MX2007008128A

MX2007008128A - Anticuerpos frente al receptor alfa-1 de il-13 y sus usos.

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Publication number: MX2007008128A
Application number: MX2007008128A
Authority: MX
Inventors: Adelbert Grossmann; Stefan Seeber; Jan Van De Winkel; Paul Parren; Yvo Graus; Frank Rebers; Ralf Schumacher; Martine Van Vugt; Kay-Gunnar Stubenrauch; Josef Endl; Maria Fuentes; Sebastian Neumann; Joerg Regula; Jan Stracke; Sandra Vereecken-Verploegen
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2005-01-03
Filing date: 2006-01-02
Publication date: 2007-07-20
Also published as: CR9209A; AR051888A1; RU2413736C2; JP5086098B2; EP1836226A1; TW200635945A; US20110086026A1; ATE513855T1; KR100934894B1; AU2006204480B2; AU2006204480A1; KR20070091180A; EP1836226B1; RU2007129676A; CA2592614A1; TW200902555A; BRPI0606368A2; MA29226B1; SG172504A1; CA2592614C

Abstract

El anticuerpo con union a IL-13R(1, inhibiendo la bioactividad de IL-13 y que contiene unas cadenas variables pesada y ligera, caracterizadas porque la secuencia de aminoacido de la region variable de la cadena pesada CD3 del anticuerpo es seleccionada a partir del grupo de secuencias de cadena pesada CD3 SEC ID NO: 1, 3, 5, 7 o 9 es util en el tratamiento del asma y las enfermedades respiratorias.

Description

ANTICUERPOS FRENTE AL RECEPTOR ALFA-1 DE IL-13 Y SUS USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención hace referencia a anticuerpos humanos frente al receptor alfa- 1 de IL-13 ( IL-13Ra (alfa ) l ) , los métodos para su producción y sus usos . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La IL-13 es un péptido monomérico secretado y producido básicamente por las células Th2 , pero también a través de células de mástil y las células NK . Las funciones biológicas de IL-13 incluyen la regulación de la producción de IgE y la modulación del desarrollo de las Th2 . IL-13 se une a un receptor complej o que consiste en una cadena alfa-1 receptora de IL-13 ( Il-13Ral ) y una cadena alfa receptora de IL-4 (IL-4RCC) . La unión de IL-13 activa una serie de transducciones de señal mediadas principalmente por STAT6. IL-13 se une con baja afinidad a IL-13RC& aislado y no se une a IL-4Ral . Por el contrario, IL-4 se une a IL-4Ra aislado y no se une a IL-13RC-1 aislado. Se ha descrito otro receptor para IL-13 , el IL-13Ra2 . IL-13 se une a este receptor con alta afinidad. Es probable que este receptor actúe como receptor señuelo. La sobre-expresión inducible de IL-13 en ratones transgénicos genera un fenotipo que comparte muchas características con los pacientes asmáticos . Éstos muestran metaplasia del moco e inflamación rica en macrófagos , Ref . 183571 linfocitos y eosinófilos, regulación positiva de proteasas como MMP-9, -12, -13, -2 y -14, catepsina B, H, K y S, presentando también fibrosis sub-epitelial . Los ratones con el gen para IL-13 anulado muestran una reducción significativa en la producción de citocinas tipo Th2 debido a la disminución del desarrollo de Th2. Estos ratones no desarrollan hiperactividad de las vías respiratorias (AHR, por sus siglas en inglés) a pesar de la presencia de inflamación con eosinófilos. La AHR se recupera mediante la administración de IL-13, indicando que IL-13 es necesaria y suficiente para la inducción de AHR en el ratón. Otras funciones biológicas importantes de IL-13 en relación con el asma incluyen la inducción de metaplasia y producción de moco de las células caliciformes. Actúa directamente sobre las células epiteliales de las vías respiratorias, fibroblastos y células del músculo liso, induciendo diferentes programas transcripcionales en cada uno de estos tipos celulares. Cabe destacar que la IL-13 disminuye la respuesta a-adrenérgica en las células del músculo liso, contribuyendo a un estrechamiento de las vías respiratorias. El polimorfismo del promotor de IL-13 se asocia con un aumento del riesgo de asma alérgica. Los polimorfismos en el gen de IL-13 se asocian con altos niveles de IgE en el suero. Los polimorfismos de un único nucleótido en la secuencia intergénica entre los genes de la IL-4 y de IL-13 se asocian con asma atópica.

Los antagonistas de IL-13 han sido utilizados en modelos de animales. Por ejemplo, se ha demostrado que una proteína de fusión soluble IL-13Ra2-IgGFc consigue revertir la AHR inducida por ovoalbúmina en ratón y reducir el número de células productoras de moco. La reversión se obtuvo incluso cuando el tratamiento se administra tras un completo desarrollo del fenotipo. Además, el tratamiento de ratones con una molécula de fusión entre IL-13 y una citotoxina di como resultado una reducción de todas las características de la enfermedad de las vías respiratorias propias de una inflamación alérgica crónica inducida con hongos. En conclusión, la IL-13 es una mediadora clave en el disparo de la respuesta alérgica. IL-13Ral es un miembro de la superfamilia de receptores de la hematopoyetina (familia de receptores de citocinas tipo 1) y fue identificado y descrito por Obiri N. I., y otros, J. Biol. Chem., 270 (1995) 8797-8804) y en la WO 96/29417. Es una proteína de 427 aminoácidos incluyendo la secuencia señal. Las secuencias de ADN y proteína se describen en la WO 97/15663 y en la SwissProt N2 P78552. IL-13RCC1 es una proteína glicosilada que se une a IL-13 con una baja afinidad, pero, cuando se une con IL-4Ra formando un heterodímero, se une a IL-13 con alta afinidad. Este complejo también es receptor para IL-4. Los anticuerpos frente a IL-13R0C1 están descritos en WO 96/29417, WO 97/15663, WO 03/080675, Graber P., y otros, Eur. J. Immunol . , 28 (1998) 4286-4298; Poudrier J., y otros, J. Immunol., 163 (1999) 1153-1161; Poudrier J., y otros, Eur. J. Immunol . , 30 (2000) 3157-3164; Aikawa M. , y otros, Cytokine, 13 (2001) 75-84. Los anticuerpos frente al IL-13Ra se pueden obtener comercialmente de R&D Systems Inc. USA. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención comprende un anticuerpo que se une a IL-13Ral y que inhibe la bioactividad de IL-13, se caracteriza porque la secuencia de aminoácido de la parte variable de la cadena pesada CDR3 , se selecciona a partir del grupo de secuencias de la cadena pesada CDR3 compuesto por las Secuencias con Ne ID: 1, 3, 5, 7 o 9. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo humano . El anticuerpo se caracteriza preferiblemente por una afinidad de unión a IL-13Ral de 10"9 M (KD) o menor, preferentemente de 10~9 a 10"13 M. El anticuerpo se caracteriza preferiblemente por tener unas secuencias para sus cadenas pesadas CDRl, CDR2 y CDR3 seleccionadas a partir del grupo que incluye a las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 con N2 de ID: 1, 3, 5, 7 o 9. El anticuerpo se caracteriza preferiblemente por que las secuencias para la parte variable de sus cadenas ligeras CDRl, CDR2 y CDR3 seleccionadas a partir del grupo que incluye a las secuencias para las cadenas ligeras CDRl, CDR2 y CDR3 con N2 de ID: 2, 4, 6, 8 o 10. El anticuerpo se caracteriza preferiblemente por que la secuencia de aminoácido de la parte variable de la cadena pesada CDRl, CDR2 y CDR3 del anticuerpo se seleccionan a partir del grupo que incluye a las secuencias CDR con N2 de ID: 1, 3, 5, 7 o 9 y por que las secuencias para la parte variable de las cadenas ligeras CDRl, CDR2 y CDR3 del citado anticuerpo son seleccionadas a partir del grupo que incluye a las secuencias para las cadenas ligeras CDR con N2 de ID: 2, 4, 6, 8 o 10. Las secuencias CDR se seleccionan preferiblemente de forma independiente una de otra y están separadas mediante regiones FR (marco) . El anticuerpo se caracteriza preferentemente por contener como CDR para la cadena pesada los CDR con Na de ID de Sec: 1 y como CDR para la cadena ligera a los CDR con Na de ID de Sec : 2 , como CDR para la cadena pesada los CDR con N2 de ID de Sec: 3 y como CDR para la cadena ligera a los CDR con N2 de ID de Sec: 4, como CDR para la cadena pesada los CDR con N2 de ID de Sec: 5 y como CDR para la cadena ligera a los CDR con N2 de ID de Sec: 6, como CDR para la cadena pesada los CDR con N2 de ID de Sec: 7 y como CDR para la cadena ligera a los CDR con N2 de ID de Sec: 8 o como CDR para la cadena pesada los CDR con N2 de ID de Sec : 9 y como CDR para la cadena ligera a los CDR con N2 de ID de Sec: 10. Las secuencias para los CDR pueden determinarse de acuerdo con la definición estándar de Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immonological Interest, 5a ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . Sobre esta base, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las secuencias con N2 de ID: 1-8 tiene las siguientes secuencias: Los CDR de cadena pesada: CDRl (aa 31-35) de N2 ID SEC: 1, 3, 5, 7, 9, CDR2 (aa 50-66) de N2 ID SEC: 1, 3, 5, 7, 9, CDR3 (aa 99-108) de N2 ID SEC: 1, 3, 9, CDR3 (aa 99-107) de N2 ID SEC: 5, CDR3 (aa 99-112) de N2 ID SEC: 7; Los CDR de cadena ligera: CDRl (aa 24-34 ) de Na ID SEC: 2, 4, 6, 10, CDRl (aa 24-35 ) de N2 ID SEC: 8, CDR2 (aa 50-56) de N2 ID SEC: 2, 4, 6, 10, CDR2 (aa 51-57) de N2 ID SEC: 8 y CDR3 (aa 89-97) de N2 ID SEC: 2, 4, 6, 10, CDR3 (aa 90-97) de Na ID SEC: 8. Preferentemente, la invención proporciona un anticuerpo que comprende como regiones determinantes de complementariedad (CDR) a las siguientes secuencias: a) una cadena pesada de anticuerpo que incluye las CDR de cadena pesada con SEC ID NO : 1, 3, 5, 7 o 9; b) una cadena ligera de anticuerpo que incluye las CDR de cadena pesada con SEC ID NO : 2, 4, 6, 8 o 10, donde las CDR se seleccionan de manera independiente una de otra. El anticuerpo se caracteriza preferentemente por contener como región variable de la cadena pesada la SEC con N2 ID: 1 y como región variable de la cadena ligera la SEC con N2 ID: 2, como región variable de la cadena pesada la SEC con N2 ID: 3 y como región variable de la cadena ligera la SEC con N2 ID: 4, como región variable de la cadena pesada la SEC con N2 ID: 5 y como región variable de la cadena ligera la SEC con N2 ID: 6, como región variable de la cadena pesada la SEC con N2 ID: 7 y como región variable de la cadena ligera la SEC con N2 ID: 8 o como región variable de la cadena pesada la SEC con N2 ID: 9 y como región variable de la cadena ligera la SEC con N2 ID: 10. El anticuerpo se caracteriza preferentemente por contener a) como región variable de la cadena pesada la SEC con N2 ID: 1, como región variable de la cadena ligera la SEC con N2 ID: 2, como región constante de la cadena ligera K la SEC con N2 ID: 11 y como región constante de la cadena pesada ?l la SEC con N2 ID: 12, opcionalmente con las mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A, b) como región variable de la cadena pesada la SEC con Na ID: 3, como región variable de la cadena ligera la SEC con N2 ID: 4, como región constante de la cadena ligera K la SEC con N2 ID: 11 y como región constante de la cadena pesada ?l la SEC con N2 ID: 12 opcionalmente con las mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A, c) como región variable de la cadena pesada la SEC con N2 ID: 5, como región variable de la cadena ligera la SEC con N2 ID: 6, como región constante de la cadena ligera K la SEC con N2 ID: 11 y como región constante de la cadena pesada ?l la SEC con N2 ID: 12 opcionalmente con las mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A, d) como región variable de la cadena pesada la SEC con N2 ID: 7, como región variable de la cadena ligera la SEC con N2 ID: 8, como región constante de la cadena ligera K la SEC con N2 ID: 11 y como región constante de la cadena pesada ?l la SEC con Ns ID: 12 opcionalmente con las mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A, o e) como región variable de la cadena pesada la SEC con N2 ID: 9, como región variable de la cadena ligera la SEC con Na ID: 10, como región constante de la cadena ligera K la SEC con Na ID: 11 y como región constante de la cadena pesada ?l la SEC con N2 ID: 12 opcionalmente con las mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A, El anticuerpo se caracteriza preferentemente por su unión a IL-13Ral en competición con los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y/o LC5002-018. El anticuerpo se caracteriza preferentemente por incluir como regiones variables las regiones variables de LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 o LC5002-018. Las regiones variables de estos anticuerpos son las que se muestran en la SEC con Ns ID: 1-10. En el estado de la técnica existen unas regiones constantes muy útiles y bien caracterizadas. En las SEC con ID N2 : 11-12 se muestran algunas de ellas. El anticuerpo es preferentemente monoclonal o producido de forma recombinante. En una modalidad de la invención el anticuerpo es un anticuerpo humano con alteración de clase. En una modalidad preferida de la presente invención el anticuerpo contiene una cadena pesada humana ?l que incluye: a) la secuencia de aminoácido Pro233Val23Ala235 con eliminación de la Gly236 y/o la secuencia de aminoácido Gly327Leu328Pro329Ser330Ser33? b) la secuencia de aminoácido Ala23Ala2 5 o c) los aminoácido Ala265 y Ala297. Preferentemente, de acuerdo con la invención, el anticuerpo inhibe la fosforilación de la Stat-6 inducida por IL-13 con un valor de CI50 de 6nM o menor, inhibe también la producción de eotaxina inducida por IL-13 con un valor de CI50 de 20nM o menor y/o inhibe la proliferación celular inducida por IL-13 o IL-4, preferentemente de células TF-1 (ATCC CRL 2003) con un valor de CI0 de lOnM o menor (IL-13) y 60nM o menor (IL-4) . La fosforilación de Stat-6, producción de eotaxina e inducción de proliferación celular se determinan de acuerdo con los ejemplos 6 al 8. El anticuerpo, de acuerdo con la invención, no se une al IL-13Ral desnaturalizado (KD de unión de 10"6 M o mayor) . El anticuerpo se caracteriza preferentemente por no mostrar reacción cruzada substancial con IL-13R 2 y IL-4Ra (KD de unión de 10~6 M o mayor) . La invención proporciona también líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales antagonistas frente al IL-13R al . Las líneas celulares de hibridoma preferidas de acuerdo con la invención (hu-MAB<h-IL-13R alfa>LC .5002-002 (DSM ACC2709), hu-MAB<h IL-13R alfa>LC .5002-003 ) DSM ACC2710), ), hu-MAB<h IL-13R alfa>LC .5002-005 ) DSM ACC2711), hu-MAB<h IL-13R alfa>LC .5002-007 (DSM ACC2712)) fueron depositadas en el 13-01-2005 en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemania. Los anticuerpos obtenibles de las líneas celulares son modalidades de la invención. La invención proporciona además los ácidos nucleicos que codificas para los polipéptidos que conforman los anticuerpos, vectores de expresión incluyendo dichos ácidos nucleicos y células huésped para la producción recombinante de dichos anticuerpos. La invención también proporciona métodos para la producción recombinante de dichos anticuerpos . Los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención son: a) una cadena pesada de anticuerpo que incluye los CDR de SEC con N2 ID: 1, 3, 5, 7 o 9 y b) una cadena ligera de anticuerpo incluyendo los CDR de SEC con N2 ID: 2, 4, 6, 8 o 10. Estos polipéptidos son capaces de ensamblarse con la otra cadena respectiva de anticuerpo para generar un anticuerpo . Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención, han demostrado ser beneficiosos para pacientes con necesidad de terapia corticoesteroide. Dichos anticuerpos poseen nuevas e innovadoras propiedades que benefician al paciente que sufre asma o enfermedad alérgica. La invención también proporciona métodos para el tratamiento del asma y de las enfermedades alérgicas. La invención incluye además el uso del anticuerpo de acuerdo con la invención para el tratamiento del asma y para la fabricación de compuestos farmacéuticos de acuerdo con la invención. Además, la invención incluye un método para la fabricación de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención. La invención también incluye una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo de acuerdo con la invención con una dosis farmacéutica efectiva, junto con un regulador de pH y/o adyuvante opcional, útil para la formulación de los anticuerpos para finalidades farmacéuticas. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen dichos anticuerpos en un portador aceptable farmacéuticamente. En una modalidad, la composición farmacéutica puede ser incluida en un artículo manufacturado o en un kit. La invención incluye también un vector que contiene un ácido nucleico el cual es capaz de ser expresado en una célula huésped eucariota o procariota. La invención también incluye una célula huésped procariota o eucariota conteniendo el vector de acuerdo con la invención. La invención también incluye un método para la producción recombinante del anticuerpo humano de acuerdo con la invención, caracterizado por la expresión de un ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula huésped procariota o eucariota y la recuperación del anticuerpo de la célula citada. La invención también comprende el anticuerpo obtenible mediante dicho método recombinante. La invención también comprende un método para la preparación de una composición farmacéutica caracterizado por seleccionar un anticuerpo frente a IL-13Ral a partir de una pluralidad de anticuerpos frente a IL-13Ral en relación con tal ensayo sin dicho anticuerpo, produciendo el citado anticuerpo mediante expresión recombinante, recuperando dicho anticuerpo y combinándolo con un regulador de pH y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. El anticuerpo tendrá preferentemente una o más de las propiedades adicionales mencionadas más arriba. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los términos "IL-13Ral, IL-13Ral de murino, IL-13, IL-13Ra2 e IL-4Ra" y sus dominios están bien definidos en el estado actual de la técnica y definidos por ejemplo en SwissProt P78552, 009030, P35225, Q14627 y P24394. Si no se indica lo contrario, los términos "IL-13Ral, IL-13, IL-13Ra2 e IL-4Ra" denotan por lo tanto los polipéptidos humanos IL-13Ral, IL-13, IL-13Ra2 e IL-4Ra. El término "anticuerpo humano", tal y como se usa a partir de aquí, incluye a los anticuerpos que poseen regiones constantes (dominios) que pueden ser asignados a secuencias de inmunoglobulinas pertenecientes a líneas germinales humanas definidas debido a su alta similitud de secuencias o a su identidad con tales secuencias de líneas germinales. Los anticuerpos humanos resultan bien conocidos en la técnica (van Dijk, M.A. , y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374) . Los anticuerpos humanos pueden producirse también en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras ser inmunizados, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. La transferencia de la serie de genes de la inmunoglobulina de la línea germinal humana a la línea germinal de ratones resulta en la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno (véase por ejemplo, Jakobovits, A., y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., y otros, Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M. , y otros, Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Los anticuerpos humanos pueden producirse también el bibliotecas de despliegue de fago (Hoogenboom, H.R., y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., y otros, J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Las técnicas de Colé y otros, y Boerner y otros, están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales (Colé y otros, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); y Boerner, P., y otros, J. Immunol . 147 (1991) 86-95) . Dentro de la definición de anticuerpo humano se incluyen diferentes formas, preferiblemente la de anticuerpos monoclonales, comprendiendo pero no estando limitado a anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos con alteración de clase y anticuerpos modificados genéticamente (anticuerpos mutantes o variantes) mientras se mantengan las propiedades características de la invención. Especialmente preferidos son los anticuerpos recombinantes humanos. El término "anticuerpo monoclonal", tal y como se utiliza en adelante, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo, todas ellas con una composición de aminoácido substancialmente idéntica. El término "anticuerpo recombinante humano", tal y como se usa a partir de aquí, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados mediante métodos recombinantes, tales como los anticuerpos aislados a partir de células huésped tales como NSO o CHO o a partir de animales (por ejemplo, ratón) que son transgénicos para los genes de la inmunoglobulina humana o los anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en la citada célula huésped. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones constantes y variables en disposición reorganizada. Los anticuerpos recombinantes humanos de acuerdo con la invención han sido sujetos a una hipermutación somática in vivo . Por lo tanto, las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que pueden asignarse a secuencias VH y VL determinadas de líneas germinales humanas, pero que pueden no existir de forma natural dentro del repertorio in vivo de las líneas germinales humanas. El término "anticuerpo con alteración de clase" se refiere a un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo humano, que comprende una región variable, la región de unión, que proviene de una fuente de línea germinal y al menos una porción de una región constante que corresponde a una región constante de una fuente de línea germinal diferente, preparada normalmente mediante técnicas de ADN recombinante. Tales anticuerpos con alteración de clase no se encuentran de manera natural y por tanto no se pueden obtener de manera directa a partir de ratones xenoimplantados . Las formas de anticuerpos con alteración de clase incluidas en la presente invención son aquellas en las cuales la región constante presenta diferencias respecto a la secuencia silvestre de la región constante, dando como resultado un anticuerpo con propiedades diferentes de acuerdo con la invención, especialmente en relación con la unión a Clq y/o al receptor Fc (FcR) , ya sea por cambio o mutación del Fc . Los anticuerpos con alteración de clase son el producto de expresión de genes para inmunoglobulina que incluyen fragmentos de ADN que codificas para las regiones variables de la inmunoglobulina y fragmentos de ADN que codificas para las regiones constantes de la inmunoglobulina. Los métodos para la producción de los anticuerpos con alteración de clase implican técnicas convencionales de ADN recombinante y transfección génica, bien conocidas en la técnica (véase, ejemplo Morrison, S.L., y otros, Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; Patentes Estadounidenses números 5.202.238 y 5.204.244). La "región variable" (región variable de la cadena ligera (VL) , región variable de la cadena pesada (VH) ) tal y como se aplica de aquí en adelante, se refiere a la parte de cada par de cadenas ligera y pesada que está directamente implicada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada humanas tiene la misma estructura general y cada dominio está formado por cuatro regiones de marco (FR) cuyas secuencias están ampliamente conservadas, conectadas entre sí por tres "regiones hípervariables" (o regiones determinantes de la complementariedad, CDR) . Las regiones marco adoptan una conformación de hoja ß (beta) y los CDR pueden formar lazos de conexión entre la estructura de lámina ß. Las CDR de cada cadena se mantienen en una estructura tridimensional mediante las regiones marco y forman, en conjunto con las CDR de la otra cadena, el lugar de unión al antígeno. Las regiones CDR3 de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, preferentemente la CDR3 de la cadena pesada, juegan un papel particularmente importante en la especificidad y afinidad de unión de los anticuerpos en concordancia con la invención y por lo tanto constituyen también objeto de la invención. Los términos "región hipervariable" o "porción de unión al antígeno de un anticuerpo" tal y como se utilizan a partir de aquí, hacen referencia a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende los residuos de aminoácido de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" . Las regiones "marco" o regiones "FR" son aquellas regiones de dominio variable aparte de los residuos de la región hipervariable tal y como han sido definidas. Por lo tanto, las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo comprenden, desde el extremo N al C, los dominios FRl, CDRl, FR2, CDR2 , FR3 , CDR3 , y FR4. Las regiones CDR y FR están determinadas de acuerdo con las definiciones estándar dadas por Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5S ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . Los "dominios constantes" no están implicados de manera directa en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero poseen varias funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoácido de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas clases pueden ser a su vez subdivididas en subclases (isotipos) , por ejemplo IgGl, IgG2 , IgG3 , e IgG4, IgAl e IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son las llamadas µ, d, y, a, y e. Los anticuerpos correspondientes a la invención son preferentemente del tipo IgGl . La parte Fc de un anticuerpo está implicada directamente en la activación del complemento, unión a Clq, activación de C3 y unión a receptor de Fc . La unión a Clq viene mediada por unos lugares de unión definidos en la parte Fc . Dichos lugares de unión son conocidos en la técnica actual y definidos por ejemplo en Lukas, T.J., y otros, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. , y Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., y otros, Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., y otros, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., y otros, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M. , y otros, J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., y otros, Immunology 86 (1995) 319-324; y EP 0 307 434. Tales lugares de unión son por ejemplo L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (enumerados de acuerdo con el índice EU de Kabat, ver más abajo). Los anticuerpos de las subclases IgGl, IgG2 e IgG3 suelen tener acción activadora del complemento, unión a Clq y activación de C3 , mientras que los anticuerpos IgG4 no activan el sistema del complemento, no se unen a Cql y no activan a C3. El término "fragmento Fc derivado de origen humano", tal y como se emplea de aquí en adelante, define un fragmento Fc que preferiblemente tiene una secuencia aminoacídica correspondiente al fragmento Fc de un anticuerpo humano de la subclase IgGl, modificado de tal manera que no se puede detectar unión a clq, activación de C3 y/o unión a Fc, o la unión está disminuida al menos en un 50%, preferiblemente en un 70%, en comparación al anticuerpo IgGl humano. El término "parte Fc de un anticuerpo" es bien conocido para el especialista formado, siendo definido en base a la digestión con papaína de los anticuerpos. Los anticuerpos correspondientes a la invención contienen una parte Fc, preferiblemente con una secuencia de aminoácido de una parte Fc derivada a partir de un origen humano y preferiblemente todas las demás partes de las regiones constantes humanas. Preferiblemente la parte Fc es una parte Fc humana mutada a partir de la subclase IgGl . De preferencia prioritaria son las partes Fc que incluyen una región constante ?l de la cadena pesada (un ejemplo se muestra en la SEC con Na de ID: 11) con mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A (W099/51642) . Las cadenas constantes humanas ejemplo las cadenas pesadas ?l están descritas en detalle por Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), y por Brüggemann, M. , y otros, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., y otros, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527. Los dominios constantes preferidos en la invención no tienen unión a complemento. La "región variable" (región variable de la cadena ligera (VL) , región variable de la cadena pesada (VH) ) tal y como se utiliza de aquí en adelante denota cada uno del par de cadenas ligeras y pesadas que están implicadas directamente en la unión del anticuerpo al antígeno El término ácido nucleico o molécula de ácido nucleico, tal y como se utiliza de aquí en adelante, pretende incluir todas las moléculas de ADN y ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser cadena individual o cadena doble, pero preferiblemente es cadena doble. Un ácido nucleico está "ligado operativamente" cuando se sitúa en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o señal de secreción está ligado operativamente al ADN para un polipéptido si es expresado en forma de pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está ligado operativamente a una secuencia que codifica si afecta la transcripción de la secuencia; o un lugar de unión para ribosoma está ligado operativamente a una secuencia que codifica si se posiciona de manera que facilita la traducción. Generalmente, "ligado operativamente" hace referencia a que las secuencias de ADN ligadas están en cis y, en el caso de una señal de secreción, de forma contigua y en pauta de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por que estar contiguos ni en marco de lectura. Esta conexión operativa puede conseguirse por ligación mediante los lugares de restricción adecuados. Si tales lugares no existen, se utilizan los adaptadores de oligonucleótido necesarios de acuerdo con práctica común. Tal y como se usa a partir de aquí, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" pueden aplicarse de manera indistinta y todas estas incluyen la progenie. Por lo tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos de allí derivados sin importar el número de transferencias. Se entiende también que toda la progenie no debe ser idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones inducidas o inadvertidas. Toda la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica definida para la célula transformante original queda incluida. Donde se apliquen designaciones diferentes se pondrá en evidencia a partir del contexto. El término "unión a IL-13Ral" tal y como será utilizado a partir de aquí se refiere a la unión del anticuerpo a IL-13Ral en un ensayo in vi tro, preferiblemente en un ensayo de unión en el cual el anticuerpo se une a una superficie y la unión a IL-13Ral se mide mediante resonancia Plasmática de Superficie (SPR) . La unión está definida por una afinidad de unión (KD) de 10~8 M o menor, preferentemente 10"13 a 10"9 M. "Sin unión" implica una KD de 10"6 M o mayor. Los anticuerpos referentes a la invención se unen al dominio extracelular de IL-13Ral humana y preferiblemente también al IL-13Ral de ratón. La unión a IL-13Ral puede determinarse utilizando el ensayo BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia) . La afinidad de la unión está definida por los términos ka (tasa constante para la asociación del anticuerpo a partir del complejo antígeno/anticuerpo) , kd (tasa de disociación) , y KD (kd/ka) . La unión de IL-13 a IL-13Ral es inhibida por los anticuerpos correspondientes a la invención. La inhibición se mide en términos de CI5o en un ELISA de unión de IL-13 al heterodímero IL-13Ral/IL-4Ra. Para llevar a cabo dicho ensayo el IL-13Ral se inmoviliza y se añaden la IL-13 y el IL-4Ra. Los valores de CI50 de los anticuerpos de acuerdo con la invención para la unión de IL-13 a IL-13Ral no son mayores de 6 nM. Los valores de IC50 se miden como valores de la media o promedio de al menos tres medidas independientes. Es posible que los valores individuales de CI50 estén fuera del intervalo . Los anticuerpos de acuerdo con la invención muestran preferiblemente una unión a los mismos epítopos del IL-13Ral que los anticuerpos seleccionados del grupo consistente en los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 o LC5002-018 o su unión a IL-13Ral está inhibida por impedimentos estéricos por la unión de estos anticuerpos. La inhibición de la unión puede detectarse mediante un ensayo de SPR utilizando un anticuerpo inmovilizado seleccionado a partir del grupo que incluye a los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 o LC5002-018 y IL-13Ral a una concentración de 20-50 nM, estando el anticuerpo a detectar a una concentración de 100 nM. Una reducción de señal del 50% o mayor demuestra competición por parte del anticuerpo frente a un anticuerpo seleccionado del grupo de anticuerpos que incluye a LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 o LC5002-018. El término "epítopo" se refiere a un determinante proteico capaz de unión específica frente a un anticuerpo. Un epítopo suele consistir de agrupamientos de moléculas químicamente activas, de cadenas laterales de aminoácido o azúcares y normalmente poseen unas características de estructura tridimensional específicas, así como una carga definida. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión a los primeros pero no a los últimos se pierde en presencia de agentes desnaturalizantes. La invención incluye también un anticuerpo humano que se une a IL-13Ral inhibiendo la bioactividad de IL-13, caracterizado por una afinidad de 10~9 M (KD) o menor, preferentemente de 109 a 10"13 M para la unión a IL-13Ral y por una afinidad de 10~7 M (KD) o menor, preferentemente de 10~8 a 10~9 M para la unión a IL-13Ral de ratón.

En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos de acuerdo con la invención son caracterizados más a fondo por tener una o más de las características seleccionadas a partir del grupo de parámetros de unión ka, kd y KD, uniéndose al mismo epítopo al cual se une un anticuerpo seleccionado a partir del grupo compuesto por los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 o LC5002-018. Los anticuerpos de acuerdo con la invención se producen de manera preferente por métodos recombinantes . Tales métodos son conocidos ampliamente en la técnica e incluyen expresión la de proteínas en células eucariotas y procariotas con el aislamiento subsecuente del polipéptido de anticuerpo y normalmente una purificación hasta obtener una pureza aceptable desde el punto de vista farmacológico. Para la expresión de la proteína, los ácidos nucleicos que codificas para las cadenas ligera y pesada o fragmentos de las mismas, se insertan en vectores de expresión mediante métodos estándar. La expresión se lleva a cabo en las células huésped adecuadas, eucariotas o procariotas, como las células CHO, NSO, SP/2, HEK293, COS, levadura o E. coli, siendo recuperado el anticuerpo a partir de las células (sobrenadante o tras una lisis celular) . La producción recombinante de anticuerpos es bien conocida en el actual estado de la técnica, estando descrita por ejemplo, en artículos de revisión como los de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., y otros, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880. Los anticuerpos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular o en forma parcialmente o sustancialmente purificada. La purificación se lleva a cabo para eliminar otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándar, que incluyen el tratamiento con álcali y SDS, la agrupación con CsCl, la cromatografía en columna electroforesis en gel de agarosa y otros métodos bien conocidos en la técnica. Ver Ausubel, F., y otros, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). La expresión en células NSO está descrita por Barnes, L.M., y otros, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; y Barnes, L.M., y otros, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. La expresión transitoria está descrita entre otros por Durocher, Y., y otros, Nucí. Acids. Res. 30 (2002) E9. La clonación de dominios variables está descrita por Orlandi, R. , y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Cárter, P., y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; y por Norderhaug, L., y otros, J. Immunol . Methods 204 (1997) 77- 87. Un sistema de expresión transitoria preferido (HEK 293) es el descrito por Schlaeger, E . -J . , y Christensen, K. , en Cytotechnology 30 (1999) 71-83 y por Schlaeger, E.-J., en J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199. Las secuencias de control adecuadas para procariotas incluyen típicamente un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un lugar de unión para el ribosoma. Las células eucariotas se conocen por utilizar promotores, potenciadores y señales de poliadenilación. Los anticuerpos monoclonales son separados de forma adecuada del medio de cultivo mediante protocolos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, proteína A unida a sefarosa, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN o ARN que codifica para los anticuerpos monoclonales se puede aislar y secuenciar de manera efectiva utilizando los métodos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuente de dicho ADN y ARN. Una vez aislado, el ADN puede ser insertado en vectores de expresión, que son transfectados a continuación en células huésped tales como las CHO, HEK293, o de mieloma que de otra manera no producirían inmunoglobulinas, para obtener así la síntesis de los anticuerpos monoclonales recombinantes. Los anticuerpos de acuerdo con la invención incluyen, además, a aquellos que presenten "modificaciones conservativas en la secuencia", modificaciones de aminoácido o de nucleótidos que no afectan o alteran a las características del anticuerpo de acuerdo con la invención, mencionadas más arriba. Pueden introducirse modificaciones mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida y la mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservativas de aminoácido incluyen aquellas en las que el residuo de aminoácido es sustituido por otro residuo aminoácido con una cadena lateral similar. Las familias de aminoácido con cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácido con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acídicas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales con ramificaciones beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Por tanto, un residuo aminoácido con predicción de no ser esencial en un anticuerpo humano anti IL-13Ral puede ser sustituido preferentemente por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral.

Las sustituciones de aminoácido pueden llevarse a término mediante mutagénesis basada en modelos moleculares tal y como describe Riechmann, L., y otros, Nature 332 (1988) 323-327 y Queen, C, y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989)10029-10033. Las secuencias de aminoácido variantes de los anticuerpos humanos frente a IL-13Ral se preparan mediante la introducción del cambio de nucleótido apropiado en el ADN que codifica para el anticuerpo, o por síntesis peptídica. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo, sin embargo, sólo dentro de un margen muy limitado como el que se describe más arriba. Por ejemplo, las modificaciones no deben alterar las características del anticuerpo mencionadas más arriba, tales como el isotipo de IgG y la unión al epítopo, pero pueden mejorar el rendimiento de la producción recombinante, la estabilidad de la proteína o facilitar su purificación. Cualquier residuo de cisteína que no esté implicado en mantener la conformación adecuada del anticuerpo an i-IL-13Ral, puede ser también sustituido, generalmente con una serina para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la formación de puentes de azufre aberrantes. De forma complementaria se podrían añadir puentes de azufre mediados por cisteínas al anticuerpo para mejorar así su estabilidad (en especial cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo como el fragmento Fv) .

Otro tipo de variante de aminoácido en el anticuerpo consistiría en la alteración del patrón original de glicosilación. Por alteración se entiende la eliminación de uno o más grupos carbohidrato presentes en el anticuerpo, y/o la adición de uno o más lugares de glicosilación que no estuviesen presentes en el anticuerpo originalmente. La glicosilación de los anticuerpos se suele hacer generalmente a través de la unión del grupo carbohidrato al grupo amino de la cadena lateral de la asparagina. Los tripéptidos de secuencia asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina, resultan secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del grupo carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de esos tripéptidos en un polipéptido crea un lugar potencial de glicosilación. La adición de dianas de glicosilación a un anticuerpo se puede conseguir mediante la alteración de la secuencia de aminoácido de manera que pase a contener una o más de las arriba mencionadas secuencias tripetídicas (para los lugares de N-glicosilación) . Las moléculas de ácido nucleico que codificas para anticuerpos anti-IL-13Ral con secuencias de aminoácido variantes se preparan mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, aunque no se limitan a, la extracción a partir de la fuente natural (para el caso de las variantes de aminoácido que se generen de forma natural) o la preparación por mutagénesis dirigida o mediada por oligonucleótido, mutagénesis por PCR o por mutagénesis por cásete de una versión variante o no variante del anticuerpo anti-13Ral preparado con anterioridad. Otro tipo de modificación covalente es la que implica el enlace al anticuerpo por vía química o enzimática de grupos glucosídicos . Estos procedimientos presentan la ventaja de no requerir la producción del anticuerpo en una célula huésped que tenga la capacidad de glicosilar ya sea por vía N- u 0- . Dependiendo del tipo de acoplamiento utilizados, el azúcar/es puede ser unido (a) a un residuo de arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de la serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como serían el triptófano, la fenilalanina o la tirosina, o (f) al grupo amida de la glutamina. Estos métodos están descritos en WO 87/05330, y en Aplin, J.D., y Wriston, J.C. Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. (1981) 259-306. La eliminación de cualquiera de los grupos carbohidrato presentes en el anticuerpo se puede conseguir por métodos enzimáticos o químicos. La desglicosilación química puede conseguirse por la exposición del anticuerpo a ácido trifluorometansulfónico, o a compuestos equivalentes.

Este tratamiento da como resultado la separación de la mayor parte de los azúcares excepto los de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) , dejando el anticuerpo intacto, la desglicosilación química esta descrita por Sojahr, H.T., y Bahl , O.P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57 y por Edge, A.S., y otros, Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137. La separación enzimática de los grupos carbohidrato de los anticuerpos puede conseguirse mediante el uso de una gran variedad de endo- y exo- glicosilasas, tal y como está descrito por Thotakura, N.R., y Bahl, O.P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359. Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo consiste en la unión al anticuerpo a cualquiera de toda una variedad de polímeros de carácter no proteico, como puede ser el polietilenglicol, el polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera establecida en las patentes Estadounidenses con los números 4.640.235; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. En otro aspecto diferente, la invención proporciona células B aisladas a partir de animales transgénicos, por ejemplo un ratón transgénico, que expresa los anticuerpos humanos anti-IL-13Ral de acuerdo con la invención. Preferiblemente, las células B aisladas se obtienen a partir de de animales transgénicos no humanos, por ejemplo el ratón, que hayan sido inmunizado con una preparación purificada o enriquecida de antígeno IL-13Ral y/o células que expresen el IL-13Ral. De preferencia, el animal transgénico no humano, por ejemplo el ratón, tiene un genoma que incluye el transgen que codifica para la cadena pesada humana y el transgen para la cadena ligera humana, codificando la totalidad o una parte de un anticuerpo de la invención. Las células B aisladas son a continuación inmortalizadas para proveer una fuente (un hibridoma) de anticuerpos humanos anti-IL-13Ral . En consecuencia, la presente invención también provee un hibridoma con la capacidad de producir anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo con la invención. En una de las realizaciones, el hibridoma incluye una célula B obtenida a partir de un animal transgénico no humano, por ejemplo un ratón transgénico, que posee un genoma que incluye un transgen que codifica para la cadena pesada humana y el transgen para la cadena ligera humana, codificando la totalidad o una parte de un anticuerpo de la invención, fusionada con una célula inmortalizada. En una modalidad particular, el animal transgénico no humano es un ratón transgénico que posee un genoma con un transgen que codifica para la cadena pesada humana y el transgen para la cadena ligera humana, codificando la totalidad o una parte de un anticuerpo de la invención. El animal transgénico no humano puede ser inmunizado con una preparación purificada o enriquecida de antígeno IL-13Ral y/o células que expresen el IL-13Ral. De preferencia, el animal transgénico no humano, por ejemplo el ratón transgénico, será capaz de producir anticuerpos monoclonales humanos del isotipo IgGl frente al IL-13Ral. Los anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo con al invención pueden obtenerse mediante la inmunización de un animal transgénico no humano, por ejemplo un ratón transgénico, que posea un genoma con un transgen que codifica para la cadena pesada humana y el transgen para la cadena ligera humana, codificando la totalidad o una parte de un anticuerpo de la invención, con una preparación purificada o enriquecida de antígeno IL-13Ral y/o células que expresen el IL-13Ral. A continuación se obtienen las células B del animal (por ejemplo células B de bazo) y se fusionan con células de mieloma para conseguir células de hibridoma inmortales que secreten anticuerpos monoclonales humanos frente al IL-13Ral. En una modalidad preferida, los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra IL-13Ral pueden ser generados, utilizando para ello ratones transgénicos portadores de partes del sistema inmunitario humano en lugar del propio del ratón. Esos ratones transgénicos, designados a partir de aquí como "ratones huMab", contienen minisitio para genes de las inmunoglobulinas humanas no reorganizados, incluyendo los genes para las regiones constantes de las cadenas pesadas (µ e ?) y ligera K, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los sitios para las cadenas µ y K endógenas (Lonberg, N. , y otros, Nature 368 (1994) 856-859). De forma correspondiente, estos ratones presentarán una reducción de la expresión de las IgM o K de ratón, y como respuesta a la inmunización, los transgenes introducidos para las cadenas pesada y ligera humanas sufrirán intercambio de clase y mutaciones somáticas para generar anticuerpos monoclonales humanos IgG de alta afinidad (Lonberg, N. , y otros, Nature 368 (1994) 856-859; revisado en Lonberg, N. , Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Lonberg, N. , y Huszar, D. , Intern. Rev. Immunol . 25 (1995) 65-93; y Harding, F., y Lonberg, N. , Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546) . La preparación de HuMab en ratones está descrita por Taylor, L., y otros, Nucleic Acids Research 20 (1992) 6287-6295; Chen, J., y otros, International Immunology 5 (1993) 647-656; Tuaillon, N. , y otros, Proc. Nati. Acad. Sci USA 90 (1993) 3720-3724; Choi, T.K., y otros, Nature Genetics 4 (1993) 117-123; Chen, J., y otros, EMBO J. 12 (1993) 821-830; Tuaillon, N. , y otros, Immunol . 152 (1994) 2912-2920; Lonberg, N. , y otros, Nature 368 (1994) 856-859; Lonberg, N. , Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Taylor, L., y otros, Int. Immunol . 6 (1994) 579-591; Lonberg, N. , y Huszar, D., Intern. Rev. Immunol . 25 (1995) 65-93; Harding, F., y Lonberg, N. , Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546; Fishwild, D.M., y otros, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851, los contenidos de los cuales están incorporados en su totalidad como referencia. Para más información véanse las patentes Estadounidense número 5.245.206; 5.269.225; 5.225.226; 5.233.225; 5.289.250; 5.277.297; 5.261.216; 5.214.218; 5.274.299; 5.245.207; 5.270.229; WO 98/24884; WO 94/25585; WO 93/1227; WO 92/22645; y WO 92/03918. Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos frente a IL-13Ral, los ratones HuMab pueden ser inmunizados con una preparación de antígeno IL-13Ral purificado o enriquecido y/o células que expresen IL-13Ral de acuerdo con el método general, tal y como está descrito por Lonberg, N. , y otros, Nature 368 (1994) 856-859; Fishwild, D.M., y otros, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851 y WO 98/24884. Preferiblemente, los ratones tendrán de 6 a 16 semanas de edad en el momento de la primera inmunización. Por ejemplo, una preparación purificada o enriquecida del antígeno lL-13Ral (por ejemplo, purificado a partir de células que expresen IL-13Ral) puede ser utilizada para inmunizar los ratones HuMab intraperitonealmente. Si resultase que las inmunizaciones utilizando una preparación purificada o enriquecida del antígeno IL-13Ral no diesen como resultado la producción de anticuerpos, los ratones pueden ser también inmunizados con células que expresen IL-13Ral, por ejemplo una línea celular tumoral, que pudiera inducir respuesta inmunitaria. La experiencia acumulada utilizando diferentes antígenos ha demostrado que los ratones transgénicos HuMab responden mejor cuando la inmunización inicial se hace por vía intraperitoneal utilizando antígeno con adyuvante completo de Freund, seguida de inmunizaciones semanales alternando la vía intraperitoneal con la subcutánea con antígeno en adyuvante incompleto de Freund. La respuesta inmunitaria puede ser monitorizada a lo largo del protocolo de inmunización utilizando muestras de plasma obtenidas por sangrados retro-orbitales. El plasma puede ser analizado por ELISA, y los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulinas humanas anti-IL-13Ral pueden utilizarse para la inmortalización de las células B correspondientes. Los ratones pueden ser re-inoculados con antígeno por vía intravenosa de 3 a 4 días antes del sacrificio y extracción del bazo y nodulos linfáticos. Cabe esperar que sea necesario llegar a realizar de 2 a 3 fusiones para cada antígeno. Varios ratones serán inmunizados para cada antígeno. Por ejemplo, se puede inmunizar un total de 5 a 12 ratones HuMab de las cepas HCo7 y HCol2. Los ratones HCo7 tienen una disrupción JKD en los genes para su cadena ligera endógena (kappa) (tal como está descrito en Chen, J., y otros, EMBO J. 12 (1993) 821-830), una disrupción CMD en sus genes endógenos para la cadena pesada (tal y como está descrito en el ejemplo 1 del WO 01/14424) , un transgen humano KCo5 para la cadena ligera kappa (según lo descrito en Fishwild, D.M., y otros, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851), y un transgen HCo7 para la cadena pesada humana (según lo descrito en la patente Estadounidense Na 5.770.429). Los ratones HCol2 tienen una disrupción JKD en los genes para su cadena ligera endógena (kappa) (tal como está descrito en Chen, J., y otros, EMBO J. 12 (1993) 821-830), una disrupción CMD en sus genes endógenos para la cadena pesada (tal y como está descrito en el ejemplo 1 del WO 01/14424), un transgen humano KCo5 para la cadena ligera kappa (según lo descrito en Fishwild, D.M. , y otros, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851), y un transgen HCol2 para la cadena pesada humana (según lo descrito en el Ejemplo 2 del WO 01/14424) . Los linfocitos de ratón pueden ser aislados y fusionados con líneas celulares de mieloma para producir hibridomas utilizando protocolos estándar basados en el uso de PEG. Los hibridomas resultantes son rastreados para comprobar la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, suspensiones celulares de linfocitos obtenidos de bazo o nodulo linfático a partir de ratones inmunizados son fusionadas con una sexta parte de células de mieloma de ratón no secretoras SP 2/0 (ATCC, CRL 1581) con PEG al 50%. Las células se colocan en placas a una densidad aproximada de 2 x 105 en placas de microtitulación de fondo plano, incubándose durante unas dos semanas en medio selectivo . Las cavidades individuales son rastreadas por ELISA para detectar los anticuerpos IgM e IgG frente a IL-13Ral. Una vez se ha producido el suficiente crecimiento del hibridoma, es analizado el medio, normalmente después de 10 a 14 días. Los hibridomas que secreten anticuerpos son colocados en placas de nuevo y caracterizados otra vez, si siguen siendo positivos para anticuerpos humanos monoclonales del tipo IgG frente a IL-13Ral, pueden ser subclonados un mínimo de dos veces por dilución limitante. Los subclones estables se cultivan in vitro para obtener medio con producción de anticuerpos para su caracterización. Debido a que las secuencias CDR son las responsables de las interacciones entre el antígeno y el anticuerpo, es posible expresar anticuerpos recombinantes de acuerdo con la invención mediante la construcción de vectores de expresión que incluyan las secuencias CDR de acuerdo con la invención dentro de secuencias marco para un anticuerpo humano diferente. (Véase por ejemplo, Riechmann, L., y otros, Nature 332 (1998) 323-327; Jones, P., y otros, Nature 321 (1986) 522-525; y Queen, C, y otros, Proc. Nati. Acad.

U.S.A. 86 (1989)10029-10033) .Tales secuencias marco pueden ser obtenidas a partir de las bases de datos públicas de ADN que incluyen las secuencias de los genes de las líneas germinales que codificas para anticuerpos humanos. Estas secuencias de líneas germinales se diferenciarán de las secuencias génicas maduras debido que no incluirán regiones variables reorganizadas, que se forman mediante la unión V (D) J durante la maduración de las células B. Las secuencias génicas de las líneas germinales presentan también diferencias puntuales respecto a las secuencias del repertorio secundario de anticuerpos de alta afinidad distribuidas de manera uniforme a lo largo de la región variable. La invención incluye preferentemente un fragmento de ácido nucleico que codifica para un polipéptido con capacidad de unirse al IL-13Ral, donde dicho polipéptido inhibe la unión de IL-13 al IL-13Ral, seleccionado a partir del grupo que incluye a) una cadena pesada de anticuerpo que incluya una de las CDR de cadena pesada SEC ID NO : 1, 3, 5, 7 o 9; b) una cadena ligera de anticuerpo que incluya una de las CDR de cadena ligera SEC ID NO : 2, 4, 6, 8 o 10. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera así reconstruidas, se combinan con las secuencias de un promotor, de iniciación de traducción, región constante, 3' no traducida, de poliadenilación y de terminación de la trascripción para formar el constructo en el vector de expresión. Los constructos de expresión para las cadenas pesada y ligera pueden ser combinados en un único vector de expresión, transfectarse conjuntamente, de manera consecutiva o de manera separada a las células huésped que son a continuación fusionadas para conseguir una única célula huésped que exprese ambas cadenas . Como resultado, la invención proporciona un método para la producción de un anticuerpo humano recombinante de acuerdo con la invención, incluyendo la expresión de un ácido nucleico que codifica para a) una cadena pesada de anticuerpo que incluye una de las CDR de cadena pesada SEC ID NO : 1 , 3 , 5 , 7 o 9 ; b) una cadena ligera de anticuerpo que incluye una de las CDR de cadena ligera SEC ID NO : 2, 4, 6, 8 o 10. Asimismo la invención también incluye el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la detección del IL-13Ral in vi tro, preferentemente por medio de un ensayo inmunológico que determine la unión entre IL-13Ral de una muestra y el anticuerpo de acuerdo con la invención. Por otro lado, la presente invención provee una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, incluyendo uno o una combinación de anticuerpos monoclonales humanos, o la parte correspondiente de unión a antígeno, de la presente invención, formulado junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

Tal y como se utiliza a partir de aquí, el término "portador farmacéutico aceptable" incluye a todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes y similares que sean fisiológicamente compatibles. De preferencia, el portador será adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por inyección o infusión). El término "sal aceptable farmacéuticamente" hace referencia a una sal que retenga la actividad biológica deseada del anticuerpo sin provocar ningún efecto toxicológico indeseado (véase por ejemplo Berge, S.M., y otros, J. Pharm. Sci. 66 (1977) 1-19). Tales sales están incluidas en la invención. Ejemplos de tales sales incluyen las de naturaleza acida y las de naturaleza básica. Las acidas incluyen a aquellas derivadas a partir de sales inorgánicas no tóxicas, como serían las sales de clorhídricas . Una composición de la presente invención puede ser administrada por medio de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Tal como será evidente para el técnico especialista, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de cuales sean los resultados esperados. Para administrar un compuesto de la invención a través de ciertas rutas, puede que sea necesario recubrir el compuesto con, o administrarlo conjuntamente con, un material que evite su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede ser administrado a un sujeto mediante un portador adecuado, como podrían ser los liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen las soluciones reguladoras de pH salinas y acuosas. Los portadores aceptables farmacéuticamente incluyen las soluciones acuosas estériles o dispersiones y los polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes con sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Las expresiones "administración parenteral" y "administrado perenteralmente" , tal y como se utilizan aquí hacen referencia a las formas de administración diferentes a la administración tópica o enteral, normalmente mediante inyección, e incluye, sin limitaciones, las vías intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intrarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraesternal . Estas composiciones pueden contener también adyuvantes tales como conservantes, humectantes, emulsificadores o dispersantes. Para evitar la presencia de microorganismos puede aplicarse algún proceso de esterilización, en la preparación e incluir agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo: el parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede resultar conveniente incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares, a los compuestos. Además, para garantizar la absorción prolongada de compuesto farmacéutico inyectable se pueden incluir agentes retardantes para la absorción tales como el monoestearato de aluminio y la gelatina. Independientemente de la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden emplearse en forma hidratada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan con una dosificación farmacológicamente aceptable mediante métodos convencionales conocidos para aquellos con conocimientos sobre la materia. Los niveles de dosificación reales para los ingredientes activos dentro de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser variados con el fin de tener una cantidad de ingrediente activo que sea suficiente para producir la respuesta terapéutica deseada en cada paciente particular, composición o modo de administración, sin que llegue a ser tóxico para el paciente. La dosis seleccionada dependerá de una serie de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad cada uno de los compuesto de la presente invención, del éster, sal o amida, de la ruta de administración en particular, del momento de la administración, de la tasa de excreción de uno de los compuestos concretos que se emplee, de la duración del tratamiento, de otras drogas, compuestos y/o materiales administrados en combinación con las composiciones concretas empleadas, de la edad, del sexo, condición, estado general de salud e historia médica previa del paciente en tratamiento, y factores del estilo, bien conocidos por los especialistas médicos . La composición debe ser estéril y fluida, en la medida que permita su administración mediante una jeringa. Además del agua, el portador puede ser una solución salina tamponada e isotónica, etanol, polialcohol (por ejemplo el glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), y mezclas adecuadas del estilo. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, gracias al uso de recubrimientos tipo lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula deseado en el caso de una dispersión y mediante el uso de surfactantes. En muchas ocasiones, es preferible incluir agentes isotónicos en la composición, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, como el manitol o el sorbitol, y cloruro sódico. La absorción a largo plazo de los compuestos inyectables puede conseguirse por la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio o gelatina. Los siguientes ejemplos, referencias, listado de secuencias y figuras se proporcionan para facilitar la comprensión de la presente invención, el alcance real de la cual se establece en las reclamaciones anexas. Se da por entendido que pueden hacerse modificaciones en los procedimientos establecidos sin alejarse del espíritu de la invención. Descripción del Listado de Secuencias SEC ID NO: 1 dominio variable de la cadena pesada del HuMab LC5002-002 SEC ID NO: 2 dominio variable de la cadena ligera del HuMab LC5002-002 SEC ID NO: 3 dominio variable de la cadena pesada del HuMab LC5002-003 SEC ID NO: 4 dominio variable de la cadena ligera del HuMab LC5002-003 SEC ID NO: 5 dominio variable de la cadena pesada del HuMab LC5002-005 SEC ID NO: 6 dominio variable de la cadena ligera del HuMab LC5002-005 SEC ID NO: 7 dominio variable de la cadena pesada del HuMab LC5002-007 SEC ID NO: 8 dominio variable de la cadena ligera del HuMab LC5002-007 SEC ID NO: 9 dominio variable de la cadena pesada del HuMab LC5002-018 SEC ID NO: 10 dominio variable de la cadena ligera del HuMab LC5002-018 SEC ID NO: 11 región constante K de la cadena ligera SEC ID NO: 12 región constante ?lde la cadena pesada BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 muestra la unión de anticuerpos anti-IL- 13R0C1 al polipéptido IL-13ROÍ1 humano recombinante inmovilizado. Se incluyen el anticuerpo AF152 policlonal de conejo anti-IL-13Ral humano (R&D systems) y un anti-KLH como HuMab de control negativo. Figura 2 muestra la inhibición de la unión a IL-13 al receptor IL-13Ral/IL-4Ra a través de anticuerpos anti-IL-13Ral. Figura 3 muestra el bloqueo de la unión de IL-13 a células CHO (que expresan IL-13Ralphal e IL-4Ra2) mediante anticuerpos anti-IL-13Ral . Como control positivo se incluyó un anticuerpo anti-IL-13Ral comercial (AF152, R&D Systems, Minneapolis, MN) . Figura 4 muestra la unión de los anticuerpos anti-IL-13Ral a hIL-13Ral y las propiedades de unión a receptores relacionados funcionalmente como hIL-13Ra2 y hIL-4Ra.

Figura 5 muestra la capacidad de los anticuerpos anti-IL-13R l para unirse al polipéptido recombinante de IL-13Ral de murino inmovilizado. Se incluyen el anticuerpo policlonal de cabra anti - IL-13Ral humana AF152 (R&D systems) y un anti-KLH como HuMab para control negativo. Ejemplos Ejemplo 1 Generación de hibridomas Los anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo con la invención pueden ser producidos mediante la inmunización de animales transgénicos, como puede ser un ratón transgénico que tenga un genoma que incluya transgenes para las cadenas pesada y ligera que codificas para todo o una parte de un anticuerpo de la presente invención, con células que expresen el IL-13RC humano. Tras ello se obtienen células B del bazo del animal y se fusionan con células de mieloma para conseguir líneas de hibridoma inmortales que puedan secretar anticuerpos monoclonales humanos frente a IL-13Ral. Se pueden generar anticuerpos monoclonales humanos frente a IL-13Ral utilizando ratones humanos portadores de partes del sistema inmunitario humano en lugar del propio. Estos ratones transgénicos se denominarán, de aquí en adelante, como ratones "HuMab", estos contienen un minisitio para la inmunoglobulina humana que incluye genes no reorganizados de las regiones constantes de las inmunoglobulinas humanas, tanto para la cadena pesada (µ e ?) como ligera K (kappa) , junto con mutaciones dirigidas que inactivan los sitios endógenos para las cadenas µ y kappa (Lonberg N. , y otros, Nature 368 (1994) 856-859) . Gracias a esto, los ratones muestran una expresión reducida de las IgM o K de ratón, y, como respuesta a la inmunización, los transgenes introducidos para las cadenas ligera y pesada humanas sufren intercambios de clase y mutaciones somáticas para generar anticuerpos monoclonales IgG humanos de alta afinidad para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos frente a IL-13Ral, los ratones HuMab pueden inmunizarse con células que expresen IL-13Ral humano de acuerdo con el método general, tal y como está descrito por Lonberg, N. , y otros, Nature 368 (1994) 856-859; Fishwild, D.M. , y otros, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851 y WO 98/24884. Preferiblemente, los ratones deben tener de 6 a 16 semanas de edad al recibir la primera inmunización. Por ejemplo, las células transfectadas con IL-13ROÍ1 pueden emplearse para inmunizar los ratones HuMab vía intraperitoneal. La respuesta inmunitaria puede monitorizarse a lo largo del protocolo de inmunización mediante la extracción de muestras de plasma obtenidas por sangrados periorbitales . El plasma puede ser rastreado por ELISA y/o FACS. Los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-IL-13Ral humana, pueden ser utilizados para inmortalización de las células B correspondientes. Los ratones pueden ser reinmunizados por vía intravenosa con el antígeno unos 3 o 4 días antes del sacrificio y extracción del bazo y nodulos linfáticos. Por ejemplo, pueden inmunizarse ratones HuMab de las cepas HCo7 o HCol2. Los ratones HCo7 tienen una disrupción JKD en sus genes endógenos para la cadena ligera (kappa) (descrito en Chen y otros, (1993) EMBO J. 12: 821-830), una disrupción CMD en sus genes endógenos para la cadena pesada (descrito en WO 01/14424) , un transgen para la cadena ligera kappa humana KCo5 (descrito en Fishwild, D.M., y otros, (1996) Nature Biotechnology 14:845-851) , y un transgen para la cadena pesada humana HCo7 (descrito en Estadounidense 5.770.429). Los ratones HCol2 tienen una disrupción JKD en sus genes endógenos para la cadena ligera (kappa) (descrito en Chen, J., y otros, EMBO J. 12 (1993) 821-830), una disrupción CMD en sus genes endógenos para la cadena pesada (como se describe en el ejemplo 1 de WO 01/14424)) un transgen KCo5 para la cadena ligera humana kappa (descrito en Fishwild, D.M., y otros, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851, y un transgen HCol2 para la cadena pesada humana (descrito en el ejemplo 2 de WO 01/14424) . Los linfocitos de ratón pueden ser aislados y fusionados con una línea de mieloma de ratón utilizando PEG según los protocolos estándar para generar hibridomas. A continuación, los hibridomas resultantes son rastreados para determinar la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, suspensiones celulares de linfocitos derivados del bazo y de los nodulos obtenidas a partir de ratones inmunizados se fusionan con células de mieloma SP/2 no secretoras de ratón (ATCC, CRL 1581) con PEG al 50%. Las células se ponen en cultivo a una densidad de 0.75 x 107 en placas de microtitulación de fondo plano, seguido de unas dos semanas de incubación en medio selectivo. Las cavidades individuales son rastreadas por ELISA y/o FACS para la presencia de anticuerpos monoclonales humanos IgM e IgG anti-IL-13Ral. Una vez se ha obtenido un crecimiento suficiente de los hibridomas, los que secretan anticuerpos son colocados en placas de nuevo, y si se mantienen positivos para anticuerpos monoclonales IgG humanos anti-IL-13Ral, pueden ser subclonados como mínimo dos veces por dilución limitante. Los subclones estables son cultivados in vitro para producir anticuerpos en medio de cultivo para su caracterización. Procedimiento de inmunización de los ratones transgénicos Tres ratones HCo7 (3 machos) , cepa GG2201 (Medarex, San José, CA, USA) y 2 ratones HCol2 (1 macho y una hembra), cepa GG2198 (Medarex, San José, CA, USA) fueron inmunizados con 1 x 106 células HEK293, previamente transfectadas con un vector de expresión para IL-13Ral. En total se procedió a ocho inmunizaciones, alternando la vía intraperitoneal (i.p.) con la subcutánea (s.c.) en la base de la cola. Para la primera inmunización se mezclaron 100 µl de células HEK293 : IL-13Ral a 1 x 106 con 100 µl de adyuvante completo de Freund (CFA; Difco Laboratories, Detroit, USA) . Para todas las demás inmunizaciones se mezclaron 100 µl de células en PBS con 100 µl de adyuvante incompleto de Freund (ICFA; Difco) . Reinoculación de los ratones Cuando los títulos de suero de anti-IL-13Ral se demostraban suficientes, los ratones eran reinoculados de nuevo dos veces con células HEK293: IL-13R l a 1 xlO6, en 200 µl de PBS (i.v.) 4 y 3 días antes de la fusión. Ejemplo 2 Comprobación por ELISA de la unión de los HuMab al IL-13Rccl inmovilizado Para determinar la capacidad de los anticuerpos de la invención para unirse a IL-13R l recombinante, el dominio extracelular de IL-13Ral (R&D Systems, UK) fue disuelto en PBS (lµg/ml) y se adsorbió a placas de microtitulación (NUNC Maxisorb) mediante una incubación a 4°C durante toda la noche. Tras un lavado de las placas con regulador de pH de lavado (TL = 0.9 % NaCl; 0.1% Tween® 20) los lugares de unión no específica fueron bloqueados mediante la adición de lOOµl regulador de pH de incubación (TI = PBS con 1% de proteína C y 0.1% de Tween® 20) e incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente (temperatura ambiente) . Tras esto se hicieron diluciones seriadas de los HuMab y de los anticuerpos control (lOOµl /cavidad; diluciones en TI) , estas se añadieron e incubaron durante lh a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas de nuevo y los anticuerpos humanos unidos se detectaron mediante una incubación con anti kappa humano de conejo conjugado a peroxidasa (DAKO, Dinamarca) a una dilución final de 1:500 en TI. Los anticuerpos policlonales de cabra anti-hIL-13R l se detectaron con un policlonal anti IgG de cabra producido en burro y conjugado con peroxidasa (Santa Cruz; dilución 1:1000 en TI). Tras incubarse durante lh a temperatura ambiente y tras un nuevo paso de lavado, las placas se revelaron con solución ABTS lista para su uso (Roche Diagnostics GmbH) a temperatura ambiente en la oscuridad. La absorbancia a 405nM se midió en el momento en que la absorbancia de la concentración más alta alcanzaba un valor suficiente. Todos los anticuerpos frente a IL-13Ralphal que se probaron fueron capaces de unirse al dominio extracelular inmovilizado del IL-13Ral humano. Los valores de EC50 que se determinaron estaban en el intervalo de 0.5 - 2 nM para los diversos anticuerpos LC testados. El anticuerpo HuMab anti-KLH que se utilizó como control negativo no se unió al dominio extracelular inmovilizado de IL-13R l. El control positivo, anticuerpo de cabra anti-IL-13Ral humano, se unió también de forma eficiente al dominio extracelular inmovilizado de IL-13Ral (Figura 1) . Ejemplo 3 Inhibición de la unión de IL-13 al heterodimero IL-13R l/IL-4Ra (ELISA) Se cubrieron placas de microtitulación con 100 µl de la proteína quimérica hIL-13Ral: hFc (R&D Systems, UK) disuelta en PBS a 3µg/ml durante toda la noche a 42C, en agitación. Tras lavar las placas con TL se añadieron diluciones seriadas de anticuerpos HuMab y controles (100 µl /cavidad; diluciones en TI) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas de nuevo y tras ello se añadió una mezcla de IL-13 (R&D Systems, UK; a 0.2 µg/ml; diluido con TI) con IL-4Ra (R&D Systems, UK; 0.25 µg/ml; diluido con TI), incubándose durante lh a temperatura ambiente. Tras el lavado de las placas, se añadieron 100 µl de anticuerpo bioteñido anti IL-13 (BAF213; R&D Systems, UK) a una concentración de of 0.4 µg/ml y se incubó durante lh a temperatura ambiente. Tras lavar las placas, se detectó la IL-13 unida mediante estreptavidina unida a peroxidasa (Roche Diagnostics GmbH, DE) a una dilución de 1:5000 en TI (lh a temperatura ambiente) . Finalmente, las placas fueron lavadas y reveladas con solución de ABTS® lista para su uso (Roche Diagnostics GmbH, DE) a temperatura ambiente en la oscuridad. La absorbancia a 405 de midió tras 45 - 60 minutos. Los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y LC5002-018 fueron capaces de inhibir la unión de IL-13 al receptor heterodimérico con unos valores máximos de inhibición de un 50 a un 80-85%. El control positivo era AF152 (anticuerpo policlonal de conejo) . Tal y como se esperaba, el control negativo, anti-KLH, no inhibió la unión de IL-13 al receptor heterodimérico. Los valores de CI50 obtenidos estaban entre 1.5 nM y 10.1 nM para LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y LC5002-018 (Figura2). Ejemplo 4 Ensayo de unión con radioligando El ensayo de unión de 125I IL-13 se llevó a cabo sobre células CHO que expresan los IL-13R l y IL-4RCC humanos, disueltas en regulador de pH de unión (HEPES 25 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 5 mM, y albúmina sérica bovina al 0.5%, ajustado a pH 7.2) . Se mezclaron lxlO5 células por cavidad con los anticuerpos y se preincubó de 15 minutos a 1 hora. Tras esto se añadió 125I-IL-13 0.2nM y la mezcla se incubó a 42C durante 4 horas. La concentración de 125I-IL-13 utilizada en el ensayo se determinó a partir de análisis de saturación de unión, de competición y por la determinación de la cantidad de 125I IL-13 necesaria para alcanzar el equilibrio de unión con la línea celular. Las muestras se recogieron en una placa con filtro GF/C pretratada con PEÍ 1% / BSA 0.5% y medidas en un contador de centelleo Packard TopCount. El análisis de los datos se llevó a cabo con el software PRISM utilizando el ajuste no lineal a una curva de regresión (GraphPad Software, San Diego, CA) . Todos los anticuerpos frente al IL-13Ralphal probados bloquearon la unión de IL-13 marcada al complejo IL-13R0Cl/IL-4Ra. Los valores de CI50 calculados para los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y LC5002-018 se encontraban entre 0.09 nM y 0.32 nM, con 84.8 nM para el AF152 (Figura3) . Ejemplo 5 Inhibición por parte de los anticuerpos HuMab de la regulación positiva de CD23 inducida por IL-13 en células B humanas y monocitos. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron mediante gradiente de densidad de Ficoll Hypaque. Tras un lavado de las células con RPMl, estas fueron resuspendidas en RPMl/10% FCS y distribuidas a una densidad de 3x1O5 PBMC/cavidad (50 µl de volumen) en placas de microtitulación de 96 cavidades de fondo plano (Corning Incorporated Costar) . Tras esto, se añadían 25 µl de anticuerpo anti CD40 humano (Immunotech) a una concentración final de 0.2 µg/ml en RPMI/10% FCS y 25 µl de anticuerpo anti IgA+IgG+IgM humanas (Immunoresearch) a una concentración final de 10 µg/ml en RPMI/10%FCS. Tras esto se añadieron diluciones seriadas de los anticuerpos HuMab y control (50 µl/cavidad; diluciones en RPMI/10% FCS) y se incubaron durante 30 min en la estufa (37°C; 5% CO2) • A continuación se añadió IL-13 humana recombinante (R&D Systems) a una concentración final de 0.27 ng/ml (50 µl/cavidad), incubándose las células durante 72 h a 37°C/5% CO2 • Tras esta incubación las placas fueron centrifugadas y el medio aspirado. Para desenganchar las células se añadieron 200 µl de Accutase (PAA) y se incubaron las células durante aproximadamente 5 minutos a 372C; 5% CO2 • Las células se desprenden por aclarado repetido y se transfieren a una placa de fondo redondo. Tras centrifugar y aspirar los sobrenadantes las células fueron incubadas con 200 µl de una mezcla de anti-CD23-PE, anti-CD20-FITC y anti-CDl4-APC (todos ellos de BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) . Las células fueron incubadas durante 30 minutos a 4aC, centrifugadas y los sobrenadantes aspirados. Este paso de lavado fue repetido nuevamente y se resuspendió las células en 200 µl de PBS/0.1% albúmina de suero humano y analizadas por FACS mediante un citómetro de flujo Calibur (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) empleando el software CellQuest. En la mayor parte de los casos se adquirieron 10000 eventos, siendo seleccionados y agrupados según la dispersión de la luz, incluyendo sólo los monocitos y linfocitos viables. Las células fueron preagrupadas en linfocitos B, positivos para CD19, o en monocitos, positivos para CD14, y fueron analizados para la expresión de CD23.

Los valores observados de CI50 para la inhibición de la regulación positiva del CD 23 en linfocitos B estaban entre 0.5 nM y >70 nM para los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y LC5002-018 y 13.2 nM para AF152. Para la inhibición de la regulación positiva de CD23 inducida por IL-13 se observó un patrón similar en los monocitos humanos. En el caso de los monocitos los valores de CI50 estaban entre 0.1 nM y 62.8 nM para los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y LC5002-018 y 62.2 nM para AF152. Ejemplo 6 Ensayo de proliferación de TF-1 en respuesta a estimulo por IL-13 o IL-4 Se cultivaron células TF-1 (ATCC # CRL 2003) en medio de cultivo conteniendo RPMl modificado por la ATCC, FBS al 10%, IX Pencilina/Estreptomicina, GM-CST a 2 ng/ml. Un día antes del ensayo las células se traspasaron a un medio sin GM-CSF. Se incubaron 5 x 103 células por cavidad frente a las concentraciones adecuadas de anticuerpos anti-IL-13Ral a 37°C durante 1 hora. A continuación las células fueron estimuladas con IL-13 humana a 2 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN) o IL-4 humana a 0.1 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, M?) e incubadas a 37°C durante 48 horas. Las células fueron expuestas a Timidina- Ci 3H a 0.2 µM e incubadas a 37°C de 16 a 18 horas. Las muestras se recogieron en placas GFC que habían sido tratadas con PEÍ al 1%+BSA al 0.25%, utilizando el cosechador de 96 cavidades Perkin Elmer. Las placas GFC fueron recontadas utilizando un contador de centelleo Perkin Elmer. El análisis de los datos se llevó a cabo con el software PRISM utilizando el ajuste no lineal a una curva de regresión (GraphPad Software, San Diego, CA) . Los anticuerpos anti-KLH no produjeron ningún tipo de inhibición en este ensayo. La misma afirmación resulta válida para LC5002-007. Todos los demás anticuerpos inhibieron la respuesta, incluso LC5002-007 inhibió la respuesta con valores de Cl más altos que otros anticuerpos. Los valores de CI50 observados para los diferentes anticuerpos fueron de: 13.50 nM para AF152, 9.21 nM para LC5002-002, 3.07 nM para LC5002-003 y de 0.39 nM para LC5002-005. Para la proliferación de TF-1 inducida por IL-4 se obtuvo un perfil similar, sin embargo la potencia de los anticuerpos era inferior en comparación con las respuestas inducidas por IL-13. Los valores de CI50 para la proliferación inducida por IL-4 fueron de 0.22 nM para el anticuerpo anti-IL4R, de 74.27 nM para AF152 y para los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y LC5002-018 de entre 4.28 nM y 60 nM. Ejemplo 7 Inhibición de la producción de eotaxina como respuesta a IL-13 en fibroblastos humanos de pulmón. El ensayo se llevó a cabo utilizando células HFL-1 (Fibroblasto de Pulmón Humano, ATCC # CCL-153). Las células fueron sembradas a una densidad de unas 100.200 células por cavidad en una placa de 12 cavidades y se incubaron a 37°C durante 72 horas hasta alcanzar confluencia. Las células fueron posteriormente mantenidas en medio libre de suero durante 24 horas y tratadas con anticuerpos anti-IL-13Ral a 37°C durante 1 hora. A continuación de este tratamiento las células fueron estimuladas con IL-13 a lOng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN) a 37°C durante 48 horas. Se recogieron los sobrenadantes y se determinó el contenido de eotaxina utilizando el kit comercial de R&D Systems (Cat. No. DTX00) . La lectura de absorbancia se hizo con un lector de placas Spectromax y los datos se analizaron con el programa PRISM (GraphPad Software, San Diego, CA) . Los anticuerpos analizados mostraron diferentes capacidades para inhibir la secreción de eotaxina. Con la excepción de LC5002-007 todos los demás anticuerpos analizados mostraron cierta inhibición. El cálculo de la CI5o promedio a partir de 3 a 4 experimentos fue de 11.2 nM para AF152 y de entre 2.45 nM y 19.8 nM para los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y LC5002-018. Ejemplo 8 Inhibición de la fosforilación de Stat-6 inducida por IL-13 en células de músculo liso de bronquio humano Se cultivaron células de músculo liso de bronquio humano (BSMC; Clonetics, Cat. No CC-2576) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las células se cultivaron en placas de 12 cavidades hasta que alcanzaron confluencia. En ese momento de dejaron 24 horas en medio sin suero y se añadieron cantidades diversas de anticuerpo. Las placas se incubaron durante 1 hora y a continuación fueron estimuladas con IL-13 a 2.2ng/ml (R&D System). Los sobrenadantes se recuperaron tras una incubación de 15 minutos, las células fueron lavadas con regulador de pH fosfato, añadiéndose finalmente 100 µl de regulador de pH de lisis. La mezcla se sónico brevemente en hielo y se centrifugó. El ligado se empleó para detección por Western Blot de Stat-6 fosforilada. Se cargó un gel de SDS con cantidades equivalentes de proteína y se transfirió a una membrana. El anticuerpo anti-Stat-6 se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology (Cat. No. SC-11762R) y se utilizó un anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa. La detección se llevó a cabo utilizando el sistema ECL Plus System de Amersham (Cat No RPN 2132) . La cuantificación se hizo con el sistema Typhoon 9400 Imager . Los dos HuMabs analizados en este ensayo (LC50002- 003 y LC5002-005) inhibían la fosforilación de Stat-6 inducida por la IL-13. La potencia observada en este ensayo fue similar a la de otros ensayos funcionales. Los valores de CI5o obtenidos fueron de 18.24nM para AF152, de 5.98 nM para LC5002-003 y de 1.18 nM para LC5002-005.

Ejemplo 9 Clonación y análisis de la secuencia gue codifica para los dominios variables (cadenas ligera-K y pesada-?l) del HuMab anti-hIL-13Ral. Las secuencias de nucleótidos que codificas para la región variable de la cadena ligera VL y la cadena pesada VH de los anticuerpos HuMabs anti hIL-13Ral fueron aisladas por síntesis de ADNc estándar, seguida por PCR. El ARN total fue obtenido a partir de células de hibridoma a lxlO6 - lxlO7 empleando para ello el kit GeneRacer™ (Invitrogen) . El ARN así obtenido se utilizó como molde para la síntesis de la primera cadena del ADNc y ligación del cebador oligo dT GeneRacer™. La síntesis de la segunda cadena del ADNc y la amplificación subsecuente por PCR de los fragmentos que codificas para la VL y la VH se llevó a término con cebadores antisentido para la cadena ligera y pesada, complementarios a las secuencias de nucleótidos que codificas para la secuencia constante de la cadena ligera-K y pesada-?l y con cebadores específicos 5' GeneRacer™, respectivamente. Los productos de PCR se clonaron utilizando el kit de clonación TOPO™ temperatura ambiente de Invitrogen™ Life Technologies y el vector de clonación pCR4-T0P0™. Los productos de PCR clonados fueron identificados por restricción de los plásmidos apropiados utilizando EcoRI para la digestión, con unos fragmentos esperados con tamaños de unos 740 y 790 pares de bases para la VL y la VH, respectivamente. La secuencia de ADN de los fragmentos de PCR clonados se determinó por secuenciación de doble cadena. Para el procesado de las secuencias de ADN se utilizó el paquete de software del GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) en su versión 10.2 y el Vector-NTI 8 (InforMax, Inc) . Las secuencias de ADN y proteína fueron alineadas utilizando el módulo CLUSTALW del GCG. Los alineamientos de secuencia se llevaron a cabo utilizando el programa GENEDOC (versión 2.1). Ejemplo 10 Construcción de los plásmidos de expresión para un anticuerpo IgGl HuMab anti-hIL-13Ral Los genes que codificas para las cadenas ligera y pesada del HuMab anti-hIL-13Ralfueron ensamblados de forma separada en vectores de expresión para células de mamífero. A continuación los segmentos que codificas para la región variable de la cadena ligera (VL) del HuMab anti-hIL-13Ral y para la región constante K de la cadena (CL, SEC N2 ID: 11) fueron unidas del mismo modo que se hizo para los segmentos para la región variable de la cadena pesada humana (VH) y para la región constante ?l de la cadena pesada humana del HuMab anti-hIL-13R al (CH?-bisagra-CH2-CH3, SEC N2 ID: 12) . La información general referente a las secuencias de nucleótidos de las cadenas humanas pesada y ligera, y de su uso de codón está publicado por: Kabat, E. A., Wu, T. T. , Perry, H. M. , Gottesman, K. S., y Foeller, C, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Ed. , NIH Publicación No. 91-3242. La unidad de transcripción de la cadena ligera K del HuMab anti-hIL-13Ral está compuesta por los siguientes elementos : • El potenciador inmediato y temprano y el promotor del citomegalovirus humano (HCMV, por sus siglas en inglés) , • Un 5 ' -UT sintético incluyendo una secuencia Kozak, • Una secuencia señal para la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón incluyendo el intrón de la secuencia señal, • El ADNc clonado para la parte variable de la cadena ligera del HuMab anti-hIL-13Ral, dispuesta en un sitio de restricción Bsml único en su extremo 5', un sitio donante de empalme y un sitio de restricción Notl único en el extremo 3 ' , • El gen para la región constante K humana, incluyendo el potenciador intrónico 2 de ratón para su Ig-K (Picard, D., y Schaffner, W. , Nature 307 (1984) 80-82) y • La secuencia señal para poliadenilación ("poli-A") de la región K de la inmunoglobulina humana. La unidad de transcripción de la cadena pesada ?l del HuMab anti-hIL-13Ral está compuesta por los siguientes elementos : • El potenciador inmediato y temprano y el promotor del citomegalovirus humano (HCMV) , • Un 5 ' -UT sintético incluyendo una secuencia Kozak, • Una secuencia señal para la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón incluyendo el intrón de la secuencia señal, • El ADNc clonado para la parte variable de la cadena pesada del HuMab anti-hIL-13Ral, dispuesta en el sitio de restricción Bsml único en su extremo 5' , un sitio donante de empalme y un sitio restricción Notl único en el extremo 3', • El gen para la región constante ?l humana, incluyendo el potenciador de ratón para su Ig-µ (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378) • La secuencia señal para poliadenilación ("poli-A") de la región ?l de la inmunoglobulina humana. Los elementos funcionales para los plásmidos de expresión de la cadena ligera K y la cadena pesada ?lde los HuMab anti-hIL-13Ral: Además del cásete de expresión antes descrito para la cadena ligera K y la cadena pesada ?lde los HuMab anti-hIL-13Ral, estos plásmidos contienen: • Un gen de resistencia a la higromicina • Un origen de replicación, oriP, del virus Epstein-Barr (EBV) • Un origen de replicación procedente del vector pUC18 que permite la replicación del plásmido en E.coli, y • Un gen de la ß-lactamasa que le aporta resistencia a la ampicilina en E.coli. Ejemplo 11 Construcción y expresión de plásmidos para el anticuerpo mutante (variante) anti-hIL-13Ral IgGl Los plásmidos de expresión que codificas para cadenas pesadas ?l mutantes de los anticuerpos anti-hlL-13Ral, pueden generarse por mutagénesis dirigida sobre los plásmidos de expresión de tipo silvestre utilizando el kit de mutagénesis Dirigido al Sitio QuickChange™ (Stratagene) y están descritos en la tabla 1. Los aminoácido están numerados de acuerdo con la numeración EU (Edelman, G.M. , y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E. A., Wu, T. T. , Perry, H. M. , Gottesman, K. S., and Foeller, C, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Ed., NIH Publication No. 91-3242).

Tabla 1 Ejemplo 12 Producción de HuMabs recombinantes anti-hIL-13Ral Los anticuerpos HuMabs recombinantes fueron generados mediante transfección transitoria de células adherentes HEK293-EBNA (ATTC CRL-10852) cultivadas en medio DMEM (Gibco) complementado con un 10% de FCS con un contenido muy bajo en IgG (Gibco) , Glutamina 2 mM (Gibco) , un 1% v/v de aminoácido no esenciales (Gibco) y 250 µg/ml de G418 (Roche Diagnostics GmbH, DE) . Para la transfección se utilizó el reactivo de transfección Fugene™ 6 (Roche Diagnostics GmbH, DE) en una proporción de reactivo (µl) respecto a ADN (µg) entre 3:1 y 6:1. Las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina fueron expresadas a partir de dos plásmidos diferentes, utilizando una proporción molar de plásmidos que codificas para cadenas pesadas y ligeras de 1:2 a 2:1. Los sobrenadantes de cultivo que contenían anticuerpos monoclonales humanos (HuMab) fueron recuperados entre los días 4 y 11 tras la transfección. Se puede encontrar información general referente a la expresión recombinante de anticuerpos humanos en líneas como las HEK293 en: Meissner, P. , y otros, Biotechnol Bioeng 75 (2001) 197-203. Ejemplo 13 a) Análisis de afinidad de los HuMabs LC5002-003, -005, and -007 frente a hIL-13Ral: hFc quimérico Para los análisis de interacción se empleo como instrumento el Biacore 3000. Como regulador de pH de operación y de reacción se utilizó HBS-P (HEPES lOmM, NaCl 150 mM, poli-agente tensioactivo P al 0.005%, pH 7.4) a 25°C. Las moléculas capturadoras (anticuerpos de cabra anti IgG humano, específicos para Fc?) se enlazaron por su amina a una concentración de 20 µg/ml con un flujo de 5 µl/min durante 20 minutos. Los HuMabs se inyectaron a una concentración de 1 µg/ml con un flujo de 10 µl/min durante 1 minuto. El bloqueo de FcY que quedó libre de anticuerpos de cabra anti humano IgG-F, se hizo mediante la inyección de gammaglobulina humana 500 nM a un flujo de 30 µl/min durante 3 minutos. El analito (la proteína quimérica hIL-13Ral: hFc) se inyectó durante dos minutos a cinco concentraciones diferentes, entre 5.63 nM y 90 nM, haciéndose un lavado con el regulador de pH HBS-P durante cinco minutos. La regeneración de la superficie se obtuvo mediante dos inyecciones de HCl lOOmM HCl durante 1 minuto. El chip, formato del ensayo y la secuencia de inyecciones, así como los datos cinéticos son los descritos en la tabla 2. Los datos del control negativo (por ejemplo, curvas del regulador de pH) se sustrajeron de las curvas de muestras para la corrección de tendencia de la línea de base intrínseca del sistema y reducción de la señal de ruido. Para el análisis de los sensogramas y el cálculo de los datos de afinidad se utilizó el software BiaEvaluation versión 4.01. Los datos de las cinéticas se obtuvieron por ajuste de los datos a un modelo de unión 1:1 de Langmuir (Tabla 2) .

Tabla 2: Análisis de afinidades de HuMab sobre hIL-13Ral: hFc. Análisis de datos basado en un modelo de unión 1:1 d< Langmuir b) Análisis de afinidad de los HuMabs LC5002-003, -005 and -007 sobre el dominio extracelular del hIL-13Ral obtenido a partir de la proteína quimérica hIL-13Ral: hFc Para los análisis de interacción se empleo como instrumento el Biacore 3000. Como regulador de pH de carrera y de reacción se utilizó HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, poli-agente tensioactivo P al 0.205%, pH 7.2) a 25°C. Las moléculas capturadoras (anti-hFc?) se enlazaron por su amina a una concentración de 100 µg/ml con un flujo de 5 µl/min durante 20 minutos. Los HuMabs se inyectaron a una concentración de 10 µg/ml con un flujo de 10 µl/min durante 30 segundos. Las moléculas hIL-13Ral procesadas (Mw40kDa) se inyectaron durante 200 segundos a siete concentraciones diferentes, entre 1.26nM y lOOnM, haciéndose un lavado con el regulador de pH HBS-P durante cinco minutos. La regeneración de la superficie se obtuvo mediante dos inyecciones de HCl 100 mM HCl durante 1 minuto cada una con un flujo de 10 µl/min. El chip, formato del ensayo y la secuencia de inyecciones, así como los datos cinéticos son los descritos en la tabla 3. Los datos de las cinéticas se obtuvieron por ajuste de los datos a un modelo de unión 1:1 de Langmuir. Tabla 3 : c) Análisis comparativo de la afinidad de las variantes recombinantes de LC5002-005, empleando el domino extracelular del hIL-13Ral procesado a partir de la proteina quimérica hIL-13R l: hFc. En estos experimentos se comparó la afinidad de la IgGl original, derivada del hibridoma con las afinidades de las variante recombinante IgGl-Ala-Ala. Para los análisis de interacción se utilizó el Biacore 3000. Como regulador de pH de carrera y de reacción se utilizó HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, poli-agente tensioactivo P al 0.205%, pH 7.2 ) a 25°C. Las moléculas de anticuerpo capturadoras (anti-hFc?) se enlazaron por su amina a una concentración de 20 µg/ml con un flujo de 5 µl/min durante 20 minutos. Los HuMabs se inyectaron a una concentración de 10 µg/ml con un flujo de 10 µl/min durante 1 minuto. Las moléculas hIL-13Ral procesadas (analito) se inyectaron durante 5 minutos a ocho concentraciones diferentes, entre 1.26 nM y 200 nM, haciéndose un lavado con el regulador de pH HBS-P durante cinco minutos. La regeneración de la superficie se obtuvo mediante dos inyecciones de HCl 100 mM HCl durante 1 minuto cada una. El chip, formato del ensayo y la secuencia de inyecciones, así como los datos cinéticos son los descritos en la tabla 4. Los datos de las cinéticas se obtuvieron por ajuste de los datos a un modelo de unión de analito bivalente .

Tabla 4 Ejemplo 14 Comprobación por ELISA de la reacción cruzada de los HuMab frente a hIL-13Ra2 y a hIL-4Ra Las proteínas quiméricas hIL-13Ra2 : hFc y hIL-4R : hFc (R&D Systems, UK) fueron disueltas en PBS (lµg/ml) y adsorbidas a placas de microtitulación (NUNC Maxisorb) mediante una incubación durante toda una noche a 42C. Tras un lavado de las placas con regulador de pH de lavado (TL = 0.9% ?aCl; 0.2% Tween® 20) los lugares de unión no específica fueron bloqueados mediante la adición de 100 µl regulador de pH de incubación (TI = PBS con 1% de proteína C y 0.1% de Tween® 20) incubándose durante 30 minutos a temperatura ambiente (temperatura ambiente). Tras esto se hicieron diluciones seriadas de los HuMab y de los anticuerpos control (100 µl /cavidad; diluciones en TI) , estas se añadieron e incubaron durante lh a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas de nuevo y los anticuerpos humanos unidos se detectaron mediante una incubación con anti kappa humano de conejo conjugado a peroxidasa (DAKO, Dinamarca) a una dilución final de 1:500 en TI. Tras incubarse durante lh a temperatura ambiente y tras un nuevo paso de lavado, las placas se revelaron con solución ABTS lista para su uso (Roche Diagnostics GmbH) a temperatura ambiente en la oscuridad. La absorbancia a 405nM se midió en el momento en que la absorbancia de la concentración más alta alcanzaba un valor suficiente. Todos los anticuerpos frente al IL-13Ralphal analizados demostraron unión al dominio extracelular inmovilizado del IL-13Ral humano, pero no a hIL-13Ra2 ni a hIL-4Ra (Figura 4) . Ejemplo 15 Reacción cruzada de los con el IL-13Ral murino La proteína quimérica de murino IL-13R l: hFc (R&D Systems, UK) se disolvió en PBS (lµg/ml) incubándose en placas de microtitulación para su adsorción (NUNC Maxisorb) mediante incubación a 4SC toda la noche. Tras un lavado de las placas con regulador de pH de lavado (TL = 0.2% ?aCl; 0.2% Tween® 20) los lugares de unión no específica fueron bloqueados mediante la adición de 100 µl regulador de pH de incubación (TI - PBS con 1% de proteína C y 0.2% de Tween® 20) e incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente (temperatura ambiente) . Tras esto se hicieron diluciones seriadas de los HuMab y de los anticuerpos control (HuMab anti-KLH y policlonal de cabra anti-hIL-13Rccl (R&D Systems) ) , se añadieron a los cavidades (100 µl /cavidad; diluciones en TI) , estas se añadieron e incubaron durante lh a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas de nuevo y los anticuerpos humanos unidos se detectaron mediante una incubación con anti-kappa humano de conejo conjugado a peroxidasa (DAKO, Dinamarca) a una dilución final de 1:500 en TI. Los anticuerpos policlonales de cabra anti-hIL-13Ral se detectaron con un policlonal anti IgG de cabra producido en burro y conjugado con peroxidasa (Santa Cruz; dilución 1:1000 en TI) . Tras incubarse durante 1 h a temperatura ambiente y tras un nuevo paso de lavado, las placas se revelaron con solución ABTS lista para su uso (Roche Diagnostics GmbH) a temperatura ambiente en la oscuridad. La absorbancia a 405nM se midió en el momento en que la absorbancia de la concentración más alta alcanzaba un valor suficiente (Figura 5) . Ejemplo 16 Reacción cruzada de los HuMab frente al IL-13Ral de Cinomolgus El gen que codifica para el IL-13Ral fue aislado por RT-PCR a partir de tejido de Cinomolgus y fue transfectado a la línea celular de murino Ba/F3. Para comprobar si los anticuerpos HuMabs tenían reacción cruzada o no con la IL-13Ral de Cinomolgus, se incubaron tanto las células Ba/F3 transfectadas y estabilizadas como las Ba/F3 parentales frente a HuMab a lOµg/ml y a anticuerpos control. Como control positivo se utilizó un policlonal de cabra anti-hIL-13Ral (R&D Systems). Los controles negativos incluidos fueron: una proteína IgGl de mieloma humano (Nórdico) y un suero de cabra normal . Los anticuerpos unidos fueron detectados mediante análisis por FACS utilizando un anticuerpo frente a la IgG humana conjugado con FITC para detectar los HuMabs y un anticuerpo específico para las IgG de cabra conjugado con FITC para la detección de los anticuerpos de cabra. Se compararon las intensidades de fluorescencia medias (IFM) para los diferentes anticuerpos probados sobre la línea transfectada Ba/F3 frente a los obtenidos con la línea parental. Todos los HuMabs de la invención fueron capaces de unirse al IL-13Ral de Cinomolgus expresado por células Ba/F3 transfectadas. Tal y como era de esperar debido a la gran homología existente entre el IL-13R l humano y el de Cinomolgus, también el anticuerpo policlonal AF152 presentaba unión al IL-13R l de Cinomolgus. Los anticuerpos control negativo presentaron sólo un aumento marginal de si IFM cuando se ensayaron con la línea celular Ba/F3 transfectada (Tabla 5) .

Tabla 5 Ejemplo 17 Unión de HuMab anti-IL-13R l a receptores de Fc? (unión a Fc?RIIIa en células T asesinas) Para determinar la capacidad de los anticuerpos de la invención para unirse a Fc?RIIIa (CD16) en células T asesinas (NK) , se aislaron en primer lugar Células Mononucleadas de Sangre Periférica (PBMCs) y se incubaron con anticuerpo HuMab a 20 µg/ml y con anticuerpos control en presencia o ausencia de anticuerpo de ratón bloqueante para Fc?RIIIa (anti-CD16, clone 3G8, RDI , Flanders, NJ) a 20 µg/ml, comprobándose así la unión vía Fc?RIIIa. Como controles negativos se usaron IgG2 e IgG4 humana (El Sitio de unión) , que no se unen a Fc?RIIIa. Las IgGl y IgG3 humanas (El sitio de unión) se utilizaron como controles positivos para unión a Fc?RIIIa. Los anticuerpos unidos a las células T asesinas se detectaron por análisis de FACS utilizando un anticuerpo anti CD56 humano (marcador de superficie de las células NK) de murino, marcado con ficoeritrina (PE) (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) en combinación con un F (ab)2 de cabra anti IgG humana (Fc) marcado con FITC (Protos immunoresearch , Burlingame, CA) . Determinándose la unión máxima a 20 µg/ml (Umax: IFM±desv . est . ) del HuMab analizado. El LC5002-005 era capaz de unirse a Fc?RIIIa de forma eficiente (comparable al anticuerpo IgGl control) tal como indicaba un valor de Umax (IFM) de 580.2±245.2. La adición de un anticuerpo de bloqueo frente a Fc?RIIIa reducía de forma muy importante la unión de LC5002-005 a las células NK (Umax (IFM) de 260.2+95.20) indicando una unión específica a Fc?RIIIa. Listado de Referencias Aikawa, M. , y otros, Cytokine 13 (2001) 75-84 Aplin, J.D., and Wriston, J.C. Jr., CRC Crit. Rev.

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Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1.- Un anticuerpo que se une a IL-13Ral y que inhibe IL-13, caracterizado porque la secuencia de aminoácido de la parte variable de la cadena pesada CDR3 del anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de las secuencias de cadena pesada CDR3 de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7 ó 9.
2.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las secuencias de aminoácido CDRl y CDR2 de la parte variable de la cadena pesada del anticuerpo se seleccionan del grupo que consiste de secuencias CDRl y CDR2 de cadena pesada de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7 ó 9
3. - El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque las secuencias variables de aminoácido CDRl, CDR2 o CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo se seleccionan del grupo que consiste de las secuencias variables de aminoácido de la cadena ligera CDRl, CDR2 y CDR3 de SEC ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10.
4. - El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende una cadena pesada humana ?l que comprende a) la secuencia de aminoácido Pro233Val23Ala3s con eliminación de Gly236 y/o la secuencia de aminoácido Gly327Leu328Pro329Ser330Ser33? , b) la secuencia de aminoácido Ala234Ala235 o c) los aminoácidos Ala265 y Ala97.
5.- El anticuerpo, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque es un anticuerpo humano .
6.- El anticuerpo, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque tiene una afinidad de unión de 10"9 o menor, preferentemente de 10"9 a 10"13 M para la unión a IL-13Ral.
7.- El anticuerpo, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque se obtiene a partir de una línea celular de hibridoma DSM ACC2709, DSM ACC2710, DSM ACC2711 o DSM ACC2712.
8. - El anticuerpo, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende como región variable de la cadena pesada a la región SEC ID NO: 1 y como región variable de la cadena ligera a SEC ID NO: 2, como región variable de la cadena pesada a la región SEC ID NO: 3 y como región variable de la cadena ligera a SEC ID NO: 4, como región variable de la cadena pesada a la región SEC ID NO: 5 y como región variable de la cadena ligera a la de SEC ID NO: 6, como región variable de la cadena pesada a la región con SEC ID NO: 7 y como región variable de la cadena ligera a la de SEC ID NO: 8 o como región variable de la cadena pesada a la región SEC ID NO: 9 y como región variable de la cadena ligera a la de SEC ID NO: 10.
9. - El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque comprende: a) como región variable de la cadena pesada la SEC ID NO: 1, como región variable de la cadena ligera la SEC ID NO: 2, como región constante de la cadena ligera K la SEC ID NO: 11 y como región constante de la cadena pesada ?l la SEC ID NO: 12 opcionalmente con mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A, b) como región variable de la cadena pesada la SEC ID NO: 3, como región variable de la cadena ligera la SEC ID NO: 4, como región constante de la cadena ligera K la SEC ID NO: 11 y como región constante de la cadena pesada ?l la SEC ID NO: 12 opcionalmente con mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A, c) como región variable de la cadena pesada la SEC ID NO: 5, como región variable de la cadena ligera la SEC ID NO: 6, como región constante de la cadena ligera K la SEC ID NO: 11 y como región constante de la cadena pesada ?l SEC ID NO: 12 opcionalmente con mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A, d) como región variable de la cadena pesada la SEC ID NO: 7, como región variable de la cadena ligera la SEC ID NO: 8, co o región constante de la cadena ligera K la SEC ID NO: 11 y como región constante de la cadena pesada ?l la SEC ID NO: 12 opcionalmente con mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A, o e) como región variable de la cadena pesada la SEC ID NO: 9, como región variable de la cadena ligera la SEC ID NO: 10, como región constante de la cadena ligera K la SEC ID NO: 11 y como región constante de la cadena pesada ?l SEC ID NO: 12 opcionalmente con mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A.
10.- El uso de un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricación de una composición farmacéutica.
11.- Una composición farmacéutica caracterizada porque incluye una cantidad de un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9.
12.- Una célula huésped recombinante caracterizada porque es capaz de producir un anticuerpo recombinante de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9.
13.- El método para la producción de una composición farmacéutica caracterizado porque comprende un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9.
14.- Un ácido nucleico caracterizado porque codifica un polipéptido capaz de ensamblarse con la otra cadena de anticuerpo respectivamente, descrita más adelante, donde dicho polipéptido es ya sea: a) una cadena pesada de anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7 ó 9. b) una cadena ligera de anticuerpo que incluye regiones de variables de cadena ligera de SEC ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10. en donde las CDR se seleccionan de forma independiente una de la otra.
15.- Un vector de expresión caracterizado porque incluye un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14, capaz de expresar el ácido nucleico en una célula huésped eucariota o procariota.
16.- Una célula huésped procariota o eucariota caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 15.
17. - Un método para la producción de un polipéptido con capacidad de unión a IL-13RCC1 y que inhibe la unión de IL-13 a IL-13Ral, caracterizado porque expresa un ácido nucleico que codifica una cadena pesada y un ácido nucleico que codifica una cadena ligera de conformidad con la reivindicación 14 en una célula huésped procariota o eucariota y la recuperación del polipéptido a partir de la célula citada.
18.- Uso de un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un paciente que requiera terapia para el asma o antialérgica.
19. - El método para la preparación del compuesto farmacéutico caracterizado porque incluye un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9 producido mediante expresión recombinante, recuperando el anticuerpo y combinándolo con un anticuerpo con un adyuvante y/o regulador farmacéuticamente aceptables .
20.- Las líneas celulares de hibridoma DSM ACC2709, DSM ACC2710, DSM ACC2711 o DSM ACC2712.