto de inicio de la sintesis del ADN cuando se coloca bajo condiciones en las cuales es inducida la sintesis del producto de extensión del cebador, por ejemplo, en presencia de nucleótidos y un agente para la polimerización tal como la ADN-polimerasa, y a una temperatura y pH adecuados. El cebador (de amplificación) es preferentemente de una sola hebra, para eficiencia máxima en amplificación. Preferentemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la sintesis de los productos de extensión en presencia del agente para la polimerización. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo la temperatura y la composición (contenido de (A/T y G/C) del cebador. Un par de cebadores bidireccionales, consiste de un cebador delantero y un cebador inverso como son comúnmente utilizados en la técnica de la amplificación de ADN tal como la amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) . Se entenderá que el "cebador" como se utiliza en la presente, puede referirse a más de un cebador, particularmente, en el caso donde exista cierta ambigüedad en la información respecto a la o las secuencias terminales de la región objetivo que va a ser amplificada. Por lo tanto, un "cebador" incluye una colección de oligonucleótidos cebadores que contienen secuencias que representan las posibles variaciones en la secuencia, o incluyen nucleótidos que permiten un apareamiento de bases típico. Los cebadores oligonucleotidicos pueden ser preparados mediante cualquier método adecuado. Los métodos para preparar los oligonucleótidos de secuencia especifica son conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, la clonación y restricción de secuencias apropiadas, y la sintesis química directa. Los métodos de sintesis química pueden incluir, por ejemplo, el método de fosfo-di- o tri-éster, el método de dietilfosforamidato y el método de soporte sólido descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 4,458,066. Los cebadores pueden ser marcados, si se desea, mediante la incorporación de medios detectables por ejemplo, medios espectroscópicos, de fluorescencia, fotoquimicos, bioquímicos, inmunoquimicos o químicos. La extensión dependiente de la plantilla del o de los cebadores oligonucleotidicos es catalizada por un agente de polimerización en presencia de cantidades adecuadas de cuatro trifosfatos de desoxirribonucleótido (dATP, dGTP, dCTP y dTTP, por ejemplo dNTPs) o análogos, en un medio de reacción que está comprendido de sales apropiadas, cationes metálicos y el sistema amortiguador de pH. Los agentes de polimerización adecuados son enzimas que se saben catalizan la sintesis de AND dependientes del cebador y de la plantilla. Las polimerasas de ADN conocidas incluyen, por ejemplo, una ADN-polimerasa I de E . coli o su fragmento de Klenow, la ADN-polimerasa T4 y la ADN-polimerasa Taq. Las condiciones de reacción para catalizar la sintesis del ADN con estas ADN-polimerasas, son conocidas en la técnica. Los productos de la sintesis son moléculas dobles o dúplex que consisten de las hebras de plantilla y las hebras de extensión del cebador, que incluyen la secuencia objetivo. Estos productos, a su vez, sirven como plantillas para otra ronda de replicación. En la segunda ronda de replicación, la hebra de extensión del cebador del primer ciclo es recocida con su cebador complementario; la síntesis produce un producto "corto" que es enlazado sobre los extremos 5' y 3' por las secuencias cebadoras o sus complementos. Los ciclos repetidos de desnaturalización, recocido con cebador, y extensión dan como resultado la acumulación exponencial de la región objetivo definida por los cebadores. Son corridos suficientes ciclos para lograr la cantidad deseada del polinucleótido que contiene la región objetivo del ácido nucleico. La cantidad deseada puede variar, y es determinada por la función que va a servir el polinucleótido producido. El método de PCR es bien descrito en los manuales y conocido por la persona experta. Después de la amplificación por PCR, los polinucleótidos objetivo pueden ser detectados mediante hibridación con un polinucleótido de sonda que forma un híbrido estable con aquel de la secuencia objetivo bajo condiciones de hibridación y lavado severas a moderadamente severas. Se espera que las sondas sean esencialmente complementarias (por ejemplo, aproximadamente 99% o más) a la secuencia diana u objetivo) serán utilizadas condiciones severas o estrictas. Si se espera cierta no concordancia o no acoplamiento, por ejemplo, si esperan cepas variantes con el resultado de que la sonda no será completamente complementaria, la severidad de la hibridación puede ser disminuida. Por ejemplo, son elegidas las condiciones que descargan el enlace no especifico/adventicio. Las condiciones que afectan la hibridación, y que seleccionan contra el enlace no especifico son conocidas en la técnica, y son descritas por ejemplo, en Sambrook et al., (2001). En general, la menor concentración de sal y una temperatura más alta incrementan la severidad del enlace. Por ejemplo, se considera usualmente que las condiciones severas son incubaciones en soluciones que contienen aproximadamente 0.1 x SSC, 0.1% de SDS, a una temperatura de incubación/lavado de 65°C, y las condiciones moderadamente severas o estrictas son las incubaciones en soluciones que contienen aproximadamente 1-2 x SSC, 0.1% de SDS y temperatura de incubación/lavado de aproximadamente 50°-65°C. Las condiciones de baja severidad son 2 x SSC y aproximadamente 30°-50°C. Los términos "severidad" o "exigencia" o "condiciones de hibridación severas o exigentes" se refieren a las condiciones de hibridación que afectan la estabilidad de los híbridos, por ejemplo, la temperatura, la concentración de sal, el pH, la concentración de formamida, y similares. Estas condiciones son empíricamente optimizadas para elevar al máximo el enlace especifico y reducir al mínimo el enlace no especifico, del cebador o la sonda a la secuencia de ácido nucleico objetivo. Los términos, como son utilizados aqui, incluyen la referencia a las condiciones bajo las cuales una sonda o cebador se hibridará a su secuencia objetivo. A un grado detectablemente mayor que otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el antecedente). Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. En general, las condiciones severas son seleccionadas para ser de aproximadamente 5°C menor que la temperatura del punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia especifica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tra es la temperatura (bajo la fuerza iónica y pH definidos) a la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria se hibrida a una sonda o cebador de concordancia perfecta. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal sea menor de aproximadamente 1.0 M del ion Na+, típicamente aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración del Na+ (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es al menos de aproximadamente 30 °C para sondas o cebadores cortos (por ejemplo 10 a 50 nucleótidos) y al menos de aproximadamente 60°C para sondas o cebadores largos (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos) . Las condiciones severas pueden también ser logradas con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Las condiciones de baja severidad ejemplares o "condiciones de severidad reducida" incluyen la hibridación con una solución amortiguadora de 30% de formamida, cloruro de sodio 1M, 1% de SDS a 37°C y un lavado en 2 x SSC a 40°C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen hibridación en 50% de formamida, cloruro de sodio 1M, 1% de SDS a 37°C, y un lavado en 0.1 x SSC a 60°C. Los procedimientos de hibridación son bien conocidos en la técnica y son descritos por ejemplo, en Ausubel et al., 1998 y Sambrook et al, 2001. El término "antigeno" se refiere a una sustancia capaz de disparar una respuesta inmune en un vertebrado, dando como resultado la producción de un anticuerpo como parte de la defensa contra dicha sustancia. Los antigenos pueden ser proteínas virales que pueden provocar la producción de anticuerpos por ejemplo en las células sanguíneas, células de los nodulos linfáticos y el bazo de los vertebrados. El término "anticuerpo" incluye la referencia a los péptidos que se enlazan a los antigenos y se refieren a los anticuerpos, anticuerpos monoclonales, a una inmunoglobulina o anticuerpo entero o cualquier fragmento funcional de una molécula de inmunoglobulina. Los ejemplos de tales péptidos incluyen moléculas de anticuerpo completas, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, F(ab')2, regiones de determinación de la complementariedad (CDRs), VL (región variable de cadena ligera) , VH (región variable de cadena pesada) , y cualquier combinación de éstas o cualquier otra porción funcional de un péptido anticuerpo. El término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido sustancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos del mismo que se enlazan específicamente y reconocen un analito (antigeno) . No obstante, mientras que pueden ser definidos diversos fragmentos de anticuerpos en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, una persona experta en la técnica apreciará que tales fragmentos puedan ser sintetizados de novo ya sea químicamente o mediante la utilización de una metodología de ADN recombinante. De este modo, el término anticuerpo, como se utiliza en la presente, también incluye los fragmentos de anticuerpo tales como Fv de cadena simple, anticuerpos quiméricos (por ejemplo, que comprenden regiones constantes y variables de diferentes especies), anticuerpos humanizados (por ejemplo, que comprenden una región de determinación de la complementariedad (CDR) proveniente de una fuente no humana) y anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecificos) . Los términos "sustancialmente puro" y "aislado", son utilizados intercambiablemente y describen una proteina, péptido o ácido nucleico que es sustancialmente separado a partir de otros componentes (sub) celulares que naturalmente lo acompañan. El término abarca un ácido nucleico o proteina que ha sido removido de su ambiente de origen natural, e incluye los aislados de ADN recombinante o clonados y análogos químicamente sintetizados o análogos biológicamente sintetizados por sistemas heterólogos. En general, el término se refiere a un proteina purificada y un ácido nucleico que tiene una pureza de al menos aproximadamente 75%, por ejemplo 85%, 95% ó 98% en peso. Variantes menores o modificaciones químicas menores comparten típicamente la misma secuencia polipeptidica o nucleotidica . Una proteina o ácido nucleico sustancialmente pura comprenderá típicamente de aproximadamente 85 a 100% (p/p) de una proteina o muestra de ácido nucleico, más usualmente aproximadamente 95%, y preferentemente será más de 99% pura. La pureza u homogeneidad de la proteina o el ácido nucleico puede ser indicada por un número de medios bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteina, seguido por la visualización de una banda de polipéptido simple sobre un gel de poliacrilamida después de la tinción, o mediante electroforesis en gel de agarosa de una muestra de ácido nucleico, seguido por la visualización de una banda de polinucleótido simple sobre un gel de agarosa después de la tinción. "Tinción" puede referirse ya sea al uso de tinciones de péptido o de ácido nucleico específicos tales como tinciones con plata y comasie, o tinciones con bromuro de etidio y SYBR©, o puede referirse al uso de las tinciones de péptido o ácido nucleico especificas tales como la puesta en contacto del péptido con un anticuerpo, y la visualización del anticuerpo utilizando un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, conjugado a la fosfatasa alcalina) en el caso de las proteínas o los péptidos, o la puesta en contacto del ácido nucleico con una sonda complementaria marcada para la visualización de la presencia de la hibridación entre en el ácido nucleico y la sonda. Para ciertos propósitos, puede ser proporcionada más alta resolución mediante el uso de cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) , o un medio similar para la purificación. Tales métodos están en el área del conocimiento general común (ver por ejemplo, Katz, et al, 1998) .

Identificación y taxonomía La invención proporciona un virus aislado que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la SEQ ID No.: 1 y/o a la SEQ ID No.: 2, y las secuencias que tienen una secuencia de nucleótido de al menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o preferentemente 65% a ésta. Como se establece anteriormente, los polinucleótidos tienen secuencias "homologas" si la secuencia de nucleótidos en las dos secuencias es la misma cuando la alinea para la correspondencia máxima. Las búsquedas BLAST utilizando secuencias de nucleótidos obtenidas a partir del aislado del virus ToTV, no revelaron homología significativa con ninguna de las secuencias virales o no virales conocidas en las bases de datos GenBank y EMBL. La más alta homología porcentual encontrada de este modo hasta ahora fue de 46.5% entre las porciones de helicasa en 0RF1 sobre la SEQ ID No: 2, correspondiente al ARNÍ de ToTV, con las porciones de helicasa de otros virus de plantas (ver ejemplos más adelante) . Se debe entender que las homologías pueden ser grandes cuando dos secuencias son comparadas sobre una ventana de comparación pequeña ya que las regiones locales de similitudes de secuencia pueden a menudo ser encontradas cuando dos secuencias nucleotidicas largas son comparadas. No obstante, la persona experta está enterada de que la homología secuencial requiere el establecimiento de porciones comunes entre las secuencias, entre las cuales la identidad secuencial puede ser localmente tan alta como 35 a 100%, pero puede también ser tan baja como de 10-20% en otras partes de la secuencia genómica de la misma ORF. De este modo, cuando se hace referencia en la presente de que una secuencia tiene una homología de secuencia nucleotidica de al menos 50% a la SEQ ID No.: 1 o la SEQ ID No.: 2, esto puede referirse a la homología secuencial entre dos regiones entre porciones comunes, donde la homología es la más grande, pero también entre la secuencia de codificación de dos proteínas homologas. Nótese que las homologías de secuencia pueden diferir entre los diversos genes en el genoma (ver ejemplos) . Como una indicación del parentesco entre el aislado del virus ToTV recién identificado y otros virus (incluyendo los virus que van a ser comparados con éste) un análisis filogenético puede ser normalmente realizado con base en (parte de la) información de secuencia genómica de los virus. Son presentados varios de tales análisis en los ejemplos siguientes. La información obtenida de este modo hasta ahora indica que ToTV muestra el más alto nivel de homología con los virus de los géneros Sequivirus y Wa ika uirus ( Sequiviridae) y los géneros Chera ?irus y Sadwa ?irus . Los virus provenientes de estos géneros son distinguidos con base en el número de ARNs virales Sequiviridae tiene 1 ARN mientras que Cheraviruses y Sadwaviruses tienen dos ARNs - y el número de proteínas de cápside - Sadwaviruses tiene dos CPs, Cheraviruses tiene tres CPs. Estos criterios sugieren que el virus torrado del tomate se va a agrupar más probablemente dentro del gen de Chera ?irus, no obstante, los análisis filogenéticos utilizando varias porciones diferentes provenientes de las proteínas RdRp y helicasa putativas, colocan a ToTV claramente separados de los géneros Chera ?irus y Sadwa ?irus y de hecho sugiere que éste está más estrechamente relacionado a Sequiviridae . Desafortunadamente, las secuencias enteras proveniente únicamente de un Cheravirus (CRLV) y dos Sadwaviruses (SDV y SMoV) son actualmente disponibles. Los datos preliminares sobre la transmisión de vectores sugieren que ToTV pueden ser transmitidos por las moscas blancas mientras que los vectores naturales de CRLV y Sadwaviruses son desconocidos. Con base en la información actualmente disponible, incluyendo la información de secuencia, asi como la información taxonómica adicional como se presenta en la Tabla 1, siguiente, el virus recién encontrado es más probablemente un nuevo género.

Tabla 1: Descriptores taxonómicos para el virus ToTV recién descubierto (como se lista por los métodos internacionalmente aceptados del manual "Matthew's Plant Virology" ('Matthew's Plant Virology", Fourth Edition, Roger Hull (ed.) Academic Press, San Diego, p 15, Tabla 2.1 en ésta) (La numeración de la Tabla en Matthews1 será adherida a la Tabla 1 siguiente) I. Propiedades del virión A . Propiedades morfológicas de los viriones 1. tamaño de 28 nm 2. de forma esférica (icosahédrica) 3. envoltura ausente B . Propiedades físicas de los viriones I . Propiedades del virión (no investigadas) C. Propiedades del genoma 1. ácido nucleico tipo ARN ARN de una sola hebra 3. ARN lineal 4. Codificación en sentido positivo 5. Al menos dos segmentos (ARN 2: SEQ ID No.: 1 y ARN 1: SEQ ID No. : 2) 6. 5.5 kb (más precisamente 5.2 kb ó 5389 nucleótidos excluyendo la cola poli (A) y 8 kb (más precisamente 7.7 kb o 7793 nucleótidos excluyendo la cola poli (A) ) . 7. Casquete 5' terminal desconocido 8. Polipéptido 5' -terminal covalentemente enlazado, desconocido 9. Tramo poli (A) presente en ambos segmentos 10. Comparación de la secuencia de nucleótidos: el ARN 1 contiene una ORF1 con porciones típicas de la helicasa (Hel) , la proteasa y la ARN-polimerasa dependiente de ARN (RdRp) . El nivel de homología con la helicasa y las porciones RdRp de otros virus, se describe con detalle en los ejemplos. - el ARN 2 contiene dos ORFs de las cuales una tiene en su extremo N una porción tipica de la proteina de movimiento putativa (MP) y la cual contiene en el extremo C, las secuencias de las tres proteínas de cápside (recubrimiento) (CP) . El nivel de homología con las proteínas de cápside de otros virus es descrito con detalle en los ejemplos.

D. Propiedades de las proteínas 1. 3 x CP; Hel; RdRp; Proteasa; MP putativa CPs: 35, 26 y 23 kDa 3. (Para actividades funcionales, ver el texto anterior y los ejemplos siguientes) 4. (Para comparación de la secuencia de aminoácidos, ver los ejemplos más adelante) II . Organización y replicación genómica 1. Organización genómica ver Figura 7 2. Citopatologia : Al menos la epidermis de las células mesofilicas o células acompañantes del floema III. Propiedades antigénicas 1. No hay relaciones serológicas conocidas IV. Propiedades Biológicas Asociación con la enfermedad: Torrado; presumiblemente también la maneha de chocolate, presumiblemente también marchitez 3. Trofismo de tejido: al menos la epidermis de las células mesofilicas o las células acompañantes del fluoema 4. Modo de transmisión en la naturaleza desconocido 5. Relaciones de vectores: presumi Diemente la mosca blanca 6. Distribución geográfica: Mediterráneo, América (América Central, México y parte Sur de Norteamérica) Los presentes inventores encontraron recientemente que las secuencias genómicas del virus asociado de una enfermedad del tomate en América Central (por ejemplo, México y Guatemala) por el nombre de "enfermedad de la mancha del chocolate", "chocolate" o "marchitez" eran idénticas a aquellas del ToTV descrito en la presente (ver ejemplo 2). Por lo tanto, el agente causal asociado con esta enfermedad es un aspecto de la presente invención. Conforme se vuelven disponibles más secuencias virales, a partir de virus no ToTV que pueden o no estar estrechamente relacionados a éstos, o de virus estrechamente relacionados o que se asemejan esencialmente al virus ToTV, el análisis filogenético probará ser una manera valiosa de determinar la amplitud del taxón o revestimiento del ToTV basado en el parentesco filogenético entre los aislados. El parentesco filogenético puede ser por ejemplo determinado con base en una o todas las secuencias nucleotidicas del ARN 1 y/o el ARN 2 del genoma viral o sobre los datos de las secuencias de la proteina de cápside (gen) . Los análisis filogenéticos son bien conocidos para la persona experta en la técnica y pueden comprender por ejemplo, los análisis mediante reconstrucción de árbol basada en distancia (por ejemplo, unión de vecinos), probabilidad máximo o método de análisis de parsimonia mediante el uso de programas tales como ClustalX (Thompson et al., 1997), PAUP (Swofford, 2000) o PHYLIP (Felsenstein, 1989) . Con el fin de realizar un análisis del parentesco filogenético entre un nuevo aislado, la secuencia de ToTV como se proporciona en la presente, y las secuencias de referencia provenientes de cepas virales por ejemplo, de las bases de datos GenBank, EMBL, o DDBJ, el ARN genómico proveniente del nuevo aislado puede ser extraído directamente de las plantas infectadas, y las secuencias genómicas pueden ser amplificadas a partir de éstas. La transcripción inversa con métodos de amplificación por PCR (RT-PCR) pueden ser conducidos por ejemplo, utilizando cebadores oligonucleotidicos degenerados, siendo tales cebadores por ejemplo capaces de actuar como cebador de amplificación para la amplificación de las secuencias de ácido nucleico a partir de los genomas de los aislados ToTV divergentes, asi como de los genomas de especies virales estrechamente relacionadas. Preferentemente, pero no necesariamente, los productos de amplificación genómica de longitud completa pueden ser obtenidos de este modo a partir de las cepas de referencia (por ejemplo, aislados divergentes), las cepas de prueba (aislados sospechosos de ToTV) y especies estrechamente relacionadas. Preferentemente, las regiones genéticas especificas de interés son amplificadas para comparación. Los productos de amplificación (ADN) pueden ser luego secuenciados por ejemplo mediante secuenciamiento directo de nucleótidos de doble hebra utilizando terminadores di-desoxinucleotidicos fluorescentemente marcados (Smith et al., 1986) con los cebadores oligonucleotidicos degenerados utilizados para la RT-PCR. La edición de la secuencia nucleotidica, el análisis, la predicción opcional de las secuencias de aminoácidos y las alineaciones pueden ser conducidas con paquetes de software disponibles tales como el paquete de análisis de secuencia LaserGene versión 5 (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.) e IntelliGenetics Gene Works versión 2.5.1 ( IntelliGenetics, Mountain View, California). Los análisis filogenéticos pueden ser luego completados con en análisis filogenético utilizando el software de parsimonia de casos (PAUP) con un algoritmo de unión de vecinos utilizando distancias absolutas después de una búsqueda heurística y 1,000 réplicas sin intervención ajena, y un árbol filogenético puede ser generado mediante el análisis de parsimonia de las secuencias nucleotidicas de aminoácidos contiguas, alineadas, con lo cual en tales árboles los números representan en general los niveles de confianza propios. Después de 1,000 réplicas, un nivel de confianza por arriba de 60%, preferentemente por arriba de 70%, más preferentemente por arriba de 80%, 90%, 95% ó 98%, dentro de un árbol filogenético, debe ser considerado una prueba suficiente de inferencia filogenética correcta (colocación de los aislados en una cierta clase) con la condición de que el árbol sea suficientemente ramificado, con lo cual opcionalmente la ramificación puede ser mejorada mediante el enraizamiento a una especie fuera de grupo, adecuada. De esta manera, se puede determinar cuáles aislados están más estrechamente relacionados a las secuencias de ToTV como se proporcionan en la presente. El parentesco es en general expresado en términos de similitud porcentual de secuencia, denominada en la presente como homología secuencial u homología de secuencia. Aunque los análisis filogenéticos proporcionan un método conveniente de identificar un virus en el caso de suficiente homología de ácido nucleico, con los virus conocidos, otros diversos métodos posiblemente más directos aunque más burdos, para identificar el virus o las proteínas virales o los ácidos nucleicos del virus, son también proporcionados en la presente. Como un método práctico, un virus ToTV puede ser identificado por los porcentajes de homología de las proteínas o ácidos nucleicos virales que van a ser identificados, en comparación con las proteínas o ácidos nucleicos virales identificados en la presente por secuencia. Se sabe en general que las especies de virus, especialmente las especies de virus ARN, a menudo constituyen una cuasi especie en donde un cúmulo de dichos virus muestra heterogeneidad entre sus miembros. De este modo, se espera que cada aislado pueda tener cierto porcentaje diferente de homología con las secuencias de aislado como se proporcionan en la presente. Por lo tanto, otros aislados virales que muestran suficiente homología de secuencia a ToTV (por ejemplo, más de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ó 99% de homología secuencial) son considerados como pertenecientes al mismo virus. El virus ToTV de la presente invención es por lo tanto un virus que tiene al menos 50 ó 60% de homología, preferentemente al menos 70%, más preferentemente al menos 80%, todavía más preferentemente al menos 90%, aún más preferentemente al menos 95%, todavía más preferentemente al menos 98%, y lo más preferentemente al menos 99% de homología a las secuencias de proteina o de ácido nucleico proporcionadas en la presente, y provoca síntomas de la enfermedad inducidos por ToTV en Solanaceae, más particularmente en Solanum y Nicotiana , cuyos síntomas de la enfermedad pueden o no ser similares a aquellos descritos en la presente. En Cucurbi ta ceae el virus parece no provocar síntomas visibles aunque el virus es capaz de realizar la propagación en las plantas. Cuando alguien desea comparar un aislado viral separado con la proteina o las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente, la invención proporciona un virus aislado (ToTV) identificable como filogenéticamente correspondiente a ToTV por la determinación de una secuencia de proteina o de ácido nucleico del aislado viral separado, y determinando que dicha secuencia de proteina o de ácido nucleico tiene un porcentaje de homología secuencial de al menos 60%, preferentemente al menos 70%, más preferentemente al menos 80%, todavía más preferentemente al menos 90%, aún más preferentemente al menos 95%, todavía más preferentemente al menos 98%, y lo más preferentemente al menos 99% a las secuencias como se listan en la presente. Los aislados virales que tienen proteínas y ácidos nucleicos individuales con mayor homología que estos valores máximos mencionados, son considerados como filogenéticamente correspondientes y de este modo taxonómicamente correspondientes a los virus ToTV, y en general las proteínas serán codificadas por una secuencia de ácido nucleico estructuralmente correspondiente con una secuencia listada en la presente. En la presente, la invención proporciona un virus filogenéticamente correspondiente al virus aislado del cual se listan las secuencias en la presente. Se debe notar que, similarmente a otros virus, un cierto grado de variación puede esperar encontrarse entre los virus de ToTV aislados de diferentes fuentes. Aunque el nucleótido o la secuencia de aminoácidos del virus ToTV o fragmentos del mismo como se proporciona en la presente, por ejemplo, muestra menos de 95%, preferentemente menos de 90%, más preferentemente menos de 80%, más preferentemente menos de 70% y lo más preferentemente menos de 60% de homología en la secuencia de nucleótidos, o menos de 95%, preferentemente menos de 90%, más preferentemente menos de 80%, más preferentemente menos de 70% y lo más preferentemente menos de 60% de homología en la secuencia de aminoácidos con las respectivas secuencias de nucleótidos o de aminoácidos de cualquier virus no ToTV o pariente más cercano. La divergencia secuencial de las cepas ToTV alrededor del mundo puede ser algo superior, en analogía con otros virus de plantas. La invención proporciona un virus aislado (ToTV) identificable como filogenéticamente correspondiente a éste por la determinación de una secuencia de ácido nucleico de un fragmento adecuado del genoma del virus, y probándolo en análisis filogenéticos en donde los árboles de probabilidad máxima son generados utilizando por ejemplo, 1000 individuos propios como se describen anteriormente y encontrando que están filogenéticamente más estrechamente relacionados a un aislado de virus que comprende las secuencias de la SEQ ID No.: 1 o la SEQ ID No.: 2, como se lista en la presente para ToTV que está relacionada a un aislado viral de una cepa de diferencia no ToTV o pariente más cercano. Los fragmentos del genoma de ácido nucleico adecuados, útiles para tales análisis filogenéticos son por ejemplo, cualquier porción de las secuencias de ácido nucleico de fragmento de ARN de 5.5 kb o 8 kb (respectivamente denominados en la presente ARN2 y ARNÍ) como se describe en el ejemplo. Con la provisión de la información de secuencia de este virus ToTV, la invención proporciona los medios de diagnóstico y los métodos que van a ser empleados en la detección de virus ToTV en una muestra. Preferentemente la detección del virus ToTV es realizada con reactivos que son más específicos para el virus ToTV. Esto por ningún medio excluye, no obstante, la posibilidad de que sean utilizados reactivos menos específicos pero de suficiente reactividad cruzada, por ejemplo, debido a que éstos son más fácilmente disponibles y enfrentan suficientemente la tarea a mano. La invención por ejemplo proporciona un método para tratar la presencia de ToTV en plantas, preferentemente en plantas de tomate, más preferentemente en plantas de S . lycopersicum . El método puede comprender por ejemplo, determinar en la muestra la presencia de un virus ToTV o un componente del mismo mediante la reacción de la muestra con un ácido nucleico o anticuerpo especifico para ToTV de acuerdo a la invención. Aunque la infección por contacto de una planta indicadora es también un método adecuado para la detección de la presencia del virus en una planta de prueba. La invención proporciona la secuencia nucleotidica parcial de un nuevo virus aislado (de aqui en adelante denominado como virus ToTV) y los componentes específicos del virus ToTV o los análogos sintéticos del mismo. Las secuencias genómicas adicionales del virus ToTV a aquellas proporcionadas en la presente, pueden ser determinadas mediante métodos de secuenciamiento conocidos para la persona experta. La determinación de la secuencia genómica está muy por dentro del alcance de la persona experta, ahora que la presente invención proporciona el virus ToTV, asi como las secuencias genómicas parciales del mismo. Estos métodos comprenden por ejemplo, aquellos descritos en el ejemplo siguiente. En general, tales métodos de secuenciamiento incluyen el aislamiento de los ácidos nucleicos del genoma viral mediante procedimientos de aislamiento de ácido nucleico, y la determinación de la secuencia nucleotidica del ácido nucleico aislado, por ejemplo, mediante métodos de terminación de cadena didesoxi (Sanger et al., 1977) opcionalmente precedidos por transcripción inversa del ARN en ADN. La invención proporciona entre otros un ácido nucleico aislado o recombinante o fragmento funcional especifico del virus del mismo, obtenible a partir de un virus de acuerdo a la invención. Los ácidos nucleicos aislados o recombinantes comprenden las secuencias como se listan en la presente, o las secuencias de homólogos, que son capaces de hibridarse con aquellas bajo condiciones severas. En particular, la invención proporciona los cebadores y/o las sondas adecuadas para identificar un ácido nucleico del virus ToTV. Las sondas y cebadores adicionales capaces de hibridarse a una secuencia de ácido nucleico del virus ToTV pueden ser desarrolladas mediante métodos conocidos por la persona experta.

Vectores de expresión y expresión de genes de codificación virales . Además, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo a la invención. Para empezar, los vectores de expresión tales como los vectores plásmidos que contienen (partes de) una secuencia de doble hebra del genoma viral de ToTV, los vectores virales que contienen (partes de) el genoma de ToTV (por ejemplo, pero no limitado al virus de la vaccinia, retrovirus, baculovirus) o virus ToTV que contienen (partes de) el genoma de otros virus u otros patógenos, son parte de la presente invención. El vector de expresión puede comprender una secuencia genómica de ToTV o parte de la misma que está bajo el control de u operativamente enlazada a un elemento regulador, tal como un promotor. El segmento de ADN denominado como el promotor es responsable de la regulación de la transcripción de ADN en mARN. El vector de expresión puede comprender uno o más promotores adecuados para la expresión del gen, preferentemente para la expresión del gen que codifica para las proteínas virales, en células vegetales, células de hongos, células bacterianas, células de levadura, células de insecto u otras células eucarióticas. Los vectores de expresión de la invención son muy útiles para proporcionar antigenos del virus en sistemas de expresión de genes . También, la invención pertenece a una célula hospedera que comprende un ácido nucleico o un vector de expresión de acuerdo a la invención. Los vectores plásmidos o virales que contienen los ácidos nucleicos que codifican para los componentes proteicos de los virus ToTV, pueden ser generados en células procarióticas para la expresión de los componentes en tipos celulares relevantes (células vegetales, células de hongos, bacterias, células de insecto, células vegetales u otras células eucarióticas). Los vectores plásmidos o virales que contienen copias de longitud completa o parciales del genoma del virus ToTV, pueden ser generados en células procarióticas para la expresión de los ácidos nucleicos virales in vi tro o in vivo .

Métodos para el aislamiento y purificación de ToTV El virus ToTV puede ser aislado de plantas infectadas u otras fuentes mediante cualquier método disponible. El aislamiento puede comprender la purificación o purificación parcial de las partículas virales de ToTV a partir de una fuente adecuada. Es disponible una amplia gama de métodos para el aislamiento y purificación de virus (por ejemplo, ver Dijkstra y De Jager, 1998) . La purificación de ToTV puede ser realizada por ejemplo mediante el uso de procedimientos estándares, por ejemplo para los nepovirus o luteovirus (con la ayuda de solventes orgánicos) (ver por ejemplo Walker, 2004). Aunque tales protocolos pueden dar como resultado pérdida de infectividad del virus, estos procedimientos pueden ser todavía útiles para obtener material del virus para otros propósitos. Preferentemente, con el fin de mantener la integridad viral, es utilizado un método de purificación suave para purificar ToTV. Tal método de purificación suave puede comprender por ejemplo la homogeneización de material infectado de una planta (tales como las hojas) en un amortiguador de homogeneización (que comprende por ejemplo amortiguador de TRIS-HC1 0.1 M a un pH de aproximadamente 8, aproximadamente 20 mM de sulfito de sodio [Na2S03] , aproximadamente 10 mM de dietilditiocarbamato de sodio [Na-DIECA] y aproximadamente 5 mM de etilendiaminotetraacetato de sodio (Na-EDTA) ) , la separación de los desechos mediante centrifugación (por ejemplo por 30 minutos a 49,000 g) , la colocación del sobrenadante sobre un cojín de sucrosa adecuado (por ejemplo 20%) y la concentración de las partículas virales (por ejemplo mediante centrifugación por 1.5 horas a 70,000 g) . Después de esto, el botón que comprende las partículas puede ser resuspendido en un amortiguador adecuado (por ejemplo el TRIS-HC1 pH 8 ) , y la fracción que contiene el virus puede ser separada del resto de la suspensión mediante el uso de centrifugación por densidad en un gradiente de sucrosa (por ejemplo, 10 a 40% de sucrosa en amortiguador de homogeneización centrifugado por 2 horas a 110,000 g) . La fracción que contiene el virus puede ser determinada mediante el uso de experimentos de infección. La purificación adicional puede ocurrir mediante el uso de centrifugación por densidad en un gradiente de sulfato de cesio (por ejemplo gradiente de sulfato de cesio de 10 a 40% en TRIS-HC1, pH 8, centrifugado por 16 horas a 125,000 g) . Las bandas virales enriquecidas pueden ser luego recolectadas del gradiente y posteriormente concentradas mediante centrifugación o diálisis (por ejemplo contra TRIS-HC1 0.1 M, pH 8 ) . La infectividad de ToTV después de la purificación puede ser verificada mediante la inoculación sobre una planta sensible (por ejemplo N. hesperis '67A').

Métodos para la purificación de proteínas asociadas a ToTV y secuenciamiento de aminoácidos Habiendo preparado el virus ToTV purificado o parcialmente purificado, es posible realizar una preparación sustancialmente pura de una proteina asociada al virus (por ejemplo proteínas codificadas por el virus) . Aunque son conocidos numerosos métodos y estrategias para la purificación de proteínas en la técnica, lo más conveniente será purificar las proteínas virales de ToTV, tales como las proteínas de recubrimiento viral, ya sea mediante electroforesis utilizando por ejemplo un gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) o mediante cromatografía de afinidad. Cada uno de estos métodos será descrito más adelante. Las proteínas de interés de ToTV pueden ser separadas mediante electroforesis utilizando por ejemplo tricina-SDS-PAGE (Schagger y Von Jagow, 1987) o glicina-SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Otros sistemas de electroforesis que son capaces de resolver las diversas proteínas comprendidas en el aislado viral, o transcritas a partir de su genoma y expresadas en un sistema de expresión adecuados, pueden ser también por supuesto empleados, tales como la electroforesis en gel no desnaturalizante. El área del gel de PAGE que incluye la proteina objetivo puede ser extirpado y los polipéptidos objetivo pueden ser eluidos a partir de éste, por ejemplo mediante el uso de un dispositivo Elutrap® (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania). Una proteina objetivo puede ser identificada por su movilidad con relación a los polipéptidos de referencia en un gel. Para incrementar la pureza la proteina eluida puede ser corrida sobre un segundo gel de SDS-PAGE y eluida una segunda vez. La proteina o péptido contenido en el fragmento de gel extirpado puede ser luego eluida nuevamente y es adecuada para el uso en inmunización o en secuenciamiento de proteínas. Las proteínas de interés de ToTV pueden ser también purificadas mediante cromatografía de afinidad utilizando un anticuerpo (tal como un anticuerpo monoclonal) que se enlaza específicamente a una proteina de ToTV. El anticuerpo puede ser covalentemente acoplado a soportes sólidos tales como celulosas, poliestireno, poliacrilamida, dextrano reticulado, agarosa en esferas o vidrio de poro controlado, utilizando agentes de acoplamiento bifuncionales que reaccionan con los grupos funcionales sobre el soporte y los grupos funcionales (por ejemplo, cadenas laterales reactivas de aminoácidos) sobre la molécula de anticuerpo. Tales métodos son fácilmente disponibles para la persona experta. La fase sólida que posee el anticuerpo, resultante, es puesta en contacto con el virus purificado o parcialmente purificado bajo condiciones reductoras utilizando pH, fuerza iónica, temperatura y tiempos de residencia que permiten que la proteina de interés se enlace al anticuerpo inmovilizado. El virus o la proteina es eluida de la columna mediante el paso de un eluyente que disocia los enlaces de hidrógeno a través del lecho. Los amortiguadores a pH especifico o soluciones de cloruro de sodio por arriba de 2 M, son eluyentes comúnmente utilizados. Los métodos para llevar a cabo la cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos asi como otros métodos para purificación de proteina por inmunoafinidad (tales como las proteínas de cápside viral) son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Harlow y La e, 1988) . Con las enseñanzas proporcionadas en la presente, la persona experta es capaz de aislar una proteina especifica del virus de ToTV, determinando la secuencia de aminoácidos por ejemplo de la parte N-terminal de dicha proteina, diseñando un grupo de sondas degeneradas (para la degeneración del código genético) para hibridarse con el ADN que codifica para una región de la proteina, utilizando estas sondas sobre un arreglo de genes en una biblioteca genómica producida a partir del virus, obteniendo hibridaciones positivas y localizando los genes correspondientes. La persona experta es luego capaz de identificar la región estructural del gen y opcionalmente las secuencias con dirección 5' y con dirección 3' de las mismas. Después de esto, la persona experta es capaz de establecer la secuencia correcta de los residuos de aminoácidos que forman la proteina .

Producción del anticuerpo Los anticuerpos, ya sea monoclonales o policlonales, pueden ser generados a una proteina purificada o parcialmente purificada o fragmento peptidico del virus ToTV en una variedad de formas conocidas por aquellos expertos en la materia, incluyendo la inyección de las proteínas como un antigeno en animales, mediante fusión de hibridoma, y mediante métodos recombinantes que involucran sistemas de bacterias o de fagos (ver Marks et al., 1992a; Marks et al., 1992b; Lowman et al., 1991; Lerner et al., 1992, cada una de cuya referencia describe los métodos adecuados) . Los anticuerpos contra las partículas virales, las proteínas o péptidos de los virus pueden ser producidos mediante la inmunización de un vertebrado apropiado, preferentemente un hospedero mamífero, por ejemplo, conejos, cabras, ratas, pollos y ratones con las partículas, proteínas o péptidos solos o en conjunto con un adyuvante. Usualmente, estarán involucradas dos o más inmunizaciones, y la sangre o el bazo serán cosechados unos pocos dias después de la última inyección. Para antisueros policlonales, las inmunoglobulinas pueden ser precipitadas, aisladas y purificadas (por afinidad) . Para los anticuerpos monoclonales, los esplenocitos serán normalmente fusionados con un linfocito inmortalizado, por ejemplo, una linea mieloide, bajo condiciones selectivas para hibridomas. Los hibridomas pueden ser luego clonados bajo condiciones de dilución limitante y sus sobrenadantes seleccionados para los anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Las técnicas para producir anticuerpos (monoclonales) y los métodos para su preparación y uso en diversos procedimientos, son bien conocidas en la literatura (ver por ejemplo las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,381,292, 4,451,570, y 4,618,577; Harlow y Lañe, 1988; Ausubel, et al, 1998; Rose et al, 1997; Coligan et al, 1997). Típicamente, un anticuerpo dirigido contra una proteina asociada al virus, tendrá una afinidad de enlace de al menos Ixl05-lxl07 M"1. Una proteina recombinante derivada del virus ToTV, tal como puede ser obtenida mediante la expresión de una secuencia genómica del virus que codifica para la proteina, en un sistema de expresión estable, es preferida como el antigeno. No obstante, pueden ser también utilizadas proteínas purificadas. Los antigenos adecuados para la detección del anticuerpo incluyen cualquier proteina de ToTV que se combina con cualquier anticuerpo especifico de ToTV de cualquier mamífero expuesto a o infectado con el virus ToTV. Los antigenos preferidos de la invención incluyen aquellos que dan origen a respuestas inmunes en mamíferos expuestos a ToTV, los cuales por lo tanto, son típicamente reconocidos más fácilmente reconocidos por los anticuerpos de un mamífero. Los antigenos particularmente preferidos incluyen las proteínas de cápside de ToTV. Las proteínas estructurales provenientes del virus purificado, son las más preferidas . Los métodos para la clonación de las secuencias genómicas, para manipular las secuencias genómicas hacia y de los vectores de expresión, y para expresar la proteina codificada por la secuencia genómica en un hospedero heterólogo, son bien conocidos, y estas técnicas pueden ser utilizadas para proporcionar los vectores de expresión, células hospederas y secuencias genómicas clonadas que codifican para los antigenos, cuyas secuencias tienen que ser expresadas en un hospedero para producir los anticuerpos para el uso en ensayos de diagnóstico (ver por ejemplo Sambrook et al., 2001 y Ausubel, et al, 1998). Pueden ser utilizados una variedad de sistemas de expresión para producir antigenos de ToTV. Por ejemplo, una variedad de vectores de expresión adecuados para producir proteínas en E . coli , B . subtilis, levaduras, células de insecto, células vegetales y células de mamífero, han sido descritos, cualquiera de los cuales pueden ser utilizados para producir un antigeno de ToTV adecuado para producir un anticuerpo anti-ToTV o un fragmento del mismo. Por supuesto, ToTV mismo puede ser también utilizado como un vector de expresión para este propósito. Un uso de los anticuerpos de la invención es para seleccionar bibliotecas de expresión de cADN para identificar los clones que contienen insertos de cADN que codifican para las proteínas de interés o proteínas de inmunorreactividad cruzada, estructuralmente relacionados. Tal selección de las bibliotecas de expresión de cADN es bien conocida en la materia (ver por ejemplo Young y Davis, 1983), a la cual se hace referencia en este contexto, asi como a otras fuentes publicadas. Otro uso más de estos anticuerpos es para el uso en cromatografía de afinidad para la purificación de las proteínas de ToTV. Estos anticuerpos son también útiles para evaluar la infección por ToTV. La presente invención proporciona de este modo una proteina viral especifica de ToTV o un fragmento de la misma, de aqui en adelante denominada molécula proteica. Las moléculas proteicas útiles son por ejemplo derivadas de cualquiera de las secuencias genómicas o fragmentos de las mismas, derivadas de un virus de acuerdo a la invención. Tales moléculas proteicas o fragmentos antigénicos de las mismas, como se proporcionan en la presente, son por ejemplo útiles en métodos de diagnóstico o kits de diagnóstico y en composiciones de diagnóstico. Particularmente útiles son aquellas moléculas proteicas que son codificadas por los fragmentos de ácido nucleico recombinante que son identificados por la producción de anticuerpos específicos del virus ToTV, ya sea in vivo (por ejemplo para proporcionar anticuerpos de diagnóstico) o in vi tro (por ejemplo mediante tecnología de visualización de fagos u otras técnicas útiles para generar anticuerpos sintéticos o partes de los mismos). Se proporcionan también en la presente los anticuerpos, ya sean policlonales o monoclonales naturales, o anticuerpos sintéticos (por ejemplo moléculas de enlace derivadas de la biblioteca (fagos) ) que reaccionan específicamente con un antigeno que comprende una molécula proteica o el fragmento funcional especifico del virus ToTV, de la misma, tal como una proteina de cápside de acuerdo a la invención .

Métodos para identificar un aislado viral como un virus ToTV Aparte de la detección del virus ToTV, el cual involucra métodos de diagnóstico, la presente invención también se refiere a los métodos para la identificación, por ejemplo la confirmación de que el aislado es ToTV. Tales métodos pueden estar basados en la inferencia filogenética como se describe anteriormente, y se determina el nivel de homología de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos entre un aislado viral no identificado y una o más cepas de referencia del virus ToTV confirmado y el virus no ToTV. Tales métodos pueden comprender por ejemplo el secuenciamiento (parte de) el genoma de un aislado viral o de una proteina de cápside y comparando el nivel de homología de esa secuencia a las secuencias como son proporcionadas en la presente para ToTV. Un aislado que tiene más de 50% de homología con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 como se proporciona en la presente, es considerado taxonómicamente correspondiente a ToTV o perteneciente al taxón viral de ToTV. Tal virus es parte de la presente invención. Con el fin de identificar un virus como un virus torrado del tomate (ToTV) se puede también hacer uso de los descriptores taxonómicos como son presentados en la Tabla 1 anterior, y se encuentra por comparación que un nuevo aislado pertenece al nuevo género presuntivo, del cual la cepa de ToTV identificada por las secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 1 y 2 proporcionadas en la presente, y depositadas con la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre del 2004 bajo el número de referencia de depositarios ToTV-EOl (DSM 16999) puede ser asignada como la especie tipo. De este modo, no es esencial que una comparación de secuencia sea realizada con el fin de evaluar que un virus sea ToTV. Más bien, un método de identificación de un virus como un virus torrado de tomate (ToTV) puede comprender los pasos de averiguar la presencia de la combinación de descriptores taxonómicos seleccionados del grupo que consiste de: a) descriptores morfológicos, tales como partículas de viriones no envueltos, esféricas de aproximadamente 28 nm de diámetro; b) descriptores de las propiedades del genoma, tales como la posición de propiedades de virus de ARN en sentido positivo, lineales, de una sola hebra, basadas en los dos segmentos de ARN que comprenden colas poli (A) , que codifican para las poliproteinas de 5.5 y 8 kDa, respectivamente, y que comprendan regiones de codificación o porciones para 3 proteínas de cápside, la helicasa, la proteasa, RdRP y la proteina de movimiento putativa, y cuyos segmentos de ARN y/o las poliproteinas y/o las porciones tienen homologías basadas en la comparación de secuencia esencialmente como se describe en la presente, y c) descriptores de las propiedades biológicas, tales como la producción de lesiones necróticas y síntomas similares a quemaduras en el tomate, que tienen una gama de hospederos, relación de vectores y/o distribución geográfica esencialmente como se describe en la presente, y que están asociados con las enfermedades de las plantas de tomate localmente conocidas bajo nombres tales como torrado, marchitez y/o mancha de chocolate. La combinación de los descriptores taxonómicos que da como resultado una identificación positiva de un aislado del virus como un virus torrado del tomate (ToTV) es que la combinación que muestra el aislado que está más estrechamente relacionado (con base en los métodos taxonómicos numéricos bien conocidos para la persona experta en la técnica) a ToTV como se describe en la presente, que a otros virus, y en donde el aislado produce preferentemente los síntomas de la enfermedad en tomate, típicos de torrado como se describe en la presente. De este modo, un virus el cual, con base en el análisis taxonómico numérico de los descriptores taxonómicos esencialmente como se define en la Tabla 1, muestra que está más estrechamente relacionado al virus como se define en la reivindicación 1 en la presente, que a cualquier otro virus conocido a la fecha de la presentación de la presente solicitud, y cuyo virus está asociado con una enfermedad que provoca lesiones necróticas en tomate, se considera en la presente que es un ToTV y cae dentro del alcance de la presente invención. De esta manera, la invención proporciona un aislado viral identificable con un método de acuerdo a la invención como un virus vegetal taxonómicamente correspondiente a un virus identificable como probable perteneciente al taxón viral ToTV. Dependiendo de la relación o parentesco filogenético, o de la distinción con otros taxones virales, el taxon viral de ToTV puede ser un aislado, una especie, un género, o incluso una familia de virus. Alternativamente, los métodos para identificar un aislado viral como un virus ToTV pueden estar basados en la sintomatologia, por ejemplo, el reconocimiento del virus por síntomas de la enfermedad. No obstante, en una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención son utilizados en un método para identificar un aislado viral como un virus ToTV, con la condición de que la reactividad cruzada de tales anticuerpos con las cepas no ToTV relacionadas haya sido efectivamente descartada. Tales métodos comprenden el paso de hacer reaccionar el aislado viral o un componente del mismo con un anticuerpo como se proporciona en la presente. La reacción es denominada en la presente como permitir la aparición del enlace anticuerpo-antigeno. Esto puede ser logrado por ejemplo mediante el uso del virus ToTV purificado o no purificado o partes del mismo (proteínas, péptidos). Preferentemente, las células infectadas o los cultivos celulares son utilizados para identificar antigenos virales utilizando cualquier método inmunológico adecuado. Específicamente útiles en este aspecto son los anticuerpos producidos contra proteínas de la cápside viral de ToTV. Otros métodos preferidos para identificar un aislado viral como un virus ToTV, comprenden hacer reaccionar el aislado viral o un componente del mismo, con un polinucleótido especifico del virus, de acuerdo a la invención, cuyo polinucleótido es capaz de hibridarse bajo condiciones severas a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, secuencias que tienen una homología de secuencia nucleotidica de al menos 60% a la SEQ ID NO: 1 o a la SEQ ID NO: 2, y sus hebras complementarias, y fragmentos específicos de ToTV de las mismas. Tal reacción de hibridación puede ser realizada en cualquier formato disponible para la persona experta e involucrará en general la impresión de tejidos, métodos de transferencia de puntos o manchas, la transferencia o hibridación de Southern/Northern, hibridación in si t u , PCR, RT-PCR y similares.

Métodos de detección inmunológica Los métodos de la invención en los cuales son detectados los antigenos, pueden ser realizados en principio, mediante el uso de cualquier método inmunológico, tales como por ejemplo inmunofluorescencia clásica (IF), técnicas inmunohistoquimicas o formatos de ensayo de detección de antigeno comparables. Los métodos de detección de ToTV preferidos basados en la detección de la proteina de recubrimiento viral pueden comprender por ejemplo métodos tales como precipitación y pruebas de aglutinación, radioinmunoensayo (RÍA) , marcación de inmuno-oro, microscopía electrónica inmunosorbente (ISEM), ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) , transferencia de Western Blot (Western blot) e inmunotrasferencia (inmunoblot ) . Los ejemplos de tipos de inmunoensayos que pueden utilizar anticuerpos de la invención son inmunoensayos competitivos y no competitivos ya sea en un formato directo o indirecto. Los anticuerpos pueden ser utilizados en inmunoensayos en la fase liquida o enlazados a un portador de fase sólida. Además, los anticuerpos en estos inmunoensayos pueden ser detectablemente marcados de diversas formas. Aquellos expertos en la técnica sabrán, o pueden discernir fácilmente, los formatos de inmunoensayo adecuados sin experimentación indebida. Los formatos de ensayo son bien conocidos en la literatura y son descritos, por ejemplo, en Harlow y Lañe (1988) . Se puede utilizar una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar los anticuerpos específicamente reactivos con un polipéptido particular de acuerdo a la invención, tales como las proteínas de recubrimiento viral de ToTV. Por ejemplo, los inmunoensayos de ELISA en fase sólida son rutinariamente utilizados para este propósito. Ver Harlow y Lañe (1988), para una descripción de los formatos de inmunoensayo y las condiciones que pueden ser utilizadas para determinar el enlace selectivo. Los anticuerpos pueden ser enlazados a muchos portadores diferentes y utilizados para detectar la presencia de las moléculas diana u objetivo. Alternativamente, los antigenos pueden ser enlazados a muchos diferentes portadores, y utilizados para detectar la presencia del anticuerpo. Los ejemplos de portadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del portador puede ser ya sea soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Aquellos expertos en la técnica sabrán de otros portadores adecuados para enlazarse a los anticuerpos, o serán capaces de averiguar tales utilizando experimentación rutinaria. Los ensayos de transferencia de Western Blot son descritos en general en Harlow y Lañe (1988) . De acuerdo a este método las proteínas virales (y otras proteínas en la preparación de virus) son separadas mediante electroforesis en gel y transferidas a una fase sólida (por ejemplo, una membrana tal como nitrocelulosa) . El antigeno inmovilizado se hace reaccionar subsecuentemente con un anticuerpo y el sistema de detección (por ejemplo, un segundo anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina). Como será aparente para aquellos expertos en la técnica, será ventajoso incluir materiales de control negativo o positivo apropiados (tales como el antigeno sustancialmente purificado o el virus ToTV) en el ensayo. Los Ensayos Inmuno-Sorbentes Ligados a Enzima (ELISA) son descritos en general en Harlow y Lañe (1988) . El ensayo involucra la reacción de un componente viral (por ejemplo, una proteina de cápside) con un anticuerpo. En una modalidad, la muestra puede comprender un tejido vegetal que es triturado y se hace reaccionar con el anticuerpo que ha sido recubierto sobre una fase sólida tal como una placa de prueba. Si el virus está presente en la muestra, un anticuerpo especifico marcado con la enzima se enlazará al complejo anticuerpo-virus, y éste será detectado por una reacción de sustrato enzimático que produce una reacción de color. Los métodos preferidos de análisis de ELISA son la ELISA de emparedado de doble anticuerpo directo (DAS) (Clark y Adams, 1977), ELISA indirecta DAS (Vela et al. 1986), o TAS-ELISA. Será aparente para aquellos expertos en la técnica que en un ensayo de ELISA o cualquier otro tipo de ensayo algunas veces será deseable determinar la presencia de más de una proteina de cápside viral en una reacción simple, por ejemplo mediante el mezclado de dos o más anticuerpos con diferentes especificidades y evaluando ya sea para una o todas las proteínas asociadas a la cápside protectora de la invención.

Métodos de detección basados en ácido nucleico ToTV está compuesto de al menos dos ácidos ribonucleicos (ARNs). Existen fuertes indicaciones para la presencia de tres proteínas de cápside protectoras. Los métodos descritos anteriormente están enfocados a la detección inmunológica de las proteínas virales para la detección del virus. Mediante tecnología de ADN recombinante es posible producir sondas que se hibridan directa o indirectamente a los ARNs virales (o su complemento) , o el cADN producido a partir de éstos mediante transcripción inversa, y que pueden ser utilizados en ensayos para la detección del virus. Las técnicas de amplificación de ácido nucleico permiten la amplificación de los fragmentos de los ácidos nucleicos virales, que pueden estar presentes en cantidades muy bajas.

Con el fin de desarrollar métodos de detección basados en ácido nucleico, las secuencias especificas del virus deben ser determinadas, para las cuales los cebadores o las sondas pueden ser luego desarrollados. Para detectar ToTV mediante amplificación de ácido nucleico y/o hibridación de sonda, la proteina de cápside de ToTV puede ser secuenciada o, alternativamente, el ARN genómico viral puede ser aislado del virus purificado, transcrito inversamente en cADN y directamente clonado y/o secuenciado. Utilizando ya sea el ácido nucleico clonado como una sonda de hibridación, utilizando la información de secuencia derivada del clon, o mediante el diseño de cebadores degenerativos basados en la secuencia de aminoácidos de la proteina ToTV, las sondas de hibridación de ácido nucleico y/o los cebadores de amplificación de ácido nucleico pueden ser diseñados y utilizados en un ensayo de detección para detectar la presencia del virus en una muestra como se define en la presente . Los métodos de la invención en los cuales son detectados los ácidos nucleicos, pueden ser realizados en principio, mediante el uso de cualquier método de amplificación de ácido nucleico, tal como la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR; Mullís y Faloona, 1987; Patente de los Estados Unidos No. 4,683,195; 4,683,202; y 4,800,159), o mediante el uso de reacciones de amplificación tales como la Reacción en Cadena de Ligasa (LCR; Barany, 1991; EP- 0,320,308), Replicación de Secuencia Auto Sostenida (3SR; Guatelli et al., 1990), Amplificación de Desplazamiento de Hebra (SDA; Walker et al., 1992; Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,270,184 y 5,455,166), Sistema de Amplificación Transcripcional (TAS; Kwoh et al, 1989), Replicasa Q-Beta (Lizardi et al., 1988), Amplificación de Circulo Giratorio (RCA; Patente de los Estados Unidos No. 5,871,921), Amplificación Basada en Secuencia de Ácido Nucleico (NASBA; Compton, 1991), Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Escindasa (Patente de los Estados Unidos No. 5,719,028), Amplificación de Ácido Nucleico iniciada por Cebador Quimérico e Isotérmico (ICAN), Método de Amplificación por extensión de Ramificación (RAM; Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,719,028 y 5,942,391) u otros métodos adecuados para la amplificación de ácidos nucleicos. Ya que el virus es un virus de ARN (por ejemplo las secuencias de las Figuras 5 y 6 son el equivalente de ADN del genoma del ARN viral), un método de detección adecuado puede comprender el aislamiento de los ácidos nucleicos virales a partir de una muestra, por ejemplo a partir de una planta infectada, mediante el uso de métodos conocidos per se para la persona experta (por ejemplo Chomczynski y Sacchi, 1987; Boom et al., 1990) o sistemas comercialmente disponibles (por ejemplo, el kit de aislamiento de ARN total RNeasy o el kit de aislamiento de ARN vegetal RNeasy de QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania, o High-Pure-RNA-Isolation-Kit® (Roche Diagnostics a división of F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basilea, Suiza). El ARN total puede ser por ejemplo extraído del material de hoja o de protoplastos de las células vegetales y el ARN total, o específicamente el ARN genómico viral o una parte del mismo, puede ser luego transcrito inversamente en cADN mediante el uso por ejemplo de una transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV) o la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Molones (M-MuLV) . Un método adecuado puede incluir por ejemplo el mezclado dentro de un sistema amortiguador acuoso adecuado (por ejemplo un amortiguador de RT comercialmente disponible) una cantidad adecuada de los ARNs totales (por ejemplo 1 a 5 µg) , una cantidad adecuada (por ejemplo 10 pmol) de un cebador de transcripción inversa, una cantidad adecuada de dNTPs y la transcriptasa inversa, la desnaturalización de los ácidos nucleicos mediante ebullición por 1 minuto, y el enfriamiento de éstos sobre hielo, seguido por la transcripción inversa por ejemplo a 45°C por 1 hora como es recomendado para la transcriptasa inversa especifica utilizada, para obtener copias del cADN de las secuencias virales. Como un cebador de transcripción inversa un polinucleótido de acuerdo a la presente invención puede ser también utilizado, por ejemplo un oligonucleótido de 18-25 mer que comprende una secuencia nucleotidica complementaria a la secuencia genómica de ToTV o preferentemente al menos capaz de hibridarse bajo condiciones severas a la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, o un fragmento especifico de ToTV de las mismas. Alternativamente, en un cebador poliT especifico de (cebador oligodT) puede ser utilizado con el fin de iniciar la transcripción inversa a partir de porciones de ARN poliA. Después del paso de transcripción inversa (RT) , el cADN obtenido puede ser amplificado por PCR mediante el uso por ejemplo de las ADN-polimerasas Pfu y Taq y cebadores de amplificación específicos para las secuencias de cADN genómicas virales. Pueden ser también utilizados sistemas comercialmente disponibles completos para RT-PCR (por ejemplo los Sistemas de RT-PCR AccessQuickMR de Promega [Madison Wi, EUA] , o el Sistema de RT-PCR de un Tubo TitanMR o los sistemas de RT-PCR de dos pasos proporcionados por Roche Diagnostics [una división de F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basilea, Suiza] ) . Con el fin de amplificar un ácido nucleico con un número pequeño de malos acoplamientos a uno o más de los cebadores de amplificación, puede ser realizada una reacción de amplificación bajo condiciones de severidad reducida (por ejemplo una amplificación de PCR utilizando una temperatura de recocido de 38 °C, o la presencia de cloruro de magnesio 3.5 mM) . La persona experta en la técnica será capaz de seleccionar las condiciones de severidad o exigencia adecuadas . Los cebadores en la presente son seleccionados para ser "sustancialmente" complementarios (por ejemplo al menos 65%, más preferentemente al menos 80% perfectamente complementarios) a sus regiones diana u objetivo presentes sobre las diferentes hebras de cada secuencia especifica que va a ser amplificada. Es posible utilizar secuencias cebadoras que contienen por ejemplo residuos de inositol o bases ambiguas, o incluso cebadores que contienen uno o más malos acoplamientos cuando se comparan a la secuencia objetivo. En general, las secuencias que muestran al menos 65%, más preferentemente al menos 80% de homología con las secuencias oligonucleotidicas de ADN o ARN objetivo, son consideradas adecuadas para el uso en un método de la presente invención. Los malos acoplamientos o malas concordancias de secuencia tampoco son criticas cuando se utilizan condiciones de hibridación de baja severidad. La detección de los productos de amplificación puede ser lograda, en principio, mediante cualquier método adecuado conocido en la materia. Los fragmentos amplificados pueden ser directamente teñidos o marcados con marcadores radioactivos, anticuerpos, colorantes luminiscentes, colorantes fluorescentes o reactivos enzimáticos. Las tinciones directas de ADN incluyen, por ejemplo el intercalamiento de colorantes tales como naranja de acridina, bromuro de etidio, monoazida de etidio o colorantes de Hoechst . Alternativamente, los fragmentos de ADN o ARN pueden ser detectados mediante incorporación de las bases de dNTP marcadas dentro de los fragmentos sintetizados. Los marcadores de detección que pueden ser asociados con las bases nucleotidicas incluyen por ejemplo fluoresceina, colorante de cianina, digoxigenina (DIG) o bromodesoxiuridina (BrdUrd) . Cuando se utiliza un sistema de detección basado en sonda, un procedimiento de detección adecuado para el uso en la presente invención puede comprender por ejemplo un formato de inmunoensayo enzimático (EIA) (Jacobs et al, 1997). Para la realización de una detección en la forma del procedimiento EIA, el cebador delantero o el cebador inverso utilizado en la reacción de amplificación puede comprender un grupo de captura, tal como un grupo de biotina para la inmovilización de los amplicones de PCR del ADN objetivo, por ejemplo, sobre pozos de una placa de microtitulación recubiertos con estreptavidina, o Dynabeads® recubiertos con estreptavidina (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) para la detección subsecuente por EIA de los amplicones de ADN objetivo. La persona experta entenderá que otros grupos para la inmovilización de los amplicones de PCR de ADN objetivo en un formato EIA pueden ser empleados. Las sondas útiles para la detección de las secuencias de ácido nucleico objetivo como se describe en la presente, se enlaza únicamente al menos una parte de la región de la secuencia de ácido nucleico como es amplificada por el procedimiento de amplificación de ácido nucleico. Aquellos de experiencia en la técnica pueden preparar sondas adecuadas para la detección con base en la secuencia nucleotidica del ácido nucleico objetivo sin experimentación indebida como se describe en la presente. También las secuencias nucleotidicas complementarias, ya sea de ADN o ARN o los análogos químicamente sintetizados, del ácido nucleico objetivo pueden ser adecuadamente utilizados como sondas de detección especificas del tipo, en un método de la invención, con la condición de que tal hebra complementaria sea amplificada en la reacción de amplificación empleada. Los procedimientos de detección adecuados para el uso en la presente pueden comprender por ejemplo la inmovilización de los amplicones y el sondeo de las secuencias de ácido nucleico de los mismos por ejemplo mediante transferencia de Norhtern y de Southern. Otros formatos pueden comprender un formato de EIA como se describe anteriormente. Para facilitar la detección del enlace, las sondas de detección del amplicón, especificas, pueden comprender una porción marcadora tal como un fluoróforo, un cromóforo, una enzima o un radiomarcador, para facilitar el monitoreo del enlace de las sondas al producto de reacción de la reacción de amplificación. Tales marcadores son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ß-galactosidasa, peroxidasa de rábano, estreptavidina, biotina, digoxigenina, 35S, 14C, 32P o 125I. Otros ejemplos serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. La detección puede también ser realizada por un denominado ensayo de transferencia de linea inversa (RLB por sus siglas en ingles) , tal como se describe por ejemplo por Ven den Brule et al. (2002). Para este propósito, las sondas de RLB son preferentemente sintetizadas con un grupo amino 5' para la inmovilización subsiguiente sobre membranas de nailon recubiertas con carboxilo. La ventaja de un formato de RLB es la facilidad del sistema y su velocidad, permitiendo de este modo el procesamiento de muestra de alto rendimiento. El uso de las sondas de ácido nucleico para la detección de los fragmentos de ARN o ADN, es bien conocido en la técnica. Principalmente estos procedimientos comprenden la hibridación del ácido nucleico objetivo con la sonda, seguido por lavados post-hibridación . La especificidad es típicamente la función de los lavados post-hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos de ácido nucleico, la Tm puede ser aproximada a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984): Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (% GC)-0.61 (% form) -500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ácido nucleico, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en los pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica definida y pH definido) a la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria se hibrida a una sonda perfectamente acoplado o con concordancia perfecta. La Tm es reducida por aproximadamente 1°C para cada 1% de mal acoplamiento; de este modo, la hibridación y/o las condiciones de lavado pueden ser ajustadas para hibridarse a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si las secuencias con >90% de identidad son buscadas, la Tm puede ser disminuida 10°C. En general, se seleccionan condiciones severas o estrictas para ser aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia especifica y su complemento, a una fuerza iónica y pH definidos. No obstante, las condiciones severamente estrictas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 ó 4°C por debajo del punto de fusión térmica (Tm) ; condiciones moderadamente exigentes o estrictas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 ó 10°C por debajo del punto de fusión térmica (Tm) ; las condiciones de baja exigencia o severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 ó 20°C por debajo del punto de fusión térmica (Tm) . Utilizando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado, y la Tm deseada, aquellos expertos en la técnica entenderán que son inherentemente descritas las variaciones en la severidad de la hibridación y/o las soluciones de lavado. Si el grado deseado de mala concordancia da como resultado una Tm menor de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) se prefiere incrementar la concentración de SSC de modo que pueda ser utilizada una temperatura más alta. Una guia extensa para la hibridación de los ácidos nucleicos es encontrada en Tijssen, 1993; Ausubel et al., 1998. En otro aspecto más, la invención proporciona las sondas oligonucleotidicas para la detección del ARN o cADN del ToTV. Las sondas de detección en la presente son seleccionadas para ser "sustancialmente" complementarias a una molécula de ARN de una sola hebra, o a una de las hebras de los ácidos nucleicos de doble hebra generados por una reacción de amplificación de la invención. Preferentemente, las sondas son sustancialmente complementarias a las hebras antisentido, opcionalmente inmovilizadas (por ejemplo marcadas con biotina) de los amplicones generados a partir del ARN o ADN objetivo. Es permisible que las sondas de detección de la presente invención contengan una o más malas concordancias o acoplamientos a su secuencia objetivo. En general, las secuencias que muestran al menos 65%, más preferentemente al menos 80% de homología con las secuencias oligonucleotidicas objetivo, son consideradas adecuadas para el uso en un método de la presente invención.

Plantas resistentes a ToTV La invención se refiere además a un método para identificar una planta resistente a ToTV, o parte de la misma. Existen varias posibilidades de identificar plantas resistentes a ToTV. En un primer grupo de modalidades de tal método, el virus activo/infeccioso o los clones infecciosos de longitud completa pueden ser utilizados, mientras que en una modalidad alternativa se utilizan únicamente medios de detección de virus. Un primer paso de un método para identificar una planta resistente a ToTV utilizando virus activo/infeccioso, comprende la exposición de una planta o parte de la planta, tal como una hoja o un segmento de tallo, a una dosis infecciosa de ToTV, el objetivo de lo cual es lograr una infección. La exposición puede en muchos casos involucrar el establecimiento de contacto fisico. Una dosis infecciosa puede variar entre plantas y entre aislados de ToTV probados. Teóricamente, una cantidad de aproximadamente 1 a 10 a una cantidad de aproximadamente 500 a 5000 partículas virales de virus o los ácidos nucleicos de las mismas serán suficientes. La infección de esta manera puede ser lograda mediante inoculación mecánica de las partículas virales purificadas o el ácido nucleico viral sobre plantas saludables. Alternativamente, la infección puede ser lograda por ejemplo mediante: el desarrollo de un retoño saludable sobre un material de raiz infectado con ToTV, o viceversa; - la exposición de una planta saludable a vectores de transmisión que contienen el virus (incluyendo plantas infectadas, por ejemplo plantas parasitarias como Cuscuta spp. ) ; introducir dentro de una planta saludable un vector de expresión que alberga una región de codificación del genoma del virus ToTV; el uso de clones agro-infecciosos, tales como de Agrobacteri um tumefa ciens que contienen un vector de expresión que alberga una región de codificación del genoma del virus ToTV. En el contexto de la presente invención, los métodos para exponer una planta o parte de la planta a una dosis infecciosa de ToTV no están limitados a ningún método particular . Como se establece, la infección puede comprender la inoculación mecánica del virus sobre plantas saludables. Por ejemplo, una porción de una hoja enferma puede ser frotada directamente sobre una hoja de una planta que va a ser infectada. En un procedimiento alternativo, un inoculo puede ser preparado por ejemplo mediante la trituración del tejido vegetal que contiene el virus, preferentemente hojas jóvenes que muestran los síntomas, con un mortero y pistilo, o cualquier otro tipo adecuado de homogeneizador, por ejemplo en un amortiguador adecuado para la inoculación (por ejemplo, un amortiguador de fosfato 0.03 M, pH 7.7). Después de la trituración o molienda, el homogeneizado obtenido (la savia) es preferentemente filtrado, por ejemplo a través de manta de cielo. La savia puede ser luego utilizada para la inoculación, por ejemplo al poner en contacto suavemente las hojas con una cantidad de la savia. Las hojas son preferentemente pretratadas con el fin de dañar la epidermis inferior y aumentar la entrada del virus. Esto puede ser por ejemplo logrado mediante el pre-espolvoreo de las hojas con polvo de carborundum. La herida excesiva es preferentemente evitada. Se utiliza preferentemente carborundum en polvo que tiene partículas angulares microscópicamente pequeñas de carburo de silicio (malla 400-500) . El polvo de carborundum puede también ser agregado directamente a la savia, en cuyo caso es omitido el pretratamiento . La savia puede ser por ejemplo aplicada con el dedo, una almohadilla de espuma o de tela humedecida con la savia, o incluso con el pistilo utilizado para la molienda, una espátula de vidrio, un cepillo rígido o una pistola de roclo. Después de la inoculación, las hojas son preferentemente inmediatamente lavadas con agua. Un segundo paso de un método para identificar una planta resistente a ToTV, comprende la identificación de la planta como una planta resistente a ToTV cuando, después de dicha exposición, i) los síntomas de la enfermedad en la planta o en la parte de la planta permanecen ausentes o bien son retrasados en la expresión, o son al menos reducidos en severidad o son localizados con relación a una planta control susceptible y/o sensible, y/o ii) el virus ToTV o las secuencias genómicas de ToTV no están presentes en la planta o en la parte de la planta, o la presencia del virus ToTV es al menos cuantitativamente reducida en la planta con relación a una planta control susceptible. Como se utiliza en la presente, el término localizado significa limitado a la hoja inoculada . La determinación del desarrollo de los síntomas de la enfermedad inducidos por ToTV, en plantas infectadas, puede ser realizada mediante métodos cuantitativos, por ejemplo, en donde el periodo requerido para el desarrollo de los síntomas de la enfermedad discernibles (por ejemplo visibles) es percibido, o por métodos cualitativos en donde, después de que ha transcurrido un cierto periodo, la planta es inspeccionada para la expresión de los síntomas y la presencia o severidad de los síntomas es indicada. Además de determinar el desarrollo de los síntomas de la enfermedad inducidos por ToTV o como una alternativa a esto, dependiendo del tipo de resistencia a ToTV que vaya a ser detectada, la presencia del virus es detectada en la planta o en la parte de la planta. Con el fin de detectar la ausencia del virus en las plantas de prueba, en principio, puede ser utilizado cualquier método. Por ejemplo, puede ser empleado un método en donde un anticuerpo especifico para ToTV, un grupo de cebadores o una sonda de acuerdo a la presente invención, sea utilizado. Alternativamente, una porción de la planta de prueba puede ser puesta en contacto con una planta indicadora susceptible (por ejemplo, N. hesperis '67A') para establecer si el virus está presente o ausente en la planta de prueba. La persona experta entenderá que para tales métodos es importante descontaminar la superficie de la planta de prueba, con el fin de distinguir entre un vector de transmisión, una planta de prueba tolerante y una planta de prueba resistente, ya que únicamente necesita ser establecida la presencia del virus en las células vegetales. En la realización del segundo paso de un método para identificar una planta resistente a ToTV, pueden ser obtenidos los siguientes resultados. Si después de la inoculación exitosa (por ejemplo después del establecimiento de un contacto planta-virus bajo condiciones que podrían dar como resultado la infección en una planta control susceptible y sensible) : i) los síntomas de la enfermedad permanecen ausentes; o las partículas virales, o el ARN viral no puede ser detectado; la planta es resistente; ii) los síntomas de la enfermedad son retrasados o reducidos en severidad; o los bajos títulos sistémicos de las partículas virales o el ARN viral pueden ser detectados; la planta es parcialmente resistente; iii) los síntomas de la enfermedad son severos, pero permanecen locales, limitados a la hoja inoculada y no se difunden sistémicamente más allá del tejido inoculado; o las partículas virales, o el ARN viral pueden únicamente ser detectados localmente; la planta es hipersensible; iv) si los síntomas de la enfermedad permanecen ausentes, y las partículas virales, o el ARN viral pueden ser detectados: la planta es tolerante. v) si la planta desarrolla síntomas de la enfermedad y tiene altos títulos virales sistémicos, entonces la planta es susceptible y sensible. Los ejemplos de tales plantas son las plantas a partir de las cuales fue aislado el virus de la presente invención. Estas plantas pueden servir como plantas control adecuadas en los métodos de la presente invención . Para el propósito de producir plantas resistentes, y desde un punto de vista de fitosanitización, únicamente los resultados i), ii) y iii) pueden ser considerados de interés. Para el propósito de obtener plantas adecuadas para la producción de cosechas y productos asintomáticos, el resultado iv) puede también ser de interés comercial particular . En una modalidad alternativa de un método para identificar una planta resistente a ToTV, únicamente se utilizan los medios de detección del virus. Por ejemplo, una planta resistente a ToTV puede ser identificada en el campo mediante la observación o identificación de una planta asintomática entre las plantas sintomáticas, y determinando la ausencia del virus en dicha planta, mediante la realización de cualquiera de los métodos de detección de virus de acuerdo a la presente invención. De hecho, esto corresponde a un método para identificar una planta resistente a ToTV en donde el paso a) de exposición de una planta o parte de la planta a una dosis infecciosa de ToTV, es realizada pasivamente (por ejemplo de manera natural). Cuando tal método es realizado se prefiere que se utilice un método para la detección de la presencia de ToTV en una muestra de acuerdo a la presente invención, en donde la presencia de un virus ToTV o un componente del mismo es realizada mediante la reacción de dicha muestra con un polinucleótido o un anticuerpo de acuerdo a la presente invención. Preferentemente, un método de identificación de una planta resistente a ToTV requiere el uso ya sea del virus de la presente invención o un polinucleótido o anticuerpo de acuerdo a la presente invención. La invención se refiere además a un método para producir una planta resistente a ToTV, o una parte de la misma. Una vez que ha sido identificada una planta resistente a ToTV, esta planta puede servir como una planta donadora de material genético que va a ser transferido de la planta donadora a una planta recipiente, con el fin de proporcionar la planta recipiente con el material genético. La transferencia del material genético a partir de una planta donadora hacia una planta recipiente puede ocurrir mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. El material genético en la mayoria de los casos, será material genómico. Es importante, no obstante, que sean al menos transferidas las partes del genoma de la planta donadora, que confieren resistencia. En ausencia de métodos para determinar cuáles partes del genoma de la planta donadora confieren la resistencia a ToTV, la transferencia puede ocurrir adecuadamente mediante la transferencia de cromosomas completos. Preferentemente, la planta resistente a ToTV sirve como una planta progenitora masculina o femenina en una cruza para producir plantas de progenie resistentes, la planta de progenie recibe por ende el material genómico del donador resistente, y actúa como la planta recipiente. Aunque un progenitor susceptible en las cruzas es en sentido estricto no necesariamente una planta recipiente, tal progenitor susceptible en la presente será también incluido en el término planta recipiente. En un método para producir una planta resistente a ToTV, la fusión de protoplastos puede ser también utilizada para la transferencia del material genómico que confiere resistencia, a partir de una planta donadora hacia una planta recipiente, por ejemplo como una manera de cruzar dichas plantas. La fusión de protoplastos es una unión inducida o espontánea, tal como una hibridación somática, entre dos o más protoplastos (células de las cuales las paredes celulares son retiradas mediante tratamiento enzimático) para producir una célula simple bi- o multi-nucleada . La célula fusionada, que puede incluso ser obtenida con especies vegetales que no pueden ser entrecruzadas en la naturaleza, es cultivada en tejidos en una planta hibrida que muestra la combinación deseable de rasgos. Más específicamente, un primer protoplasto puede ser obtenido a partir de una planta de tomate u otra linea vegetal que muestre resistencia a la infección por ToTV. Por ejemplo, un protoplasto proveniente de una linea resistente a ToTV (tomate, berenjena, pimiento, melón, sandia o pepino) puede ser utilizado. Un segundo protoplasto puede ser obtenido a partir de una segunda linea vegetal susceptible, opcionalmente proveniente de otra especie de planta o variedad de planta, preferentemente de la misma especie de planta o de la misma variedad, que comprende características comercialmente deseables, tales como, pero no limitadas a resistencia a la enfermedad, resistencia a insectos, características valiosas de la fruta, etc. Los protoplastos son luego fusionados utilizando los procedimientos tradicionales de fusión de protoplastos, los cuales son conocidos en la técnica para producir la cruza. Alternativamente, el rescate de los embriones puede ser empleado en la transferencia del material genómico que confiere resistencia, proveniente de una planta donadora hacia una planta recipiente, por ejemplo, como una manera de cruzar las plantas. El rescate de los embriones puede ser utilizado como un procedimiento para aislar los embriones provenientes de las cruzas, en donde las plantas dejan de producir semillas viables. En este proceso, el ovario fertilizado o la semilla madura de una planta es cultivado en tejidos para crear nuevas plantas (este método es descrito con detalle en Pierik, 1999) . Un método para producir plantas resistentes a ToTV comprende de este modo, en una modalidad, los pasos de identificar una planta donadora resistente a ToTV como se describe en la presente anteriormente, y cruzando dicha planta donadora resistente a ToTV con una planta resistente, como se describe anteriormente, produciendo con esto plantas de progenie resistentes. Un método para producir una planta resistente a ToTV comprende además el paso de seleccionar de las plantas de progenie una planta resistente mediante la realización de un método para identificar una planta resistente a ToTV, como se describió al principio. Preferentemente, la planta donadora resistente a ToTV es una planta de la familia Solana ceae o Cucurbi taceae, aún más preferentemente una planta de tomate, una planta de berenjena, una planta de pimiento, una planta de melón, una planta de sandia o una planta de pepino. Preferentemente, la planta recipiente es una planta de la familia Solanaceae o Cucurbi ta ceae, aún más preferentemente una planta de tomate, una planta de berenjena, una planta de pimiento, una planta de melón, una planta de sandia o una planta de pepino. Todavía más preferentemente, la planta recipiente es una planta de tomate de la especie Solanum lycopersi cum, más preferentemente una planta de S . lycopersicum que posee características comercialmente deseables. La planta recipiente puede ser una planta susceptible a ToTV, una planta sensible a ToTV o una planta recipiente resistente a ToTV. Como se explicó anteriormente, la elección de la planta será determinada principalmente por si el rasgo resistente es dominante o bien recesivo. La persona experta está enterada de las diversas metodologías disponibles para resolver tales problemas. También, un aspecto de la presente invención es una planta resistente a ToTV, o una parte de la misma, obtenible mediante un método de la invención. Como se estableció, una modalidad preferida de un método para producir una planta resistente a ToTV comprende la transferencia mediante introgresión de la secuencia de ácido nucleico que confiere resistencia, proveniente de una planta donadora resistente a ToTV dentro de una planta recipiente, mediante la cruza de dichas plantas. Las plantas resistentes desarrolladas de acuerdo a esta modalidad preferida, pueden derivar ventajosamente una mayor parte de sus rasgos a partir de la planta recipiente, y derivar la resistencia a ToTV de la planta donadora. En un método, que es denominado como la crianza de pedigri, una planta donadora que muestra resistencia a ToTV es cruzada con una planta recipiente que muestra preferentemente características comercialmente deseables, tales como, pero no limitadas a, resistencia a la enfermedad, resistencia a insectos, características valiosas de la fruta, etc. La población de plantas resultante (que representa los híbridos Fi) es luego auto-polinizada y se deja que de semillas (semillas F2) . Las plantas F2 desarrolladas a partir de las semillas F2 son luego seleccionadas para la resistencia a ToTV. La población puede ser seleccionada en un número de diferentes formas, preferentemente, mediante la realización de un método de la presente invención para la inspección visual. Debido a que la identificación de las plantas resistentes a ToTV ha sido únicamente posible al principio por la presente invención, el método para producir la planta resistente es un aspecto de la invención. También, un aspecto de la presente invención es una planta resistente a ToTV o una parte de la misma, obtenible mediante un método de la invención. La presente invención proporciona los métodos para prevenir la dispersión de la infección por ToTV en plantas de tomate, al proporcionar plantas de tomate resistentes, asi como mediante la eliminación de plantas que llevan el virus ToTV. Estas medidas pueden formar una parte de la estrategia general para mejorar la fitosanitización en relación al virus ToTV. Las plantas tolerantes pueden ser de este modo identificadas y eliminadas con el fin de eliminar tales fuentes del virus ToTV. En una modalidad de un método para producir una planta resistente a ToTV, o una parte de la misma, la presente invención proporciona un método para producir una planta tolerante a ToTV. Una planta tolerante puede proporcionar una cosecha valiosa, frutas y semillas valiosas, ya que aunque la planta puede albergar el virus, ésta no muestra los síntomas de la enfermedad. Tal método involucrará la identificación de plantas tolerantes, y el uso de tales plantas tolerantes como fuentes o donadores del material genético deseado. El objetivo no es proporcionar una planta capaz de resistir la entrada o multiplicación del virus en sus células, sino proporcionar una planta que no sufra de los síntomas. De este modo, la presente invención se refiere a un método para identificar una planta tolerante a ToTV, que comprende los pasos de a) exponer una planta o parte de la planta a una dosis infecciosa de ToTV, y b) identificar la planta como una planta tolerante a ToTV cuando, después de la exposición, los síntomas de la enfermedad en la planta o la parte de la planta permanecen ausentes, y ToTV está presente en la planta o en la parte de la planta. La determinación del desarrollo de los síntomas de la enfermedad inducidos por ToTV, en plantas infectadas, puede ser realizada mediante métodos cuantitativos, por ejemplo, en donde el periodo requerido para el desarrollo de los síntomas discernióles de la enfermedad (por ejemplo visibles) es percibido, o por métodos cualitativos en donde, después de que ha transcurrido un cierto periodo, la planta es inspeccionada para la ausencia de expresión de los síntomas o la reducción en la severidad de los síntomas es indicada . En una modalidad preferida, la presencia de ToTV en la planta o parte de la planta es determinada en el paso b) mediante la realización de un método que comprende determinar en la planta o la parte de la planta la presencia de un virus ToTV o componente de la misma al hacer reaccionar la planta o parte de la planta con un polinucleótido de acuerdo a la invención o un anticuerpo de acuerdo a la invención.

Kits de Diagnóstico Los métodos y los medios proporcionados en la presente son particularmente útiles en un kit de diagnóstico para diagnosticar una infección por el virus ToTV mediante diagnóstico virológico. Tales kits o ensayos pueden comprender por ejemplo un virus, un ácido nucleico, una molécula proteica o fragmento de la misma, y/o un anticuerpo de acuerdo a la invención. La invención también proporciona un kit de diagnóstico para diagnosticar una infección por ToTV que comprende un virus ToTV, un ácido nucleico especifico del virus ToTV, la molécula proteica o fragmento de la misma y/o un anticuerpo de acuerdo a la invención, y preferentemente un medio para detectar el virus ToTV, el ácido nucleico especifico del virus ToTV, la molécula proteica o el fragmento de la misma y/o un anticuerpo, los medios por ejemplo comprenden un grupo excitable tal como un sistema de detección fluoróforo o enzimático utilizado en la técnica (los ejemplos de formatos de kit de diagnóstico adecuados comprenden IF, ELISA, ensayo de neutralización, ensayo de RT-PCR, ensayos de hibridación) . Los ensayos de detección adecuados incluyen los ensayos directos e indirectos, ensayos de emparedado, ensayos en fase sólida tales como aquellos que utilizan placas o esferas entre otros, y ensayos en fase líquida. Los ensayos adecuados incluyen aquellos que utilizan anticuerpos primarios y secundarios, y aquellos que utilizan reactivos que se enlazan a los anticuerpos, tales como la proteina A. Además, puede ser utilizada una variedad de métodos de detección en la invención, incluyendo los métodos colorimétricos, fluorescentes, fosforescentes, quimioluminiscentes, luminiscentes y radioactivos. Para determinar si un componente viral todavía no identificado o el análogo sintético del mismo tal como el ácido nucleico, la molécula proteica o el fragmento de la misma puede ser identificado como especifico del virus ToTV, es suficiente con analizar la secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico del componente, por ejemplo para un tramo del ácido nucleico o de los aminoácidos, preferentemente de al menos 10, más preferentemente de al menos 25, más preferentemente de al menos 40 nucleótidos o aminoácidos (respectivamente), mediante comparación de homología de secuencia con las secuencias virales de ToTV proporcionadas, y con las secuencias virales no ToTV conocidas (preferentemente el pariente filogenético más cercano de ToTV es utilizado) utilizando por ejemplo análisis filogenéticos como se proporcionan en la presente. Dependiendo del grado de relación con las secuencias virales de ToTV o no ToTV, el componente o el análogo sintético pueden ser identificados. Un kit para detectar un virus ToTV, dependiendo del formato de ensayo, incluir uno o más anticuerpos específicos para una proteina, preferentemente específicos para al menos una proteína de cápside de ToTV, y preferentemente también incluye una proteina ToTV sustancialmente purificada o un anticuerpo anti-idiotipico para el uso como un control positivo .

Agentes antivirales La invención también proporciona los métodos para obtener un agente antiviral útil en el tratamiento de la infección por ToTV en plantas, que comprende establecer un cultivo celular o planta experimental que comprende un virus de acuerdo a la invención, el tratamiento del cultivo o la planta con un agente antiviral candidato, y la determinación del efecto del agente sobre el virus o su infección del cultivo o la planta. Un ejemplo de tal agente antiviral comprende un anticuerpo neutralizador de ToTV, o un componente funcional del mismo, como se proporciona en la presente, pero los agentes antivirales de otra naturaleza pueden también ser obtenidos. Existen diferentes agentes antivirales utilizados en plantas, tales como productos químicos, bacterias, hongos, insectos y virus. La mayoria de ellos están relacionados a la resistencia adquirida sistémica (SAR) . La presente invención contempla el uso del genoma de ToTV o una parte del mismo como un inductor de resistencia sistémica adquirida en las plantas. La resistencia sistémica adquirida puede ser dirigida al ToTV o a otras enfermedades. A este respecto, ToTV, su genoma, o las partes que confieren resistencia del mismo, pueden ser utilizadas como el agente antiviral. La invención también proporciona el uso de un agente antiviral de acuerdo a la invención, para la preparación de una composición de tratamiento, en particular para el tratamiento de la infección por ToTV en plantas, y proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente antiviral de acuerdo a la invención, útil en un método para el tratamiento o prevención de una infección por el virus ToTV, el método comprende proporcionar tal composición de tratamiento a una planta individual.

La invención también se refiere a un modelo de planta utilizable para probar los métodos de tratamiento y/o las composiciones. Ha aparecido que varias especies de Ni cotiana pueden ser infectadas con el virus ToTV, con lo cual muestran síntomas de la enfermedad no similares a aquellos encontrados en las plantas de tomate que sufren del virus ToTV. Al someter las plantas de Nicotiana a un tratamiento antiviral ya sea antes o durante la infección con el virus, se puede tener un valor predictivo para la aplicación de tal agente antiviral en las plantas de tomate. La invención también se refiere al uso de ToTV, o partes del genoma viral de ToTV, como vector de expresión, por ejemplo para el uso en el silenciamiento de genes inducido por virus (VIGS) . VIGS es una tecnología que explota un mecanismo de defensa antiviral mediado por el ARN, en las plantas. En las plantas infectadas con los virus no modificados, el mecanismo es específicamente dirigido contra el genoma viral. Mediante el uso de vectores de expresión virales que llevan insertos derivados de los genes hospederos, el mecanismo puede también ser utilizado para dirigirse contra los ARNs de la planta, correspondientes. VIGS ha sido utilizado ampliamente en plantas para el análisis de la función de los genes y ha sido adaptado para los genómicos funcionales de alto rendimiento. Hasta ahora, la mayoria de las aplicaciones de VIGS han sido en Ni cotiana ben thamiana . No obstante, la presente invención contempla el uso de ToTV como nuevos sistemas vectores de expresión que permiten el análisis de la función del gen en otras plantas, tales como tomate u otras especies de la familia Solana ceae, tales como pimiento y tomate y en especie de la familia Cucurbi taceae. La invención es también explicada en los Ejemplos sin limitarla a éstos.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Aislamiento y caracterización de ToTV a partir de plantas de tomate Métodos Introducción Muestras de plantas de tomate de España fueron recibidas para investigación y diagnóstico. Los síntomas sobre las plantas de tomate consistieron de manchas necróticas y clorosis sobre las hojas, y anillos cafés sobre los frutos. Las pruebas serológicas (ELISA) señalaron la presencia del virus mosaico del Pepino (PepMV), pero considerando los síntomas, fue probable que estuviera presente otro agente todavía no definido. Partículas esféricas del virus fueron encontradas en estudios de microscopía electrónica del tejido infectado de la hoja. Subsecuentemente, se condujo una prueba de infección y se encontraron múltiples accesos de tomate como susceptibles para ToTV, varios de los cuales reaccionaron con síntomas claros (necrosis de las hojas, iniciando en la base de las hojuelas individuales (ver Figura 1) .

Transmisión y propagación de virus ToTV fue aislado como se describe más adelante a partir de una planta enferma obtenida de España. ToTV fue mecánicamente transmisible a varias especies de Ni cotiana .

Un amortiguador de inoculación estándar (por ejemplo amortiguador de fosfato 0.03 M, pH 7.7) probó ser adecuado.

A todo lo largo de este Ejemplo, ToTV fue mecánicamente inoculado sobre y propagado en N. glutinosa o N. ben thamiana .

La purificación del virus fue llevada aproximadamente 14 dias después de la inoculación.

Purificación del virus Se realizaron varios intentos para purificar ToTV de acuerdo a protocolos estándares, por ejemplo para nepovirus y luteovirus (con la ayuda de solventes orgánicos) . Estos protocolos dieron como resultado siempre pérdida de infectividad del virus. Además, ToTV tendió a agregarse cuando fueron utilizadas bajas temperaturas en los pasos de centrifugación (por debajo de 5°C). Eventualmente, un método de purificación muy suave dio como resultado preparaciones del virus razonablemente limpias sobre las cuales pudieron ser llevados a cabo los experimentos posteriores. El siguiente procedimiento fue utilizado para purificar ToTV (todos los pasos de centrifugación fueron realizados a 6°C) . Las hojas infectadas de N. gl utinosa o N. ben thamíana fueron homogeneizadas en 5 partes de TRIS-HC1 0.1 M (pH 8) más ?a2S03 20 mM, ?a-DIECA 10 mM en ?a-EDTA 5 mM (amortiguador de homogeneización) y el homogeneizado fue centrifugado por 30 minutos a 49,000 x g. El sobrenadante fue colocado sobre un cojín de sucrosa al 20% y centrifugado por 1.5 horas a 70,000 x g. El botón fue resuspendido en 2 ml de TRIS-HC1, pH 8 , y la suspensión fue colocada sobre un gradiente de sucrosa (10 a 40% de sucrosa en el amortiguador de homogeneización) y centrifugado por 2 horas a 110,000 x g. Ya que una banda del virus no fue visible, el gradiente fue repartido en alícuotas en fracciones discretas y se determinó la presencia del virus en cada fracción, mediante inoculación de una porción de la fracción sobre hojas de N. hesperis '67A' como se describe en la presente, y observando la aparición de la infección. La fracción que contiene el virus fue colocada sobre un gradiente de sulfato de cesio al 10-40% (en TRIS-HC1, pH 8) y centrifugada por 16 horas a 125,000 x g. Las bandas del virus fueron recolectadas y concentradas mediante centrifugación o dializadas contra TRIS-HC1 0.1 M, pH 8. La infectividad de ToTV después de cada paso de purificación fue verificada mediante inoculación sobre N. hesperis '67A' (fracciones en gradiente de sulfato de cesio fueron dializadas contra TRIS-HC1, pH 8, antes de la inoculación) .

Microscopía electrónica Suspensiones del virus fueron "montadas" sobre una rejilla recubierta con Fromvar®, de otro modo conocido como polivinil-formal, teñido con 2% de acetato de uranilo y examinado en un microscopio electrónico Philips CM12.

Análisis PAGE Las proteínas virales fueron separadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante al 12% (SDS-PAGE, Laemmli, 1970) y teñidas con plata.

Aislamien to y eval ua ción del ácido nucleico El virus purificado fue concentrado mediante centrifugación (2 horas a 115,000 g) . Los botones fueron sometidos a extracción de AR? de acuerdo al procedimiento Qiagen R?easy MinElute Cleanup (Qiagen, Hilden, Alemania) .

La concentración de ARN fue determinada en un espectrofotómetro de UV (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, EUA) . La integridad del ARN fue verificada mediante electroforesis en gel de agarosa. Después de electroforesis por 2 horas a 60 V, el ARN fue teñido utilizando azul de ortotoluidina.

Sín tesis y clona ción de cADN El cADN fue sintetizado utilizando el sistema de Elección Invitrogen Superscript (Invitrogen, Breda, Holanda) para la sintesis de cADN de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes. El cADN de primera hebra fue cebado utilizando ya sea el Oligo-d(T) o cebadores hexaméricos aleatorios. Después de la sintesis de la segunda hebra, fueron ligados los adaptadores de EcoRI para facilitar la clonación. Después de la fosforilación del cADN adaptado con EcoRI, los ligadores no ligados fueron removidos mediante cromatografía en columna. El cADN resultante fue ligado en el vector de expresión pre-digerido con EcoRI, pBluescript II (Stratagene, La Jolla, EUA) y la mezcla de ligadura transformada a células competentes Top 10 (Invitrogen). El extremo terminal 5' de la secuencia ToTV fue determinado utilizando el Sistema 5 ' RACE para la Amplificación Rápida de Extremos de cADN (LifeTechnologies) utilizando dCTP de acuerdo a las instrucciones del fabricante .

Análisis de cADN Después de la transformación, los clones recombinantes fueron analizados para la presencia de insertos mediante PCR utilizando cebadores específicos de T3 y T7. Los productos de PCR fueron analizados para tamaño sobre un gel de agarosa al 1%. Los clones que contienen los insertos de aproximadamente 1500 nucleótidos fueron utilizados para el análisis de secuencia posterior. Los datos de la secuencia resultantes fueron analizados utilizando el paquete de programa DNASTAR.

Determina ción de las secuencias de aminoácidos de las tres proteínas de cápside de ToTV Las partículas de ToTV purificadas fueron cargadas sobre un gel de PAGE desnaturalizante y las proteínas de cápside fueron separadas. Las bandas de proteina de cápside separadas fueron aisladas del gel, tratadas con tripsina y las digestiones fueron analizadas utilizando un espectrómetro de masa en tándem (MSMS) utilizando esencialmente el método como se describe por Kinter & Sherman, 2000. Esto dio como resultado una secuencia de aminoácidos (AA) de péptidos pequeños, cada uno de los cuales mostró homología con la secuencia de aminoácidos predicha de la secuencia nucleotidica ARN2 del ToTV. La comparación con otros datos de la secuencia viral fue realizada con programas del paquete PHYLIP.

Resultados Transmisión y propaga ción del virus Para la propagación de ToTV, se pudo utilizar N. glutinosa y N. benthamina . Las especies de tabaco N. hesperis '67A' y N. occiden tales ' Pl ' son muy susceptibles a ToTV y mostraron síntomas después de 3 a 4 dias. Estas especies de tabaco se volvieron muy necróticas en corto tiempo y fueron por lo tanto consideradas más adecuadas como planta indicadora que como hospedero de propagación. N. gl utinosa y N. bethamiana reaccionan con lesiones cloróticas locales y una clorosis sistémica, y de formación leve de las hojas .

Purifi ca ción del virus La purificación de los viriones a partir del tejido infectado de la hoja se volvió más bien difícil. ToTV no puede resistir solventes orgánicos y tiende a agregarse cuando es centrifugado a bajas temperaturas. El protocolo de purificación utilizado (ver 1.2) dio como resultado dos bandas que contienen virus, visibles, en el gradiente de sulfato de cesio. Las bandas aparecieron en la parte inferior del gradiente, indicando una densidad más bien altamente boyante en Cs2S0 igual a o mayor de 1.4 g/cm2. La infectividad de ToTV es afectada por el sulfato de cesio, pero no completamente perdida cuando la concentración del virus en el material inicial fue alta. Las fracciones de las bandas de virus que contienen el gradiente de sulfato de cesio, fueron ambas infecciosas. La infectividad de las bandas individuales no fue determinada.

Mi croscopía electróni ca Las dos bandas fueron examinadas con microscopio electrónico y ambas contenían partículas virales de aproximadamente 28 nm de diámetro (Figura 2) .

Análisis de PAGE La Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (PAGE) de las fracciones virales purificadas, seguida por tinción con plata del gel mostró tres proteínas de cápside (CP) de aproximadamente 28, 26 y 35 kDa (ver Figura 3, indicando las fracciones superior (TAgV-T) e inferior (TAgV-B) del virus purificado) .

Aislamien to del ácido nuclei co y análisis del cADN El aislamiento del ARN de ambas bandas del virus reveló conjuntamente dos ARNs: aproximadamente 5.5 kb y 8 kb (ver Figura 4) . El aislamiento del ARN de la banda superior dio como resultado un fragmento de ARN de 5.5 kb únicamente. El ARN de 5.5 kb proveniente de la banda superior fue utilizado como la plantilla para la sintesis y clonación del cADN . Las reacciones de la secuencia fueron realizadas utilizando cebadores de secuencia delanteros e inversos (T3/T7 o M13F/M13R) sobre diferentes clones. Una Amplificación Rápida 5' de los Extremos de cADN (RACE) fue realizada para determinar el extremo 5' exacto del ARN. El análisis de los datos de la secuencia resultantes, utilizando el paquete de software Lasergene® (DNASTAR, Inc., Madison, WI, EUA), dio como resultado la secuencia completa del ARN2 del virus (SEQ ID NO: 1, ver Figura 5) . El tamaño del ARN es de 5389 nucleótidos excluyendo la cola poli A. Sobre el ARN se encuentran dos estructuras de lectura abierta (ORFs por sus siglas en ingles) . ORF1 está localizada desde el nucleótido 182 hasta el 742, y es de 561 nucleótidos de longitud, y codifica para una proteina de 187 aminoácidos. No fueron encontradas homologías para esta secuencia en la base de datos NCBI a nivel de la proteina y de los nucleótidos . Los tramos ORF2 desde el nucleótido 702 hasta el 4298, es de 3597 nucleótidos de longitud, y codifica para una proteina de 1199 aminoácidos. Después de una búsqueda BLAST en la base de datos NCBI, fueron encontradas bajas homologías con varias poliproteinas virales. Para las homologías encontradas, los números de acceso provenientes de la base de datos NCBI son proporcionados junto con el nombre del virus y el tipo de proteina. Las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos derivadas en las tres estructuras de lectura, fueron utilizadas en el análisis BLAST. MAPDRAW del paquete de software Lasergene® se utilizó para identificar las ORFs.

Mapas de ORF de ambos ARNs : ARNÍ El ARNÍ contiene un ORF (0RF1) con porciones típicas de la helicasa, la ARN-polimerasa dependiente de ARN (RdRp) . Además de un bajo nivel de homología de secuencia de aminoácidos (aa) se observó con un co-factor de proteasa (Pro-Co) del virus mosaico suave del Pa tchouli (PatMMV) (NP647592.1 ) , para las posiciones de los aminoácidos 106-338, con una identidad de 22%. Las porciones A de helicasa típicas (GKS) , B (D), C (N) fueron identificadas en las posiciones de los aminoácidos 398-400, 444 y 495 del péptido putativo. Para la región de helicasa fueron encontradas identidades más estrechas con el virus esférico tungro del arroz (RTSV; 42% idéntico en un traslape de 140 aminoácidos) , el virus enano clorótico del maíz (MCDV; 43% idéntico en un traslape de 137 aminoácidos), el virus de la mota de la fresa (SMoV; 42% idéntico en un traslape de 135 aminoácidos) y el virus de la peca amarilla de la Chiviría (PYFV; 42% en un traslape de 138 aminoácidos) . En la región VpG putativa no se encontró similitud de secuencia con otros virus. La más alta similitud en la proteasa es encontrada para los aminoácidos 1000-1100, es encontrada 25% de identidad con el virus V de la Papa (PVV; proteasa Nía con un traslape de 86 aminoácidos). La región RdRp entre las porciones I (KDE) a VII (FLSR) fue encontrada entre los aminoácidos 1303-1554 (Koornin 1991) . Las más estrechas identidades de la secuencia poliproteica fueron encontradas con: el virus esférico tungro del arroz (RTSV) con 29% de identidad en un traslape de 751 aminoácidos, el virus enano clorótico del maíz (MCDV) con 28% de identidad en un traslape de 742 aminoácidos, el virus de la peca amarilla de la Chiviría (PYFV) con una identidad de 33% en 501 aminoácidos, el virus esférico latente de la manzana (ALSV) con 32% de identidad en 472 aminoácidos, el virus de la mota de la fresa (SMoV) con 30% de identidad en 680 aminoácidos y el virus de la hoja rasgada de la cereza (CRLV) con 33% en 465 aminoácidos.

Tabla 2. Niveles generales de homología (en porcentaje) entre las porciones RdRp en ORFl sobre el ARNÍ de ToTV con las porciones RdRp de otros virus de plantas .

Nimv= Virus del moteado infeccioso de la naranja de ombligo (Sdwa); PYFV=virus de la peca amarilla de la Chiviría ( Sequ ivirus ) ; RTSV= virus esférico del arroz tungro (Wa ikavi rus ) ; SDV= virus enano Satsumae ( Sadwavirus ) ; SMoV= virus de la mota de la fresa ( Sadwavirus ) ; ToTV= virus torrado del tomate (género propuesto); ALSV= virus esférico latente de la manzana (Cheravirus ) ; CRLV= virus de la hoja rasgada de la cereza (Cheravirus); MCDV= virus enano clorótico del maíz (Wa ikavirus ) . Tabla 3. Niveles generales de homología (en porcentaje) entre las porciones de helicasa en ORFl sobre el ARNÍ de ToTV con las porciones de helicasa de otros virus de plantas PYFV= virus de la peca amarilla de la Chiviría (Sequivirus) ; RTSV= virus esférico del arroz tungro (Waikavirus) ; SDV= virus enano Satsumae (Sadwavirus) ; SMoV= virus de la mota de la fresa (Sadwavirus) ; ToTV= virus torrado del tomate (género propuesto) ; ALSV= virus esférico latente de la manzana (Cheravirus) ; CRLV= virus de la hoja rasgada de la cereza (Cheravirus) ; MCDV= virus enano clorótico del maíz (Waikavirus) .

ARN2 El ARN2 contiene dos ORFs potenciales (Figura 7) .

ORFl codifica para una proteína predicha de 187 aminoácidos con un peso molecular de 20 kDa. El análisis de la secuencia no reveló homologías con ninguna proteina de la base de datos EMBL. No se sabe si esta ORF codifica para una proteina efectiva . La segunda ORF que se traslapa parcialmente con la ORFl comienza con tres codones de inicio ATG intraestructurales . Ésta codifica para una proteina putativa de 1198 aminoácidos con un peso molecular predicho de 134 kDa. La identificación de la proteina mediante espectrometría de masa de la proteina de recubrimiento aislada, mapea claramente los tres cistrones proteina de recubrimiento en el extremo C del ARN2-ORF2. La región N-terminal de la poliproteina ARN2-ORF2 codifica más probablemente para la proteina de movimiento putativa (MP) , ya que una porción LRVPML altamente similar a la secuencia de consenso LxxPxL de la proteina de movimiento propuesta (Mushegian, 1994) fue encontrada en la posición de los aminoácidos 262-267. No fueron encontradas otras homologías de secuencia en el extremo N de la ORF2 del ARN2. La ORF2 codifica putativamente cuatro proteínas que deben ser escindidas del precursor de poliproteina de escisión proteolítica . No obstante, no pudieron ser identificadas homologías aparentes con los sitios de escisión de poliproteina conocidos. Las posiciones exactas de estos sitios de escisión quedan por ser determinadas.

Para la secuencia de la poliproteina CP1 se encontró únicamente alguna homología con el parechovirus humano (HPeV) con 21% de identidad en 103 aminoácidos. Las identidades más estrechas de la secuencia de poliproteina CP2 fueron encontradas con: el virus Rhopalasiphun padi (RhPV) con 25% de identidad en 168 aminoácidos, el virus de la encef alomieli tis aviar (AEV) con 33% en 74 aminoácidos, el virus de la célula reina negra (BQCV) con 43% de identidad en 37 aminoácidos y el virus de Solenopsis invi cta (SINV-1) con 30% de identidad en 51 aminoácidos. Con la secuencia de poliproteina CP3 no fueron encontradas homologías.

Regiones no traducidas (UTRs) Las 3 'UTRs del ARNÍ y el ARN2 son de 1210 nucleótidos y 1092 nucleótidos respectivamente. Existe 98% de identidad en los 988 nucleótidos finales de ambos ARNs. Para confirmar que las regiones 3' de las UTRs de ambos ARNs son idénticas, se realizaron RT-PCRs sobre el ARN viral total con un cebador inverso derivado de la región 3' -UTR idéntica y dos cebadores delanteros específicos del ARN. Los productos de PCR resultantes fueron secuenciados. A partir de estos resultados, se concluyó lo siguiente: el virus aislado de las plantas de tomate y tentativamente nombrado virus torrado del tomate (ToTV) tiene partículas esféricas (icosahédricas) de aproximadamente 28 nm de diámetro. Después de la purificación el virus muestra al menos dos bandas en un gradiente de sulfato de cesio. Ambas bandas combinadas son infecciosas cuando son inoculadas sobre plantas de tabaco. Las partículas virales parecen consistir de al menos tres proteínas de cápside de aproximadamente 23, 26 y 35 kDa. La fracción superior del gradiente de sulfato de cesio del virus contiene una molécula de ARN de aproximadamente 5.5 kb (ARN2; SEQ ID NO: 1) y la fracción inferior de una molécula de ARN de aproximadamente 8 kb (ARNÍ; SEQ ID NO: 2) . La sintesis del cADN y la clonación del mismo, utilizando el ARN de 5.5 kb a partir de la fracción viral superior, y el análisis subsiguiente de la información de la secuencia, dio como resultado la recopilación de varios contiguos en la SEQ ID NO: 1. Dos contiguos contenían claramente una cola poli-A, sugiriendo que el ARN viral tiene una cola poli-A. El análisis BLAST de los nucleótidos y las secuencias de aminoácidos derivadas no reveló ninguna homología significativa con ningún virus conocido de la base de datos EMBL. La información anterior indica que ToTV es un nuevo virus y hasta ahora no descrito. La información obtenida hasta ahora no permite un agrupamiento del virus en una familia o género de virus particular.

Para fines de detección e identificación del virus, han sido diseñados dos grupos de cebadores de RT-PCR (Tabla 4) con base en la secuencia de la SEQ ID NO: 1.

Tabla 4. Cebadores de RT-PCR para la detección de ToTV Un Protocolo de RT-PCR adecuado podria comprender lo siguiente. El ARN total es aislado y purificado a partir de aproximadamente 100 µg del material de hoja infectada utilizando un kit de purificación de ARN, tal como por ejemplo Qiagen RNA-Easy. De este ARN total, una cantidad de aproximadamente 1 µg es utilizada en una mezcla de reacción de 50 µl de la reacción de RT-PCR Superscript One-Step Superscript de un solo paso (Invitrogen), cuya mezcla de reacción comprende además 25 µl de la mezcla de reacción 2x, 1 µl (100 ng) del cebador superior y del cebador inferior, 1 µl de la mezcla RT/Taq y 22 µl de agua MilliQ. Con el fin de transcribir inversamente el ARN en cADN y amplificar este cADN, puede ser utilizado el siguiente programa de RT-PCR: Paso 1: 30 minutos a 50°C (reacción en transcripción inversa); Paso 2: 3 minutos a 94°C (activación de la polimerasa taq); Paso 3. 30 segundos a 94 °C; Paso 4: 30 segundos a 55°C; Paso 5: 1 minuto a 72°C; Paso 6: Repetir los pasos (3 al 5) 40x; Paso 7: 10 minutos a 72°C; Paso 8: 10°C siempre y cuando sea necesario. Los productos de PCR pueden ser analizados sobre un gel de agarosa al 1% en amortiguador TAE o TBE. 2. 6. De termina ción de la s secuencia s de aminoácidos de tres pro teína s de cápside de ToTV Los fragmentos de la proteina de recubrimiento más grande (CP1: aproximadamente 35 kDa) pudieron ser alineados con partes de un área en la ORF2 del ARN2 (AA 487-729) . Los fragmentos de la banda de proteina de recubrimiento intermedia (CP2: aproximadamente 25 kDa) pudieron ser alienados con un área de ORF2 del ARN2 entre los aminoácidos 730 y 983. Los fragmentos de la proteina de recubrimiento más pequeña (CP3: aproximadamente 23 kDa) pudieron ser alienados con el extremo C de la 0RF2 del ARN2 (AA 984-1195) . A partir de estos resultados se puede concluir que las secuencias de codificación de las tres proteínas de cápside están localizadas sobre la 0RF2 del ARN2 (5.5 kb) de ToTV, y de este modo que las moléculas de ARN virales aisladas son parte de las partículas del virus ToTV.

Ejemplo 2. Aislamiento y caracterización del agente causal de la marchitez En 2003, plantas de tomate desarrolladas en América Central (México y Guatemala) con síntomas similares a los síntomas de ToTV fueron encontradas. Se sospechó que el agente causal era viral. La enfermedad es localmente conocida bajo el nombre de "Chocolate" "Marchitez (virus)" o "enfermedad de la mancha de Chocolate". Las plantas susceptibles desarrolladas en el campo se llegaron a infectar fuertemente a partir del año 2003 en adelante. La meta de la presente investigación fue comparar la secuencia del virus hasta ahora desconocido que provocaba la "enfermedad de la mancha de Chocolate" a la secuencia del ToTV como se aisló en el E j emplo 1.

Métodos El ARN fue aislado de aproximadamente 100 µg del material de hoja infectado con la "enfermedad de la mancha de Chocolate" utilizando el Sistema de Aislamiento de ARN Total (Promega SV 96) . Dos µl del ARN total fueron utilizados en una mezcla de reacción de 50 µl de la reacción de RT-PCR de un solo paso Superscript (Invitrogen), cuya mezcla de reacción comprende además 25 µl de la mezcla de reacción 2x, 1 µl (100 ng) del cebador delantero y del cebador inverso, 1 µl de la mezcla RT/Taq y 22 µl de agua MilliQ. Con el fin de transcribir inversamente el ARN en cADN y amplificar este cADN, se utilizó el siguiente programa de RT-PCR: Paso 1: 30 minutos a 50°C (reacción de transcripción inversa); Paso 2: 3 minutos a 94°C (activación de polimerasa Taq); Paso 3: 30 segundos a 94°C; Paso 4: 30 segundos a 55°C; Paso 5: 1 minuto a 72°C; Paso 6: Repetir los pasos (3 a 5) 40x; Paso 7: 10 minutos a 72°C; Paso 8: 10°C siempre y cuando sea necesario. Los productos de PCR fueron analizados sobre un gel de agarosa al 1% en amortiguador TAE o TBE. Diferentes grupos de cebadores fueron utilizados en la RT-PCR, los cuales se sabe que se recocen en diferentes sitios con el ARNÍ o el ARN2 del genoma de ToTV.

Tabla 5. Cebadores de RT-PCR basados en la secuencia del ARN2 de ToTV utilizado para la caracterización de los virus causales de la enfermedad de la mancha de Chocolate como se utiliza en el Ejemplo 2 y como se indica en la Figura 7 Resultados Los grupos de cebadores utilizados promovieron la amplificación de parte de la secuencia de ToTV como se esperaba, pero el uso de cuatro diferentes grupos de cebadores basados en la secuencia del ARN-2 (P1048/1049, P1056/1057, P1060/1061 y P1064/1065) en la RT-PCR, dio también como resultado la amplificación de parte del genoma de la "enfermedad de la mancha de Chocolate". El sitio de recocido de estos grupos de cebadores se ilustra en la Figura 1. El producto de RT-PCR de los cuatro grupos de cebadores que amplificaron los fragmentos de la "enfermedad de la mancha de Chocolate" fueron secuenciados, y mostraron 100% de identidad con las partes correspondientes de la secuencia del genoma viral del virus como se describe en el Ejemplo 1.

LEYENDAS A LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una fotografía de los síntomas de la enfermedad ToTV sobre las hojas de una planta de tomate . La Figura 2 muestra una microfotografia electrónica de las partículas de ToTV purificadas. Las partículas son de aproximadamente 28 nm de diámetro. La Figura 3 muestra el resultado de un gel de PAGE teñido con plata de las fracciones superior (TAgV-T) e inferior (TAgV-B) del virus ToTV purificado, indicando las tres proteínas de cápside de aproximadamente 23, 26 y 35 kDa. La Figura 4 muestra el resultado de la electroforesis de gel de agarosa desnaturalizante. Los tamaños de los segmentos son indicados en kilobases (kb) . El gel fue teñido utilizando azul de orto-toluidina . M: estándar de tamaño molecular. TAgV: 1 µg de ARN de ToTV aislado . La Figura 5 muestra la secuencia completa de la molécula de ARN2 de ToTV (SEQ ID NO: 1). La Figura 6 muestra la secuencia completa de la molécula de ARNÍ de ToTV (SEQ ID NO: 2) . La Figura 7 muestra la estructura general del virus ToTV indicando el sitio de recocido de los diversos grupos de cebadores como se utilizan en el Ejemplo 2 al ARN2.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un virus de planta llamado virus torrado del tomate (ToTV) , caracterizado porque es depositado con la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 Noviembre del 2004 bajo el número de referencia de depositarios ToTV-EOl (DSM 16999) .

2. Un virus, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, y secuencias que tienen una homología de secuencia de nucleótidos de al menos 50% a ésta.

3. El virus de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque está asociado con las enfermedades del tomate conocidas bajo los nombres de "Torrado", "Marchitez" y/o "enfermedad de la mancha de Chocolate", y/o en donde el virus, basado en el análisis taxonómico numérico de los descriptores taxonómicos esencialmente como se define en la Tabla 1, muestra que está más estrechamente relacionado al virus como se define de conformidad con la reivindicación 1, que a cualquier otro virus, y en donde el virus está asociado con una enfermedad que provoca lesiones necróticas en el tomate.

4. Un ácido nucleico aislado recombinante o el fragmento especifico de ToTV del mismo, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, secuencias que tienen una homología de secuencia nucleotidica de al menos 50% a la SEQ ID NO: 1 o a la SEQ ID NO: 2, y sus hebras complementarias y fragmentos específicos de ToTV de las mismas.

5. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4.

6. Un polinucleótido, caracterizado porque es capaz de hibridarse bajo condiciones severas a un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4.

7. Un polipéptido aislado o recombinante, caracterizado porque es obtenible a partir de un virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un fragmento del mismo, especifico de ToTV.

8. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de las proteínas de cápside de 23, 26 y 35 kDa, la helicasa, la ARN-polimerasa dependiente del ARN, y la proteina de movimiento putativa (MP) de ToTV y fragmentos de la misma específicos de ToTV.

9. Un antigeno, caracterizado porque comprende un polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 7 u 8.

10. Un anticuerpo, caracterizado porque es específicamente dirigido contra el antigeno de conformidad con la reivindicación 9.

11. Un método para producir un anticuerpo contra ToTV, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar un virus ToTV, o una proteina o fragmento peptidico de la misma; b) inmunizar un hospedero vertebrado apropiado con el virus, la proteina o el fragmento peptidico, y c) cosechar de la sangre o los esplenocitos del hospedero vertebrado, los anticuerpos contra el virus, la proteina o el fragmento peptidico.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende además los pasos de seleccionar un esplenocito productor de anticuerpo, la fusión del esplenocito a una linea celular hibridoma inmortalizada, y permitir que la fusión de hibridoma produzca anticuerpos monoclonales .

13. Un anticuerpo, caracterizado porque es obtenible mediante un método de conformidad con la reivindicación 11 ó 12.

14. Un método para identificar un aislado viral como un virus ToTV, caracterizado porque comprende la reacción del aislado viral o un componente del mismo, con un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10 ó 13.

15. El método para identificar un aislado viral como un virus ToTV, caracterizado porque comprende la reacción del aislado viral o un componente del mismo, con un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6.

16. Un método para detectar la presencia de ToTV en una muestra, caracterizado porque comprende determinar en la muestra la presencia de un virus ToTV o componente del mismo, mediante la reacción de la muestra con un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6, o un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10 ó 13.

17. Un método para identificar una planta resistente a ToTV, caracterizado porque comprende los pasos de: a) exponer una planta o parte de la planta a una dosis infecciosa de ToTV, y b) identificar la planta como una planta resistente a ToTV cuando, después de dicha exposición: los síntomas de la enfermedad en la planta o en la parte de la planta permanecen ausentes o bien están retardados en la expresión, o son al menos reducidos en severidad o son localizados con relación a una planta control susceptible, y/o el virus ToTV o las secuencias genómicas de ToTV no están presentes en la planta o en la parte de la planta, o la presencia del virus ToTV es al menos cuantitativamente reducida con relación a una planta control susceptible.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque en el paso b) la presencia de ToTV en la planta o en la parte de la planta es determinada mediante la realización de un método de conformidad con la reivindicación 16.

19. Un método para producir una planta resistente a ToTV, caracterizado porque comprende los pasos de: a) identificar una planta donadora resistente a ToTV mediante la realización de un método de conformidad con la reivindicación 17 ó 18, b) cruzar la planta donadora resistente a ToTV con una planta recipiente, y c) seleccionar de las plantas de progenie, una planta resistente mediante la realización de un método de conformidad con la reivindicación 17 ó 18.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la planta donadora es una planta de la familia Solana ceae o Cucurbi ta ceae .

21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la planta donadora es una planta de tomate, una planta de berenjena, una planta de pimiento, una planta de melón, una planta de sandia o una planta de pepino.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque la planta recipiente es una planta de la familia Solana ceae o Cucurbi taceae .

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque la planta recipiente es una planta de tomate, una planta de berenjena, una planta de pimiento, una planta de melón, una planta de sandia o una planta de pepino.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque la planta recipiente es una planta de tomate de la especie Solanum lycopersi cum, más preferentemente una linea de S. lycopersicum que posee características comercialmente deseables .

25. Una planta resistente a ToTV, o parte de la misma, caracterizada porque es obtenible mediante un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24.

26. Un kit de diagnóstico para realizar un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende al menos un componente seleccionado del grupo que consiste de un virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6, un polipéptido de conformidad con la reivindicación 7 u 8, un antigeno de conformidad con la reivindicación 9 y un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10 ó 13.

27. El uso de un virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6, un polipéptido de conformidad con la reivindicación 7 u 8, un antigeno de conformidad con la reivindicación 9, o un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10 ó 13, para la producción de una composición de diagnóstico.

28. Una composición de diagnóstico, caracterizada porque comprende un virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6, un polipéptido de conformidad con la reivindicación 7 u 8, un antigeno de conformidad con la reivindicación 9 o un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10 ó 13.

29. El uso de un virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, su genoma o partes del mismo que confieren resistencia, como agente antiviral.

30. El uso de un virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o su genoma, o partes del mismo como vector de expresión.

31. El uso de una forma atenuada de un virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o su genoma, o parte del mismo, para la premunición de una planta .