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MX2007007590A - Composiciones que contienen, metodos que involucran y usos de aminoacidos no naturales y polipeptidos. - Google Patents

Composiciones que contienen, metodos que involucran y usos de aminoacidos no naturales y polipeptidos.

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Publication number
MX2007007590A
MX2007007590A MX2007007590A MX2007007590A MX2007007590A MX 2007007590 A MX2007007590 A MX 2007007590A MX 2007007590 A MX2007007590 A MX 2007007590A MX 2007007590 A MX2007007590 A MX 2007007590A MX 2007007590 A MX2007007590 A MX 2007007590A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
substituted
alkylene
group
amino acid
alkyl
Prior art date
Application number
MX2007007590A
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English (en)
Inventor
Zhenwei Miao
Junjie Liu
Thea Norman
Russell Driver
Original Assignee
Ambrx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ambrx Inc filed Critical Ambrx Inc
Publication of MX2007007590A publication Critical patent/MX2007007590A/es

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Abstract

Se describen aminoacidos no naturales y polipeptidos que incluyen por lo menos un aminoacido no natural y metodos para la fabricacion de tales aminoacidos no naturales y polipeptidos. Los aminoacidos no naturales, por si mismos o como parte de un polipeptido puede incluir un amplio intervalo de funcionalidades posibles, pero comunmente tiene por lo menos un grupo oxima, carbonilo, dicarbonilo y/o hidroxilamina. Tambien se revelan en la presente polipeptidos de aminoacido no naturales que son modificados ademas post-traduccionalmente, metodos para efectuar tales modificaciones y metodos para la purificacion de tales polipeptidos. Comunmente, los polipeptidos de aminoacido no naturales modificados incluyen por lo menos un grupo oxima, carbonilo, dicarbonilo y/o hidroxilamina. Se revelan ademas metodos para el uso de tales polipeptidos de aminoacido no naturales y polipeptidos de aminoacido no naturales modificados, en los que se incluyen usos terapeuticos, de diagnostico y otros usos de biotecnologia.

Description

COMPOSICIONES QUE CONTIENEN, MÉTODOS QUE INVOLUCRAN Y USOS DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES Y POLIPÉPTIDOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La habilidad de incorporar aminoácidos no codificados genéticamente (esto es, "aminoácidos no naturales") a proteínas permite la introducción de grupos funcionales químicos que podrían proporcionar alternativas valiosas a los cuerpos funcionales que se presentan de manera estable en la naturaleza, tales como el épsilon -NH2 de lisina, el sulfhidrilo -SH de cisteína, el grupo imino de histidina, etc. se sabe que ciertos grupos funcionales químicos son inertes a los grupos funcionales encontrados en el 20 aminoácidos codificados genéticamente comunes, pero reaccionan limpia y eficientemente para formar enlaces estables con grupos funcionales que pueden ser incorporados sobre aminoácidos no naturales . Están ahora disponibles métodos para introducir selectivamente grupos funcionales químicos que no son encontrados en proteínas, que son químicamente inertes a todos los grupos funcionales encontrados en el 20 aminoácidos codificados genéticamente comunes y que pueden ser usados para reaccionar eficiente y selectivamente con reactivos que comprenden ciertos grupos funcionales para formar enlaces covalentes estables.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se describen en la presente métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricar, purificar, caracterizar, y usar aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados. En un aspecto se encuentran métodos, composiciones, técnicas y estrategias para derivar un aminoácido no natural y/o un polipéptido de aminoácido no natural. En una modalidad, tales métodos, composiciones, técnicas y estrategias involucran derivación química, en otras modalidades, derivación biológica, en otras modalidades, derivación física, en otras modalidades una combinación de derivaciones. En demás modalidades o modalidades adicionales, tales derivaciones son regioselectivas . En modalidades adicionales, tales derivaciones son regioespecíficas . En modalidades adicionales, tales derivaciones son rápidas a temperatura ambiente. En demás modalidades o modalidades adicionales, tales derivaciones ocurren en soluciones acuosas. En demás modalidades y modalidades adicionales, tales derivaciones ocurren a un pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 10. En demás modalidades o modalidades adicionales, con la adición de un acelerante tales derivaciones son estequiométricas, casi estequiométricas o semejante a estequiométricas tanto en el reactivo que contiene aminoácido no natural como el reactivo derivatizante . En demás modalidades o modalidades adicionales se proporcionan métodos que, con la adición de un acelerante, permiten la incorporación estequiométrica, casi estequiométrica o semejante a estequiométrica de un grupo deseado sobre un polipéptido de aminoácido no natural. En demás modalidades o modalidades adicionales se proporcionan estrategias, mezclas de reacción, condiciones sintéticas que, con la adición de un acelerante, permiten la incorporación estequiométrica, casi estequiométrica o semejante a estequiométrica de un grupo deseado sobre un polipéptido de aminoácido no natural. En un aspecto se encuentran aminoácidos no naturales para la derivación química de péptidos y proteínas en base a un enlace de oxima. En demás modalidades o modalidades adicionales, el aminoácido no natural es incorporado a un polipéptido, esto es, tales modalidades son polipéptidos de aminoácido no natural. En demás modalidades o modalidades adicionales, los aminoácidos no naturales son funcionalizados sobre sus cadenas laterales del tal manera que su reacción con una molécula derivatizante genera un enlace de oxima. En demás modalidades o modalidades adicionales se encuentran polipéptidos de aminoácido no natural que pueden reaccionar con una molécula derivatizante para generar un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima. En demás modalidades o modalidades adicionales, los aminoácidos no naturales son seleccionados de aminoácidos que tienen cadenas laterales de carbonilo, dicarbonilo, acetal, hidroxilamina u oxima. En demás modalidades o modalidades adicionales, los aminoácidos no naturales son seleccionados de aminoácidos que tienen cadenas laterales carbonilo, dicarbonilo, hidroxilamina u oxima, protegidas o enmascaradas. En demás modalidades o modalidades adicionales, los aminoácidos no naturales comprenden una cadena lateral enmascarada por oxima. En demás modalidades o modalidades adicionales, los aminoácidos no naturales comprenden cadenas laterales de carbonilo o dicarbonilo en donde el carbonilo o dicarbonilo es seleccionado de una cetona o un aldehido. En otra modalidad se encuentran aminoácidos no naturales que contienen un grupo funcional que es capaz de formar una oxima después de tratamiento con co-reactivo apropiadamente funcionalizado. En una modalidad adicional, los aminoácidos no naturales se asemejan a un aminoácido no natural en estructura, pero contienen uno de los grupos funcionales mencionados anteriormente. En otra modalidad o modalidad adicional, los aminoácidos no naturales se asemejan a fenilalanina o tirosina (aminoácidos aromáticos) ; en tanto que en una modalidad separada, los aminoácidos no naturales se asemejan a alanina y leucina (aminoácidos hidrofóbicos) . En una modalidad, los aminoácidos no naturales tienen propiedades que son distintas de aquellos de los aminoácidos naturales. En una modalidad, tales propiedades distintas son la reactividad química de la cadena lateral, en una modalidad adicional esta reactividad química distinta permite que la cadena lateral del aminoácido no natural sufra una reacción en tanto que es una unidad de un polipéptido, aunque las cadenas laterales de las unidades de aminoácido que se presentan de manera estable en la naturaleza en el mismo polipéptido no sufren la reacción mencionada anteriormente. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural tiene una química ortogonal a aquella de los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural comprende una porción que contiene electrófilo; en una modalidad adicional, la porción que contiene electrófilo sobre la cadena lateral del aminoácido no natural puede sufrir ataque nucleofílico para generar una proteína derivada de oxima. En cualquiera de las modalidades mencionadas anteriormente en este párrafo, el aminoácido no natural puede existir como una molécula separada o puede ser incorporado a un polipéptido de cualquier longitud; si es lo último, entonces el polipéptido puede incorporar adicionalmente aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza o aminoácidos que no se presentan de manera estable en la naturaleza. En otro aspecto, se encuentran moléculas hidroxilamina-sustituidas para la producción de polipéptido de aminoácido no naturales derivados en base a un enlace de oxima. En una modalidad adicional se encuentra moléculas hidroxilamina-sustituidas usadas para derivar polipéptidos de aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo vía la formación de un enlace de oxima entre la molécula derivatizante y el polipéptido de aminoácido no natural que contiene carbonilo o dicarbonilo. En modalidades adicionales los polipéptidos de aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo mencionados anteriormente son polipéptidos de aminoácido no natural que contienen ceto. En demás modalidades o modalidades adicionales, los aminoácidos no naturales que contienen carbonilo o dicarbonilo comprenden cadenas laterales seleccionadas de una cetona o un aldehido. En demás modalidades o modalidades adicionales, las moléculas hidroxilamina-sustituidas comprenden un grupo seleccionado de: un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de fotoreticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelante de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; una etiqueta de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional nuevo; un grupo que interactúa covalente o covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica, un ligando, una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción isotópicamente marcada; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor; un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptámero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa y cualquier combinación de los mismos. En demás modalidades o modalidades adicionales, las moléculas hidroxilamina-sustituidas son moléculas de polietilenglicol (PEG) hidroxilamina-sustituidas. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural tiene una química ortogonal a aquella de los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza que permite que el aminoácido no natural reaccione selectivamente con las moléculas hidroxilamina-sustituidas. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural comprende una porción que contiene electrófilo que reacciona selectivamente con la molécula que contiene hidroxilamina; en una modalidad adicional, la porción que contiene electrófilo sobre la cadena lateral del aminoácido no natural puede sufrir ataque nucleofílico para generar una proteína oxima-derivada. En un aspecto adicional relacionado con las modalidades descritas en este párrafo se encuentran los polipéptidos de aminoácido no natural modificados que resultan de la reacción de la molécula derivatizante con los polipéptidos de aminoácido no natural. Modalidades adicionales incluyen cualesquier modificaciones de los polipéptido de aminoácido no natural ya modificados. En otro aspecto, se encuentran moléculas carbonil- o dicarbonil-sustituido para la producción de polipéptidos de aminoácido no natural derivados en base a un enlace de oxima. En una modalidad adicional se encuentran moléculas carbonil- o dicarbonil-sustituidas usadas para derivar polipéptidos de aminoácido no natural que contienen oxima vía una reacción de intercambio de oxima entre la molécula derivatizante y el péptido o proteína que contiene oxima. En una modalidad adicional se encuentran moléculas carbonil- o dicarbonil-sustituidas que pueden sufrir intercambio de oxima con un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima en un intervalo de pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8. En una modalidad adicional se encuentran moléculas carbonil- o dicarbonil-sustituidas usadas para derivar polipéptidos de aminoácido no natural que contienen oxima o que contienen hidroxilamina vía la formación de un enlace de oxima entre la molécula derivatizante y los polipéptidos de aminoácido no natural que contienen oxima (formando así un nuevo enlace de oxima vía una reacción tipo intercambio) o que contienen hidroxilamina. En una modalidad adicional, las moléculas carbonil- o dicarbonil-sustituidas son moléculas aldehido sustituidas. En modalidades adicionales, las moléculas carbonil- o dicarbonil-sustituidas comprenden un grupo seleccionado de: un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; una etiqueta de foto-afinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelante de metal; un co- factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; una etiqueta de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un nuevo grupo funcional ; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción foto-enjaulada; una porción excitable por radiación actínica, un ligando, una porción foto-isomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo ; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor; un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptamero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa, y cualquier combinación de los mismos. En demás modalidades o modalidades adicionales, las moléculas aldehido-sustituidas son moléculas de polietilenglicol (PEG) aldehido-sustituidas. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural tienen una química ortogonal a aquellas de los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza que permite que el aminoácido no natural reaccione selectivamente con las moléculas carbonil- o dicarbonil-sustituidas. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural comprende una porción, a manera de ejemplo un grupo oxima o hidroxilamina, que reacciona selectivamente con la molécula que contiene carbonilo o dicarbonilo; en una modalidad adicional, la porción nucleofílica sobre la cadena lateral del aminoácido no natural puede sufrir ataque electrofílico para generar una proteína oxima-derivada . En un aspecto relacionado adicional a las modalidades descritas en este párrafo se encuentran los polipéptidos de aminoácido no natural modificados que resultan de la reacción de la molécula derivatizante con los polipéptidos de aminoácido no natural. Modalidades adicionales incluyen cualesquier modificaciones adicionales de los polipéptidos de aminoácido no naturales ya modificados. En otro aspecto se encuentran enlazadores mono-, bi-y multi-funcionales para la generación de polipéptidos de aminoácido no naturales derivados en base a un enlace de oxima. En una modalidad se encuentran enlazadores moleculares (bi- y multi-funcionales) que pueden ser usados para conectar polipéptidos de aminoácido no natural que contiene carbonilo- o dicarbonilo a otras moléculas. En otra modalidad se encuentran enlazadores moleculares (bi- y multi-funcionales) que pueden ser usados para conectar polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen oxima o hidroxilamina a otras moléculas. En otra modalidad los polipéptidos de aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo comprenden una cadena lateral de cetona y/o un aldehido. En una modalidad que utiliza un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima o hidroxilamina, el enlazador molecular contiene un grupo carbonilo o dicarbonilo en uno de sus términos; en modalidades adicionales, el grupo carbonilo o dicarbonilo es seleccionado de un grupo aldehido o un grupo cetona. En demás modalidades o modalidades adicionales, las moléculas enlazadores hidroxilamina-sustituidas son moléculas enlazadoras de polietilenglicol (PEG) hidroxilamina-sustituidas. En demás modalidades o modalidades adicionales, las moléculas enlazadoras carbonil- o dicarbonil-sustituidas son moléculas enlazadoras de polietilenglicol (PEG) carbonilo o dicarbonilo-sustituidas. En modalidades adicionales, la frase "otras moléculas" incluye, a manera de ejemplo solamente, proteínas, otros polímeros y moléculas pequeñas. En demás modalidades o modalidades adicionales, los enlazadores moleculares que contienen hidroxilamina comprenden los mismos grupos o grupos equivalentes sobre todos los términos, de tal manera que después de la reacción con un polipéptido de aminoácido no natural que contiene carbonilo o dicarbonilo, el producto resultante es la homo-multimerización del polipéptido de aminoácido no natural que contiene carbonilo o dicarbonilo. En modalidades adicionales, la homo-multimerización es una homo-dimerización. En demás modalidades o modalidades adicionales, los enlazadores moleculares que contienen carbonilo o dicarbonilo comprenden los mismos grupos o grupos equivalentes sobre todos los términos, de tal manera que después de reacción con un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima o hidroxilamina, el producto resultante es la homo-multimerización del polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima o hidroxilamina. En modalidades adicionales, la homo-multimerización es una homo-dimerización. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural tiene una química ortogonal a aquellos de los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza que permite que el aminoácido no natural reaccione selectivamente con las moléculas enlazadoras hidroxilamina-sustituidas. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural tiene una química ortogonal a aquella de los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza que permite que el aminoácido no natural reaccione selectivamente con las moléculas enlazadoras carbonilo- o dicarbonilo-sustituidas . En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural comprende una porción que contiene electrófilo que reacciona selectivamente con la molécula enlazadora que contiene hidroxilamina; en una modalidad adicional, la porción que contiene electrófilo sobre la cadena lateral del aminoácido no natural puede sufrir ataque nucleofílico por la molécula enlazadora que contiene hidroxilamina para generar una proteína oxima-derivada. En un aspecto adicional relacionado con las modalidades descritas en este párrafo se encuentran los polipéptidos de aminoácido no natural "modificados o sin modificar" enlazados que resulta de la reacción de la molécula enlazadora con los polipéptidos de aminoácido no natural. Modalidades adicionales incluyen cualesquier modificaciones adicionales de los polipéptidos de aminoácido no natural "modificados o sin modificar" ya enlazados. En un aspecto se encuentran métodos para derivar proteínas vía la condensación de reactivos de carbonilo o dicarbonilo e hidroxilamina para generar un producto a base de oxima. Incluidos dentro este aspecto se encuentran métodos para la derivatización de proteínas en base a la condensación de reactivos que contienen carbonilo o dicarbonilo e hidroxilamina para generar un producto de adición de proteína derivado de oxima. En demás modalidades o modalidades adicionales se encuentran métodos para derivar proteínas que contienen ceto con moléculas de polietilenglicol (PEG) hidroxilamina-funcionalizadas . En todavía aspectos adicionales se encuentran métodos para derivar proteínas que contienen oxima vía una reacción de intercambio de oxima entre una molécula derivatizante que contiene carbonilo o dicarbonilo y el péptido o proteína que contiene oxima. En todavía aspectos adicionales, la molécula hidroxilamina-sustituida puede incluir proteínas, otros polímeros y moléculas pequeñas. En otro aspecto se encuentran métodos para la síntesis química de moléculas hidroxilamina-sustituidas para la derivatización de proteínas ceto-sustituidas . En otro aspecto se encuentran métodos para la síntesis química de moléculas hidroxilamina-sustituidas para la derivación de proteínas aldehido-sustituidas. En una modalidad, la molécula hidroxilamina-sustituida puede comprender péptidos, otros polímeros (sin ramificar o ramificados) y moléculas pequeñas. En una modalidad se encuentran métodos para la preparación de moléculas hidroxilamina-sustituidas apropiadas para la derivación de polipéptidos de aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo, en los que se incluyen, a manera de ejemplo solamente, polipéptidos de aminoácido no natural que contienen ceto. En una modalidad adicional, los aminoácidos no naturales son incorporados específicamente en el sitio durante la traducción in vivo de proteínas. En demás modalidades o modalidades adicionales, las moléculas hidroxilamina-sustituidas permiten la derivación especifica en el sitio de este aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo vía un ataque nucleofílico del grupo carbonilo o dicarbonilo para formar un polipéptido oxima-derivado de manera específica del sitio. En una modalidad adicional, el método para la preparación de moléculas hidroxilamina-sustituidas proporciona acceso a una amplia variedad de polipéptidos derivados específicamente en el sitio. En una modalidad adicional se encuentran métodos para la síntesis de moléculas de polietilenglicol (PEG) hidroxilamina-funcionalizadas . En otro aspecto se encuentran métodos para la síntesis química de moléculas carbonilo- o dicarbonilo-sustituidas para la derivación de polipéptidos de aminoácido no natural oxima-sustituidos . En una modalidad, la molécula carbonilo- o dicarbonilo-sustituida es una molécula ceto-sustituida. En una modalidad, la molécula carbonilo- o dicarbonilo-sustituida es una molécula aldehido-sustituida. En otra modalidad, las moléculas carbonilo- o dicarbonilo-sustituidas incluyen proteínas, polímeros (sin ramificar y ramificados) y moléculas pequeñas. En una modalidad adicional, tales métodos complementan la tecnología que permite la incorporación específica del sitio de aminoácidos no naturales durante la traducción in vivo de proteínas. En una modalidad adicional se encuentran métodos generales para la preparación de moléculas carbonilo- o dicarbonilo-sustituidas apropiadas para reacción con polipéptidos de aminoácido no natural que contienen oxima para proporcionar polipéptidos de aminoácido no natural derivados específicamente en el sitio. En una modalidad adicional se encuentran métodos para la síntesis de moléculas de polietilenglicol (PEG) carbonil- o dicarbonil-sustituidas. En otro aspecto se encuentran métodos para la derivación química de polipéptidos de aminoácido no natural carbonilo- o dicarbonilo-sustituidos utilizando un enlazador bi-funcional que contiene hidroxilamina. En una modalidad se encuentran métodos para anexar un enlazador hidroxilamina-sustituido a una proteína carbonilo- o dicarbonilo-sustituida vía una reacción de condensación para generar un enlace de oxima. En demás modalidades o modalidades adicionales, el aminoácido no natural carbonilo- o dicarbonilo-sustituido es un aminoácido no natural ceto-sustituido. En demás modalidades o modalidades adicionales, los polipéptidos de aminoácido no natural son derivados específicamente en el sitio y/o con control preciso de la estructura tridimensional, utilizando un enlazador bi- funcional que contiene hidroxilamina. En una modalidad, tales métodos son usados para anexar enlazadores moleculares (en los que se incluyen, pero no limitados a, enlazadores mono-, bi- y multi-funcionales) a polipéptidos de aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo (en los que se incluyen, pero no limitados a, que contienen ceto y que contienen aldehido) , en donde por lo menos uno de los términos de enlazador contiene un grupo de hidroxilamina que se puede enlazar a los polipéptidos de aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo vía un enlace de oxima. En demás modalidades o modalidades adicionales, estos enlazadores son usados para conectar los polipéptidos de aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo a otras moléculas, en los que se incluyen, a manera de ejemplo, proteínas, otros polímeros (ramificados y sin ramificar) y moléculas pequeñas. En algunas modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural es enlazado a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende una porción de polietilenglicol. En algunas modalidades, la molécula de polietilenglicol es un polímero bifuncional. En algunas modalidades, el polímero bifuncional está enlazado a un segundo polipéptido. En algunas modalidades, el segundo polipéptido es idéntico al primer polipéptido, en otras modalidades, el segundo polipéptido es un polipéptido diferente. En algunas modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural comprende por lo menos dos aminoácidos enlazados a un polímero soluble en agua que comprende una porción de poli (etilenglicol) . En algunas modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural comprende una sustitución, adición o cancelación que incrementa la afinidad del polipéptido de aminoácido no natural por un receptor. En algunas modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural comprende una sustitución, adición o cancelación que incrementa la estabilidad del polipéptido de aminoácido no natural. En algunas modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural comprende una sustitución, adición o cancelación que incrementa la solubilidad acuosa del polipéptido de aminoácido no natural. En algunas modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural comprende una sustitución, adición o cancelación que incrementa la solubilidad del polipéptido de aminoácido no natural producido en una célula huésped. En algunas modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural comprende una sustitución, adición o cancelación que modula la resistencia a proteasa, vida media en el suero, inmunogenicidad y/o expresión en relación con el polipéptido de aminoácido sin la sustitución, adición o cancelación. En algunas modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural es una agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial o agonista inverso. En algunas modalidades, el agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial o agonista inverso comprende un aminoácido no natural enlazado a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende una porción de polietilenglicol. En algunas modalidades, el polipéptido que comprende un aminoácido no natural enlazado a un polímero soluble en agua, por ejemplo, puede impedir la dimerización del receptor correspondiente. En algunas modalidades, el polipéptido que comprende un aminoácido no natural enlazado a un polímero soluble en agua modula el enlace del polipéptido a un socio de enlace, ligando o receptor. En algunas modalidades, el polipéptido que comprende un aminoácido no natural enlazado a un polímero soluble en agua modula una o más propiedades o actividades del polipéptido. En algunas modalidades, el codón selector es seleccionado del grupo que consiste de un codón ámbar, codón ocre, codón ópalo, codón único, un codón raro, un codón no natural, un codón de cinco bases y un codón de cuatro bases. También se describen en la presente métodos para la fabricación de un polipéptido de aminoácido no natural enlazado a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto un polipéptido aislado que comprende un aminoácido no natural con un polímero soluble en agua que comprende una porción que reacciona con el aminoácido no natural. En algunas modalidades, el aminoácido no natural incorporado a es reactivo hacia un polímero soluble en agua que es de otra manera no reactivo hacia cualquiera de los 20 aminoácidos comunes. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende una porción de polietilenglicol. El peso molecular del polímero puede ser de un amplio intervalo, en los que se incluyen pero no limitados a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del polímero puede ser de entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo pero no limitado a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, la molécula de polietilenglicol es un polímero ramificado. El peso molecular del PEG de cadena ramificada puede ser de entre aproximadamente 1,000 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo pero no limitado a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da y 1,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 1,000 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 5,000 Da y 20,000 Da. También se describen en la presente composiciones que comprenden un polipéptido que comprende por lo menos uno de los aminoácidos no naturales descritos en la presente y un portador aceptable farmacéuticamente. En algunas modalidades, el aminoácido no natural está enlazado a un polímero soluble en agua. También se describe en la presente composiciones farmacéuticas que comprenden un portador aceptable farmacéuticamente y un polipéptido, en donde por lo menos un aminoácido está sustituido por un aminoácido no natural. En algunas modalidades, el aminoácido no natural comprende una porción de sacárido. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua está enlazado al polipéptido vía una porción de sacárido. También se describen en la presente profármacos de los aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados; se describen además en la presente composiciones que comprenden tales profármacos y un portador aceptable farmacéuticamente. También se describen en la presente metabolitos de los aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados; tales metabolitos pueden tener una actividad deseada que complementa o sinergiza con la actividad de los aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados. También se describe en la presente el uso de los aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente para proporcionar un metabolito deseado a un organismo, incluyendo un paciente en necesidad de tal metabolito. También se describen en la presente células que contienen un polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende un codón selector. En algunas modalidades, las células comprenden una ARN sintetasa ortogonal y/o una tARN ortogonal para sustituir un aminoácido no natural al polipéptido. En algunas modalidades las células están en un cultivo celular, mientras que en otras modalidades las células son parte de un organismo multicelular, en los que se incluyen anfibios, reptiles, aves y mamíferos. En cualquiera de las modalidades de célula, modalidades adicionales incluyen la expresión del polinucleótido para producir el polipéptido de aminoácido no natural. En otras modalidades se encuentran organismos que pueden utilizar los aminoácidos no naturales descritos en la presente para producir un polipéptido de aminoácido no natural, en los que se incluyen un polipéptido de aminoácido no natural modificado. En otras modalidades, se encuentran organismos que contienen los aminoácidos no naturales, los polipéptidos de aminoácido no natural y/o los polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente. Tales organismos incluyen organismos unicelulares y organismos multicelulares, en los que se incluyen anfibios, reptiles, aves y mamíferos. En algunas modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural es producido in vitro. En algunas modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural es producido en lisado celular. En algunas modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural es producido mediante traducción ribosomal . También se describen en la presente métodos de fabricación de un polipéptido que comprende un aminoácido no natural. En algunas modalidades, los métodos comprenden cultivar células que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos que codifican un polipéptido, una ARN sintetasa ortogonal y/o una tARN ortogonal bajo condiciones para permitir la expresión del polipéptido; y purificar el polipéptido de las células y/o medio de cultivo. También se describen en la presente bibliotecas de los aminoácidos no naturales descritos en la presente o bibliotecas de los polipéptidos de aminoácido no natural descritos en la presente o bibliotecas de los polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente o bibliotecas de combinación de los mismos. También se describen en la presente arreglos que contienen por lo menos un aminoácido no natural, por lo menos un polipéptido de aminoácido no natural y/o por lo menos un aminoácido no natural modificado. También se describen en la presente arreglos que contienen por lo menos un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende un codón selector. Los arreglos descritos en la presente pueden ser usados para seleccionar en cuanto a la producción de los polipéptidos de aminoácido no natural en un organismo (ya sea al detectar la transcripción del polinucleótido que codifica el polipéptido o mediante detección de la traducción del polipéptido) . También se describen en la presente métodos para seleccionar bibliotecas descritas en la presente en cuando a una actividad deseada o para usar los arreglos descritos en la presente para seleccionar las bibliotecas descritas en la presente o para otras bibliotecas de compuestos y/o polipéptidos y/o polinucleótidos en cuanto a una actividad deseada. También se describen en la presente el uso de tales datos de actividad de selección de biblioteca para desarrollar y descubrir nuevos agentes terapéuticos, también como los agentes terapéuticos mismos. También se describen en la presente métodos para incrementar la vida media terapéutica, vida media en el suero o tiempo de circulación de un polipéptido. En algunas modalidades, los métodos comprenden sustituir por lo menos un aminoácido no natural por cualquiera de uno o más aminoácidos en un polipéptido que se presentan de manera estable en la naturaleza y/o acoplamiento del polipéptido a un polímero soluble en agua. También se describen en la presente métodos de tratamiento de un paciente en necesidad de tal tratamiento con una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende un aminoácido no natural y un portador aceptable farmacéuticamente. En algunas modalidades, el aminoácido no natural es acoplado a un polímero soluble en agua. En modalidades adicionales o alternativas se encuentran métodos para el tratamiento de una alteración, condición o enfermedad, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de aminoácido no natural que comprende por lo menos un aminoácido no natural seleccionado del grupo que consiste de un aminoácido no natural que contiene oxima, un aminoácido no natural que contiene carbonilo, un aminoácido no natural que contiene dicarbonilo y un aminoácido no natural que contiene hidroxilamina. En otras modalidades tales aminoácidos no naturales han sido incorporados biosintéticamente al polipéptido como se describe en la presente. En modalidades adicionales o alternativas tal polipéptido de aminoácido no natural comprende por lo menos un aminoácido no natural seleccionado de aminoácidos de fórmula I -XVIII, XXX-XXXIV(A&B) o XXXX-XXXXIII. En modalidades adicionales o alternativas se encuentran métodos para tratamiento de una alteración, condición o enfermedad, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de aminoácido no natural que comprende por lo menos un aminoácido no natural que contiene oxima y el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima biosintético resultante incrementa la biodisponibilidad del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. En modalidades adicionales o alternativas se encuentran métodos para el tratamiento de una alteración, condición o enfermedad, el método que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de aminoácido no natural que comprende por lo menos un aminoácido no natural que contiene oxima y el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima biosintético resultante incrementa el perfil de seguridad del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. En modalidades adicionales o alternativas se encuentran métodos para el tratamiento de una alteración, condición o enfermedad, el método que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de aminoácido no natural que comprende por lo menos un aminoácido no natural que contiene oxima y el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima biosintético resultante incrementa la solubilidad en agua del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. En modalidades adicionales o alternativas se encuentran métodos para el tratamiento de una alteración, condición o enfermedad, el método que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de aminoácido no natural que comprende por lo menos un aminoácido no natural que contiene oxima y el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima biosintético resultante incrementa la vida media terapéutica del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. En modalidades adicionales o alternativas se encuentran métodos para el tratamiento de una alteración, condición o enfermedad, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de aminoácido no natural que comprende por lo menos un aminoácido no natural que contiene oxima y el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima biosintético resultante incrementa la vida media en el suero del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. En modalidades adicionales o alternativas se encuentran métodos para el tratamiento de una alteración, condición o enfermedad, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de aminoácido no natural que comprende por lo menos un aminoácido no natural que contiene oxima y el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima biosintético resultante prolonga el tiempo de circulación del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. En modalidades adicionales o alternativas se encuentran métodos para el tratamiento de una alteración, condición o enfermedad, el método que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de aminoácido no natural que comprende por lo menos un aminoácido no natural que contiene oxima y el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima biosintético resultante modula la actividad biológica del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. En modalidades adicionales o alternativas se encuentran métodos para el tratamiento de una alteración, condición o enfermedad, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de aminoácido no natural que comprende por lo menos un aminoácido no natural que contiene oxima y el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima biosintético resultante modula la inmunogenicidad del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. Se comprenderá que los métodos y composiciones descritos en la presente no están limitados a la metodología, protocolos, líneas celulares, constructos y reactivos particulares descritos en la presente y como tal pueden variar. También se comprenderá que la terminología usada en la presente es por el propósito de describir modalidades particulares solamente y no es pretende limitar el alcance de los métodos y composiciones descritos en la presente, que serán limitados solamente por las reivindicaciones adjuntas. Como se usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "uno," "una" y "el" incluyen referencias plurales a no ser que el contexto indique claramente de otra manera. A no ser que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente para aquel de habilidad ordinaria en el arte con la cual la invención descrita en la presente pertenece. Aunque cualesquier métodos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden ser usados en la práctica o prueba de la invención descrita en la presente, los métodos, dispositivos y materiales preferidos son ahora descritos. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la presente son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad por el propósito de describir y revelar, por ejemplo, las construcciones y metodologías que son descritos en las publicaciones, que podrían ser usadas en relación con la invención descrita actualmente. Las publicaciones discutidas en la presente son proporcionadas solamente por su revelación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente se interpretará como admisión de que los inventores descritos en la presente no tienen derecho a anticiparse a tal revelación en virtud de invención previa o por cualquier otra razón. El término "etiqueta de afinidad", como se usa en la presente, se refiere a una etiqueta que se enlaza reversible o irreversiblemente a otra molécula, ya sea para modificar, destruirla o formar un compuesto con la misma. A manera de ejemplo, las etiquetas de afinidad incluyen, enzimas y sus sustratos o anticuerpos y sus antígenos. Los términos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltio" son usados en su sentido convencional y se refieren a grupos alquilos enlazados a moléculas vía un átomo de oxígeno, un grupo amino, un átomo de azufre, respectivamente. El término "alquilo" por sí mismo o como parte de otra molécula, significa, a no ser que se afirme de otra manera, un radical hidrocarburo de cadena recta o ramificada o cíclico o combinación de los mismos, que puede estar plenamente saturado, mono- o poli-insaturado y puede incluir radicales di-y multivalentes, que tienen el número de átomos de carbono designados (esto es, C1-C10 significa uno a diez átomos de carbono) . Ejemplos de radicales hidrocarburo saturados incluyen, pero no están limitados a, grupos tale como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciciohexilo, (ciclohexil) metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y los semejantes. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más dobles enlaces o triples enlaces. Ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no están limitados a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2- (butadienilo) , 2 , 4-pentadienilo, 3- (1 , 4-pentadienilo) , etinilo, 1- y 3 -propinilo, 3 -butinilo y los homólogos e isómeros superiores. El término "alquilo", a no ser que se indique de otra manera, también se propone aquellos derivados de alquilo definidos en más detalle en la presente, tales como "heteroalquilo" , "haloalquilo" y "homoalquilo" . El término "alquileno" por sí mismo o como parte de otra molécula significa un radical divalente derivado de un alcano, ejemplificado por (—CH2-)n, en donde n puede ser de 1 a aproximadamente 24. A manera de ejemplo solamente, tales grupos incluyen, pero no están limitados a, grupos que tienen 10 ó menos átomos de carbono, tales como las estructuras -CH2CH2- y -CH2CH2CH2CH2- . Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que tiene en general ocho o menos átomos de carbono. El término "alquileno", a no ser que se indique de otra manera, también se propone incluir aquellos grupos descritos en la presente como "heteroalquileno" . El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza y aminoácidos no naturales, también como análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido que funcionan de manera similar a los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza. Aminoácidos codificados de manera estable en la naturaleza son los 20 aminoácidos comunes (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina) y pirolisina y selenocisteína . Análogos de aminoácido se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza, a manera de ejemplo solamente, un átomo de carbono que está enlazado a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R. Tales análogos pueden tener grupos R modificados (a manera de ejemplo, norleucina) o puede tener cadenas fundamentales de péptido modificadas, en tanto que todavía retienen la misma estructura química básica como un aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza. Ejemplos no limitantes de análogos de aminoácido incluyen homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio metionina. Los aminoácidos pueden ser denominados en la presente ya sea por su nombre, sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB. Adicionalmente, los nucleótidos, pueden ser denominados por sus códigos de una sola letra aceptados común. Un "grupo de modificación de término amino" se refiere a cualquier molécula que puede ser anexada a un grupo amina terminal. A manera de ejemplo, tales grupos amina terminales pueden estar en el extremo de moléculas poliméricas, en donde tales moléculas poliméricas incluyen, pero no están limitadas a, polipéptido, polinucleótidos y polisacáridos. Los grupos de modificación de término incluyen pero no están limitados a, varios polímeros solubles en agua, péptidos o proteínas. A manera de ejemplo solamente, grupos de modificación de término incluyen polietilenglicol o albúmina de suero. Grupos de modificación de término pueden usados para modificar características terapéuticas de la molécula polimérica, incluyendo pero no limitado a incrementar la vida media en el suero de los péptidos. "Fragmento de anticuerpo" significa cualquier forma de un anticuerpo diferente a la forma de plena longitud. Fragmentos de anticuerpo en la presente incluyen anticuerpos que son componentes más pequeños que existen dentro de anticuerpos de plena longitud y anticuerpos que han sido diseñados. Fragmentos de anticuerpo incluyen pero no están limitados a Fv, Fe, Fab, y (Fab')2, Fv de una sola cadena (scFv) , diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos híbridos bifuncionales, CDRl, CDR2 , CDR3 , combinaciones de CDR, regiones variables, regiones de estructura, regiones constantes, cadenas pesadas, cadenas ligeras y regiones variables y moléculas sin anticuerpo de andamio alternativas, anticuerpos bisespecífieos y los semejantes (Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402). Otra subestructura funcional es un Fv de una sola cadena (scFv) , que consiste de las regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina, conectada covalentemente por un enlazador de péptido (S-z Hu et al., 1996, Cáncer Research, 56, 3055-3061). Estas proteínas pequeñas (Mr 25,000) retienen especificidad y afinidad por antígeno en un solo polipéptido y pueden proporcionar un bloque de construcción conveniente para moléculas antígeno-específicas más grandes. A no ser que se indique específicamente de otra manera, las afirmaciones y reivindicaciones que usan el término "anticuerpo" o "anticuerpos" incluyen específicamente "fragmento de anticuerpo" y "fragmentos de anticuerpo" . El término "aromático" o "arilo", como se usa en la presente, se refiere a una estructura de anillo cerrado que tiene por lo menos un anillo que tiene un sistema de electrones pi conjugado e incluye tanto grupos arilo carbocíclicos como arilo heterocíclicos (o "heteroarilo" o "heteroaromático"). El grupo aromático carbocíclico o heterocíclico puede contener de 5 a 20 átomos en el anillo. El término incluye anillos monocíclicos enlazados covalentemente o grupos policíclicos de anillo fusionado (esto es, anillos que comparten pares adyacentes de átomos de carbono) . Un grupo aromático porque estar sin sustituir o sustituido. Ejemplos no limitantes de grupos "aromáticos" o "arilo", incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, antracenilo y fenantracenilo . Sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillo arilo y heteroarilo indicados anteriormente son seleccionados del grupo de sustituyentes aceptables descritos en la presente. Por brevedad, el término "aromático" o "arilo" cuando es usado en combinación con otros términos (en los que se incluyen pero no limitados a, ariloxi, ariltioxi, aralquilo) incluye tanto anillos de arilo y heteroarilo como se definen anteriormente. Así, el término "aralquilo" o "alcarilo" se propone incluir aquellos radicales en los cuales un grupo arilo está anexado a un grupo alquilo (en los que se incluyen pero no limitados a, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y los semejantes) incluyendo aquellos grupos alquilo en los cuales un átomo de carbono (incluyendo pero no limitado a, un grupo metileno) ha sido reemplazado por un heteroátomo, a manera de ejemplo solamente, por un átomo de oxígeno. Ejemplos de tales grupos arilo incluyen, pero no están limitados a, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3- (1-naftiloxi) propilo y los semejantes. El término "arileno", como se usa en la presente, se refiere a un radical arilo divalente. Ejemplos no limitantes de "arileno" incluyen fenileno, piridinileno, pirimidinileno y tiofenileno. Sustituyentes para grupos arileno son seleccionados del grupo de sustituyentes aceptables descritos en la presente. Un "polímero bifuncional" , también denominado como "enlazador bifuncional" , se refiere a un polímero que comprende dos grupos funcionales que son capaces de reaccionar específicamente con otras porciones para formar enlaces covalentes o no covalentes. Tales porciones pueden incluir, pero no están limitadas a, los grupos laterales sobre aminoácidos naturales o no naturales o péptidos que contienen tales aminoácidos naturales o no naturales. A manera de ejemplo solamente, un enlazador bifuncional puede tener un grupo funcional reactivo con un grupo sobre un primer péptido y otro grupo funcional que es reactivo con un grupo sobre un segundo péptido, formando mediante esto un conjugado que incluye el primer péptido, el enlazador bifuncional y el segundo péptido. Muchos procedimientos y moléculas enlazadoras para anexión de varios compuestos a péptidos son conocidos. Véase, por ejemplo, solicitud de patente europea No. 188,256; patentes estadounidenses Nos. 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; y 4,569,789 que son incorporados por referencia en la presente en su totalidad. Un "polímero multi-funcional" también denominado como "enlazador multi-funcional" , se refiere a un polímero que comprende dos o más grupos funcionales que son capaces de reaccionar con otras porciones. Tales porciones pueden incluir, pero no están limitadas a, los grupos laterales sobre aminoácidos naturales o no naturales o péptidos que contienen tales aminoácidos naturales o no naturales (incluyendo pero no limitados a, grupos laterales de aminoácido) para formar enlaces covalentes o no covalentes. Un polímero bifuncional o polímero multi-funcional puede ser de cualquier longitud deseada o peso molecular y puede ser seleccionado para proporcionar un espaciamiento o conformación deseado particular entre una o más moléculas enlazadas a un compuesto y moléculas que se enlazan a o el compuesto. El término "biodisponibilidad", como se usa en la presente, se refiere a la proporción y extensión a la cual una substancia o su porción activa es entregada de una forma de dosificación farmacéutica y se hace disponible en el sitio de acción o en la circulación general. Incrementos en biodisponibilidad se refiere a incrementar la proporción y extensión que una substancia o su porción activa es entregada de una forma de dosificación farmacéutica y se hace disponible en el sitio de acción o en la circulación general. A manera de ejemplo, un incremento en biodisponibilidad puede ser indicado como un incremento en concentración de la substancia o su porción activa en la sangre cuando se compara con otras substancias o porciones activas. Un ejemplo no limitante de un método para evaluar incrementos en biodisponibilidad es dado en los ejemplos 88-92. Este método puede ser usado para evaluar la biodisponibilidad de cualquier polipéptido. El término "molécula biológicamente activa" , "porción biológicamente activa" o "agente biológicamente activo" cuando se usa en la presente significa cualquier substancia que puede afectar cualesquier propiedades físicas o bioquímicas de un sistema biológico, ruta, molécula o interacción concerniente con un organismo, en los que se incluyen pero no limitado a, virus, bacterias, bacteriófagos, transposon, prion, insectos, hongos, plantas, animales y humanos. En particular, como se usa en la presente, moléculas biológicamente activas incluyen pero no están limitados a cualquier substancia diseñada para diagnosis, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedad en humanos u otros animales o para mejorar de otra manera el bienestar físico o mental de humanos o animales. Ejemplos de moléculas biológicamente activas incluyen, pero no están limitados a, péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de molécula pequeña, fármacos duros, fármacos blandos, carbohidratos, átomos o moléculas inorgánicos, tintes, lípidos, nucleósidos, radionúcleos, oligonucleótidos, toxinas, células, virus, liposomas, micropartículas y micelas. Clases de agentes biológicamente activos que son apropiado para uso con los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen, pero no están limitados a, fármacos, profármacos, radionúcleos, agentes de formación de imagen, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes antivirales, agentes antiinflamatorios, agente anti-tumor, agentes cardiovasculares, agentes antiansiedad, hormonas, factores de crecimiento, agentes esteroidales, toxinas derivadas microbianamente y los semejantes . "Modular actividad biológica" significa incrementar o disminuir la reactividad de un polipéptido, alterar la selectividad del polipéptido, mejorar o disminuir la selectividad del sustrato del polipéptido. El análisis de la actividad biológica modificada puede ser efectuado al comparar la actividad biológica del polipéptido no natural con aquella del polipéptido natural.
El término "biomaterial", como se usa en la presente, se refiere a un material derivado biológicamente, en los que se incluyen pero no limitados a material obtenido de bioreactores y/o a partir de métodos y técnicas recombinantes. El término "sonda biofísica", como se usa en la presente, se refiere a sondas que pueden detectar o verificar cambios estructurales en moléculas. Tales moléculas incluyen, pero no están limitadas a, proteínas y la "sonda biofísica" puede ser usada para detectar o verificar la interacción de proteínas con otras macromoléculas. Ejemplos de sondas biofísicas incluyen, pero no están limitadas a, espín-etiquetas, fluoróforos y grupos fotoactivables . El término "biosintéticamente" , como se usa en la presente, se refiere a cualquier método que utiliza un sistema de traducción (celular o no celular) , que incluye el uso de por lo menos uno de los siguientes componentes: un polinucleótido, un codón, un tARN y una ribosoma. A manera de ejemplo, los aminoácidos no naturales pueden ser "incorporados biosintéticamente" a polipéptidos de aminoácido no natural utilizando los métodos y técnicas descritos en la sección VIII "Generación in vivo de polipéptidos que comprende aminoácidos no naturales" y en el ejemplo no limitante 14. Adicionalmente, los métodos para la selección de aminoácidos no naturales útiles que pueden ser "incorporados biosintéticamente" a polipéptidos de aminoácido no natural son descritos en los ejemplos no limitantes 15-16. El término "análogo de biotina" o también denominado como "imitación de biotina", como se usa en la presente, es cualquier molécula, diferente a biotina, que se enlaza con alta afinidad a avidina y/o estreptavidina. El término "carbonilo" como se usa en la presente, se refiere a un grupo que contiene una porción seleccionada del grupo que consiste de -C(0)-, -S(0)-, -S(0)2- y -C(S)-, en los que se incluyen, pero no limitados a, grupos que contienen por lo menos un grupo cetona y/o por lo menos un grupo aldehido y/o por lo menos un grupo éster y/o por lo menos un grupo de ácido carboxílico y/o por lo menos un grupo tioéster. Tales grupos carbonilo incluyen cetonas, aldehidos, ácidos carboxílicos, esteres y tioésteres. Además, tales grupos pueden ser parte de moléculas lineales, ramificadas o cíclicas. El término "grupo de modificación de término carboxi" se refiere a cualquier molécula que puede ser anexada a un grupo carboxi terminal. A manera de ejemplo, tales grupos carboxi terminales pueden estar al final de moléculas poliméricas, en donde tales moléculas poliméricas incluyen, pero no están limitadas a, polipéptidos, polinucleótidos y polisacáridos. Grupos de modificación de término incluyen pero no están limitados a, varios polímeros solubles en agua, péptidos o proteínas. A manera de ejemplo solamente, grupos de modificación de término incluyen polietilenglicol o albúmina de suero. Grupos de modificación de término pueden ser usados para modificar características terapéuticas de la molécula polimérica, en los que se incluyen pero no limitados a incrementar la vida media en el suero de los péptidos. El término "grupo escindible químicamente" , también denominado como "químicamente lábil", como se usa en la presente, se refiere a un grupo que se rompe o escinde en la exposición a ácido, base, agentes oxidantes, agentes reductores, iniciadores químicos o iniciadores de radicales. El término "grupo quimioluminiscente" , como se usa en la presente, se refiere a un grupo que emite luz como resultado de una reacción química sin la adición de calor. A manera de ejemplo solamente, el luminol (5-amino-2 , 3-dihidro-l , 4-ftalazindiona) reacciona con oxidantes como peróxido de hidrógeno (H202) en presencia de una base y un catalizador de metal para producir un producto de estado excitado (3-aminoftalato, 3-APA). El término "cromóforo", como se usa en la presente, se refiere a una molécula que absorbe luz de longitudes de onda visibles, longitudes de onda UV o longitudes de onda de IR. El término "co-factor", como se usa en la presente, se refiere a un átomo o molécula esencial para la acción de una molécula grande. Co- factores incluyen, pero no están limitados a, iones inorgánicos, coenzimas, proteínas o algún otro factor necesario para la actividad de enzimas. Ejemplos incluyen, heme en hemoglobina, magnesio en clorofila y iones de metal para proteínas . "Coplegado" , como se usa en la presente, se refiere a procesos de re-plegado, reacciones o métodos que emplean por lo menos dos moléculas que interactúan entre sí y dan como resultado la transformación de moléculas no plegadas o plegadas inapropiadamente a moléculas plegadas apropiadamente. A manera de ejemplo solamente, "coplegado", emplea por lo menos dos polipéptidos que interactúan entre sí y dan como resultado la transformación de polipéptidos sin plegar o plegados inapropiadamente a polipéptidos plegados apropiadamente naturales. Tales polipéptidos pueden contener aminoácidos naturales y/o por lo menos un aminoácido no natural . Una "ventana de comparación" , como se usa en la presente, se refiere a un segmento de cualquiera de las posiciones contiguas usadas para comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después que las dos secuencias son alineadas óptimamente. Tales posiciones contiguas incluyen, pero no están limitadas a un grupo que consiste de aproximadamente 20 a aproximadamente 600 unidades secuenciales, en las que incluye aproximadamente 50 a aproximadamente 200 unidades secuenciales, y aproximadamente 100 a aproximadamente 150 unidades secuenciales. A manera de ejemplo solamente, tales secuencias incluyen polipéptidos y polipéptidos que contienen aminoácidos no naturales, las unidades secuenciales incluyen, pero no están limitadas a aminoácidos naturales y no naturales. Además, a manera de ejemplo solamente, tales secuencias incluyen polinucleótidos, los nucleótidos son las unidades secuenciales correspondientes. Métodos de alineación de secuencias por comparación son bien conocidos en el arte. Una alineación óptima de secuencias por comparación se puede llevar a cabo, en las que se incluyen, pero no limitados a, mediante el algoritmo de homología local de Smity y aterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y unsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante el método de búsqueda de similaridad de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de elementos de programación de isconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 suplemento) ) . A manera de ejemplo, un algoritmo que puede ser usado para determinar el por ciento de identidad de secuencia y similaridad de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que son descritos en Altschul et al. (1997) Nuc . Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. Elementos de programación para efectuar análisis de BLAST están disponibles públicamente a través del Centro Nacional para la Información de Biotecnología los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como predeterminados una longitud de palabra de 3 y esperanza (E) de 10 y la matriz de puntuación BL0SUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915) alineaciones (B) de 50, esperanza (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. El algoritmo BLAST es efectuado comúnmente con el filtro de "baja complejidad" apagado. El algoritmo BLAST también efectúa un análisis estadístico de la similaridad entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida de similaridad proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante el cual ocurriría una coincidencia o correspondencia entre dos secuencias de nucleótido o aminoácido por probabilidad. Por ejemplo, un ácido nucleico es considerado similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0.2 o menor de aproximadamente 0.01 o menor de aproximadamente 0.001. El término "variantes modificadas conservadoramente" se aplica tanto a secuencias de aminoácido tanto natural como no natural y de ácido nucleico natural como no natural y combinaciones de los mismos. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, "variantes modificadas conservadoramente" se refiere a aquellos ácidos nucleicos naturales y no naturales que codifican secuencias de aminoácido natural y no natural idénticos o esencialmente idénticos o en donde el ácido nucleico natural y no natural no codifica una secuencia de aminoácido natural y no natural, a secuencias esencialmente idénticas. A manera de ejemplo, debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido alanina. Así, en cada posición en donde una alanina es especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silentes" , que son una especie de variaciones modificadas conservadoramente. Así, a manera de ejemplo cada secuencia de ácido nucleico natural o no natural en la presente que codifica un polipéptido natural o no natural también describe cada variación silente posible del ácido nucleico natural o no natural . Aquel de habilidad en el arte reconocerá que cada codón en un ácido nucleico natural o no natural (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina y TGG, que es ordinariamente el único codón para triptófano) puede ser modificado para producir una molécula funcionalmente idéntica. Así, cada variación silente de un ácido nucleico natural o no natural que codifica un polipéptido natural y no natural está implícito en cada secuencia descrita. En cuanto a secuencias de aminoácido, sustituciones individuales, cancelaciones o adiciones a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteína que altere, agregue o cancele un solo aminoácido natural y no natural o un porcentaje pequeño de aminoácidos naturales y no naturales en la secuencia codificada es una "variante modificada conservadoramente" en donde la alteración da como resultado la cancelación de un aminoácido, adición de un aminoácido o sustitución de un aminoácido natural y no natural con un aminoácido químicamente similar. Tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos naturales funcionalmente similares son bien conocidas en el arte. Tales variantes modificadas conservadoramente están además de y no excluyen variantes polimórficas, homólogos de interespecie y alelos de los métodos y composiciones descritos en la presente. Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras por otro: (1) Alanina (A) , Glicina (G) ; (2) Ácido aspártico (D) , Ácido glutámico (E) ; (3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; (4) Arginina (R) , Lisina (K) ; (5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; (6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptófano (W) ; (7) Serina (S) , Treonina (T) ; y (8) Cisteína (C) , Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins - Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2a edición (diciembre 1993) . Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por sí mismos o en combinación con otros términos, representan, a no ser que se afirme de otra manera, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Así, un cicloalquilo o heterocicloalquilo incluye enlaces de anillo saturado, parcialmente insaturado y plenamente insaturado. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la cual el heterociclo es anexado al resto de la molécula. El heteroátomo puede incluir, pero no está limitado a, oxígeno, nitrógeno o azufre. Ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no están limitados a, ciclopentilo, ciciohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicioheptilo y los semejantes. Ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no están limitados a, 1- (1 , 2 , 5 , 6-tetrahidropiridilo) , 1-piperidinilo, 2- piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1-piperazinilo, 2-piperazinilo y los semejantes. Adicionalmente, el término abarca estructuras multicíclicas, en las que se incluyen, pero no limitadas a, estructuras de anillo bicíclicas y tricíclicas. Similarmente, el término "heterocicloalquileno" por sí mismo o como parte de otra molécula significa un radical divalente derivado de heterocicloalquilo y el término "cicloalquileno" por sí mismo o como parte de otra molécula significa un radical divalente derivado de cicloalquilo. El término "ciclodextrina" , como se usa en la presente, se refiere a carbohidratos cíclicos que consisten de por lo menos seis a ocho moléculas de glucosa en una formación de anillo. La parte externa del anillo contiene grupos solubles en agua; en el centro del anillo se encuentra una cavidad relativamente no polar apta de acomodar moléculas pequeñas. El término "citotóxico", como se usa en la presente, se refiere a un compuesto que daña la células. "Agente desnaturalizante" o "desnaturalizante" , como se usa en la presente, se refiere a cualquier compuesto o material que provocará un despliegue reversible de un polímero. A manera de ejemplo solamente, "agente desnaturalizante" o "desnaturalizantes" , pueden provocar un despliegue reversible de una proteína. La fuerza de un agente desnaturalizante o desnaturalizante será determinada tanto por las propiedades como la concentración del agente desnaturalizante o desnaturalizante particular. A manera de ejemplo, agentes desnaturalizantes o desnaturalizantes incluyen, pero no están limitados a, caótropos, detergentes, orgánicos, solventes miscibles en agua, fosfolípidos o una combinación de los mismos. Ejemplos no limitantes de caótropos incluyen, pero no están limitados a, urea, guanidina y tiocianato de sodio. Ejemplos no limitantes de detergentes pueden incluir, pero no están limitados a, detergentes fuertes tales como dodecil sulfato de sodio o éteres de polioxietileno (por ejemplo, detergentes Tween o Tritón), Sarkosyl , detergentes no iónicos moderados (por ejemplo, digitonina) , detergentes catiónicos moderados tales como N->2 , 3- (dioleioxi) -propil-N,N,N-trimetilamonio, detergentes iónicos moderados (por ejemplo, colato de sodio o desoxicolato de sodio) o detergentes zwitteriónicos en los que se incluyen, pero no limitados a, sulfobetaínas (Zwittergente) , 3- (3-colamidopropil) dimetilamonio-1-propano (CHAPS) y sulfonato de 3- (3-colamidopropil) dimetilamonio-2 -hidroxi -1 -propano (CHAPSO) . Ejemplos no limitantes de solventes miscibles en agua orgánicos incluyen, pero no están limitados a, acetonitrilo, alcanoles inferiores (especialmente C2-C4 alcanoles tales como etanol o isopropanol) o alcandioles inferiores (C2-C alcandioles tales como etilen glicol) pueden ser usado como desnaturalizantes. Ejemplos no limitantes de fosfolípidos incluyen, pero no están limitados a, fosfolípidos que se presentan de manera estable en la naturaleza tales como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidilinositol o derivados de fosfolípido sintéticos o variantes tales como dihexanoilfosfatidilcolina o una diheptanoilfosfatidilcolina. El término "etiqueta detectable" , como se usa en la presente, se refiere a una etiqueta que puede ser observable utilizando técnicas analíticas en las que se incluyen, pero no limitadas a, fluorescencia, quimioluminiscencia, resonancia de espín de electrones, espectroscopia de absorbancia ultravioleta/visible, espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear, resonancia magnética y métodos electroquímicos. El término "dicarbonilo" como se usa en la presente se refiere a un grupo que contiene por lo menos dos porciones seleccionadas del grupo que consiste de -C(O)-, -S(O)-, -S(0)2-y -C(S)-, en los que se incluyen, pero no limitados a, grupos 1, 2 -dicarbonilo, grupos 1 , 3 -dicarbonilo y grupos 1,4-dicarbonilo y grupos que contienen por lo menos un grupo cetona y/o por lo menos un grupo aldehido y/o por lo menos un grupo éster y/o por lo menos un grupo ácido carboxílico y/o por lo menos un grupo tioéster. Tales grupos dicarbonilo incluyen dicetonas, cetoaldehídos, cetoácidos, cetoésteres y cetotioésteres . Además, tales grupos pueden ser parte de moléculas lineales, ramificadas o cíclicas. Las dos porciones en el grupo dicarbonilo puede ser las mismas o diferentes y pueden incluir sustituyentes que producirían, a manera de ejemplo solamente, un éster, una cetona, un aldehido, un tioéster o una amida, ya sea en una u otra de las dos porciones . El término "fármaco", como se usa en la presente, se refiere a cualquier substancia usada en la prevención, diagnosis, alivio, tratamiento o cura de una enfermedad o condición. El término "tinte", como se usa en la presente, se refiere a una sustancia colorante soluble, que contiene un cromóforo. El término "cantidad efectiva" , como se usa en la presente, se refiere a una cantidad suficiente de un agente o un compuesto que es administrada que aliviará a alguna extensión uno o más de los síntomas de la enfermedad o condición que es tratada. El resultado puede ser reducción y/o alivio de los signos, síntomas o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. A manera de ejemplo, un agente o un compuesto que es administrado incluye, pero no está limitado a, un polipéptido de aminoácido natural, polipéptido de aminoácido no natural, polipéptido de aminoácido natural modificado o polipéptido de aminoácido no natural modificado. Composiciones que contiene tales polipéptido de aminoácido naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales, polipéptidos de aminoácido natural modificados o polipéptidos de aminoácido no natural modificados pueden ser administradas para tratamiento profilácticos, de mejora y/o terapéuticos. Una cantidad "efectiva" apropiada en cualquier caso individual puede ser determinada utilizando técnicas, tales como un estudio de escalamiento de dosis. El término "grupo denso de electrones" , como se usa en la presente, se refiere a un grupo que dispersa electrones cuando es irradiado con un haz de electrones. Tales grupos incluyen, pero no están limitados a, molibdato de amonio, yoduro de cadmio subnitrato de bismuto, 99%, carbohidrazida, cloruro férrico hexahidratado, hexametilen tetramina, 98.5%, tricloruro de indio anhidro, nitrato de lantano, acetato de plomo trihidratado, citrato de plomo trihidratado, nitrato de plomo, ácido periódico, ácido fosfomolíbdico, ácido fosfotúngstico, ferricianuro de potasio, ferrocianuro de potasio, rojo de rutenio, nitrato de plata, proteinato de plata (Análisis de Ag .- 8.0-8.5%) "Fuerte", tetrafenilporfina de plata (S-TPPS) , cloroaurato de sodio, tungstato de sodio, nitrato de talio, tiosemicarbazida (TSC) , acetato de uranilo, nitrato de uranilo y sulfato de vanadilo. El término "agente de transferencia de energía" , como se usa en la presente, se refiere a una molécula que puede ya sea donar o aceptar energía de otra molécula. A manera de ejemplo solamente, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) es un proceso de acoplamiento dipolo-dipolo mediante el cual la energía de estado excitado de una molécula donadora fluorescente es transferida no radiantemente a una molécula aceptora sin excitar que luego emite fluorescentemente la energía donada a una longitud de onda más larga. Los términos "mejora" o "que mejora" significa incrementar o prolongar ya sea en potencia o duración un efecto deseado. A manera de ejemplo, "mejorar" el efecto de agentes terapéuticos se refiere a la habilidad de incrementar o prolongar, ya sea en potencia o duración, el efecto de agentes terapéuticos durante el tratamiento de una enfermedad, alteración o condición. Una "cantidad mejoradora efectiva", como se usa en la presente, se refiere a una cantidad apropiada para mejorar el efecto de un agente terapéutico en el tratamiento de una enfermedad, alteración o condición. Cuando se usa en un paciente, cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad y curso de la enfermedad, alteración o condición, terapia previa, estatus de salud del paciente y respuesta a los fármacos y el juicio del médico de tratamiento. Como se usa en la presente, el término "eucarionte" se refiere a organismos pertenecientes al dominio filogenético Eucarya, en los que se incluyen pero no limitados a animales (en los que se incluyen pero no limitados a, mamíferos, insectos, reptiles, aves, etc.), ciliados, plantas (en los que se incluyen pero no limitados a, monocotiledóneas, dicotiledóneas y algas) , hongos, levaduras, flagelados, microsporidia y protistas. El término "ácido graso", como se usa en la presente, se refiere a ácido carboxílicos con aproximadamente C6 o cadena lateral de hidrocarburo más larga. El término "fluoróforo" , como se usa en la presente, se refiere a una molécula que en la excitación emite fotones y mediante es fluorescente. Los términos "grupo funcional", "porción activa", "grupo activador", "grupo saliente", "sitio reactivo", "grupo químicamente reactivo" y "porción químicamente reactiva" , como se usan en la presente, se refiere a porciones o unidades de una molécula en la cual ocurren reacciones químicas. Los términos son un tanto sinónimos en las artes químicas y son usados en la presente para indicar las porciones de moléculas que efectúan alguna función o actividad y son reactivas con otras moléculas . El término "halógeno" incluye flúor, cloro, yodo y bromo . El término "haloacilo" , como se usa en la presente, se refiere a grupos acilo que contienen porciones de halógeno, en las que se incluyen, pero no limitadas a, -C(0)CH3, C(0)CF3, -C(0)CH20CH3 y los semejantes. El término "haloalquilo", como se usa en la presente, se refiere a grupos alquilo que contienen porciones de halógeno, en los que se incluyen, pero no limitadas a, -CF3 y -CH2CF3 y los semejantes. El término "heteroalquilo" , como se usa en la presente, se refiere radicales de hidrocarburo de cadena recta o ramificada o cíclicos, o combinaciones de los mismos, que consisten de un grupo alquilo y por lo menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de O, N, Si y S, y en donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden opcionalmente estar oxidados y el heteroátomo de nitrógeno puede opcionalmente estar cuaternizado. El (los) heteroátomo (s) O, N y S y Si pueden ser colocados en cualquier posición interior del grupo de heteroalquilo o en la posición en la cual el grupo alquilo está anexado al resto de la molécula. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, -CH2-CH2-0-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2 , -S (O) -CH3 , -CH2-CH2-S (O) 2-CH3 , -CH=CH-0-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-0CH3 y -CH=CH-N (CH3) -CH3. Además, hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos, tal como, a manera de ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-0-Si (CH3) 3. El término "heteroalquileno" , como se usa en la presente, se refiere a un radical divalente derivado de heteroalquilo, tal como se ejemplifica, pero no limitado por, -CH2-CH2-S-CH2CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2- . Para grupos heteroalquileno, los mismos o diferentes heteroátomos pueden también ocupar ya sea uno o ambos de los términos de cadena (en los que se incluyen pero no limitados a, alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino, aminooxialquileno y los semejantes) . Todavía además, para grupos enlazantes de alquileno y heteroalquileno, ninguna orientación del grupo enlazante es implicada por la dirección en la cual la fórmula del grupo enlazante es escrita. A manera de ejemplo, la fórmula -C(0)2R'- representa tanto -C(0)2R'-como -R'C(0)2-. El término "heteroarilo" o "heteroaromático" , como se usa en la presente, se refiere a grupos arilo que contienen por lo menos un heteroátomo seleccionado de N, O y S; en donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados y el (los) átomo (s) de nitrógeno pueden opcionalmente ser cuaternizados . Grupos heteroarilo pueden estar sustituidos o sin sustituir. Un grupo heteroarilo puede estar anexado al resto de la molécula por medio de un heteroátomo. Ejemplos no limitantes de grupos heteroarilo incluyen 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-benzimidazolilo, 5-indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3 -quinolilo y 6-quinolilo. El término "homoalquilo" , como se usa en la presente se refiere a grupo alquilos que son grupos hidrocarburo. El término "idéntico", como se usa en la presente, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas. Además, el término "sustancialmente idéntico", como se usa en la presente, se refiere a dos o más secuencias que tienen un porcentaje de unidades' secuenciales que son las mismas cuando son comparadas y alineadas para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación o región designada como se mide usando algoritmos de comparación o mediante alineación manual e inspección visual. A manera de ejemplo solamente, dos o más secuencias pueden ser "sustancialmente idénticas" si las unidades secuenciales son aproximadamente 60% idénticas, aproximadamente 65% idénticas, aproximadamente 70% idénticas, aproximadamente 75% idénticas, aproximadamente 80% idénticas, aproximadamente 85% idénticas, aproximadamente 90% idénticas o aproximadamente 95% idénticas sobre una región especificada. Tales porcentajes para describir el "por ciento de identidad" de dos o más secuencias. La identidad de una secuencia puede existir sobre una región que es por lo menos aproximadamente 75-100 unidades secuenciales de longitud, sobre una región que es aproximadamente 50 unidades secuenciales de longitud, o en donde no se específica, a través de toda la secuencia. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba. A manera de ejemplo solamente, dos o más secuencias de polipéptidos son idénticas cuando los residuos de aminoácidos son los mismos, en tanto que dos o más secuencias de polipéptidos son "sustancialmente idénticas" si los residuos de aminoácidos son aproximadamente 60% idénticos, aproximadamente 65% idénticos, aproximadamente 70% idénticos, aproximadamente 75% idénticos, aproximadamente 80% idénticos, aproximadamente 85% idénticos, aproximadamente 90% idénticos o aproximadamente 95% idénticos sobre una región especificada. La identidad puede existir sobre una región que es por lo menos de aproximadamente 75-100 aminoácidos de longitud, sobre una región que es de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, o en donde no se específica, a través de toda la secuencia de una secuencia de polipéptido. Además, a manera de ejemplo solamente, dos o más secuencias de polinucleótido son idénticas cuando los residuos de ácido nucleico son los mismos, en tanto que dos o más secuencias de polinucleótido son "sustancialmente idénticas" si los residuos de ácido nucleico son aproximadamente 60% idénticos, aproximadamente 65% idénticos, aproximadamente 70% idénticos, aproximadamente 75% idénticos, aproximadamente 80% idénticos, aproximadamente 85% idénticos, aproximadamente 90% idénticos o aproximadamente 95% idénticos sobre una región especificada. La identidad puede existir sobre una región que es de por lo menos aproximadamente 75-100 ácidos nucleicos de longitud, sobre una región que es de aproximadamente 50 ácidos nucleicos de longitud, o en donde no se específica, a través de toda la secuencia de una secuencia de polinucleótidos. Para la comparación de secuencia, comúnmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual secuencias de prueba son comparadas. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y de referencia son introducidas a una computadora, coordenadas de subsecuencia son designadas, si es necesario y los parámetros del programa de algoritmo de secuencia son designados. Se pueden usar parámetros de programa predeterminados o se pueden designar parámetros alternativos. Luego el algoritmo de comparación de secuencias calcula el por ciento de identidades de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa. El término "inmunogenicidad", como se usa en la presente, se refiere a una respuesta de anticuerpo a la administración de un fármaco terapéutico. La inmunogenicidad hacia polipéptidos de aminoácido no natural terapéuticos puede ser obtenida utilizando análisis cuantitativos y cualitativos para la detección de anticuerpos de polipéptidos de aminoácido anti-no naturales en fluidos biológicos. Tales análisis incluyen, pero no están limitados a, radioinmunoanálisis (RÍA) , análisis de inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) , inmunoanálisis luminiscente (LIA) e inmunoanálisis fluorescente (FIA) . El análisis de inmunogenicidad hacia polipéptidos de aminoácido no natural terapéuticos involucra comparar la respuesta de anticuerpo después de la administración de polipéptidos de aminoácido no naturales terapéuticos a la respuesta de anticuerpo después de la administración de los polipéptidos de aminoácido naturales terapéuticos. El término "agente intercalante" , también denominado como "grupo intercalante", como se usa en la presente, se refiere a un químico que se puede insertar al espacio intramolecular de una molécula o el espacio intermolecular entre moléculas. A manera de ejemplo solamente un agente intercalante o grupo intercalante puede ser una molécula que se inserta a las bases apiladas de la doble hélice de ADN. El término "aislado", como se usa en la presente, se refiere a la separación y remoción de un componente de interés de componentes no de interés. Substancias aisladas pueden estar ya sea en estado anhidro o semi-anhidro o en solución, en los que se incluyen pero no limitados a una solución acuosa. El componente aislado puede estar en estado homogéneo o el componente aislado puede ser parte de una composición farmacéutica que comprende portadores y/o excipientes aceptables farmacéuticamente adicionales. La pureza y homogeneidad pueden ser determinados utilizando técnicas de química analítica en las que se incluyen, pero no limitadas a, electroforesis de gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto desempeño. Además, cuando un componente de interés es aislado y es la especie predominante presente en una preparación, el componente es descrito en la presente como sustancialmente purificado. El término "purificado", como se usa en la presente, se refiere a un componente de interés que es por lo menos 85% puro, por lo menos 90% puro, por lo menos 95% puro, por lo menos 99% o mayor puro. A manera de ejemplo solamente, ácidos nucleicos o proteínas están "aislados" cuando tales ácidos nucleicos o proteínas están libres de por lo menos algunos de los componentes celulares con los cuales están asociados en estado natural o que el ácido nucleico o proteína ha sido concentrado a un nivel mayor que la concentración de su producción in vivo o in vitro. También, a manera de ejemplo, un gen está aislado cuando separado de cuadros de lectura abierta que flanquean el gen y codifican una proteína diferente al gen de interés. El término "etiqueta", como se usa en la presente, se refiere a una substancia que es incorporada a un compuesto y es detectada fácilmente, mediante lo cual su distribución física puede ser detectada y/o verificada. El término "enlace" , como se usa en la presente se refiere a enlaces de porción química formada de una reacción química entre el grupo funcional de un enlazador y otra molécula. Tales enlaces pueden incluir, pero no están limitados a, enlaces covalentes y enlaces no covalentes, en tanto que tales porciones químicas pueden incluir, pero no están limitadas a, esteres, carbonatos, esteres de imina fosfato, hidrazonas, acétales, ortoésteres, enlaces de péptido y enlaces de oligonucleótido. Enlaces hidrolíticamente estables significa que los enlaces son sustancialmente estables en agua y no reaccionan con agua a valores de pH útiles, en los que se incluyen pero no limitados a, bajo condiciones fisiológicas por un período de tiempo extendido, quizás aún indefinidamente. Enlaces hidrolíticamente inestables o degradables significa que los enlaces son degradables en agua o en soluciones acuosas, en los que se incluyen por ejemplo, sangre. Enlaces enzimáticamente inestables o degradables significa que el enlace puede ser degradado por una o más enzimas. A manera de ejemplo solamente, polímeros de PEG y polímeros relacionados pueden incluir enlaces degradables en la cadena fundamental del polímero o en el grupo enlazador entre la cadena fundamental del polímero y uno o más de los grupos funcionales terminales de la molécula de polímero. Tales enlaces degradables incluyen, pero no están limitados a, enlaces de esteres formados por la reacción de ácidos carboxílicos PEG o ácidos carboxílicos PEG activados con grupos alcohol sobre un agente biológicamente activo, en donde tales grupos éster en general se hidrolizan bajo condiciones fisiológicas para liberar el agente biológicamente activo. Otros enlaces hidrolíticamente degradables incluyen pero no están limitados a enlaces de carbonato; enlaces de imina resultantes de la reacción de una amina y un aldehido; enlaces de éster fosfato formados al hacer reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; enlaces de hidrazona que son el producto de reacción una hidrazida y un aldehido; enlaces de acetal que son el producto de reacción de un aldehido y un alcohol; enlaces de ortoéster que son el producto de reacción de un formiato y un alcohol; enlaces de péptido formados por un grupo amina, en los que se incluyen pero no limitado a, en un extremo de un polímero tal como PEG y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces de oligonucleótido formados por un grupo fosforamidita, en los que se incluyen pero no limitado a, al final de un polímero y un grupo 5' grupo hidroxilo de un oligonucleótido. Los términos "medio" o "medios" , como se usan en la presente, se refieren a cualquiera medio de cultivo usado para cultivar y cosechar células y/o productos expresados y/o secretados por tales células. Tal "medio" o "medios" incluyen, pero no están limitados a, solución, soportes sólidos, semi-sólidos o rígidos que pueden soportar o contener cualquier célula huésped, en los que se incluyen, a manera de ejemplo, células huésped bacterianas, células huésped de levadura, células huésped de insectos, células huésped de plantas, células huésped eucariónticas, células huésped mamíferas, células CHO, células huésped procariónticas, E. coli o células huésped de Pseudomonas y contenidos de células. Tal "medio" o "medios" incluyen, pero no están limitado a, medio o medios en los cuales la célula huésped ha sido cultivada al cual un polipéptido ha sido secretado, en los que se incluyen ya sea medio antes o después de una etapa de proliferación. Tal "medio" o "medios" también incluyen, pero no están limitados a, soluciones reguladoras del pH o reactivos que contienen lisados de célula huésped, a manera de ejemplo un polipéptido producido intracelularmente y las células huésped son sometidas a lisis o rotas para liberar el polipéptido. El término "metabolito", como se usa en la presente, se refiere a un derivado de un compuesto, a manera de ejemplo polipéptido de aminoácido natural, un polipéptido de aminoácido no natural, un polipéptido de aminoácido natural modificado o un polipéptido de aminoácido no natural modificado, que es formado cuando el compuesto, a manera de ejemplo polipéptido de aminoácido natural, polipéptido de aminoácido no natural, polipéptido de aminoácido natural modificado o polipéptido de aminoácido no natural modificado, es metabolizado. El término "metabolito farmacéuticamente activo" o "metabolito activo" se refiere a un derivado biológicamente activo de un compuesto, a manera de ejemplo polipéptido de aminoácido natural, un polipéptido de aminoácido no natural, un polipéptido de aminoácido natural modificado o un polipéptido de aminoácido no natural modificado, que es formado cuando tal compuesto, a manera de ejemplo un polipéptido de aminoácido natural, un polipéptido de aminoácido no natural, polipéptido de aminoácido natural modificado o polipéptido de aminoácido no natural modificado, es metabolizado. El término "metabolizado", como se usa en la presente, se refiere a la suma de los procesos mediante los cuales una sustancia particular es cambiada por un organismo. Tales procesos incluyen, pero no están limitados a, reacciones de hidrólisis y reacciones catalizadas por enzimas. Información adicional en cuanto a metabolismo se puede obtener de The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a Edición, McGraw-Hill (1996) . A manera de ejemplo solamente, metabolitos de polipéptidos de aminoácido natural, polipéptidos de aminoácido no natural, polipéptido de aminoácido natural modificados o polipéptidos de aminoácido no natural modificados pueden ser identificados ya sea mediante administración de los polipéptidos de aminoácido natural, polipéptidos de aminoácido no natural, polipéptidos de aminoácido natural modificados o polipéptidos de aminoácido no natural modificados a un huésped y análisis de las muestras de tejido del huésped o mediante incubación de los polipéptidos de aminoácido natural, polipéptidos de aminoácido no natural, polipéptidos de aminoácido natural modificados o polipéptidos de aminoácido no natural modificados con células hepáticas in vitro y análisis de los compuestos resultantes. El término "quelador de metal", como se usa en la presente, se refiere a una molécula que forma un complejo de metal con iones de metal. A manera de ejemplo, tales moléculas pueden formar dos o más enlaces de coordinación con un ion de metal central y puede formar estructuras de anillo. El término "porción que contiene metal" , como se usa en la presente, se refiere a un grupo que contiene un ion de metal, átomo o partícula. Tales porciones incluyen, pero no están limitadas a, cisplatina, iones de metal quelados (tales como níquel, hierro y platino) y nanopartículas de metal (tales como níquel, hierro y platino) . El término "porción que incorpora un átomo pesado" , como se usa en la presente, se refiere a un grupo que incorpora un ion de átomo que es usualmente más pesado que el átomo de carbono. Tales iones o átomos incluyen, pero no están limitados a, silicio, tungsteno, oro, plomo y uranio. El término "modificado" , como se usa en la presente se refiere a la presencia de un cambio a un aminoácido natural, un aminoácido no natural, un polipéptido de aminoácido natural o un polipéptido de aminoácido no natural . Tales cambios o modificaciones, pueden ser obtenidos mediante modificaciones de post-síntesis de aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido natural o polipéptidos de aminoácido no natural o mediante modificación co-traducción o mediante modificación post-traducción de aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido natural o polipéptidos de aminoácido no natural. La forma "modificada o sin modificar" significa que el aminoácido natural, aminoácido no natural, polipéptido de aminoácido natural o polipéptido de aminoácido no natural que es discutido están opcionalmente modificados, esto es, el aminoácido natural, aminoácido no natural, polipéptido de aminoácido natural o polipéptido de aminoácido no natural bajo discusión pueden estar modificados o sin modificar. Como se usa en la presente, el término "vida media en el suero modulada" se refiere a cambios positivos o negativos en la vida media circulante de una molécula biológicamente activa modificada en relación con su forma sin modificar. A manera de ejemplo, las moléculas biológicamente activas modificadas incluyen, pero no están limitadas a, aminoácido natural, aminoácido no natural, polipéptido de aminoácido natural o polipéptido de aminoácido no natural. A manera de ejemplo, la vida media en el suero es medida al tomar muestras de sangre en varios puntos en el tiempo después de administración de la molécula biológicamente activa o molécula biológicamente activa modificada y determinar la concentración de aquella molécula en cada muestra. La correlación de la concentración en el suero con el tiempo permite el cálculo de la vida media en el suero. A manera de ejemplo, la vida media en el suero modulada puede ser un incremento en vida media en el suero, que puede habilitar regímenes de dosificación mejorados o evitar efectos tóxicos. Tales incrementos en el suero pueden ser por lo menos aproximadamente dos veces, por lo menos aproximadamente tres veces, por lo menos aproximadamente cinco veces o por lo menos aproximadamente diez veces. Un ejemplo no limitante de un método para evaluar incrementos en vida media en el suero es dado en los ejemplos 88-92. Este método puede ser usado para evaluar la vida media en el suero de cualquier polipéptido. El término "vida media terapéutica modulada" , como se usa en la presente, se refiere un cambio positivo o negativo en la vida media de la cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula biológicamente activa modificada, en relación con su forma sin modificar. A manera de ejemplo, las moléculas biológicamente activas modificadas incluyen, pero no están limitadas a, aminoácido natural, aminoácido no natural, polipéptido de aminoácido natural o polipéptido de aminoácido no natural. A manera de ejemplo, la vida media terapéutica es medida al medir propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de la molécula en varios puntos en el tiempo después de la administración. La vida media terapéutica incrementada puede habilitar un régimen de dosificación benéfico particular, una dosis total benéfica particular o evita un efecto indeseable. A manera de ejemplo, la vida media terapéutica incrementada puede dar resultar de potencia incrementada, enlace incrementado o disminuido de la molécula modificada a su objetivo, un incremento o disminución en otro parámetro o mecanismo de acción de la molécula no modificada o un rompimiento incrementado o disminuido de las moléculas por enzimas tales como, a manera de ejemplo solamente, proteasas. Un ejemplo no limitante de un método para evaluar incrementos en la vida media terapéutica es dado en los ejemplos 88-92. Este método puede ser usado para evaluar la vida media terapéutica de cualquier polipéptido. El término "nanopartícula", como se usa en la presente, se refiere a una partícula que tiene un tamaño de partícula entre aproximadamente 500 nm a aproximadamente 1 nm. El término "casi estequiométrico" , como se usa en la presente, se refiere a la proporción de los moles de compuestos que participan en una reacción química que es de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 1.5. Como se usa en la presente, el término "no eucarionte" se refiere a organismos no eucariónticos . A manera de ejemplo, un organismo no eucarióntico puede pertenecer al dominio de Eubacteria, (que incluye pero no está limitado a, Escherichia coli, Thermus thermophilus o Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida) , dominio filogenético o la Archaea, que incluye, pero no está limitado a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix o Halobacterium tal como Haloferax volcanii y especie Halobacterium NRC-1 o dominio filogenético. Un "aminoácido no natural" se refiere a un aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos comunes o pirolisina o selenocisteína. Otros términos que pueden ser usados como sinónimos con el término "aminoácido no natural" es "aminoácido codificado no naturalmente", "aminoácido no natural", "aminoácido que no se presenta de manera estable en la naturaleza" y varias versiones con y sin guión de los mismos. El término "aminoácido no natural" incluye, pero no está limitado a, aminoácidos que se presentan naturalmente por modificación de un aminoácido codificado naturalmente (en los que se incluyen pero no limitados a, los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina y selenocisteína) pero no son en sí mismos incorporados a una cadena de polipéptido creciente por el complejo de traducción. Ejemplos de aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza que no son codificados naturalmente incluyen, pero no están limitados a, N-acetilglucosaminil-1-serina, N-acetilglucosaminil-1-treonina y 0- fosfotirosina. Adicionalmente, el término "aminoácido no natural" incluye, pero no está limitado a, aminoácidos que no se presentan de manera estable en la naturaleza y pueden ser obtenidos sintéticamente o pueden ser obtenidos mediante modificación de aminoácidos no naturales. El término "ácido nucleico" , como se usa en la presente, se refiere a desoxiribonucleótidos, desoxiribonucleósidos, ribonucleósidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos ya sea en forma de una sola hebra o de doble hebra. A manera de ejemplo solamente, tales ácidos nucleicos y polímeros de ácido nucleico incluyen, pero no están limitados a, (i) análogos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de enlace similares como un ácido nucleico de referencia y son metabolizados de manera similar a nucleótidos que se presentan de manera estable en la naturaleza; (ii) análogos de oligonucleótido en los que se incluyen, pero no limitados a, PNA (ácido peptidonucleico) , análogos de ADN usados en tecnología antisentido (fosforotioatos, fosforoamidatos y los semejantes) ; (iii) variantes modificadas conservadoramente de los mismos (en los que se incluyen pero no limitado a, sustituciones de codón degeneradas) y secuencias complementarias y secuencia explícitamente indicada. A manera de ejemplo, sustituciones de codón degenerados pueden ser obtenidas al generar secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más codones (o todos) seleccionados está sustituida con residuos de base mezclada y/o desoxirosina residuos (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
El término "agente oxidante" , como se usa en la presente, se refiere a un compuesto o material que es capaz de remover un electrón de un compuesto que es oxidado. A manera de ejemplo, agentes oxidantes incluyen, pero no están limitados a, glutationa oxidada, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritritoi oxidado y oxígeno. Una amplia variedad de agentes oxidantes son apropiados para uso en los métodos y composiciones descritos en la presente. El término "aceptable farmacéuticamente", como se usa en la presente, se refiere a un material, en los que se incluyen pero no limitados, una sal, portador o diluyente, que no abroga la actividad biológica o propiedades del compuesto y es relativamente no tóxico, esto es, el material puede ser administrado a un individuo sin provocar efectos biológicos indeseables o interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los componentes de la composición en la cual está contenido. El término "etiqueta de fotoafinidad" , como se usa en la presente, se refiere a una etiqueta con un grupo que, en la exposición a la luz, forma un enlace con una molécula para la cual la etiqueta tiene afinidad. A manera de ejemplo solamente, tal enlace puede ser covalente o no covalente. El término "porción fotoenjaulada", como se usa en la presente, se refiere a un grupo que, después de iluminación a ciertas longitudes de onda, se enlaza covalente o no covalentemente a otros iones o moléculas.
El término "grupo foto-escindible" , como se usa en la presente, se refiere a un grupo que se rompe después de exposición a la luz. El término "agente de foto-reticulación" , como se usa en la presente, se refiere a un compuesto que comprende dos o más grupos funcionales que, en la exposición a la luz, son reactivos y forman un enlace covalente o no covalente con dos o más moléculas monoméricas o poliméricas. El término "porción fotoisomerizable" , como se usa en la presente, se refiere a un grupo en donde después de la iluminación con luz cambia de una forma isomérica a otra. El término "polialquilenglicol", como se usa en la presente, se refiere a poliéter polioles poliméricos lineales o ramificados. Tales polialquilenglicoles, incluyen pero no están limitados a, polietilenglicol, polipropilenglicol, polibutilenglicol y derivados de los mismos. Otras modalidades ejemplares son enlistadas, por ejemplo, en catálogos de proveedores comerciales, tales como Shearwater Corporation' s catalog "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001) . A manera de ejemplo solamente, tales polioles de poliéter poliméricos tienen pesos moleculares promedio entre aproximadamente 0.1 kDa a aproximadamente 100 kDa. A manera de ejemplo, tales polioles de poliéter poliméricos incluyen, pero no están limitados a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del polímero puede ser de entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, en los que se incluyen pero no limitado a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, la molécula de poli (etilenglicol) es un polímero ramificado. El peso molecular del PEG de cadena ramificada puede ser de entre aproximadamente 1,000 Da y aproximadamente 100,000 Da, en los que se incluyen pero no limitados a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da y 1,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 1,000 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 5,000 Da y 20,000 Da. El término "polímero", como se usa en la presente, se refiere a una molécula compuesta de subunidades repetidas. Tales moléculas incluyen, pero no están limitadas a, polipéptidos, polinucleótidos o polisacáridos o polialquilenglicoles . Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" son usados intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Esto es, una descripción dirigida a un polipéptido se aplica igualmente a una descripción de un péptido y una descripción de una proteína y viceversa. Los términos se aplican a polímeros de aminoácido que se presentan de manera estable en la naturaleza también como polímeros de aminoácido en los cuales uno o más residuos de aminoácido es un aminoácido no natural. Adicionalmente, tales "polipéptidos" , "péptidos" y "proteínas" incluyen cadenas de aminoácido de cualquier longitud, en los que se incluyen proteínas de plena longitud, en donde los residuos de aminoácido están enlazados por enlaces de péptido covalentes. El término "modificado post-traducción" se refiere a cualquier modificación de un aminoácido natural o no natural que ocurre después que tal aminoácido ha sido incorporado traduccionalmente a una cadena de polipéptido. Tales modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, modificaciones in vivo co-traducción, modificaciones in vivo co-traducción (tal como en un sistema de traducción libre de células) , modificaciones in vivo post-traducción y modificaciones in vitro post-traducción. Los términos "profármaco" o "profármaco aceptable farmacéuticamente", como se usa en la presente, se refiere a un agente que es convertido al fármaco original in vivo o in vitro, en donde tal no abroga la actividad biológica o propiedades del fármaco y es relativamente no tóxico, esto es, el material puede ser administrado a un individuo sin provocar efectos biológicos indeseables o interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los componentes de la composición en la cual está contenido. Los profármacos son en general precursores de fármaco que, enseguida de la administración a un sujeto y absorción subsecuente, son convertidos a una especie activa o una especie más activa vía algún proceso, tal como conversión mediante una ruta metabólica. Tales profármacos tienen un grupo químico presente sobre el profármaco que los vuelve menos activos y/o confiere solubilidad o alguna otra propiedad al fármaco. Una vez que el grupo químico ha sido escindido y/o modificado del profármaco, el fármaco activo es generado. Los profármacos son convertidos al fármaco activo dentro del cuerpo por medio de reacciones enzimáticas o no enzimáticas. Los profármacos pueden proporcionar propiedades fisicoquímicas mejoradas tales como mejor solubilidad, características de administración mejoradas, tales como apuntamiento específicamente de una célula, tejido, órgano o ligando particular y valor terapéutico mejorado. Los beneficios de tales profármacos incluyen, pero no están limitados a, (i) facilidad de administración en comparación con el fármaco original; (ii) el profármaco puede estar biodisponible mediante administración oral mientras que el original no; y (iii) el profármaco puede también tener solubilidad mejorada en composiciones farmacéuticas en comparación con el fármaco original, un pro- fármaco incluye un derivado farmacológicamente inactivo o de actividad reducida de un fármaco activo. Los profármacos pueden estar diseñados para modular la cantidad de un fármaco o molécula biológicamente activa que llega a un sitio de acción deseado por medio de la manipulación de las propiedades de un fármaco, tales como propiedades fisicoquímicas, biofarmacéuticas o farmacocinéticas. Un ejemplo, sin limitación, de un profármaco sería un polipéptido de aminoácido no natural que es administrado como un éster (el "profármaco") para facilitar la transmisión a través de una membrana celular en donde la solubilidad en agua es perjudicial a la movilidad, pero que luego es hidrolizado metabólicamente al ácido carboxílico, la entidad activa, una vez al interior de la célula en donde la solubilidad en agua es benéfica. Los profármacos pueden ser diseñados como derivados de fármaco reversibles, para uso como modificadores para mejorar el transporte de fármaco a tejidos específicos del sitio. El término "cantidad profilácticamente efectiva", como se usa en la presente, se refiere a aquella cantidad de una composición que contiene por lo menos un polipéptido de aminoácido no natural o por lo menos un polipéptido de aminoácido no natural modificado aplicado profilácticamente a un paciente que aliviará a alguna extensión uno o más de los síntomas de una enfermedad, condición o alteración que es tratada. En tales aplicaciones profilácticas, tales cantidades pueden depender del estado de salud del paciente, peso y los semejantes. Se considera dentro de la habilidad del arte determinar tales cantidades profilácticamente efectivas por experimentación de rutina, en los que se incluyen, pero no limitados a, prueba clínica de escalamiento de dosis. El término "protegido", como se usa en la presente, se refiere a la presencia de un "grupo protector" o porción que impide reacción del grupo funcional químicamente reactivo bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo que es protegido. A manera de ejemplo solamente, (i) si el grupo químicamente reactivo es una amina o una hidrazida, el grupo protector puede ser seleccionado de ter-butiloxicarbonilo (t-Boc) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) ; (ii) si el grupo químicamente reactivo es un tiol, el grupo protector puede ser ortopiridildisulfuro; y (iii) si el grupo químicamente reactivo es un ácido carboxílico, tal como ácido butanoico o ácido propiónico o un grupo hidroxilo, el grupo protector puede ser bencilo o un grupo alquilo tal como metilo, etilo o ter-butilo. A manera de ejemplo solamente, grupos bloqueadores/protectores pueden también ser seleccionados de: alilo Bn Cbz aflloc M? HjC' Et t-butilo TBDMS Teoc (CHJJJC' B ?oc tritilo acetilo Fmoc Adicionalmente, los grupos protectores incluyen, pero no están limitados a, grupos fotolábiles tales como Nvoc y MeNvoc y otros grupos protectores conocidos en el arte. Otros grupos protectores son descritos en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a Ed. , John Wiley & Sons, New York, NY, 1999, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad. El término "porción radioactiva" , como se usa en la presente, se refiere a un grupo cuyos núcleos espontáneamente desprenden radiación nuclear, tales como partículas alfa, beta o gamma; en donde las partículas alfa son núcleos de helio, las partículas beta son electrones y las partículas gamma son fotones de alta energía. El término "compuesto reactivo" , como se usa en la presente, se refiere a un compuesto que bajo condiciones apropiadas es reactivo hacia otro átomo, molécula o compuesto. El término "célula huésped recombinante" , también denominada como "célula huésped" , se refiere a una célula que incluye un polinucleótido exógeno, en donde los métodos usados para insertar el polinucleótido exógeno a una célula incluyen, pero no están limitados a, absorción directa, transducción, acoplamiento f u otros métodos conocidos en el arte para crear células huésped recombinantes. A manera de ejemplo solamente, tal polinucleótido exógeno puede ser un vector no integrado, en los que se incluyen pero no limitados a un plásmido o pueden ser integrados al genoma huésped. El término "agente redox-activo" , como se usa en la presente, se refiere a una molécula que oxida o reduce otra molécula, mediante lo cual el agente redox activo se vuelve reducido u oxidado. Ejemplos de agente redox activo incluyen, pero no están limitados a, ferroceno, quinonas, complejos de Ru2+/3+, complejos de Co2+/3+ y complejos de Os2+/3+. El término "agente reductor" , como se usa en la presente, se refiere a un compuesto o material que es capaz de agregar un electrón a un compuesto que es reducido. A manera de ejemplo, agentes reductores incluyen, pero no están limitados a, ditiotreitol (DTT) , 2 -mercaptoetanol , ditioeritritol , cisteína, cisteamina (2-aminoetantiol) y glutationa reducida. Tales agentes reductores pueden ser usados, a manera de ejemplo solamente, para mantener grupos sulfhidrilo en el estado reducido y para reducir enlaces de disulfuro intra- o intermoleculares . "Re-plegado" , como se usa en la presente describe cualquier proceso, reacción o método que transforma un estado plegado inapropiadamente o sin plegar a una conformación natural o plegada apropiadamente. A manera de ejemplo solamente, el re-plegado transforma polipéptidos que contienen enlace de disulfuro de un estado plegado inapropiadamente o sin plegar a una conformación natural o plegada apropiadamente con respecto a los enlaces de disulfuro. Tales polipéptidos que contienen enlace de disulfuro pueden ser polipéptidos de aminoácido natural o polipéptidos de aminoácido no natural. El término "resina", como se usa en la presente, se refiere perlas poliméricas insolubles de alto peso molecular. A manera de ejemplo solamente, tales perlas pueden ser usadas como soportes síntesis de péptido en fase sólida o sitios para anexión de moléculas antes de la purificación. El término "sacárido", como se usa en la presente, se refiere a una serie de carbohidratos en los que se incluyen pero no limitado a azúcares, monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos . El término "seguridad" o "perfil de seguridad" , como se usa en la presente, se refiere a efectos laterales que podrían estar relacionados con la administración de un fármaco en relación con el número de veces que el fármaco ha sido administrado. A manera de ejemplo, un fármaco que ha sido administrado muchas veces y producido solamente efectos moderados o ningunos efectos secundarios se dice que tiene excelente perfil de seguridad. Un ejemplo no limitante de un método para evaluar el perfil de seguridad es dado en el ejemplo 92. Este método puede ser usado para evaluar el perfil de seguridad de cualquier polipéptido. La frase "hibridiza selectivamente a" o "hibridiza específicamente a", como se usa en la presente, se refiere al enlace, duplexión o hibridización de una molécula a una secuencia de nucleótido particular bajo condiciones de hibridización severas cuando aquella secuencia está presente en una mezcla compleja en los que se incluyen pero no limitados a, ADN o ARN celular total o de biblioteca. El término "indicador de espín" , como se usa en la presente, se refiere moléculas que contienen un átomo o un grupo de átomos que exhiben un espín de electrones no apareado (esto es, un grupo paramagnético estable) que puede ser detectado mediante espectroscopia de resonancia de espín de electrones y puede ser anexado a otra molécula. Tales moléculas indicadores de espín incluyen pero no están limitados a, radicales nitrilo y nitróxidos y pueden ser indicadores de un solo espín o indicadores de doble espín. El término "estequiométrico" , como se usa en la presente, se refiere a la proporción de los moles de compuestos que participan en una reacción química que es de aproximadamente 0.9 a aproximadamente 1.1. El término "semejante a estequiométrico", como se usa en la presente, se refiere a una reacción química que se vuelve estequiométrica o casi estequiométrica después de cambios en condiciones de reacción o en presencia de aditivos. Tales cambios en condiciones de reacción incluyen, pero no están limitados a, un incremento en temperatura o cambio en pH. Tales aditivos incluyen, pero no están limitados a, acelerantes. La frase "condiciones de hibridización severas" se refiere a hibridización de secuencias de ADN, ARN, PNA u otros imitadores de ácido nucleico o combinaciones de los mismos, bajo condiciones de baja fuerza iónica y alta temperatura. A manera de ejemplo, bajo condiciones severas una sonda hibridizará a su subsecuente objetivo en una mezcla compleja de ácido nucleico (en los que se incluyen pero no limitados a, ADN o ARN celular total o de biblioteca) pero no hibridiza a otras secuencias en la mezcla compleja. Las condiciones severas son dependientes de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. A manera de ejemplo, secuencias más largas hibridizan específicamente a temperaturas más altas. Condiciones de hibridización severas incluyen, pero no están limitadas a, (i) aproximadamente 5-10°C más bajo que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos; (ii) la concentración de sal es aproximadamente 0.01 M a aproximadamente 1.0 M a un pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente pH 8.3 y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (en las que se incluyen pero no limitadas a, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (en las que se incluyen pero no limitadas a, mayor que 50 nucleótidos) ; (iii) la adición de agentes desestabilizantes incluyen, pero no limitados a, formamida, (iv) formamida al 50%, 5X SSC y SDS al 1%, incubación a 42°C o 5X SSC, SDS al 1%, incubación a 65°C, con lavado en 0.2X SSC y SDS al 0.1% a 65°C por un período de entre aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 120 minutos. A manera de ejemplo solamente, la detección de hibridización selectiva o específica incluye, pero no está limitada a, una señal positiva por lo menos dos veces el fondo. Una guía extensa a la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molcular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993) . El término "sujeto" como se usa en la presente, se refiere a un animal que es el objeto de tratamiento, observación o experimento. A manera de ejemplo solamente, el sujeto puede ser, pero no está limitado a, un mamífero en los que se incluyen, pero no limitado a, un humano. El término "sustancialmente purificado" , como se usa en la presente, se refiere a un componente de interés que puede estar sustancial o esencialmente libre de otros componentes que normalmente acompañan o interactúan con el componente de interés antes de la purificación. A manera de ejemplo solamente, un componente de interés puede estar "sustancialmente purificado" cuando la preparación del componente de interés contiene menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2% o menos de aproximadamente 1% (en peso seco) de componentes contaminantes. Así, un compuesto de interés "sustancialmente purificado" puede tener un nivel de pureza de aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o mayor. A manera de ejemplo solamente, un polipéptido de aminoácido natural o un polipéptido de aminoácido no natural puede ser purificado de una célula natural o célula huésped en el caso de polipéptidos de aminoácido natural o polipéptidos de aminoácido no natural producidos recombinantemente. A manera de ejemplo una preparación de un polipéptido de aminoácido natural o un polipéptido de aminoácido no natural puede estar "sustancialmente purificada" cuando la preparación contiene menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2% o menos de aproximadamente 1% (en peso seco) de material contaminante. A manera de ejemplo, cuando un polipéptido de aminoácido natural o un polipéptido de aminoácido no natural es producido recombinantemente mediante células huésped, el polipéptido de aminoácido natural o polipéptido de aminoácido no natural puede estar presente a aproximadamente 30%, aproximadamente 25%, aproximadamente 20%, aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5%, aproximadamente 4%, aproximadamente 3%, aproximadamente 2% o aproximadamente 1% o menos del peso seco de las células. A manera de ejemplo cuando un polipéptido de aminoácido natural o un polipéptido de aminoácido no natural es producido recombinantemente por células huésped, el polipéptido de aminoácido natural o polipéptido de aminoácido no natural puede estar presente en el medio de cultivo a aproximadamente 5 g/l, aproximadamente 4 g/l, aproximadamente 3 g/l, aproximadamente 2 g/l, aproximadamente 1 g/l, aproximadamente 750 mg/1, aproximadamente 500 mg/1, aproximadamente 250 mg/1, aproximadamente 100 mg/1, aproximadamente 50 mg/1, aproximadamente 10 mg/1 o aproximadamente 1 mg/1 o menos del peso seco de las células. A manera de ejemplo, polipéptidos de aminoácido natural o polipéptidos de aminoácido no natural "sustancialmente purificados" pueden tener un nivel de pureza de aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 99% o mayor como se determina mediante métodos apropiados, en los que se incluyen, pero no limitados a, análisis de SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC y electroforesis capilar. El término "sustituyentes" también denominado como "sustituyentes no interferentes" se refiere a grupos que pueden ser usados para reemplazar otro grupo en una molécula. Tales grupos incluyen, pero no están limitados a, halo, CÍ-CIO alquilo, C2-C10 alquenilo, C2-C10 alquinilo, C1-C10 alcoxi, C5-C?2 aralquilo, C3-C12 cicloalquilo, C -C?2 cicloalquenilo, fenilo, fenilo sustituido, toluolilo, xilenilo, bifenilo, C2-C?2 alcoxialquilo, C5-C?2 alcoxiarilo, C5-C?2 ariloxialquilo, C7-C?2 oxiarilo, C?-C6 alquilsulfinilo, C1-C10 alquilsulfonilo, -(CH2)m-0- (C1-C10 alquilo) en donde m es de 1 a 8, arilo, arilo sustituido, alcoxi sustituido, fluoroalquilo, radical heterocíclico, radical heterocíclico sustituido, nitroalquilo, -N02, -CN, -NRC(O) - (Ci-Cio alquilo), -C (O) - (C?-C?0 alquilo), C2-C?o alquiltioalquilo, -C (O) O- (C?-C?0 alquilo), -OH, -S02, =S, -COOH, -NR2, carbonilo, -C (O) - ( L-CIO alquilo) -CF3, -C(0)-CF3/ -C(0)NR2, - (Ci-Cio arilo) -S- (C3-C?o arilo), -C (O) - (C6-C?0 arilo), - (CH2) m-O- (CH2) m-O- (Ci-Cio alquilo) en donde cada m es de 1 a 8, -C(0)NR2, -C(S)NR2, -S02NR2, -NRC(0)NR2, -NRC(S)NR2, sales de los mismos y los semejantes. Cada grupo R en la lista precedente incluye, pero no está limitado a, H, alquilo o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido o alcarilo. En donde grupos sustituyentes son especificados por sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, abarcan igualmente los sustituyentes químicamente idénticos que resultarían de la escritura de derecha a izquierda, por ejemplo -CH20- es equivalente a -0CH2- . A manera de ejemplo solamente, sustituyentes para radicales alquilo y heteroalquilo (en los que se incluyen aquellos grupos denominados como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) incluye, pero no está limitado a: -OR, =0, =NR, =N-0R, -NR2, -SR, -halógeno, -SiR3, -0C(0)R, -C(0)R, -C02R, -C0NR2, -0C(0)NR2, -NRC(0)R, -NRC(0)NR2, -NR(0)2R, -NR-C (NR2) =NR, -S(0)R, -S(0)2R, -S(0)2NR2, -NRS02R, -CN y -N02. Cada grupo R en la lista precedente incluye, pero no está limitado a, hidrógeno, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, en los que se incluyen pero no limitados a, arilo sustituido con 1-3 halógenos, alquilo sustituido o sin sustituir, grupos alcoxi o tioalcoxi o grupos aralquilo. Cuando dos grupos R están anexados al mismo átomo de nitrógeno, pueden ser combinados con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5-, 6- o 7-miembros. Por ejemplo, -NR2 significa que incluye, pero no está limitado a, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo . A manera de ejemplo, sustituyentes para grupos arilo y heteroarilo incluyen, pero no están limitados a, -OR, =0, =NR, =N-OR, -NR2, -SR, -halógeno, -SiR3, -OC(0)R, -C(0)R, -C02R, -C0NR2, -OC(0)NR2, -NRC(0)R, -NRC(0)NR2, -NR(0)2R, -NR-C(NR2)=NR, -S(0)R, -S(0)2R, -S(0)2NR2, -NRS02R, -CN, -N02, -R, -N3, -CH(Ph)2, fluoro (C?-C4) alcoxi y fluoro (Cx-C alquilo, en un número que fluctúa de cero al número total de valencias abiertas sobre el sistema de anillo aromático; y en donde cada grupo R en la lista precedente incluye, pero no está limitado a, hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilo y heteroarilo. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" , como se usa en la presente, se refiere a la cantidad de una composición que contiene por lo menos un polipéptido de aminoácido no natural y/o por lo menos un polipéptido de aminoácido no natural modificado administrado a un paciente que ya sufre de una enfermedad, condición o alteración, suficiente para curar o por lo menos detener parcialmente o aliviar a alguna extensión uno o más de los síntomas de la enfermedad, alteración o condición que es tratada. La efectividad de tales composiciones depende de condiciones en las que se incluyen, pero no limitadas a, la severidad y curso de la enfermedad, alteración o condición, terapia previa, estatus de salud del paciente y respuesta a los fármacos y el juicio del médico de tratamiento. A manera de ejemplo solamente, cantidades terapéuticamente efectivas pueden ser determinadas mediante experimentación de rutina, en los que se incluyen pero no limitados a un estudio clínico de escalamiento de dosis. El término "tioalcoxi", como se usa en la presente, se refiere a grupos alquilo que contienen azufre enlazados a moléculas vía un átomo de oxígeno. El término "punto de fusión térmico" o Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica, pH y concentración nucleica definidos) al cual el 50% de las sondas complementarias a un objetivo se hibridizan a la secuencia objetivo en equilibrio. El término "porción tóxica" , como se usa en la presente, se refiere a un compuesto que puede provocar daños o muerte . Los términos "trato" , "tratar" o "tratamiento" , como se usan en la presente, incluye aliviar, abatir o mejorar una enfermedad o síntoma de condición, prevenir síntomas adicionales, mejorar o impedir las causas metabólicas subyacentes de síntomas, inhibir la enfermedad o condición, por ejemplo, detener el desarrollo de la enfermedad o condición, aliviar la enfermedad o condición, provocar regresión de la enfermedad o condición, aliviar una condición provocada por la enfermedad o condición o detener los síntomas de la enfermedad o condición. Los términos "trato", "tratar" o "tratamiento", incluyen, pero no están limitados a, tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. Como se usa en la presente, el término "polímero soluble en agua" se refiere a un polímero que es soluble en solventes acuosos. Tales polímeros solubles en agua incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicol, polietilenglicol propionaldehído, mono C!-C10 alcoxi o ariloxi derivados de los mismos (descritos en la patente estadounidense No. 5,252,714 que es incorporada por referencia en la presente) , monometoxi-polietilenglicol , polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, poliaminoácidos, anhídrido de diviniléter maleico, N- (2-hidroxipropil) -metacrilamida, dextrana, derivados de dextrana en los que se incluyen sulfato de dextrana, polipropilenglicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polisacáridos, oligosacáridos, glicanas, celulosa y derivados de celulosa, en los que se incluyen pero no limitados a metilcelulosa y carboximetil celulosa, albúmina de suero, almidón y derivados de almidón, polipéptidos, polialquilenglicol y derivados de los mismos, copolímeros de polialquilenglicoles y derivados de los mismos, polivinil etil éteres y alfa-beta-poli [ (2-hidroxietil) -DL-aspartamida y los semejantes o mezclas de los mismos. A manera de ejemplo solamente, el acoplamiento de tales polímeros solubles en agua a polipéptidos de aminoácido natural o polipéptidos de aminoácido no natural puede dar como resultado cambios en los que se incluyen, pero no limitados a, solubilidad en agua incrementada, vida media en el suero modulada o incrementada, vida media terapéutica incrementada o modulada en relación con la forma sin modificar, biodisponibilidad incrementada, actividad biológica modulada, tiempo de circulación prolongado, inmunogenicidad modulada, características de asociación física moduladas en las que se incluyen, pero no limitadas a, agregación y formación de multímeros, enlace de receptor alterada, enlace alterado a uno o más socios de enlace y dimerización o multimerización de receptor alterada. Además, tales polímeros solubles en agua pueden o pueden no tener su propia actividad biológica. A no ser que se indique de otra manera, métodos convencionales de espectroscopia de masas, RMN, HPLC, química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinantes y farmacología, dentro de la habilidad del arte son usadas. Compuestos, (en los que se incluyen, pero no limitados a aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados y reactivos para producir los compuesto mencionados anteriormente) presentados en la presente incluyen compuestos marcados isotópicamente, que son idénticos a aquellos citados en el varias fórmulas y estructuras presentadas en la presente, pero por el hecho de que uno o más átomos son reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o número de masa diferente de la masa atómica o número de masa usualmente encontrados en la naturaleza. Ejemplos de isótopos que pueden ser incorporados a los compuestos presentes incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, flúor y cloro, tales como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 180, 170, 35S, 18F, 36C1, respectivamente. Ciertos compuestos marcados isotópicamente descritos en la presente, por ejemplo aquellos a los cuales isótopos radioactivos tales como 3H y 14C son incorporados, son útiles en análisis de distribución de fármaco y/o tejido de sustrato. Además, la sustitución con isótopos tales como deuterio, esto es, 2H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de mayor estabilidad metabólica, por ejemplo vida media in vivo incrementada o requerimientos de dosificación reducidos. Algunos de los compuestos de la presente (en los que se incluyen, pero no limitados a aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados y reactivos para producir los compuesto mencionados anteriormente) tienen átomos de carbono asimétricos y pueden existir por consiguiente como enantiómeros o diastereómeros. Las mezclas diastereoméricas pueden ser separadas a sus diastereómeros individuales en base a sus diferencias fisicoquímicas mediante métodos conocidos, por ejemplo, mediante cromatografía y/o cristalización fraccional. Los enantiómeros pueden ser separados al convertir la mezcla enantiomérica a una mezcla diastereomérica mediante reacción con un compuesto apropiado ópticamente activo (por ejemplo, alcohol), separar los diastereómeros y convertir (por ejemplo, hidrolizar) los diastereómeros individuales a los enantiómeros puros correspondientes. Todos de tales isómeros, en los que se incluyen diastereómeros, enantiómeros y mezclas de los mismos son considerados como parte de las composiciones descritas en la presente. En demás modalidades o modalidades adicionales, los compuestos descritos en la presente (en los que se incluyen, pero no limitados a aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados y reactivos para producir los compuesto mencionados anteriormente) son usados en forma de pro-fármacos. En demás modalidades o modalidades adicionales, los compuestos descritos en la presente (en los que se incluyen, pero no limitados a aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados y reactivos para producir los compuesto mencionados anteriormente) son metabolizados después de administración a un organismo en necesidad de producir un metabolito que es luego usado para producir un efecto deseado, en los que se incluyen un efecto terapéutico deseado. En demás modalidades o modalidades adicionales se encuentran metabolitos activos de aminoácidos no naturales y polipéptidos de aminoácido no natural "modificados o sin modificar" . Los métodos y formulaciones descritos en la presente incluyen el uso de N-óxidos, formas cristalinas (también conocidas como polimorfos) o sales aceptables farmacéuticamente de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados. En ciertas modalidades, los aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados pueden existir como tautómeros. Todos los tautómeros están incluidos dentro del alcance de los aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados presentados en la presente. Además, los aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente pueden existir en forma sin solvatar también como formas solvatadas con solventes aceptables farmacéuticamente tales como agua, etanol y los semejantes. Las formas solvatadas de los aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados presentadas en la presente son también consideradas ser reveladas en la presente. Algunos de los compuestos en la presente (en los que se incluyen, pero no limitados a aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados y reactivos para producir los compuesto mencionados anteriormente) pueden existir en varias formas tautoméricas. Todas de tales formas tautoméricas son consideradas como parte de las composiciones descritas en la presente. También, por ejemplo todas las formas enol-ceto de cualquier compuestos (en los que se incluyen, pero no limitados a aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados y reactivos para producir los compuesto mencionados anteriormente) en la presente son considerados como parte de las composiciones descritas en la presente.
Algunos de los compuestos en la presente (en los que se incluyen, pero no limitados a aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados y reactivos para producir ya sea uno u otro de los compuestos mencionados anteriormente) son ácidos y pueden formar una sal con un catión aceptable farmacéuticamente. Algunos de los compuestos en la presente (en los que se incluyen, pero no limitados a aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados y reactivos para producir los compuesto mencionados anteriormente) pueden ser básicos y así, pueden formar una sal con un anión aceptable farmacéuticamente. Todas de tales sales, en las que se incluyen di-sales están dentro del alcance de las composiciones descritas en la presente y pueden ser preparadas mediante métodos convencionales. Por ejemplo, sales pueden ser preparadas al poner en contacto las entidades acidas o básicas, ya sea en un medio acuoso, no acuoso o parcialmente acuoso. Las sales son recuperadas al utilizar por lo menos una de las siguientes técnicas: filtración, precipitación con un no solvente seguido por filtración, evaporación del solvente, o en el caso de soluciones acuosas, liofilización. Sales aceptables farmacéuticamente de los polipéptidos de aminoácido no natural revelados en la presente pueden ser formadas cuando un protón ácido presente en los polipéptidos de aminoácido no natural originales es ya sea reemplazado por un ion de metal, a manera de ejemplo un ion de metal alcalino, un ion alcalino terreo o un ion de aluminio; o se coordina con una base orgánica. Además, las formas de sal de los polipéptidos de aminoácido no natural revelados pueden ser preparadas usando sales de los materiales de partida o intermediarios. Los polipéptidos de aminoácido no natural descritos en la presente pueden ser preparados como una sal de adición de ácido aceptable farmacéuticamente (que es un tipo de una sal aceptable farmacéuticamente) al hacer reaccionar la forma de base libre de los polipéptidos de aminoácido no natural descritos en la presente con un ácido inorgánico u orgánico aceptable farmacéuticamente. Alternativamente, los polipéptidos de aminoácido no natural descritos en la presente pueden ser preparados como sales de adición de base aceptables farmacéuticamente (que es un tipo de una sal aceptable farmacéuticamente) al hacer reaccionar la forma de ácido libre de polipéptidos de aminoácido no natural descritos en la presente con una base inorgánica u orgánica aceptable farmacéuticamente. El tipo de sales aceptables farmacéuticamente, incluyen, pero no están limitadas a: (1) sales de adición de ácido, formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y los semejantes; o formadas con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido hexanoico, ácido ciclopentanpropiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido 3- (4-hidroxibenzoil) benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido 1 , 2-etandisulfónico, ácido 2-hidroxietansulfónico, ácido bencensulfónico, ácido 2-naftalensulfónico, ácido 4-metilbiciclo- [2.2.2] oct-2-en-l-carboxílico, ácido glucoheptónico, 4, 4' -metilenbis- (ácido 3-hidroxi-2-en-l-carboxílico) , ácido 3-fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciario, ácido lauril sulfúrico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido hidroxinaftoico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucónico y los semejantes; (2) sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto original es ya sea es reemplazado por un ion de metal, por ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion alcalino terreo o un ion de aluminio; o se coordina con una base orgánica. Bases orgánicas aceptables incluyen etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina y los semejantes. Bases inorgánicas aceptables incluyen hidróxido de aluminio, hidróxido de calcio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio, hidróxido de sodio y los semejantes. Los contraiones correspondientes de las sales aceptables farmacéuticas de polipéptido de aminoácido no natural pueden ser analizados e identificado utilizando varios métodos en los que se incluyen, pero no limitados a, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía iónica, electroforesis capilar, plasma acoplado inductivamente, espectroscopia de absorción atómica, espectrometría de masas o cualquier combinación de los mismos. Además, la actividad terapéutica de tales sales aceptables farmacéuticas de polipéptido de aminoácido no natural puede ser probada utilizando las técnicas y métodos descritos en los ejemplos 87-91. Se debe entender que una referencia a una sal incluye las formas de adición de solvente o formas cristalinas de las mismas, particularmente solvatos o polimorfos. Lo solvatos contienen ya sea cantidades estequiométricas o no estequiométricas de un solvente y son frecuentemente formadas durante el proceso de cristalización con solventes aceptables farmacéuticamente tales como agua, etanol y los semejantes. Los hidratos son formados cuando el solvente es agua o se forman alcoholatos cuando el solvente es alcohol. Los polimorfos incluyen los diferentes arreglos de empaque cristalinos de la misma composición elemental de un compuesto. Los polimorfos tienen usualmente diferentes patrones de difracción de rayos X, espectros infrarrojos, puntos de fusión, densidad, dureza, forma cristalina, propiedades ópticas y eléctricas, estabilidad y solubilidad. Varios factores tales como el solvente de recristalización, velocidad de cristalización y temperatura de almacenamiento pueden provocar que una sola forma cristalina domine . La selección y caracterización de polimorfos de sales aceptables farmacéuticas de polipéptidos de aminoácido no natural y/o solvatos se pueden llevar a cabo utilizando una variedad de técnicas, en los que se incluyen pero no limitadas a, análisis térmico, difracción de rayos x, espectroscopia, absorción de vapor y microscopía. Los métodos de análisis térmico tratan la degradación termoquímica o procesos termofísicos en los que se incluyen, pero no limitados a, transiciones polimórficas y tales métodos son usados para analizar las relaciones entre formas polimórficas, determinar pérdida de peso, para encontrar la temperatura de transición vitrea o para estudios de compatibilidad de excipiente. Tales métodos incluyen, pero no están limitados a, Calorimetría de exploración o barrido diferencial (DSC) , calorimetría de exploración diferencial modulada (MDCS) , análisis termogravimétrico (TGA) y análisis termogravimétrico e infrarrojo (TG/IR) . Los métodos de difracción de rayos x incluyen, pero no están limitados a, difractómetros de un solo cristal y polvo y fuentes de sincrotrón. Las varias técnicas espectroscópicas usadas incluyen, pero no están limitadas a, Raman, FTIR, UVIS y RMN (líquida y de estado sólido) . Las varias técnicas de microscopía incluyen, pero no están limitadas a, microscopía de luz polarizada, microscopia electrónica de barrido (SEM) con análisis de rayos x dispersiva de energía (EDX) , microscopia electrónica de barrido ambiental con EDX (en gas o atmósfera de vapor de agua) , microscopía IR y microscopía de Raman.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Un mejor entendimiento de los elementos y ventajas de los presentes métodos y composiciones se puede obtener por referencia a la siguiente descripción detallada que resume modalidades ilustrativas, en las cuales los principios de los métodos, composiciones, dispositivos y aparatos son utilizados y las figuras adjuntas de la cuales: La figura 1 presenta una representación esquemática de la relación de ciertos aspectos de los métodos, composiciones, estrategias y técnicas descritas en la presente. La figura 2 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes de los tipos de aminoácidos no naturales descritos en la presente. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente.
La figura 3 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes de los tipos de aminoácidos no naturales descritos en la presente. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporado a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente. La figura 4 presenta un ejemplo ilustrativo no limitante de la metodología sintética usada para fabricar los aminoácidos no naturales descritos en la presente. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente. La figura 5 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes de la metodología sintética usada para fabricar los aminoácidos no naturales descritos en la presente. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente . La figura 6 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes de la metodología sintética usada para fabricar los aminoácidos no naturales descritos en la presente. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente. La figura 7 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes de la modificación post-traducción de polipéptidos de aminoácido no natural que contienen carbonilo con reactivos que contienen hidroxilamina para formar polipéptidos de aminoácido no natural que contienen oxima modificados. Tales polipéptidos de aminoácido no natural pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente. La figura 8 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes de aditivos que pueden ser usados para mejorar la reacción de polipéptidos de aminoácido no natural que contienen carbonilo con reactivos que contienen hidroxilamina para formar polipéptidos de aminoácido no natural que contienen oxima modificados . La figura 9 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes de la modificación post-traducción de polipéptidos de aminoácido no natural que contienen oxima con reactivos que contienen carbonilo para formar polipéptidos de aminoácido no natural que contienen oxima modificados. Tales polipéptidos de aminoácido no natural pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente. La figura 10 presenta un ejemplo ilustrativo no limitante de la modificación post-traducción de polipéptidos de aminoácido no natural que contienen hidroxilamina con reactivos que contienen carbonilo para formar polipéptidos de aminoácido no natural que contienen oxima modificados. Tales polipéptidos de aminoácido no natural pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente. La figura 11 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes de reactivos que contienen PEG que pueden ser usados para modificar polipéptidos de aminoácido no natural para formar polipéptidos de aminoácido no natural oxima-enlazados que contienen PEG. La figura 12 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes de la síntesis de reactivos que contienen PEG que pueden ser usados para modificar polipéptidos de aminoácido no naturales para formar polipéptidos de aminoácido no natural oxima-enlazados que contienen PEG. La figura 13 presenta un ejemplo ilustrativo no limitante de la síntesis de un reactivo que contiene PEG a base de amida que puede ser usado para modificar polipéptidos de aminoácido no natural para formar polipéptidos de aminoácido no natural oxima-enlazados que contienen PEG. La figura 14 presenta un ejemplo ilustrativo no limitante de la síntesis de un reactivo que contiene PEG a base de carbamato que puede ser usado para modificar polipéptidos de aminoácido no natural para formar polipéptidos de aminoácido no natural oxima-enlazados que contienen PEG. La figura 15 presenta un ejemplo ilustrativo no limitante de la síntesis de un reactivo que contiene PEG a base de carbamato que puede ser usado para modificar polipéptidos de aminoácido no natural para formar polipéptidos de aminoácido no natural oxima-enlazados que contienen PEG. La figura 16 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes de la síntesis de reactivos que contienen PEG simples que pueden ser usados para modificar polipéptidos de aminoácido no natural para formar polipéptidos de aminoácido no natural oxima-enlazados que contienen PEG. La figura 17 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes de reactivos que contienen PEG ramificados que pueden ser usados para modificar polipéptidos de aminoácido no natural para formar polipéptidos de aminoácido no natural oxima-enlazados que contienen PEG y el uso de tal reactivo para modificar un polipéptido de aminoácido no natural a base de carbonilo. La figura 18 presenta un ejemplo ilustrativo no limitante de la síntesis de un grupo enlazador bifuncional que puede ser usado para modificar y enlazar polipéptidos de aminoácido no naturales. La figura 19 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes de grupos enlazadores multifuncionales que pueden ser usados para modificar y enlazar polipéptidos de aminoácido no naturales. La figura 20 presenta una representación ilustrativa no limitante del uso de un grupo enlazador bifuncional para modificar y enlazar un polipéptido de aminoácido no natural a un grupo PEG. La figura 21 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes del uso de grupos enlazadores bifuncionales para modificar y enlazar polipéptidos de aminoácido no naturales a un grupo PEG. La figura 22 presenta una representación ilustrativa no limitante del uso de un grupo enlazador bifuncional para enlazar conjuntamente dos polipéptidos de aminoácido no naturales para formar un homodímero. La figura 23 presenta una representación ilustrativa no limitante del uso de un grupo enlazador bifuncional para enlazar conjuntamente dos polipéptidos de aminoácido no natural diferentes para formar un heterodímero . La figura 24 presenta una representación ilustrativa no limitante de la síntesis de un aminoácido no natural que contiene carbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente. La figura 25 presenta una representación ilustrativa no limitante de la síntesis de un aminoácido no natural que contiene dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente. La figura 26 presenta una representación ilustrativa no limitante de la síntesis de un aminoácido no natural que contiene dicarbonilo. La figura 27 presenta una representación ilustrativa no limitante de la síntesis de un aminoácido no natural que contiene dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente. La figura 28 presenta una representación ilustrativa no limitante de la síntesis de un aminoácido no natural que contiene dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente. La figura 29 presenta una representación ilustrativa no limitante de la síntesis de un aminoácido no natural que contiene dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificados descritos en la presente. La figura 30 presenta una representación ilustrativa no limitante de la síntesis de un aminoácido no natural que contiene dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 31 presenta una representación ilustrativa no limitante de la síntesis de un aminoácido no natural que contiene dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 32 presenta una representación ilustrativa no limitante de la síntesis de un aminoácido no natural que contiene dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 33 presenta una representación ilustrativa no limitante de la síntesis de un aminoácido no natural que contiene dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 34 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de aminoácidos no naturales que contienen dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 35 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de aminoácidos no naturales que contienen carbonilo y dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 36 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de aminoácidos no naturales. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 37 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de aminoácidos no naturales que contienen carbonilo y dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 38 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de aminoácidos no naturales que contienen carbonilo y dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 39 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de aminoácidos no naturales que contienen carbonilo y dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 40 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de de aminoácidos no naturales que contienen dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente.
La figura 41 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de aminoácidos no naturales que contienen dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 42 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de aminoácidos no naturales que contienen dicarbonilo. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 43 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de (a) aminoácidos no naturales que contienen 1 , 3-cetoaldehído protegidos o sin proteger, y (b) aminoácidos no naturales que contienen 1-3-cetocarboxilil (tio) éster. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 44 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de aminoácidos no naturales que contienen hidrazida. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 45 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de aminoácidos no naturales que contienen hidrazida. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. Las figuras 46A y 46B presenta representaciones ilustrativas no limitantes de aminoácidos no naturales que contienen oxima y la figura 46C presenta representaciones ilustrativas no limitantes de aminoácidos no naturales que contienen hidrazina. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 47 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de conjugación de una etapa a polipéptidos de aminoácido no naturales y conjugación de dos etapas a polipéptidos de aminoácido no naturales. A manera de ejemplo, tales conjugaciones incluyen PEGilación de a polipéptidos de aminoácido no naturales. La figura 48 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de mPEG-hidroxilamina . Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 49 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de mPEG-hidroxilamina. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente.
La figura 50 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de mPEG-hidroxilamina . Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 51 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de mPEG-hidroxilamina . Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 52 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de mPEG-hidroxilamina . Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 53 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de mPEG-hidroxilamina. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 54 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de mPEG-hidroxilamina. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 55 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de mPEG-hidroxilamina . Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 56 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de mPEG-hidroxilamina. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 57 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de mPEG-hidroxilamina . Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 58 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de mPEG-hidroxilamina. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 59 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de mPEG-hidroxilamina. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 60 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de hidroxilamina. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 61 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de mPEG-hidroxilamina. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 62A presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de hidroxilamina; la figura 62B presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de mPEG. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 63 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes de (A) la modificación de polipéptidos de aminoácido no naturales mediante conversión química a polipéptidos de aminoácido no natural que contiene carbonilo (en los que se incluyen que contienen dicarbonilo) y (B) la modificación de polipéptidos de aminoácido no naturales mediante conversión química a polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen hidroxilamina. Tales polipéptidos de aminoácido no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 64 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de PEG-hidroxilamina. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La figura 65 presenta representaciones ilustrativas no limitantes de la síntesis de compuestos de PEG-hidroxilamina. Tales aminoácidos no naturales pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN J. Introducción Recientemente, una tecnología completamente nueva en la ciencia de proteínas se ha reportado, que promete superar muchas de las limitaciones asociados con modificaciones específicas del sitio de proteínas. Específicamente, nuevos compuestos han sido agregados a la maquinaria biosintética de proteína del procarionte Escherichia coli (E. coli ) (por ejemplo, L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500) y el eucarionte Sacchrowyces cerevisiae (S. cerevisiae) (por ejemplo, J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), que ha permitido la incorporación de aminoácidos no naturales a proteínas in vivo. Un número de nuevos aminoácidos con novedosas propiedades químicas, físicas o biológicas, en las que se incluyen marcadores de fotoafinidad y aminoácidos fotoisomerizables, ceto aminoácidos y aminoácidos glicosilados han sido incorporados eficientemente y con alta fidelidad a proteínas en E. coli y en levadura en respuesta al codón ámbar, TAG, utilizando esta metodología. Véase, por ejemplo, J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027 (incorporado por referencia en su totalidad); J. W. Chin, Se P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11): 1135-1137 (incorporado por referencia en su totalidad) ; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99 (17) : 11020- 11024 (incorporado por referencia en su totalidad) ; y, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002) , Chem. Comrau 1-11 (incorporado por referencia en su totalidad) . Estos estudios han demostrado que es posible introducir selectiva y sistemáticamente grupos funcionales químicos que no son encontrados en proteínas, que son químicamente inertes a todos los grupos funcionales encontrados en el 20 aminoácidos comunes codificados genéticamente y que pueden ser usado para reaccionar eficiente y selectivamente para formar enlaces covalentes estables.
II. Vista General La figura 1 presenta una vista general de las composiciones, métodos y técnicas que son descritos en la presente. En un nivel, descrito en la presente se encuentran herramientas (métodos, composiciones, técnicas) para crear y usar un polipéptido que comprende por lo menos un aminoácido no natural o aminoácido no natural modificado con un grupo carbonilo, dicarbonilo, oxima o hidroxilamina. Tales aminoácidos no naturales puede contener además funcionalidad, en los que se incluyen pero no limitados a, un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co- factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; una etiqueta de espín; un fluoróforo; una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica; un ligando; una porción fotoisomerizable ; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-reticulado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo (en cuyo caso, el agente biológicamente activo puede incluir un agente con actividad terapéutica y el polipéptido de aminoácido no natural o aminoácido no natural modificado puede servir ya sea como agente co-terapéutico con el agente terapéutico anexado o como medio para administrar el agente terapéutico a un sitio deseado dentro de un organismo) ; una etiqueta detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor; un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor; un radiotransmisor; una abzima, un activador complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptámero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa, y cualquier combinación de los mismos. Nótese que las varias funcionalidades mencionadas anteriormente no significa implicar que los miembros de una funcionalidad no puedan ser clasificados como miembros de otra funcionalidad. Por supuesto, habrá superposición dependiendo de las circunstancias particulares. A manera de ejemplo solamente, un polímero soluble en agua se superpone en alcance con un derivado de polietilenglicol, sin embargo la superposición no es completa y así ambas funcionalidades citadas anteriormente. Como se muestra en figura 1, en un aspecto se encuentran métodos para seleccionar y diseñar un polipéptido a ser modificado utilizando los métodos, composiciones y técnicas descritos en la presente. El nuevo polipéptido puede ser diseñados de nuevo, incluyendo a manera de ejemplo solamente, como parte de un proceso de selección de alto rendimiento (en cuyo caso numerosos polipéptidos pueden ser diseñados, sintetizados, caracterizados y/o probados) o en base al interés del investigador. El nuevo polipéptido puede también ser diseñado en base a la estructura de un polipéptido conocido o parcialmente caracterizado. A manera de ejemplo solamente, la superfamilia genética de hormona del crecimiento (véase infra) ha sido el tema de estudio intenso por la comunicación científica; un nuevo polipéptido puede ser diseñado en base a la estructura de un miembro o miembros de esta superfamilia genética. Los principios para seleccionar cual (es) aminoácido (s) sustituir y/o modificar son descritos separadamente en la presente. La elección de cual modificar usar es también descrita en la presente y puede ser usado para cumplir con la necesidad del experimentador o usuario final. Tales necesidades pueden incluir, pero no están limitadas a, manipulación de la efectividad terapéutica del polipéptido, mejora del perfil de seguridad del polipéptido, ajuste de la farmacocinética, farmacología y/o farmacodinámica del polipéptido, tal como, a manera de ejemplo solamente, incrementar la solubilidad en agua, biodisponibilidad, incrementar la vida media en el suero, incrementar la vida media terapéutica, modular la inmunogenicidad, modular la actividad biológica o prolongar el tiempo de circulación. Además, tales modificaciones incluyen, a manera de ejemplo solamente, proporcionar funcionalidad adicional al polipéptido, incorporar una etiqueta, marcador o señal detectable al polipéptido, facilitar las propiedades de aislamiento del polipéptido y cualquier combinación de las modificaciones mencionadas anteriormente. También se describen en la presente aminoácidos no naturales que han o pueden ser modificados para contener un grupo oxima, carbonilo, dicarbonilo o hidroxilamina. Incluidos con este aspecto se encuentran métodos para producción, purificación, caracterización y uso de tales aminoácidos no naturales. En otro aspecto descrito en la presente se encuentran métodos, estrategias y técnicas para incorporar por lo menos uno de tales aminoácido no naturales a un polipéptido. También incluidos con este aspecto se encuentran métodos para la producción, purificación, caracterización y uso de tales polipéptidos que contienen por lo menos uno de tales aminoácido no naturales. También incluidos con este aspecto se encuentran composiciones de y métodos para la producción, purificación, caracterización y uso de oligonucleótidos (en los que se incluyen ADN y ARN) que pueden ser usados para producir, por lo menos en parte, un polipéptido que contiene por lo menos un aminoácido no natural . También incluidos con este aspecto se encuentran composiciones de y métodos para la producción, purificación, caracterización y uso de células que pueden expresar tales oligonucleótidos que pueden ser usados para producir, por lo menos en parte, un polipéptido que contiene por lo menos un aminoácido no natural . Así, los polipéptidos que comprenden por lo menos un aminoácido no natural o aminoácido no natural modificado con un grupo carbonilo, dicarbonilo, oxima o hidroxilamina son provistos y descritos en la presente. En ciertas modalidades, polipéptidos con por lo menos un aminoácido no natural o aminoácido no natural modificado con un grupo carbonilo, dicarbonilo, oxima o hidroxilamina incluyen por lo menos una modificación post-traducción en alguna posición sobre el polipéptido. En algunas modalidades la modificación co-traducción o post-traducción ocurre vía la maquinaria celular (por ejemplo, glicosilación, acetilación, acilación, lípido-modificación, palmitoilación, palmitato adición, fosforilación, modificación de enlace de glicolípido y los semejantes), en muchas instancias, tales modificaciones co-traducción o posttraducción a base de maquinaria celular ocurren en los sitios de aminoácido que se presentan de manera estable en la naturaleza sobre el polipéptido, sin embargo, En ciertas modalidades, las modificaciones co-traducción o post-traducción a base de maquinaria celular ocurren sobre el (los) sitio (s) de aminoácido no natural sobre el polipéptido. En otras modalidades la modificación post-traducción no utiliza la maquinaria celular, pero la funcionalidad es provista en lugar de esto mediante anexión de una molécula (en los que se incluyen pero no limitados a, un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica; un ligando; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor; un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptámero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa y cualquier combinación de los mismos) que comprende un segundo grupo reactivo al por lo menos un aminoácido no natural que comprende un primer grupo reactivo (en los que se incluyen pero no limitados a, aminoácido no natural que contiene un grupo funcional cetona, aldehido, acetal, hemiacetal, oxima o hidroxilamina) utilizando metodología de química descrita en la presente u otros apropiados para los grupos reactivos particulares. En ciertas modalidades, la modificación co-traducción o post-traducción se efectúa in vivo en una célula eucarióntica o en una célula no eucarióntica. En ciertas modalidades, la modificación post-traducción se hace in vitro no utilizando la maquinaria celular. También incluidos con este aspecto se encuentran métodos para la producción, purificación, caracterización y uso tales polipéptidos que contienen por lo menos uno de tales aminoácidos no naturales modificados co-traducción o post-traduccionalmente . También incluido dentro del alcance de los métodos, composiciones, estrategias y técnicas descritos en la presente se encuentran reactivos capaces de reaccionar con un aminoácido no natural (que contiene un grupo carbonilo o dicarbonilo, grupo oxima, grupo hidroxilamina o formas enmascaradas o protegidas de los mismos) que es parte de un polipéptido para producir cualquiera de las modificaciones post-traducción mencionadas anteriormente. En general, el aminoácido no natural modificado post-traduccionalmente resultante contendrá por lo menos un grupo oxima; el aminoácido no natural que contiene oxima modificado resultante puede sufrir reacciones de modificación subsecuentes. También incluidos con este aspecto se encuentran métodos para la producción, purificación, caracterización y uso tales reactivos que son capaces de cualquiera de tales modificaciones post-traducción de tal (es) aminoácido (s) no natural (es) . En ciertas modalidades, el polipéptido incluye por lo menos una modificación co-traducción o post-traducción que se hace in vivo por una célula huésped, en donde la modificación post-traducción no se hace normalmente por otro tipo de célula huésped. En ciertas modalidades, el polipéptido incluye por lo menos una modificación co-traducción o post-traducción que se hace in vivo por una célula eucarióntica, en donde la modificación co-traducción o post-traducción no se hace normalmente por una célula no eucarióntica. Ejemplos de tales modificaciones co-traducción o post-traducción incluyen pero no están limitadas a, glicosilación, acetilación, acilación, modificación de lípido, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación de enlace de glicolípido y los semejantes. En una modalidad, la modificación co-traducción o post-traducción comprende anexión de un oligosacárido a una asparagina mediante un enlace de GlcNAc-asparagina (en los que se incluyen pero no limitado a, en donde el oligosacárido comprende (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc y los semejantes). En otra modalidad, la modificación co-traducción o post-traducción comprende anexión de oligosacárido (en los que se incluyen pero no limitados a, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a una serina o treonina mediante una GalNAc-serina, una GalNAc-treonina, una GlcNAc-serina o un enlace de GlcNAc-treonina. En ciertas modalidades, una proteína o polipéptido puede comprender una secreción o secuencia de localización, una etiqueta de epítopo, una etiqueta de FLAG, una etiqueta de polihistidina, una fusión de GST y/o los semejantes. También incluidos con este aspecto se encuentran métodos para la producción, purificación, caracterización y uso de tales polipéptidos que contienen por lo menos una de tales modificaciones co-traducción o posttraducción. En otras modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural glicosilado es producido en una forma sin glicosilar. Tal forma sin glicosilar de un aminoácido no natural glicosilado puede ser producida mediante métodos que incluyen remoción química o enzimática de grupos oligosacárido de un polipéptido de aminoácido no natural aislado o sustancialmente purificado o sin purificar; producción del aminoácido no natural en un huésped que no glicosila tal polipéptido de aminoácido no natural (tal huésped incluye, procariontes o eucariontes diseñados o mutados para no glicosilar tal polipéptido) , la introducción de un inhibidor de glicosilación al medio de cultivo celular en el cual tal polipéptido de aminoácido no natural es producido mediante un eucarionte que normalmente glicosilaría tal polipéptido, o una combinación de cualquiera de tales métodos. También se describen en la presente tales formas no glicosiladas de polipéptidos de aminoácido no naturales normalmente glicosilados (normalmente glicosilado significa un polipéptido que sería glicosilado cuando es producido bajo condiciones en las cuales polipéptidos que se presentan de manera estable en la naturaleza son glicosilados) . Por supuesto, tales formas sin glicosilar de polipéptidos de aminoácido no naturales normalmente glicosilados (o por supuesto cualquier polipéptido descrito en la presente) puede estar en forma sin purificar, una forma sustancialmente purificada o en una forma aislada. En ciertas modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural incluye por lo menos una modificación post-traducción que se hace en presencia de un acelerante, en donde la modificación post-traducción es estequiométrica, semejante a estequiométrica o casi estequiométrica. En otras modalidades el polipéptido es contactado con un reactivo de fórmula (XIX) en presencia de un acelerante. En otras modalidades el acelerante es seleccionado del grupo que consiste de: . El polipéptido que contiene aminoácido no natural puede contener por lo menos uno, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, por lo menos seis, por lo menos siete, por lo menos ocho, por lo menos nueve o diez o más aminoácidos no naturales que contienen ya sea un grupo carbonilo o dicarbonilo, grupo oxima, grupo hidroxilamina o formas protegidas de los mismos. Los aminoácidos no naturales pueden ser los mismos o diferentes, por ejemplo, pueden haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más sitios diferentes en la proteína que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos no naturales diferentes. En ciertas modalidades, por lo menos uno, pero menos de todos, de un aminoácido particular presente en una versión que se presenta de manera estable en la naturaleza de la proteína es sustituido con un aminoácido no natural . Los métodos y composiciones proporcionados y descritos en la presente incluyen polipéptidos que comprenden por lo menos un aminoácido no natural que contiene un grupo carbonilo o dicarbonilo, grupo oxima, grupo hidroxilamina o formas protegidas o enmascaradas de los mismos. La introducción de por lo menos un aminoácido no natural a un polipéptido puede permitir la aplicación de químicas de conjugación que involucran reacciones químicas específicas, en las que se incluyen, pero no limitadas a, con uno o más aminoácidos no naturales en tanto que no reaccionan con los 20 aminoácidos comunes que se presentan de manera estable en la naturaleza. Una vez incorporados, las cadenas laterales de aminoácido que no se presentan de manera estable en la naturaleza pueden también ser modificadas al utilizar metodologías de química descritas en la presente o apropiadas para los grupos funcionales particulares o sustituyentes presentes en el aminoácido conjugado de manera estable en la naturaleza. Los métodos y composiciones de aminoácido no naturales descritos en la presente proporcionan conjugados de substancias que tienen una amplia variedad de grupos funcionales, sustituyentes o porciones, con otras substancias en las que se incluyen pero no limitados a un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co- factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica; un ligando; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo ; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción isotópicamente marcada; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor; un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptámero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa y cualquier combinación de los mismos. En ciertas modalidades, los aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales, enlazadores y reactivos descritos en la presente, en los que se incluyen compuestos de fórmulas (I) -(XXXIII) son estables en solución acuosa bajo condiciones moderadamente acidas (en las que se incluyen pero no limitadas a pH 2 a 8) . En otras modalidades, tales compuestos son estables para por lo menos un mes bajo condiciones moderadamente acidas. En otras modalidades, tales compuestos son estables durante por al menos 2 semanas bajo condiciones moderadamente acidas. En otras modalidades, tales compuestos son estables por al menos 5 días bajo condiciones moderadamente acidas. En otro aspecto de las composiciones, métodos, técnicas y estrategias descritos en la presente se encuentran métodos para estudiar o usar cualquiera de los polipéptidos de aminoácido no naturales "modificados o sin modificar" mencionados anteriormente. Incluidos dentro este aspecto, a manera de ejemplo solamente, se encuentran productos terapéuticos, de diagnóstico, a base de análisis, industriales, cosméticos, de biología de plantas, ambientales, de producción de energía, productos del consumidor y/o usos militares que se beneficiarían de un polipéptido que comprende un polipéptido de aminoácido no natural "modificado o sin modificar" o proteína.
IIJ. Ubicación de aminoácidos no naturales en polipéptidos Los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen incorporación de uno o más aminoácidos no naturales a un polipéptido. Uno o más aminoácidos no naturales pueden ser incorporados en una o más posiciones particulares que no alteran la actividad del polipéptido. Esto se puede obtener al realizar sustituciones "conservadoras" , en las que se incluyen pero no limitadas a, sustituir aminoácidos hidrofóbicos con aminoácidos hidrofóbicos con aminoácidos hidrofóbicos no naturales o naturales, aminoácidos voluminosos con aminoácidos voluminosos no naturales o naturales, aminoácidos hidrofílicos con aminoácidos hidrofílicos no naturales o naturales) y/o insertar el aminoácido no natural a un sitio que no es requerido para actividad. Una variedad de procedimientos bioquímicos y estructurales pueden ser empleados para seleccionar los sitios deseados para sustitución con un aminoácido no natural dentro el polipéptido. Cualquier posición de la cadena de polipéptido es apropiada para selección para incorporar un aminoácido no natural y la selección puede estar basada en diseño racional o mediante selección aleatoria para cualquiera o ningún propósito deseado particular. La selección de sitos deseados puede estar basada en producir un polipéptido de aminoácido no natural (que puede ser modificado adicionalmente o permanecer sin modificar) que tiene cualquier propiedad o actividad deseada, en los que se incluyen pero no limitados a agonistas, super-agonistas, agonista parciales, agonistas inversos, antagonistas, moduladores de enlace de receptor, moduladores de actividad de receptor, moduladores de enlace a socios de aglutinador, moduladores de actividad de socio de enlace, moduladores de conformación de socio de enlace, formación de dímero o multímeros, ningún cambio a la actividad o propiedad en comparación con la molécula natural o manipulación de cualquier propiedad física o química del polipéptido tal como solubilidad, agregación o estabilidad. Por ejemplo, sitios en el polipéptido requeridos para actividad biológica de un polipéptido pueden ser identificados utilizando métodos en los que se incluyen, pero no limitados a, análisis de mutación puntual, barrido o exploración de alanina o métodos de barrido homólogos. Residuos diferentes a aquellos identificados como críticos para la actividad biológica mediante métodos en los que se incluyen, pero no limitados a, alanina o mutagénesis de barrido homólogos pueden ser buenos candidatos para sustitución con un aminoácido no natural dependiendo de la actividad deseada buscada para el polipéptido. Alternativamente, los sitios identificados como críticos para actividad biológica pueden también ser buenos candidatos para sustitución con un aminoácido no natural, dependiendo otra vez de la actividad deseada buscada para el polipéptido. Otro alternativa sería simplemente efectuar sustituciones seriales en cada posición sobre la cadena de polipéptido con un aminoácido no natural y observar el efecto sobre las actividades del polipéptido. Cualesquier medios, técnica o método para selección de una posición para sustitución con un aminoácido no natural a cualquier polipéptido es apropiado para uso en los métodos, técnicas y composiciones descritos en la presente. La estructura y actividad de mutantes que se presentan de manera estable en la naturaleza de un polipéptido que contiene cancelaciones puede también ser examinada para determinar regiones de la proteína que son probables que sean tolerantes para sustitución con un aminoácido no natural. Una vez que los residuos que son probables que sean intolerantes a sustitución con aminoácidos no naturales han sido eliminados, el impacto de sustituciones propuestas en cada una de las posiciones restantes puede ser examinado utilizando métodos en los que se incluyen, pero no limitados a, la estructura tridimensional el polipéptido relevante y cualesquier ligandos o proteínas de enlace asociados. Estructuras cristalográficas de rayos X y estructuras de RMN de muchos polipéptidos están disponibles en el base de datos de proteínas (PDB, www.rcsb.org), una base de datos centralizada que contiene datos estructurales tridimensionales de moléculas grandes de proteínas y ácidos nucleicos, se pueden usar para identificar posiciones de aminoácidos que pueden ser sustituidas con aminoácidos no naturales. Además, se pueden realizar modelos que investigan la estructura secundaria y terciaria de los polipéptidos, si datos estructurales tridimensional no están disponibles. Así, la identidad de posiciones de aminoácido que pueden ser sustituidos con aminoácidos no naturales pueden ser obtenidas fácilmente. Sitios de incorporación ejemplares de un aminoácido no natural incluyen, pero no están limitados a, aquellos que son excluidos de regiones de enlace de receptor potencial o regiones para enlace a proteínas de enlace o ligandos pueden ser plena o parcialmente expuesto a solvente, tienen mínimas o ninguna interacción de enlace de hidrógeno con residuos cercanos, pueden ser mínimamente expuestos a residuos reactivos cercanos y/o pueden estar en regiones que son altamente flexibles tal como se predice por la estructura cristalina tridimensional de un polipéptido particular con su receptor, ligando o proteínas de enlace asociados. Una amplia variedad de aminoácidos no naturales pueden ser sustituidos por o incorporado a, una posición dada en un polipéptido. A manera de ejemplo, un aminoácido no natural particular puede ser seleccionado para incorporación en base a un examen de la estructura cristalina tridimensional de un polipéptido con su ligando, receptor y/o proteínas de enlace asociados, una preferencia por sustituciones conservadoras. En una modalidad, los métodos descritos en la presente incluyen incorporación al polipéptido del aminoácido no natural, en donde el aminoácido no natural comprende un primer grupo reactivo; y poner en contacto el polipéptido con una molécula (en las que se incluyen pero no limitados a un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; a etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica; un ligando; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor ; un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptámero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa y cualquier combinación de los mismos) que comprende un segundo grupo reactivo. En ciertas modalidades, el primer grupo reactivo es una porción carbonilo o dicarbonilo y el segundo grupo reactivo es una porción de hidroxilamina, mediante lo cual se forma un enlace de oxima. En ciertas modalidades, el primer grupo reactivo es una porción de hidroxilamina y el segundo grupo reactivo es una porción carbonilo o dicarbonilo, mediante lo cual se forma un enlace de oxima. En ciertas modalidades, el primer grupo reactivo es una porción carbonilo o dicarbonilo y el segundo grupo reactivo es una porción de oxima, mediante lo cual ocurre una reacción de intercambio de oxima. En ciertas modalidades, el primer grupo reactivo es una porción de oxima y el segundo grupo reactivo es una porción carbonilo o dicarbonilo, mediante lo cual ocurre una reacción de intercambio de oxima. En algunos casos, la sustitución (es) o incorporación (es) de aminoácido no natural serán combinadas con otras adiciones, sustituciones o cancelaciones dentro del polipéptido para afectar otros rasgos químicos, físicos, farmacológicos y/o biológicos. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o cancelaciones pueden incrementar la estabilidad (en los que se incluyen pero no limitados a, resistencia a degradación proteolítica) del polipéptido o incrementar la afinidad del polipéptido por su receptor apropiado, ligando y/o proteína de enlace. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o cancelaciones pueden incrementar la solubilidad (en los que se incluyen pero no limitado a, cuando son expresados en E. coli u otras células huésped) del polipéptido. En algunas modalidades los sitios son seleccionados para sustitución con un aminoácido codificado de manera natural o no natural además de otro sitio para incorporación de un aminoácido no natural por el propósito de incrementar la solubilidad del polipéptido enseguida de la expresión de E. coli, u otras células huésped recombinantes. En algunas modalidades, los polipéptidos comprenden otra adición, sustitución o cancelación que modula la afinidad por el ligando, proteínas de enlace y/o receptor asociado, modula (en los que se incluyen pero no limitados a, incrementos o disminuciones) la dimerización del recepto, estabiliza dímeros de receptor, modula la vida media de circulación, modula la liberación o bio-disponibilidad, facilita la purificación o mejora o altera una ruta de administración particular. Similarmente, el polipéptido de aminoácido no natural puede comprender secuencias de escisión químicas o de enzima, secuencias de escisión de proteasa, grupos reactivos, dominios de enlace de anticuerpo (en los que se incluyen pero no limitados a, FLAG o poli-His) u otras secuencias a base de afinidad (en las que se incluyen pero no limitados a, FLAG, poli-His, GST, etc.) o moléculas enlazadas (en las que se incluyen pero no limitadas a, biotina) que mejoran la detección (en los que se incluyen pero no limitados a, GFP) , purificación, transporte a través de tejidos o membranas celulares, liberación o activación de profármaco, reducción de tamaño u otro rasgos del polipéptido.
IV. Familia supergenética de hormona de crecimiento como ejemplo Los métodos, composiciones, estrategias y técnicas descritos en la presente no están limitados a un tipo, clase o familia particular de polipéptidos o proteínas. Por supuesto, virtualmente cualesquier polipéptidos pueden ser diseñados o modificados para incluir por lo menos un aminoácido no natural "modificado o sin modificar" descrito en la presente. A manera de ejemplo solamente, el polipéptido puede ser homólogo a una proteína terapéutica seleccionado del grupo que consiste de: alfa-1 antitripsina, angiostatina, factor antihemolítico, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, apolipoproteína, apoproteína, factor natriurético atrial, polipéptido natriurético atrial, péptido atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4 , MIG, calcitonina, ligandos de c-kit, citocina, CC quimiocina, monocito quimioatrayente de proteína-1, monocito quimioatrayente de proteína-2, monocito quimioatrayente de proteína-3, monocito inflamatorio de proteína-1 alfa, monocito inflamatorio de proteína-i beta, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligando CD40, ligando c-kit, colágeno, factor estimulador de colonia (CSF), factor de complemento 5a, inhibidor de complemento, receptor de complemento 1, citocina, péptido-78 activador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF), péptido activador de neutrófilo epitelial, eritropoyetina (EPO), toxina exfoliante, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor X, factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) , fibrinógeno, fibronectina, proteína de haz de cuatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glucocerebrosidasa, gonadotropina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, grf , proteína de hedgehog, hemoglobina, factor de crecimiento de hepatocito (hGF) , hirudina, hormona de crecimiento humana (hGH) , albúmina de suero humano, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferona (IFN) , IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, interleucina (IL) , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL- 10, IL-11, IL-12, factor de crecimiento de queratinocito (KGF), lactoferrina, factor inhibidor de leucemia, luciferasa, neurturin, factor inhibidor de neutrófilo (NIF) , oncostatina M, proteína osteogénica, producto oncógeno, paracitonina, hormona paratiroides, PD-ECSF, PDGF, hormona de péptido, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogénica, exotoxina B pirogénica, exotoxina C pirogénica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biosintética pequeña, receptor I de complemento soluble, I-CAM 1 soluble, receptor de interleucina soluble, receptor de TNF soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptocinasa, superantígenos, enterotoxina estafilococal, SEA, SEB, SEC1, SEC2 , SEC3 , SED, SEE, receptor de hormona esteroides, superóxido dismutasa, toxina de síndrome de choque tóxico, timosina alfa 1, activador de plasminógeno de tejido, factor de crecimiento de tumor (TGF), factor de necrosis de tumor, factor alfa de necrosis de tumor, factor beta de necrosis de tumor, receptor del factor de necrosis de tumor (TNFR) , proteína VLA-4, proteína VCAM-1, factor de crecimiento entotelial vascular (VEGF), urocinasa, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, reí, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL y corticosterona . Así, la siguiente descripción de la familia de supergen de hormona de crecimiento (GH) es proporcionada por propósitos ilustrativos y a manera de ejemplo solamente y no como a límite en cuanto al alcance de los métodos, composiciones, estrategias y técnicas descritas en la presente. Además, la referencia a polipéptidos GH en esta solicitud se propone usar el término genérico como un ejemplo de cualquier miembro de la familia de supergen GH. Así, se comprenderá que la modificaciones y químicas descritas en la presente con referencia a polipéptidos o proteína de GH puede ser aplicadas igualmente a cualquier miembro de la familia de supergen GH, incluyendo aquellos enlistados específicamente en la presente. Las siguientes proteínas incluyen aquellas codificadas por genes de la familia de supergen de hormona de crecimiento (GH) (Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1990); Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992); Mott, H. R. y levapbell, I. D., Current Opinión in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, 0. y Ihle, J. N. , Signalling by the Hematopoietic Cytokine Receptors (1996) ) : hormona de crecimiento, prolactina, lactógeno placental, eritropoyetina (EPO), trombopoyetina (TPO) , interleucina-2 (IL-2) , IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (subunidad p35), IL-13, IL-15, oncostatina M, factor neurotrófico ciliar, factor inhibidor de leucemia, interferón alfa, interferón beta, interferón épsilon, interferón gamma, interferón omega, interferón tau, factor estimulador de colonia de granulocito (G-CSF) , factor estimulador de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF) , factor estimulador de colonia de macrófago (M-CSF) y cardiotrofina-1 (CT-1) ("la familia de supergen GH" ) . Se anticipa que miembros adicionales de esta familia genética serán definidos en el futuro por medio de clonación y secuencia genética. Los miembros de la familia del supergen GH tienen estructuras secundarias y terciarias similares a pesar del hecho de que tienen en general identidad de secuencia de aminoácido o ADN limitada. Los elementos estructurales compartidos permiten que nuevos miembros de la familia genética sean fácilmente identificados y los métodos y composiciones de aminoácido no naturales descritas en la presente aplicadas similarmente . Estructuras de un número de citocinas, incluyendo G-CSF (Zink et al., FEBS Lett. 314:435 (1992); Zink et al., Biochemistry 33:8453 (1994); Hill et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5167 (1993)), GM-CSF (Diederichs, K. , et al. Science 154: 1779-1782 (1991); Walter et al., J. Mol. Biol. 224:1075-1085 (1992)), IL-2 (Bazan, J. F. y McKay, D. B., Science 257: 410-413 (1992); IL-4 (Redfield et al., Biochemistry 30: 11029-11035 (1991); Powers et al., Science 256:1673-1677 (1992)) y IL-5 (Milburn et al., Nature 363: 172-176 (1993)) han sido determinadas mediante estudios de difracción de rayos x y RMN y muestran conservación impresionante con la estructura de GH, a pesar de carencia de homología de secuencia primaria significativa. Se considera que IFN es un miembro de esta familia en base un modelado y otros estudios (Lee et al., J. Interferon Cycokine Res. 15:341 (1995); Murgolo et al., Proteins 17:62 (1993); Radhakrishnan et al., Structure 4:1453 (1996); Klaus et al., J. Mol. Biol. 274:661 (1997)). Un gran número de citocinas adicionales y factores de crecimiento en los que se incluyen factor neurotrófico ciliar (CNTF) , factor inhibidor de leucemia (LIF) , trombopoyetina (TPO) , oncostatina M, factor estimulador de colonia de macrófago (M-CSF), IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15 y factor estimulador de colonia de granulocito (G-CSF) , también como los IFN tales como alfa, beta, omega, tau, épsilon y gamma interferón pertenecen a esta familia (revisado en Mott y Campbell, Current Opinión in Structural Biology 5: 114-121 (1995) ; Silvennoinen y Ihle (1996) Signalling by the Hematopoietic Cytokine Receptors) . Todas de las citocinas y factores de crecimiento anteriores son ahora considerados que comprenden una familia genética grande. Además de compartir estructuras secundarias y terciarias similares, los miembros de esta familia comparten la propiedad que deben oligomerizar receptores de superficie celular para activar rutas de señalización intracelulares. Algunos miembros de la familia de GH en los que se incluyen pero no limitados a; GH y EPO, se enlazan a un solo tipo de receptor y provocan que forme homodímeros . Otros miembros de familia, en los que se incluyen pero no limitados a, IL-2, IL-4 y IL-6, se enlazan a más de un tipo de receptor y provocan que los receptores formen heterodímeros o agregados de orden superior (Davis et al, (1993) Science 260: 1805-1808; Paonessa et al., 1995) EMBO J. 14: 1942-1951; Mott y Campbell, Current Opinión in Structural Biology 5: 114-121 (1995)). Estudios de mutagénesis han demostrado, como GH, estas otras citocinas y factores de crecimiento contienen múltiples sitios de enlace de receptor, comúnmente dos y se enlazan a sus receptores cognatos secuencialmente (Mott y Campbell, Current Opinión in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Matthews et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 9471-9476). Como GH, los sitios de enlace de receptor primario para estos otros miembros de familia ocurre principalmente en las cuatro hélices alfa y el bucle A-B. Los aminoácidos específicos en los haces helicoidales que participan en enlace de receptor difieren entre los elementos de familia. La mayoría de los receptores de superficie celular que interactúan con miembros de la familia supergenética de GH están estructuralmente relacionados y comprenden una segunda familia multigenética grande. Véase, por ejemplo patente estadounidense No. 6,608,183, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Una conclusión general a la que se llega a partir de estudios mutacionales de varios miembros de la familia de supergen GH es que los bucles que unen las hélices alfa tienden en general a no estar involucradas en el enlace del receptor. En particular el bucle B-C corto parece ser no esencialmente para enlace de receptor en la mayoría, sin es que todos, los miembros de la familia. Por esta razón, el bucle B-C puede ser sustituido con aminoácidos no naturales como se describe en la presente en miembros de la familia de supergen GH. El bucle A-B, el bucle C-D (y el bucle D-E de miembros semejantes a interferón/lL- 10 de la superfamilia de GH) pueden también ser sustituidos con un aminoácido no natural. Los aminoácidos próximos a la hélice A y distantes a la hélice final también tienden a no estar involucrados en el enlace del receptor también pueden ser sitios para introducir aminoácidos no naturales. En algunas modalidades, un aminoácido no natural es sustituido en cualquier posición dentro de una estructura de bucle en las que se incluyen pero no limitados a los primeros 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más aminoácidos del bucle A-B, B-C, C-D o D-E. En algunas modalidades, un aminoácido no natural es sustituido dentro de los últimos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más aminoácidos del bucle A-B, B-C, C-D o D-E. Ciertos miembros de la familia GH, en los que se incluyen pero no limitados a, EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IFN, GM-CSF, TPO, IL-10, IL-12 p35, IL-13, IL-15 e interferón beta contienen azúcares N-enlazados y/o O-enlazados. Los sitios de glicosilación en las proteínas ocurren casi exclusivamente en las regiones de bucle y no en los haces helicoidales alfa. Debido a que las regiones de bucle en general no están involucradas en el enlace de receptor y debido a que son sitios para la anexión covalente de grupos de azúcar, pueden ser sitios útiles para introducir sustituciones de aminoácido no natural a las proteínas. Los aminoácidos que comprenden sitios de glicosilación N- y O-enlazados en las proteínas pueden ser sitios para sustituciones de aminoácido no natural debido a que estos aminoácidos están expuestos en la superficie. Por consiguiente, la proteína natural puede tolerar grupos azúcar voluminosos anexados a las proteínas en estos sitios y los sitios de glicosilación tienden a estar ubicados a los lejos de los sitios de enlace de receptor. Miembros adicionales de la familia de GH son probables de ser descubiertos en el futuro. Nuevos miembros de la familia de supergen GH pueden ser identificados por medio de análisis de estructura secundaria y terciaria auxilados por computadora de las secuencias de proteína predecidas y mediante técnicas de selección diseñadas para identificar moléculas que se enlazan a un objetivo particular. Los miembros de la familia de supergen GH poseen comúnmente cuatro o cinco hélices antipáticas unidas mediante aminoácidos no helicoidales (las regiones de bucle) . Las proteínas pueden contener una secuencia de señal hidrofóbica en su término N para promover la secreción de la célula. Tales miembros descubiertos más tarde de la familia de supergen de GH son también incluidos dentro de los métodos y composiciones descritos en la presente.
V. Aminoácidos no naturales Los aminoácidos no naturales usados en los métodos y composiciones descritos en la presente tienen por lo menos una de las siguientes cuatro propiedades: (1) por lo menos un grupo funcional sobre la cadena lateral del aminoácido no natural tiene por lo menos un característica y/o actividad y/o reactividad ortogonal a la reactividad química de los 20 aminoácidos comunes codificados genéticamente (esto es, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina) o por lo menos ortogonal a la reactividad química de los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturalezas presentes en el polipéptido que incluye el aminoácido no natural; (2) los aminoácidos no naturales introducidos son sustancialmente inertes químicamente hacia los 20 aminoácidos codificados genéticamente comunes; (3) el aminoácido no natural puede ser incorporado de manera estable a un polipéptido, preferiblemente con la estabilidad conmensurada con los aminoácidos que se presenta de manera estable en la naturaleza o bajo condiciones fisiológicas típicas y además preferiblemente tal incorporación puede ocurrir vía un sistema in vivo; y (4) el aminoácido no natural incluye un grupo funcional oxima o un grupo funcional que puede ser transformado a un grupo oxima al reaccionar con un reactivo, preferiblemente bajo condiciones que no destruyen las propiedades biológicas del polipéptido que incluye el aminoácido no natural (a no ser por supuesto que tal destrucción de las propiedades biológicas sea el propósito de la modificación/transformación) o en donde la transformación puede ocurrir bajo condiciones acuosas a un pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8 o en donde el sitio reactivo sobre el aminoácido no natural es un sitio electrofílico. Ejemplos ilustrativos no limitantes de aminoácidos que satisfacen estas cuatro propiedades para aminoácidos no naturales que pueden ser usados con las composiciones y métodos descritos en la presente son presentados en las figuras 2, 3, 35 y 40-43. Cualquier número de aminoácidos no naturales pueden ser introducidos al polipéptido. Los aminoácidos no naturales pueden también incluir oximas protegidas o enmascaradas o grupos protegidos o enmascarados que pueden ser transformados a un grupo oxima después de la desprotección del grupo protegido o desenmascaramiento del grupo enmascarado. Los aminoácidos no naturales pueden también incluir grupos carbonilo o dicarbonilo protegidos o enmascarados, que pone ser transformados a un grupo carbonilo o dicarbonilo después de la desprotección del grupo protegido o desenmascaramiento del grupo enmascarado y mediante esto están disponibles para reaccionar con hidroxilaminas u oximas para formar grupos oxima. Aminoácidos no naturales que pueden ser usado en los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen, pero no están limitados a, aminoácidos que comprenden un reticulador fotoactivable, aminoácidos de espín marcado, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de enlace de metal, aminoácidos que contienen metal, aminoácidos radioactivos, aminoácidos con novedosos grupos funcionales, aminoácidos que interactúan covalente o no covalentemente con otras moléculas, aminoácidos fotoenjaulados y/o fotoisomerizables, aminoácidos que comprenden biotina o un análogo de biotina, aminoácidos glicosilados tales como una serina azúcar sustituida, otros aminoácidos carbohidrato modificados, aminoácidos que contienen ceto, aminoácidos que contienen aldehido, aminoácidos que comprenden polietilenglicol u otro poliéteres, aminoácidos sustituidos por átomos pesados, aminoácidos escindibles y/o fotoescindibles químicamente, aminoácidos con cadenas laterales alargadas en comparación con aminoácidos naturales, en los que se incluyen pero no limitados a, poliéteres o hidrocarburos de cadena larga, en los que se incluyen pero no limitados a, mayor de aproximadamente 5 o mayor de aproximadamente 10 átomos de carbono, aminoácidos que contienen azúcar carbono-enlazados, aminoácidos redox-activos, aminoácidos que contienen amino tioácido y aminoácidos que comprenden una o más porciones tóxicas . En algunas modalidades, los aminoácidos no naturales comprenden una porción de sacárido. Ejemplos de tales aminoácidos incluye N-acetil-L-glucosaminil-1-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glucosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glucosaminil-1-asparagina y O-manosaminil-L-serina. Ejemplos de tales aminoácidos también incluyen ejemplos en donde el enlace N- o enlace O- que se presenta de manera estable en la naturaleza entre el aminoácido y el sacárido es reemplazado por un enlace covalente no encontrado comúnmente en la naturaleza - en los que se incluyen pero no limitado a, un alqueno, una oxima, un tioéter, una amida y los semejantes. Ejemplos de tales aminoácidos también incluye sacáridos que no son encontrados comúnmente en proteínas que se presentan de manera estable en la naturaleza tales como 2 -desoxi-glucosa, 2-desoxigalactosa y los semejantes. Las porciones químicas incorporadas a polipéptidos vía incorporación de aminoácidos no naturales a tales polipéptidos ofrece una variedad de ventajas y manipulaciones de polipéptidos. Por ejemplo, la reactividad única de un grupo carbonilo o dicarbonilo funcional (en los que se incluyen un grupo funciona ceto o aldehido) permite la modificación selectiva de proteínas con cualquiera de un número de reactivos que contienen hidrazina o reactivos que contienen hidroxilamina in vivo e in vitro. Un aminoácido no natural de átomo pesado, por ejemplo, puede ser útil para datos de estructura de rayos x de fases. La introducción específica del sitio de átomos pesados utilizando aminoácidos no naturales también proporciona selectividad y flexibilidad en escoger posiciones para átomos pesados. Aminoácidos no naturales fotoreactivos (en los que se incluyen pero no limitados a, aminoácidos con benzofenona y cadenas laterales de arlazidas (en los que se incluyen pero no limitados a, fenilazida) ) , por ejemplo, permite la fotoreticulación in vivo e in vitro eficiente de polipéptidos. Ejemplos de aminoácidos no naturales fotoreactivos incluyen, pero no están limitados a, p-azido-fenilalanina y p-benzoil-fenilalanina. El polipéptido con los aminoácidos no naturales fotoreactivos puede luego ser reticulado a voluntad mediante excitación del grupo fotoreactivo que proporciona control temporal. En un ejemplo no limitante, el grupo metilo de un aminoácido no natural puede ser sustituido con uno marcado isotópicamente, en los que se incluyen pero no limitados a, con un grupo metilo, como una sonda de estructura local y dinámica, en los que se incluyen pero no limitados a, con el uso de resonancia magnética nuclear y espectroscopia vibracional .
A. Estructura y Síntesis de Aminoácidos no naturales: Grupos Carbonilo, semejante a Carbonilo, Carbonilo Enmascarado y Carbonilo Protegidos Aminoácidos con un grupo reactivo electrofílico permiten una variedad de reacciones para enlazar moléculas vía varias reacciones químicas, en los que se incluyen, pero no limitadas a, reacciones de adición nucleofílicas . Tales grupos reactivos electrofílicos incluyen un grupo carbonilo o dicarbonilo (en los que se incluyen un grupo ceto o aldehido) un grupo semejante a carbonilo o grupo semejante a dicarbonilo (que tiene reactividad similar a un grupo carbonilo o dicarbonilo y es estructuralmente similar a un grupo carbonilo o dicarbonilo) , un grupo carbonilo enmascarado o dicarbonilo enmascarado (que puede ser convertido fácilmente a un grupo carbonilo o dicarbonilo) o un grupo carbonilo protegido o grupo dicarbonilo protegido (que tiene reactividad similar a un grupo carbonilo o dicarbonilo después de la desprotección) . Tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (I) en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno o sustituido alquileno)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; cada R" es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido o un grupo protector o cuando más de un grupo R" está presente, dos R" forman opcionalmente un heterocicloalquilo; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R4 ó dos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; o los grupos -A-B-J-R forman conjuntamente un cicloalquilo o heterocicloalquilo bicíclico o tricíclico que comprende por lo menos un carbonilo grupo, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo enmascarado; o el grupo -J-R forma conjuntamente un cicloalquilo o heterocicloalquilo monocíclico o bicíclico que comprende por lo menos un grupo carbonilo, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado, incluyendo un grupo dicarbonilo enmascarado; con la condición de que cuando A es fenileno y cada R3 es H, B está presente; y que cuando A es -(CH2)4- y cada R3 es H, B no es -NHC (O) (CH2CH2)-; y que cuando A y B están ausentes y cada R3 es H, R no es metilo. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . En ciertas modalidades, los compuestos de fórmula (I) son estables en solución acuosa por al menos 1 mes bajo condiciones moderadamente acidas. En ciertas modalidades, los compuestos de fórmula (I) son estables durante por al menos 2 semanas bajo condiciones moderadamente acidas. En ciertas modalidades, los compuestos de fórmula (I) son estables durante por al menos 5 días bajo condiciones moderadamente acidas. En ciertas modalidades, tales condiciones acidas son pH 2 a 8. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (I) , B es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , N(R')C0-, -C(0)-, -C(R')=N-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, S (alquileno o alquileno sustituido)-, -S (0) (alquileno o alquileno sustituido)- o -S (O) 2 (alquileno o alquileno sustituido) - . En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (I), B es -0(CH2)-, -CH=N-, -CH=N-NH-, -NHCH2-, -NHCO-, -C(0)-, -C(0) - (CH2) -, -CONH- (CH2) -, -SCH2-, -S(=0)CH2- o -S(0)2CH2-. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (I) , R es C?-6 alquilo o cicloalquilo. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (I) R es -CH3, -CH(CH3)2 o ciclopropilo. En ciertas modalidades de compuestos de fórmula (I), Ri es H, ter-butiloxicarbonilo (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) , N-acetilo, tetrafluoroacetilo (TFA) o benciloxicarbonilo (Cbz) . En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (I) , R? es una resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (I) , R2 es OH, O-metilo, O-etilo u 0-t-butilo. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (I) , R2 es una resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (I), R es un polinucleótido. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (I) , R2 es ácido ribonucleico (ARN) . En ciertas modalidades de compuestos de fórmula (I) , R2 es tARN. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (I) , el tARN reconoce específicamente un codón selector. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (I) el codón selector es seleccionado del grupo que consiste de un codón ámbar, codón ocre, codón ópalo, codón único, un codón raro, un codón no natural, un codón de cinco bases y un codón de cuatro bases. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (I) , R2 es un tARN supresor. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula :D ?~A ? es seleccionado del grupo que consiste de: (i) A es alquileno inferior sustituido, C -arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador divalente seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, CSN(R')-, -N(R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -N(R')C(S)-, -S(0)N(R'), -S(0)2N(R'), N(R' )C(0)N(R' ) -, -N(R' )C(S)N(R' ) -, -N (R' ) S (O) N (R' ) - , N(R' )S(0)2N(R' ) , -N(R')-N= -C (R' ) =N-N (R' ) - , -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - ; (ii) A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior sustituido, C4-arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es un enlazador divalente seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -NS(0)2-, -OS (O) 2-, -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(0)N(R')-, -CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -N(R')C0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) C (0) 0- , -N(R')C(S)-, -S(0)N(R'), -S(0)2N(R'), -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , - N(R' )S(0)N(R' ) -, - N(R' )S(0)2N(R' ) -, -N(R')-N= -C (R' ) =N-N (R' ) - , -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - ; (iii) A es alquileno inferior; B es opcional y cuando está presente es un enlazador divalente seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, C(0)N(R')-, -CSN(R')-, -CO (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0) 0-, -N(R')C(S)-, -S(0)N(R'), S(0)2N(R'), -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , N(R' )S(0)N(R' ) -, -N(R' )S(0)2N(R' ) -, -N(R')-N= -C (R' ) =N-N (R' ) - , -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - ; y (iv) A es fenileno; B es un enlazador divalente seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, - S(O)-, -S(0)2-, -NS(0)2-, -OS (O) 2-, -C(O)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(0)N(R')-, -CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, - CSN(R')-, -N(R')CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) C (0) 0- , -N(R')C(S)-, -S(0)N(R'), -S(0)2N(R'), -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , - N(R' )S(0)N(R' ) -, - N(R' )S(0)2N(R' ) -, -N(R')-N=, -C (R' ) =N-N (R' ) - , -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - ; cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; Ri es opcional y cuando está presente, es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional y cuando está presente, es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y cada R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o sustituido cicloalquilo; Además, aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (II) están incluidos: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -. -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S)N(R' ) - , -N(R' )S(0) N(R' ) -, -N(R')-N=, -C (R' ) =N- , -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; con la condición de que cuando A es fenileno, B está presente; y que cuando A es -(CH2)4-, B no es -NHC (O) (CH2CH2)-; y que cuando A y B están ausentes, R no es metilo. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificado post-traduccionalmente . Además, se incluyen aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (III) : en donde : B es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -NS(0)2-, 0S(0)2-, -C (0) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) C (0) 0- , -S (0) k (R' ) - , N(R' )C(0)N(R' ) -, -N(R' )C(S)N(R' ) -, -N (R' ) S (0) kN (R' ) - , -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' ) =N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o sustituido cicloalquilo; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada Ra es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, N(R')2, - C(0)kR' en donde k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -0R' y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden ser en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificado post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos son incluidos: Tales aminoácidos no naturales pueden ser opcionalmente grupo amino protegido, carboxilo protegido y/o en forma de una sal o puede ser incorporado a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (IV) son incluidos: ) en donde -NS(0)2-, -OS (O) 2-, opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, - S(0) - en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido) -, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R' )CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) C (O) O- , -S(0)kN(R')-, -N(R' )C(0)N(R' ) , -N(R' ) C (S)N(R' ) - , N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada Ra es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, N(R')2, - C(0)kR' en donde k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -OR' y -S(0) R', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; y n es 0 a 8; con la condición de que cuando A es -(CH2) -, B no es -NHC (0) (CH2CH2) - . Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos son incluidos: en donde tales compuestos están opcionalmente amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegido o una sal de los mismos o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos que tiene la estructura de fórmula (VIII) son incluidos: en donde, A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R')C(0)N(R') -, -N(R' ) C (S)N(R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (IX) son incluidos: en donde, B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0) - en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S)N(R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; en donde cada Ra es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 ó 3, C(0)N(R')2, -OR' y -S(0)kR' en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente .
Además, los siguientes aminoácidos son incluidos en donde tales compuestos están opcionalmente amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegido, opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos o una sal de los mismos o puede ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (X) son incluidos: en donde, B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0) N(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada Ra es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -OR' y - S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; y n es 0 a 8. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post- traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos son incluidos: en donde tales compuestos están opcionalmente amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos o una sal de los mismos o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además de las estructuras de monocarbonilo, los aminoácidos no naturales descritos en la presente pueden incluir grupos tales como dicarbonilo, semejantes a dicarbonilo, grupos dicarbonilo enmascarados y dicarbonilo protegido. Por ejemplo, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (V) son incluidos: en donde , A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N= -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (VI) son incluidos: en donde , B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; en donde cada Ra es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -OR' y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos son incluidos: en donde tales compuestos están opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos o una sal de los mismos. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente. Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (VII) son incluidos: en donde, B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada lí R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada Ra es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -OR' y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; y n es 0 a 8. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos son incluidos: en donde tales compuestos están opcionalmente aminoprotegidos y carboxilo protegidos o una sal de los mismos o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente. Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XXX) son incluidos: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; Xi es C, S o S (O) ; y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XXX-A) son incluidos: M en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XXX-B) son incluidos: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XXXI) son incluidos: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido ,- Xi es C, S o S(O); y n es 0, 1, 2, 3, 4 ó 5; y cada R8 y R9 en cada grupo CR8R9 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, alcoxi, alquilamina, halógeno, alquilo, arilo o cualquier R8 y R9 pueden formar conjuntamente =0 ó un cicloalquilo o cualquier a grupos adyacentes R8 pueden formar conjuntamente un cicloalquilo. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XXXI -A) son incluidos: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; n es O, 1, 2, 3, 4 ó 5; y cada R8 y R9 en cada grupo CR8R9 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, alcoxi, alquilamina, halógeno, alquilo, arilo o cualquier R8 y R9 pueden formar conjuntamente =0 ó un cicloalquilo o cualquiera adyacente a grupos adyacentes Rs pueden formar conjuntamente un cicloalquilo. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XXXI -B) son incluidos: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; n es O, 1, 2, 3, 4 ó 5; y cada R8 y R9 en cada grupo CR8R9 grupo es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, alcoxi, alquilamina, halógeno, alquilo, arilo o cualquier R8 y R9 pueden formar conjuntamente =0 ó un cicloalquilo o cualquier grupo adyacente a grupos R8 pueden formar conjuntamente un cicloalquilo. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XXXII) son incluidos: R ,H N (XXXII); en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; Xi es C, S o S (O) ; y L es alquileno, alquileno sustituido, N (R' ) (alquileno) o N (R' ) (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XXXII -A) son incluidos: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XXXII-B) son incluidos: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XXXX) son incluidos: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; en donde (a) indica enlace al grupo A y (b) indica enlace a respectivos grupos carbonilo, R3 y n R.44 son seleccionado independientementes de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido o R3 y R ó dos grupos R3 o dos grupos R4 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; T3 es un enlace, C (R) (R) , O o S y R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido,- Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XXXXI) son incluidos: en donde Cb) <b) <b) F) -S—I (b) en donde (a) indica enlace al grupo A y (b) indica enlace grupos carbonilo respectivos, R3 y R4 son escogidos independientemente de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido o R3 y R4 ó dos grupos R3 o dos grupos R4 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; T3 es un enlace, C (R) (R) , O o S y R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada Ra es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -OR' y -S(0)kR' en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XXXXII) son incluidos: (XXXXII), en donde : R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; y T3 es O ó S. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XXXXIII) son incluidos: (xxxxpi), en donde : R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Además, los siguientes aminoácidos que tienen estructuras de fórmula (XXXXIII) son incluidos: Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . La funcionalidad carbonilo o dicarbonilo se puede hacer reaccionar selectivamente con un reactivo que contiene hidroxilamina bajo condiciones moderadas en solución acuosa para formar el enlace de oxima correspondiente que es estable bajo condiciones fisiológicas. Véase, por ejemplo, Jencks, . P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. y Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117 (14) : 3893-3899 (1995). Además, la reactividad única del grupo carbonilo o dicarbonilo permite la modificación selectiva en presencia de otras cadenas laterales de aminoácido. Véase, por ejemplo, Cornish, V. ., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K. , et al., Science 276:1125-1128 (1997). La síntesis de p-acetil- (+/-) -fenilalanina y m-acetil- (+/-) -fenilalanina es descrita en Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), incorporado por referencia. Otros aminoácidos que contienen carbonilo o dicarbonilo pueden ser preparados similarmente. Además, síntesis ejemplares no limitantes de aminoácido no natural que son incluidos en la presente son presentados en las figuras 4, 24-34 y 36-39. En algunas modalidades, un polipéptido que comprende un aminoácido no natural es modificado químicamente para generar un grupo funcional carbonilo o dicarbonilo reactivo. Por ejemplo, una funcionalidad aldehido útil para reacciones de conjugación puede ser generada a partir de una funcionalidad que tiene grupos amino e hidroxilo adyacentes. En donde la molécula biológicamente activa es un polipéptido, por ejemplo, una serina N-terminal o treonina (que puede estar normalmente presente o puede ser expuesta vía digestión química o enzimática) puede ser usada para generar una funcionalidad aldehido bajo condiciones de escisión moderadamente oxidantes utilizando peryodado. Véase, por ejemplo, Gaertner, et . al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). Sin embargo, los métodos conocidos en el arte están restringidos al aminoácido en el término N del péptido o proteína. Adicionalmente, a manera de ejemplo, un aminoácido no natural que lleva grupos hidroxilo y amino adyacentes puede ser incorporado a un polipéptido como una funcionalidad aldehido "enmascarada". Por ejemplo, 5-hidroxilisina lleva un grupo hidroxilo adyacente a la épsilon amina. Las condiciones de reacción para generar el aldehido involucran comúnmente la adición del exceso molar de metaperyodato de sodio bajo condiciones moderadas para evitar la oxidación en otros sitios dentro el polipéptido. El pH de la reacción de oxidación es comúnmente de alrededor de 7.0. A reacción representativa involucra la adición de aproximadamente 1.5 exceso molar de meta peryodato de sodio a una solución de pH regulado del polipéptido, seguido por incubación por aproximadamente 10 minutos en la oscuridad. Véase, por ejemplo patente estadounidense No. 6,423,685.
B. Estructura y Síntesis de Aminoácidos no Naturales : Aminoácidos que contienen Hidroxilamina Aminoácidos no naturales que contienen un grupo hidroxilamina (también llamado un grupo aminooxi) permiten la reacción con una variedad de grupos electrofílicos para formar conjugados (en los que se incluyen pero no limitados a, con PEG u otros polímeros solubles en agua) . Como las hidrazinas, hidrazidas y semicarbazidas, la nucleofilicidad mejorada del grupo aminooxi permite que reaccione eficiente y selectivamente con una variedad de moléculas que contienen grupos carbonilo o dicarbonilo, en los que se incluyen pero no limitados a, grupos cetonas, aldehidos u otros grupos funcionales con reactividad química similar. Véase, por ejemplo, Shao, J. y Tarn, J. , J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995); H. Hang y C. Bertozzi, Ace. Chem. Res. 34(9): 727-736 (2001). Mientras que el resultado de la reacción con un grupo hidrazina es la hidrazona correspondiente, sin embargo, una oxima resulta en general de la reacción de un grupo aminooxi con un grupo que contiene carbonilo o dicarbonilo tal como, a manera de ejemplo, cetonas, aldehidos u otros grupos funcionales con reactividad química similar. Así, en ciertas modalidades descritas en la presente se encuentran aminoácidos no naturales con cadenas laterales que comprenden un grupo hidroxilamina, un grupo semejante a hidroxilamina (que tiene reactividad similar a un grupo hidroxilamina y es estructuralmente similar a un grupo hidroxilamina) , un grupo hidroxilamina enmascarado (que puede ser convertido fácilmente a un grupo hidroxilamina) o un grupo hidroxilamina protegido (que tiene reactividad similar a un grupo hidroxilamina después de la desprotección) . Tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen la estructura de fórmula: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C (0) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R') -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R')S(0)kN(R') -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; K es -NR6R7 ó -N=CR6R7; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R ó dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; cada uno de R6 y R7 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido, -C(0)R", -C(0)2R", -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R5 ó R7 es L-X, en donde : X es seleccionado del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un indicador detectable; y cualquier combinación de los mismos; L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CO (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(O)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , A es fenileno o fenileno sustituido. En ciertas modalidades de compuestos de fórmula (XIV) , B es - (alquileno o alquileno sustituido)-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)- ó -C (0) - (alquileno o alquileno sustituido)-. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV), B es -0(CH2)2, -S(CH2)2-, -NH(CH2)2-, -C0(CH2)2- o -(CH2)n- en donde n es de 1 a 4. En ciertas modalidades de compuestos de fórmula (XIV) , Ri es H, ter-butiloxicarbonilo (Boc) , 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) , N-acetilo, tetrafluoroacetilo (TFA) o benciloxicarbonilo (Cbz) . En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , en donde Ri es una resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , en donde R2 es OH, 0-metilo, 0-etilo o 0-t-butilo. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , en donde R2 es una resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido. En ciertas modalidades de compuestos de fórmula (XIV), en donde R2 es un polinucleótido. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , en donde R2 es ácido ribonucleico (ARN) . En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , en donde R2 es tARN. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , en donde el tARN reconoce específicamente un codón selector. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , en donde el codón selector es seleccionado del grupo que consiste de un codón ámbar, codón ocre, codón ópalo, un codón único, un codón raro, un codón no natural, un codón de cinco bases y un codón de cuatro bases. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , en donde R2 es un tARN supresor. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , cada uno de R6 y R7 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , cada uno de R6 y R7 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, metilo, fenilo y - [ (alquileno o alquileno sustituido) -O- (hidrógeno, alquilo o alquilo sustituido) ] x, en donde x es de 1-50. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV), K es -NR6R7. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , x es un agente biológicamente activo seleccionado del grupo que consiste de un péptido, proteína, enzima, anticuerpo, fármaco, tinte, lípido, nucleósidos, oligonucleótido, célula, virus, liposoma, micropartícula y micela. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , x es un fármaco seleccionado del grupo que consiste de un antibiótico, fungicida, agente anti-viral, agente antiinflamatorio, agente anti-tumor, agente cardiovascular, agente anti-ansiedad, hormona, factor de crecimiento y agente esteroidal . En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , x es una enzima seleccionada del grupo que consiste de peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa y glucosa oxidasa. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) , x es un indicador detectable seleccionado del grupo que consiste de una porción fluorescente, fosforescente, quimioluminiscente, quelante, denso de electrones, magnética, intercalante, radioactiva, cromofórica y porción de transferencia de energía. En ciertas modalidades, los compuestos de fórmula (XIV) son estables en una solución acuosa por al menos 1 mes bajo condiciones moderadamente acidas. En ciertas modalidades, los compuestos de fórmula (XIV) son estables durante por al menos 2 semanas bajo condiciones moderadamente acidas. En ciertas modalidades, los compuestos de fórmula (XIV) son estables durante por al menos 5 días bajo condiciones moderadamente acidas. En ciertas modalidades, tales condiciones acidas son pH 2 a 8. Tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XV) : en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R4 ó dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo . Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Un aminoácido representativo no limitante tiene la si estructura : Tal aminoácido no natural puede estar en forma de una sal o puede ser incorporado a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificado post-traduccionalmente. Aminoácidos que contienen aminooxi pueden ser preparados a partir de precursores de aminoácidos disponibles fácilmente (homoserina, serina y treonina) . Véase, por ejemplo, M. Carrasco y R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003). Ciertos aminoácidos que contienen aminooxi, tales como L-2-amino-4- (aminooxi) ácido butírico), han sido aislados de fuentes naturales (Rosenthal, G. et al., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997) . Otros aminoácidos que contienen aminooxi pueden ser preparados similarmente. Además, síntesis ejemplares no limitantes de un aminoácido no natural descrito en la presente son presentados en La figura 5.
C. Síntesis Química de Aminoácidos no Naturales : Aminoácidos gue contienen Oxima Aminoácidos no naturales que contienen un grupo oxima permiten reacción con una variedad de reactivos que contienen ciertos grupos carbonilo o dicarbonilo reactivos (en los que se incluyen pero no limitados a, cetonas, aldehidos u otros grupos con reactividad similar) para formar nuevos aminoácidos no naturales que comprenden un nuevo grupo oxima. Tal reacción de intercambio de oxima permite la funcionalización adicional de polipéptidos de aminoácido no naturales. Además, los aminoácidos no naturales originales que contienen un grupo oxima pueden ser útiles en su propio derecho en tanto que el enlace de oxima sea estable bajo condiciones necesarias para incorporar el aminoácido a un polipéptido (por ejemplo, los métodos sintéticos in vivo, in vitro y químicos descritos en la presente) .
Así, en ciertas modalidades descritas en la presente se encuentran aminoácidos no naturales con cadenas laterales que comprenden un grupo oxima, un grupo semejante a oxima (que tiene reactividad similar a un grupo oxima y es estructuralmente similar a un grupo oxima) , un grupo oxima enmascarado (que puede ser convertido fácilmente a un grupo oxima) o un grupo oxima protegido (que tiene reactividad similar a un grupo oxima después de la desprotección) . Tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XI ) : (XI) en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (0) (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C (OJ(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' ) C (O)N(R' ) - , -N(R' ) C (S)N(R' ) - , -N(R' )S(0) N(R>, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; R es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R4 ó dos grupos R3 opcionalmente forman un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R5 es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi , alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -(alquileno o alquileno sustituido) -ON (R" ) 2, -(alquileno o alquileno sustituido) -C (0) SR" , -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- (arilo o arilo sustituido), -C(0)R", -C(0)2R" o -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R5 es L-X, en donde: X es seleccionado del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co- factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un indicador detectable; y cualquier combinación de los mismos; y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -(alquileno o alquileno sustituido) -0-N=CR' - , (alquileno o alquileno sustituido) -C (0) NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) -S (0) k- (alquileno o alquileno sustituido) -S- , -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- , -S (0) kN (R' ) - , -N(R' ) C (O)N(R' ) -, -N(R' )C(S)N(R' ) , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; con la condición de que cuando A y B están ausentes, R no es metilo. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI), B es -O- (alquileno o alquileno sustituido)-. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI), B es -0(CH2)-.
En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI) , R es C?-6 alquilo. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI), R es -CH3. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI), Ri es H, ter-butiloxicarbonilo (Boc) , 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) , N-acetilo, tetrafluoroacetilo (TFA) o benciloxicarbonilo (Cbz) . En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI) , Ri es una resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI), R2 es OH, 0-metilo, O-etilo o O-t-butilo. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI) , R2 es una resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI), R2 es un polinucleótido. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI) , R2 es ácido ribonucleico (ARN) . En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI), R2 es tARN. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI) , el tARN reconoce específicamente un codón selector. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI) , el codón selector es seleccionado del grupo que consiste de un codón ámbar, codón ocre, codón ópalo, un codón único, un codón raro, un codón no natural, un codón de cinco bases y un codón de cuatro bases. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI) , R2 es un tARN supresor. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI), R5 es alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido o -C(0)2R". En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XI), R5 es —[(alquileno o alquileno sustituido) -0- (hidrógeno, alquilo o alquilo sustituido) ] x, en donde x es de 1-50. En ciertas modalidades los compuestos de fórmula (XI), R5 es — (CH2CH2) -0-CH3 ó -COOH. En ciertas modalidades, los compuestos de fórmula (I) son estables en solución acuosa por al menos 1 mes bajo condiciones moderadamente acidas. En ciertas modalidades, los compuestos de fórmula (I) son estables por al menos 2 semanas bajo condiciones moderadamente acidas. En ciertas modalidades, los compuestos de fórmula (I) son estables durante por al menos 5 días bajo condiciones moderadamente acidas. En ciertas modalidades, tales condiciones acidas son pH 2 a 8. Los aminoácidos de fórmula (XI) incluyen aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XII) : en donde, B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C (R' ) =N- , -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R5 es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -(alquileno o alquileno sustituido) -ON (R" ) 2, -(alquileno o alquileno sustituido) -C (O) SR" , -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- (arilo o arilo sustituido), -C(0)R", -C(0)2R" o -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R5 es L-X, en donde: X es seleccionado del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co- factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; y cualquier combinación de los mismos ,-y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -(alquileno o alquileno sustituido) -0-N=CR' - , (alquileno o alquileno sustituido) -C (0) NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) -S (0) k- (alquileno o alquileno sustituido) -S- , -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- , -S (O) kN(R' ) - , -N(R' ) C (O)N(R' ) - , -N(R' )C(S)N(R') -, -N (R' ) S (O) kN (R' ) - , -N(R')-N= -C(R')=N-, C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XIII) : en donde , R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R5 es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -(alquileno o alquileno sustituido) -ON (R" ) 2, -(alquileno o alquileno sustituido) -C (O) SR" , -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- (arilo o arilo sustituido), -C(0)R", -C(0)2R" o -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R5 es L-X, en donde: X es seleccionado del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co- factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo ; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; y cualquier combinación de los mismos; y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -(alquileno o alquileno sustituido) -0-N=CR' - , (alquileno o alquileno sustituido) -C (O) NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, - (alquileno o alquileno sustituido) -S (0) - (alquileno o alquileno sustituido) -S- , -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- , -S (0) kN(R' ) - , -N(R' ) C (O)N(R' ) - , -N(R' )C(S)N(R' ) -, -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, C(R' )=N-N(R' ) , -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) -, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Ejemplos adicionales no limitantes de tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen las siguientes estructuras : J < Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XIV) (XIV) en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0) N(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; K es -NR5R7 ó -N=CR6R7,- Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R4 ó dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; cada uno de R6 y R7 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido, -C(0)R", -C(0)2R", -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R6 ó R7 es L-X, en donde X es seleccionado del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción isotópicamente marcada; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; y cualquier combinación de los mismos; y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- ( alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0) - en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, - C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0) 0-, -S (O) N (R' ) - , -N(R' ) C (O)N(R' ) - , -N(R' )C(S)N(R' ) -, -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, C(R' ) =N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente .
Tales aminoácidos incluyen además aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XVI) : en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R') -, -N(R' )C(0)N(R') -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R4 ó dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; cada uno de R5 y R7 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido, -C(0)R", -C(0)2R", -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R6 ó R7 es L-X, en donde X es seleccionado del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; y cualquier combinación de los mismos; y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S (0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) , -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' ) S (0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Además, tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XVII) en donde : B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0) - en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R6 y R7 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido, -C(0)R", -C(0)2R", -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R6 ó R7 es L-X, en donde X es seleccionado del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; a etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co- factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; y cualquier combinación de los mismos; y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N(R' ) C (S)N(R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Ejemplos no limitantes de tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen las siguientes estructuras: Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Adicionalmente, tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen la estructura de fórmula (XVIII) : en donde : B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N (R' ) C (O) N (R' ) - , -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R6 y R7 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido, -C(0)R", -C(0)2R", -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o Rs ó R7 es L-X, en donde X es seleccionado del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo ,-un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; y cualquier combinación de los mismos; y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0) - en donde k es 1, 2 ó 3, S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N(R' ) C (S)N(R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; y cada Ra es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, N(R')2, -C(0) R' en donde k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -OR' y -S(0)kR'; en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido y n es de 0 a 8. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente . Ejemplos no limitantes de tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen las siguientes estructuras: Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal o pueden ser incorporados a un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificados post-traduccionalmente. Aminoácidos no naturales a base de oxima pueden ser sintetizados mediante métodos ya descritos en el arte o mediante métodos descritos en la presente, en los que se incluyen: (a) reacción de un aminoácido no natural que contiene hidroxilamina con un reactivo que contiene carbonilo o dicarbonilo; (b) reacción de un aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo con un reactivo que contiene hidroxilamina; o (c) reacción de un aminoácido no natural que contiene oxima con ciertos reactivos que contienen carbonilo o dicarbonilo, en los que se incluyen a manera de ejemplo, un reactivo que contiene cetona o un reactivo que contiene aldehido. Las figuras 5 y 6 presentan ejemplos representativos no limitantes de estas metodologías sintéticas.
D. Absorción Celular de Aminoácidos no Naturales La absorción de aminoácido no natural mediante una célula eucarióntica es una cuestión que es considerada comúnmente cuando se diseñan y seleccionan aminoácidos no naturales, en los que se incluyen pero no limitados a, para incorporación a una proteína. Por ejemplo, la alta densidad de carga de los a-aminoácidos sugiere que es improbable que estos compuestos sean permeables a la célula. Los aminoácidos naturales son absorbidos a la célula eucarióntica vía una colección de sistemas de transporte a base de proteína. Una selección rápida se puede hacer que determina cuales aminoácidos no naturales, si los hay, son absorbidos por las células (los ejemplos 15 y 16 de la presente ilustran ejemplos no limitantes de pruebas que se pueden efectuar en aminoácidos no naturales) . Véase, por ejemplo, los análisis de toxicidad en, por ejemplo la publicación de patente estadounidenses No. 2004/198637 intitulada "Protein Arrays" , que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad y Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785. Aunque la absorción es fácilmente analizada con varios análisis, una alternativa al diseño de aminoácidos no naturales que son propensos a rutas de absorción celular es proporcionar rutas biosintéticas para crear aminoácidos in vivo . Comúnmente, los aminoácidos no naturales producidos vía absorción celular como se describe en la presente se produce en una concentración suficiente para la biosíntesis de proteína eficiente, en los que se incluyen pero no limitados a, una cantidad celular natural, pero no a tal grado para afectar la concentración de los otros aminoácidos o agotar recursos celulares. Concentraciones típicas producidas de esta manera son de alrededor de 10 mM a aproximadamente 0.05 mM.
E. Biosíntesis de Aminoácidos no Naturales Existen muchas rutas biosintéticas en las células para la producción de aminoácidos y otros compuestos. En tanto que un método biosintético para un aminoácido no natural particular puede no existir en la naturaleza, en los que se incluyen pero no limitados a, en una célula, los métodos y composiciones descritos en la presente proporcionan tales métodos. Por ejemplo, rutas biosintéticas para aminoácidos no naturales pueden ser generadas en célula huésped al agregar nuevas enzimas o modificar rutas de célula huésped existentes. Nuevas enzimas adicionales incluyen enzimas que se presentan de manera estable en la naturaleza o enzimas desarrolladas artificialmente. Por ejemplo, la biosíntesis de p-aminofenilalanina (como se presenta en un ejemplo en WO 2002/085923 intitulado "In vivo incorporation of unnatural amino acids") depende de la adición de una combinación de enzimas conocidas de otros organismos. Los genes para estas enzimas pueden ser introducidos a una célula eucarióntica al transformar la célula con un plásmido que comprende los genes. Los genes, cuando son expresados en la célula, proporcionan una ruta enzimática para sintetizar el compuesto deseado. Ejemplos de los tipos de enzimas que son agregadas opcionalmente son provistos en la presente. Secuencias de enzimas adicionales se encuentran, por ejemplo en Genbank. Enzimas desarrolladas artificialmente pueden ser agregadas a una célula de la misma manera. De esta manera, la maquinaria celular y recursos de una célula son manipulados para producir aminoácidos no naturales. Una variedad de métodos están disponibles para producir novedosas enzimas para uso en rutas biosintéticas o para evolución de rutas existentes. Por ejemplo, la recombinación recursiva, en las que se incluyen pero no limitada a, tal como está desarrollada por Maxygen, Inc. (disponible en el world wide web en www.maxygen.com), puede ser usada para desarrollar nuevas enzimas y rutas. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) , Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370 (4) : 389-391 ; y Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751. Similarmente DesignPath™, desarrollado por Genencor (disponible en el world wide web en genencor.com) es usado opcionalmente para el diseño de rutas metabólicas, en los que se incluyen pero no limitados a, para diseñar una ruta para crear un aminoácido no natural en una célula. Esta tecnología reconstruye rutas existentes en los organismos huésped utilizando una combinación nuevos genes, en los que se incluyen pero no limitados a, aquellos identificados por medio de genómicos funcionales, evolución molecular y diseño. Diversa Corporation (disponible en el world wide web en diversa.com) también proporciona tecnología para seleccionar rápidamente bibliotecas de genes y rutas genéticas, en los que se incluyen pero no limitados a, para crear nuevas rutas para producir biosintéticamente aminoácidos no naturales. Comúnmente, el aminoácido no natural producido con una ruta biosintética diseñada como se describe en la presente es producido en un concentración suficiente para la biosíntesis de proteína eficiente, en los que se incluyen pero no limitados a, una cantidad celular natural, pero no a tal grado para afectar la concentración de los otros aminoácidos o agotar recursos celulares. Las concentraciones típicas producidas in vivo de esta manera son aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0.05 mM. Una vez que una célula es transformada con un plásmido que comprende los genes usados para producir enzimas deseadas para una ruta específica y un aminoácido no natural es generado, selecciones in vivo son usadas opcionalmente para optimizar adicionalmente la producción del aminoácido no natural tanto para la síntesis de proteína ribosomal como crecimiento celular.
F. Metodología Sintética Adicional Los aminoácidos no naturales descritos en la presente puede ser sintetizados utilizando metodologías descritas en el arte o utilizando las técnicas descritas en la presente o mediante una combinación de los mismos. Como una ayuda, la siguiente tabla proporciona varios electrófilos y nucleófilos de partida que pueden ser combinados para crear un grupo funcional deseado. La información es proporcionada para ser ilustrativa y no limitante a las técnicas sintéticas descritas en la presente. Tabla 1: E em los de Enlaces Covalentes Precursores de los mismos En general, los electrófilos de carbono son susceptibles a ataque mediante nucleófilos complementarios, en los que se incluyen nucleófilos de carbono, en donde un nucleófilo de ataque trae un par de electrones al electrófilo de carbono con el fin de formar un nuevo enlace entre el nucleófilo y el electrófilo de carbono. Ejemplos no limitantes de nucleófilos de carbono incluyen, pero no están limitados a alquilo, alquenilo, arilo y alquinilo de Grignard, organolitio, organozinc, reactivo de alquilo, alquenilo, aril- y alquinilo-estaño (organoestananos) , reactivos alquilo, alquenilo, aril- y alquinil -borano (organoboranos y organoboronatos) ; estos nucleófilos de carbono tienen la ventaja de ser cinéticamente estables en agua o solventes orgánicos polares. Otros ejemplos no limitantes de nucleófilos de carbono incluyen ilids de fósforo, enol y reactivos de enolato; estos nucleófilos de carbono tienen la ventaja de ser relativamente fáciles de generar a partir de precursores bien conocidos para aquellos experimentados en el arte de química orgánica sintética. Los nucleófilos de carbono, cuando es usados en conjunción con electrófilos de carbono, engendran nuevos enlaces carbono-carbono entre el nucleófilo de carbono y electrófilo de carbono. Ejemplos no limitantes de nucleófilos que no son de carbono apropiados para acoplamiento a electrófilos de carbono incluyen pero no están limitados a aminas primarias y secundarias, tioles, tiolatos y tioéteres, alcoholes, alcóxidos, azidas, semicarbazidas y los semejantes. Estos nucleófilos que no son de carbono, cuando es usados en conjunción con electrófilos de carbono, genera comúnmente enlaces de heteroátomo (C-X-C) , en donde x es un heteroátomo, en los que se incluyen, pero no limitados a, oxígeno, azufre o nitrógeno.
VT. Polipéptidos con Aminoácidos no Naturales Por conveniencia, la forma, propiedades y otras características de los compuestos descrito en esta sección han sido descritos genéricamente y/o con ejemplos específicos. Sin embargo, la forma, propiedades y otras características descritas en esta sección no deben estar limitadas a solo las descripciones genéricas o ejemplo específico proporcionado en esta sección, sino que más bien la forma, propiedades y otras características descritas en esta sección se aplican igualmente bien a todos los compuestos que caen dentro del alcance de fórmulas I -XVIII, XXX-XXXIV (A&B) y XXXX-XXXXIII , en las que se incluyen cualesquier sub-fórmulas o compuestos específicos que caen dentro del alcance de las fórmulas I -XVIII, XXX-XXXIV (A&B) y XXXX-XXXXIII que son descritas en la especificación, reivindicaciones y las figuras en la presente. Las composiciones y métodos descritos en la presente proporcionan la incorporación de por lo menos un aminoácido no natural a un polipéptido. El aminoácido no natural puede estar presente en cualquier sitio sobre el polipéptido, en los que se incluyen cualquier posición terminal o cualquier posición interna del polipéptido. Preferiblemente, el aminoácido no natural no destruye la actividad y/o estructura terciaria del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo, a no ser que tal destrucción de la actividad y/o estructura terciaria fuera uno de los propósitos de incorporar el aminoácido no natural al polipéptido. Además, la incorporación del aminoácido no natural al polipéptido puede modificar a alguna extensión la actividad (por ejemplo, manipular la efectividad terapéutica del polipéptido, mejorar el perfil de seguridad del polipéptido, ajustar la farmacocinética, farmacología y/o farmacodinámica del polipéptido (por ejemplo, incrementar la solubilidad en agua, biodisponibilidad, incrementar la vida media en el suero, incrementar la vida media terapéutica, modular la inmunogenicidad, modular la actividad biológica o extender el tiempo de circulación) , proporcionar funcionalidad adicional al polipéptido, incorporar una etiqueta, indicador o señal detectable al polipéptido, facilitar las propiedades de aislamiento del polipéptido y cualquier combinación de las modificaciones mencionadas anteriormente) y/o estructura terciaria del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo sin provocar plenamente destrucción de la actividad y/o estructura terciaria. Tales modificaciones de la actividad y/o estructura terciaria son frecuentemente uno de los objetivos para efectuar tales incorporaciones, aunque la incorporación del aminoácido no natural al polipéptido puede también tener poco efecto sobre la actividad y/o estructura terciaria del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. Correspondientemente, polipéptidos de aminoácido no natural, composiciones que comprenden polipéptidos de aminoácido no natural, métodos de fabricación de tales polipéptidos y composiciones de polipéptido, métodos para purificar, aislar y caracterizar tales polipéptidos y composiciones de polipéptido y métodos para usar tales polipéptidos y composiciones de polipéptido son considerados dentro del alcance de la presente revelación. Además, los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente pueden también estar ligados a otro polipéptido (en los que se incluye, a manera de ejemplo, un polipéptido de aminoácido no natural o un polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza) . Los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente pueden ser producidos biosintéticamente o no biosintéticamente. Biosintéticamente significa cualquier método que utiliza un sistema de traducción (celular o no celular) , en los que se incluyen el uso de por lo menos uno de los siguientes componentes: un polinucleótido, un codón, un tARN y una ribosoma. No biosintéticamente significa cualquier método que no utiliza un sistema de traducción: este procedimiento puede ser dividido adicionalmente en métodos que utilizan métodos sintéticos de péptido de estado sólido, métodos sintéticos de péptido de fase sólida, métodos que utilizan por lo menos una enzima y métodos que no utilizan por lo menos una enzima; además cualquiera de estas sub-divisiones se pueden superponer y muchos métodos pueden utilizar una combinación de estas subdivisiones. Los métodos, composiciones, estrategias y técnicas descritos en la presente no están limitados a un tipo particular, clase o familia de polipéptidos o proteínas. Por supuesto, virtualmente cualquier polipéptido puede incluir por lo menos un aminoácido no natural descrito en la presente. A manera de ejemplo solamente, el polipéptido puede ser homólogo a una proteína terapéutica seleccionada del grupo que consiste de: alfa-1 antitripsina, angiostatina, factor antihemolítico, anticuerpo, apolipoproteína, apoproteína, factor natriurético atrial, polipéptido natriurético atrial, péptido atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4 , MIG, calcitonina, ligando de c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína-1 quimioatrayente de monocito, proteína-2 quimioatrayente de monocito, proteína-3 quimioatrayente de monocito, proteína-1 alfa inflamatoria de monocito, proteína-i beta inflamatoria de monocito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCCl , T58847, D31065, T64262, CD40, ligando CD40, ligando c-kit, colágeno, factor estimulador de colonia (CSF) , factor de complemento 5a, inhibidor de complemento, receptor 1 de complemento, citocina, péptido- 78 activador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , péptido activador de neutrófilo epitelial, eritropoyetina (EPO), toxina exfoliante, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor X, factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) , fibrinógeno, fibronectina, proteína de haz de cuatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glucocerebrosidasa, gonadotropina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, grf , proteína de hedgehog, hemoglobina, factor de crecimiento de hepatocito (hGF) , hirudina, hormona de crecimiento humana (hGH) , albúmina de suero humano, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferón (IFN) , IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, interleucina (IL) , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, factor de crecimiento de queratinocito (KGF), lactoferrina, factor inhibidor de leucemia, luciferasa, neurturina, factor inhibidor de neutrófilo (NIF) , oncostatina M, proteína osteogénica, producto de oncógeno, paracitonina, hormona paratiroides, PD-ECSF, PDGF, hormona de péptido, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogénica, exotoxina B pirogénica, exotoxina C pirogénica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biosintética pequeña, receptor I de complemento soluble, I-CAM 1 soluble, receptor de interleucina soluble, receptor de TNF soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptocinasa, superantígenos, enterotoxina estafilococal, SEA, SEB, SEC1, SEC2 , SEC3 , SED, SEE, receptor de hormona de esteroides, superóxido dismutasa, toxina de síndrome de choque tóxico, timosina alfa 1, activador de plasminógeno de tejido, factor de crecimiento de tumor (TGF) , factor de necrosis de tumor, factor alfa de necrosis de tumor, factor beta de necrosis de tumor, receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR) , proteína VLA-4, proteína VCAM-1, factor de crecimiento entotelial vascular (VEGF) , urocinasa, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, reí, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL y corticosterona . En una modalidad relacionada o modalidad adicional, el polipéptido de aminoácido no natural puede también ser homólogo a cualquier miembro de polipéptido de la familia de supergen de hormona de crecimiento. Los polipéptidos de aminoácido no naturales pueden ser modificados adicionalmente como se describe en cualquier parte en esta revelación o el polipéptido de aminoácido no natural puede ser usado sin modificación adicional . La incorporación de un aminoácido no natural a un polipéptido se puede hacer por una variedad de propósitos, en los que se incluyen pero no limitados a, adaptar cambios en estructura y/o función de proteína, cambiar el tamaño, acidez, nucleofilicidad, enlace de hidrógeno, hidrofobicidad, acceso de sitio objetivo de proteasa, apuntamiento a una porción (en los que se incluyen pero no limitados a, para un arreglo de polipéptido), etc. los polipéptidos que incluyen un aminoácido no natural puede tener propiedades catalíticas o biofísicas mejoradas o aún completamente nuevas. A manera de ejemplo solamente, las siguientes propiedades pueden ser modificadas mediante inclusión de un aminoácido no natural a un polipéptido: toxicidad, biodistribución, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o propiedades fotoquímicas, capacitad catalítica, vida media (en los que se incluyen pero no limitados a, vida media en el suero) , habilidad para reaccionar con otras moléculas, en las que se incluyen pero no limitados a, covalente o no covalentemente y los semejantes. Las composiciones con polipéptidos que incluyen por lo menos un aminoácido no natural son útiles para, en los que se incluyen pero no limitados a, nuevos terapéuticos, diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industriales, proteínas de enlace (en los que se incluyen pero no limitados a, anticuerpos) e investigación en los que se incluyen, pero no limitados a, el estudio de estructura y función de proteína. Véase, por ejemplo, Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinión in Chemical Biology, 4:645-652. Además, la cadena lateral del (los) componente (s) de aminoácido no natural de un polipéptido puede proporcionar un amplio intervalo de funcionalidad adicional al polipéptido; a manera de ejemplo solamente y no como limitación, la cadena lateral de la porción de aminoácido no natural de un polipéptido puede incluir cualquiera de los siguientes: un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de fotoreticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co- factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica; un ligando; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un indicador detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor; un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptámero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela reversible y cualquier combinación de los mismos. En un aspecto, una composición incluye por lo menos un polipéptido con por lo menos uno, en los que se incluyen pero no limitados a, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, por lo menos seis, por lo menos siete, por lo menos ocho, por lo menos nueve o por lo menos diez o más aminoácidos no naturales. Tales aminoácidos no naturales pueden ser los mismos o diferentes. Además, pueden haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más sitios diferentes en el polipéptido que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más diferentes o los mismos aminoácidos no naturales. En otro aspecto, una composición incluye un polipéptido con por lo menos uno, pero menos de todos, de un aminoácido particular presente en el polipéptido sustituido con aminoácido (s) no natural (es) . Para un polipéptido dado con más de un aminoácido no natural, los aminoácidos no naturales pueden ser idénticos o diferentes (tal como, a manera de ejemplo solamente, el polipéptido puede incluir dos o más tipos diferentes de aminoácidos no naturales o puede incluir dos del mismo aminoácido no natural) . Para un polipéptido dado con más de dos aminoácidos no naturales, los aminoácidos no naturales pueden ser los mismos, diferentes o una combinación de un número múltiple de aminoácidos no naturales de la misma clase con por lo menos un aminoácido no natural diferente. Aunque modalidades de los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente puede ser sintetizados químicamente vía métodos de síntesis de péptido de fase sólida (tal como, a manera de ejemplo solamente, sobre una resina sólida) , los métodos de síntesis de péptido de fase en solución y/o sin la ayuda de enzimas, otras modalidades de los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente permiten síntesis vía una membrana celular, extracto celular o sistema de lisado o vía un sistema in vivo, tal como, a manera de ejemplo solamente, utilizando la maquinaria celular de una célula procarióntica o eucarióntica. En demás modalidades o modalidades adicionales, uno de los aspectos clave de los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente es que pueden ser sintetizados utilizando ribosomas. En demás modalidades o modalidades adicionales de los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente, los polipéptidos de aminoácido no natural pueden ser sintetizados mediante una combinación de los métodos en los que se incluyen, pero no limitados a, una combinación de resinas sólidas, sin la ayuda de enzimas, vía la ayuda de ribosomas y/o vía un sistema in vivo. La síntesis de polipéptidos de aminoácidos no naturales vía ribosomas y/o un sistema in vivo tiene ventajas distintivas y característica de un polipéptido de aminoácido no natural sintetizado sobre una resina sólida o sin la ayuda de enzimas. Estas ventajas o características incluyen diferentes perfiles de pureza: un sistema que utiliza ribosomas y/o un sistema in vivo tendrá impurezas que se derivan del sistema biológico utilizado, en los que se incluyen proteínas de célula huésped, porciones de membrana y lípidos, mientras que el perfil de impureza de un sistema utiliza una resina sólida y/o sin la ayuda de enzimas puede incluir solventes orgánicos, grupos protectores, materiales de resina, reactivos de acoplamiento y otros químicos usados en los procedimientos sintéticos. Además, el patrón isotópico del polipéptido de aminoácido no natural sintetizado vía el uso de ribosomas y/o un sistema in vivo puede reflejar el patrón isotópico de la materia prima de alimentación utilizada para las células; por otra parte, el patrón isotópico del polipéptido de aminoácido no natural sintetizado sobre una resina sólida y/o sin la ayuda de enzimas puede reflejar el patrón isotópico de los aminoácidos utilizados en la síntesis. Además, el aminoácido no natural sintetizado vía el uso de ribosomas y/o un sistema in vivo puede estar sustancialmente libre de los D- isómeros de los aminoácidos y/o puede ser apto de incorporar fácilmente aminoácidos de cisteína internos a la estructura del polipéptido y/o puede proporcionar raramente polipéptidos de cancelación de aminoácido internos. Por otra parte, un polipéptido de aminoácido no natural sintetizado vía una resina sólida y/o sin el uso de enzimas puede tener un contenido más alto de D-isómeros de los aminoácidos y/o un contenido más bajo de aminoácidos de cisteína internos y/o un porcentaje más alto de polipéptidos de cancelación de aminoácido internos. Además, el experimentado en el arte será apto de diferenciar un polipéptido de aminoácido no natural sintetizado mediante el uso de una ribosoma y/o un sistema in vivo de un polipéptido de aminoácido no natural sintetizado vía una resina sólida y/o sin el uso de enzimas.
VII. Composiciones y Métodos que Comprenden Ácidos Nucleicos y Oligonucleótidos A . Métodos de Ácido Nucleico Recombinantes Generales para uso en la Presente En numerosas modalidades de los métodos y composiciones descritos en la presente, los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de interés (en los que se incluyen a manera de ejemplo un polipéptido GH) serán aislados, clonados y frecuentemente alterados utilizando métodos recombinantes. Tales modalidades son usadas, en las que se incluyen pero no limitadas a, para expresión de proteína o durante la generación de variantes, derivados, casetes de expresión, u otras secuencias derivadas de un polipéptido. En algunas modalidades, las secuencias que codifican los polipéptidos son enlazadas operativamente a un promotor heterólogo. Una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que comprende un aminoácido no natural puede ser sintetizada en base a la secuencia de aminoácidos del polipéptido original y luego cambiar la secuencia de nucleótido para efectuar la introducción (esto es, incorporación o sustitución) o remoción (esto es, cancelación o sustitución) del (los) residuo (s) de aminoácido relevante (s) . La secuencia de nucleótidos puede ser modificada convenientemente mediante mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con métodos convencionales. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos puede ser preparada mediante síntesis química, en los que se incluyen pero no limitados a, al utilizar un sintetizador de oligonucleótido, en donde los oligonucleótidos están diseñados en base a la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y seleccionando preferiblemente aquellos codones que son favorecido en la célula huésped en la cual el polipéptido recombinante será producido. Por ejemplo, varios oligonucleótidos pequeños codifican para porciones del polipéptido deseado pueden ser sintetizados y ensamblados mediante PCR, ligación o reacción en cadena de ligación. Véase, por ejemplo, Darany ++++, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 88:189-193 (1991); U.S. 6,521,427 que es incorporado en la presente por referencia. Los métodos y composiciones de aminoácidos no naturales descritos en la presente utilizan técnicas de rutina en el campo de genética recombinante. Textos básicos que revelan los métodos generales de uso para los métodos y composiciones de aminoácido naturales descritos en la presente incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990) ; y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)). Textos generales que describen técnicas biológicas moleculares incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (complementado a través de 1999) ("Ausubel")). Estos textos describen mutagénesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes relacionados con, en los que se incluyen pero no limitados a, la generación de genes o polinucleótidos que incluyen codones selectores para producción de proteínas que incluyen aminoácidos no naturales, tARN ortogonales, sintetasas ortogonales y pares de los mismos. Varios tipos de mutagénesis son usados en los métodos y composiciones de aminoácidos no naturales descritos en la presente para una variedad de propósitos, en los que se incluyen pero no limitados a, para producir nuevas sintetasas o tARN, para mutar moléculas tARN, para mutar polinucleótidos que codifican sintetasas, bibliotecas de tARN, para producir bibliotecas de sintetasas, para producir codones selectores, para insertar codones selectores que codifican aminoácidos no naturales en una proteína o polipéptido de interés. Incluyen pero no están limitados a mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis de punto aleatorio, recombinación homologa, entremezcla de ADN u otros métodos de mutagénesis recursivos, construcción quimérica, mutagénesis usando plantillas que contienen uracilo, mutagénesis dirigida a oligonucleótido, mutagénesis de ADN fosforotioato modificada, mutagénesis utilizando ADN dúplex con espacios o los semejantes, o cualquier combinación de los mismos. Métodos apropiados adicionales incluyen reparación de desajuste de punto, mutagénesis utilizando cepas huésped deficientes de reparación, restricción-selección y restricción-purificación, mutagénesis de cancelación, mutagénesis mediante síntesis de gen total, reparación de ruptura de doble hebra, y los semejantes. La mutagénesis, que incluye pero no está limitado a, involucrar constructos quiméricos, son también incluidos en los métodos y composiciones de aminoácido no naturales descritos en la presente. En una modalidad, la mutagénesis puede ser guiada al conocer la información de la molécula que se presentan de manera estable en la naturaleza o molécula que se presenta de manera estable en la naturaleza alterada o mutada, en los que se incluyen pero no limitados a, comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura cristalina o los semejantes. Los textos y ejemplos encontrados en la presente describen estos y otros procedimientos relevantes. Información adicional se encuentra en las siguientes publicaciones y referencias citadas en las mismas: Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis : an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random jnutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vi tro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462(1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vi tro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985); Cárter, Si te-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlín)) (1987); Kunkel, Rapid and efficient si te-specific mutagenesis wi thout phenotypic selection, Proc. Nati. Acad. Sci. 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Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995). Detalles adicionales en cuanto a muchos de tales métodos se pueden encontrar en Methods in Enzymology Volumen 154, que también describe controles útiles para resolución de problemas con varios métodos de mutagénesis. Los métodos y composiciones descritos en la presente también incluyen el uso de células huésped eucariónticas, células huésped no eucariónticas y organismos para la incorporación in vivo de un aminoácido no natural vía pares de tARN/RS ortogonales. Las células huésped son diseñadas genéticamente (en los que se incluyen pero no limitadas a, transformadas, transducidas o transfectadas) con los polinucleótidos correspondientes a los polipéptidos descritos en la presente o constructos que incluye un polinucleótido correspondiente a los polipéptidos descritos en la presente, en los que se incluyen pero no limitados a, un vector correspondiente a los polipéptidos descritos en la presente, que puede ser, por ejemplo un vector de clonación o un vector de expresión. Por ejemplo, las regiones de codificación para el tARN ortogonal, la tARN sintetasa ortogonal y la proteína a ser derivadas son enlazadas operativamente para la expresión genética de elementos de control que son funcionales en la célula huésped deseada. El vector puede, por ejemplo, estar en forma de un plásmido, cósmido, un fago, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo o un polinucleótido conjugado. Los vectores son introducidos a las células y/o microorganismos mediante métodos estándar en los que se incluyen electroporación (Fromm et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)), infección mediante vectores virales, penetración balística de alta velocidad mediante partículas pequeñas con los ácidos nucleicos ya sea dentro de la matriz de las perlas pequeñas o partículas o sobre la superficie (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)) y/o los semejantes. Las células huésped diseñadas pueden ser cultivadas en medios nutrientes convencionales modificados como sea apropiado para tales actividades, tal por ejemplo, etapas de selección, activación de promotores o selección de transformantes. Estas células pueden opcionalmente ser cultivadas en organismos transgénicos. Otras referencias útiles en las que se incluyen pero no limitadas a, para aislamiento y cultivo celular (por ejemplo, para aislamiento de ácido nucleico subsecuente) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, New York y las referencias citadas en la misma; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg y Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg New York) y Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL. Varios métodos bien conocidos para introducir ácidos nucleico objetivo, a células están disponibles, cualquiera de los cuales pueden ser usados en los métodos y composiciones descritos en la presente. Estos incluyen: fusión de las células receptores con protoplastos bacterianos que contienen el ADN, electroporación, bombardeo de proyectiles e inyección con vectores virales (discutidos adicionalmente en la presente) , etc. Células bacterianas pueden ser usadas para amplificar el número de plásmidos que contienen constructos de ADN correspondientes a los polipéptidos descritos en la presente. Las bacterias son cultivadas a la fase logarítmica y los plásmidos dentro de la bacteria pueden ser aislados mediante una variedad de métodos conocidos en el arte (véase, por ejemplo Sambrook) . Además, una plétora de equipos están disponibles comercialmente para la purificación de plásmidos a partir de bacterias, (véase, por ejemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean™ de Stratagene; y QIAprep™ de Qiagen) . Luego los plásmidos aislados y purificados son manipulados para producir otros plásmidos, usados para transfectar células o incorporados a vectores relacionados para infectar organismos. Los vectores típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de inicio de transcripción y traducción y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico objetivo particular. Los vectores comprenden opcionalmente casetes de expresión que contienen por lo menos una secuencia de terminador independiente, secuencias que permiten la replicación del cásete en eucariontes o procariontes o ambos (en los que se incluyen pero no limitados a, vectores de lanzadera) y marcadores de selección tanto para sistema procariónticos como eucariónticos . Los vectores son apropiados para replicación e integración en procariontes, eucariontes o preferiblemente ambos. Véase, Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al, Nature, 328:731 (1987); Schneider, E., et al, Proteína Expr. Purif. 6(1):10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger { todos supra) . Un catálogo de bacterias y bacteriófagos útiles para la clonación es proporcionado, por ejemplo por la ATCC, por ejemplo el catálogo ATCC de bacterias y bacteriófagos (1992) Gherna et al. (eds) publicado por la ATCC. Procedimientos básicos adicionales para la secuenciación, clonación y otros aspectos de biología molecular y consideraciones teóricas fundamentales también son encontrados en Watson et al (1992) Recombinante DNA Second Edition Scientific American Books, NY. Además, esencialmente cualquier ácido nucleico (y virtualmente cualquier ácido nucleico marcado, ya sea estándar o no estándar) puede ser ordenado sobre pedido o de manera estándar a partir cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como la Midland Certified Reagent Company (Midland, TX mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponible en el world wide web en genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponible en el world wide web en expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) y muchos otros.
B. Codones selectores Codones selectores abarcados dentro los métodos y composiciones descritos en la presente expanden la estructura de codón genético de la maquinaria biosintética de proteína. Por ejemplo, un codón selector incluye, pero no está limitado a, un codón de tres bases único, un codón sin sentido, tal como un codón de retención, en los que se incluyen pero no limitados a, un codón ámbar (UAG) o un codón ópalo (UGA) , un codón no natural, un codón de cuatro o más bases, un codón raro o los semejantes. Hay una amplia variedad en el número de codones selectores que pueden ser introducidos a un gen o polinucleótido deseado, en los que se incluyen pero no limitados a uno o más, dos o más, más de tres, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más en un solo polinucleótido que codifica por lo menos una porción de un polipéptido de interés. En una modalidad, los métodos involucran el uso de un codón selector que es un codón de retención para la incorporación de uno o más aminoácidos no naturales in vivo. Por ejemplo, un O-tARN es producido que reconoce el codón de retención, en los que se incluyen pero no limitados a, UAG y es aminoacilado mediante un O-RS con un aminoácido no natural deseado. Este O-tARN no es reconocido por las aminoacil-tARN sintetasas del huésped que se presentan de manera estable en la naturaleza. Mutagénesis dirigida al sitio convencional puede ser usada para introducir el codón de retención, en los que se incluyen pero no limitados a, UAG, en el sitio de interés en un polipéptido de interés. Véase, por ejemplo, Sayers, J.R., et al. (1988), 5', 3' Exonuclease in phosphorothioate -based oligonucleotide-directed mutagenesis . Nucleic Acids Res, 16 (3) .791-802. Cuando el O-RS, O-tARN y el ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés son combinados in vivo, el aminoácido no natural es incorporado en respuesta al codón UAG para dar un polipéptido que contiene el aminoácido no natural en la posición especificada. La incorporación de aminoácidos no naturales in vivo se puede hacer sin alteración significativa de la célula huésped eucarióntica. Por ejemplo, debido a que la eficiencia de supresión para el codón UAG depende de la competencia entre el O-tARN, en los que se incluyen pero no limitados a, el tARN supresor ámbar y un factor de liberación eucarióntico (en los que se incluyen pero no limitados a, eRF) (que se enlaza a un codón de retención e inicia la liberación del polipéptido creciente del ribosoma) , la eficiencia de supresión puede ser modulada al incluir, pero no limitado a, incrementar el nivel de expresión de O-tARN y/o el tARN supresor. Los codones selectores también comprenden codones extendidos, en los que se incluyen pero no limitados a, codones de cuatro o más bases, tales como codones de cuatro, cinco, seis o más bases. Ejemplos de codones de cuatro bases incluyen, pero no están limitados a, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU y los semejantes. Ejemplos de codones de cinco bases incluyen, pero no están limitados a, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC y los semejantes. Un aspecto de los métodos y composiciones descritos en la presente incluye el uso de codones extendidos a base de supresión de desplazamiento de cuadro. Codones de cuatro o más bases se pueden insertar, en los que se incluyen pero no limitados a, uno o múltiples aminoácidos no naturales a la misma proteína. Por ejemplo, en presencia de O-tARN mutado, en los que se incluyen pero no limitados a, un tARN supresor de desplazamiento de cuadro especial, con bucles anticodón, con por lo menos 8-10 nt bucles anticodón, el codón de cuatro o más bases es leído como un solo aminoácido. En otras modalidades, los bucles anticodón pueden descodificar, en los que se incluyen pero no limitados a, por lo menos un codón de cuatro bases, por lo menos un codón de cinco bases o por lo menos un codón de seis bases o más. Puesto que hay 256 codones de cuatro bases posibles, múltiples aminoácidos no naturales pueden ser codificados en la misma célula utilizando un codón de cuatro o más bases. Véase, Anderson et al., (2002) Exploring the Li i ts of codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code : Selection of Efficient Suppresssors of Four-base Codons and Identification o "Shifty" Four-base Codons wi th a Library Approach in Escherichia coli , J. Mol. Biol. 307: 755-769. Por ejemplo, codones de cuatro bases han sido usados para incorporar aminoácidos no naturales a proteínas utilizando métodos biosintéticos in vitro. Véase, por ejemplo, Ma et al., (1993) Biochemistry, 32:7939-7945; y Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:34-40. CGGG y AGGU fueron usados para incorporar simultáneamente 2-naftilalanina y un derivado de NBD de lisina a estreptavidina in vitro con dos tARN supresores de desplazamiento de cuadro acilados químicamente. Véase, por ejemplo, Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:12194-12195. En un estudio in vivo, Moore et al. examinaron la habilidad de derivados de tARNLeu con anticodones NCUA para suprimir codones UAGN (N puede ser U, A, G ó C) , y encontraron que el cuadrupleto UAGA puede ser descodificado por un tARNLeu con un anticodón UCUA con una eficiencia de 13 a 26% con poca descodificación en el cuadro 0 ó -1. Véase, Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298:195-205. En una modalidad, codones extendidos a base de codones raros o codones sin sentido pueden ser usados en los métodos y composiciones descritos en la presente, que pueden reducir la lectura sin sentido y supresión de desplazamiento de cuadro en otros sitios indeseables.
Para un sistema dado, un codón selector puede también incluir uno de los codones de tres bases naturales, en donde el sistema endógeno no usa (o raramente usa) el codón base natural. Por ejemplo, esto incluye un sistema que carece de tARN que reconoce el codón de tres bases natural y/o un sistema en donde el codón de tres bases es un codón raro. Codones selectores incluyen opcionalmente pares base no naturales. Estos pares base no naturales expanden adicionalmente el alfabeto genético existente. Un par base extra incrementa el número de codones triplete de 64 a 125. Propiedades de pares de tres bases incluyen apareamiento de base estable y selectivo, incorporación enzimática eficiente a ADN con alta fidelidad mediante una polimerasa y la extensión de cebador continua eficiente después de la síntesis del par base no natural naciente. Descripciones de pares base no naturales que pueden ser adaptados para métodos y composiciones incluyen, por ejemplo, Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein. Nature Biotechnology, 20:177-182 y véase también, Wu, Y., et . al. (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630. Otras publicaciones relevantes son enlistadas en la presente. Para uso in vivo, el nucleósido no natural es permeable a membrana y es fosforilado para formar el trifosfato correspondiente. Además, la información genética incrementada es estable y no destruida por las enzimas celulares. Esfuerzos previos por Benner y otros toma ventaja de patrones de enlace de hidrógeno que son diferentes de aquellos en los pares de Watson-Crick canónicos, el ejemplo más valioso de los cuales es el par iso-C:iso-G. Véase, por ejemplo, Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc, 111:8322-8322; y Piccirilli et al., (1990) Nature, 343:33-37; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602-608. Estas bases en general se desaparean a algún grado con las bases naturales y no pueden ser replicadas enzimáticamente. Kool y colaboradores demostraron que interacciones de empaque hidrofóbicas entre bases pueden reemplazar enlace de hidrógeno para impulsar la formación de par de base. Véase, Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602-608; y Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36(24): 2825-2828. En un esfuerzo por desarrollar un par de base no natural que satisfaga todos los requerimientos anteriores, Schultz, Romesberg y colaboradores han sintetizado sistemáticamente y estudiado una serie de bases hidrofóbicas no naturales. Se encontró que un auto par PICS:PICS es más estable que los pares de base naturales y puede ser incorporado eficientemente a ADN mediante el fragmento de Klenow de polimerasa I (KF) de ADN de Escherichia coli. Véase, por ejemplo, McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:11585-11586; y Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:3274-3278. Un auto par 3MN:3MN puede ser sintetizado mediante KF con eficiencia y selectividad suficientes para función biológica. Véase, por ejemplo, Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:8803-8804. Sin embargo, ambas bases actúan como un terminador de cadena para la replicación adicional. Una ADN polimerasa mutante ha sido desarrollada recientemente que puede ser usada para replicar el auto par PICS. Además, un autopar 7AI puede ser replicado. Véase, por ejemplo, Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439-7440. Un nuevo par de metalobase, Dipic:Py, también ha sido desarrollado, que forma un par estable en el enlace Cu (II). Véase, Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122: 10714-10715. Debido a que los codones extendidos y los codones no naturales son intrínsecamente ortogonales a los codones naturales, los métodos de aminoácidos no naturales descritos en la presente pueden tomar ventaja de esta propiedad para generar tARN ortogonales para ellos. Un sistema de desviación de traducción puede también ser usado para incorporar un aminoácido no natural a un polipéptido deseado. En un sistema de desviación de traducción, una secuencia grande es incorporada a un gen pero no es traducida a proteína. La secuencia contiene una estructura que sirve como indicación para inducir la ribosoma a brincar o saltar sobre la secuencia y reanudar la traducción corriente abajo de la inserción. En ciertas modalidades, la proteína o polipéptido de interés (o una porción de la misma) en los métodos y/o composiciones descritos en la presente es codificada por un ácido nucleico. Comúnmente, el ácido nucleico comprende por lo menos un codón selector, por lo menos dos codones selectores, por lo menos tres codones selectores, por lo menos cuatro codones selectores, por lo menos cinco codones selectores, por lo menos seis codones selectores, por lo menos siete codones selectores, por lo menos ocho codones selectores, por lo menos nueve codones selectores, diez o más codones selectores. Genes que codifican para proteínas o polipéptidos de interés pueden ser mutagenizados utilizando métodos bien conocidos por aquel de habilidad en el arte y descritos en la presente bajo "Mutagénesis y otras técnicas de biología molecular" para incluir, por ejemplo, uno o más codones selectores para la incorporación de un aminoácido no natural . Por ejemplo, un ácido nucleico para una proteína de interés es mutagenizado para incluir uno o más codones selectores, proporcionando la incorporación del uno o más aminoácidos no naturales. Los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen cualquiera de tales variantes, en los que se incluyen pero no limitados a, versiones mutantes de cualquier proteína, por ejemplo, en los que se incluyen por lo menos un aminoácido no natural. Similarmente, los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen ácidos nucleicos correspondientes, esto es, cualquier ácido nucleico con uno o más codones selectores que codifica o permite la incorporación in vivo de uno o más aminoácidos no naturales.
Moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de interés, en las que se incluyen a manera de ejemplo solamente, polipéptido de GH pueden ser mutadas fácilmente para introducir una cisteína en cualquier posición deseada del polipéptido. La cisteína es ampliamente usada para introducir moléculas reactivas, polímeros solubles en agua, proteínas o una amplia variedad de otras moléculas sobre una proteína de interés. Métodos apropiado para la incorporación de cisteína a una posición deseada de un polipéptido son bien conocidos en el arte, tales como aquellos descritos en la patente estadounidense No. 6,608,183, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad y técnicas de mutagénesis estándar. El uso de tales técnicas de introducción y utilización de cisteína pueden ser usadas en conjunción con las técnicas de introducción de aminoácido no naturales y utilización descritos en la presente.
VIII. Generación in vivo de polipéptido que comprenden aminoácidos no naturales Por conveniencia, la generación in vivo de polipéptidos que comprenden aminoácidos no naturales descritos en esta sección han sido descritos genéricamente y/o con ejemplos específicos. Sin embargo, la generación in vivo de polipéptidos que comprenden aminoácidos no naturales descritos en esta sección no deben estar limitados a solamente las descripciones genéricas o ejemplo específico proporcionado en esta sección, sino más bien la generación in vivo de polipéptidos que comprenden aminoácidos no naturales descritos en esta sección se aplican igualmente bien a todos los compuestos que caen dentro del alcance de las fórmulas I -XVIII, XXX-XXXIV(A&B) y XXXX-XXXXIII , en los que se incluyen cualquier sub- fórmulas o compuestos específicos que caen dentro del alcance de las fórmulas I -XVIII, XXX-XXXIV(A&B) y XXXX-XXXXIII que son descritos en la especificación, reivindicaciones y figuras en la presente. Los polipéptidos descritos en la presente pueden ser generados in vivo utilizando tARN modificadas y tARN sintetasas para agregar a o sustituir aminoácidos que no son codificados en sistemas que se presentan de manera estable en la naturaleza. Métodos para generar tARN y tARN sintetasas que utilizan aminoácidos que no son codificados en sistemas que se presentan de manera estable en la naturaleza son descritos por ejemplo en las publicaciones de solicitud de patente estadounidense 2003/0082575 (No. de Serie 10/126,927) y 2003/0108885 (No. de Serie 10/126,931) que son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Estos métodos involucran generar una maquinaria de traducción que funciona independientemente de las sintetasas y tARN endógenos al sistema de traducción (y por consiguiente son algunas veces denominados como "ortogonales"). En una modalidad, el sistema de traducción comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido; el polinucleótido puede ser mARN que fue transcrito del ADN correspondiente o el mARN puede surgir de un vector viral de ARN; además, el polinucleótido comprende un codón selector correspondiente al sitio predesignado de incorporación para el aminoácido no natural. El sistema de traducción comprende además un tARN para y también cuando es apropiado que comprende el aminoácido no natural, en donde el tARN es específico a/reconoce específicamente el codón selector mencionado anteriormente; En modalidades adicionales, el aminoácido no natural es aminoacilado . Los aminoácidos no naturales incluyen aquellos que tienen la estructura de cualquiera de las fórmulas I -XVIII, XXX-XXXIV (A&B) y XXXX-XXXXIII descritas en la presente. En demás modalidades o modalidades adicionales, el sistema de traducción comprende una aminoacil sintetasa específica para el tARN y en otras modalidades o modalidades adicionales, el sistema de traducción comprende una tARN ortogonal y una aminoacil tARN sintetasa ortogonal. En demás modalidades o modalidades adicionales, el sistema de traducción comprende por lo menos uno de los siguientes: un plásmido que comprende el polinucleótido mencionado anteriormente (tal como, a manera de ejemplo solamente, en forma de ADN) , ADN genómico que comprende el polinucleótido mencionado anteriormente (tal como, a manera de ejemplo solamente, en forma de ADN) o ADN genómico al cual el polinucleótido mencionado anteriormente ha sido integrado (en modalidades adicionales, la integración es integración estable) . En demás modalidades o modalidades adicionales del sistema de traducción, el codón selector es seleccionado del grupo que consiste de un codón ámbar, codón ocre, codón ópalo, un codón único, un codón raro, un codón no natural, un codón de cinco bases y un codón de cuatro bases. En demás modalidades o modalidades adicionales del sistema de traducción, el tARN es un tARN supresor. En demás modalidades o modalidades adicionales, el polipéptido de aminoácido no natural es sintetizado por una ribosoma. En demás modalidades o modalidades adicionales, el sistema de traducción comprende un tARN ortogonal (O-tARN) y una aminoacil tARN sintetasa ortogonal (O-RS) . Comúnmente, la O-RS aminoacila preferiblemente el O-tARN con por lo menos un aminoácido no natural en el sistema de traducción y el O-tARN reconoce por lo menos un codón selector que no es reconocido por otros tARN en el sistema. El sistema de traducción inserta así el aminoácido no natural a un polipéptido producido en el sistema, en respuesta a un codón selector codificado, "sustituyendo" mediante esto un aminoácido no natural a una posición en el polipéptido codificado. Una amplia variedad de tARN ortogonales y aminoacil tARN sintetasas han sido descritos en el arte para insertar aminoácidos sintéticos particulares a polipéptidos y son en general apropiados para los métodos descritos en la presente para producir los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente. Por ejemplo, O-tARN/aminoacil-tARN sintetasas ceto-específicos son descritos en Wang, L. , et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100(1) :56-61 (2003) y Zhang, Z. et al., Biochem. 42 (22) : 6735-6746 (2003). O-RS ejemplares o porciones de las mismas, son codificadas mediante secuencias de polinucleótidos e incluyen secuencias de aminoácido reveladas en las publicaciones de solicitud de patente estadounidense 2003/0082575 y 2003/0108885, cada una incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Moléculas de O-tARN correspondientes para uso con las O-RS son también descritas en las publicaciones de solicitud de patente estadounidense 2003/0082575 (No. de Serie 10/126,927) y 2003/0108885 (No. de Serie 10/126,931) que son incorporadas por referencia en la presente en su totalidad. Además, Mehl et al. en J. Am. Chem. Soc. 2003; 125:935-939 y Santoro et al. Nature Biotechnology 2002 Oct; 20: 1044-1048, que son incorporadas por referencia en la presente en su totalidad, discuten medios de selección y moléculas de aminoacil tARN sintetasa y tARN para la incorporación de p-aminofenilalanina a polipéptidos. Secuencias de O-tARN ejemplares apropiadas para uso en los métodos descritos en la presente incluyen, pero no están limitados a, secuencias de nucleótidos SEQ ID NOs: 1-3 como se revela en la solicitud de publicación de patente estadounidense 2003/0108885 (No. de Serie 10/126,931) que es incorporado en la presente por referencia. Otros ejemplos de pares de 0-tARN/aminoacil-tARN sintetasa específicos a aminoácidos no naturales particulares son descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2003/0082575 (No. de Serie 10/126,927) que es incorporado por referencia en la presente en su totalidad. O-RS y U-tARN que incorporan aminoácidos que contienen ceto y azida en S . cerevisiae son descritos en Chin, J. W., et al, Science 301:964-967 (2003). El uso de O-tARN/aminoacil-tARN sintetasas involucra la selección de un codón específico que codifica el aminoácido no natural. En tanto que cualquier codón puede ser usado, es en general deseable seleccionar un codón que es raramente usado o nunca usado en la célula en la cual la O-tARN/aminoacil-tARN sintetasa es expresada. A manera de ejemplo solamente, codones incluye ejemplares incluyen codón sin sentido tales como codones de retención (ámbar, ocre y ópalo) , codones de cuatro o más bases y otros codones de tres bases naturales que son raramente o nunca usados . Codón (es) selector (es) específico (s) que puede (n) ser introducido (s) a posiciones apropiadas al polinucleótido que codifica secuencia utilizando métodos de mutagénesis conocidos en el arte (en los que se incluyen pero no limitados a, mutagénesis específica del sitio, mutagénesis de cásete, mutagénesis de selección de restricción, etc.). Métodos para generar componentes de la maquinaria biosintética de proteína, tales como O-RS, O-tARN y pares de 0-tARN/0-RS ortogonales que pueden ser usados para incorporar un aminoácido no natural son descritos en Wang, L., et al, Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W., et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003) . Métodos y composiciones para la incorporación in vivo de aminoácidos no naturales son descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2003/0082575 (No. de Serie 10/126,927) que es incorporado por referencia en la presente en su totalidad. Métodos para seleccionar un par de tARN-tARN sintetasa ortogonal para uso en sistema de traducción in vivo de un organismo son también descritos en publicaciones de solicitud de patente estadounidense 2003/0082575 (No. de Serie 10/126,927) y 2003/0108885 (No. de Serie 10/126,931) que son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Además la publicación de PCT No. WO 04/035743 intitulada "Site Specific Incorporación of Keto Amino Acids into proteins, que es incorporada por referencia en la presente en su totalidad, describe pares de RS y tARN ortogonales para la incorporación de ceto aminoácidos. La publicación de PCT No. WO 04/094593 intitulada "Expanding the Eukaryotic Genetic Code" , que es incorporado por referencia en la presente en su totalidad, describe pares de RS y tARN ortogonales para la incorporación de aminoácidos codificados no naturalmente en células huésped eucariónticas . Métodos para producir por lo menos una aminoacil-tARN sintetasa ortogonal recombinante (O-RS) comprenden: (a) generar una biblioteca de RS (opcionalmente mutantes) derivada de por lo menos una aminoacil-tARN sintetasa (RS) de un primer organismo, en los que se incluyen pero no limitados a, un organismo procarióntico, tal como, a manera de ejemplo solamente, Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli , A . fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii , A . pernix, T. thermophilus, o los semejantes o un organismo eucarióntico; (b) seleccionar (y/o filtrar) la biblioteca de RS (opcionalmente RS mutantes) en cuanto a miembros que aminoacilan un tARN ortogonal (O-tARN) en presencia de un aminoácido no natural y un aminoácido natural, proporcionando mediante esto una acumulación de RS activos (opcionalmente mutantes) ; y/o (c) seleccionar (opcionalmente por medio de selección negativa) el cúmulo de RS activas (en los que se incluyen pero no limitadas a, RS mutantes) que aminoacilan preferiblemente el O-tARN en ausencia del aminoácido no natural, proporcionando mediante esto el por lo menos una O-RS recombinante; en donde la por lo menos una O-RS recombinante aminoacila preferiblemente el 0-tARN con el aminoácido no natural . En una modalidad, la RS es una RS inactiva. La RS inactiva puede ser generada mediante mutación una RS activa. A manera de ejemplo solamente, la RS inactiva puede ser generada mediante mutación de por lo menos 1, por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6 o por lo menos alrededor de 10 o más aminoácidos a diferentes aminoácidos, en los que se incluyen pero no limitados a, alanina. Bibliotecas de RS mutantes pueden ser generadas utilizando varíaos técnicas conocidos en el arte, en las que se incluyen pero no limitadas diseño racional a base de estructura de RS tridimensional de proteína o mutagénesis de nucleótidos de RS en una técnica de diseño aleatoria o racional . A manera de ejemplo solamente, las RS mutantes pueden ser generadas mediante mutaciones específicas del sitio, mutación aleatorias, mutaciones de recombinación que generan diversidad, constructos quiméricos, diseño racional y mediante otros métodos descritos en la presente o conocidos en el arte. En una modalidad, la selección (y/o filtración) de la biblioteca de RS (opcionalmente RS mutantes) en cuanto a miembros que son activos, en los que se incluyen pero no limitados a, aquellos que aminoacilan un tARN ortogonal (0-tARN) en presencia de un aminoácido no natural y un aminoácido natural, incluye, pero no está limitado a: introducir un marcador de selección o filtración positivo, en los que se incluyen pero no limitados a, un gen de resistencia a antibióticos o los semejantes y la biblioteca de RS (opcionalmente mutante) a una pluralidad de células, en donde el marcador de selección y/o filtración positivo comprende por lo menos un codón selector, en los que se incluyen pero no limitados a, un codón ámbar, codón ocre, codón ópalo, un codón único, un codón raro, un codón no natural, un codón de cinco bases y un codón de cuatro bases; cultivar la pluralidad de células en presencia de un agente de selección; identificar células que sobreviven (o muestran una respuesta específica) en respuesta del agente de selección y/o filtración al suprimir el por lo menos un codón selector en el marcador de selección o filtración positivo, proporcionando mediante esto un subconjunto de células seleccionadas positivamente que contienen la acumulación de RS activas (opcionalmente mutante) . Opcionalmente, la concentración del agente de selección y/o filtración se puede hacer variar. En un aspecto, el marcador de selección positivo es un gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y el codón selector es un codón de detención ámbar en el gen CAT. Opcionalmente, el marcador de selección positivo es un gen de ß-lactamasa y el codón selector es un codón de detención ámbar en el gen ß-lactamasa. En otro aspecto el marcador de selección positivo comprende un marcador de selección fluorescente o luminiscente o un marcador de selección a base de afinidad (en los que se incluyen pero no limitados a, un marcador de superficie celular) . En una modalidad, la selección o filtración negativamente del cúmulo de RS activas (opcionalmente mutantes) , en los que se incluyen pero no limitadas a, aquellas que aminoacilan preferiblemente el O-tARN en ausencia del aminoácido no natural incluye, pero no está limitado a: introducir un marcador de selección o filtración negativo con el cúmulo de RS activas (opcionalmente mutantes) de la selección o filtración positiva a una pluralidad de células de un segundo organismo, en donde el marcador de selección o filtración negativo comprende por lo menos un codón selector (en los que se incluyen pero no limitados a, un gen de resistencia a antibióticos, en los que se incluyen pero no limitados a, un gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) ) ; e, identificar células que sobreviven o muestran una respuesta de de selección específica en un primer medio complementado con el aminoácido no natural y un agente de filtración o selección, pero fallan de sobrevivir o mostrar la respuesta específica en un segundo medio no complementado con el aminoácido no natural y el agente de selección o filtración, proporcionando mediante esto células sobrevivientes o células seleccionadas con la por lo menos una O-RS recombinante. A manera de ejemplo solamente, un protocolo de identificación de CAT actúa opcionalmente como una selección positiva y/o una selección negativa en la determinación de O-RS recombinantes apropiados. Por ejemplo, un cúmulo de clones son opcionalmente replicados sobre cajas de cultivo que contienen CAT (que comprende por lo menos un codón selector) ya sea con o sin uno o más aminoácidos no naturales. Las colonias que crecen exclusivamente sobre las cajas que contienen aminoácidos no naturales son así consideradas que contienen O-RS recombinante. En un aspecto, la concentración del agente de selección (y/o filtración) se hace variar. En algunos aspectos los primeros y segundos organismos son diferentes. Así, el primero y/o segundo organismo comprende opcionalmente: un procarionte, un eucarionte, un mamífero, una Escherichia coli, un hongo, una levadura, una arqueabacteria, una eubacteria, una planta, una insecto, un aprotista, etc. En otras modalidades, el marcador de selección comprende un marcador de selección fluorescente o luminiscente o un marcador de selección a base de afinidad. En otra modalidad, la filtración o selección (en los que se incluyen pero no limitados a, selección negativamente) del cúmulo de RS activas (opcionalmente mutante) incluye, pero no está limitado a: aislamiento del cúmulo de RS mutantes activas de la etapa de selección positiva, (b) ; introducir un marcador de selección o filtración negativo, en donde el marcador de selección o filtración negativo comprende por lo menos un codón selector (en los que se incluyen pero no limitados a, un gen marcador tóxico, en los que se incluyen pero no limitados a, un gen de ribonucleasa barnasa, que comprende por lo menos un codón selector) y el cúmulo de RS activas (opcionalmente mutante) a una pluralidad de células de un segundo organismo; e identificar células que sobreviven o muestran una respuesta de de selección específica en un primer medio no complementado con el aminoácido no natural, pero que fallan de sobrevivir o mostrar una respuesta de selección específica en un segundo medio complementado con el aminoácido no natural, proporcionando mediante esto células sobrevivientes o seleccionadas con la por lo menos una O-RS recombinante, en donde la por lo menos una O-RS recombinante es específica para el aminoácido no natural . En un aspecto, el por lo menos un codón selector comprende aproximadamente dos o más codones selectores. Tales modalidades pueden incluir opcionalmente en donde el por lo menos un codón selector comprende dos o más codones selectores, y en donde los primeros y segundos organismos son diferentes (en los que se incluyen pero no limitados a, cada organismo es opcionalmente, incluyendo pero no limitado a, un procarionte, un eucarionte, un mamífero, una Escherichia coli, un hongo, una levadura, una arqueobacteria, una eubacteria, una planta, un insecto, un aprotista, etc.) . También, algunos aspectos incluyen en donde el marcador de selección negativo comprende un gen de ribonucleasa barnasa (que comprende por lo menos un codón selector) . Otros aspectos incluyen en donde el marcador de selección comprende opcionalmente un marcador de selección fluorescente o luminiscente o un marcador de selección a base de afinidad. En las modalidades de la presente, las filtraciones y/o selecciones incluyen opcionalmente variación de severidad de filtración y/o selección. En otra modalidad, los métodos para producir por lo menos una aminoacil -tARN sintetasa ortogonal recombinante (O-RS) pueden comprender además: (d) aislar por lo menos una O-RS recombinante; (e) generar un segundo conjunto de O-RS (opcionalmente mutada) derivadas de la por lo menos una O-RS recombinante; y (f) repetir las etapas (b) y (c) hasta que se obtiene una O-RS mutada que comprende la habilidad de aminoacilar preferiblemente el O-tARN. Opcionalmente, las etapas (d) - (f ) son repetidas, en las que se incluyen pero no limitadas a, por lo menos aproximadamente dos veces. En un aspecto, el segundo conjunto de O-RS mutadas derivadas de por lo menos una O-RS recombinante pueden ser generadas mediante mutagénesis, en las que se incluyen pero no limitadas a, mutagénesis aleatoria, mutagénesis específica del sitio, recombinación o una combinación de las mismas. La severidad de las etapas de selección/filtración, en las que se incluyen pero no limitadas a, etapa de selección/filtración positiva (b) , la etapa de selección/filtración negativa (c) o tanto las etapas de selección/filtraciones positivas como negativas (b) y (c) , en los métodos descritos anteriormente, incluye opcionalmente hacer variar la severidad de selección/filtración. En otra modalidad, la etapa de selección/filtración positiva (b) , la etapa de selección/filtración negativa (c) o tanto las etapas de selección/filtraciones positivas como negativas (b) y (c) comprenden utilizar un reportero, en donde el reportero es detectado mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o en donde el reportero es detectado mediante luminiscencia. Opcionalmente, el reportero es desplegado sobre una superficie celular, sobre una exhibición de fago o los semejantes y seleccionado en base a afinidad o actividad catalítica que involucra el aminoácido no natural o un análogo. En una modalidad, la sintetasa mutada es desplegada sobre una superficie celular, sobre una exhibición de fago o los semejantes. Métodos para producir un tARN recombinante ortogonal (O-tARN) incluye, pero no están limitados a: (a) generar una biblioteca de tARN mutantes derivados de por lo menos un tARN, en los que se incluyen pero no limitados a, un tARN supresor, de un primer organismo; (b) seleccionar (en los que se incluyen pero no limitados a, seleccionar negativamente) o filtrar la biblioteca en cuanto a tARN (opcionalmente mutantes) que son aminoacilados por una aminoacil -tARN sintetasa (RS) de un segundo organismo en ausencia de una RS del primer organismo, proporcionando mediante esto un cúmulo de tARN (opcionalmente mutantes) ; y (c) seleccionar o filtrar la biblioteca de tARN (opcionalmente mutantes) en cuanto a miembros que son aminoacilados por una RS ortogonal introducida (O-RS) , proporcionando mediante esto por lo menos un O-tARN recombinante; en donde el por lo menos un O-tARN recombinante reconoce un codón selector y no es reconocido eficientemente por la RS del segundo organismo y es preferiblemente aminoacilado por la O-RS. En algunas modalidades el por lo menos un tARN es un tARN supresor y/o comprende un codón de tres bases único de bases naturales y/o no naturales o es un codón sin sentido, un codón raro, un codón no natural, un codón que comprende por lo menos 4 bases, un codón ámbar, un codón ocre o un codón de retención ópalo. En una modalidad, el O-tARN recombinante posee una mejora en ortogonalidad. Se apreciará que en algunas modalidades, el O-tARN es importado opcionalmente a un primer organismo de un segundo organismo sin la necesidad de modificación. En varias modalidades, los primeros y segundos organismos son ya sea los mismos o diferentes y son escogidos opcionalmente de, en los que se incluyen pero no limitados a, procariontes (en los que se incluyen pero no limitados a, Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Escherichia coli , Halobacterium, etc.), eucariontes, mamíferos, hongos, levaduras, arquebacteria, eubacterias, plantas, insectos, protistas, etc. Adicionalmente, el tARN recombinante es opcionalmente aminoacilado por un aminoácido no natural, en donde el aminoácido no natural es biosintetizado in vivo ya sea naturalmente o por medio de de manipulación genética. El aminoácido no natural es opcionalmente agregado al medio de cultivo por al menos los primeros o segundos organismos, en donde el aminoácido no natural es capaz de obtener concentraciones intracelulares apropiadas para permitir la incorporación al polipéptido de aminoácido no natural. En un aspecto, la selección (en los que se incluyen pero no limitados a, selección negativamente) o filtración de la biblioteca en cuanto a tARN (opcionalmente mutantes) que son aminoacilados por una aminoacil -tARN sintetasa (etapa (b) ) incluye: introducir un gen marcador tóxico, en donde el gen marcador tóxico comprende por lo menos uno de los codones selectores (o un gen que conduce a la producción de un agente tóxico o estático un gen esencial al organismo en donde tal gen marcador comprende por lo menos un codón selector) y la biblioteca de tARN (opcionalmente mutantes) a una pluralidad de células del segundo organismo; y seleccionar células sobrevivientes, en donde las células sobrevivientes contienen el cúmulo de tARN (opcionalmente mutante) que comprende por lo menos un tARN ortogonal o tARN no funcional. Por ejemplo, células sobrevivientes pueden ser seleccionadas al utilizar un análisis de proporción de comparación de densidad celular. En otro aspecto, el gen marcador tóxico puede incluir dos o más codones selectores. En otra modalidad de los métodos descritos en la presente, el gen marcador tóxico es un gen de ribonucleasa barnasa, en donde el gen de ribonucleasa barnasa comprende por lo menos un codón ámbar. Opcionalmente, el gen de ribonucleasa barnasa, puede incluir dos o más codones ámbar. En una modalidad, la selección o filtración del cúmulo de tARN (opcionalmente mutante) en cuanto a miembros que son aminoacilados mediante una RS ortogonal (O-RS) introducida pueden incluir: introducir un gen marcador de selección o filtración positivo, en donde el gen marcador positivo comprende un gen de resistencia a fármaco (en los que se incluyen pero no limitados a, gen de ß-lactamasa, que comprende por lo menos uno de los codones selectores, tal como el por lo menos un codón de detención ámbar) o un gen esencial al organismo o un gen que conduce a la destoxificación de un agente tóxico, junto con la O-RS y el cúmulo de tARN (opcionalmente mutante) a una pluralidad de células del segundo organismo; e identificar células sobrevivientes o seleccionadas cultivadas en presencia de un agente de selección o filtración, en los que se incluyen pero no limitados a, un antibiótico, proporcionando mediante esto un cúmulo de células que poseen el por lo menos un tARN recombinante, en donde el por lo menos un tARN recombinante es aminoacilado por la O-RS e inserta un aminoácido a un producto de traducción codificado por el gen marcador positivo, en respuesta a los por lo menos unos codones selectores. En otra modalidad, la concentración del agente de selección y/o filtración se hace variar. Se proporcionan métodos para generar pares de 0-tARN/0-RS específicos. Los métodos incluyen, pero no están limitados a: (a) generar una biblioteca de tARN mutantes derivados de por lo menos un tARN de un primer organismo; (b) seleccionar o filtrar negativamente la biblioteca en cuanto a tARN (opcionalmente mutante) que son aminoacilados por una aminoacil -tARN sintetasa (RS) de un segundo organismo en ausencia de una RS del primer organismo, proporcionando mediante esto un cúmulo de tARN (opcionalmente mutante) ; (c) seleccionar o filtrar la biblioteca de tARN (en cuanto a miembros que son aminoacilados por una RS ortogonal (O-RS) introducida, proporcionando mediante esto por lo menos un O-tARN recombinante. El por lo menos un O-tARN recombinante reconoce un codón selector y no es reconocido eficientemente por la RS del segundo organismo y es preferiblemente aminoacilado por la O-RS. El método también incluye (d) generar una biblioteca de RS (opcionalmente mutante) derivadas de por lo menos una aminoacil -tARN sintetasa (RS) de un tercer organismo; (e) seleccionar o filtrar la biblioteca de RS mutantes en cuanto a miembros que aminoacilan preferiblemente el por lo menos un O-tARN recombinante en presencia de un aminoácido no natural y un aminoácido natural, proporcionando mediante esto un cúmulo de RS activas (opcionalmente mutantes) ; y (f) seleccionar o filtrar negativamente el cúmulo de RS activas (opcionalmente mutantes) que aminoacilan preferiblemente el por lo menos un O-tARN recombinante en ausencia del aminoácido no natural, proporcionando mediante esto el por lo menos un par de O-tARN/O-RS específico, en donde el por lo menos un par de O-tARN/O-RS específico comprende por lo menos una O-RS recombinante que es específica para el aminoácido no natural y el por lo menos un O-tARN recombinante. Pares de O-tARN/O-RS específicos producidos mediante los métodos descritos en la presente están incluidos dentro del alcance y métodos descritos en la presente. Por ejemplo, el par O-tARN/O-RS específico puede incluir, en los que se incluyen pero no limitados a, un par mutRNATyr-mutTyrRS, tal como un par mutRNATyr-SS12TyrRS, un par mutRNALeu-mutLeuRS, un par mutRNAThr-mutThrRS, un par mutRNAGlu-mutGluRS o los semejantes. Adicionalmente, tales métodos incluyen en donde el primer organismo y el tercer organismo son los mismos (en los que se incluyen pero no limitados a, Methanococcus jannaschii ) . Métodos para seleccionar un par de tARN-tARN sintetasa ortogonal para uso en un sistema de traducción in vivo de un segundo organismo también están incluidos en los métodos descritos en la presente. Los métodos incluyen, pero no están limitados a: introducir un gen marcador, un tARN y una aminoacil -tARN sintetasa (RS) aislada o derivada de un primer organismo a un primer conjunto de células del segundo organismo; introducir el gen marcador y el tARN a un conjunto de células duplicadas de un segundo organismo y seleccionar en cuanto a células sobrevivientes en el primer conjunto que fallan de sobrevivir en el conjunto de células duplicado o seleccionar en cuanto a células que muestran una respuesta de selección específica que fallan para dar tal respuesta en el conjunto de células duplicado, en donde el primer conjunto y el conjunto de células duplicado son cultivados en presencia de un agente de selección o filtración, en donde las células sobrevivientes o seleccionadas comprenden el par de tARN-tARN sintetasa ortogonal para uso en el sistema de traducción in vivo del segundo organismo. En una modalidad, la comparación y selección o filtración incluye un análisis de complementación in vivo. La concentración del agente de selección o filtración se puede hacer variar. Los organismos descritos en la presente comprenden una variedad de organismos y una variedad de combinaciones. En una modalidad, los organismos son opcionalmente un organismo procarióntico, en los que se incluyen pero no limitados a, Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Halojbac erium, Escherichia coli , A . fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii , A . pernix, T. thermophilus , o los semejantes. Alternativamente, los organismos son un organismo eucarióntico, en los que se incluyen pero no limitados a, plantas (en las que se incluyen pero no limitadas a, plantas complejas tales como monocotiledóneas o dicotiledóneas), algas, protistas, hongos (en los que se incluyen pero no limitados a, levadura, etc.), animales (en los que se incluyen pero no limitados a, mamíferos, insectos, artrópodos, etc.), o los semejantes.
A . Expresión en No Eucariontes y Eucariontes Las técnicas reveladas en esta sección pueden ser aplicadas a la expresión en no eucariontes y eucariontes de los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente . Para obtener expresión de alto nivel de un polinucleótido clonado, normalmente se subclonan polinucleótidos que codifican un polipéptido deseado a un vector de expresión que contiene a promotor fuerte para dirigir la transcripción, un terminador de transcripción/traducción y si para un ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de enlace de ribosoma para el inicio de traducción. Promotores bacterianos apropiados son descritos, por ejemplo, en Sambrook et al . y Ausubel et al . Sistemas de expresión bacterianos para expresión de polipéptidos están disponibles en, en los que se incluye pero no limitados a, E. coli , Bacillus sp . , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida y Salmonella (Paiva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al, Nature 302:543-545 (1983) . Equipos para tales sistemas de expresión están disponibles comercialmente. Sistemas de expresión eucarionticos para células mamíferas, células de levadura y de insecto están disponibles comercialmente. En casos en donde tARN ortogonales y aminoacil tARN sintetasas (descritas en cualquier parte en la presente) son usados para expresar los polipéptidos, células huésped para expresión son seleccionadas en base a su habilidad para usar los componentes ortogonales. Células huésped ejemplares incluyen bacterias Gram-positivas (en las que se incluyen pero no limitadas a B . brevis o B . subtili s o Strepto/nyces) y bacterias Gram-negativas bacteria (E. coli o Pseudomonas fluorescein, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida) , también como células de levadura y otras células eucarionticas . Células que comprenden pares de O-tARN/O-RS pueden ser usadas como se describe en la presente. Una célula huésped eucarióntica o célula huésped no eucarióntica como se describe en la presente proporciona la habilidad de sintetizar polipéptidos que comprenden aminoácidos no naturales en grandes cantidades útiles. En un aspecto, la composición incluye opcionalmente, pero no está limitada a, por lo menos 10 microgramos, por lo menos 50 microgramos, por lo menos 75 microgramos, por lo menos 100 microgramos, por lo menos 200 microgramos, por lo menos 250 microgramos, por lo menos 500 microgramos, por lo menos 1 miligramo, por lo menos 10 miligramos, por lo menos 100 miligramos, por lo menos uno gramo, o más del polipéptido que comprende un aminoácido no natural o una cantidad que puede ser obtenida con métodos de producción de polipéptidos in vivo (detalles en cuanto a producción de proteína recombinante y purificación son proporcionados en la presente) . En otro aspecto, el polipéptido está opcionalmente presente en la composición a una concentración de, incluyendo pero no limitado a, por lo menos 10 microgramos de polipéptido/litro, por lo menos 50 microgramos de polipéptido/litro, por lo menos 75 microgramos de polipéptido/litro, por lo menos 100 microgramos de polipéptido/litro, por lo menos 200 microgramos de polipéptido/litro, por lo menos 250 microgramos de polipéptido/litro, por lo menos 500 microgramos de polipéptido/litro, por lo menos 1 miligramo de polipéptido/litro o por lo menos 10 miligramos de polipéptido/litro o más, en los que se incluyen pero no limitados a, un lisado celular, una solución reguladora del pH, una solución reguladora del pH farmacéutica u otra suspensión líquida (en los que se incluyen pero no limitados a, en un volumen de cualquiera de aproximadamente 1 ni a aproximadamente 100 L) . La producción de grandes cantidades (en las que se incluye pero no limitadas a, mayor de aquella que es comúnmente posible con otros métodos, en las que se incluyen pero no limitadas a, traducción in vitro) de una proteína en una célula eucarióntica que incluye por lo menos un aminoácido no natural es un aspecto de los métodos, técnicas y composiciones descritos en la presente.
Una célula huésped eucarióntica o célula huésped no eucarióntica como se describe en la presente proporciona la capacidad para biosintetizar proteínas que comprenden aminoácidos no naturales en grandes cantidades útiles. Por ejemplo, polipéptidos que comprenden un aminoácido no natural pueden ser producidos a una concentración de, que incluye pero no limitado a, por lo menos 10 µg/litro, por lo menos 50 µg/litro, por lo menos 75 µg/litro, por lo menos 100 µg/litro, por lo menos 200 µg/litro, por lo menos 250 µg/litro o por lo menos 500 µg/litro, por lo menos 1 mg/litro, por lo menos 2 mg/litro, por lo menos 3 mg/litro, por lo menos 4 mg/litro, por lo menos 5 mg/litro, por lo menos 6 mg/litro, por lo menos 7 mg/litro, por lo menos 8 mg/litro, por lo menos 9 mg/litro, por lo menos 10 mg/litro, por lo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/litro, 1 g/litro, 5 g/litro, 10 g/litro o más del polipéptido en un extracto celular, lisado celular, medio de cultivo, una solución reguladora del pH y/o los semejantes. 1. Sistemas de Expresión, Cultivo y Aislamiento Las técnicas reveladas en esta sección pueden ser aplicadas a los sistemas de expresión, cultivo y aislamiento de los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente. Los polipéptidos de aminoácido no naturales pueden ser expresados en cualquier número de sistemas de expresión apropiados en los que se incluyen, pero no limitados a, levadura, células de insecto, células mamíferas y bacterias. Una descripción de sistemas de expresión ejemplares es proporcionada en la presente. Levadura . Como se usa en la presente, el término "levadura" incluye cualquiera de las varias levaduras capaces de expresar un gen que codifica el polipéptido de aminoácido no natural. Tales levaduras incluyen, pero no están limitadas a, levaduras ascosporógenas (Endomycetales) , levaduras basidiosporogenas y levaduras pertenecientes al grupo de Fungi imperfecti (Blastomycetes) . Las lavaduras ascosporógenas son divididas en dos familias, Spermophthoraceae y Saccharomycetaceae . La última consiste de cuatro subfamilias, Schizosaccharomycoideae (por ejemplo, género Schi zosaccharomyces) , Nadsonioideae , Lipomycoideae ? Saccharomycoideae (por ejemplo, géneros Pichia, Kluyveromyces y Saccharomyces) . Las levaduras basidiosporógenas incluyen los géneros Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus , Filobasidium y Filobasidiella . Las levaduras pertenecientes al grupo Fungi Imperfecti (Blastomycetes) son divididas en dos familias, Sporobolomycetaceae (por ejemplo, géneros Sporobolomyces y Bullera) y Cryptococcaceae (por ejemplo, género Candida) . En ciertas modalidades, las especies dentro de los géneros Pichia, Kluyveromyces , Saccharomyces , Schizosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis y Candida, en los que se incluyen, pero no limitados a, P. pastoris, P. guillerimondii , S. cerevisiae, S. carlsbergensis , S. diastaticus, S. douglasii , S. khiyveri , S, norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. mal tosa y H. polymorpha son usados en los métodos, técnicas y composiciones descritos en la presente. La selección de la levadura apropiada para la expresión del polipéptido de aminoácido no natural está dentro de la habilidad de aquel de habilidad ordinaria en el arte. En la selección de huéspedes de levadura para expresión, huéspedes apropiados pueden incluir pero no están limitados a, aquellos que se muestra que tienen, a manera de ejemplo, buena capacidad de secreción, baja actividad proteolítica y robustez global. Las levaduras están en general disponibles de una variedad de fuentes en las que se incluyen, pero no limitadas a, el Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, universidad de California (Berkeley, CA) y the American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA) . El término "huésped de levadura" o "célula huésped de levadura" incluye levaduras que pueden ser o han sido usadas como receptor para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula huésped de levadura original que ha recibido los vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. Se comprenderá que la progenie de una sola célula parenteral puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN genómico o total al padre original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula parenteral que son suficientemente similares al padre a ser caracterizado por la propiedad relevante, tal como la presencia de un secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de aminoácido no natural, están incluidos en la progenie propuesta por esta definición. La expresión y transformación de vectores, en los que se incluyen replicones extracromosomales o vectores de integración, se ha desarrollado para transformación a muchos huéspedes de levadura. Por ejemplo, vectores de expresión han sido desarrollados para S . cerevisiae (Sikorski et al., GENETICS (1998) 112:19; Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153:163; Hinnen et al., PROC. NATL . ACAD. Sci. USA (1978) 75:1929); C. albicans (Kurtz et al., MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142); C. mal tosa (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); H. polymorpha (Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459; Roggenkamp et al., MOL. GEN. GENET. (1986) 202:302); K. fragilis (Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158:1165); K. lactis (De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154:737; Van den Berg et al., BIO/TECHNOLOGY (1990) 8:135); P. guillerimondii (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141); P. pastoris (patentes estadounidenses Nos. 5,324,639; 4,929,555; y 4,837,148; Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376); Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, NATURE (1981) 300:706); y Y. lipolytica (Davidow et al., CURR. GENET. (1985) 10:380 (1985); Gaillardin et al., CURR. GENET. (1985) 10:49); A . nidulans (Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89; Tilburn et al., GENE (1983) 26:205-221; y Yelton et al., PROC NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74); A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479); T. reesia (EP 0 244 234); y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357) , cada uno incorporado en la presente por referencia en su totalidad. Secuencias de control para vectores de levadura incluyen, pero no están limitados a, regiones promotoras de genes tales como una alcohol deshidrogenasa (ADH) (EP 0 284 044); enolasa; glucocinasa; glucosa-6-fosfato isomerasa; gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAP o GAPDH) ; hexocinasa; fosfofructocinasa; 3 -fosfoglicerato mutasa,- y piruvato cinasa (PyK) (EP 0 329 203) . El gen PH05 de levadura, que codifica ácido fosfatasa, puede también proporcionar secuencias de promotor útiles (Miyanohara et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1). Otras secuencias de promotor apropiadas para uso con huéspedes de levadura pueden incluir los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J. BIOL. CHEM. (1980) 255 (4) : 12073 -12080) ; y otras enzimas glicolíticas, tales como piruvato decarboxilasa, triosefosfato isomerasa y fosfoglucosa isomerasa (Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17 (23) : 4900-4907 ; Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:149-167). Promotores de levadura inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de crecimiento pueden incluir las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2; isocitocromo C; ácido fosfatasa; metalotioneína; gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; enzimas degradantes asociadas con el metabolismo de nitrógeno; y enzimas responsables para la utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores apropiados para uso en expresión de levadura son descritos adicionalmente en EP 0073 657. Mejoradores de levadura también pueden ser usados con promotores de levadura. Además, los promotores sintéticos pueden también funcionar como promotores de levadura. A manera de ejemplo, las secuencias activadoras corriente arriba (UAS) de un promotor de levadura puede ser unido con la región de activación de transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Ejemplos de tales promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora ADH enlazada a la región de activación de transcripción de GAP. Véase patentes estadounidenses Nos. 4,880,734 y 4,876,197, que son incorporadas por referencia en la presente en su totalidad. Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores que consisten de las secuencias reguladoras de los genes ADH2 , GAL4 , GALIO o PH05 , combinados con la región de activación transcripcional de un gen de enzima glicolítica tal como GAP o PyK. Véase EP 0 164 556. Además, un promotor de levadura puede incluir promotores que se presentan de manera estable en la naturaleza de origen que no es de levadura que tiene la habilidad para enlazar ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción . Otros elementos de control que pueden comprender parte de los vectores de expresión de levadura incluyen terminadores, por ejemplo, de GAPDH o los genes de enolasa (Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256:1385). Además, el origen de replicación del origen de plásmido 2µ es apropiado para levadura. Un gen de selección apropiado para uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura. Véase Tschumper et al., GENE (1980) 10:157; Kingsman et al., GENE (1979) 7:141. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la habilidad para crecer en triptófano. Similarmente, cepas de levadura Leu2 -deficientes (ATCC 20,622 ó 38,626) son complementadas mediante plásmidos conocidos que llevan el gen Leu2. Métodos para introducir ADN exógeno a huéspedes de levadura incluyen, pero no están limitados a, ya sea la transformación de esferoplastos o de células huésped de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. A manera de ejemplo, la transformación de levadura se puede llevar a cabo de acuerdo con el método descrito en Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. Sci. USA (1979) 76:3829 y Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130:946. Sin embargo, otros métodos para introducir ADN a células tales como mediante inyección nuclear, electroporación o fusión de protoplasto pueden también ser usados como se describe en general en SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001) . Luego las células huésped de levadura pueden ser cultivadas utilizando técnicas estándar conocidas para aquellos de habilidad ordinaria en el arte . Otros métodos para expresa proteínas heterólogas en células huésped de levadura son descritos en la publicación de patente estadounidense No. 20020055169, patentes estadounidenses Nos. 6,361,969; 6,312,923; 6,183,985; 6,083,723; 6,017,731; 5,674,706; 5,629,203; 5,602,034; y 5,089,398; patente re-examinada estadounidense Nos. RE37,343 y RE35,749; solicitudes de patente publicadas PCT WO 99/07862; WO 98/37208; y WO 98/26080; publicaciones de patente europeas EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; WO 90/10277; EP 0 460 071; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; y EP 0 164 556. Véase también Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62(1-2): 79-93; Romanos et al., LEVADURA (1992) 8 (6) :423-488 ; Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7, cada uno incorporado por referencia en la presente en su totalidad. Las cepas huésped de levadura pueden ser cultivadas en fermentadores durante la etapa de amplificación etapa utilizando métodos de fermentación por lotes de alimentación estándar. Los métodos de fermentación pueden ser adaptados para tomar en cuenta las diferencias en una ruta de utilización de carbono del huésped de levadura particular o modo de control de expresión. A manera de ejemplo solamente, la fermentación de un huésped de levadura Saccharomyces puede requerir una sola alimentación de glucosa, fuente de nitrógeno complejo (por ejemplo, hidrolisados de caseína) y complementación con múltiples vitaminas, mientras que la levadura metilotrópica P. pastoris puede requerir alimentaciones de glicerol, metanol y minerales en trazas, pero solamente sales de amonio simples (nitrógeno) para crecimiento y expresión óptimos. Véase, por ejemplo, patente estadounidense No. 5,324,639; Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95; y Fieschko et al., BIOTECH. BlOENG. (1987) 29: 1113, cada uno incorporado por referencia en la presente en su totalidad. Tales métodos de fermentación, sin embargo, pueden tener ciertos aspectos comunes independientes de la cepa huésped de levadura usada. A manera de ejemplo, un nutriente limitante del crecimiento, comúnmente carbono, puede ser agregado al termentador durante la fase de amplificación para permitir crecimiento máximo. Además, métodos de fermentación emplean en general un medio de fermentación diseñado para contener cantidades apropiadas de carbono, nitrógeno, sales básales, fósforo y otros nutrientes menores (vitaminas, minerales en trazas y sales, etc.). Ejemplos de medios de fermentación apropiados para uso con Pichia son descritos en las patentes estadounidenses Nos. 5,324,639 y 5,231,178, cada una incorporada por referencia en la presente en su totalidad. Células de Insecto Baculovirus-Infectados . El término "huésped de insecto" o "célula huésped de insecto" se refiere a un insecto que puede ser o ha sido usado como receptor para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula huésped de insecto original que ha sido transfectada. Se comprenderá que la progenie de una sola célula parenteral puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN genómico o total al padre original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula parenteral que son suficientemente similares al padre a ser caracterizado por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de aminoácido no natural, están incluidos en la progenie propuesta por esta definición. La selección de células de insecto apropiadas para expresión de un polipéptido es bien conocido para aquellos de habilidad originaria en el arte. Varias especies insecto son bien descritas en el arte y están disponibles comercialmente en las que se incluyen, pero no limitados a, Aedes aegypti , Bombyx morí , Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichopliisia ni . En la selección de huéspedes de insectos para expresión, huéspedes apropiados pueden incluir, pero no están limitados a, aquellos que muestran tener, inter alia, buena capacidad de secreción, baja actividad proteolítica y robustez global. Los insectos están en general disponibles en una variedad de fuentes en las que se incluyen pero no limitados a la Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, Universidad de California (Berkeley, CA) ; y the American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA). En general, los componentes de un sistema de expresión de insectos baculovirus-infectado incluyen un vector de transferencia, usualmente un plásmido bacteriano, que contiene tanto un fragmento del genoma de baculovirus y un sitio de restricción conveniente para inserción del gen heterólogo a ser expresado; un baculovirus tipo silvestre con una secuencia homologa al fragmento baculovirus-específico en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homologa del gen heterólogo al genoma de baculovirus) ; y células huésped de insectos y medios de cultivo apropiados. Los materiales, métodos y técnicas usados en la construcción de vectores, transfección de células, recolección de placas, cultivo de células en cultivo y los semejantes son conocidos en el arte y están disponibles manuales que describen estas técnicas . Después de insertar el gen heterólogo al vector de transferencia, el vector y el genoma viral tipo silvestre son transfectados a una célula huésped de insecto, en donde el vector y el genoma viral se recombinan. El virus recombinante empacado es expresado y placas recombinantes son identificadas y purificadas. Materiales y métodos para sistemas de expresión de baculovirus/célula de insecto están disponibles comercialmente en forma de equipos por ejemplo de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) . Técnicas ilustrativas son descritas en SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987) , incorporado en la presente por referencia. Véase también, RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSSION PROTOCOLS (1995) ; AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994); KING AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); y O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992) . La producción de varias proteínas heterólogas utilizando sistemas de expresión de baculovirus/célula de insecto es descrita en las siguientes referencias y tales técnicas pueden ser adaptadas para producir los polipéptidos de aminoácidos no naturales descritos en la presente. Véase, por ejemplo, patentes estadounidenses Nos. 6,368,825; 6,342,216; 6,338,846; 6,261,805 6,245,52í 6,225,060 6,183,987 6,168,932; 6,126,944 6,096,304; 6,013,433 5,965,393 5,939,285; 5,891,676 5,871,986; 5,861,279 5,858,368 5,843,733; 5,762,939 5,753,220; 5,605,827 5,583,023 5,571,709; 5,516,657; 5,290,686; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032 WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/03628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082, cada uno incorporado en la presente por referencia en su totalidad. Vectores que son útiles en sistemas de expresión de baculovirus/célula de insecto incluyen pero no están limitados a, expresión de insectos y vectores de transferencia derivados del baculovirus Autographacalifornica de virus polihidrosis nuclear (AcNPV) , que es un vector de expresión viral auxiliar-independiente. Vectores de expresión viral derivados de este sistema usan usualmente el promotor de gen de polihedrina viral fuerte para impulsar la expresión de genes heterólogos. Véase en general, Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992) . Antes de la inserción del gen extraño al genoma de baculovirus, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, líder (si se desea) , secuencias de codificación de interés y secuencias de terminación de transcripción, son ensamblados comúnmente en un constructo de trans-colocación intermedio (vector de transferencia) . Los constructos de trans-colocación intermedios son frecuentemente mantenidos en un replicón, tal como un elemento extra cromosomal (por ejemplo, plásmidos) capaces de mantenimiento estable en un huésped, tal como bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo así que sea mantenido en un huésped apropiado para clonación y amplificación. Más específicamente, el plásmido puede contener la señal de poliadenilación de polihedrina (Miller et al., ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177) y un gen resistente a ampicilina {amp) procarióntico de replicación para selección y propagación en E. coli. Un vector de transferencia usado comúnmente para introducir genes extraños a AcNPV es pAc373. Muchos otros vectores, conocidos para aquellos de habilidad en el arte, han también sido diseñados en los que se incluye, por ejemplo, pVL985, que altera el codón de inicio de polihiderina de ATG a ATT y que introduce un sitio de clínico de BamHl 32 pares de bases corriente abajo del ATT. Véase Luckow y Summers, VIROLOGY 170:31-39 (1989) . Otros vectores disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, PBlueBac4.5/V5-HÍS; pBlueBacHis2 ; pMelBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) . Después de la inserción del gen heterólogo, el vector de transferencia y genoma baculovirual tipo silvestre son co-transfectados a un huésped de célula de insectos. Métodos ilustrativos para introducir ADN heterólogo al sitio deseado en el virus de baculovirus descrito en SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENTO STATION BULLETIN NO. 1555 (1987) ; Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156; Luckow y Summers, VIROLOGY (1989) 170:31-39. A manera de ejemplo, la inserción puede ser a un gen tal como el gen de polihedrina, mediante recombinación de cruce doble homologa; la inserción puede también ser a un sitio de enzima de restricción diseñado al gen de baculovirus deseado. Véase Miller et al., BIOESSAYS (1989) 4:91. La transfección puede ser llevada a cabo mediante electroporación utilizando métodos descritos en TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995) ; Mann y King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501. Alternativamente, se pueden usar liposomas para transfectar las células de insecto con el vector de expresión recombinante y el baculovirus. Véase, por ejemplo, Liebman et al., BlOTECHNIQUES (1999) 26(1) :36; Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050; Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570; Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323; Siffert et al., NATURE GENETICS (1998) 18:45; TILKINS ET AL., MOLECULAR BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263; Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17:491; Kost et al., GENE (1997) 190:139; Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271:22203; Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (37) : 22376 ; Reversey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (39) :23607-10; Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270:4121; Sisk et al., J. VlROL. (1994) 68(2) :766; y Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14.2:274. Liposomas disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, Cellfectin® y Lipofectin® (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA) . Además, se puede usar transfección de fosfato de calcio. Véase TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18(19) :5667; y Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501. Los vectores de expresión de baculovirus contienen usualmente un promotor de baculovirus. Un promotor de baculovirus es cualquier secuencia de ADN capaz de enlace de una ARN de polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción corriente abajo (3') de una secuencia de codificación (por ejemplo, gen estructural) a mARN. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción que es usualmente colocada próxima al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de transcripción incluye comúnmente un sitio de enlace de ARN polimerasa y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor de baculovirus puede también tener un segundo dominio llamado un mejorador, que si está presente, está usualmente distante al gen estructural. Además, la expresión puede ser ya sea regulada o constitutiva.
Genes estructurales, transcritos abundantemente en tiempos posteriores en ciclo de infección, proporcionan secuencias de promotor particularmente útiles. Ejemplos incluyen secuencias derivadas del gen que codifica la proteína de polihedron viral (FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression en THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986) ; EP 0 127 839 y 0 155 476) y el gen que codifica la proteína plO (Vlak et al., J. GEN. VlROL. (1988) 69:765. El vector de expresión de baculovirus recién formado es empacado a un baculovirus recombinante infeccioso y subsecuentemente placas de cultivo pueden ser purificadas mediante técnicas tales como aquellas descritas en Miller et al., BIOESSAYS (1989) 4:91; SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987) . Vectores de expresión de baculovirus recombinantes han sido desarrollados para infección varias células de insectos. Por ejemplo, baculovirus recombinantes han sido desarrollados para, inter alia, Aedes aegypti (ATCC No. CCL-125) , Bombyx mori (ATCC No. CRL-8910) , Drosophila melanogaster (ATCC No. 1963), Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni . Véase WO 89/046,699; Wright , NATURE (1986) 321:718; Carbonell et al., J. V1ROL. (1985) 56: 153; Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156. Véase en general, Fraser et al., in vitro CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225. Más específicamente, las líneas celulares usadas para sistemas de expresión de vector de expresión de baculovirus comúnmente incluyen, pero no están limitados a Sf9 { Spodoptera frugiperda) (ATCC No. CRL-1711) , Sf21 ( Spodoptera frugiperda) (Invitrogen Corp., No. de Cat. 11497-013 (Carlsbad, CA) ) , Tri-368 ( Trichopulsia ni ) y High-Five™ BTI-TN-5B1-4 ( Trichopulsia ni) . Células y medios de cultivo están disponibles comercialmente tanto para expresión directa y de fusión de polipéptidos heterólogos en un baculovirus/expresión. Bacterias . Técnicas de expresión bacterianas son bien conocidas en el arte. Una amplia variedad de vectores están disponibles para uso en huéspedes bacterianos. Los vectores pueden ser de una sola copia o vectores de baja o alta multicopia. Los vectores pueden servir para clonación y/o expresión. En vista de los amplios vectores concernientes con la literatura, la disponibilidad comercial de los muchos vectores y aún manuales que describen vectores y sus mapas de restricción y características, no se requiere ninguna discusión extensa en la presente. Como es bien conocido, los vectores involucran normalmente marcadores que permiten la selección, cuales marcadores pueden proporcionar resistencia a agentes citotóxicos, prototrofia o inmunidad. Frecuentemente, una pluralidad de marcadores están presentes, que proporcionan características diferentes. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de enlace de ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción corriente abajo (3") de una secuencia de codificación (por ejemplo, gen estructural) a mARN. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción que está colocada usualmente próxima al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de transcripción incluye comúnmente un sitio de enlace de ARN polimerasa y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor bacteriano puede también tener un segundo dominio llamado un operador, que se puede superponer a un sitio de enlace de ARN polimerasa adyacente en el cual comienza la síntesis de ARN. El operador permite la transcripción regulada (inducible) negativa, ya que una proteína represora de gen se puede enlazar al operador e inhibir mediante esto la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede ocurrir en ausencia de elementos reguladores negativos, tales como el operador. Además, se puede obtener regulación positiva mediante una secuencia de enlace de proteína de activador de gen, que, si está presente, está usualmente próximo (5') a la secuencia de enlace de ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora de gen es proteína activadora de catabolito (CAP) , que ayuda a iniciar la transcripción del operon lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18: 173]. Por consiguiente, la expresión regulada puede ser ya sea positiva o negativa, mejorando o reduciendo mediante esto la transcripción . Secuencias que codifican enzimas de ruta metabólica proporcionan secuencias de promotor particularmente útiles. Ejemplos incluyen secuencias de promotor derivadas de enzimas metabolizantes de azúcar, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang et al., NATURE (1977) 198:1056] y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias de promotor derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) (Goeddel et al., NUC. ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731; patente estadounidense No. 4,738,921; IFNPub. Nos. 036 776 y 121 775), cada uno es incorporado en la presente por referencia en su totalidad. El sistema promotor de ß-galactosidasa (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes" . En Inferieron 3 (Ed. I. Gresser) ] , bacteriófago lambda PL [Shimatake et al . , NATURE (1981) 292:128] y T5 [patente estadounidense No. 4,689,406], cada uno de los cuales es incorporado en la presente por referencia en su totalidad, sistemas de promotor también proporcionan secuencias de promotor útiles. Los métodos preferidos abarcados en la presente utilizan promotores fuertes tales como el promotor T7 para inducir la producción de polipéptido a altos niveles. Ejemplos de tales vectores incluyen, pero no están limitados a, la serie pET29 de Novagen y los vectores pPOP descritos en WO 99/05297, que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad.
Tales sistemas de expresión producen altos niveles de polipéptido en el huésped sin comprometer la viabilidad del huésped o parámetros de cultivo. Además, promotores sintéticos que no se presentan en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, secuencias de activación de transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago puede ser unido con las secuencias de operon de otro promotor bacteriano o de bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético [patente estadounidense No. 4,551,433], por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp- lac híbrido que consiste tanto del promotor trp como las secuencias de operon lac que es regulado por el represor lac [Amann et al., GENE (1983) 25:167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21]. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores que se presentan de manera estable en la naturaleza de origen no bacteriano que tienen la habilidad de enlazarse a ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor que se presenta de manera estable en la naturaleza de origen no bacteriano puede también ser acoplado con una ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariontes . El sistema de ARN polimerasa/promotor de T7 bacteriofasa es un ejemplo de un sistema de promotor acoplado [Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189:113; Tabor et al., Proc Nati. Acad. Sci. (1985) 82:1074] . Además, un promotor híbrido puede también consistir de un promotor de bacteriófago una región de operador de E. coli (IFNPub. No. 267 851) . Además de una secuencia promotora que funciona, un sitio de enlace de ribosoma eficiente es también útil para la expresión de genes extraños en procariontes. En E. coli, el sitio de enlace de ribosoma es la llamada secuencia de Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud localizado 3-11 nucleótidos corriente arriba del codón de inicio [Shine et al . , NATURE (1975) 254:34] . Se piensa que la secuencia de SD promueve el enlace de mARN al ribosoma mediante el apareamiento de las bases entre la secuencia de SD en la posición 3' y de E . coli 16S rARN [Steitz et al. "Genetic signáis and nucleotide sequences in messenger RNA" , en Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)] . Para expresar genes eucarionticos y genes procarionticos con sitios de enlace de ribosoma débil [Sambrook et al . "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989] . El término "huésped bacteriano" o "célula huésped bacteriana" se refiere a una bacteria que puede ser o ha sido usada como receptor para vectores recombinantes u otros ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula huésped bacteriana original que ha sido transfectada. Se comprenderá que la progenie de una sola célula parenteral puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN genómico o total al padre original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula parenteral que son suficientemente similares al padre a ser caracterizado por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido deseado, están incluidas en la progenie propuesta por esta definición. La selección de bacterias huésped apropiadas para expresión de un polipéptido deseado es bien conocida para aquellos de habilidad ordinaria en el arte. En la selección de huéspedes bacterianos para expresión, huéspedes apropiados pueden incluir, pero no están limitados a, aquellos que han demostrado que tienen por lo menos una de las siguientes características y preferiblemente por lo menos dos de los siguientes características, inter alia, buena capacidad de formación de cuerpo de inclusión, baja actividad proteolítica, buena capacidad de secreción, buena capacidad de protección de proteína soluble y robustez global . Huéspedes bacterianos están en general disponibles de una variedad de fuentes en las que se incluyen, pero no limitadas a, the Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, Universidad de California (Berkeley, CA) ; y the American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA). La fermentación industrial/farmacéutica usa en general bacterias derivadas de cepa K (por ejemplo, W3110) o de bacterias derivadas de cepas B (por ejemplo, BL21) . Estas cepas son particularmente útiles debido a que sus parámetros de clave son extremadamente bien conocidos y robustos. Además, estas cepas no son patógenas que es importante comercialmente por razones de seguridad y ambientales. En una modalidad de los métodos descritos y abarcados en la presente, el huésped E. coli incluye, pero no está limitado a, cepas de BL21, DH10B o derivados de los mismos. En otra modalidad de los métodos descritos y abarcados en la presente, el huésped E. coli es una cepa sin proteasa que incluye pero no limitados a, OMP- y LON- . En otra modalidad, el huésped bacteriano es una especie Pseudomonas, tal como P. fluorescens, P. aeruginosa y P. putida . Un ejemplo de una cepa de expresión de Pseudomonas es P. fluorescens biovar I, cepa MB101 (Dow Chemical) . Una vez que una cepa de célula huésped recombinante ha sido establecida (esto es, el constructo de expresión ha sido introducido a la célula huésped y células huésped con el constructo de expresión apropiado son aislados) , la cepa de célula huésped recombinante es cultivada bajo condiciones apropiadas para la producción de polipéptidos. El método de cultivo de la cepa de célula huésped recombinante será dependiente de la naturaleza del constructo de expresión utilizado y la identidad de la célula huésped. Cepas huésped recombinantes son normalmente cultivadas utilizando métodos que son bien conocidos en el arte. Células huésped recombinantes son cultivadas comúnmente en medio líquido que contiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas y que contienen opcionalmente vitaminas, aminoácidos, factores de crecimiento y otros complementos de cultivo proteináceos bien conocidos en el arte. Los medios líquidos para el cultivo de células huésped pueden contener opcionalmente antibióticos o anti-fungales para impedir el crecimiento de microorganismos indeseables y/o compuestos en los que se incluyen, pero no limitados a, antibióticos para seleccionar células huésped que contienen el vector de expresión. Las células huésped recombinantes pueden ser cultivadas en formatos por lotes o continuos, ya sea con cosecha celular (en el caso en donde el polipéptido deseado se acumula intracelularmente o cosecha de sobrenadante de cultivo ya sea en formatos por lotes o continuos. Para la producción en células huésped procariónticas, el cultivo por lotes y cosecha celular son preferidos. En una modalidad, los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente son purificados después de la expresión en sistemas recombinantes. Los polipéptidos pueden ser purificados de células huésped o medio de cultivo mediante una variedad de métodos conocidos en el arte. Normalmente, muchos polipéptidos producidos en células huésped bacterianas son deficientemente solubles o insolubles (en forma de cuerpos de inclusión) . En una modalidad, sustituciones de aminoácido se pueden hacer fácilmente en los polipéptidos que son seleccionados por el propósito de incrementar la solubilidad del polipéptido producido recombinantemente utilizando los métodos revelados en la presente, tales como aquellos conocidos en el arte. En el caso de polipéptidos insolubles, los polipéptidos pueden ser recolectados de lisados de célula huésped mediante centrifugación o filtración y pueden ser seguido adicionalmente por homogenización de las células. En el caso de polipéptidos deficientemente solubles, compuestos en los que se incluyen, pero no limitados a, polietilenimina (PEÍ) pueden ser agregados para inducir la precipitación de los polipéptidos parcialmente solubles. Luego los polipéptidos precipitados pueden ser recolectados convenientemente mediante centrifugación o filtración. Las células huésped recombinantes pueden ser sometidas a disrupción u homogenizadas para liberar los cuerpos de inclusión dentro de las células utilizando una variedad de métodos bien conocidos para aquellos de habilidad ordinaria en el arte. La disrupción de célula huésped u homogenización pueden ser efectuadas utilizando técnicas bien conocidas en las que se incluyen, pero no limitados a, disrupción de célula enzimática, sonificación, homogenización dounce o disrupción de liberación de alta presión. En una modalidad de los métodos descritos y abarcados en la presente, la técnica de liberación de alta presión es usada para someter a disrupción las células huésped de E. coli para liberar los cuerpos de inclusión de los polipéptidos. Se ha encontrado que los rendimientos de polipéptidos insolubles en forma de cuerpos de inclusión pueden ser incrementados al utilizar solamente un paso de las células huésped de E. coli a través del homogeneizador. Cuando se manipulan cuerpos de inclusión de polipéptidos, es ventajoso minimizar el tiempo de homogenización en repeticiones con el fin de maximizar el rendimiento de cuerpos de inclusión sin pérdida debido a factores tales como solubilización, corte mecánico o proteólisis . Luego los polipéptidos insolubles o precipitados pueden ser solubilizados utilizando cualquiera de un número de agentes de solubilización apropiados conocidos en el arte. A manera de ejemplo, los polipéptidos son solubilizados con urea o clorhidrato de guanidina. El volumen de los polipéptidos solubilizados debe ser minimizado, de tal manera que los lotes grandes pueden ser producidos utilizando tamaños de lote manejables convenientemente. Este factor puede ser significativo en una instalación comercial a gran escala en donde el huésped recombinante puede ser cultivo por lotes que son de miles de litros en volumen. Además, cuando se fabrican polipéptidos en una instalación comercial a gran escala, en particular para usos farmacéuticos humanos, la derivación de químicos peligrosos que pueden dañar la maquinaria y el recipiente o el producto de polipéptido mismo, deben ser evitados si es posible. Se ha demostrado en los métodos y descritos y abarcados en la presente que el agente desnaturalizante más moderado urea puede ser usado para solubilizar los cuerpos de inclusión de polipéptido en lugar del agente desnaturalizante más duro clorhidrato de guanidina. El uso de urea reduce significativamente el riesgo de daños a equipo de acero inoxidable utilizado en el proceso de manufactura y purificación de un polipéptido, en tanto que solubiliza eficientemente los cuerpos de inclusión de polipéptidos . En el caso de polipéptidos solubles, los péptidos pueden ser secretados en el espacio periplásmico o al medio de cultivo. Además, péptidos solubles pueden estar presentes en el citoplasma de las células huésped. El péptido soluble puede ser concentrado antes de efectuar las etapas de purificación. Técnicas estándar, en las que se incluyen pero no limitadas a aquellas descritas en la presente, pueden ser usadas para concentrar el péptido soluble de a manera de ejemplo, lisados celulares o medio de cultivo. Además, técnicas estándar, en las que se incluyen pero no limitadas a aquellas descritas en la presente, pueden ser usadas para someter a disrupción las células huésped y liberar péptido soluble del citoplasma o espacio periplásmico de las células huésped. Cuando el polipéptido es producido como una proteína de fusión es preferiblemente removida. La remoción de una secuencia de fusión puede ser efectuada mediante métodos en los que se incluyen, pero no limitados a, escisión enzimática o química, en donde la escisión enzimática es preferida. La remoción enzimática de secuencias de fusión se puede llevar a cabo utilizando métodos bien conocidos para aquellos experimentados en el arte. La elección de enzima para remoción de la secuencia de fusión será determinada por la identidad de la fusión y las condiciones de reacción serán especificadas por la elección de la enzima. La escisión química puede ser llevada a cabo utilizando reactivos, en los que se incluyen pero no limitados a, bromuro de cianógeno, proteasa de TEV y otros reactivos. El polipéptido escindido es purificado opcionalmente de la secuencia de fusión escindida mediante métodos bien conocidos. Tales métodos serán determinados por la identidad y propiedades de la secuencia de fusión y el polipéptido. Métodos para purificación pueden incluir, pero no están limitados a, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de intercambio iónico o diálisis o cualquier combinación de los mismos. El polipéptido es también purificado opcionalmente para remover ADN de la solución de proteína. El ADN puede ser removido mediante cualquier método apropiado conocido en el arte, en los que se incluyen, pero no limitados a, precipitación o cromatografía de intercambio iónico. En una modalidad, el ADN es removido mediante precipitación con un agente de precipitación de ácido nucleico, tal como, pero no limitado a, sulfato de protamina. El polipéptido puede ser separado del ADN precipitado utilizando métodos estándar bien conocidos en los que se incluyen, pero no limitados a, centrifugación o filtración. La remoción de las moléculas de ácido nucleico huéspedes es un factor importante en una instalación en donde el polipéptido va a ser usado para tratar humanos y los métodos descritos en la presente reducen el ADN de célula huésped a niveles aceptables farmacéuticamente. Métodos para la fermentación a pequeña escala o gran escala pueden también ser usados en la expresión de proteína, en los que se incluyen pero no limitados a termentadores, frascos de agitación, bioreactores de lecho fluidizado, bioreactores de fibra hueca, sistemas de cultivo de botella rodillo y sistemas de bioreactor de tanque agitado. Cada uno de estos métodos pueden ser efectuados en un proceso de modo por lotes, alimentación-lote o modo continuo. Las formas humanas de los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente pueden en general ser recuperadas utilizando métodos estándar en el arte. Por ejemplo, el medio de cultivo o lisado celular puede ser centrifugado o filtrado para remover los desechos celulares. El sobrenadante puede ser concentrado o diluido a un volumen deseado o diafiltrado a una solución reguladora del pH apropiada para acondicionar la preparación para purificación adicional. La purificación adicional de los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente incluyen, pero no están limitados a, separar las formas desamidadas y recortadas de una variante de polipéptido de la forma intacta correspondiente . Cualquiera de los siguientes procedimientos ejemplares pueden ser empleados para la purificación de un polipéptido de aminoácido no natural descrito en la presente: cromatografía de afinidad; cromatografía de intercambio aniónico o intercambio catiónico (utilizando, incluyendo pero no limitado a, DEAE SEPHAROSE) ; cromatografía sobre sílice; HPLC de fase inversa; filtración de gel (utilizando, en los que se incluyen pero no limitados a, SEPHADEX G-75) ; cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de metal -quelato; ultrafiltración/diafiltración; precipitación de etanol; precipitación de sulfato de amonio; cromatoenfoque; cromatografía de desplazamiento; procedimientos electroforéticos (en los que se incluyen pero no limitados a enfoque isoelétrico preparativo) , solubilidad diferencial (en los que se incluyen pero no limitados a precipitación de sulfato de amonio) , extracción SDS-PAGE o cualquier combinación de los mismos. Los polipéptidos abarcados dentro los métodos y composiciones descritos en la presente, en los que se incluyen pero no limitados a, polipéptidos que comprenden aminoácidos no naturales, anticuerpos a polipéptidos que comprenden aminoácidos no naturales, socios de enlaces para polipéptidos que comprenden aminoácidos no naturales, pueden ser purificados, ya sea parcial o sustancialmente a homogeneidad, de acuerdo con procedimientos estándar conocidos a y usados por aquellos de habilidad en el arte. Así, los polipéptidos descritos en la presente pueden ser recuperados y purificados mediante cualquiera de un número de métodos bien conocidos en el arte, en los que se incluyen pero no limitados a, precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción de ácido o base, cromatografía en columna, cromatografía de columna de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico o c-atiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de lectina, electroforesis de gel y cualquier combinación de los mismos. Etapas de replegado de proteína pueden ser usadas, como se desee, en la fabricación de proteínas maduras correctamente plegadas. La cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) , cromatografía de afinidad u otros métodos apropiados pueden ser empleados en etapas de purificación finales en donde se desea alta pureza. En una modalidad, anticuerpos fabricados contra aminoácidos no naturales (o polipéptidos que comprenden aminoácidos no naturales) son usados como reactivos de purificación, en los que se incluyen pero no limitados a, purificación a base de afinidad de polipéptidos que comprenden uno o más aminoácido (s) no natural (es) . Una vez purificados, parcialmente o a homogeneidad, como se desee, los polipéptidos son usados opcionalmente para una amplia variedad de utilidades, en las que se incluyen pero no limitadas a, como compuestos de análisis, terapéuticos, profilaxis, diagnóstico, reactivos de investigación y/o como inmunógenos para producción de anticuerpos. Además de otras referencias indicadas en la presente, una variedad de métodos de purificación/plegado de proteína son bien conocidos en el arte, en los que se incluyen, pero no limitados a, aquellos resumidos en R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982) ; Deutscher, Methods in Enzymologv Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990); Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods. 2a Edición Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3a Edición Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principies. High Resolution Methods and Applications, segunda Edición Wiley-VCH, NY; y Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; y las referencias citadas en las mismas. Una ventaja de producir polipéptidos que comprenden por lo menos un aminoácido no natural en una célula huésped eucarióntica o célula huésped no eucarióntica es que comúnmente los polipéptidos serán plegados en sus confirmaciones naturales. Sin embargo, en ciertas modalidades de los métodos y composiciones descritos en la presente, después de la síntesis, la expresión y/o purificación, los polipéptidos pueden poseer una conformación diferente de las confirmaciones deseadas de los polipéptidos relevantes. En un aspecto de los métodos y composiciones descritos en la presente, la proteína expresada es opcionalmente desnaturalizada y luego renaturalizada . Esta desnaturalización y renaturalización opcional se lleva a cabo utilizando métodos conocidos en el arte, en los que se incluyen pero no limitados a, mediante adición de una chaperonina al polipéptido de interés y mediante solubilización de los polipéptidos en un agente caotrópico en los que se incluyen, pero no limitados a, guanidina HCl y utilizando la proteína disulfuro isomerasa. En general, es ocasionalmente deseable desnaturalizar y reducir los polipéptidos expresados y luego provocar que los polipéptidos se re-plieguen a la conformación preferida. A manera de ejemplo, tal re-plegado puede ser llevado a cabo con la adición de guanidina, urea, DTT, DTE y/o una chaperonina a un producto de traducción de interés. Métodos de reducción, desnaturalización y renaturalización de proteínas son bien conocidos para aquellos de habilidad en el arte (véase, las referencias anteriores y Debinski , et al. (1993) J. Biol. Cherm, 268: 14065-14070; Kreitman y Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; y Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270). Debinski, et al., por ejemplo, describen la desnaturalización y reducción de proteínas de cuerpo de inclusión en guanidina-DTE . Las proteínas pueden ser replegadas en una solución regulada del pH redox que contiene, en los que se incluyen pero no limitados a, glutationa oxidada y L-arginina . Los agentes de replegado se pueden hacer fluir o hacerse mover de otra manera en contacto con el uno o más polipéptidos u otro producto de expresión o viceversa. En el caso de producción procarióntica de un polipéptido de aminoácido no natural, el polipéptido así producido puede ser mal plegado y así carece o tiene actividad biológica reducida. La bioactividad de la proteína puede ser restaurada mediante "replegado" . En una modalidad, un polipéptido mal plegado es re-plegado mediante solubilización (en donde el polipéptido es también insoluble) , desplegado y reducción de la cadena de polipéptido utilizando, a manera de ejemplo, uno o más agentes caotrópicos (en los que se incluyen pero no limitados a, urea y/o guanidina) y un agente reductor capaz de reducir enlaces de disulfuro (en los que se incluye, pero no limitados a, ditiotreitol , DTT o 2 -mercaptoetanol , 2-ME) . A una concentración moderada de caótropo, se agrega luego un agente oxidante (en los que se incluyen, pero no limitados a, oxígeno, cistina o cistamina) , que permite la reformación de enlaces de disulfuro. Un polipéptido sin plegar o mal plegado puede ser re-plegado utilizando métodos estándar conocidos en el arte, tales como aquellos descritos en las patentes estadounidenses Nos. 4,511,502, 4,511,503 y 4,512,922, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. El polipéptido puede también ser co-plegado con otras proteínas para formar heterodímeros o heteromultímeros . Después del replegado o co-plegado, el polipéptido es purificado opcionalmente de manera adicional. La purificación de polipéptidos de aminoácido no naturales se puede llevar a cabo utilizando una variedad de técnicas, en las que se incluyen pero no limitada a aquellas descritas en la presente, a manera de ejemplo cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa, cromatografía de afinidad y los semejantes o cualquier combinación de los mismos. La purificación adicional puede también incluir una etapa de secado o precipitación de la proteína purificada.
Después de la purificación, los polipéptidos de aminoácido no naturales pueden ser intercambiados a diferentes soluciones reguladoras del pH y/o concentrados mediante cualquiera de una variedad de métodos conocidos en el arte, en los que se incluyen, pero no limitados a, diafiltración y diálisis. hGH que es provisto como una sola proteína purificada puede ser sometida a agregación y precipitación. En ciertas modalidades los polipéptidos de aminoácido no naturales purificados pueden ser por lo menos 90% puros (tal como se mide mediante cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa, RP-HPLC o electroforesis de gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida, SDS-PAGE) . En ciertas otras modalidades, los polipéptidos de aminoácido no naturales purificados pueden ser por lo menos 95% puros o por lo menos 98% puros o por lo menos 99% o mayor de pureza. Sin consideración del valor numérico exacto de la pureza de los polipéptidos de aminoácido no naturales, los polipéptidos de aminoácido no naturales son suficientemente puros para uso como producto farmacéutico o para procesamiento adicional, en los que se incluyen pero no limitados a, conjugación con un polímero soluble en agua tal como PEG. En ciertas modalidades las moléculas de polipéptidos de aminoácido no naturales pueden ser usadas como agentes terapéuticos en ausencia de otros ingredientes activos o proteínas (diferentes a excipientes, portadores y estabilizadores, albúmina de suero y los semejantes) y en ciertas modalidades, las moléculas de polipéptidos de aminoácido no naturales pueden ser luego acomplejadas con otro polipéptido o un polímero. 2. Purificación de Polipéptidos de Aminoácidos no Naturales Métodos de purificación generales. Las técnicas reveladas en esta sección pueden ser aplicadas a la purificación general de los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente. Cualquiera de una variedad de etapas de aislamiento pueden ser efectuadas sobre el extracto de lisado celular, medio de cultivo, cuerpos de inclusión, espacio periplásmico de las células huésped, citoplasma de las células huésped u otro material que comprende el polipéptido deseado o sobre cualesquier mezclas de polipéptido resultantes de cualesquier etapas de aislamiento en las que se incluyen, pero no limitadas a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración de gel, cromatografía líquida de alto desempeño ("HPLC"), HPLC de fase inversa ("RP-HPLC"), adsorción sobre lecho expandido o cualquier combinación y/o repetición de los mismos y en cualquier orden apropiado. El equipo y otros materiales necesarios usados para efectuar las técnicas descritas en la presente están disponibles comercialmente. Bombas, recolectores de fracciones, monitores, grabadoras y sistemas completos están disponibles de, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA) , Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA) y Amersham Biosciences, Inc. (Piscataway, NJ) . Materiales cromatográficos en los que se incluyen, pero no limitados a, materiales de matriz de intercambio, medios y soluciones reguladoras del pH están también disponibles de tales compañías. La equilibración y otras etapas en los procesos de cromatografía en columna descritos en la presente tales como lavado y elución, se pueden efectuar más rápidamente utilizando equipo especializado tal como una bomba. Bombas disponibles comercialmente incluyen, pero no están limitadas a, bomba P-50 de HILOAD®, bomba peristáltica P-l, Bomba P-901 y Bomba P-903 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Ejemplos de recolectores de fracciones incluyen el recolector de fracciones RediFrac, recolectores de fracciones FRAC-100 y FRAC-200 y el recolector de fracciones SUPERFRAC® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Mezcladores están también disponibles para formar gradientes de pH y gradientes de concentración lineal. Mezcladores disponibles comercialmente incluyen el mezclador de gradiente GM-1 y mezcladores en línea (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . El proceso cromatográfico puede ser monitoreado utilizando cualquier monitor disponible comercialmente. Tales monitores pueden ser usados para recolector información como UV, fluorescencia, pH y conductividad. Ejemplos de detectores incluyen el monitor UV-1, UVICORD® S II, monitor UV-M II, monitor UV-900, monitor UPC-900, monitor de pH/C-900 y monitor de conductividad (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Por supuesto, sistemas completos están disponibles comercialmente en los que se incluyen los varios sistemas AKTA® de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) . En una modalidad de los métodos y composiciones descritos en la presente, por ejemplo, el polipéptido puede ser reducido y desnaturalizado al desnaturalizar primero el polipéptido purificado resultante en urea, seguido por dilución a solución reguladora del pH TRIS que contiene un agente reductor (tal como DTT) a un pH apropiado. En otra modalidad, el polipéptido es desnaturalizado en urea en un intervalo de concentración de entre aproximadamente 2 M a aproximadamente 9 M, seguido por dilución en solución reguladora del pH TRIS a un pH en el intervalo de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0. La mezcla de re-plegado de esta modalidad puede luego ser incubada. En una modalidad, la mezcla de re-plegado es incubada a temperatura ambiente por cuatro a veinticuatro horas. Luego la mezcla de polipéptidos reducida y desnaturalizada puede ser aislada adicionalmente o purificada. Como se afirma en la presente, el pH de la primera mezcla de polipéptidos puede ser ajustado antes de la ejecución de cualquiera de las etapas de aislamiento subsecuentes. Además, la primera mezcla de polipéptidos o cualquier mezcla subsecuente de la misma puede ser concentrada utilizando técnicas conocidas en el arte. Además, la clase reguladora del pH de elución que comprende la primera mezcla de polipéptido o cualquier mezcla subsecuente de la misma puede ser puede intercambiada por una solución reguladora del pH apropiada para la siguiente etapa de aislamiento utilizando técnicas bien conocidas para aquellos de habilidad ordinaria en el arte. Cromatografía de intercambio iónico. Las técnicas reveladas en esta sección pueden ser aplicadas a la cromatografía de intercambio iónico de los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente. En una modalidad y como una etapa opcional, adicional, la cromatografía de intercambio iónico puede ser efectuada sobre la primera mezcla de polipéptidos. Véase en general EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS (No. de Cat. 18-1114-21, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) ) . Columnas de intercambio iónico disponibles comercialmente incluyen columnas HITRAPF, HIPREP® y HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Tales columnas utilizando intercambiadores aniónicos fuertes tales como Q SEPHAROSE Fast Flow, Q SEPHAROSE® High Performance y Q SEPHAROSE® XL; intercambiadores catiónicos fuertes tales como SP SEPHAROSE High Performance, SP SEPHAROSE® Fast Flow y SP SEPHAROSE® XL; intercambiadores de aniones débiles tales como DEAE SEPHAROSE Fast Flow; e intercambiadores de cationes débiles tales como CM F SEPHAROSE Fast Flow (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . La cromatografía en columna de intercambio aniónico o catiónico puede ser efectuada sobre el polipéptido en cualquier etapa del proceso de purificación para aislar el polipéptido sustancialmente purificado. La etapa de cromatografía de intercambio catiónico puede ser efectuada utilizando cualquier matriz de intercambio catiónico apropiada. Matrices de intercambio catiónico incluyen, pero no están limitadas a, materiales de matriz fibrosos, porosos, no porosos, microgranulares, de perlas o materiales de matriz de intercambio catiónico reticulados. Tales materiales de matriz de intercambio catiónico incluyen, pero no están limitados a, celulosa, agarosa, dextrana, poliacrilato, polivinilo, poliestireno, sílice, poliéter o combinaciones de cualquiera de los anteriores. Enseguida de la adsorción del polipéptido a la matriz de intercambio catiónico, el polipéptido sustancialmente purificado puede ser eluído al poner en contacto la matriz con una solución reguladora del pH que tiene un pH suficientemente alto o fuerza iónica para desplazar el polipéptido de la matriz. Soluciones reguladoras del pH apropiadas para uso en elución a alto pH del polipéptido sustancialmente purificado incluyen, pero no están limitados a, citrato, fosfato, formiato, acetato, HEPES y soluciones reguladoras del pH de MES que fluctúan en concentración de por lo menos aproximadamente 5 mM a por lo menos aproximadamente 100 mM. Cromatografía de fase inversa. Las técnicas reveladas en esta sección pueden ser aplicadas a la cromatografía de fase inversa de los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente. La RP-HPLC puede ser efectuada para purificar proteínas enseguida de protocolos apropiados que son conocidos para aquellos de habilidad ordinaria en el arte. Véase, por ejemplo, Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268:112-119; Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359:391-402. La RP-HPLC puede ser efectuada sobre el polipéptido para aislar el polipéptido sustancialmente purificado. A este respecto, resinas derivadas de sílice con funcionalidades alquilo con una amplia variedad de longitudes, en las que se incluyen, pero no limitadas a, resinas de por lo menos aproximadamente C3 a por lo menos aproximadamente C30, por lo menos aproximadamente C3 a por lo menos aproximadamente C20 o por lo menos aproximadamente C3 a por lo menos aproximadamente C?8, pueden ser usadas. Alternativamente, se puede usar una resina polimérica. Por ejemplo, se puede usar una resina CGlOOsd de TosoHaas Amberchrome que es una resina de polímero de estireno. Resinas ciano o poliméricas con una amplia variedad de longitudes de cadena de alquilo pueden también ser usadas. Además, la columna de RP-HPLC puede ser lavada con un solvente tal como etanol . Una solución reguladora del pH de elución apropiada que contiene un agente de apareamiento de iones y un modificador orgánico tal como metanol, isopropanol, tetrahidrofurano, acetonitrilo o etanol, puede ser usado para eluir el polipéptido de la columna de RP-HPLC. Los agentes de apareamiento de iones más comúnmente usados incluyen, pero no están limitados a, ácido acético, ácido fórmico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido trifluoroacético, ácido heptafluorobutírico, trietilamina, tetrametilamonio, tetrabutilamonio, acetato de trietilamonio. La elución puede ser efectuada utilizando uno o más gradientes o condiciones isocráticas, con condiciones gradientes preferidas para reducir el tiempo de separación y para disminuir el ancho de pico. Otro método involucra el uso de dos gradientes con diferentes intervalos de concentración del solvente. Ejemplos de soluciones reguladoras del pH de elución apropiadas para uso en la presente pueden incluir, pero no están limitadas a, soluciones de acetato de amonio y acetonitrilo. Técnicas de purificación de cromatografía de interacción hidrofóbica. Las técnicas reveladas en esta sección pueden ser aplicadas a la purificación de cromatografía de interacción hidrofóbica de los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente. La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) puede ser efectuada sobre los polipéptidos. Véase en general HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS (No. de Cat. 18-1020-90, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) que es incorporado en la presente por referencia. Matrices de HIC apropiadas pueden incluir, pero no están limitadas a, matrices alquil- o aril-sustituidas, tales como matrices butil-, hexil-, octil- o fenil-sustituidas en las que se incluyen agarosa, agarosa reticulada, sefarosa, celulosa, sílice, dextrana, poliestireno, matrices de poli (metacrilato) y resinas de modo mezclado, en los que se incluyen pero no limitados a, una resina de polietilenamina o una matriz de poli (metacrilato) butil- o fenil-sustituida . Fuentes disponibles comercialmente para cromatografía de columna de interacción hidrofóbica incluyen, pero no están limitadas a, columnas HITRAP81, HIPREP® y HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Brevemente, antes de la carga, la columna de HIC puede ser equilibrada utilizando soluciones reguladoras del pH estándar conocidas por aquellos de habilidad ordinaria en el arte, tales como una solución de ácido acético/cloruro de sodio o sulfato de amonio que contiene HEPES. Se puede usar sulfato de amonio como la solución reguladora del pH para cargar la columna de HIC. Después de la carga del polipéptido, la columna puede luego ser lavada utilizando soluciones reguladoras del pH estándar y condiciones estándar para remover los materiales indeseables pero reteniendo el polipéptido sobre la columna de HIC. El polipéptido puede ser eluído con aproximadamente 3 a aproximadamente 10 volúmenes de columna de una solución reguladora del pH estándar, tal como solución reguladora del pH de HEPES que contiene EDTA y una concentración de sulfato amonio más baja concentración que la solución reguladora del pH de equilibrio o una solución reguladora del pH de ácido acético/cloruro de sodio, entre otros. Un gradiente de sal lineal decreciente utilizando, por ejemplo, un gradiente de fosfato de potasio, puede también ser usado para eluir las moléculas de polipéptido. El eluyente puede luego ser concentrado, por ejemplo mediante filtración, tal como diafiltración o ultrapurificación. La diafiltración puede ser utilizada para remover la sal usada para eluir el polipéptido. Otras técnicas de purificación. Las técnicas reveladas en esta sección pueden ser aplicadas a otras técnicas de purificación de los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente. Todavía otra etapa de aislamiento, por ejemplo utilizando filtración de gel (GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS (No. de Cat. 18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad; , cromatografía de hidroxiapatita (matrices apropiadas incluyen, pero no están limitadas a, HA-Ultrogel, High Resolution (Calbiochem), CHT Ceramic Hydroxyapatite (BioRad) , Bio-Gel HTP Hydroxyapatite (BioRad) ) , HPLC, adsorción en lecho expandido, ultrafiltración, diafiltración, liofilización y los semejantes, pueden ser efectuados sobre la primera mezcla de polipéptidos o cualquier mezcla subsecuente de la misma, para remover cualesquier sales en exceso y reemplazar la solución reguladora del pH con una solución reguladora del pH estable para la siguiente etapa de aislamiento o aún formulación del producto de fármaco final . El rendimiento del polipéptido, en los que se incluyen el polipéptido sustancialmente purificado, puede ser monitoreado en cada etapa descrita en la presente utilizando varias técnicas, en las que se incluyen pero no limitadas a aquellas descritas en la presente. Tales técnicas pueden también ser usadas para determinar el rendimiento del polipéptido sustancialmente purificado enseguida de la última etapa de aislamiento. A manera de ejemplo, el rendimiento del polipéptido puede ser monitoreado utilizando cualquiera de varias columnas de cromatografía líquida de alta presión de fase inversa, que tienen una variedad de longitudes de cadena de alquilo, tales como ciano RP-HPLC, C?8RP-HPLC; también como HPLC de intercambio catiónico y HPLC de filtración de gel. La pureza puede ser determinada utilizando técnicas estándar, tales como SDS-PAGE o al medir el polipéptido utilizando análisis de Western blot y ELISA. Por ejemplo, anticuerpos policlonales pueden ser generados contra proteínas aisladas a partir de fermentación de levadura de control negativo y la recuperación de intercambio catiónico. Los anticuerpos pueden también ser usados para probar en cuanto a la presencia de proteínas de célula huésped contaminantes. En ciertas modalidades, el rendimiento del polipéptido después de cada etapa de purificación puede de por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98%, por lo menos aproximadamente 99%, por lo menos aproximadamente 99.9% o por lo menos aproximadamente 99.99%, del polipéptido en el material de partida para cada etapa de purificación. El material de RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) consiste de partículas de gel de sílice, las superficies de las cuales portan cadenas de alquilo de C4. La separación del polipéptido de las impurezas proteináceas está basada en diferencias en la fuerza de las interacciones hidofóbicas. La elución es efectuada con un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético diluido. La HPLC preparativa es efectuada utilizando una columna de acero inoxidable (rellena con 2.8 a 3.2 litro de gel de sílice Vydac C4) . El eluido de Ultrogel de hidroxiapatita es acidificado al agregar ácido trifluoroacético y cargado sobre la columna de C4 Vydac. Para el lavado y elución se usa un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético diluido. Las fracciones son recolectadas y neutralizadas inmediatamente con una solución reguladora del pH de fosfato. Las fracciones de polipéptido que están dentro de los límites de IPC son acumuladas. El material de DEAE sefarosa (Pharmacia) consiste de grupos dietilaminoetilo (DEAE que son enlazados covalentemente a la superficie de perlas de sefarosa. El enlace del polipéptido a los grupos de DEAE es moderado mediante interacciones iónicas. Acetonitrilo y ácido trifluoroacético pasan a través de la columna sin ser retenidos. Después que estas superficies han sido lavadas, las impurezas en trazas son removidas mediante lavado de la columna con solución reguladora del pH de acetato a un bajo pH. Luego la columna es lavada con solución reguladora del pH de fosfato neutro y el polipéptido es eluido con una solución reguladora del pH con fuerza iónica incrementada. La columna es empacada con DEAE sefarosa de flujo rápido. El volumen de la columna es ajustado para asegurar una carga de polipéptido en el intervalo de 3-10 mg de polipéptido/ml de gel. La columna es lavada con agua y solución reguladora del pH de equilibrio (fosfato de sodio/potasio) . Las fracciones acumuladas de la HPLC eluido son cargadas y la columna es lavada con solución reguladora del pH de equilibrio. Luego la columna es lavada con solución reguladora del pH de lavado (solución reguladora del pH de acetato de sodio) seguida por lavado con solución reguladora del pH de equilibrio. Subsecuentemente el polipéptido es eluido de la columna con solución reguladora del pH de elución (cloruro de sodio, fosfato de sodio/potasio) y recolectado en una sola fracción de acuerdo con el perfil de elución maestro. El eluido de la columna de DEAE sefarosa es ajustado a la conductividad especificada. La sustancia de fármaco resultante es filtrada de manera estéril a botellas de teflón y almacenada a -70°C. Una amplia variedad de métodos y procedimientos pueden ser para determinar el rendimiento y pureza de un polipéptido de uno o más aminoácidos no naturales, en los que se incluyen pero no limitados al análisis de Bradford, SDS-PAGE, SDS-PAGE teñido de plata, SDS-PAGE teñido de Coomasie, espectrometría de masas (en los que se incluyen pero no limitados a, MALDI-TOF) y otros métodos para caracterizar proteínas conocidos para el experimentado en el arte. Métodos adicionales incluyen, pero no están limitados a, etapas para remover endotoxinas . Las endotoxinas son lipopoli-sacáridos (LPS) que están localizados sobre la membrana externa de células huésped Gram-negativas, tales como por ejemplo Escherichia coli. Métodos para reducir los niveles de endotoxina incluyen, pero no están limitados a, técnicas de purificación utilizando soportes de sílice, polvo de vidrio o hidroxiapatita, cromatografía de fase inversa, afinidad, exclusión de tamaño, intercambio aniónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, una combinación de estos métodos y los semejantes. Modificaciones o métodos adicionales pueden ser requeridos para remover contaminantes tales como proteínas co-migrantes del polipéptido de interés. Métodos para medir niveles de endotoxina son conocidos para el experimentado en el arte e incluyen, pero no están limitados a, análisis de lisado de Limulus Amebocito (LAL) . Métodos y procedimientos adicionales incluyen, pero no están limitados a, SDS-PAGE acoplado con métodos de teñido de proteína, pruebas inmunológicas, desorción de láser auxiliada por matriz/ionización-espectrometría de masas (MALDI-MS) , cromatografía líquida/espectrometría de masas, enfoque isoeléctrico, intercambio aniónico catalítico, cromato enfoque y dicroismo circular. En ciertas modalidades los aminoácidos de fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV(A&B) y XXXX- XXXXIII, en las que se incluyen cualquier sub- fórmulas o compuestos específicos que caen dentro del alcance de las formales I -XVIII, XXX- XXXIV (A&B) y XXXX-XXXXIII pueden ser incorporados biosintéticamente a polipéptidos, fabricando mediante esto polipéptidos de aminoácido no naturales. En otras modalidades, tales aminoácidos son incorporados a un sitio específico dentro el polipéptido. En otras modalidades, tales aminoácidos incorporados al polipéptido utilizando un sistema de traducción. En otras modalidades, tales sistemas de traducción comprende: (i) un polinucleótido que codifica el polipéptido, en donde el polinucleótido comprende un codón selector correspondiente al sitio pre-designado de incorporación de los aminoácidos anteriores, y (ii) un tARN que comprende el aminoácido, en donde el tARN es específico al codón selector. En otras modalidades de tales sistemas de traducción, el polinucleótido es mARN producido en el sistema de traducción. En otras modalidades de tales sistemas de traducción, el sistema de traducción comprende un plásmido o un fago que comprende el polinucleótido. En otras modalidades de tales sistemas de traducción, el sistema de traducción comprende un ADN genómico que comprende el polinucleótido. En otras modalidades de tales sistemas de traducción, el polinucleótido es integrado de manera estable al ADN genómico. En otras modalidades de tales sistemas de traducción, el sistema de traducción comprende tARN específico por un codón selector seleccionado del grupo que consiste de un codón ámbar, codón ocre, codón ópalo, codón único, un codón raro, un codón no natural, un codón de cinco bases y un codón de cuatro bases. En otras modalidades de tales sistemas de traducción, el tARN es un tARN supresor. En otras modalidades de tales sistemas de traducción, el sistema de traducción comprende un tARN que es aminoacilado a los aminoácidos anteriores. En otras modalidades de tales sistemas de traducción, el sistema de traducción comprende una aminoacil sintetasa específica para el tARN. En otras modalidades de tales sistemas de traducción, el sistema de traducción comprende un tARN ortogonal y una aminoacil tARN sintetasa ortogonal. En otras modalidades de tales sistemas de traducción, el polipéptido es sintetizado mediante un ribosoma y en modalidades adicionales, el sistema de traducción es un sistema de traducción in vivo que comprende una célula seleccionada del grupo que consiste de una célula bacteriana, una célula de arqueabacteria y célula eucarióntica. En otras modalidades la célula es una célula de Escherichia coli , célula de levadura, una célula de una especie de Pseudomonas, célula mamífera, célula de plantas o una célula de insectos. En otras modalidades de tales sistemas de traducción, el sistema de traducción es un sistema de traducción in vitro que comprende extracto celular de una célula bacteriana, célula de arqueabacteria o célula eucarióntica. En otras modalidades, el extracto celular es de una célula de Escherichia coli, una célula de una especie de Pseudomonas, célula de levadura, célula mamífera, célula de plantas o una célula de insectos. En otras modalidades por lo menos una porción del polipéptido es sintetizada mediante síntesis de péptido en fase sólida o en fase de solución o una combinación de los mismos, en tanto que en otras modalidades comprende además ligar el polipéptido a otro polipéptido. En otras modalidades, los aminoácidos de fórmulas I -XVIII, XXX-XXXIV (A&B) y XXXX-XXXXIII , en los que se incluyen cualquier sub-fórmulas o compuestos específicos que caen dentro del alcance de fórmulas I -XVIII, XXX-XXXIV (A&B) y XXXX-XXXXIII pueden ser incorporadas biosintéticamente a polipéptidos, en donde el polipéptido es una proteína homologa a una proteína terapéutica seleccionada del grupo que consiste de: alfa-1 antitripsina, angiostatina, factor antihemolítico, anticuerpo, apolipoproteína, apoproteína, factor natriurético atrial, polipéptido natriurético atrial, péptido atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4 , MIG, calcitonina, ligando de c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína- 1 quimioatrayente de monocito, proteína-2 quimioatrayente de monocito, proteína-3 quimioatrayente de monocito, proteína- 1 alfa inflamatoria de monocito, proteína-i beta inflamatoria de monocito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCCl, T58847, D31065, T64262, CD40, ligando CD40, ligando de c-kit, colágeno, factor estimulador de colonia (CSF) , factor de complemento 5a, inhibidor de complemento, receptor 1 de complemento, citocina, péptido-78 activador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , péptido activador de neutrófilo epitelial, eritropoyetina (EPO), toxina exfoliante, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor X, factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) , fibrinógeno, fibronectina, proteína de haz de cuatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glucocerebrosidasa, gonadotropina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, grf, proteína de hedgehog, hemoglobina, factor de crecimiento de hepatocito (hGF) , hirudina, hormona de crecimiento humana (hGH) , albúmina de suero humano, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferón (IFN) , IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, interleucina (IL) , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL- 10, IL-11, IL-12, factor de crecimiento de queratinocito (KGF), lactoferrina, factor inhibidor de leucemia, luciferasa, neurturin, factor inhibidor de neutrófilo (NIF) , oncostatina M, proteína osteogénica, producto oncógeno, paracitonina, hormona paratiroides, PD-ECSF, PDGF, hormona de péptido, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogénica, exotoxina B pirogénica, exotoxina C pirogénica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biosintética pequeña, receptor I de complemento soluble, I-CAM 1 soluble, receptor de interleucina soluble, receptor de TNF soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptocinasa, superantígenos, enterotoxina estafilococal, SEA, SEB, SEC1, SEC2 , SEC3 , SED, SEE, receptor de hormona de esteroides, superóxido dismutasa, toxina de síndrome de choque tóxico, timosina alfa 1, activador de plasminógeno de tejido, factor de crecimiento de tumor (TGF), factor de necrosis de tumor, factor alfa de necrosis de tumor, factor beta de necrosis de tumor, receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR) , proteína VLA-4, proteína VCAM-1, factor de crecimiento entotelial vascular (VEGF) , urocinasa, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, reí, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL y corticosterona .
B. Modificaciones Post-traducción In Vivo Al producir polipéptidos de interés con por lo menos un aminoácido no natural en células eucariónticas, tales polipéptidos pueden incluir modificaciones post-traducción eucariónticas. En ciertas modalidades, una proteína incluye por lo menos un aminoácido no natural y por lo menos una modificación post-traducción que es realizada in vivo mediante una célula eucarióntica, en donde la modificación posttraducción no es realizada por una célula eucarióntica. A manera de ejemplo, la modificación post-traducción incluye, pero no está limitada a, acetilación, acilación, modificación de lípido, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación de enlace de glicolípido, glicosilación y los semejantes. En un aspecto, la modificación post-traducción incluye anexión de un oligosacárido (en los que se incluyen pero no limitados a, (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc) ) a una asparagina mediante un enlace de GlcNAc-asparagina. Véase Tabla 1 que enlista algunos ejepplos de oligosacáridos N-enlazados de proteínas eucariónticas (residuos adicional pueden también estar presentes, que no son mostrados) . En otro aspecto, la modificación post-traducción incluye anexión de un oligosacárido (en los que se incluye pero no limitados a, Gal-GalNAc, Gal-GlcAc, etc.) a una serina o treonina mediante un enlace de GalNAc-serina o GalNAc- treonina o un enlace de GlcNAc-serina o GlcNAc-treonina. Tabla 1: EJEMPLOS DE OLIGOSACÁRIDOS POR MEDIO DE ENLACE DE GlcNAc Manal Manal En todavía otro aspecto, la modificación post-traducción incluye el procesamiento proteolítico de precursores (en los que se incluyen pero no limitados a, precursor de calcitonina, precursor de péptido relacionado con gen de calcitonina, hormona preproparatiroides, preproinsulina, proinsulina, prepro-opiomelanocortina, proopiomelanocortina y los semejantes), ensamble a una proteína multisubunidades o conjunto macromolecular, traducción a otro sitio en la célula (en los que se incluyen pero no limitados a, organelos, tales como el retículo endoplásmico, el aparato de golgi, el núcleo, lisosomas, peroxisomas, mitocondria, cloroplastos, vacuolas, etc. o por medio de la ruta secretoria) . En ciertas modalidades, la proteína comprende una secuencia de secreción o localización, una etiqueta de epítopo, una etiqueta de FLAG, una etiqueta de polihistidina, una fusión GST o los semejantes. Una ventaja de un aminoácido no natural es que presenta porciones químicas adicionales para agregar moléculas adicionales. Estas modificaciones pueden ser realizadas in vivo en una célula eucarióntica o no eucarióntica o in vitro. Así, en ciertas modalidades, la modificación post-traducción es por medio del aminoácido no natural. Por ejemplo, la modificación post-traducción puede ser por medio de una reacción nucleofílica-electrofílica . La mayoría de las reacciones usadas actualmente para la modificación selectiva de proteínas involucran formación de enlaces covalentes entre socios de reacción nucleofílicos y electrofílicos, en los que se incluyen pero no limitados a la reacción de a-halocetonas con cadenas laterales de histidina o cisteína. La selectividad en estos casos es determinado por el número y posibilidad de acceso de los residuos nucleofílicos en la proteína. En los polipéptidos descritos en la presente o producidos utilizando los métodos descritos en la presente, otras reacciones más selectivas pueden ser usadas, en las que se incluyen, pero no limitadas a, la reacción de un ceto-aminoácido no natural con hidrazidas o compuestos aminooxi, in vitro e in vivo. Véase, por ejemplo, Cornish, et al., (1996) Am. Chem. Soc. 118:8150-8151; Mahal , et al., (1997) Science, 276:1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin, et al., (2002) Am. Chem, Soc. 124:9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. 99:11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Nati. Acad. Sci. 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry 42:6735-6746; y, Chin, et al., (2003) Science 300:964-967. Esto permite la marcación selectiva de virtualmente cualquier proteína con un huésped de reactivos en los que se incluyen fluoróforos, agentes de reticulación, derivados de sacárido y moléculas citotóxicas . Véase también, solicitud de patente estadounidense No. de Serie 10/686,944 intitulada "Glycoporotein synthesis" presentada el 16 de enero de 2003, que es incorporado por referencia en la presente. Modificaciones post-traducción, en las que se incluyen pero no limitadas a, por medio de un azido aminoácido, pueden también ser efectuadas por medio de la ligación de Staudinger (en las que se incluyen pero no limitadas a, con reactivos de trialilfosfina) . Véase, por ejemplo, Kiick et al, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99(1): 19-24.
IX. Sistemas Alternos para Producir Polipéptidos de Aminoácidos No Naturales Varias estrategias han sido empleadas para introducir aminoácidos no naturales a proteínas en células huésped no recombinantes, células huésped mutagenizadas o en sistemas libres de células. Los sistemas alternos revelados en esta sección pueden ser aplicados a la producción de los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente. A manera de ejemplo, la derivación de aminoácidos con cadenas laterales reactivas tales como Lys, Cys y Tyr da como resultado la conversión de lisina a N2-acetil-lisina . La síntesis química también proporciona un método directo para incorporar aminoácidos no naturales. Con el desarrollo reciente de ligación enzimática y ligación química natural de fragmentos de péptido, es posible fabricar proteínas más grandes. Véase, por ejemplo, P. E. Dawson y S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000). La ligación de péptido química y ligación química natural son descritas en la patente estadounidense No. 6,184,344, publicación de patente estadounidense No. 2004/0138412, publicación de patente estadounidense No. 2003/0208046, WO 02/098902 y WO 03/042235, que son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Un método biosintético in vitro gra len el cual un tARN supresor acilado químicamente con el aminoácido no natural deseado es agregado a un extracto in vitro capaz de soportar biosíntesis de proteína, ha sido usado para incorporar específicamente más de 100 aminoácidos no naturales a una variedad de proteínas de virtualmente cualquier tamaño. Véase, por ejemplo, V. W. Cornish, D. Mendel y P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34:621-633 (1995); C.J. Noren, S.J. Anthony-Cahi11 , M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for si te-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244 182-188 (1989) ; y J.D. Bain, CG. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic si te-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide . J. Am. Chem. Soc. 111 8013-8014 (1989) . Un amplio intervalo de grupos funcionales ha sido introducido a proteínas para estudios de estabilidad de proteína, plegado de proteína, mecanismo enzimático y transducción de señal. Un método in vivo, denominado incorporación a presión selectiva, fue desarrollado para aprovechar la promiscuidad de sintetasas tipo silvestre. Véase, por ejemplo, N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder y R. Huber, FASEB J., 13:41-51 (1999). Una cepa auxotrópica, en la cual la ruta metabólica relevante que suministra la célula con un aminoácido no natural particular es conmutada, es cultivada en medios mínimos que contienen concentraciones limitadas del aminoácido natural, en donde la transcripción del gen objetivo es reprimida. Al inicio de una fase de crecimiento estacionaria, el aminoácido natural es agotado y reemplazado con el análogo de aminoácido no natural . La inducción de expresión de la proteína recombinante da como resultado la acumulación de una proteína que contiene el análogo no natural. Por ejemplo, utilizando esta estrategia, o, m y p-fluorofenilalaninas han sido incorporadas a proteínas y exhiben dos resaltos característicos en el espectro de UV que pueden ser identificados fácilmente, véase, por ejemplo, C. Minks, R. Huber, L. Moroder y N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29-34 (2000) ; se ha usado trifluorometionina para reemplazar la metionina en el bacteriófago T4 lisozima para estudiar su interacción con ligandos de quitoligosacárido mediante RMN 19F, véase, por ejemplo, H. Duewel, E. Daub, V. Robinson y J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404-3416 (1997); y trifluoroleucina ha sido incorporada en lugar de leucina, dando como resultado estabilidad térmica y química incrementada de una proteína de leucina-cremallera. Véase, por ejemplo, Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado y D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40(8): 1494-1496 (2001). Además, selenometionina y telurometionina son incorporados a varias proteínas recombinantes para facilitar la solución de fases en cristalografía de rayos X. Véase, por ejemplo, W. A. Hendrickson, J. R. Horton y D. M. Lemaster, EMBO J. , 9(5) :1665-1672 (1990) ; J. O. Boles, K. Lewinski , M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda y M. Hatada, Nat. Struct. Biol, 1:283-284 (1994) ; N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J.
Kellermann y R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788-796 (1995); y N. Budisa, W. Kambrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T.
Neuefeind, L. Moroder y R. Huber, J. Mol. Biol. 270:616-623 (1997) . Análogos de metionina con funcionalidades alqueno o alquino han sido incorporados eficientemente, permitiendo la modificación adicional de proteínas mediante medios químicos. Véase, por ejemplo, J. C. M. vanHest y D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68-70 (1998); J. C. M. van Hest, K. L. Kiick y D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc. 122:1282-1288 (2000); y K. L. Kiick y D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487-9493 (2000); patente estadounidense No. 6,586,207; publicación de patente estadounidense 2002/0042097, que son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. El éxito de este método depende del reconocimiento de los análogos de aminoácido no naturales por aminoacil -tARN sintetasas, que en general, requieren alta selectividad para asegurar la fidelidad de traducción de proteína. Una manera de expandir el alcance de este método es relajar la especificidad de sustrato de aminoacil -tARN sintetasas, que se ha obtenido en un número limitado de casos. A manera de ejemplo solamente, el reemplazo de Ala294 por Gly en fenilalanil-tARN sintetasa (PheRS) de Escherichia coli incrementa el tamaño de la cavidad de enlace de sustrato y da como resultado la acilación de tRNAPhe mediante p-Cl-fenilalanina (p-Cl-Phe) . Véase, M. Ibba, P. Kast y H. Hennecke, Biochemistry. 33:7107-7112 (1994). Una cepa de Escherichia coli que abarca este PheRS mutante permite la incorporación de p-Cl-fenilalanina o p-Br-fenilalanina en lugar de fenilalanina. Véase, por ejemplo, M. Ibba y H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272-275 (1995); y N. Sharma, R. Furter, P. Kast y D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37-40 (2000). Similarmente, una mutación puntual Phel30Ser cerca del sitio de enlace del aminoácido de tirosil-tARN sintetasa de Escherichia coli demostró que permite que azatirosina sea incorporada más eficientemente que tirosina. Véase, F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soil y S. Nishimura, J, Biol. Chem., 275 (51) : 40324-40328 (2000). Otra estrategia para incorporar aminoácidos no naturales a proteínas in vivo es modificar las sintetasas que tienen mecanismos a prueba de lectura. Estas sintetasas no pueden discriminar y por consiguiente activar aminoácidos que son estructuralmente similares a los aminoácidos naturales cognatos. Este error es corregido en un sitio separado, que desacila el aminoácido cargado equivocadamente del tARN para mantener la fidelidad de la traducción de proteína. Si la actividad a prueba de lectura de la sintetasa es deshabilitada, análogos estructurales que son activados equivocadamente pueden escapar de la función de edición y ser incorporados. Este procedimiento ha sido demostrado recientemente con la valil-tARN sintetasa (ValRS) . Véase, V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel y P. Marliere, Science. 292:501-504 (2001). ValRS puede aminoacilar equivocadamente tRNAVal con Cys, Thr o aminobutirato (Abu) ; estos aminoácidos no cognatos son hidrolizados subsecuentemente por el dominio de edición. Después de la mutagénesis aleatoria del cromosoma de Escherichia coli, una cepa de Escherichia coli mutante fue seleccionada que tiene una mutación en el sitio de edición de ValRS . Esta ValRS de edición defectuosa carga tRNAVal con Cys. Debido a que Abu se asemeja estéricamente al grupo Cys (el grupo -SH de Cys es reemplazado con -CH3 en Abu) , el ValRS mutante también incorpora Abu a proteínas cuando esta cepa de Escherichia coli mutante es cultivada en presencia de Abu. El análisis espectrométrico de masas muestra que aproximadamente 24% de valinas son reemplazadas por Abu en cada posición de valina en la proteína natural. La síntesis en fase sólida y métodos semisintéticos también han permitido la síntesis de una diversidad de proteínas que contienen nuevos aminoácidos. Por ejemplo, véase las siguientes publicaciones y referencias citadas en las mismas, que son como sigue: Crick, F.J.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins . Nature, 192(4809): 1227-1232 (1961); Hofmann, K. , Bohn, H. Studies on polypeptides . XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements of the S -protein activating potency of an S-peptide fragment , J. Am Chem, 88 (24) : 5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes, Acc Chem Res, 22(2):47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki , T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc . , 109, 3808-3810 (1987); Schnolzer, M. , Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides : backbone- eng ineered HIV protease, Science, 256, 221-225 (1992); Chaiken, I.M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem 255-301 (1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1 (3): 151-157 (1987); y Jackson, D.Y., Burnier, J. , Quan, C, Stanley, M. , Tom, J. , Wells, J.A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A wi th Unnatural Catalytic Residues, Science, 266, 243-247 (1994) . Se ha usado modificación química para introducir una variedad de cadenas laterales no naturales, en las que se incluyen co-factores, indicadores de espín y oligonucleótidos a proteínas in vitro. Véase, por ejemplo, Corey, D.R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence -spec i fie single- stranded deoxyribonuclease, Science, 238, 1401-1403 (1987) ; Kaiser, E.
T., Lawrence D. S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specifici ty, Ann. Rev Biochem, 54, 565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation ofenyzme active si tes, Science, 226, 505-511 (1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol -subtilisin, J Biol. Chem, 243(24): 6392-6401 (1968); Polgar, L.B., M.L. A new enzima containing a synthetically formed active si te . Thiol -subtilisin . J. Am Chem Soc, 88 (13) : 3153-3154 (1966); y Pollack, SJ., Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining si tes, Science, 1(242): 1038-1040 (1988). Alternativamente, métodos biosintéticos que emplean aminoacil -tARN modificados químicamente han sido usados para incorporar varias sondas biofísicas a proteínas sintetizadas in vitro. Véase las siguientes publicaciones y referencias citadas en las mismas: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 483-514 (1993); y Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54 -kilodal ton polypeptide of the signal recogni tion partióle, Proc. Nati. Acad. Sci. 83, 8604-8608 (1986). Previamente, se ha demostrado que los aminoácidos no naturales puede ser incorporadas específicamente en el sitio incorporado a proteínas in vitro mediante la adición de tARN supresores aminoacilados químicamente a reacciones de síntesis de proteína programadas con un gen que contiene una mutación sin sentido ámbar deseada. Utilizando estos procedimientos, se pueden sustituir una diversidad de los veinte aminoácidos comunes con homólogos estructurales estrechos, por ejemplo fluorofenilalanina por fenilalanina, utilizando cepas auxotróficas para un aminoácido particular. Véase, por ejemplo, Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P. G. A general method for si te-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science. 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic si te-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc. 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellmnan, J.A. , Mendel, D., Anthony-Cahill , S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids si te-specifically into proteins, Methods in Enz . , 202, 301-336 (1992); y Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P.G. Si te-directed Mutagénesis wi th an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys . Biomol Struct. 24, 435-62 (1995) . Por ejemplo, un tARN supresor fue preparado que reconoció el codón de retención UAG y fue aminoacilado químicamente con un aminoácido no natural . Mutagénesis dirigida al sitio convencional fue usada para introducir el codón de retención TAG, en el sitio de interés en el gen de proteína.
Véase, por ejemplo, Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5 ' , 3 ' Exonuclease in phosphorothioate -based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucleic Acids Res. 16 (3) : 791-802 (1988). Cuando el tARN supresor acilado y el gen mutante fueron combinados en un sistema de transcripción/traducción in vitro, el aminoácido no natural fue incorporado en respuesta al codón UAG que dio una proteína que contiene el aminoácido en la posición especificada. Experimentos usando [3H] -Phe y experimentos con a-hidroxi ácidos demostraron que solamente el aminoácido deseado es incorporado en la posición especificada por el codón UAG codón y que este aminoácido no es incorporado en cualquier otro sitio en la proteína. Véase, por ejemplo, Noren, et al, supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10 (6) : 425-432 ; y Ellman, J.A. , Mendel, D., Schultz, P.G. Si te-specific incorporation of novel backbone s truc tu es into proteins . Science, 255, 197-200 (1992) . Técnicas de microinyección han sido también usadas para incorporar aminoácidos no naturales a proteínas. Véase, por ejemplo, M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Science, 268:439-442 (1995); y D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chern. Biol., 4:645 (2000). Un oocito de xenopus fue coinyectado con dos especies de ARN elaboradas in vitro: un mARN que codifica la proteína objetivo con un condón de retención UAG en la posición de aminoácido de interés y un tARN supresor ámbar aminoacilado con el aminoácido no natural deseado. La maquinaria de traducción del oocito inserta luego el aminoácido no natural en la posición especificada por las UAG. Este método ha permitido estudios de estructura-función in vivo de proteínas de membrana integrales, que en general no son propensas a sistemas de expresión in vitro. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, la incorporación de un aminoácido fluorescente al receptor de tacykinin nuerokini-2 para medir distancias mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, véase, por ejemplo, G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel y A. Chollet, J Biol. Chem., 271 (33) : 19991-19998 (1996); la incorporación de aminoácidos biotinilados para identificar residuos de superficie expuesta en canales iónicos, véase, por ejemplo, J. P. Gallivan, H. A. Lester y D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4 (10) :739-749 (1997); el uso de análogos de tirosina enjaulados para monitorear cambios conformacionales en un canal iónico en tiempo real, véase, por ejemplo, J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Neuron, 20:619-624 (1998); y el uso de alfa hidroxi aminoácidos para cambiar cadenas fundamentales de canal iónico para probar en cuanto a sus mecanismos de compuerta. Véase, por ejemplo, P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Cell, 96:89-98 (1999); y T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz y J. Yang, Nat. Neurosci, 4(3):239-246 (2001). La habilidad para incorporar aminoácidos no naturales directamente a proteínas in vivo ofrece las ventajas de altos rendimientos de proteínas mutantes, facilitad técnica, el potencial para estudiar las proteínas mutantes en células o posiblemente en organismos vivientes y el uso de estas proteínas mutante en tratamientos terapéuticos. La habilidad de incluir aminoácidos no naturales con varios tamaños, acideces, nucleofilicidades, hidrofobicidades y otras propiedades a proteínas puede expandir extensamente la habilidad de manipular racional y sistemáticamente las estructuras de proteínas, tanto para probar la función de proteína como para crear nuevas proteínas u organismos con nuevas propiedades. En un intento por incorporar específicamente en el sitio para-F-Phe, un par tRNAPheCUA/fenilalanil-tARN sintetasa supresor ámbar de levadura fue usado en una cepa de Escherichia coli Phe autoxtrópica resistente a p-F-Phe. Véase, por ejemplo, R. Furter, Proteína Sci., 7:419-426 (1998). También puede ser posible obtener la expresión de un polinucleótido deseado utilizando un sistema de traducción libre de células (in-vitro) . En estos sistemas, que puede incluir ya sea mARN como plantilla (traducción in-vitro) o ADN como plantilla (transcripción y traducción in vitro combinadas) , la síntesis in vitro es dirigida por los ribosomas. Se ha aplicado considerable esfuerzo al desarrollo de sistemas de expresión de proteínas libres de células. Véase, por ejemplo, Kim, D.- M. y J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74 (4) : 309-316 (2001); Kim, D.-M., y J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D.-M. y J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000) ; Kim, D.-M. y J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66(3): 180-188, (1999); y Patnaik, R. y J.R. Swartz, Biotechniqxi.es 24(5): 862-868, (1998); patente estadounidense No. 6,337,191; publicación de patente estadounidense No. 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785, que son incorporados en la presente por referencia en su totalidad. Otro procedimiento que puede ser aplicado a la expresión de polipéptidos que comprenden un aminoácido no natural incluye, pero no está limitado a, la técnica de fusión de mARN-péptido . Véase, por ejemplo, R. Roberts y J. Szostak, Proc. Nati Acad. Sci. (USA) 94 1229/-12302 (1997); A Frankel, et al., Chemistry & biology 10, 1043-1050 (2003) . En este procedimiento, una plantilla de mARN enlazada a puromicina es traducida a péptido sobre el ribosoma. Si una o más moléculas de tARN han sido modificadas, los aminoácidos no naturales pueden ser incorporado al péptido también. Después que el último codón de mARN ha sido leído, la puromicina captura el término C del péptido. Si se encuentra que el conjugado de mARN-péptido resultante tiene propiedades interesantes en un análisis in vitro, su identidad puede ser revelada fácilmente a partir de la secuencia de mARN. De esta manera, se pueden seleccionar bibliotecas de polipéptidos que comprenden uno o más aminoácidos no naturales para identificar polipéptidos que tienen propiedades deseadas. Más recientemente, traducción de ribozima in vitro con componentes purificados han sido reportados que permiten la síntesis de péptidos sustituidos con aminoácidos no naturales. Véase, por ejemplo, A. Forster et al, Proc. Nati Acad. Sci. (USA) 100(11): 6353-6357 (2003) .
X. Modificaciones Post - traducción de Componentes de Aminoácido No Natural de un Polipéptido Por conveniencia, las modificaciones post-traducción de componentes de aminoácido no naturales de un polipéptido descritas en esta sección (XA a XJ) han sido descritos genéricamente y/o con ejemplos específicos. Sin embargo, las modificaciones post-traducción de componentes de aminoácido no naturales de un polipéptido descritas en esta sección no deben estar limitadas a solo las descripciones genéricas o ejemplo específico proporcionado en esta sección, sino que más bien las modificaciones post-traducción de componentes de aminoácido no naturales de un polipéptido descritas en esta sección se aplican igualmente bien a todos los compuestos que caen dentro del alcance de las fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV (A&B) y XXXX-XXXXIII, en las que se incluyen cualquier sub- fórmulas o compuestos específicos que caen dentro del alcance de fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV(A&B) y XXXX-XXXXIII que son descritas en la especificación, reivindicaciones y figuras en la presente. Se han desarrollado métodos, composiciones, técnicas y estrategias para incorporar específicamente en el sitio aminoácidos no naturales durante la traducción in vivo de proteínas. Al incorporar un aminoácido no natural con una química de cadena lateral que es ortogonal a aquella de los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza, esta tecnología hace posible la derivación especifica en el sitio de proteínas recombinante. Como resultado, una ventaja principal de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias descritos en la presente es que proteínas derivadas pueden ahora ser preparadas como se define productos homogéneos. Sin embargo, los métodos, composiciones, mezclas de reacción, técnicas y estrategias descritos en la presente no están limitados a polipéptidos de aminoácido no naturales formados mediante técnicas de traducción de proteína in vivo, sino que incluye polipéptidos de aminoácido no naturales formados mediante cualquiera técnica, en las que se incluyen a manera de ejemplo solamente ligación de proteínas, síntesis química, técnicas a base de ribozima (véase, por ejemplo, sección en la presente intitulada "Expresión en sistema alternos") . La habilidad de incorporar aminoácidos no naturales a proteínas recombinante expande ampliamente las químicas que pueden ser implementadas para la derivación post-traducción, en donde tal derivación ocurre ya sea in vivo o in vitro. Más específicamente, la derivación de proteína para formar un enlace de oxima sobre una porción de aminoácido no natural de un polipéptido ofrece varias ventajas. En primer lugar, los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza en general no forman enlaces de oxima y así reactivos diseñados para formar enlaces de oxima reaccionarán específicamente en el sitio con el componente de aminoácido no natural del polipéptido (suponiendo por supuesto que el aminoácido no natural y el reactivo correspondiente han sido diseñados para formar un enlace de oxima) , así la habilidad de derivar selectivamente en el sitio proteínas proporciona un producto homogéneo individual en contraposición a las mezclas de proteína derivadas producidas utilizando tecnología del arte previo. En segundo lugar, los aductos de oxima son estables bajo códigos biológicas, sugiriendo que las proteínas derivadas mediante intercambio de oxima son candidatos válidos para aplicaciones terapéuticas. En tercer lugar, la estabilidad del enlace de oxima resultante puede ser manipulada en base a la identidad (esto es, los grupos funcionales y/o estructura) del aminoácido no natural al cual el enlace de oxima ha sido formado. Así, como se muestra en el ejemplo 16, la estabilidad de pH del enlace de oxima a un aminoácido no natural puede variar de menos de una hora a significativamente más de una semana. Así, en algunas modalidades, el enlace de oxima al polipéptido de aminoácido no natural tiene una vida media descomposición menor de una hora, en otras modalidades menor de un día, en otras modalidades menor de 2 días, en otras modalidades menor de 1 semana y en otras modalidades más de 1 semana. En todavía otras modalidades, la oxima resultante es estable por al menos dos semanas bajo condiciones moderadamente acidas, en otras modalidades la oxima resultante es estable por al menos 5 días bajo condiciones moderadamente acidas. En otras modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural es estable por al menos 1 día en un pH entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8; en otras modalidades, de un pH de aproximadamente 2 a aproximadamente 6; en otra modalidad, en un pH de aproximadamente 2 a aproximadamente 4. En otras modalidades, utilizando las estrategias, métodos, composiciones y técnicas descritos en la presente, el experimentado en el arte será apto de sintetizar un enlace de oxima a un polipéptido de aminoácido no natural con una vida media de descomposición ajustada a las necesidades del experimentado en el arte (por ejemplo, para un uso terapéutico tal como liberación sostenida o un uso de diagnóstico o un uso industrial o un uso militar. Los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos anteriormente son útiles para, en los que se incluyen pero no limitados a, nuevos terapéuticos, diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industriales, proteínas de enlace (en las que se incluyen pero no limitadas a, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos) y en los que se incluyen pero no limitados a, el estudio de estructura y función de proteína. Véase, por ejemplo, Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinión in Chemical Biology, 4:645-652. Otros usos para los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos anteriormente incluyen, a manera de ejemplo solamente, usos a base de análisis, cosméticos, biología de plantas, ambientales, producción de energía y/o usos militares. Sin embargo, los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos anteriormente pueden sufrir modificaciones adicionales para incorporar nuevas funcionalidades o funcionalidades modificadas, en las que se incluyen manipulación de la efectividad terapéutica del polipéptido, mejora del perfil de seguridad del polipéptido, ajuste de la farmacocinética, farmacología y/o farmacodinamia del polipéptido (por ejemplo, incrementar la solubilidad en agua, biodisponibilidad, incrementar la vida media en el suero, incrementar la vida media terapéutica, modular la inmunogenicidad, modular la actividad biológica o prolongar el tiempo de circulación) , proporcionar funcionalidad adicional al polipéptido, incorporar una etiqueta, indicador o señal detectable al polipéptido, facilitar las propiedades de aislamiento del polipéptido y cualquier combinación de las modificaciones mencionadas anteriormente. En ciertas modalidades se encuentran métodos para facilitar las propiedades de aislamiento de un polipéptido que comprende utilizar un polipéptido de aminoácido no natural biosintético homólogo que comprende por lo menos un aminoácido no natural seleccionado del grupo que consiste de un aminoácido no natural que contiene oxima, un aminoácido no natural que contiene carbonilo y un aminoácido no natural que contiene hidroxilamina. En otras modalidades, tales aminoácidos no naturales han sido incorporados biosintéticamente a la proteína como se describe en la presente. En demás modalidades o modalidades alternativas tales polipéptidos de aminoácido no naturales comprenden por lo menos un aminoácido no natural seleccionado de los aminoácidos de fórmula I -XVIII, XXX-XXXI V(A&B) O XXXX-XXXXIII . Los métodos, composiciones, estrategias y técnicas descritos en la presente no están limitados a un tipo, clase o familia particular de polipéptidos. Por supuesto, virtualmente cualquier polipéptido puede incluir por lo menos un aminoácido no natural descrito en la presente. A manera de ejemplo solamente, el polipéptido puede ser homólogo a una proteína terapéutica seleccionada del grupo que consiste de: alfa-1 antitripsina, angiostatina, factor antihemolítico, anticuerpo, apolipoproteína, apoproteína, factor natriurético atrial, polipéptido natriurético atrial, péptido atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4 , MIG, calcitonina, ligando de c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína-1 quimioatrayente de monocito, proteína-2 quimioatrayente de monocito, proteína-3 quimioatrayente de monocito, proteína-1 alfa inflamatoria de monocito, proteína-i beta inflamatoria de monocito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCCl , T58847, D31065, T64262, CD40, ligando CD40, ligando de c-kit, colágeno, factor estimulador de colonia (CSF) , factor 5a de complemento, inhibidor de complemento, receptor 1 de complemento, citocina, péptido-78 activador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , péptido activador de neutrófilo epitelial, eritropoyetina (EPO), toxina exfoliante, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor X, factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) , fibrinógeno, fibronectina, proteína de haz de cuatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glucocerebrosidasa, gonadotropina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, grf , proteína de hedgehog, hemoglobina, factor de crecimiento de hepatocito (hGF) , hirudina, hormona de crecimiento humana (hGH) , albúmina de suero humano, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferón (IFN) , IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, interleucina (IL) , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, factor de crecimiento de queratinocito (KGF), lactoferrina, factor inhibidor de leucemia, luciferasa, neurturin, factor inhibidor de neutrófilo (NIF) , oncostatina M, proteína osteogénica, producto oncógeno, paracitonina, hormona paratiroides, PD-ECSF, PDGF, hormona de péptido, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogénica, exotoxina B pirogénica, exotoxina C pirogénica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biosintética pequeña, receptor I de complemento soluble, I-CAM 1 soluble, receptor de interleucina soluble, receptor de TNF soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptocinasa, superantígenos, enterotoxina estafilococal, SEA, SEB, SEC1, SEC2 , SEC3 , SED, SEE, receptor de hormona de esteroides, superóxido dismutasa, toxina de síndrome de choque tóxico, timosina alfa 1, activador de plasminógeno de tejido, factor de crecimiento de tumor (TGF), factor de necrosis de tumor, factor alfa de necrosis de tumor, factor beta de necrosis de tumor, receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR) , proteína VLA-4, proteína VCAM-1, factor de crecimiento entotelial vascular (VEGF) , urocinasa, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, reí, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL y corticosterona . El polipéptido de aminoácido no natural puede también ser homólogo a cualquier miembro de polipéptido de la familia de supergen de hormona de crecimiento. Tales modificaciones incluyen la incorporación de funcionalidad adicional sobre el componente de aminoácido no natural del polipéptido, en los que se incluyen pero no limitados a, un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica; un ligando; una porción fotoisomerizable ; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor ; un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptámero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa y cualquier combinación de los mismos. Además, polipéptidos de aminoácido no naturales pueden contener porciones que pueden ser convertidas a otros grupos funcionales, tales como, a manera de ejemplo solamente, carbonilos, dicarbonilos o hidroxilaminas . La figura 63A ilustra la conversión química de polipéptidos de aminoácido no naturales a polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen carbonilo o dicarbonilo en tanto que la figura 63B ilustra la conversión química de polipéptidos de aminoácido no naturales a polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen hidroxilamina. Los polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen carbonilo o dicarbonilo y polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen hidroxilamina pueden ser usados en o incorporados a cualquiera de los métodos, composiciones, técnicas y estrategias para fabricación, purificación, caracterización y uso de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no naturales y polipéptidos de aminoácido no naturales modificados descritos en la presente. La conversión química de porciones químicas a otros grupos funcionales, tales como, a manera de ejemplo solamente, carbonilos, di-carbonilos o hidroxilaminas se pueden obtener utilizando técnicas y materiales conocidos para aquellos de habilidad en el arte, tal como se describe, por ejemplo, en March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 5th Ed. , (Wiley 2001); y Carey y Sundberg, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4th Ed. , Vols. A y B (Plenum 2000, 2001), (todos los cuales son incorporados en la presente por referencia en su totalidad) . Así, a manera de ejemplo solamente, un polipéptido de aminoácido no natural que contiene cualquiera de los siguientes aminoácidos puede ser modificado adicionalmente utilizando los métodos y composiciones descritos en la presente: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; cada R" es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido o un grupo protector o cuando más de un grupo R" está presente, dos R" forman opcionalmente un heterocicloalquilo; Rx es H, un grupo protector amino, resina; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; o cada uno de los grupos -A-B-J-R forman conjuntamente un cicloalquilo o heterocicloalquilo bicíclico o tricíclico que comprende por lo menos un grupo carbonilo, que incluye un grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, que incluye un grupo dicarbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado, que incluye un grupo dicarbonilo enmascarado; o el grupo -J-R forma conjuntamente un cicloalquilo o heterocicloalquilo monocíclico o bicíclico que comprende por lo menos un grupo carbonilo, que incluye un grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, que incluye un grupo dicarbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado, que incluye un grupo dicarbonilo enmascarado; (b) en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (0) (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, - (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R ó dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R5 es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -(alquileno o alquileno sustituido) -ON(R" ) 2, -(alquileno o alquileno sustituido) -C (O) SR" , -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- (arilo o arilo sustituido), -C(0)R", -C(0)2R" o -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R5 es L-X, en donde X es uno seleccionado del grupo que consiste de una etiqueta; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica; un ligando; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un indicador detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor,- un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptamero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa, y cualquier combinación de los mismos; y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -0-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- ( alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (0) (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(ROC(0)0-, (alquileno o alquileno sustituido) -0-N=CR' - , -(alquileno o alquileno sustituido) -C(0)NR'-, -(alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) -S (O) k- ( alquileno o alquileno sustituido)- S-, -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' ) C (O)N(R' ) - , N(R' )C(S)N(R' ) -, -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N(R' ) C (S)N(R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; K es -NRSR7 ó -N=CR6R7; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R4 ó dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; cada uno de R6 y R7 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido, -C(0)R", -C(0)2R", C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R6 ó R7 es L-X, en donde X es uno seleccionado del grupo que consiste de una etiqueta; un tinte; un polímero,- un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido ,-un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica; un ligando; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un indicador detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor; un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptámero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa, y cualquier combinación de los mismos; y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, S (O) ic (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C (O) -(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N (R' ) C (O)N(R' ) - , -N(R' ) C (S)N(R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; (d) en donde ; A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; Xi es C, S o S (O) ; y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N (R' ) (alquileno sustituido), en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; o (e) en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; en donde (a) indica enlace a los grupos carbonilo respectivos, R3 y R son seleccionados independientemente de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido o R3 y R4 ó dos grupos R3 o dos grupos R4 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; T3 es un bond, C(R) (R) , 0 o S y R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido. En un aspecto de los métodos y composiciones descritos en la presente se encuentran composiciones que incluye por lo menos un polipéptido con por lo menos uno, en los que se incluyen pero no limitados a, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, por lo menos seis, por lo menos siete, por lo menos ocho, por lo menos nueve o por lo menos diez o más aminoácidos no naturales que han sido modificados post-traduccionalmente. Los aminoácidos no naturales modificados post-traduccionalmente pueden ser los mismos o diferentes, en los que se incluyen pero no limitados a, pueden haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más sitios diferentes en el polipéptido que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos no naturales modificados post-traduccionalmente diferentes. En otro aspecto, una composición incluye un polipéptido con por lo menos uno, pero menos de todos, de un aminoácido particular presente en el polipéptido es sustituido con el aminoácido no naturales modificado post-traduccionalmente. Para un polipéptido dado con más de un aminoácido no natural modificados post-traduccionalmente, los aminoácidos no naturales modificados post-traduccionalmente pueden ser idénticos o diferentes. (en los que se incluyen pero no limitados a, el polipéptido puede incluir dos o más tipos diferentes de aminoácidos no naturales modificados post-traduccionalmente o pueden incluir dos de los mismos aminoácidos no naturales modificados post-traduccionalmente) . Para un polipéptido dado con más de dos aminoácidos no naturales modificados post-traduccionalmente, los aminoácidos no naturales modificados post-traduccionalmente pueden ser los mismos, diferentes o una combinación de múltiples aminoácidos no naturales modificados post-traduccionalmente de la misma clase con por lo menos un aminoácido no natural modificado post-traduccionalmente diferente.
A . Métodos para Modificar Post - traduccionalmente Polipéptidos de Aminoácidos No Naturales : Reacciones de Aminoácidos No Naturales que Contienen Carbonilo con Reactivos que Contienen Hidroxilamina Las cadenas laterales de los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza carecen de sitios altamente electrofílicos . Por consiguiente, la incorporación de un aminoácido no natural con una cadena lateral que contiene electrófilo, en los que se incluyen a manera de ejemplo solamente, un aminoácido que contiene un grupo carbonilo o dicarbonilo tales como cetonas o aldehidos, hace posible la derivación especifica en el sitio de esta cadena lateral vía ataque nucleofílico del grupo carbonilo o dicarbonilo. En el caso en donde el nucleófilo atacante es una hidroxilamina, se generará una proteína oxima-derivada. Los métodos para derivar y/o modificar adicionalmente se pueden llevar a cabo con un polipéptido que ha sido purificado antes de la etapa de derivación o después de la etapa de derivación. Además, los métodos para derivar y/o modificar adicionalmente pueden ser conducidos sobre polímeros sintéticos, polisacáridos o polinucleótidos que han sido purificados antes o después de tales modificaciones. Además, la etapa de derivación puede ocurrir bajo condiciones moderadamente acidas a ligeramente básicas, en las que se incluyen a manera de ejemplo entre un pH de aproximadamente 2-8 o entre un pH de aproximadamente 4-8. Un método de derivación de polipéptido a base de la resección de polipéptidos que contienen carbonilo o dicarbonilo con una molécula hidroxilamina-sustituida tiene ventajas distintivas. En primer lugar, las hidroxilaminas sufren condensación con compuestos que contienen carbonilo o dicarbonilo en un intervalo de pH de 2-8 (y en modalidades adicionales en un intervalo de pH de 4-8) para generar aductos de oxima. Bajo estas condiciones, las cadenas laterales de los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza no son reactivas. En segundo lugar, tal química selectiva hace posible la derivación específica del sitio de proteínas recombinantes: proteínas derivadas pueden ahora ser preparadas como productos homogéneos definidos. En tercer lugar, las condiciones moderadas necesarias para efectuar la reacción de las hidroxilaminas descritas en la presente con los polipéptidos que contienen carbonilo o bicarbonilo descritos en la presente en general no destruyen irreversiblemente la estructura terciaria del polipéptido (exceptuando, por supuesto, en donde el propósito de la reacción es destruir tal estructura terciaria) . Finalmente, aunque el grupo amino hidroxilamina parece ser metabolizado por E. coli, la condensación de hidroxilamina con moléculas que contienen carbonilo o dicarbonilo genera aductos de oxima que son estables bajo condiciones biológicas. A manera de ejemplo solamente, los siguientes aminoácidos no naturales son el tipo de aminoácidos que contienen carbonilo o dicarbonilo que son reactivos con los reactivos que contienen hidroxilamina descritos en la presente que pueden ser usados para modificar adicionalmente polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen carbonilo o dicarbonilo: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CS (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; cada R" es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido o un grupo protector o cuando más de un grupo R" está presente, dos R" forman opcionalmente form un heterocicloalquilo; Rx es H, un grupo protector amino, resina; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R4 ó dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; o los grupos -A-B-J-R forman conjuntamente un cicloalquilo o heterocicloalquilo bicíclico o tricíclico que comprende por lo menos un grupo carbonilo, que incluye un grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, que incluye un grupo dicarbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado, que incluye un grupo dicarbonilo enmascarado ,- o el grupo -J-R forma conjuntamente un cicloalquilo monocíclico o bicíclico que comprende por lo menos un grupo carbonilo grupo, que incluye un grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, que incluye un grupo dicarbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado, que incluye un grupo dicarbonilo enmascarado. En ciertas modalidades, compuesto de fórmula (I) son reactivas con hidroxilaminas en solución acuosa bajo condiciones moderadamente acidas. En ciertas modalidades, tales condiciones acidas son pH 2 a 8. A manera de ejemplo solamente, para los propósitos antes mencionados, los compuestos de fórmula (I) incluyen: compuestos que tienen la estructura: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; Xi es C, S o S (O) ; y L es un enlace, alquileno, alquileno sustituido, N (R' ) (alquileno) o N (R' ) (alquileno sustituido) , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. A manera de ejemplo adicional solamente, para los propósitos mencionados anteriormente, los compuestos de fórmula (I) incluyen compuestos que tienen la estructura de fórmula (XXXX) : en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; en donde (a) indica enlace al grupo A y (b) indica enlace a grupos carbonilo respectivos, R3 y R4 son seleccionados independientemente de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido o R3 y R ó dos grupos R3 o dos grupos R4 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; T3 es un bond, C (R) (R) , 0 o S y R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido. Los tipos de polipéptidos que comprenden tales aminoácidos no naturales que contienen carbonilo o dicarbonilo son prácticamente ilimitados, en tanto que el aminoácido no natural que contiene carbonilo o dicarbonilo esté localizado sobre el polipéptido, de tal manera que el reactivo de hidroxilamina pueda reaccionar con el grupo carbonilo o dicarbonilo y crear un aminoácido no natural modificado resultante que destruya la estructura terciaria del polipéptido (a excepción, por supuesto, de si tal destrucción es el propósito de la reacción) . A manera de ejemplo solamente, los siguientes reactivos que contienen hidroxilamina son el tipo de reactivos que contienen hidroxilamina que son reactivos con los aminoácidos no naturales que contienen carbonilo o dicarbonilo descritos en la presente y pueden ser usado para modificar adicionalmente polipéptidos de aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo: en donde : cada X es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, - (alquileno o alquileno sustituido) -ON (R" ) 2 , -(alquileno o alquileno sustituido) -C(0)SR", -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- (arilo o arilo sustituido), -C(0)R", -C(0)2R" o -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o cada X es seleccionado independientemente del grupo que consiste de una etiqueta; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de fotoreticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co- factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactúa covalentemente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica; un ligando; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un indicador detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor; un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptamero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa, y cualquier combinación de los mismos; cada L es seleccionado independientemente del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido) -, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) NR' C (O) 0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -0-C0N(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' ) C (0) 0- , -N(R')C(0)0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S (0) kN (R' ) - , N(R' )C(0)N(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R') - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(S)N(R' ) -, -N (R' ) S (0) kN (R' ) - , -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C(R')2-N(R' ) -N(R' ) -; Li es opcional y cuando está presente, es -C(R')P-NR'-C (0) 0- (alquileno o alquileno sustituido)- en donde p es 0, 1 ó 2; cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; W es -N(R8)2, en donde cada R8 es independientemente H o un grupo protector amino; y n es 1 to 3; a condición de que L-L?-W conjuntamente proporciona por lo menos uno grupo hidroxilamina capaz de reaccionar con un grupo carbonilo (en los que se incluye dicarbonilo) sobre un aminoácido no natural o polipéptido de aminoácido no naturales "modificado o sin modificar" . En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , X es un polímero que comprende alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , X es un polímero que comprende óxido de polialquileno u óxido de polialquileno sustituido. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , X es un polímero que comprende - [ (alquileno o alquileno sustituido) -O- (hidrógeno, alquilo o alquilo sustituido) ] x, en donde X es de 20-10,000. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , X es m-PEG que tiene un peso molecular que fluctúa de 2 a 40 KDa. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , X es un agente biológicamente activo seleccionado del grupo que consiste de un péptido, proteína, enzima, anticuerpo, fármaco, tinte, lípido, nucleósido, oligonucleótido, célula, virus, liposoma, micropartícula y micela. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , X es un fármaco seleccionado del grupo que consiste de un antibiótico, fungicida, agente anti-viral, agente antiinflamatorio, agente anti-tumor, agente cardiovascular, agente anti-ansiedad agente, hormona, factor de crecimiento y agente esferoidal. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , X es a una enzima seleccionada del grupo que consiste de peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa y glucosa oxidasa. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , X es un indicador detectable seleccionado del grupo que consiste de una porción fluorescente, fosforescente, quimioluminiscente, quelante, grupo denso de electrones, magnético, intercalante, radioactiva, cromofórica y porción de transferencia de energía. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , L es seleccionado del grupo que consiste de -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' ) C(0)N(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -O- CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')- y N (R' ) C (O) O- (alquileno o alquileno sustituido)-. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , se encuentran compuestos que tienen la estructura de fórmula (XX) : X L O NH2 (XX). En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XX) , se encuentran compuestos seleccionados del grupo que consiste de: en donde otras modalidades tales como m-PEG o grupos PEG tienen un peso molecular que fluctúa de 5 a 30 kDa. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , se encuentran compuestos que tienen la estructura de fórmula (XXI) : En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XXI) , se encuentran compuestos seleccionados del grupo que consiste de: m-PEG «A m-PEG HW m-PEG ? Y- -PEG U PS T I En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , se encuentran compuestos que tiene la estructura de fórmula (XXII) : poai). En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XXII), L es -(alquileno o alquileno sustituido) -N(R' ) C (O) O-(alquileno o alquileno sustituido) - . En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XXII), se encuentran compuestos que tiene la estructura de fórmula (XXIII) : (xxip). en donde otras modalidades de compuestos de fórmula (XXII) tales como grupos m-PEG tienen un peso molecular que fluctúa de 5 a 30 kDa. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , se encuentran compuestos que tiene la estructura de fórmula (XXIV) : (XXIV).
En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XXIV), L es -(alquileno o alquileno sustituido) -N (R' ) C (O) 0-(alquileno o alquileno sustituido)- o -N (R' ) C (0) 0- (alquileno o alquileno sustituido) - . En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XXIV) , se encuentran compuestos que tiene la estructura de fórmula (XXV) : (XXV). en donde modalidades de los compuestos de fórmula (XXIV) tales grupos m-PEG tienen un peso molecular que fluctúa de 5 a 30 kDa. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , se encuentran compuestos que tienen la estructura de fórmula (XXVI) : (XXVI) en donde cada R?0 es independientemente H o un grupo protector amino. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XXVI) , el óxido de polialquileno es PEG. En otras modalidades de los compuestos de fórmula (XXVI) , el grupo PEG tiene un peso molecular que fluctúa de 5 a 30 kDa. En otra modalidad de compuestos de fórmula (XXVI) es el compuesto correspondiente a: Tres modalidades ilustrativas de métodos para el acoplamiento de una hidroxilamina a un aminoácido no natural que contiene carbonilo sobre un polipéptido son presentadas en la figura 7. En estas modalidades ilustrativas, un reactivo hidroxilamina-derivado es agregado a una solución de pH regulado (pH 2-8) de un polipéptido de aminoácido no natural que contiene carbonilo. La reacción proceeds a temperatura ambiente por horas a días. Para acelerar la conjugación, aditivos tales como aquellos presentados en la figura 8 son agregados; tales compuestos son también conocidos en la presente como acelerantes. En ciertas modalidades, los acelerantes o aditivos son aptos de catálisis por base. El polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima resultante es purificado mediante HPLC, FPLC o cromatografía de exclusión de tamaño. En una modalidad, químicas de múltiple enlazador pueden reaccionar específicamente en el sitio con un polipéptido de aminoácido no natural carbonilo- o dicarbonilo-sustituido. En una modalidad, los métodos de enlazador descritos en la presente utilizan enlazadores que contienen la funcionalidad hidroxilamina sobre por lo menos un término de enlazador (mono-, bi- o multifuncional) . La condensación de un enlazador hidroxilamina-derivado con una proteína ceto-sustituida genera un enlace de oxima estable. Los enlazadores bi- y/o multi-funcionales (por ejemplo, hidroxilamina con una, o más, otras químicas enlazantes) permite la conexión específica del sitio de diferentes moléculas (por ejemplo, otras proteínas, polímeros o moléculas pequeñas) al polipéptido de aminoácido no natural, en tanto que los enlazadores mono-funcionales (hidroxilamina-sustituidos sobre todos los términos) facilitan la dímero- u oligomerización específica del sitio del polipéptido de aminoácido no natural. Al combinar esta estrategia de enlazador con la tecnología de traducción in vivo descrita en la presente, se hace posible especificar las estructuras tridimensionales de proteínas elaboradas químicamente . En ciertas modalidades se encuentran métodos para derivar un polipéptido que comprende aminoácidos de fórmulas I-XVIII, XXX-XXXIV (A&B) o XXXX-XXXXIII , en las que se incluyen cualquier sub- fórmulas o compuestos específicos que caen dentro del alcance de fórmulas I -XVIII, XXX-XXXIV (A&B) o XXXX-XXXXIII , en donde el método comprende poner en contacto el polipéptido que comprende por lo menos un aminoácido de fórmulas I-XVIII, XXX- XXXIV (A&B) o XXXX-XXXXIII con un reactivo de fórmula (XIX) . En ciertas modalidades el polipéptido es purificado antes de o después de contacto con el reactivo de fórmula (XIX). En otras modalidades, se encuentran polipéptidos derivados resultantes que comprenden por lo menos un aminoácido que contiene oxima correspondiente a la fórmula (XI) , en tanto que en otras modalidades tales polipéptidos derivados son estables en solución acuosa por al menos 1 mes bajo condiciones moderadamente acidas. En otras modalidades tales polipéptidos derivados son por al menos 2 semanas bajo condiciones moderadamente acidas. En otras modalidades tales polipéptidos derivados son estables por al menos 5 días bajo condiciones moderadamente acidas. En otras modalidades tales condiciones son pH 2 a 8. En ciertas modalidades la estructura terciaria del polipéptido derivado es preservada. En otras modalidades tal derivación de los polipéptidos comprende .además ligar el polipéptido derivado a otro polipéptido. En otras modalidades tales polipéptidos que son derivados son homólogos a una proteína terapéutica seleccionada del grupo que consiste de: alfa-1 antitripsina, angiostatina, factor antihemolítico, anticuerpo, apolipoproteína, apoproteína, factor natriurético atrial, polipéptido natriurético atrial, péptido atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4 , MIG, calcitonina, ligando de c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína-1 quimioatrayente de monocito, proteína-1 quimioatrayente de monocito, proteína-3 quimioatrayente de monocito, proteína-1 alfa inflamatoria de monocito, proteína-1 beta inflamatoria de monocito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligando CD40, ligando de c-kit, colágeno, factor estimulador de colonia (CSF) , factor de complemento 5a, inhibidor de complemento, receptor de complemento 1, citocina, péptido-78 activador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , péptido activador de neutrófilo epitelial, eritropoyetina (EPO), toxina exfoliante, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor X, factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) , fibrinógeno, fibronectina, proteína de haz de cuatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glucocerebrosidasa, gonadotropina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, grf, proteína de hedgehog, hemoglobina, factor de crecimiento de hepatocito (hGF) , hirudina, hormona de crecimiento humana (hGH) , albúmina de suero humano, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferón (IFN) , IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, interleucina (IL) , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, factor de crecimiento de queratinocito (KGF), lactoferrina, factor inhibidor de leucemia, luciferasa, neurturin, factor inhibidor de neutrófilo (NIF) , oncostatina M, proteína osteogénica, producto oncógeno, paracitonina, hormona paratiroides, PD-ECSF, PDGF, hormona de péptido, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogénica, exotoxina B pirogénica, exotoxina C pirogénica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biosintética pequeña, receptor I de complemento soluble, I-CAM 1 soluble, receptor de interleucina soluble, receptor de TNF soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptocinasa, superantígenos, enterotoxina estafilococal, SEA, SEB, SEC1, SEC2 , SEC3 , SED, SEE, receptor de hormona de esteroides, superóxido dismutasa, toxina de síndrome de choque tóxico, timosina alfa 1, activador de plasminógeno de tejido, factor de crecimiento de tumor (TGF), factor de necrosis de tumor, factor alfa de necrosis de tumor, factor beta de necrosis de tumor, receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR) , proteína VLA-4, proteína VCAM-1, factor de crecimiento entotelial vascular (VEGF) , urocinasa, mos, ras, raf, met, p53 , tat, fos, myc, jun, myb, reí, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL y corticosterona . En ciertas modalidades se encuentran métodos para producir un dímero de polipéptido, en donde el método comprende : (i) derivar un primer polipéptido que comprende un aminoácido de fórmula (I) con un reactivo de fórmula (XXVI) , y (ii) poner en contacto la proteína derivada resultante de la etapa (i) con una segunda proteína que comprende un aminoácido de fórmula (I) , formando mediante esto un dímero que comprende el primer polipéptido y el segundo polipéptido. En otras modalidades, se encuentran métodos para producir un dímero de polipéptido, en donde el primer polipéptido y el segundo polipéptido comprenden un aminoácido de correspondiente a fórmula (II) . En ciertas modalidades los polipéptidos son purificados antes de o después del contacto con el reactivo de fórmula (XXVI) . En otras modalidades la proteína derivada resultante de la etapa (i) comprende por lo menos un aminoácido que contiene oxima correspondiente a fórmula (XXVIII) : óxido de polialquileno u cocido de polialquileno sustituido) /J™&l (xxvm).
B . Métodos para Modificar Post - traduccionalmente Polipéptidos de Aminoácido No Naturales : Reacciones de Aminoácidos no Naturales gue contienen Oxima con Reactivos que Contienen Carbonilo Un método de derivación de proteína a base de la reacción de intercambio de una proteína que contiene oxima con una molécula carbonilo- o dicarbonilo-sustituida tiene ventajas distintivas. En primer lugar, los estudios indican que los aductos de oxima a base de aminoácido sufren intercambio de oxima mediante el equilibrio con un compuesto que contiene carbonilo- o dicarbonilo más reactivo que el usado para generar la oxima original. Esta reacción de intercambio ocurre en un intervalo de pH de 4-8: bajo estas condiciones, las cadenas laterales de los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza, son no reactivas. Así, un método general para la preparación de moléculas carbonilo- o dicarbonilo-sustituidas apropiadas para reacción con proteínas que contienen oxima pueden proporcionar acceso a una amplia variedad de proteínas derivadas específicamente en el sitio. En el contexto de esta tecnología de traducción in vivo, un método general para preparar versiones carbonilo- o dicarbonilo-sustituidas de aquella molécula que son usadas comúnmente para derivar proteínas (en las que se incluyen a manera de ejemplo solamente, polímeros hidrofílicos tales como polietilenglicol) son valiosos y proporcionarán acceso a una amplia variedad de polipéptidos de aminoácido no naturales derivados específicamente en el sitio. En segundo lugar, tal química selectiva hace posible la derivación específica del sitio de proteínas recombinantes: proteínas derivadas pueden ahora ser preparadas como productos homogéneos definidos. En tercer lugar, las condiciones moderadas necesarias para efectuar las reacciones de intercambio descritas en la presente en general no destruyen irreversiblemente la estructura terciaria del polipéptido (exceptuando, por supuesto, en donde el propósito de la reacción es destruir tal estructura terciaria) . Finalmente, las reacciones de intercambio generan nuevos aductos de oxima que son estables bajo condiciones biológicas. A manera de ejemplo solamente, los siguientes aminoácidos no naturales son el tipo de aminoácidos que contienen oxima que son reactivos con los reactivos que contienen carbonilo- o dicarbonilo- descritos en la presente que pueden ser usados para crear nuevos polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen oxima: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)?N(R' ) -, -N (R' ) C (0) N (R' ) - , -N(R' ) C (S)N(R' ) - , -N(R' )S(0) N(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N- (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R4 ó dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R5 es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -(alquileno o alquileno sustituido) -ON (R" ) 2, -(alquileno o alquileno sustituido) -C (O) SR" , -(alquileno o alquileno sustituido)- S-S- (arilo o arilo sustituido), -C(0)R", -C(0)2R" o -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R5 es L-X, en donde X es seleccionado del grupo que consiste de una etiqueta; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica; un ligando; una porción fotoisomerizable ; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un indicador detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor ; un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptámero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa, y cualquier combinación de los mismos; y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido) - , -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, - (R' ) C (0) 0- , (alquileno o alquileno sustituido) -0-N=CR' - , -(alquileno o alquileno sustituido) -C (0) NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) -S (0) k- ( alquileno o alquileno sustituido)- S-, -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' ) C (O)N(R' ) - , N(R' )C(S)N(R' ) -, -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C (R' ) =N- , C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. A manera de ejemplo solamente, los siguientes aminoácidos no naturales son también el tipo de aminoácidos que contienen oxima que son reactivos con los reactivos que contienen carbonilo- o dicarbonilo- descritos en la presente que pueden ser usado para crear nuevos polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen oxima: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CO (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0) N(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R4 ó dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; cada uno de R6 y R7 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido, -C(0)R", -C(0)2R", C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R6 0 R7 es L-X, en donde X es un seleccionado del grupo que consiste de una etiqueta; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua un derivado de polietilenglicol; un agente de fotoreticulación un compuesto citotóxico; un fármaco; una etiqueta de afinidad a etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica; un ligando; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un indicador detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor; un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptamero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa, y cualquier combinación de los mismos; y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- ( alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, - CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R0C(0)0-, -(alquileno o alquileno sustituido) -0-N=CR' - , (alquileno o alquileno sustituido) -C(0)NR'-, -(alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) -S(0)k-( alquileno o alquileno sustituido)- S-, -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- , -S (O) kN (R' ) - , -N(R' ) C (O)N(R' ) - , -N(R' )C(S)N(R' ) -, -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2~ (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. A manera de ejemplo solamente, los siguientes reactivos que contienen carbonilo o dicarbonilo son el tipo de reactivos que contienen carbonilo o dicarbonilo que son reactivos con los aminoácidos no naturales que contienen oxima descritos en la presente que pueden ser usados para efectuar reacciones de intercambio para formar nuevos enlaces de oxima y así modificar los polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen oxima: en donde : cada X es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, - (alquileno o alquileno sustituido) -0N(R" ) 2 , -(alquileno o alquileno sustituido) -C(0)SR", -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- (arilo o arilo sustituido), -C(0)R", -C(0)2R" o -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o cada X es seleccionado independientemente del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un DNA; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica; un ligando; una porción fotoisomerizable,• biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un indicador detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor; un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptámero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa, y cualquier combinación de los mismos; cada L es seleccionado independientemente del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, S(0)k- en donde k es 1 , 2 ó 3, -S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido) -, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) NR' C (O) O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -0-C0N(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) C (O) O- , -N(R')C(0)0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S (0) kN (R' ) - , N(R' )C(0)N(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(S)N(R' ) -, -N (R' ) S (0) N (R' ) - , -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C(R')2-N(R' ) -N(R' ) -; Li es opcional y cuando está presente, es -C(R')P-NR'-C (O) O- (alquileno o alquileno sustituido)- en donde p es 0, 1 ó 2; cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; W es -C(=0)R9, en donde R9 es H o OR' ; y n es 1 a 3 ; o en donde L-Li-W forma conjuntamente un cicloalquilo o heterocicloalquilo monocíclico o bicíclico que comprende por lo menos un grupo carbonilo, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo enmascarado; a condición de que L-Li-W conjuntamente proporcione por lo menos un grupo carbonilo (en los que se incluyen un grupo dicarbonilo) apto de sufrir una reacción de intercambio de oxima con un grupo oxima sobre un aminoácido no natural o un polipéptido de aminoácido no natural "modificado o sin modificar" . Dos modalidades ilustrativas de métodos para efectuar una reacción de intercambio de oxima entre un aminoácido que contiene oxima sobre un polipéptido y un reactivo que contiene carbonilo son presentadas en la figura 9. En estas modalidades ilustrativas, un reactivo que contiene carbonilo es agregado a una solución de pH regulado (pH 2-8) de un polipéptido de aminoácido no naturales que contiene oxima. La reacción procede a temperatura ambiente durante horas a días. El polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima modificado es purificado mediante HPLC, FPLC o cromatografía de exclusión de tamaño . En una modalidad, las químicas de múltiple enlazador pueden reaccionar específicamente en el sitio con un polipéptido de aminoácido no natural oxima-sustituido. En una modalidad, los métodos de enlazador descritos en la presente utilizan enlazadores que contienen la funcionalidad carbonilo o dicarbonilo sobre por lo menos un término de enlazador (mono-, bi- o multi-funcional) . La condensación de un enlazado carbonilo- o dicarbonilo-derivado con un polipéptido de aminoácido no notar oxima-sustituido genera un nuevo enlace de oxima estable. Enlazadores bi- y/o multi-funcionales (por ejemplo, carbonilo o dicarbonilo con una o más, de otras químicas enlazantes) permiten la conexión específica del sitio de diferentes moléculas (por ejemplo, otras proteínas, polímeros o moléculas pequeñas) al polipéptido de aminoácido no natural, en tanto que los enlazadores mono- funcionales (carbonilo- o dicarbonilo-sustituidos en todos los términos) facilitan la dimer- u oligomerización específica del sitio del polipéptido de aminoácido no natural. Al combinar esta estrategia de enlazador la tecnología de traducción in vivo descrita en la presente, se hace posible especificar las estructuras tridimensionales de proteínas elaboradas químicamente.
C. Métodos para Modificar Post-traduccionalmente Polipéptidos de Aminoácido no Naturales: Reacciones de Aminoácidos no Naturales que Contienen Hidroxilamina con Reactivos que Contienen Carbonilo Las técnicas de modificación post-traducción y composiciones descritas anteriormente pueden también ser usados con aminoácidos no naturales que contienen hidroxilamina que reaccionan con reactivos que contienen carbonilo o dicarbonilo para producir polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen oxima modificados. Un método de derivación de proteína a base de la reacción de una proteína que contiene hidroxilamina con una molécula carbonilo- o dicarbonilo-sustituida tiene ventajas distintivas. En primer lugar, las hidroxilaminas sufren condensación con compuestos que contienen carbonilo o dicarbonilo en un intervalo de pH de 4-8 para generar aductos de oxima. Bajo estas condiciones, las cadenas laterales de los aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza no son reactivos. En segundo lugar, tal química selectiva hace posible la derivación específica del sitio de proteínas recombinantes: proteínas derivadas pueden ahora ser preparadas como productos homogéneos definido. En tercer lugar, las condiciones moderadas necesarias para efectuar la reacción de los reactivos que contienen carbonilo o dicarbonilo descritos en la presente con los polipéptidos que contienen hidroxilamina descritos en la presente en general no destruyen irreversiblemente la estructura terciaria del polipéptido (exceptuando, por supuesto, en donde el propósito de la reacción es destruir tal estructura terciaria) . Finalmente, aunque el grupo amino de hidroxilamina parece ser metabolizado por E. coli, la condensación de reactivos que contienen carbonilo o dicarbonilo con aminoácidos que contienen hidroxilamina genera aductos de oxima que son estables bajo condiciones biológicas. A manera de ejemplo solamente, los siguientes aminoácidos no naturales son el tipo de aminoácidos que contienen hidroxilamina que son reactivos con los reactivos que contiene carbonilo o dicarbonilo descritos en la presente que pueden ser usados para modificar polipéptidos de aminoácidos no naturales que contienen hidroxilamina: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, - (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S (0)kN(R' ) -, -N(R0C(0)N(R' ) -, -N (R) C (S) N (R) - , -N(R0S(0)?N(R0-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (RO- , - C(R0=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; K es -NR6R7 ó -N=CRSR7; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R4 ó dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo. En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIV) K es NH2. Los tipos de polipéptidos que comprenden tales aminoácidos no naturales que contienen hidroxilamina son prácticamente ilimitados en tanto que el aminoácido no natural que contiene hidroxilamina está localizado sobre el polipéptido, de tal manera que el reactivo que contiene carbonilo o dicarbonilo pueda reaccionar con el grupo hidroxilamina y no crear un aminoácido no natural modificado resultante que destruye la estructura terciaria del polipéptido (exceptuando, por supuesto, si tal destrucción es el propósito de la reacción) . A manera de ejemplo solamente, los siguientes reactivos que contienen carbonilo o dicarbonilo son del tipo de reactivos que contienen carbonilo o dicarbonilo que son reactivos con el aminoácido no natural que contiene hidroxilamina descrito en la presente y pueden ser usados para modificar polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen hidroxilamina . en donde : cada X es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, - (alquileno o alquileno sustituido) -ON(R" ) 2 , -(alquileno o alquileno sustituido) -C(0)SR", -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- (arilo o arilo sustituido), -C(0)R", -C(0)2R" o -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o cada X es seleccionado independientemente del grupo que consiste de una etiqueta; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de fotoreticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica; un ligando; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un indicador detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor; un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptámero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa, y cualquier combinación de los mismos ; cada L es seleccionado independientemente del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido) -, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) NR' C (O) O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -0-C0N(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) C (O) 0- , -N(R')C(0)0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S (O) kN (R' ) - , N(R' )C(0)N(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(S)N(R' ) -, -N (R' ) S (O) kN (R' ) - , -N(R')-N=, - C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- y -C(R')2-N(R' ) -N(R' ) -; Li es opcional y cuando está presente, es -C(R')P-NR'-C (0) 0- (alquileno o alquileno sustituido)- en donde p es 0, 1 ó 2; cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; W es -J-R, en donde J es R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; cada R" es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido o un grupo protector o cuando más de un grupo R" está presente, dos R" forman opcionalmente un heterocicloalquilo; y n es 1 a 3 ; a condición de que L-Lx-W conjuntamente proporcione por lo menos un grupo carbonilo (que incluye un grupo dicarbonilo) capaz de reaccionar con un grupo hidroxilamina sobre un aminoácido no natural o un polipéptido de aminoácido no natural "modificado o sin modificar" . En ciertas modalidades de los compuestos de fórmula (XIX) , se encuentran compuestos que tienen la estructura de fórmula (XXI) : (XXI).
Una modalidad ilustrativa de métodos para el acoplamiento un reactivo que contiene carbonilo a un aminoácido no natural que contiene hidroxilamina sobre un polipéptido es presentado en la figura 10. En esta modalidad ilustrativa, un reactivo derivado de carbonilo es agregado a una solución de pH regulado (pH 2-8) de un polipéptido de aminoácido no natural que contiene hidroxilamina. La reacción procede a temperatura ambiente por horas a días. Para acelerar la conjugación, aditivos tales como aquellos presentados en La figura 8 son agregados. El polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima resultante es purificado mediante HPLC, FPLC o cromatografía de exclusión de tamaño. En una modalidad, químicas de múltiple enlazador pueden reaccionar específicamente en el sitio con un polipéptido de aminoácido no natural hidroxilamina-sustituido . En una modalidad, los métodos de enlazador descritos en la presente utilizan enlazadores que contienen la funcionalidad carbonilo o dicarbonilo sobre por lo menos un término de enlazador (mono, bi- o multifuncional) . La condensación de un enlazador carbonilo- o dicarbonilo-derivado con una proteína hidroxilamina-sustituida genera un enlace de oxima estable. Enlazadores bi- y/o multi-funcionales (por ejemplo, carbonilo o dicarbonilo con una o más de otras químicas de enlazador) permiten la conexión específica al sitio de diferentes moléculas (por ejemplo, otras proteínas, polímeros o moléculas pequeñas) al polipéptido de aminoácido no natural, en tanto que los enlazadores mono-funcionales (carbonilo- o dicarbonilo-sustituidos sobre todos los términos) facilita la dímero- u oligomerización específica en el sitio del polipéptido de aminoácido no natural. Al combinar esta estrategia de enlazador la tecnología de traducción in vivo descrito en la presente, se hace posible especificar las estructuras tridimensionales de proteínas elaboradas químicamente. En ciertas modalidades se encuentran métodos para derivar un polipéptido que comprende aminoácidos de fórmulas XIV-XVI, en las que se incluyen cualesquier sub-fórmulas o compuestos específicos que caen dentro del alcance de fórmulas XIV-XVI , en donde el método comprende poner en contacto el polipéptido que comprende por lo menos un aminoácido de fórmula XIV-XVI con un reactivo de fórmula (XIX) . En ciertas modalidades el polipéptido es purificado antes de o después del contacto del reactivo de fórmula (XIX) . En otras modalidades se encuentran polipéptidos derivados resultantes que comprenden por lo menos un aminoácido que contiene oxima correspondiente a la fórmula (XXIX) , (XXIX) en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido) -, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, - (R' ) C (O) O- , S(0)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R') -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; L es un enlazador independientemente seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, - S(0)k en donde k es 1, 2 ó 3, -S (0) (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (0) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido) -, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, (alquileno o alquileno sustituido) NR' C (0) 0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -0-C0N (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -N(R' )C (O) O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)kN(R')-, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (O) N (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' ) C (S)N(R' ) - , -N (R' ) S (O) N (R' ) - , -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N= -C(R')2-N=N-y -C (R' ) 2-N(R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional y cuando está presente es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido; y X es independientemente un marcador detectable, agente biológicamente activo o polímero. En otras modalidades tales polipéptidos derivados son estables en solución acuosa por al menos 1 mes bajo condiciones moderadamente acidas. En otras modalidades tales polipéptidos derivados son estables por al menos 2 semanas bajo condiciones moderadamente acidas. En otras modalidades tales polipéptidos derivados son estables por al menos 5 días bajo condiciones moderadamente acidas. En otras modalidades tales condiciones son pH 2 a 8. En ciertas modalidades la estructura terciaria el polipéptido derivado es preservada. En otras modalidades tal derivación de polipéptido comprende además ligar el polipéptido derivado a otro polipéptido. En otras modalidades tales polipéptidos que son derivados son homólogos a una proteína terapéutica seleccionada del grupo que consiste de: alfa-1 antitripsina, angiostatina, factor antihemolítico, anticuerpo, apolipoproteína, apoproteína, factor natriurético atrial, polipéptido natriurético atrial, péptido atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4 , MIG, calcitonina, ligando de c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína- 1 quimioatrayente de monocito, proteína-2 quimioatrayente de monocito, proteína 3 quimioatrayente de monocito, proteína-1 alfa inflamatoria de monocito, proteína- i beta inflamatoria de monocito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCCl , T58847, D31065, T64262, CD40, ligando CD40, ligando de c-kit, colágeno, factor estimulador de colonia (CSF) , factor de complemento 5a, inhibidor de complemento, receptor de complemento 1, citocina, péptido- 78 activador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , péptido activador de neutrófilo epitelial, eritropoyetina (EPO), toxina exfoliante, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor X, factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) , fibrinógeno, fibronectina, proteína de haz de cuatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glucocerebrosidasa, gonadotropina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, grf , proteína de hedgehog, hemoglobina, factor de crecimiento de hepatocito (hGF) , hirudina, hormona de crecimiento humana (hGH) , albúmina de suero humano, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferón (IFN) , IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, interleucina (IL) , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL- 10, IL-11, IL-12, factor de crecimiento de queratinocito (KGF), lactoferrina, factor inhibidor de leucemia, luciferasa, neurturin, factor inhibidor de neutrófilo (NIF) , oncostatina M, proteína osteogénica, producto oncógeno, paracitonina, hormona paratiroides, PD-ECSF, PDGF, hormona de péptido, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogénica, exotoxina B pirogénica, exotoxina C pirogénica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biosintética pequeña, receptor I de complemento soluble, I-CAM 1 soluble, receptor de interleucina soluble, receptor de TNF soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptocinasa, superantígenos, enterotoxina estafilococal, SEA, SEB, SEC1, SEC2 , SEC3 , SED, SEE, receptor de hormona de esteroides, superóxido dismutasa, toxina de síndrome de choque tóxico, timosina alfa 1, activador de plasminógeno de tejido, factor de crecimiento de tumor (TGF), factor de necrosis de tumor, factor alfa de necrosis de tumor, factor beta de necrosis de tumor, receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR) , proteína VLA-4, proteína VCAM-1, factor de crecimiento entotelial vascular (VEGF) , urocinasa, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, reí, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL y corticosterona .
D. Ejemplos de Adición de Funcionalidad: Polímeros Macromoleculares Acoplados a Polipéptidos de Aminoácido No Naturales Varias modificaciones a los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente pueden ser efectuadas usando las composiciones, métodos, técnicas y estrategias descritos en la presente. Estas modificaciones incluyen la incorporación de funcionalidad adicional sobre el componente de aminoácido no natural del polipéptido, en los que se incluyen pero no limitados a, un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de fotoreticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica,- un ligando; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un marcador detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor; un radiotransmisor; una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un agíican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptamero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa, y cualquier combinación de los mismos. Como ejemplo ilustrativo no limitante de las composiciones, métodos, técnicas y estrategias descritos en la presente, la siguiente descripción se enfocará en la adición de polímeros macromoleculares a polipéptidos de aminoácido no naturales con el entendimiento de que las composiciones, métodos, técnicas y estrategias descritas son también aplicables (con modificaciones apropiadas, si es necesario y para los cuales el experimentado en el arte haría con las revelaciones descritas en la presente) para agregar otras funcionalidades, en las que se incluyen pero no limitadas a aquellas enlistadas anteriormente.
Una amplia variedad de polímeros macromoleculares y otras moléculas pueden ser acoplados a los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente para modular propiedades biológicas del polipéptido de aminoácido no natural (o el polipéptido de aminoácido natural correspondiente) y/o proporcionar nuevas propiedades biológicas al polipéptido de aminoácido no natural (o el correspondiente polipéptido de aminoácido natural) . Estos polímeros macromoleculares pueden ser acoplados al polipéptido de aminoácido no natural vía el aminoácido no natural o cualquier sustituyente funcional del aminoácido no natural o cualquier sustituyente o grupo funcional agregado al aminoácido no natural . Polímeros solubles en agua pueden ser acoplados a los aminoácidos no naturales incorporados a polipéptidos (naturales o sintéticos) , polinucleótidos, polisacáridos o polímeros sintéticos descritos en la presente. Los polímeros solubles en agua pueden ser acoplados vía un aminoácido no natural incorporado en el polipéptido o cualquier grupo funcional o sustituyente de un aminoácido no natural o cualquier grupo funcional o sustituyente agregado a un aminoácido no natural. En algunos casos, los polipéptidos de aminoácido no natural descritos en la presente comprenden uno o más aminoácido (s) no natural (es) acoplado (s) a polímeros solubles en agua y uno o más aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza enlazados a polímeros solubles en agua. La anexión covalente de polímeros hidrofílicos a una molécula biológicamente activa representa un procedimiento para incrementar la solubilidad en agua (tal como en un ambiente fisiológico) , biodisponibilidad, incrementar la vida media en el suero, incrementar la vida media terapéutica, modular la inmunogenicidad, modular la actividad biológica o prolongar el tiempo de circulación de la molécula biológicamente activa, en las que se incluyen proteínas, péptidos y moléculas particularmente hidrofóbicas. Aspectos importantes adicionales de tales polímeros hidrofílicos incluyen biocompatibilidad, carencia de toxicidad y carencia de inmunogenicidad. Preferiblemente, para uso terapéutico de la preparación de producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de polímeros hidrofílicos incluyen, pero no están limitados a: polialquil éteres y análogos alcoxi-coronados de los mismos (por ejemplo, polioxietilenglicol , polioxietilen/propilenglicol y análogos de metoxi o etoxi-coronados de los mismos, especialmente polioxietilenglicol, el último es también conocido como polietilenglicol o PEG) ; polivinilpirrolidonas; polivinilalquil éteres; polioxazolinas, polialquil oxazolinas y polihidroxialquil oxazolinas; poliacrilamidas, polialquil acrilamidas y polihidroxialquil acrilamidas (por ejemplo, polhidroxipropilmetacrilamida y derivados de las mismas) ; polihidroxialquil acrilatos; ácidos polisiálicos y análogos de los mismos; secuencias de péptido hidrofílicas; polisacáridos y sus derivados, en los que se incluyen dextrana y derivados de dextrana, por ejemplo, carboximetildextrana, sulfatos de dextrana, aminodextrana; celulosa y sus derivados, por ejemplo, carboximetil celulosa, hidroxialquil celulosas; quitina y sus derivados, por ejemplo, quitosana, succinil quitosana, carboximetilquitina, carboximetilquitosana; ácido hialurónico y sus derivados; almidones; alginatos; sulfato de condroitina; albúmina; pululana y carboximetil pululana; poliaminoácidos y derivados de los mismos, por ejemplo, ácidos poliglutámicos, polilisinas, ácidos poliaspárticos, poliaspartamidas ; copolímeros de anhídrido maleico tales como: copolímero de anhídrido maleico estireno, copolímero de anhídrido maleico divinil éter; alcoholes polivinílieos ; copolímeros de los mismos; terpolímeros de los mismos; mezclas de los mismos; y derivados de los anteriores. El polímero soluble en agua puede ser cualquier forma estructural en los que se incluyen pero no limitados a lineal, en horquilla o ramificados. En algunas modalidades, las cadenas fundamentales de polímero que son solubles en agua, con de 2 a 300 términos, son particularmente útiles. Derivados de polímero multifuncionales incluyen, pero no están limitados a, polímeros lineales que tienen dos términos, cada término es enlazado a un grupo funcional que puede ser el mismo o diferente. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende una porción de poli (etilenglicol) . El peso molecular del polímero puede ser de un amplio intervalo, en los que se incluyen pero no limitados a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del polímero puede ser de entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, en los que se incluyen pero no limitados a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, la molécula de poli (etilenglicol) es un polímero ramificado. El peso molecular del PEG de cadena ramificada puede ser de entre aproximadamente 1,000 Da y aproximadamente 100,000 Da, en los que se incluyen pero no limitados a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da y 1,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 1,000 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 5,000 Da y 20,000 Da. Aquellos de habilidad ordinaria en el arte reconocerán que la lista anterior para cadenas fundamentales sustancialmente solubles en agua no se propone de ninguna manera ser exhaustiva y es solamente ilustrativa y que todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades descritas anteriormente son contemplados como apropiados para uso en los métodos y composiciones descritos en la presente. Como se describe anteriormente, un ejemplo de un polímero hidrofílico es poli (etilenglicol) , abreviado PEG, que ha sido usado extensamente en farmacéuticos, en implantes artificiales y en otras aplicaciones en donde la biocompatibilidad, carencia de toxicidad y carencia de inmunogenicidad son de importancia. Las modalidades de polímero: polipéptido descritos en la presente usará PEG como un polímero hidrofílico ejemplar con el entendimiento de que otros polímeros hidrofílicos pueden ser utilizados similarmente en tales modalidades. El PEG es un polímero soluble en agua bien conocido que está disponible comercialmente o puede ser preparado mediante polimerización de apertura de anillo de etilenglicol de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte (Sandler y Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, páginas 138-161) . El PEG es comúnmente claro, incoloro, inodoro, soluble en agua, estable al calor, inerte a muchos agentes químicos, no se hidroliza o deteriora y es en general no tóxico. Se considera que poli (etilenglicol) es biocompatible, es decir que el PEG es capaz de coexistencia con tejidos vivientes u organismos sin provocar daños. Más específicamente, PEG es sustancialmente no inmunogénico, es decir que el PEG no tiende a producir una respuesta inmune en el cuerpo. Cuando es anexado a una molécula que tiene alguna función deseable en el cuerpo, tal como un agente biológicamente activo, el PEG tiende a enmascarar el agente y puede reducir o eliminar cualquier respuesta inmune de tal manera que un organismo puede tolerar la presencia del agente. Los conjugados de PEG tienden a no producir una respuesta inmune sustancial o provocar coagulación u otros efectos indeseables.
El término "PEG" es usado ampliamente para abarcar cualquier molécula de polietilenglicol, sin consideración del tamaño o modificación a un extremo del PEG y puede ser representado como enlazado a un polipéptido de aminoácido no natural por la fórmula: XO- (CH2CH20)n-CH2CH2-Y en donde n es 2 a 10,000 y X es H o una modificación terminal, en las que se incluyen pero no limitadas a, un C?-4 alquilo, un grupo protector o un grupo funcional terminal. El término PEG incluye, pero no está limitado a, poli (etilenglicol) en cualquiera de su formas, en las que se incluyen PEG bifuncional, PEG de múltiples brazos, PEG derivado, PEG en horquilla, PEG ramificado (con cada cadena que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 50 kDa o de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 20 kDa), el PEG pendiente (esto es, PEG o polímeros relacionados que tienen uno o más grupos funcionales pendientes a la cadena fundamental del polímero) o PEG con enlaces degradables en el mismo. En una modalidad, PEG en el cual n es de aproximadamente 20 a aproximadamente 2000 es apropiado para uso en los métodos y composiciones descritos en la presente. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende una porción de poli (etilenglicol) . El peso molecular del polímero de PEG puede ser de un amplio intervalo, en los que se incluyen pero no limitados a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del polímero de PEG puede ser de entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, en los que se incluyen pero no limitados a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, la molécula de poli (etilenglicol) es un polímero ramificado. El peso molecular del PEG de cadena ramificada puede ser de entre aproximadamente 1,000 Da y aproximadamente 100,000 Da, en los que se incluyen pero no limitados a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da y 1,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 1,000 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 5,000 Da y 20,000 Da. Un amplio intervalo de moléculas de PEG son descritas en, en los que se incluyen pero no limitados a, the Shearwater Polymers, Inc. catalog, catálogo Nektar Therapeutics, incorporado en la presente por referencia. Ejemplos específicos de grupos funcionales terminales en la literatura incluyen, pero no están limitados a, carbonato de N-succinimidilo (véase por ejemplo, patentes estadounidenses Nos. 5,281,698, 5,468,478), amina (véase, por ejemplo, Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), hidrazida (Véase, por ejemplo, Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), propionato de succinimidilo y butanoato de succinimidilo (véase, por ejemplo, Olson et al. en Poly (ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D. C, 1997; véase también patente estadounidense No. 5,672,662), succinato de succinimidilo (Véase, por ejemplo, Abuchowski et al. Cáncer Biochem. Biophys . 7:175 (1984) y Joppich et al. Makromol. Chem. 180:1381 (1979), éster de succinimidilo (véase, por ejemplo, patente estadounidense No. 4,670,417), carbonato de benzotriazol (véase, por ejemplo, patente estadounidense No. 5,650,234), glicidil éter (véase, por ejemplo, Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonilimidazol (véase, por ejemplo, Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Reléase 1:251 (1985)), carbonato de p-nitrofenilo (véase, por ejemplo, Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); y Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldehido (véase, por ejemplo, Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), patente estadounidense No. 5,824,784, patente estadounidense No. 5,252,714), maleimida (véase, por ejemplo, Goodson et al. Bio/Techonology 8:343 (1990), Romani et al. en Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)) y Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), ortopiridil-disulfuro (véase, por ejemplo, Woghiren, et al.
Bioconj . Chem. 4:314(1993)), acrilol (véase, por ejemplo, Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilsulfona (véase, por ejemplo, patente estadounidense No. 5,900,461). Todas de las referencias y patentes anteriores son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. En algunos casos, un PEG termina sobre un extremo con hidroxi o metoxi, esto es, X es H o CH3 ("metoxi PEG") . Alternativamente, el PEG puede terminar con un grupo reactivo, formando mediante esto un polímero bifuncional. Grupos reactivos típicos pueden incluir aquellos grupos reactivos que son usados comúnmente para reaccionar con grupos funcionales encontrados en los 20 aminoácidos comunes (en los que se incluyen pero no limitados a, grupos maleimida, carbonatos activados (en los que se incluyen pero no limitados a, éter de p-nitrofenilo) , esteres activados (en los que se incluyen pero no limitados a, N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenil éster) y aldehidos) también como grupos funcionales que son inertes a los 20 aminoácidos comunes pero que reaccionan específicamente con grupos funcionales complementarios presentes en aminoácidos no naturales (en los que se incluyen pero no limitados a, grupos oxima, carbonilo o dicarbonilo e hidroxilamina) . Se notará que el otro extremo del PEG, que es mostrado en la fórmula anterior por Y, se anexará ya sea directa o indirectamente a un polipéptido (sintético o natural) , polinucleótido, polisacárido o polímero sintético vía un aminoácido no natural. Cuando Y es un grupo hidroxilamina, entonces el reactivo de PEG que contiene hidroxilamina puede reaccionar con un aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo en un polipéptido para formar un grupo PEG enlazado al polipéptido vía un enlace de oxima. Cuando Y es un grupo carbonilo o dicarbonilo, entonces el reactivo de PEG que contiene carbonilo o dicarbonilo puede reaccionar con un aminoácido no natural que contiene hidroxilamina en un polipéptido para formar un grupo PEG enlazado al polipéptido vía un enlace de oxima. Cuando Y es un grupo carbonilo o dicarbonilo, entonces el reactivo de PEG que contiene carbonilo o dicarbonilo también puede reaccionar con un aminoácido no natural que contiene oxima en un polipéptido para formar un grupo PEG enlazado al polipéptido vía un nuevo enlace de oxima. Ejemplos de condiciones de reacción apropiadas, métodos de purificación y reactivos son descritos en toda esta especificación y las figuras adjuntas. Por ejemplo, la figura 7 presenta tres ejemplos de la reacción de un polipéptido de aminoácido no natural que contiene carbonilo con un reactivo de PEG que contiene hidroxilamina para formar un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima enlazado a un grupo PEG. Además, la figura 9 presenta dos ejemplos de la reacción de un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima con un reactivo de PEG que contiene carbonilo para formar un nuevo polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima enlazado a un grupo PEG. Además, la figura 10 presenta un ejemplo de la reacción de un polipéptido de aminoácido no natural que contiene hidroxilamina con un reactivo de PEG que contiene carbonilo para formar un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima enlazado a un grupo PEG. A manera de ejemplo solamente y no como limitación en cuanto a los tipos o clases de reactivos de PEG que pueden ser usados con las composiciones, métodos, técnicas y estrategias descritos en la presente, la figura 11 presenta ejemplos ilustrativos adicionales de reactivos de PEG que contienen hidroxilamina que pueden reaccionar con polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen carbonilo para formar polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen oxima enlazados al grupo PEG, también como ejemplos de reactivos de PEG que contienen carbonilo que pueden reaccionar con polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen oxima o polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen hidroxilamina para formar nuevos polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen oxima enlazados a grupos PEG. La figura 12 presenta cuatro ejemplos ilustrativos de métodos sintéticos para formar reactivos de PEG que contienen hidroxilamina o formas protegidas de reactivos de PEG que contienen hidroxilamina o formas enmascaradas de reactivos de PEG que contienen hidroxilamina. La figura 13 presenta un ejemplo ilustrativo de métodos sintéticos para formar reactivos de PEG que contienen hidroxilamina amida-enlazados o formas protegidas de reactivos de PEG que contienen hidroxilamina amida-enlazados o formas enmascaradas de reactivos de PEG que contienen hidroxilamina amida-enlazados. La figura 14 y la figura 15 presentan ejemplos ilustrativos de métodos sintéticos para formar reactivos de PEG que contienen hidroxilamina carbamato-enlazados o formas protegidas de reactivos de PEG que contienen hidroxilamina carbamato-enlazados o formas enmascaradas de reactivos de PEG que contienen hidroxilamina carbamato-enlazados. La figura 16 presenta ejemplos ilustrativos de métodos sintéticos para formar reactivos de PEG que contienen hidroxilamina simples o formas protegidas de reactivos de PEG que contienen hidroxilamina simples o formas enmascaradas de reactivos de PEG que contienen hidroxilamina simples. Además, la figura 17 presenta ejemplos ilustrativos de reactivos que contienen hidroxilamina que tienen múltiples ramas de grupos de PEG enlazados y además muestra la reacción de uno de tales reactivos ramificados de PEG múltiples que contienen hidroxilamina con un polipéptido de aminoácido no natural que contiene carbonilo para formar un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima con un grupo multi -PEG-ramificado enlazado. Derivados heterobifuncionales son también particularmente útiles cuando se desea anexar diferentes moléculas a cada término del polímero. Por ejemplo, el PEG omega-N-amino-N-azido permitiría la anexión de una molécula que tiene un grupo electrofílico activado, tal como un aldehido, cetona, éster activado, carbonato activado y así sucesivamente, a un término del PEG y una molécula que tiene un grupo acetileno al otro término del PEG. En algunas modalidades, un nucleófilo fuerte (en los que se incluyen pero no limitados a hidroxilamina) se puede hacer reaccionar con un grupo aldehido o grupo cetona presente en un aminoácido no natural para formar una oxima, que en algunos casos puede ser reducida adicionalmente mediante tratamiento con un agente reductor apropiado. Alternativamente, el nucleófilo fuerte puede ser incorporado al polipéptido vía un aminoácido no natural y usado para reaccionar preferiblemente con un grupo cetona o aldehido presente en el polímero soluble en agua. En general, por lo menos un término de la molécula de PEG está disponible para reacción con el aminoácido no natural. Así, en algunas modalidades, el polipéptido que comprende el aminoácido no natural es enlazado a un polímero soluble en agua, tal como polietilenglicol (PEG) , vía la cadena lateral del aminoácido no natural . Los métodos y composiciones de aminoácido no naturales descritos en la presente proporcionan un método altamente eficiente para la modificación selectiva de proteínas con derivados de PEG, que involucra la incorporación selectiva de aminoácidos no naturales, en los que se incluyen pero no limitados a, aquellos aminoácidos que contienen grupos funcionales o sustituyentes no encontrados en los 20 aminoácidos incorporados naturalmente a proteínas en respuesta a un codón selector y la modificación subsecuente de aquellos aminoácidos con un derivado de PEG apropiadamente reactivo. Metodologías de química conocidas de una amplia variedad son apropiadas para uso con los métodos y composiciones de aminoácido no naturales descritos en la presente para incorporar un polímero soluble en agua a la proteína. La cadena fundamental del polímero puede ser lineal o ramificada. Cadenas fundamentales de polímero ramificadas son en general conocidos en el arte. Comúnmente, un polímero ramificado tiene una porción de núcleo de rama central y una pluralidad de cadenas de polímero lineales enlazada al núcleo de rama central. El PEG es usado en formatos ramificados que pueden ser preparados mediante la adición de óxido de etileno a varios polioles, tales como glicerol, oligómeros de glicerol, pentaeritritol y sorbitol. La porción de rama central puede también ser derivada a partir de varios aminoácidos, tales como lisina. El poli (etilenglicol) ramificado puede ser representado en forma general como R(-PEG-0H)m en la cual R es derivado de una porción central, tal como glicerol, oligómeros de glicerol o pentaeritritol y m representa el número de brazos. Moléculas de PEG de múltiples brazos, tales como aquellas descritas en las patentes estadounidenses Nos. 5,932,462 5,643,575; 5,229,490; 4,289,872; solicitud de patente estadounidense 2003/0143596; WO 96/21469; y WO 93/21259, cada uno de los cuales es incorporado en la presente por referencia en su totalidad, pueden también ser usadas como la cadena fundamental del polímero. El PEG ramificado puede también estar en forma de PEG en horquilla representado por PEG ( -YCHZ2) n, en donde Y es un grupo enlazante y Z es un grupo terminal activado enlazado a CH por una cadena de átomos de longitud definida. Todavía otra forma ramificada, el PEG pendiente, tiene grupos reactivos, tales como carboxilo, a lo largo de la cadena fundamental de PEG en lugar de en el extremo de las cadenas de PEG. Además de estas formas de PEG, el polímero puede también ser preparado con enlaces débiles o degradables en la cadena fundamental. Por ejemplo, PEG puede ser preparado con enlaces de éster en la cadena fundamental del polímero que son sometidas a hidrólisis. Como se muestra en la presente, esta hidrólisis da como resultado escisión del polímero en fragmentos de peso molecular más bajo: -PEG-C02-PEG-+H20 -> PEG-C02H+HO-PEG- Se comprenderá por aquellos experimentados en el arte que el término polietilenglicol o PEG representa o incluye todas las formas conocidas en el arte en las que se incluyen pero no limitadas a aquellas reveladas en la presente. El peso molecular del polímero puede ser de un amplio intervalo, en los que se incluyen pero no limitados a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del polímero puede ser de entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, en los que se incluyen pero no limitados a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. Con el fin de maximizar las propiedades deseadas de PEG, el peso molecular total y esto de hidratación del polímero de PEG o polímeros anexados a la molécula biológicamente activa deben ser suficientemente altos para impartir las características ventajosas asociadas comúnmente con la anexión del polímero de PEG, tales como solubilidad en agua incrementada y vida media circulante incrementada, en tanto que no impacte adversamente la bioactividad de la molécula original .
Los métodos y composiciones descritos en la presente pueden ser usados para producir preparaciones sustancialmente homogéneas de conjugados de polímero:proteína. "Sustancialmente homogéneo" como se usa en la presente significa que se observa que las moléculas de conjugado de polímero :proteína son mayor de la mitad de la proteína total. El conjugado de polímero :proteína tiene actividad biológica y las preparaciones de polipéptido PEGiladas "sustancialmente homogéneas" presentes proporcionadas en la presente son aquellas que son lo suficientemente homogéneas para exhibir las ventajas de una preparación homogénea, por ejemplo, facilidad en aplicación clínica en predecibilidad de farmacocinética de lote a lote. También se puede escoger preparar una mezcla de moléculas de conjugado de polímero :proteína y la ventaja proporcionada en la presente es que se puede seleccionar la proporción de conjugado de mono-polímero :proteína para incluir en la mezcla. Así, si se desea, se puede preparar una mezcla de varias proteínas con varios números de porciones de polímero anexadas (esto es, di-, tri-, tetra-, etc.) y combinar los conjugados con el conjugado de mono-polímero : proteína preparado usando los métodos descritos en la presente y tener una mezcla con una proporción predeterminada de conjugados de mono-polímero : proteína . La proporción de moléculas de polietilenglicol a moléculas de proteína variará, como sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la proporción óptima (en términos de eficiencia de reacción en que hay un exceso mínimo de proteína o polímero sin reaccionar) puede ser determinada por el peso molecular del polietilenglicol seleccionado y el número de grupos reactivos disponible. Ya que se relaciona con el peso molecular, comúnmente mientras más alto el peso molecular del polímero, menor el número de moléculas de polímero que pueden ser anexadas a la proteína. Similarmente, la ramificación del polímero debe ser tomado en cuenta cuando se optimizan estos parámetros. En general, mientras más alto es el peso molecular (o más ramas) más alta es la proporción de polímero: proteína . Como se usa en la presente y cuando se contemplan conjugados de polímero :polipéptido/proteína hidrofílicos, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a además a una cantidad que da un incremento en beneficio deseado a un paciente. La cantidad variará de un individuo a otro y dependerá de una diversidad de factores, en los que se incluyen la condición física global del paciente y el caso fundamental de la enfermedad, alteración o condición a ser tratado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de las presentes composiciones puede ser determinada fácilmente por el experimentado en el arte utilizando materiales y procedimientos disponibles públicamente. El número de polímeros solubles en agua enlazado a un polipéptido de aminoácido no natural "modificado o sin modificar" (esto es, a la extensión de PEGilación o glicosilación) descrito en la presente puede ser ajustado para proporcionar una característica farmacológica, farmacocinética o farmacodinamia mejorada (en los que se incluyen pero no limitados a, incrementada o disminuida) tales como vida media in vivo. En algunas modalidades, la vida media del polipéptido es incrementada por lo menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por ciento, dos veces, cinco veces, 10 veces, 50 veces o por lo menos aproximadamente 100 veces con respecto al polipéptido sin modificar. En una modalidad, un polipéptido que comprende un aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo es modificado con un derivado de PEG que contiene una porción hidroxilamina terminal que está enlazada directamente a la cadena fundamental PEG. En algunas modalidades, el derivado de PEG hidroxilamina-terminal tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-0-NH2 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (esto es, el peso molecular promedio es de entre 5-40 kDa) . El peso molecular del polímero puede ser de un amplio intervalo, en los que se incluyen pero no limitados a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del polímero puede ser de entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, en los que se incluyen pero no limitados a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. En otra modalidad, un polipéptido que comprende un aminoácido que contiene carbonilo o dicarbonilo es modificado con un derivado de PEG que contiene una porción hidroxilamina terminal que es enlazada a la cadena fundamental de PEG por medio de un enlace de amida. En algunas modalidades, los derivados de PEG hidroxilamina-terminal tienen la estructura: RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-NH-C (O) (CH2) m-0-NH2 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (esto es, el peso molecular promedio es de entre 5-40 kDa) . El peso molecular del polímero puede ser de un amplio intervalo, en los que se incluyen pero no limitados a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del polímero puede ser de entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, en los que se incluyen pero no limitados a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. En otra modalidad, un polipéptido que comprende un aminoácido que contiene carbonilo o dicarbonilo es modificado con un derivado de PEG ramificado que contiene una porción hidroxilamina terminal, con cada cadena del PEG ramificado que tiene un peso molecular que fluctúa de 10-40 kDa y en otras modalidades, de 5-20 kDa. El peso molecular del polímero ramificado puede ser de un amplio intervalo, en los que se incluyen pero no limitados a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del polímero puede ser de entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, en los que se incluyen pero no limitados a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. En otra modalidad, un polipéptido que comprende un aminoácido no natural es modificado con por lo menos un derivado de PEG que tiene una estructura ramificada. En algunas modalidades, los derivados de PEG que contienen un grupo hidroxilamina tendrán la estructura: [RO- (CH2CH20)n-0-(CH2)2-C(0) -NH-CH2-CH2] 2CH-X- (CH2) m-0-NH2 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), X es opcionalmente NH, O, S, C (O) o no está presente, m es 2-10 y n es 100-1,000. El peso molecular del polímero puede ser de entre aproximadamente 1,000 Da y aproximadamente 100,000 Da, en los que se incluyen pero no limitados a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da y 1,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 1,000 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada es de entre aproximadamente 5,000 Da y 20,000 Da. Varias revisiones y monografías en cuanto a la funcionalización y conjugación de PEG están disponibles. Véase, por ejemplo, Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al, Enzyme Microb . Technol . 14: 866-874 (1992); Delgado et al, Cri tical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem . 6: 150-165 (1995). Métodos para activación de polímeros pueden también ser encontrados en WO 94/17039, patente estadounidense No. 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, patente estadounidense No. 5,219,564, patente estadounidense No. 5,122,614, WO 90/13540, patente estadounidense No. 5,281,698, y más WO 93/15189 y para conjugación entre polímeros activados y enzimas en los que se incluyen pero no limitados a Factor de coagulación VIII (WO 94/15625) , hemoglobina (WO 94/09027) , molécula portadora de oxígeno (patente estadounidense No. 4,412,989), ribonucleasa y superóxido dismutasa (Veronese at al, App. Biochem. Biotech. 11: 141-152 (1985)), todas las cuales son incorporadas por referencia en su totalidad. Si es necesario, los polipéptidos de aminoácido no naturales PEGilados descritos en la presente obtenidos de la cromatografía hidrofóbica pueden ser purificados adicionalmente mediante uno o más procedimientos conocidos para aquellos experimentados en el arte en los que se incluyen pero no limitados a, cromatografía de afinidad; cromatografía de intercambio aniónico o catiónico (utilizando, en los que se incluyen pero no limitados a, DEAE SEPHAROSE) ; cromatografía sobre sílice; HPLC de fase inversa; filtración de gel (utilizando, en los que se incluyen pero no limitados a, SEPHADEX G-75) ; cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de quelato de metal; ultrafiltración/diafiltración; precipitación de etanol; precipitación de sulfato de amonio; cromatoenfoque; cromatografía de desplazamiento; procedimientos electroforéticos (en los que se incluyen pero no limitados a enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (en los que se incluyen pero no limitados a precipitación de sulfato de amonio) o extracción. El peso molecular aparente puede ser estimado mediante GPC mediante comparación con estándar de proteína globulares (Preneta AZ, PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306). La pureza del conjugado de polipéptido de aminoácido no natural: PEG puede ser determinada mediante degradación proteolítica (en las que se incluyen pero no limitadas a, escisión de tripsina) seguida por análisis de espectrometría de masas. Pepinsky RB., et.al, J. Pharmacol. & Exp. Ther. 297(3): 1059-66 (2001). Un polímero soluble en agua enlazado a un aminoácido no natural de un polipéptido descrito en la presente puede ser derivado adicionalmente o sustituido sin limitación.
E. Mejora de Afinidad por Albúmina de Suero Varias moléculas pueden también ser fusionadas a los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente para modular la vida media en el suero. En algunas modalidades, las moléculas son enlazadas o fusionadas a los polipéptido de aminoácido no naturales "modificado o sin modificar" descritos en la presente para mejorar a afinidad por albúmina de suero endógena en un animal . Por ejemplo, en algunos casos, una fusión recombinante de un polipéptido y una secuencia de enlace de albúmina es elaborada. Secuencias de enlace de albúmina ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, el dominio de enlace de albúmina de la proteína estreptococcal G {véase, por ejemplo, Makrides et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. 277(1) :534-542 (1996) y Sjolander et al, J, Immunol . Methods 201:115-123 (1997) ) o péptidos de albúmina-enlace tales como aquellos descritos en, por ejemplo, Dennis, et al, J. Biol. Chem. 277(38) :35035-35043 (2002). En otras modalidades, los polipéptidos de aminoácido no naturales "modificados o sin modificar" descritos en la presente son acilados con ácidos grasos. En algunos casos, los ácidos grasos promueven el enlace a albúmina de suero. Véase, por ejemplo, Kurtzhals, et al, Biochem. J. 312:725-731 (1995). En otras modalidades, los polipéptidos de aminoácido no naturales "modificados o sin modificar" descritos en la presente son fusionados directamente con albúmina de suero (en los que se incluyen pero no limitados a, albúmina de suero humano) . Aquellos de habilidad en el arte reconocerán que una amplia variedad de otras moléculas puede también ser enlazadas a polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente, para modular el enlace a albúmina de suero u otros componentes de suero.
F. Glicosilación de Polipéptidos de Aminoácidos no Naturales descritos en la presente Los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen polipéptidos que incorporan uno o más aminoácidos no naturales que llevan residuos de sacárido. Los residuos de sacárido pueden ser ya sea naturales (en los que se incluyen pero no limitados a, N-acetilglucosamina) o no naturales (en los que se incluyen pero no limitados a, 3-fluorogalactosa) . Los sacáridos pueden estar enlazado a los aminoácidos no naturales mediante un enlace glicosídico N- o O-enlazado (en los que se incluyen pero no limitados a, N-acetilgalactosa-1-serina) o un enlace no natural (en los que se incluyen pero no limitados a, una oxima o el glicósido C- o S- enlazado correspondiente) . Las porciones de sacárido (en las que se incluyen pero no limitadas a, glicosilo) pueden ser agregadas a los polipéptidos de aminoácido no naturales ya sea in vivo o in vitro. En algunas modalidades, un polipéptido que comprende un aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo es modificado con un sacárido derivado con un grupo aminooxi para generar el polipéptido glicosilado correspondiente enlazado vía un enlace de oxima. Una vez anexado al aminoácido no natural, el sacárido puede ser elaborado adicionalmente mediante tratamiento con glicosiltransferasas y otras enzimas para generar un oligosacárido enlazado al polipéptido de aminoácido no natural. Véase, por ejemplo, H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003).
G. Uso de Grupos Enlazantes y Aplicaciones, en los que se incluyen Dímeros y Multímeros de Polipéptido Además de agregar funcionalidad directamente al polipéptido de aminoácido no natural, la porción de aminoácido no natural del polipéptido puede ser modificada primero con una molécula enlazadora multifuncional (por ejemplo, bi-, tri, tetra-) que luego subsecuentemente es modificada adicionalmente. Esto es, por lo menos uno extremo de la molécula enlazadora multifuncional reacciona con por lo menos un aminoácido no natural en un polipéptido y por lo menos otro extremo del enlazador multifuncional está disponible para funcionalización adicional. Si todos los extremos del enlazador multifuncional son idénticos, entonces se pueden formar (dependiendo de las condiciones estequiométricas) homomultímeros del polipéptido de aminoácido no natural. Si los extremos del enlazador multifuncional tienen reactividades químicas distintas, entonces por lo menos un extremo del grupo enlazador multifuncional será enlazado al polipéptido de aminoácido no natural y el otro extremo puede subsecuentemente reaccionar con una funcionalidad diferente, en las que se incluyen a manera de ejemplo solamente: un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de fotoreticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co- factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación actínica; un ligando; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalador; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibidor, un radionucleótido; un agente de captura de neutrones; un derivado de biotina; punto (s) de quantum; un nanotransmisor; un radiotransmisor, una abzima, un activador de complejo activado, un virus, un adyuvante, un aglican, un alérgeno, una angiostatina, una antihormona, un antioxidante, un aptámero, un ARN de guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa, y cualquier combinación de los mismos. El grupo enlazador multifuncional tiene la estructura general en donde : cada X es independientemente NH2, -C(=0)R9, -SR' o -J-R, en donde R9 es H o OR' , en donde J es R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; cada R" es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido o un grupo protector o cuando más de un grupo R" grupo está presente, dos R" forman opcionalmente un heterocicloalquilo; cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; cada L es seleccionado independientemente del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, S(0) - en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido) -, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) NR' C (O) O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -O-CON(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CS (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) C (O) O- , -N(R')C(0)0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S (O) kN (R' ) - , N(R' )C(0)N(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(S)N(R') -, -N (R' ) S (0) kN (R' ) - , -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- y -C(R')2- N(R' ) -N(R' ) -; Li es opcional y cuando está presente, es -C(R')P-NR'-C (O) O- (alquileno o alquileno sustituido)- en donde p es 0, l o 2; W es NH2, -C(=0)R9, -SR' o -J-R; y n es 1 a 3 a condición de que X y L-Li-W cada uno conjuntamente de manera independiente proporcionen por lo menos uno de los siguientes (a) un grupo hidroxilamina capaz de reaccionar con un grupo carbonilo (en los que se incluyen un grupo dicarbonilo) sobre un aminoácido no natural o un polipéptido de aminoácido no natural "modificado o sin modificar" ; (b) un grupo carbonilo (en los que se incluyen un grupo dicarbonilo) capaz de reaccionar con un grupo hidroxilamina sobre un aminoácido no natural o un polipéptido de aminoácido no natural "modificado o sin modificar" ; o (c) un grupo carbonilo (en los que se incluyen un grupo dicarbonilo) capaz de sufrir una reacción de intercambio con un grupo oxima sobre un aminoácido no natural o un polipéptido de aminoácido no natural "modificado o sin modificar" . La figura 18 presenta un ejemplo ilustrativo no limitante de la síntesis de un homoenlazador bifuncional en el cual el enlazador tiene dos extremos idénticos, esto es grupos hidroxilamina. Tal enlazador puede ser usado para formar un homodímero de un polipéptido de aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo para formar dos enlaces de oxima. Alternativamente, si un extremo de tal enlazador está protegido, entonces tal enlazador parcialmente protegido puede ser usado para enlazar el extremo de hidroxilamina sin proteger a un polipéptido de aminoácido no natural que contienen carbonilo o dicarbonilo vía un enlace de oxima, dejando el otro extremo protegido disponible para reacciones de enlace adicionales enseguida de la desprotección. Alternativamente, la manipulación cuidadosa de la estequiometría de los reactivos puede proporcionar un resultado similar (un heterodímero) , aunque un resultado en el cual el heterodímero deseado probablemente estará contaminado con algo homodímero. La figura 19 presenta ejemplos ilustrativos no limitantes de dos heteroenlazadores multifuncionales en los cuales cada enlazador tiene más de un tipo de grupo reactivo terminal, esto es, grupos hidroxilamina, oxima y tioéster. Tal enlazador puede ser usado para formar un heterodímero de un polipéptido de aminoácido no natural utilizando la química a base de oxima discutida en toda esta especificación. La figura 20 presenta un ejemplo ilustrativo no limitante esquemático del uso de un heteroenlazador bifuncional para anexar un grupo PEG a un polipéptido de aminoácido no natural en una síntesis de múltiples etapas. En la primera etapa, como se ilustra en esta figura ilustrativa, el polipéptido de aminoácido no natural que contiene carbonilo reacciona con un enlazador bifuncional que contiene hidroxilamina para formar un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima modificado. Sin embargo, el enlazador bifuncional todavía retiene un grupo funcional (ilustrado en la presente por un objeto formado) que es capaz de reaccionar con un reactivo con reactividad apropiada (ilustrado en el figura por un objeto de forma correspondiente) para formar un polipéptido de aminoácido no natural funcionalizado que contiene oxima modificado. En esta figura ilustrativa particular, la funcionalización es un grupo PEG, pero puede también incluir cualquiera de las funcionalidades mencionadas anteriormente o en este caso de un enlazador tri- o tetra- funcional , más de un tipo de funcionalidad o múltiples tipos de la misma funcionalidad. La figura 21 presenta ejemplos ilustrativos de cuatro tipos de grupos de enlazador usados para enlazar un polipéptido de aminoácido no natural que contiene hidroxilamina a un grupo PEG. Como antes, la funcionalidad PEG es proporcionada por propósitos ilustrativos solamente. Así, los grupos enlazadores descritos en la presente proporcionan un medio adicional para modificar adicionalmente un polipéptido de aminoácido no natural de manera selectiva del sitio.
Los métodos y composiciones descritos en la presente también proporcionan combinaciones de polipéptido, tales como homodímeros, heterodímeros, homomultímeros o heteromultímeros (esto es, trímeros, tetrámeros, etc.) . A manera de ejemplo solamente, la siguiente descripción se enfoca sobre los miembros de familia de supergen GH, sin embargo, los métodos, técnicas y composiciones descritos en esta sección pueden ser aplicados a virtualmente cualquier otro polipéptido que pueda proporcionar beneficio en forma de dímeros y multímeros, en los que se incluyen a manera de ejemplo solamente: alfa-1 antitripsina, angiostatina, factor antihemolítico, anticuerpo, apolipoproteína, apoproteína, factor natriurético atrial, polipéptido natriurético atrial, péptido atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4 , MIG, calcitonina, ligando de equipo c, citocina, CC quimiocina, proteína-1 quimioatrayente de monocito, proteína-2 quimioatrayente de monocito, proteína-3 quimioatrayente de monocito, proteína-1 alfa inflamatoria de monocito, proteína- i beta inflamatoria de monocito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCCl, T58847, D31065, T64262, CD40, ligando CD40, ligando c-kit, colágeno, factor estimulador de colonia (CSF) , factor 5a de complemento, inhibidor de complemento, receptor 1 de complemento, citocina, péptido- 78 activador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , péptido activador de neutrófilo epitelial, eritropoyetina (EPO), toxina exfoliante, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor X, factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) , fibrinógeno, fibronectina, proteína de haz de cuatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glucocerebrosidasa, gonadotropina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, grf, proteína de hedgehog, hemoglobina, factor de crecimiento de hepatocito (hGF) , hirudina, hormona de crecimiento humana (hGH) , albúmina de suero humano, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferón (.IFN), IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, interleucina (IL) , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, factor de crecimiento de queratinocito (KGF), lactoferrina, factor inhibidor de leucemia, luciferasa, neurturin, factor inhibidor de neutrófilo (NIF) , oncostatina M, proteína osteogénica, producto de oncógeno, paracitonina, hormona paratiroides, PD-ECSF, PDGF, hormona de péptido, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogénica, exotoxina B pirogénica, exotoxina C pirogénica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biosintética pequeña, receptor I de complemento soluble, I-CA 1 soluble, receptor de interleucina soluble, receptor de TNF soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptocinasa, superantígenos, enterotoxina estafilococal, SEA, SEB, SEC1, SEC2 , SEC3 , SED, SEE, receptor de hormona de esteroides, superóxido dismutasa, toxina de síndrome de choque tóxico, timosina alfa 1, activador de plasminógeno de tejido, factor de crecimiento de tumor (TGF) , factor de necrosis de tumor, factor alfa de necrosis de tumor, factor beta de necrosis de tumor, receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR) , proteína VLA-4, proteína VCAM-1, factor de crecimiento entotelial vascular (VEGF) , urocinasa, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, reí, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL y corticosterona . Así, abarcados dentro los métodos, técnicas y composiciones descritos en la presente se encuentra un polipéptido del miembro de la familia del supergen GH que contiene uno o más aminoácidos no naturales enlazados u otro miembro de la familia del supergen GH o variante del mismo o cualquier otro polipéptido que no es un miembro de la familia del supergen GH o variante del mismo, ya sea directamente a la cadena fundamental del polipéptido o vía un enlazador. Debido a su peso molecular incrementado en comparación con los monómeros, los conjugados del dímero o multímero del miembro de la familia del supergen GH pueden exhibir propiedades nuevas o deseables, en los que se incluyen pero no limitadas a farmacología, farmacocinética, farmacodinámica, vida media terapéutica modulada o vida media en el plasma modulada diferente en relación con el miembro de la familia del supergen GH monomérico. En algunas modalidades, los dímeros del miembro de la familia del supergen GH descritos en la presente modularán la dimerización del receptor del miembro de la familia del supergen GH. En otras modalidades, los dímeros o multímeros del miembro de la familia del supergen GH descritos en la presente actuarán como un antagonista, agonista o modulador del receptor del miembro de la familia del supergen GH. En algunas modalidades, los polipéptido del miembro de la familia del supergen GH son enlazados directamente, en los que se incluyen pero no limitados a, vía un enlace de Asn-Lys amida o enlace de Cys-Cys disulfuro. En algunas modalidades, los polipéptidos del miembro de la familia del supergen GH enlazados y/o el miembro de la familia del supergen que no es de GH enlazado comprenderán diferentes aminoácidos no naturales para facilitar la dimerización, en los que se incluyen pero no limitados a, un primer miembro de la familia del supergen GH y/o el miembro de la familia de supergen que no es GH enlazado, polipéptido que comprende un aminoácido no natural que contiene cetona conjugado a un segundo polipéptido del miembro de la familia del supergen GH que comprende un aminoácido no natural que contiene hidroxilamina y los polipéptidos se hacen reaccionar vía formación de la oxima correspondiente . Alternativamente, los dos polipéptidos de miembro de la familia del supergen GH y/o el miembro de la familia del supergen que no es de GH enlazado, son enlazados vía un enlazador. Cualquier enlazador hetero- u homo-bifuncional puede ser usado para enlazar los dos miembros de la familia del supergen GH y/o el miembro de la fórmula del supergen que no es de GH enlazados, polipéptidos que pueden tener la misma o diferente secuencia primaria. En algunos casos, el enlazador usado para atar los miembros de la familia de supergen GH y/o el miembro de la familia de supergen que no es GH enlazado, polipéptidos conjuntamente pueden ser un reactivo de PEG bifuncional . En algunas modalidades, los métodos y composiciones descritos en la presente proporcionan enlazadores bifuncionales solubles en agua que tienen extremos de mayor sección que la parte central que incluyen: (a) una azida, un alquino, una hidrazina, una hidrazida, una hidroxilamina o una porción que contiene carbonilo o dicarbonilo sobre por lo menos un primer extremo de una cadena fundamental del polímero; y (b) por lo menos un segundo grupo funcional sobre un segundo extremo de la cadena fundamental del polímero. El segundo grupo funcional puede ser el mismo o diferente como el primer grupo funcional. El segundo grupo funcional, en algunas modalidades, no es reactivo con el primer grupo funcional. Los métodos y composiciones descritos en la presente proporciona, en algunas modalidades, compuestos solubles en agua que comprenden por lo menos uno brazo de una estructura molecular ramificada. Por ejemplo, la estructura molecular ramificada puede ser dendrítica. En algunas modalidades, los métodos y composiciones descritos en la presente proporcionan multímeros que comprenden uno o más miembros de familia de supergen GH formados mediante reacciones con polímeros activados solubles en agua que tienen la estructura: R-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-X en donde n es de aproximadamente 5 a 3,000, m es 2- 10, X puede ser un grupo azida, alquino, una hidrazina, una hidrazida, un grupo aminooxi, una hidroxilamina, un acetilo o porción que contiene carbonilo o dicarbonilo y R es un grupo coronante, un grupo funcional o un grupo saliente que puede ser el mismo o diferente como X. R puede ser, por ejemplo, un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, N-hidroxisuccinimidil éster, 1-benzotriazolil éster, carbonato de N-hidroxisuccinimidilo, carbonato de 1-benzotriazolilo, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos y tresilato, alqueno y cetona. La figura 22 presenta un ejemplo ilustrativo no limitante del uso de un grupo enlazador descrito en la presente para formar un homodímero de un polipéptido de aminoácido no natural descrito en la presente. En este ejemplo ilustrativo, un polipéptido de aminoácido no natural que contiene carbonilo se hace reaccionar con un grupo enlazador bifuncional que tiene dos grupos hidroxilamina disponibles bajo condiciones apropiadas para la formación de polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen oxima de homodímero enlazados. El método presentado en la figura no está limitado a polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen carbonilo acoplados a enlazadores bifuncionales que contienen hidroxilamina. El polipéptido de aminoácido no natural puede contener además un grupo oxima que es capaz de sufrir una reacción de intercambio con un grupo enlazador multifuncional que contiene carbonilo para formar un homomultímero enlazado mediante una estructura que contiene múltiples grupos oxima o el polipéptido de aminoácido no natural puede contener adicionalmente un grupo hidroxilamina que es capaz de sufrir una reacción con un grupo enlazador multifuncional que contiene carbonilo para formar un homomultímero enlazado por una estructura que contiene múltiples grupos oxima. Por supuesto, el homomultímero puede ser un homodímero, un homotrimero o un homotetrámero. La figura 23 presenta un ejemplo ilustrativo no limitante del uso de un grupo enlazador heterofuncional para formar un heterodímero de polipéptidos, en el cual por lo menos uno de los miembros del heterodímero es un polipéptido de aminoácido no natural descrito en la presente y los otros miembros son opcionalmente polipéptidos de aminoácido no naturales como se describe en la presente, otros tipos de polipéptidos de aminoácido no naturales o polipéptido de aminoácido que se presentan de manera estable en la naturaleza. En el ejemplo presentado en esta figura, el grupo enlazador contiene dos grupos hidroxilamina idénticos, al controlar la estequiometría, temperatura y otros parámetros de la reacción, el producto dominante de la reacción del enlazador con un polipéptido de aminoácido no natural que contiene carbonilo es un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima modificado anexado a un enlazador con un grupo hidroxilamina disponible. Este último grupo puede reaccionar adicionalmente con otro polipéptido de aminoácido no natural que contiene carbonilo o dicarbonilo para formar un heterodímero bifuncional de polipéptidos de aminoácido no naturales que contienen oxima. Por supuesto, los grupos funcionales sobre el enlazador no tienen que ser idénticos ni tienen que ser grupos hidroxilamina. Utilizando a química detallada en toda esta especificación, el experimentado en el arte podría diseñar un enlazador en el cual por lo menos uno grupo funcional pueda formar un grupo oxima con un polipéptido de aminoácido no natural; los otros grupos funcionales sobre el enlazador podría utilizar otras químicas conocidas, en las que se incluyen la química a base de nucleófilo/electrófilo bien conocido en el arte de química orgánica.
H. Ejemplo de Funcionalidad Agregada : Facilitación de las Propiedades de Aislamiento de un Polipéptido Un polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza o no natural puede ser difícil de aislar de una muestra por una diversidad de razones, en las que se incluyen pero no limitadas a las características de solubilidad o enlace del polipéptido, por ejemplo, en la preparación de un polipéptido para uso terapéutico, tal terapéutico puede ser aislado de un sistema recombinante que ha sido diseñado para sobreproducir el polipéptido. Sin embargo, debido a las características de solubilidad o enlace del polipéptido, la obtención de un nivel deseado de pureza frecuentemente prueba ser difícil. Los métodos, composiciones, técnicas y estrategias descritos en la presente proporcionan una solución a esta situación. Utilizando los métodos, composiciones, técnicas y estrategias descritos en la presente, el experimentado en el arte puede producir un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima que es homólogo al polipéptido deseado, en donde el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima tiene características de aislamiento mejoradas. En una modalidad, un polipéptido de aminoácido no natural homólogo es producido biosintéticamente. En modalidad más o modalidad adicional, el aminoácido no natural ha incorporado a su estructura uno de los aminoácidos no naturales descritos en la presente. En una modalidad más o modalidad adicional, el aminoácido no natural es incorporado en una posición terminal o interna y es incorporados además específicamente en el sitio. En una modalidad, el aminoácido no natural resultante, tal como es producido biosintéticamente, ya tiene las características de aislamiento mejoradas deseadas. En demás modalidades o modalidades adicionales, el aminoácido no natural comprende un enlace de oxima a un grupo que proporciona las características de aislamiento mejoradas. En demás modalidades o modalidades adicionales, el aminoácido no natural es modificado adicionalmente para formar un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima modificado, en donde la modificación proporciona un enlace de oxima a un grupo que proporciona las características de aislamiento mejoradas. En algunas modalidades, tal grupo es enlazado directamente al aminoácido no natural y en otras modalidades, tal grupo es enlazado vía un grupo enlazador al aminoácido no natural . En ciertas modalidades, tal grupo es conectado al aminoácido no natural mediante una sola reacción química, en otras modalidades se requieren una serie de reacciones químicas para conectar tal grupo al aminoácido no natural. Preferiblemente, el grupo que imparte características de aislamiento mejoradas es enlazado específicamente del sitio al aminoácido no natural en el polipéptido de aminoácido no natural y no es enlazado a un aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza bajo las condiciones de reacción utilizadas. En demás modalidades o modalidades adicionales el polipéptido de aminoácido no natural resultante es homólogo a los miembros de la familia del supergen GH, sin embargo, los métodos, técnicas y composiciones descritos en esta sección pueden ser aplicados a virtualmente cualquier otro polipéptido que se pueda beneficiar de las características de aislamiento mejoradas, en las que se incluyen a manera de ejemplo solamente: alfa-1 antitripsina, angiostatina, factor antihemolítico, anticuerpo, apolipoproteína, apoproteína, factor natriurético atrial, polipéptido natriurético atrial, péptido atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4 , MIG, calcitonina, ligando de c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína-1 quimioatrayente de monocito, proteína-2 quimioatrayente de monocito, proteína-3 quimioatrayente de monocito, proteína-1 alfa inflamatoria de monocito, proteína-i beta inflamatoria de monocito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligando CD40, ligando de c-kit, colágeno, factor estimulador de colonia (CSF), factor de complemento 5a, inhibidor de complemento, receptor 1 de complemento, citocina, péptido-78 activador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF), péptido activador de neutrófilo epitelial, eritropoyetina (EPO), toxina exfoliante, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor X, factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) , fibrinógeno, fibronectina, proteína de haz de cuatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glucocerebrosidasa, gonadotropina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, grf, proteína de hedgehog, hemoglobina, factor de crecimiento de hepatocito (hGF) , hirudina, hormona de crecimiento humana (hGH) , albúmina de suero humano, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferón (IFN) , IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, interleucina (IL) , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, factor de crecimiento de queratinocito (KGF), lactoferrina, factor inhibidor de leucemia, luciferasa, neurturin, factor inhibidor de neutrófilo (NIF) , oncostatina M, proteína osteogénica, producto oncógeno, paracitonina, hormona paratiroides, PD-ECSF, PDGF, hormona de péptido, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogénica, exotoxina B pirogénica, exotoxina C pirogénica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biosintética pequeña, receptor I de complemento soluble, I-CAM 1 soluble, receptor de interleucina soluble, receptor de TNF soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptocinasa, superantígenos, enterotoxina estafilococal, SEA, SEB, SEC1, SEC2 , SEC3 , SED, SEE, receptor de hormona de esteroides, superóxido dismutasa, toxina de síndrome de choque tóxico, timosina alfa 1, activador de plasminógeno de tejido, factor de crecimiento de tumor (TGF), factor de necrosis de tumor, factor alfa de necrosis de tumor, factor beta de necrosis de tumor, receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR) , proteína VLA-4, proteína VCAM-1, factor de crecimiento entotelial vascular (VEGF) , urocinasa, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, reí, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL y corticosterona . En demás modalidades o modalidades adicionales, el grupo que imparte características de aislamiento mejoradas mejora la solubilidad en agua del polipéptido; en otras modalidades, el grupo mejora las propiedades de enlace del polipéptido; en otras modalidades, el grupo proporciona nuevas propiedades de enlace al polipéptido (en las que se incluyen a manera de ejemplo solamente, un grupo biotina o un grupo biotina-enlazante) . En modalidades en donde el grupo mejora la solubilidad en agua del polipéptido, el grupo es seleccionado de los polímeros solubles en agua descritos en la presente, en los que se incluyen a manera de ejemplo solamente, cualquiera de los grupos de polímero PEG descritos en la presente. J. Ejemplo de Adición de Funcionalidad: Detección de la Presencia de un Polipéptido Un polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza o polipéptido de aminoácido no natural puede ser difícil de detectar en un muestra (en los que se incluyen un muestra in vivo y una muestra in vitro) por una diversidad de razones, en los que se incluyen pero no limitadas a la carencia de un reactivo o indicador que se puede enlazar fácilmente al polipéptido. Los métodos, composiciones, técnicas y estrategias descritos en la presente proporcionan una solución a esta situación. Utilizando los métodos, composiciones, técnicas y estrategias descritos en la presente, el experimentado en el arte puede producir un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima que es homólogo al polipéptido deseado, en donde el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima permite la detección del polipéptido en una muestra in vivo y una muestra in vitro. En una modalidad, un polipéptido de aminoácido no natural homólogo es producido biosintéticamente. En una modalidades más o modalidad adicional, el aminoácido no natural tiene incorporado a su estructura uno de los aminoácidos no naturales descritos en la presente. En una modalidad más o modalidad adicionalmente, el aminoácido no natural es incorporado en una posición terminal o interna y es incorporado además específicamente en el sitio. En una modalidad, el polipéptido de aminoácido no natural resultante, tal como es producido biosintéticamente, ya tiene las características de detección deseadas. En demás modalidades o modalidades adicionales, el polipéptido de aminoácido no natural comprende por lo menos un aminoácido no natural seleccionado del grupo que consiste de un aminoácido no natural que contiene oxima, un aminoácido no natural que contiene carbonilo y un aminoácido no natural que contiene hidroxilamina. En otras modalidades tales aminoácidos no naturales han sido incorporados biosintéticamente al polipéptido como se describe en la presente. En demás modalidades o modalidades alternativas, el polipéptido de aminoácido no natural comprende por lo menos un aminoácido no natural seleccionado de los aminoácidos de fórmulas I -XVIII, XXX-XXXIV(A&B) o XXXX-XXXXIII . En demás modalidades o modalidades adicionales, el aminoácido no natural comprende un enlace de oxima a un grupo que proporciona las características de detección mejoradas. En demás modalidades o modalidades adicionales, el aminoácido no natural es modificado adicionalmente para formar un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima modificado, en donde la modificación proporciona un enlace de oxima a un grupo que proporciona las características de detección mejoradas. En algunas modalidades, tal grupo es enlazado directamente al aminoácido no natural y en otras modalidades, tal grupo es enlazado vía un grupo enlazador al aminoácido no natural. En ciertas modalidades, tal grupo es conectado al aminoácido no natural mediante una sola reacción química, en otras modalidades se requieren una serie de reacciones químicas para conectar tal grupo al aminoácido no natural. Preferiblemente, el grupo que imparte características de detección mejoradas es enlazado específicamente en el sitio al aminoácido no natural en el polipéptido de aminoácido no natural y no es enlazado a un aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza bajo las condiciones de reacción utilizadas. En demás modalidades o modalidades adicionales el polipéptido de aminoácido no natural resultante es homólogo a los miembros de la familia del supergen GH, sin embargo, los métodos, técnicas y composiciones descritos en esta sección pueden ser aplicados a virtualmente cualquier otro polipéptido que necesita ser detectado en una muestra in vivo y una muestra in vitro, en los que se incluyen a manera de ejemplo solamente: alfa-1 antitripsina, angiostatina, factor antihemolítico, anticuerpo, apolipoproteína, apoproteína, factor natriurético atrial, polipéptido natriurético atrial, péptido atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4 , MIG, calcitonina, ligando de c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína-1 quimioatrayente de monocito, proteína-2 quimioatrayente de monocito, proteína-3 quimioatrayente de monocito, proteína-1 alfa inflamatoria de monocito, proteína-i beta inflamatoria de monocito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1 , T58847, D31065, T64262, CD40, ligando CD40, ligando de c-kit, colágeno, factor estimulador de colonia (CSF) , factor de complemento 5a, inhibidor de complemento, receptor 1 de complemento, citocina, péptido-78 activador de neutrófilo epitelial, MIP- 16, MCP-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , péptido activador de neutrófilo epitelial, eritropoyetina (EPO), toxina exfoliante, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor X, factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) , fibrinógeno, fibronectina, proteína de haz de cuatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glucocerebrosidasa, gonadotropina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, grf, proteína de hedgehog, hemoglobina, factor de crecimiento de hepatocito (hGF) , hirudina, hormona de crecimiento humana (hGH) , albúmina de suero humano, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferón (IFN) , IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, interleucina (IL) , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, factor de crecimiento de queratinocito (KGF), lactoferrina, factor inhibidor de leucemia, luciferasa, neurturin, factor inhibidor de neutrófilo (NIF) , oncostatina M, proteína osteogénica, producto oncógeno, paracitonina, hormona paratiroides, PD-ECSF, PDGF, hormona de péptido, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina A pirogénica, exotoxina B pirogénica, exotoxina C pirogénica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biosintética pequeña, receptor I de complemento soluble, I-CAM 1 soluble, receptor de interleucina soluble, receptor de TNF soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptocinasa, superantígenos, enterotoxina estafilococal, SEA, SEB, SEC1, SEC2 , SEC3 , SED, SEE, receptor de hormona de esteroides, superóxido dismutasa, toxina de síndrome de choque tóxico, timosina alfa 1, activador de plasminógeno de tejido, factor de crecimiento de tumor (TGF), factor de necrosis de tumor, factor alfa de necrosis de tumor, factor beta de necrosis de tumor, receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR) , proteína VLA-4, proteína VCAM-1, factor de crecimiento entotelial vascular (VEGF) , urocinasa, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, reí, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL y corticosterona . En demás modalidades o modalidades adicionales, el grupo que imparte características de detección mejoradas es seleccionado del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un indicador de espín; un fluoróforo; una porción radioactiva; una porción que incorpora un átomo pesado; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; una etiqueta detectable, y cualquier combinación de los mismos.
J. Ejemplo de Adición de Funcionalidad: Mejora de las Propiedades Terapéuticas de un Polipéptido Un polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza o polipéptido de aminoácido no natural será apto de proporcionar un cierto beneficio terapéutico a un paciente con una alteración, enfermedad o condición particular. Tal beneficio terapéutico dependerá de una diversidad de factores, en los que se incluyen a manera de ejemplo solamente: el perfil de seguridad del polipéptido y la farmacocinética, farmacología y/o farmacodinámica del polipéptido (por ejemplo, solubilidad en agua, biodisponibilidad, vida media en el suero, vida media terapéutica, inmunogenicidad, actividad biológica o tiempo de circulación) . Además, puede ser ventajoso proporcionar funcionalidad adicional al polipéptido, tal como un compuesto o fármaco citotóxico anexado o puede ser deseable anexar polipéptido adicionales para formar los homo- y heteromultímeros descritos en la presente. Tales modificaciones preferiblemente no destruyen la actividad y/o estructura terciaria del polipéptido original. Los métodos, composiciones, técnicas y estrategias descritos en la presente proporcionan soluciones a estas cuestiones. Al utilizar los métodos, composiciones, técnicas y estrategias descritos en la presente, el experimentado en el arte puede producir un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima que es homólogo al polipéptido deseado, en donde el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima tiene características terapéuticas mejoradas. En una modalidad, un polipéptido de aminoácido no natural homólogo es producido biosintéticamente. En una modalidad más o modalidad adicional, el aminoácido no natural ha incorporado a su estructura uno de los aminoácidos no naturales descritos en la presente. En una modalidad más o modalidad adicional, el aminoácido no natural es incorporado en una posición terminal o interna y es además incorporado específicamente en el sitio. En una modalidad, el aminoácido no natural resultante, tal como es producido biosintéticamente, ya tiene las características terapéuticas mejoradas deseadas. En demás modalidades o modalidades adicionales, el aminoácido no natural comprende un enlace de oxima a un grupo que proporciona las características terapéuticas mejoradas. En demás modalidades o modalidades adicionales, el aminoácido no natural es modificado adicionalmente para formar un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima modificado, en donde la modificación proporciona un enlace de oxima a un grupo que proporciona las características terapéuticas mejoradas. En algunas modalidades, tal grupo es enlazado directamente al aminoácido no natural y en otras modalidades, tal grupo es enlazado vía un grupo enlazador al aminoácido no natural. En ciertas modalidades, tal grupo es conectado al aminoácido no natural mediante una sola reacción química, en otras modalidades se requieren una serie de reacciones químicas para conectar tal un grupo al aminoácido no natural. Preferiblemente, el grupo que imparte características terapéuticas mejoradas es enlazado específicamente en el sitio al aminoácido no natural en el polipéptido de aminoácido no natural y no es enlazado a un aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza bajo las condiciones de reacción utilizadas. En demás modalidades o modalidades adicionales el polipéptido de aminoácido no natural resultante es homólogo a los miembros de la familia del supergen GH, sin embargo, los métodos, técnicas y composiciones descritos en esta sección pueden ser aplicados a virtualmente cualquier otro polipéptido que se pueda beneficiar de las características terapéuticas mejoradas, en los que se incluyen a manera de ejemplo solamente: alfa-1 antitripsina, angiostatina, factor antihemolítico, anticuerpo, apolipoproteína, apoproteína, factor natriurético atrial, polipéptido natriurético atrial, péptido atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4 , MIG, calcitonina, ligando de c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína-1 quimioatrayente de monocito, proteína-2 quimioatrayente de monocito, proteína-3 quimioatrayente de monocito, proteína-1 alfa inflamatoria de monocito, proteína-i beta inflamatoria de monocito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligando CD40, ligando de c-kit, colágeno, factor estimulador de colonia (CSF), factor 5a de complemento, inhibidor de complemento, receptor 1 de complemento, citocina, péptido-78 activador de neutrófilo epitelial, MTP-16, MCP-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF), péptido activador de neutrófilo epitelial, eritropoyetina (EPO), toxina exfoliante, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor X, factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) , fibrinógeno, fibronectina, proteína de haz de cuatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glucocerebrosidasa, gonadotropina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, grf, proteína de hedgehog, hemoglobina, factor de crecimiento de hepatocito (hGF) , hirudina, hormona de crecimiento humana (hGH) , albúmina de suero humano, ICAM-1, receptor de ICAM-1, LFA-1, receptor de LFA-1, insulina, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferón (IFN) , IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, interleucina (IL) , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, factor de crecimiento de queratinocito (KGF), lactoferrina, factor inhibidor de leucemia, luciferasa, neurturin, factor inhibidor de neutrófilo (NIF) , oncostatina M, proteína osteogénica, producto de oncógeno, paracitonina, hormona paratiroides, PD-ECSF, PDGF, hormona de péptido, pleiotropina, proteína A, -proteína G, pth, exotoxina A pirogénica, exotoxina B pirogénica, exotoxina C pirogénica, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biosintética pequeña, receptor I de complemento soluble, I-CAM 1 soluble, receptor de interleucina soluble, receptor de TNF soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptocinasa, superantígenos, enterotoxina estafilococal, SEA, SEB, SEC1, SEC2 , SEC3 , SED, SEE, receptor de hormona de esteroides, superóxido dismutasa, toxina de síndrome de choque tóxico, timosina alfa 1, activador de plasminógeno de tejido, factor de crecimiento de tumor (TGF) , factor de necrosis de tumor, factor alfa de necrosis de tumor, factor beta de necrosis de tumor, receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR) , proteína VLA-4, proteína VCAM-1, factor de crecimiento entotelial vascular (VEGF) , urocinasa, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, reí, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL y corticosterona . En demás modalidades o modalidades adicionales, el grupo que imparte características terapéuticas mejoradas mejora la solubilidad en agua del polipéptido; en otras modalidades, el grupo mejora las propiedades de enlace del polipéptido; en otras modalidades, el grupo proporciona nuevas propiedades de enlace al polipéptido (en las que se incluyen, a manera de ejemplo solamente, un grupo biotina o un grupo biotina-enlazante) . En modalidades en donde el grupo mejora la solubilidad en agua del polipéptido, el grupo es seleccionado de los polímeros solubles en agua descritos en la presente, en los que se incluyen a manera de ejemplo solamente los grupos de polímero de PEG. En demás modalidades o modalidades adicionales el grupo es un compuesto citotóxico, mientras que en otras modalidades el grupo es un fármaco. En modalidades adicionales el grupo enlazado o compuesto citotóxico enlazado puede ser escindido del polipéptido de aminoácido no natural para administrar el fármaco o compuesto citotóxico a un sitio terapéutico deseado. En otras modalidades, el grupo es un segundo polipéptido, en los que se incluyen a manera de ejemplo solamente, un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima, que incluye además a manera de ejemplo, un polipéptido que tiene la misma estructura de aminoácido como el primer polipéptido de aminoácido no natural. En demás modalidades o modalidades adicionales, el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima es un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima modificado. En demás modalidades o modalidades adicionales, el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima incrementa la biodisponibilidad del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido no natural que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. En demás modalidades o modalidades adicionales, el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima incrementa el perfil de seguridad del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. En demás modalidades o modalidades adicionales, el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima incrementa la solubilidad en agua del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. En demás modalidades o modalidades adicionales, el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima incrementa la vida media terapéutica del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. En demás modalidades o modalidades adicionales, el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima incrementa la vida media en el suero del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. En demás modalidades o modalidades adicionales, el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima prolonga el tiempo de circulación del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. En demás modalidades o modalidades adicionales, el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima modula la actividad del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo. En demás modalidades o modalidades adicionales, el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima modula la inmunogenicidad del polipéptido en relación con el polipéptido de aminoácido que se presenta de manera estable en la naturaleza homólogo.
XI. Usos Terapéuticos de los Polipéptido Modificados Por conveniencia, los polipéptidos no naturales "modificados o sin modificar" descritos en esta sección han sido descritos genéricamente y/o con ejemplos específicos. Sin embargo, los polipéptidos no naturales "modificados o sin modificar" descritos en esta sección no deben ser limitados a solo las descripciones genéricas o ejemplo específico proporcionado en esta sección, sino que más bien los polipéptidos no naturales "modificados o sin modificar" descritos en esta sección se aplican igualmente bien a todos los polipéptidos no naturales "modificado o sin modificar" que comprenden por lo menos un aminoácido que cae dentro del alcance de las fórmulas I -XVIII, XXX-XXXIV (A&B) y XXXX-XXXXIII , en las que se incluyen cualquier sub-fórmulas o compuestos específicos que caen dentro del alcance de fórmulas I -XVIII, XXX-XXXIV(A&B) y XXXX- XXXXIII que son descritas en la especificación, reivindicaciones y las figuras en la presente. Los polipéptidos de aminoácido no naturales "modificados o sin modificar" descritos en la presente, en los que se incluyen homo- y hetero-multímeros de los mismos encuentran múltiples usos, en los que se incluyen pero no limitados a: usos terapéuticos, de diagnóstico, a base de análisis, industriales, cosméticos, de biología de platas, ambientales, de producción de energía y/o usos militares. Como una ilustración no limitante, los siguientes usos terapéuticos de los polipéptidos de aminoácido no naturales "modificados o sin modificar" son proporcionados. Los polipéptidos de aminoácido no naturales "modificados o sin modificar" descritos en la presente son útiles para el tratamiento de un amplio intervalo de alteraciones, condiciones o enfermedades. La administración de los productos de polipéptido de aminoácido no naturales "modificados o sin modificar" descritos en la presente da como resultado cualquiera de las actividades demostradas por preparaciones de polipéptido disponibles comercialmente en humanos. Las cantidades promedio del producto de polipéptido de aminoácido no natural "modificado o sin modificar" pueden variar y en particular deben estar basadas en las recomendaciones y prescripción de un médico calificado. La cantidad exacta del polipéptido de aminoácido no natural "modificado o sin modificar" es materia de preferencia sujeta a factores tales como el tipo exacto de condición que es tratada, la condición del paciente que es tratada, también como los otros ingredientes en la composición. La cantidad a ser dada dado puede ser determinada fácilmente por el experimentado en el arte en base a la terapia con el polipéptido de aminoácido no natural "modificado o sin modificar" .
A . Administración y Composiciones Farmacéuticas Los polipéptidos de aminoácido no naturales "modificados o sin modificar" descritos en la presente, en los que se incluye homo- y hetero-multímeros de los mismos encuentran múltiples usos, en los que se incluyen pero limitados a: usos terapéuticos, de diagnóstico, a base de análisis, industriales, cosméticos, de biología de plantas, ambientales, de producción de energía y/o usos militares. Como ilustración no limitante, los siguientes usos terapéuticos de los polipéptidos de aminoácido no naturales "modificados o sin modificar" son proporcionados. Los polipéptidos de aminoácido no naturales "modificados o sin modificar" descritos en la presente son útiles para el tratamiento de un amplio intervalo de alteraciones. La administración de los productos de polipéptido de aminoácido no naturales "modificado o sin modificar" descritos en la presente da como resultado cualquiera de las actividades demostradas por preparación de polipéptido disponibles comercialmente en humanos. Las cantidades promedio del producto de polipéptido de aminoácido no natural "modificado o sin modificar" pueden variar y en particular deben estar basadas en las recomendaciones y prescripción de un médico calificado. La cantidad exacta del polipéptido de aminoácido no natural "modificado o sin modificar" es un materia de preferencia sujeta a factores tales como el tipo exacto de condición que es tratada, la condición del paciente que es tratado, también como los otros ingredientes en el composición. La cantidad a dada puede ser determinada fácilmente por el experimentado en el arte en base a terapia con el polipéptido de aminoácido no natural "modificado o sin modificar" . Los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente (en los que se incluyen pero no limitados a, sintetasas, proteínas que comprenden uno o más aminoácido no naturales, etc.) son empleados opcionalmente para usos terapéuticos, en los que se incluyen pero no limitados a, en combinación con un portador farmacéutico apropiado. Tales composiciones, por ejemplo, comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente y un portador o excipiente aceptable farmacéuticamente. Tal portador o excipiente incluyen, pero no está limitado a, solución salina, solución salina de pH regulado, dextrosa, agua, glicerol, etanol y/o combinaciones de los mismos. La formulación es fabricada para adaptarse al modo de administración. En general, métodos de administración de proteínas son bien conocidos en el arte y pueden ser aplicados a la administración de los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente. Composiciones terapéuticas que comprenden uno o más de los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente son probadas opcionalmente en uno o más modelos de animal de enfermedad in vitro y/o in vivo apropiados para confirmar la eficacia, metabolismo de tejido y para estimar dosificaciones, de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte. En particular, las dosificaciones pueden ser determinadas inicialmente por actividad, estabilidad u otras medidas apropiadas de homólogos de aminoácido no naturales a naturales (en los que se incluyen pero no limitados a, comparación de un polipéptido modificado para incluir uno o más aminoácidos no naturales a un polipéptido de aminoácido natural), esto es, en un análisis relevante . La administración es mediante cualquiera de las rutas normalmente usadas para introducir una molécula en contacto íntimo con sangre o células de tejido. Los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente, son administrados de cualquier manera apropiada, opcionalmente con uno o más portadores aceptables farmacéuticamente. Métodos apropiados de administración de los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente, a un paciente están disponibles, y aunque más de una ruta puede ser usada para administrar una composición particular, una ruta particular puede frecuentemente proporcionar una acción o reacción más inmediata y más efectiva que otra ruta. Portadores aceptables farmacéuticamente son determinados en parte por la composición particular que es administrada, también como por el método particular usado para administrar la composición. Así, hay una amplia variedad de formulaciones apropiadas de composiciones farmacéuticas descritas en la presente. Los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente y composiciones que comprenden tales polipéptidos pueden ser administrados mediante cualquier ruta convencional apropiada para proteínas o péptidos, en los que se incluyen, pero no limitados a parenteralmente, por ejemplo inyecciones en las que se incluyen, pero no limitadas a, subcutáneamente o intravenosamente o cualquier otra forma de inyecciones o infusiones. Composiciones farmacéuticas de polipéptido (en las que se incluyen los varios polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente) pueden ser administradas por un número de rutas en las que se incluyen, pero no limitadas a oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, transdérmica, subcutánea, tópica, sublingual o medios rectales. Las composiciones que comprenden polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente, puede también ser administradas vía liposomas. Tales rutas de administración y formulaciones apropiadas son en general conocidas para aquellos de habilidad en el arte. Los polipéptidos de aminoácido no naturales descritos en la presente pueden ser usados solos o en combinación con otros componentes apropiados, en los que se incluyen pero no limitados a, un portador farmacéutico. Los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente, solos o en combinación con otros componentes apropiados, pueden también ser fabricados en formulaciones de aerosol (esto es, pueden ser "nebulizados" ) para ser administrados vía inhalación. Formulaciones de aerosol pueden ser colocados en propelentes aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y los semejantes. Formulaciones apropiadas para administración parenteral, tal como, por ejemplo, mediante rutas intraarticulares (en las articulaciones) , intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal y subcutánea, incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones de inyecciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, soluciones reguladoras del pH, bacteriostatos y solutos que vuelven a la formulación isotónica con la sangre del receptor propuesto y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizadores, agentes de espesamiento, estabilizantes y conservadores. Las formulaciones de ácido nucleico empacadas pueden ser presentadas en recipientes de una sola dosis o recipientes sellados de múltiples dosis, tales como ampolletas y frascos . La administración parenteral y administración intravenosa son métodos de administración preferidos. En particular, las rutas de administración ya en uso para terapéuticos de homólogo de aminoácido naturales (en los que se incluyen pero no limitados a, aquellos usados comúnmente para EPO, IFN, GH, G-CSF, GM-CSF, IFN, interleucinas, anticuerpos y/o cualquier otra proteína derivada farmacéuticamente) , junto con formulaciones en uso actual, proporcionan rutas de administración terapéuticas y formulación para los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente. La dosis administrada a un paciente, en el contexto composiciones y métodos descritos en la presente, es suficiente para tener una respuesta terapéutica benéfica en el paciente con el paso del tiempo. La dosis es determinada por la eficacia de la formulación particular y la actividad, estabilidad o vida media en el suero de los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificado o sin modificar, empleados y la condición del paciente, también como el peso corporal o área superficial del paciente a ser tratado. El tamaño de la dosis es también determinado por la existencia, naturaleza y extensión de cualesquier efectos adversos que acompañan la administración de una formulación particular o los semejantes en un paciente particular. En la determinación de la cantidad efectiva de la formulación a ser administrada en el tratamiento o profilaxis de la enfermedad (en las que se incluye pero no limitadas a, cánceres, enfermedades hereditarias, diabetes, SIDA o los semejantes), el médico evalúa los niveles de plasma circulantes, toxicidades de la formulación, avance de la enfermedad y/o en donde sea relevante, la producción de anti-anticuerpos de polipéptido de aminoácido no naturales. La dosis administrada, por ejemplo, a un paciente de 70 kilogramos, está comúnmente en el intervalo equivalente a dosificaciones de proteínas terapéuticas usadas actualmente, ajustadas en cuanto a la actividad alterada o vida media en el suero de la composición relevante. Las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente pueden complementar condiciones de tratamiento mediante cualquier terapia convencional conocida, en las que se incluyen administración de anticuerpos, administración de vacunas, administración de agentes citotóxicos, polipéptidos de aminoácidos naturales, ácidos nucleicos, análogos de nucleótidos, modificadores de respuesta biológica y los semejantes. Para administración, las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente son administradas a una proporción determinada por la LD-50 ó ED-50 de la formulación relevante y/u observación de cualesquier efectos secundarios de los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, a varias concentraciones, en los que se incluyen pero no limitadas a, tal como son aplicadas a la masa y salud global del paciente. La administración puede ser efectuada vía una sola dosis o dosis divididas. Si un paciente que sufre infusión de una formulación desarrolla fiebre, escalofríos o dolores musculares, recibe la dosis apropiada de aspirina, ibuprofeno, acetaminofeno u otro fármaco que controla el dolor/fiebre. Los pacientes que experimentan reacciones a la infusión tales como fiebre, dolores musculares y escalofríos son premedicados 30 minutos antes de las infusiones futuras a sea con aspirina, acetaminofeno, o en los que se incluyen pero no limitados a, difenhidramina. Meperidina es usada para escalofríos más severos y dolores musculares que no responden rápidamente a antipiréticos y antihistamínicos. La infusión celular es frenada o discontinuada dependiendo de la severidad de la reacción. Los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente, pueden ser administrados directamente a un sujeto mamífero. La administración es mediante cualquiera de las rutas normalmente usadas para introducir un polipéptido a un sujeto. Los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente, incluyen aquellos apropiados para administración oral, rectal, tópica, inhalación (en las que se incluyen pero no limitadas a, vía un aerosol) , bucal (en las que se incluyen pero no limitadas a, sublingual) , vaginal, parenteral (en las que se incluyen pero no limitadas a, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraarticular , intrapleural , intraperitoneal, intracerebral , intraarterial o intravenosa), tópica (esto es, tanto piel como superficies mucosas, en las que se incluyen superficies de vías aéreas) y administración transdérmica, aunque la ruta más apropiada en cualquier caso dado dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que es tratada. La administración puede ser ya sea local o sistémica.
Las formulaciones pueden ser presentadas en recipientes de dosis unitaria o recipientes sellados de múltiples dosis, tales como ampolletas y frascos. Los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente, pueden ser preparados en una mezcla en una forma inyectable de dosificación unitaria (en las que se incluyen pero no limitadas a, solución, suspensión o emulsión) con un portador aceptable farmacéuticamente. Los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente, pone también ser administrados mediante infusión continua (utilizando, en los que se incluyen pero no limitados a, minibombas tales como bombas osmóticas) , formulaciones de depósito de un solo bolo o de liberación lenta. Formulaciones apropiadas para administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, soluciones reguladoras del pH, bacteriostatos y solutos que vuelven a la formulación isotónica y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizadores, agentes espesantes, estabilizadores y conservadores. Soluciones y suspensiones puede ser preparadas a partir de polvos estériles, granulos y tabletas de la clase descrita previamente. El secado por congelación es una técnica empleada comúnmente para presentar proteínas que sirven para remover el agua de la proporción de proteína de interés. El secado por congelación o liofilización es un proceso mediante el cual el material a ser secado es primero congelado y luego el hielo o solvente congelado es removido mediante sublimación en un ambiente al vacío. Un excipiente puede ser incluido en las formulaciones pre-liofilizadas para mejorar la estabilidad durante el proceso de congelación- secado y/o para mejorar la estabilidad del producto liofilizado en el almacenamiento. Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) y Arakawa et al. Pharm. Res. 8 (3) :285-291 (1991) . El secado por atomización de farmacéuticos es también conocido para aquellos de habilidad ordinaria en el arte. Por ejemplo, véase Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals", in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12)', 1169-1206 (1992) . Además de farmacéuticos de molécula pequeña, una variedad de materiales biológicos han sido secados por atomización y estos incluyen: enzimas, sueros, plasma, microorganismos y levaduras. El secado por atomización es una técnica útil debido a que puede convertir una preparación farmacéutica líquida a un polvo fino, sin polvo o aglomerado en un proceso de una etapa. La técnica básica comprende las siguientes cuatro etapas: (a) atomización de la solución de alimentación a una atomización; (b) contacto de atomización-aire; (c) secado de la atomización; y (d) separación del producto seco del aire de secado. Las patentes estadounidenses Nos. 6,235,710 y 6,001,800, que son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad, describen la preparación de eritropoyetina recombinante mediante secado por atomización. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden comprender un portador, excipiente o estabilizador aceptable farmacéuticamente. Portadores aceptables farmacéuticamente son determinados en parte por la composición particular que es administrada, también como por el método particular usado para administrar la composición. Así, hay una amplia variedad de formulaciones apropiadas de composiciones farmacéuticas (en las que se incluyen portadores, excipientes o estabilizadores aceptables farmacéuticamente opcionales) para los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, descritos en la presente, (véase, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa . : Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co . , Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. y Lachman, L., Eds., Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins, 1999)). Portadores apropiaos incluyen soluciones reguladoras del pH que contienen succinato, fosfato, borato, HEPES, citrato, imidazol, acetato, bicarbonato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes en los que se incluyen pero no limitados a, ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular en los que se incluyen pero no limitados a aquellos de menos de aproximadamente 10 residuos; proteínas, en las que se incluyen pero no limitadas a, albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos en los que se incluyen pero no limitados a, polivinilpirrolidona; aminoácidos en los que se incluyen pero no limitados a, glicina, glutamina, asparagina, arginina, histidina o derivados de histidina, metionina, glutamato o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, en los que se incluyen pero no limitados a, trehalosa, sacarosa, glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes en los que se incluyen pero no limitados a, EDTA; iones de metal divalentes en los que se incluyen pero no limitados a, zinc, cobalto o cobre; alcoholes de azúcar en los que se incluyen pero no limitados a, manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal en los que se incluyen pero no limitados a, sodio; y/o surfactantes no iónicos, en los que se incluye pero no limitados a Tween™ (en los que se incluyen pero no limitados a, Tween 80 (polysorbate 80) y Tween 20 (polysorbate 20) , Pluronics™ y otros ácidos plurónicos, en los que se incluyen pero no limitados a, y otros ácidos plurónicos, en los que se incluyen pero no limitados a, ácido plurónico F68 (poloxamer 188) o PEG. Surfactantes apropiados incluye por ejemplo pero no están limitados a poliéteres a base de poli (óxido de etileno) -poli (óxido de propileno) -poli (óxido de etileno), esto es, (PEO-PPO-PEO) o poli (óxido de propileno) -poli (óxido de etileno) -poli (óxido de propileno), esto es (PPO-PEO-PPO) o una combinación de los mismos. PEO-PPO-PEO y PPO-PEO-PPO están disponibles comercialmente bajo los nombres comerciales PluronicsTM, R-PluronicsTM, TetronicsTM y R-TetronicsTM (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.) y son descritos adicionalmente en la patente estadounidense No. 4,820,352 incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Otros polímeros en bloque de etileno/polipropileno pueden ser surfactantes apropiados. Un surfactante o una combinación de surfactantes pueden ser usados para estabilizar polipéptido de aminoácido no naturales PEGilados contra uno o más esfuerzos en los que se incluyen pero no limitados a esfuerzos que resultan de la agitación. Algunos de los anteriores pueden ser denominados como "agentes de volumen" . Algunos pueden también ser denominados como "modificadores de tonicidad" . Los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente, en los que se incluyen aquellos enlazados a polímeros solubles en agua tales como PEG pueden también ser administrados por o como parte de sistemas de liberación sostenida, composiciones de liberación sostenida incluyen, pero no están limitadas a, matrices poliméricas semi-permeables en forma de artículos formados, en los que se incluyen pero no limitados a películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen aquellos de materiales biocompatibles tales como poli (metacrilato de 2 -hidroxietilo) (Langer et al, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167- 277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), etileno acetato de vinilo (Langer et al, supra) o ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico (EP 133,988), polilacturos (ácido poliláctico) (patente estadounidense No. 3,773,919; EP 58,481), poliglicoluro (polímero de ácido glicólico), co-glicoluro de polilacturo (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico) polianhídridos, copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-1-glutamato (U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli (orto) esteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitina, ácido carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos tal como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona y silicona. Las composiciones de liberación sostenida también incluyen un compuesto atrapado liposomalmente . Liposomas que contienen el compuesto son preparadas mediante métodos conocidos per se: DE 3,218,121; Epstein et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 11: 4030- 4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes estadounidenses Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. Polipéptidos atrapados liposomalmente pueden ser preparados mediante métodos descritos por ejemplo en DE 3,218,121; Epstein et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes estadounidenses Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. la composición y tamaño de liposomas son bien conocidos o aptos de ser determinados fácilmente de manera empírica por el experimentado en el arte. Algunos ejemplos de liposomas como se describe por ejemplo en, Park JW, et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995); Lasic D y Papahadjopoulos D (eds) : MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC, et al, Liposomal drug delivery systems for cáncer therapy, en Teicher B (ed) : CÁNCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al, Clin. Cáncer Res. 8: 1172- 1181 (2002); Nielsen UB, et al, Biochim. Biophys . Acta 1591(1- 3) :109-118 (2002); Mamot C, et al, Cáncer Res. 63: 3154-3161 (2003) . La dosis administrada a un paciente en el contexto de las composiciones, formulaciones y métodos descritos en la presente, debe ser suficiente para provocar una respuesta benéfica en el sujeto con el paso del tiempo. En general, la cantidad farmacéuticamente efectiva total de los polipéptidos de aminoácido no naturales, modificados o sin modificar, como se describe en la presente, administrada parenteralmente por dosis está en el intervalo de aproximadamente 0.01 µg/Kg/día a aproximadamente 100 µg/Kg o aproximadamente 0.05 mg/Kg a aproximadamente 1 mg/Kg, de peso corporal del paciente, aunque esta está sujeta a discreción terapéutica. La frecuencia de dosificación también está sujeta discreción terapéutica y puede ser más frecuente o menos frecuente que los productos disponibles comercialmente aprobados para uso en humanos. En general, un conjugado de polímero :polipéptido en los que se incluyen a manera de ejemplo solamente, un polipéptido PEGilado, como se describe en la presente, pueden ser administrados mediante cualquiera de las rutas de administración descritos anteriormente.
EJEMPLOS Ejemplo 1 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene carbonilo presentado en la figura 4. El aminoácido no natural que contiene carbonilo fue producido como se describe en la figura 4.
Ejemplo 2 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene hidroxilamina protegido presentado en la figura 5a. El aminoácido no natural que contiene hidroxilamina fue producido como se describe en la figura 5a.
Ejemplo 3 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene hidroxilamina presentado en la figura 5b. El aminoácido no natural que contiene hidroxilamina fue producido como se describe en la figura 5b.
Ejemplo 4 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene hidroxilamina presentado en la figura 5c. El aminoácido no natural que contiene hidroxilamina fue producido como se describe en la figura 5c.
Ejemplo 5 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene oxima presentado en la figura 5d. El aminoácido no natural que contiene oxima fue producido como se describe en la figura 5d.
Ejemplo 6 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene oxima presentado en la figura 6a. El aminoácido no natural que contiene oxima fue producido como se describe en la figura 6a.
Ejemplo 7 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene oxima presentado en la figura 6b. El aminoácido no natural que contiene oxima fue producido como se describe en la figura 6b.
Ejemplo 8 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene oxima presentado en la figura 6c. El aminoácido no natural que contiene oxima fue producido como se describe en la figura 6c.
Ejemplo 9 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene carbonilo presentado en la figura 24. Síntesis de : A una solución NaOH (40 ml , 25% en volumen) a 0°C se agrega éter (60 ml) . Un blindaje contra explosiones fue colocado enfrente del matraz de reacción. A la mezcla resultante se agrega N-nitroso-N-metil urea (6.0 g, 57.9 mmol) en 3 porciones durante 3 minutos. La reacción fue agitada a 0°C durante 10 minutos. Luego se permite que las capas de éter dietílico e hidróxido de sodio se separen. La capa orgánica fue agregada a la solución de N-Boc-4-hidroximetilfenilalanina (7.5 g, 25.4 mmol) en THF anhidro (20 ml) de porción en porción (aproximadamente 6 adiciones) durante 5 minutos hasta que el material de partida había desaparecido completamente (monitoreado mediante TLC) . Luego se agregaron 5 gotas de ácido acético glacial para enfriar la reacción. Después que los solventes orgánicos fueron removidos mediante evaporación rotativa, se agrega acetato de etilo. La capa orgánica fue lavada sucesivamente con solución de NaHC03 saturada, H20 y salmuera, luego secada sobre MgS04 anhidro, filtrada y concentrada para producir el producto (5.9 g, 75%) como un polvo blanco.
Síntesis de : A una solución agitada de alcohol (6.0 g, 19.4 mmol) y piridina (12 ml , 150 mmol) en CH2C12 (400 ml) a 0°C se agrega peryodinano de Dess-Martin (14.2 g, 33.4 mmol) . La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. Luego la reacción fue enfriada con Na2S203-NaHC03 acuosa saturada (1:1, 300 ml) y extraída con CH2C12. Las capas orgánicas fueron combinadas y lavadas con H20 y salmuera, luego secadas sobre Na2S04 anhidro, filtradas y concentradas in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía de vaporización instantánea (sílice, 1:100 — 1:1 hexano : EtOAc) proporcionó el producto de aldehido (5.48 g, 92%) como un sólido blanco.
Síntesis de A una solución de aldehido (3.07 g, 10 mmol) en EtOH (40 ml) se agrega hidrazida acética (1.7 g, 20 mmol). La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 30 minutos y concentrada. Al residuo se agrega H20 (200 ml) seguido por CH2C12. La capa orgánica fue separada y concentrada in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 3:7 — 1:9 hexano : EtOAc) produjo el producto (3.29 g, 90%) como un sólido blanco.
Síntesis de A una solución del éster de metilo anterior (3.29 g, 9.1 mmol) en dioxano (10 ml) a 0°C se agrega LiOH (10 ml, 1 N) . La mezcla fue agitada a la misma temperatura durante 1 hora y luego enfriada mediante la adición de ácido cítrico (5 g) y diluida con H20. La mezcla fue extraída con EtOAc. La capa orgánica fue lavada sucesivamente con H20 y salmuera, luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada para proporcionar un sólido blanco (3.05 g, 96%) . Síntesis de: A una solución del ácido anterior (3.02 g, 8.6 mmol) en CH2C12 (20 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (20 ml) . La mezcla de reacción fue agitada a 0°C durante 2 horas y concentrada. Al residuo se agrega MeOH (1 ml) seguida por la adición de HCl (2.0 ml, 4 N en dioxano) . Luego se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto (2.07 g, 83%) como un sólido amarillo.
Ejemplo 10 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene dicarbonilo presentado en la figura 25. Síntesis de: A una solución agitada de amina (10 g, 34 mmol) en DMF (70 ml) a 0°C se agrega ácido piruvato (5 ml , 72 mmol), clorhidrato de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida (EDC, 20 g, 104 mmol) , hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, 85 g, 71 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (DIEA, 35 ml , 200 mmol) . La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 6 horas y luego enfriada con solución de ácido cítrico acuosa (5%, 500 ml) y extraída con EtOAc (500 ml) . La capa orgánica fue lavada sucesivamente con H20 y salmuera, luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. El residuo fue purificado mediante cromatografía de instantánea (sílice, 3:1 — 1:1 hexano : EtOAc) para proporcionar el producto como un sólido (4.78 g, 40%) .
Síntesis de: A una solución del metil éster anterior (2.96 g, 8.1 mmol) en dioxano (10 ml) a 0°C se agrega LiOH (10 ml, 1 N) . La mezcla fue agitada a la misma temperatura durante 3 horas. Luego la reacción fue enfriada con solución de ácido cítrico acuosa (5%) y diluida con EtOAc. La capa orgánica fue separada y lavada sucesivamente con H20 y salmuera, luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrado para proporcionar el producto como un sólido amarillo (2.87 g, 100%) .
Síntesi.s d ?e: A una solución del ácido anterior (2.05 g, 5.9 mmol) en CH2C12 (10 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (10 ml) . La mezcla fue agitada durante 2 horas y concentrada in vacuo. Al residuo se agrega HCl (1 ml, 4 N en dioxano) seguido por éter (400 ml) . El precipitado fue recolectado como un sólido blanco (1.38 g, 82%).
Ejemplo 11 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene el grupo dicarbonilo presentado en la Figura 26.
Síntesis de A una solución de 4 ' -metilpropiofenona (20 g, 122 mmol) y N-bromosuccinimida (?BS, 23 g, 130 mmol) en benceno (300 mi9 a 90°C se le agrega 2 , 2 ' -azobisisobutironitrilo (AIB?, 0.6g, 3.6 mmol) . La solución resultante se calienta hasta reflujo durante la noche. Luego la reacción se enfría a temperatura ambiente.
La solución color café se lava sucesivamente con H20 y salmuera, se seca sobre ?a2S04 anhidro, se filtra y se concentra in vacuo . El residuo se cristaliza a partir de hexanos para proporcionar el producto como un sólido color amarillo pálido (27 g, 87%) .
Síntesis de A una solución de EtONa (14.5 g, 203 mmol) en EtOH (400 ml) a 0°C se le agrega acetamidomalonato dietílico (39 g, 180 mmol) seguido por la solución del bromuro anterior (27 g, 119 mmol) en EtOH (100 ml) . La mezcla resultante se calienta hasta reflujo durante una hora y se extingue con ácido cítrico (30 g) y se diluye con H20 (300 ml) . Luego de que la mayoría del solvente es retirado in vacuo, el residuo se extrae con EtOAc. La capa orgánica se lava sucesivamente con H20 y salmuera, se seca sobre Na2S0 anhidro, se filtra y se concentra in vacuo . El residuo se purifica mediante cromatografía rápida (sílice, 10:1 - 3:1 hexano : EtOAc) para proporcionar el producto (37 g, 88%) como un sólido color amarillo.
Síntesis de A una solución de la cetona (5 g, 13.8 mmol) en éter (100 ml) a 0°C se le agrega Br2 (0.8 ml , 15.6 mmol) . La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 3 horas y luego se extingue con NaHC03 saturado acuoso. La mezcla se extrae con Et20. La capa orgánica se lava sucesivamente con H20 y salmuera, se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra in vacuo para proporcionar el producto como un sólido color amarillo (5.4 g, 88%) que se utiliza directamente para el siguiente paso sin purificación adicional.
Síntesis de A la solución de -bromo cetona (5.4 g, 12.2 mmol) y Na2C03 (2.0 g, 18.9 mmol) en DMSO (20 ml) se le agrega Kl (2.1 g, 13.2 mmol) . La mezclase agita a 90 °C bajo una atmósfera de nitrógeno durante 28 horas. Luego la reacción se extingue con H20 y se diluye con EtOAc. La capa orgánica se separa y lava sucesivamente con H20 y salmuera, se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra in vacuo . El residuo se purifica mediante cromatografía rápida (sílice, 6:1 - 1:10 hexano :EtOAc) para producir el producto como un sólido (1.12 g, 24%) .
Se calienta hasta reflujo durante la noche la solución de dicetona (1.12 g, 3.0 mmol) en HCl concentrado (10 ml) y dioxano (10 ml) . Después de retirar el solvente in vacuo, se agrega MeOH (3 ml) para disolver el residuo. Luego se agrega éter (300 ml) para precipitar el producto (302 mg, 42%) como un sólido color amarillo.
Ejemplo 12 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene el grupo dicarbonilo presentado en la Figura 27.
Síntesis de Se agrega benzaldehído (5 ml, 42.5 mmol9 en éter (50 ml) a una solución de C3H7MgCl (2 M, 50 mmol) en éter (25 ml) a 0°C. La solución resultante se agita a 0°C durante 30 minutos. Luego la reacción se extingue con NH4C1 saturado y se diluye con éter. La capa orgánica se separa y lava sucesivamente con H20 y salmuera, luego se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra in vacuo para producir el producto crudo (7.2 g) que se utiliza directamente en la siguiente reacción sin purificación.
Síntesis de A una solución del alcohol anterior (7.2 g, 43.9 mmol) y piridina (7 ml , 86.7 mmol) en CH2C12 (300 ml) a 0°C se le agrega peryodinano Dess-Marin (19.2 g, 45.3 mmol). La mezcla resultante se agita durante la noche y se extingue con Na2S203 y NaHC03 acuoso saturado (1:1). La capa orgánica se lava sucesivamente con H20 y salmuera, luego se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra in vacuo . El residuo se purifica mediante cromatografía rápida (sílice, 8:1 - 4:1 hexano : EtOAc) para proporcionar un aceite incoloro (6.28 g, 91% para dos pasos) .
Síntesis de A una solución de la cetona anterior (4.43 g, 27.3 mmol) y N-bromosuccinimida (?BS, 5.5 g, 30.9 mmol) en benceno (150 ml) se le agrega 2, 2 ' -azobisisobutironitrilo (AIB?, 0.2 g, 1.2 mmol) a 90°C. La solución resultante se calienta hasta reflujo durante la noche y luego se enfría a temperatura ambiente. La solución color café se lava sucesivamente con H20 y salmuera, luego se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra in vacuo . El residuo se cristaliza a partir de hexanos para proporcionar el producto como un sólido color blanco (6.21 g, 95%) .
Síntesis de A una solución de EtONa (2.5 g, 34.9 mmol) en EtOH (200 ml) a 0°C se le agrega acetamidomalonato dietílico (6.7 g, 30.9 mmol) seguida por la solución de bromuro anterior (6.2 g, 25.8 mmol) en EtOH (100 ml) . La mezcla resultante se calienta hasta reflujo durante una hora y luego se extingue con ácido cítrico (9 g) y se diluye con H20. Luego de que la mayoría del solvente fue retirado, el residuo se extrae con EtOAc. La capa orgánica se lava sucesivamente con H20 y salmuera, luego se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra in vacuo . El residuo se purifica mediante cromatografía rápida (sílice, 4:1 - 2:1 hexano : EtOAc) para proporcionar el producto como un sólido color amarillo claro (8.92 g, 92%).
Síntesis de A una solución de la cetona anterior (1.4 g, 3.71 mmol) en HOAc (50 ml) se le agrega Br2 (0.7 ml , 13.6 mmol) . La mezcla se agita a temperatura ambiente durante la noche y luego se extingue con NaHC03 saturado acuoso. Luego la mezcla se extrae con Et20. La capa orgánica se lava sucesivamente con H20 y salmuera, luego se seca sobre Na2S0 anhidro, se filtra y concentra in vacuo . El residuo se purifica mediante cromatografía rápida (sílice, 5:1 - 3:2 hexano :EtOAc) para proporcionar un producto como un sólido color amarillo (1.23 g, 73%) .
Síntesis de A una solución de a-bromo cetona (1.12 g, 2.46 mmol) y Na2C03 (0.4 g, 3.77 mmol) en DMSO (30 ml) se le agrega Kl (0.45 g, 13.2 mmol) . La mezcla se agita a 90 °C durante la noche y luego se extingue con ácido cítrico (2 g) y H20 (200 ml) . La mezcla se extrae con EtOAc. La capa orgánica se lava sucesivamente con H20 y salmuera, luego se seca sobre Na2S0 anhidro, se filtra y concentra in vacuo. El residuo se purifica mediante cromatografía rápida (sílice, 6:1 - 1:10 hexano:EtOAc) para proporcionar a-hidroxilcetona como un aceite (0.62 g, 64%) . A una solución del alcohol anterior (0.62 g, 1.58 mmol) y piridina (0.5 ml , 6.19 mmol) en CH2C12 (100 ml) a 0°C se le agrega peryodinano Dess-Martin (0.9 g, 2.12 mmol) . La mezcla resultante se agita durante la noche y luego se extingue con Na2S203 acuoso saturado y NaHC03 (1:1). La capa orgánica se lava sucesivamente con H20 y salmuera, luego se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra in vacuo. El residuo se purifica mediante cromatografía rápida (sílice, 9:1 - 3:2 hexano :EtOAc) para proporcionar el producto como un aceite color amarillo (287 mg, 30% para dos etapas) .
Síntesis de La mezcla de la dicetona anterior (272 mg, 0.7 mmol) en HCl concentrado (10 ml) y dioxano (10 ml) se calienta hasta reflujo durante la noche. Después el solvente se retira in vacuo, se agrega MeOH (1 ml) para disolver el residuo. Luego se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto como un sólido color amarillo (162 mg, 81%) .
Ejemplo 13 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene el grupo dicarbonilo presentado en la Figura 28. Los compuestos se sintetizan como se presenta en la Figura 28.
Ejemplo 14 Este ejemplo detalla la clonación y expresión de un polipéptido modificado en E. coli . Un sistema de traducción introducido que comprende un ARNt ortogonal (0-tRNA) y un aminoacilo ortogonal ARNt sintetasa (O-RS) utilizado para expresar el polipéptido que contiene un aminoácido no natural. El O-RS aminoacila preferiblemente el O-tRNA con un aminoácido no natural. A su vez, el sistema de traducción inserta el aminoácido no natural en el polipéptido, en respuesta a un codon seleccionador codificado. Las secuencias de aminoácidos y polinucleótidos de O-tRNA y O-RS útiles para la incorporación de aminoácidos no naturales se describen en la Solicitud de patente de EE. UU. No. de serie 10/126,927 titulado "Incorporación in vivo de aminoácidos no naturales" y la Solicitud de Patente de EE . UU. No. de serie 10/126,931 titulada "Métodos y composiciones para la producción de pares de tRNA-aminoacilo ortogonal tRNA sintetasa", que se incorporan aquí por referencia. Las siguientes secuencias O-RS y O-tRNA pueden también ser utilizadas: La transformación de E. coli con plásmidos contiene el gen modificado y el par de ARNt aminoacil sintetasa ortogonal/ARNt (específico para el aminoácido natural no natural) permite la incorporación específica del sitio del aminoácido no natural en el polipéptido. Las E. coli transformada se desarrolla a 37°C en un medio que contiene entre 0.011 - 100 mM del aminoácido particular no natural, que expresa el polipéptido modificado con alta fidelidad y eficiencia. El polipéptido marcado con His contiene un aminoácido no natural que se produce por las células huésped de E. coli como cuerpos de inclusión o agregados. Los agregados se solubilizan y la afinidad purificada bajo condiciones desnaturalizadas en guanidina HCl 6M. El repliegue se lleva a cabo mediante diálisis a 4°C durante la noche en 50 mM TRIS-HCl, pH 8.0, 40 µM CuS04 y 2% (p/p) Sarkosyl . Luego el material es dializado contra 20 mM TRIS-HCl, pH 8.0, 100 M NaCl , 2 mM CaCl2, seguido del retiro del marcador His. Véase Boissel et al., J. Biol. Chem., (1993) 268: 15983-93. Los métodos de purificación de polipéptidos son bien conocidos en la técnica y se confirman mediante SDS-PAGE, análisis de Transferencia Western o espectrometría de masas con trampa de iones para ionización por electroaspersión y los semejantes .
Ejemplo 15; Análisis de aminoácidos no naturales Este ejemplo proporciona resultados de cuatro análisis que se llevan a cabo en ciertos aminoácidos no naturales ilustrativos como ayuda para predecir sus propiedades para la incorporación en polipéptidos de aminoácidos no naturales.
Ejemplo 16; Análisis de aminoácidos no naturales Este ejemplo proporciona los resultados de análisis de estabilidad de pH que se llevaron a cabo en ciertos aminoácidos no naturales como ayuda para predecir sus propiedades para la incorporación de polipéptidos de aminoácidos no naturales.
Ejemplo 17 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene el grupo dicarbonilo presentado en la Figura 29.
Síntesis de A una solución del aminoácido pAF (10 g, 41.1 mmol) en H20-dioxano (300 ml , 1:1) se le agrega NaHC03 (12 g, 142.9 mmol) y Boc20 (12 g, 55.0 mmol). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 7 horas y luego se extingue con ácido cítrico. La mezcla se extrae con EtOAc. La capa orgánica se lava sucesivamente con H20 y salmuera y luego se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra para proporcionar el N-Boc-pAF como un sólido color blanco (13.7 g, cuantificado) .
Síntesis de Se agrega éter (60 ml) a NaOH (40 ml , 25% vol) a 0°C. Se coloca un campo de protección enfrente del matraz de reacción. A la mezcla resultante se le agrega N-nitroso-N-metilurea (6.0 g, 57.9 mmol) en 3 porciones durante 3 minutos. La reacción se agita a 0°C durante 10 minutos. Se les permite separarse a las capas de éter dietílico e hidróxido de sodio. La capa orgánica se agrega a la solución de N-Boc-pAF (5.0 g, 16.2 mmol) en THF anhidro (20 ml) cuidadosamente (aproximadamente 6 adiciones) durante 5 minutos hasta que la materia prima desaparecido (monitoreada mediante TLC) . Luego se agregan 5 gotas de ácido acético glacial para extinguir la reacción. Después que los solventes orgánicos son retirados mediante evaporación giratoria, se agrega acetato etílico. La capa orgánica se lava sucesivamente con solución saturada de ?aHC03, H20 y salmuera, luego se seca sobre MgS04 anhidro, se filtra y concentra para proporcionar un polvo color blanco (4.1 g, 80%) .
Síntesis de Se agrega lentamente a t-BuOK (60 ml , 1.0 M en THF) la solución del pAF protegido (3.82 g, 11.9 mmol) en propionato de metilo destilado y fresco (20 ml, 208 mmol). La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos y se extingue con una solución de ácido cítrico (10%, 300 ml) . La mezcla se extrae con EtOAc. La capa orgánica se lava sucesivamente con H20 y salmuera, luego se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra. El residuo se purifica mediante cromatografía rápida (sílice, 4:1 - 1:1 hexano : EtOAc) para proporcionar el producto como un sólido color blanco (3.89 g, 87%) .
Scíínntoecsi.s d,ße A una solución del éster metílico anterior (1.12 g, 2.97 mmol) en dioxano (4 ml) a 0°C se le agrega LiOH (4 ml , ÍN) . La mezcla se agita a 0°C durante 3 horas y se extingue con una solución de ácido cítrico acuoso (5%, 200 ml) y se diluye con EtOAc. La capa orgánica se separa y se lava sucesivamente con H20 y salmuera, luego se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra para proporcionar un sólido color blanco.
Síntesis de A una solución del ácido anterior (1.0 g, 2.75 mmol) en CH2C12 (10 ml) a 0°C se le agrega ácido trifluoroacético (10 ml) . La mezcla se agita a 0°C durante 2 horas y luego se concentra. AL residuo se le agrega MeOH (1 ml) seguido de HCl (1.5 ml, 4 N en dioxano) . Se agrega éter para precipitar el producto (701 mg, 96%) como un sólido color blanco.
Ejemplo 18 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene el grupo dicarbonilo presentado en la Figura 30.
Síntesis de Se le agrega lentamente al t-BuOK (15 ml , 1.0 M en THF)) la solución del pAF protegido (1.09 g, 3.4 mmol) en difluoroacetato de metilo (6 ml , 68.7 mmol). La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos y se extingue con ácido cítrico (5 g, 25.4 mmol) y se diluye con H20. La mezcla se extrae con EtOAc. La capa orgánica se lava sucesivamente con H20 y salmuera, se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra. El residuo se purifica mediante cromatografía rápida (sílice, 20:1 - 3:2 hexano : EtOAc) para proporcionar el producto como un sólido color café claro (1.27 g, 94%) .
Síntesis de A la solución del éster metílico anterior (1.26 g, 3.17 mmol) en dioxano (30 ml) a 0°C se le agrega LiOH (30 ml, 1 N) .
La mezcla se agita a 0°C durante 0.5 horas y se extingue con ácido cítrico (10 g, 51 mmol) y se diluye con H20. la mezcla se extrae con EtOAc. La capa orgánica se lava sucesivamente con H20 y salmuera, luego se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra. El residuo se purifica mediante cromatografía rápida (sílice, 100:1 - 10:1 CH2Cl2:MeOH, 0.5% HOAc) para proporcionar un aceite color café (1.19 g, 98%) .
Síntesis de A una solución del ácido anterior (1.196 g, 3.1 mmol) en CH2C12 (15 ml) a 0°C se le agrega ácido trifluoroacético (15 ml) . La mezcla se agita durante 0.5 horas y se concentra. Se agrega al residuo MeOH (2 ml) seguido de HCl (2 ml, 4 N en dioxano) . Después se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto (0.82 mg, 82%) como un sólido color blanco.
Ejemplo 19 Este ejemplo detalla la síntesis del reactivo PEG que contiene hidroxilamina presentado en la Figura 12a. El reactivo PEG que contiene hidroxilamina se produce como se describe en la Figura 12a.
Ejemplo 20 Este ejemplo describe detalles de la síntesis del reactivo PEG que contiene hidroxilamina presentado en la Figura 12b. El reactivo PEG que contiene hidroxilamina se produce como se describe en la Figura 12b.
Ejemplo 21 Este ejemplo describe detalles de la síntesis del reactivo PEG que contiene hidroxilamina presentado en la Figura 12c. El reactivo PEG que contiene hidroxilamina se produce como se describe en la Figura 12c.
Ejemplo 22 Este ejemplo describe detalles de la síntesis del reactivo PEG que contiene hidroxilamina presentado en la Figura 12d. El reactivo PEG que contiene hidroxilamina se produce como se describe en la Figura 12d.
Ejemplo 23 Este ejemplo describe detalles de la síntesis del reactivo PEG que contiene hidroxilamina presentado en la Figura 13. El reactivo PEG que contiene hidroxilamina se produce como se describe en la Figura 13.
Ejemplo 24 Este ejemplo describe detalles de la síntesis del reactivo PEG que contiene hidroxilamina presentado en la Figura 14. El reactivo PEG que contiene hidroxilamina se produce como se describe en la Figura 14.
Ejemplo 25 Este ejemplo describe detalles de la síntesis del reactivo PEG que contiene hidroxilamina presentado en la Figura 15. El reactivo PEG que contiene hidroxilamina se produce como se describe en la Figura 15.
Ejemplo 26 Este ejemplo describe detalles de la síntesis del reactivo PEG que contiene hidroxilamina presentado en la Figura 16a. El reactivo PEG que contiene hidroxilamina se produce como se describe en la Figura 16a.
Ejemplo 27 Este ejemplo describe detalles de la síntesis del reactivo PEG que contiene hidroxilamina presentado en la Figura 16b. El reactivo PEG que contiene hidroxilamina se produce como se describe en la Figura 16b.
Ejemplo 28 Este ejemplo describe detalles de la síntesis del reactivo PEG que contiene hidroxilamina presentado en la Figura 18. El reactivo PEG que contiene hidroxilamina se produce como se describe en la Figura 18.
Ejemplo 29 Este ejemplo detalla la síntesis de l,2-bis(4- (bro ometil) fenil) disulfano (1) presentado en la Figura 36. En un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación a presión de gas de nitrógeno, se agrega disulfuro de p-tolilo (5.0 g, 20.3 mmol), N-bromo succinimida (8.6 g, 48.4 mmol) y 60 ml de benceno anhidro. La solución se calienta hasta 95°C. Se agrega azobisisobutilnitrilo (.106g, .64 mmol) en una sola porción. La reacción se deja en reflujo durante 16 horas.
El solvente se retira mediante evaporación giratoria y se disuelve el sólido color café en 100 ml de acetato etílico. La mezcla de reacción se lava sucesivamente con una solución de bicarbonato de sodio acuosa saturada ( 2 x 50 ml), agua desionizada (1 x 50 ml) y salmuera (1 x 50 ml) . La capa orgánica se separa y seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y concentra a presión reducida. El producto crudo se purifica mediante cromatografía en gel de sílice utilizando el sistema cromatográfico HORIZON™ de Biotage Inc., para producir, después de la concentración de las fraccionas apropiadas y retiro de trazas de solvente (bomba de vacío) , 1, 2-bis (4- (bromometil) fenil) disulfano (2.1 g, 25%) como un sólido color blanco. Se obtienen espectro de datos 1H RMN y un espectro de masa. La reacción se repite para producir (2.0 g, 23%) del producto.
Ejemplo 30 Este ejemplo detalla la síntesis de 1, 2-bis (4-dietil-2-acetamidomalonato) fenildisulfano (2) presentado en la Figura 36. Se agrega acetamidomalonatodietílico (6.48 g, 30 mmol) y 50 ml de EtOH anhidro a un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación a una presión de gas nitrógeno. A la solución se le agrega en una porción etóxido de sodio (2.6 mg, 38 mmol) . La reacción se enfría a 0°C. Se disuelve 1,2-bis (4- (bromometil) fenil) disulfano (4.1 g, 10.1 mmol) en 20 ml de 1:1 EtOH/THF y se agrega a través de un embudo de adición a la solución fría durante el transcurso de una hora. El baño helado se retira y se le permite a la reacción agitarse a temperatura ambiente durante 6 horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y el sólido color rojo se disuelve en 100 ml de acetato etílico. La mezcla de reacción se lava sucesivamente con una solución de ácido cítrico 5% (2 x 50 ml) , agua desionizada (1 x 50 ml) y salmuera (1 x 50 ml) . La capa orgánica se separa y seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y concentra a presión reducida. El producto crudo se purifica mediante cromatografía en gel de sílice utilizando un sistema cromatográfico HORIZON™ de Biotage Inc., para proporcionar después de la concentración de las fracciones apropiadas y retiro de trazas de solvente (bomba de vacío) , 1, 2-bis (4-dietil-2-acetamidomalonato) fenildisulfano (5.0 g, 73%) como un sólido color amarillo. Se obtienen mediante 1H RMN espectro de datos, una traza HPLC y un espectro de masa.
Ejemplo 31 Este ejemplo detalla la síntesis de 1, 2-bis (4- (ácido 2-a ino-3 -propanoico) fenildisulfano (3) presentado en la Figura 36. En un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación a presión de gas nitrógeno se agrega 1, 2-bis (4-dietil-2-acetamidomalonato) fenildisulfano (1.0 g, 1.4 mmol), HCl (8 ml, 12 M) y 8 ml de 1,4 -dioxano. La reacción se agita en reflujo durante 16 horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y bomba de vacío para proporcionar el producto crudo 1, 2-bis (4- (ácido o-3 -propanoico) fenildisulfano (0.75 g, 135%) como un aceite claro. Se obtienen datos del espectro y espectro de masa mediante 1H RMN.
Ejemplo 32 Este ejemplo detalla la síntesis de N,N' -diBoc-1, 2-bis (4-(ácido 2 -amino-3 -propanoico) fenildisulfano (4) presentado en la Figura 36. Al 1, 2-bis (4- (ácido 2 -amino-3 -propanoico) fenildisulfano (0.75 g, 1.9 mmol) en un matraz de fondo redondo previamente seco se le agregan 5 ml de 1,4 -dioxano, 5 ml de agua desionizada, dicarbonato de Di-t-butilo (.65g, 3.0 mmol) y bicarbonato de sodio (0.98 g, 12 mmol) . La reacción se agita a temperatura ambiente durante 16 horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y el aceite claro se disuelve en 100 ml de acetato etílico. La mezcla de reacción se lava sucesivamente con una solución de ácido cítrico al 5% (5 ml x 2) , agua desionizada (50 ml) y salmuera (50 ml) . La capa orgánica se separa y seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y concentra a presión reducida. El producto crudo se purifica mediante cromatografía en gel de sílice utilizando un sistema cromatográfico HORIZON™ de Biotage Inc., para proporcionar, después de la concentración de las fracciones adecuadas y retiro de trazas de solvente (bomba de vacío) , N,N' -diBoc-1, 2-bis (4- (ácido 2 -amino-3 -propanoico) (0.5 g, 44% de crudo, 52% sobre dos pasos) como un sólido color blanco. Se obtuvieron datos del espectro 1H RMN, traza HPLC y espectro de masa.
Ejemplo 33 Este ejemplo detalla la síntesis del ácido N-BOC-2-amino-3- (4 -mercaprofenil) propanoico (5) presentado en la Figura 36. En un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación bajo presión de gas nitrógeno se agrega N,N'-diBoc-1, 2-bis (4- (ácido 2-amino-3-propanoico) fenildisulfano (0.5 g, 0.84 mmol), n-butil fosfino (0.6 ml , 2.44 mmol) y 15 ml de THF anhidro. La reacción se agita a temperatura ambiente durante dos horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y el aceite claro se disuelve en 50 ml de acetato etílico, la mezcla de reacción se lava sucesivamente con una solución de ácido cítrico al 5% (2 x 25 ml) , agua desionizada (25 ml) y salmuera (25 ml) . La capa orgánica se separa y seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y concentra a presión reducida. El producto crudo se purifica mediante cromatografía en gel de sílice utilizando un sistema cromatográfico HORIZON™ de Biotage Inc., para proporcionar después de la concentración de las fracciones apropiadas y retiro de trazas de solvente (bomba de vacío), ácido N-BOC-2-amino-3- (4-mercaptofenil) propanoico (0.5 g, 100%) como un sólido color blanco. Se obtuvieron datos del espectro XH RMN, trazas HPLC y espectro de masas.
Ejemplo 34 Este ejemplo detalla la síntesis del clorhidrato del ácido 2-amino-3- (4-mercaptofenil) propanoico (6) presentado en la Figura 36. En un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación se agrega ácido N-BOC-2-amino-3- (4-mercaptofenil) propanoico (.5 g, 1.6 mmol), lo ml de diclorometano anhidro y 3 ml de ácido trifluoroacético. La reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y se agregan 1 ml de cloruro de hidrógeno 4.0 M en 1,4 -dioxano. El matraz de fondo redondo se revuelve levemente, luego se agregan 100 ml de éter dietílico anhidro al precipitado del clorhidrato del ácido 2-amino-3- (4-mercaptofenil) propanoico (0.39 g, 100%) para obtener un sólido color blanco. Se obtuvieron datos del espectro 1H RMN, trazas HPLC y espectro de masa.
Ejemplo 35 Este ejemplo detalla la síntesis de 2- (4- (2oxopropiltio) bencil) -2 -acetamidomalonato dietílico (7) presentado en la Figura 37. En un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación en presión de gas nitrógeno, se agrega (2) (1.1 g, 1.6 mmol), n-Bu3P (1.2 ml , 4.8 mmol) y 25 ml de THF anhidro (25 ml) . la reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. Se agrega a la reacción cloroacetona (0.16 ml , 2.0 mmol) y NaHC03 (0.98 g, 12 mmol). La reacción se agita a temperatura ambiente durante dos horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y el sólido color blanco se disuelve en 100 ml de acetato etílico. La mezcla de reacción se lava sucesivamente con una solución de bicarbonato de sodio acuosa saturada (50 ml x 2) , agua desionizada (50 ml) y salmuera (50 ml) . La capa orgánica se separa y seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y concentra a presión reducida. El producto crudo se purifica mediante cromatografía en gel de sílice utilizando el sistema cromatográfico HORIZON™ de Biotage Inc., para proporcionar, después de la concentración de las fracciones apropiadas y retiro de trazas de solvente (bomba de vacío), 2- (4- (2-oxopropiltio) bencil) -2-acetam?domalonato dietílico (0.62 g, 98%) como un sólido color blanco. Se obtuvieron datos del espectro X RMN, una traza HPLC y espectro de masas.
Ejemplo 36 Este ejemplo detalla la síntesis del ácido 3- (4- (2-oxopropiltio) fenil) -2-aminopropanóico (8) presentado en la figura 37. A un matraz de fondo redondo secado en horno con barra de agitación bajo presión de gas nitrógeno se agrega 7 (0.62 g, 1.5 mmol), 10 ml de 1,4-d?oxano y 10 ml de HCl 12 M. La reacción fue traída a reflujo y se permite que se agite durante toda la noche. El solvente fue removido mediante evaporación rotativa para producir ácido 3- (4- (2-oxoprop?lt?o) -fenil) -2-ammopropanó?co (0.40 g, 99% crudo).
Ejemplo 37 Este ejemplo detalla la síntesis de N-BOC-3- (4- (2-oxopropiltio) fenil) -2-aminopropanoico (9) presentado en la Figura 37. En 8 (0.35g, 1.3 mmol) en un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación a una presión de gas nitrógeno se agrega dicarbonato Di-t-butílico (0.63 g, 3.0 mmol), bicarbonato de sodio (0.98 g, 12 mmol), 8 ml de 1,4-dioxano y 8 ml de agua desionizada. La reacción se agita a temperatura ambiente durante 16 horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y el aceite claro se disuelve en 100 ml de acetato etílico. La mezcla de reacción se lava sucesivamente con 5% de solución de ácido cítrico (50 ml x 2) , agua desionizada (50 ml) y salmuera (50 ml) . La capa orgánica se separa y seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y concentra a presión reducida. El producto crudo se purifica mediante cromatografía en gel de sílice utilizando un sistema cromatográfico HORIZON™ de Biotage Inc., para proporcionar luego de concentrar las fracciones apropiadas y retiro de trazas del solvente (bomba de vacío) , B-BOC-3- (4- (2-oxopropiltio) fenil) -2 -aminopropanoico (0.30 g, 66% del crudo) como un sólido color blanco. Se obtuvieron Espectro de datos 1H RMN, trazas HPLC y espectro de masa.
Ejemplo 38 Este ejemplo detalla la síntesis del ácido N-BOC-3- (4- (2-oxopropilsulfinil) fenil) -2-aminopropanoico (10) presentado en la Figura 37. En un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación a una presión de gas nitrógeno, se agregan 9 (150 mg, 4 mmol) , 8 ml de ácido acético glacial y 2 ml de peróxido de hidrógeno en agua 30% v/v. La reacción se agita durante dos horas a temperatura ambiente. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y el aceite claro se disuelve en 50 ml de acetato etílico. La mezcla de reacción se lava sucesivamente con una solución de ácido cítrico al 5% (25 ml x 2) , agua desionizada (25 ml) y salmuera (25 ml) . La capa orgánica se separa y seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y concentra a presión reducida. El producto crudo se purifica mediante cromatografía en gel de sílice utilizando un sistema cromatográfico HORIZON™ de Biotage Inc., para proporcionar, después de la concentración de las fracciones apropiadas y retiro de trazas de solvente (bomba de vacío) , ácido N-BOC-3- (4- (2 -oxopropilsulfinil) fenil) -2-aminopropanoico (0.13 g, 86% crudo) . Se obtuvieron una traza HPLC y espectro de masas .
Ejemplo 39 Este ejemplo detalla la síntesis del ácido 3- (4- (2-oxopropilsulfinil) fenil) -2 -aminopropanoico (11) presentado en la Figura 37. En un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación se agrega ácido N-BOC-3- (4- (2-oxopropilsulfinil) fenil) -2 -aminopropanoico 10 (0.13 g, 0.35 mmol) , 10 ml de diclorometano y 3 ml de ácido trifluoroacético. La reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y se agrega 1 ml de cloruro de hidrógeno 4.0 M en 1,4 -dioxano. El matraz de fondo redondo es agitado levemente para agregar 100 ml de éter dietílico anhidro para precipitar el ácido 3- (4- (2-oxopropilsulfinil) fenil) -2 -aminopropanoico (0.072 g, 74% de producto crudo) como un sólido color blanco. Se obtiene el espectro de datos ""? RMN, traza HPLC y un espectro de masa.
Ejemplo 40 Este ejemplo detalla la síntesis del ácido N-BOC-3- (4- (2-oxopropilsulfonil) fenil) -2 -aminopropanoico (12) presentado en la Figura 37. En un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación a presión de gas nitrógeno se agrega 9 (150 mg, 0.4 mmol) , 8 ml de ácido acético glacial y 2 ml de peróxido de hidrógeno en agua 30% v/v. la reacción se agita a temperatura ambiente durante 24 horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y el aceite claro se disuelve en 50 ml de acetato etílico. La mezcla de reacción se lava sucesivamente con una solución de ácido cítrico al 5% (25 ml x 2) , agua desionizada (25 ml) y salmuera (25 ml) . La capa orgánica se separa y seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y concentra a presión reducida. El producto crudo se purifica mediante cromatografía en gel de sílice utilizando un sistema cromatográfico HORIXON™ de Biotage Inc., para proporcionar, luego de la concentración de las fracciones apropiadas y retiro de trazas de solvente (bomba de vacío) , ácido N-BOC-3- (4- (2 -oxopropilsulfonil) fenil) -2 -aminopropanoico (12) (0.13 g, 86% producto crudo) . Se obtiene una traza HPLC y un espectro de masa.
Ejemplo 41 Este ejemplo detalla la síntesis del ácido 3- (4- (2-oxopropilsulfonil) fenil) -2 -aminopropanoico presentado en la Figura 37. En un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación se agrega el ácido N-BOC-3- (4- (2-oxopropilsulfonil) fenil) -2 -aminopropanoico 12 (0.13 g, 0.35 mmol) , 10 ml de diclorometano anhidro y 3 ml de ácido trifluoroacético. La reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y se agrega 1 ml de cloruro de hidrógeno 4.0 M en 1,4 -dioxano. El matraz de fondo redondo se agita levemente, luego se agregan 100 ml de éter dietílico anhidro para precipitar el ácido 3- (4- (2 -oxopropilsulfonil) fenil) -2-aminopropanoico (0.067 g, 65% de producto crudo) como un sólido color blanco. Se obtiene el espectro de datos 1H RMN, traza HPLC y un espectro de masa.
Ejemplo 42 Este ejemplo detalla la síntesis del ácido 3- (4- (2-oxopropiltio) fenil) -2 -aminopropanoico (14) presentado en la Figura 37. En un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación se agrega ácido N-BOC-3- (4- (2-oxopropiltio) fenil) -2-aminopropiónico 9 (0.10 g, .28 mmol), 10 ml de diclorometano anhidro y 3 ml de ácido trifluoroacético. La reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y se agrega 1 ml de cloruro de hidrógeno 4.0 M en 1,4 -dioxano. El matraz de fondo redondo se agita levemente y se agregan 100 ml de éter dietílico anhidro para precipitar el ácido 3- (4- (2-oxopropiltio) fenil) -2 -aminopropanoico (0.062 g, 85% de producto crudo) como un sólido color blanco. S obtienen espectro de datos 1H RMN, traza HPLC y un espectro de masa.
Ejemplo 43 Este ejemplo detalla la síntesis del ácido N-BOC-3- (4- (2-oxociclopentiltio) fenil) -2 -aminopropanoico (15) presentado en la Figura 38. En un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación a presión de gas nitrógeno se agrega 5 (0.15 g, 0.76 mmol), 2-clorociclopentanona (0.12 ml , 1.25 mmol), bicarbonato de sodio (0.98 g, 12 mmol), 15 ml de THF anhidro. La reacción se agita a temperatura ambiente durante 16 horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y el sólido color blanco se disuelve en 100 ml de acetato etílico. La mezcla de reacción se lava sucesivamente con una solución de bicarbonato de sodio acuoso saturado (50 ml x 2), agua desionizada (50 ml) y salmuera (50 ml) . La capa orgánica se separa y seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y concentra bajo presión reducida. El producto crudo se purifica mediante cromatografía en gel de sílice utilizando un sistema cromatográfico HORIZON ™ de Biotage Inc., para proporcionar, después de la concentración de fracciones apropiadas y retiro de trazas de solvente (bomba de vacío), ácido N-BOC-3- (4- (2-oxociclopentiltio) fenil) -2 -aminopropanoico (0.15 g, 51 mmol) como un sólido color blanco. Se obtienen una traza HPLC y un espectro de masa.
Ejemplo 44 Este ejemplo detalla la síntesis del ácido 3- (4- (2-oxociclopentiltio) fenil) -2 -aminopropanoico (0.15 g, 0.39 mmol), 10 ml de diclorometano anhidro y 3 ml de ácido trifluoroacético. La reacción se agita a temperatura ambiente durante dos horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y se agrega 1 ml de cloruro de hidrógeno 4.0 M en 1,4 -dioxano. El matraz de fondo redondo se agita levemente y luego se agregan 100 ml de éter dietílico anhidro para precipitar el ácido 3- (4- (2-oxociclopentiltio) fenil) -2-aminopropanoico (0.108 g, 100%) como un sólido color blanco. Se obtiene espectro de datos 1H RMN, traza HPLC y un espectro de masa .
Ejemplo 45 Este ejemplo detalla la síntesis del ácido N-BOC-3- (4- (2-oxob tiltio) fenil) -2 -aminopropanoico (18) presentado en la Figura 38. En un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación a presión de gas nitrógeno se agrega 5 (0.15 g, 0.76 mmol), 1 -bromo-2 -butanona (0.12 ml , 1.25 mmol), bicarbonato de sodio (0.98 g, 12 mmol), 15 ml de THF anhidro. La reacción se agita a temperatura ambiente durante 16 horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y el sólido color blanco se disuelve en 100 ml de acetato etílico. La mezcla de reacción se lava sucesivamente con una solución de bicarbonato de sodio acuoso saturado (50 ml x 2) , agua desionizada (50 ml) y salmuera (50 ml) . La capa orgánica se separa y seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y concentra bajo presión reducida. El producto crudo se purifica mediante cromatografía en gel de sílice utilizando un sistema cromatográfico HORIZON™ de Biotage Inc., para proporcionar, luego de concentrar las fracciones adecuadas y retirar las trazas del solvente (bomba de vacío), ácido N-BOC-3- (4- (2-oxobutiltio) fenil) -2 -aminopropanoico (0.15 g, 51%) como un sólido color blanco. Se obtienen una traza HPLC y un espectro de masa .
Ejemplo 46 Este ejemplo detalla la síntesis de los Compuestos 19-22 presentados en la Figura 38. Los compuestos 19-22 son sintetizados utilizando la metodología análoga que se describe para los Compuestos 10-14.
Ejemplo 47 Este ejemplo detalla la síntesis del ácido 3- (4- (2-oxobutiltio) fenil) -2 -aminopropanoico (23) presentado en la Figura 38. En un matraz de fondo redondo previamente seco con barra de agitación se agrega el ácido N-BOC-3- (4- (2-oxobutiltio) fenil) -2 -aminopropanoico 18 (0.15 g, .56 mmol), 10 ml de diclorometano anhidro y 3 ml de ácido trifluoroacético. La reacción se agita a temperatura ambiente durante dos horas. El solvente se retira mediante evaporación giratoria y se agrega 1 ml de cloruro de hidrógeno en 1,4 -dioxano. El matraz de fondo redondo se agita levemente y se agregan 100 ml de éter dietílico para precipitar el ácido 3- (4- (2-oxobutiltio) fenil) -2 -aminopropanoico (0.149 g, 100%) como un sólido color blanco. Se obtiene espectro de datos 1H RMN, traza HPLC y un espectro de masa .
Ejemplo 48 Este ejemplo detalla la síntesis de los Compuestos 24-27 presentados en la Figura 39. Los Compuestos 24-27 se sintetizan utilizando metodología análoga a la descrita para los Compuestos 10-14.
Ejemplo 49 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene el grupo dicarbonilo presentado en la Figura 31.
Síntesis de ~' Se agrega lentamente al t-BuOK (15 ml, 1.0 M en THF) la solución del pAF protegido (1.0 g, 3.1 mmol) en trifluoroacetato de metilo (5 ml , 50 mmol) . La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos y se extingue con ácido cítrico (5g, 25.4 mmol) y se diluye con EtOAc. La capa orgánica se lava sucesivamente con H20 y salmuera, luego se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra. El residuo se purifica mediante cromatografía rápida (sílice, 20:1 - 3:2 hexano : EtOAc) para proporcionar el producto (1.07 g, 83%) como un sólido color café claro.
Síntesis de Se agrega LiOH (30 ml , ÍN) a la solución de éster metílico anterior (1.0 g, 2.4 mmol) en dioxano (30 ml) a 0°C. La mezcla se agita a 0°C durante 0.5 horas y se extingue con ácido cítrico (10 g, 51 mmol) y se diluye con H20. la mezcla se extrae con EtOAc. La capa orgánica se lava sucesivamente con H20 y salmuera, luego se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra. El residuo se purifica mediante cromatografía rápida (sílice, 100:1 - 10:1 CH2Cl2:Me0H, 0.5% HOAc) para proporcionar un aceite color café (0.87 g, 98%).
Síntesis de Se agrega ácido trifluoroacético (15 ml) a una solución del ácido anterior (1.0 g, 2.5 mmol) en CH2C12 (15 ml a 0°C) .
La mezcla resultante se agita durante 0.5 horas y se concentra in vacuo . Al residuo se le agrega MeOH (2 ml) seguido por HCl (2 ml, 4 N en dioxano) . Luego se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto (0.56 g, 75%) como un sólido color blanco.
Ejemplo 50 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene el grupo dicarbonilo presentado en la Figura 32.
Se agrega lentamente al t-BuOK (15 ml , 1.0 M en THF) la solución del pAF protegido (1.0 g, 3.1 mmol) en pentafluoropropionato de metilo (8 ml, 62 mmol). La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante una hora y se extingue con ácido cítrico (5 g, 25.4 mmol) y se diluye con H20 y salmuera, luego se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra. El residuo se purifica mediante cromatografía rápida (sílice 20:1 - 3:2 hexano : EtOAc) para proporcionar el producto (1.1 g, 76%) como un sólido color café claro.
Se agrega LiOH (30 ml , 1 N) a la solución del éster metílico anterior (1.0 g, 2.1 mmol) en dioxano (30 ml) a 0°C.
La mezcla resultante se agita a 0°C durante 0.5 horas y se extingue con ácido cítrico (10 g, 51 mmol) y H20. la mezcla se extrae con EtOAc. La capa orgánica se lava sucesivamente con H20 y salmuera, luego se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y concentra. El residuo se purifica mediante cromatografía rápida (sílice, 100:1 - 10:1 CH2Cl2:Me0H, 0.5% HOAc) para proporcionar el producto (0.8 g, 84%) como un sólido color amarillo.
Síntesis de Se agrega ácido trifluoroacético (15 ml) a una solución del ácido anterior (0.7 g, 2.5 mmol) a 0°C. La mezcla se agita a la misma temperatura durante 0.5 horas y se concentra. Al residuo se le agrega MeOH (2 ml) seguido por HCl (2 ml, 4 N en dioxano) . Luego se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto (0.62 g, 70%) como un sólido color blanco.
Ejemplo 51 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene el grupo dicarbonilo presentado en la Figura 33.
Síntesis de A una solución agitada del alcohol 1 (2.35 g, 7.6 mmol) y piridina (1.5 ml , 18.6 mmol) en CH2C12 (150 ml) a 0°C se agrega peryodinano de Dess-Martin (3.5 g, 8.3 mmol) . La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche y enfriada con solución acuosa saturada de Na2S203NaHC03 (1:1, 100 ml) y diluida con CH2C12. La capa orgánica fue separada y lavada con H20 y salmuera, luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 20:1 - 3:1 hexano : EtOAc) para proporcionar el aldehido 2 como sólido blanco (2.15 g, 92%). ESI-MS, m/z: 292 (M+ - OH), 232, 204, 175, 131, 115 (100) .
Síntesis de A una solución agitada de diisopropilamina (0.33 ml , 2.33 mmol) en THF (60 ml) a 0°C se agrega n-butil-litio (1.46 ml , 2.34 mmol) . La mezcla fue agitada a 0°C durante 20 minutos y enfriada a -78°C y luego se agrega ciclopentanona. Después que la mezcla fue agitada durante 20 minutos a -78°C, la solución de aldehido 2 (0.5 g, 1.63 mmol) en THF (20 ml , lavado con 20 ml) fue agregada. La mezcla resultante fue agitada a -78°C durante 1.0 hora y enfriada con solución acuosa saturada de NH4C1. Después que la mayoría del solvente fue removido, el residuo fue extraído con EtOAc. La capa orgánica fue lavada con H20 y salmuera, luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 10:1 - 1:1 hexano : EtOAc) proporcionó 3 como aceite incoloro (482 mg, 80%) .
Síntesis de A una solución agitada de alcohol 3 (0.44 g, 1.13 mmol) y piridina (0.6 ml , 7.44 mmol) en CH2C12 (150 ml) a 0°C se agrega peryodinano de Dess-Martin (0.6 g, 1.41 mmol). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción fue enfriada con solución acuosa saturada de Na2S2?3NaHC?3 (1:1, 100 ml) y extraída con CH2C12. Las capas orgánicas fueron combinadas y lavadas con H20 y salmuera, luego secadas sobre Na2S04 anhidro, filtradas y concentradas in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 20:1 - 2:1 hexano :EtOAc) dio la cetona 4 (342 mg, 78%) como aceite incoloro. ESI-MS, m/z: 412 (M+ + Na), 356, 312, 230, 212, 184, 146 (100).
Síntesis de A una solución del metil éster 4 (330 mg, 0.85 mmol) en dioxano (4 ml) a 0°C se agrega LiOH (4 ml, 1 N) . La mezcla resultante fue agitada a 0°C durante 30 minutos y enfriada con solución acuosa de ácido cítrico (5%, 100 ml) . La mezcla fue extraída con EtOAc. La capa orgánica fue lavada sucesivamente con H20 y salmuera, luego secada sobre Na2S0 anhidro, filtrada y concentrada para proporcionar un sólido blanco (310 mg, 97%) . ESI-MS, m/z: 342, 330 (M+ - COOH), 298, 230, 185, 119 (100).
Síntesis de: A una solución del ácido 5 (310 mg, 0.83 mmol) en CH2C12 (4 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (4 ml) . La mezcla fue agitada a 0°C durante 30 minutos y concentrada in vacuo. Al residuo se agrega MeOH (1 ml) seguido por HCl (1 ml , 4 N en dioxano) . Luego se agrega éter (100 ml) para precipitar el producto (241 mg, 94%) como un sólido blanco. ESI-MS, m/z: 298 (M+ + Na), 276 (M+ + 1), 230 (M+ - COOH), 184, 119 (100).
Ejemplo 52 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene dicarbonilo presentado en la figura 34. Síntesis de: A una solución agitada de alcohol (6.0 g, 19.4 mmol) y piridina (12 ml , 150 mmol) en CH2C12 (400 ml) a 0°C se agrega peryodinano de Dess-Martin (14.2 g, 33.4 mmol) . La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción fue enfriada con Na2S203-NaHC03 acuosa saturada (1:1, 300 ml) y extraída con CH2C12. Las capas orgánicas fueron combinadas y lavadas con H20 y salmuera, luego secadas sobre Na2S04 anhidro, filtradas y concentradas in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 1:100 — 1:1 hexano : EtOAc) proporcionó el aldehido (5.48 g, 92%) como un sólido blanco. Síntesis de : A una solución del aldehido anterior (3.41 g, 11.1 mmol) en acetona (70 ml) se agrega KMn04 (2.5 g, 15.8 mmol) en H20 (10 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. Después que la mayor parte del solvente fue removido, el residuo fue disuelto en solución acuosa de ácido cítrico (5%, 300 ml) y extraído con EtOAc. Las capas orgánicas fueron combinadas y lavadas con H20 y salmuera, luego secadas sobre Na2S04 anhidro, filtradas y concentradas in vacuo para proporcionar el producto como un sólido blanco (2.83 g, 79%) que fue usado directamente para la siguiente etapa sin purificación adicional . Síntesis de: A una solución del ácido anterior (2.83 g, 8.76 mmol) en DMF (60 ml) a 0°C se agrega 1-amino-2 -propanol (1.4 ml , 17.9 mmol), clorhidrato de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida (EDC, 4.1 g, 21.4 mmol), hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, 2.2 g, 18.5 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (DIEA, 9 ml , 51.6 mmol) . La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche y luego enfriada con solución acuosa de ácido cítrico (5%, 200 ml) y extraída con EtOAc. Las capas orgánicas fueron combinadas y lavadas con H20 y salmuera, luego secadas sobre Na2S04 anhidro, filtradas y concentradas in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 10:1 — 1:1 hexano: EtOAc) proporcionó producto (2.45 g, 74%) como una espuma blanca. Síntesis de: A una solución agitada del alcohol anterior (2.44 g, 6.4 mmol) y piridina (4 ml , 49.6 mmol) en CH2C12 (100 ml) a 0°C se agrega peryodinano de Dess-Martin (4.1 g, 9.7 mmol) . La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción fue enfriada con Na2S203-NaHC03 acuosa saturada (1:1, 300 ml) y extraída con CH2C1 . La capa orgánica fue lavada con H20 y salmuera, luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 1:1 — 1:3 hexano : EtOAc) proporcionó el producto (1.84 g, 76%) como un sólido amarillo. Síntesis de : A una solución del metil éster anterior (1.72 g, 4.6 mmol) en dioxano (10 ml) a 0°C se agrega LiOH (10 ml , 1 N) . La mezcla fue agitada a la misma temperatura durante 3 horas y enfriada con solución acuosa de ácido cítrico (5%) . La mezcla fue extraída con EtOAc. La capa orgánica fue lavada sucesivamente con H20 y salmuera, luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada para proporcionar el producto (1.7 g) como un sólido que fue usado directamente para la siguiente etapa sin purificación. A una solución del ácido anterior (1.7 g, 4.7 mmol) en CH2C12 (15 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (15 ml) . La mezcla fue agitada a la misma temperatura durante 2 horas y concentrada in vacuo. Al residuo se agrega HCl (1.5 ml , 4 N en dioxano) seguido por éter (400 ml) . El producto precipitado (1.52 g, 90% para 2 etapas) fue recolectado como un sólido blanco.
Ejemplo 53 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene hidrazida presentado en la figura 44. Síntesis de: A una solución de aldehido (410 mg, 1.34 mmol) en EtOH (15 ml) se agrega hidrazida fórmica (170 25 mg, 2.83 mmol) . La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 1 hora. Después que la mayoría del solvente fue removido, el residuo fue extraído con CH2C12. Las capas orgánicas fueron combinados y concentradas in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 1:6 — 1:1 hexano :EtOAc) proporcionó un sólido blanco A una solución del metil éster anterior (349 mg, 1 mmol) en dioxano (7 ml) se agrega LiOH (7 ml , 1 N) a 0°C. La mezcla fue agitada a la misma temperatura durante 10 minutos y enfriada con ácido cítrico (2.5 g) y diluida con H20. La mezcla fue extraída con EtOAc. La capa orgánica fue lavada sucesivamente con H20 y salmuera, luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada para dar un sólido blanco (290 mg, 87%) . Síntesis de : A una solución del ácido anterior (290 mg, 0.87 mmol) en CH2C12 (20 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (20 ml) . La mezcla fue agitada durante 20 minutos y concentrada. Al residuo se agrega MeOH (1 ml) seguido por HCl (1.0 ml, 4 N en dioxano) . Luego se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto (195 mg, 83%) como un sólido amarillo claro.
Ejemplo 54 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene hidrazida presentado en la figura 45. Síntesis de: A una solución de N-Boc-4-hidroximetilfenilalanina (11.73 g, 39.8 mmol) en DMF (100 ml) se agrega clorhidrato de metil éster de alanina (9.0 g, 64.5 mmol), clorhidrato de l-(3-dimetilaminopropil) 3-etilcarbodiimida (EDC, 15.4 g, 80.3 mmol), N,N-diisopropiletilamina (DIEA, 30 ml , 172 mmol) e hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, 8.4 g, 70.6 mmol). La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche y luego diluida con EtOAc. La capa orgánica fue separada y lavada sucesivamente con H20, ácido cítrico (5%) , H20, NaHC03, H0 y salmuera, luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrado para proporcionar el dipéptido protegido como un sólido blanco (13.74 g, 91%; Síntesis de: A una solución del dipéptido protegido anterior (10.33 g, 27.2 mmol) en CH2C12 (300 ml) a 0°C se agrega piridina (8 ml, 99.1 mmol) y peryodinano de Dess-Martin (14 g, 33.0 mmol) . La mezcla de reacción fue agitada durante toda la noche y luego enfriada con NaHCO3/Na2S203 acuosa saturada (1:1) . La capa orgánica fue lavada sucesivamente con H20, ácido cítrico, H20 y salmuera, luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentradas. El residuo fue purificado mediante cromatografía instantánea (sílice, 9:1 — 1:1 hexano: EtOAc) para proporcionar el producto (10.12 g, 98%) como un sólido blanco. Síntesis de: A una solución del aldehido de dipéptido (10.1 g, 26.7 mmol) en EtOH (200 ml) se agrega hidrazida acética (3.7 g, 45 mmol) . La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 30 minutos y concentrada. Al residuo se agrega H20 (1 L) y CH2Ci2 (500 ml) . La capa orgánica fue separada y concentrada para proporcionar un sólido blanco (11.21 g, 97%). Síntesis de: A una solución del metil éster anterior (11.1 g, 25.6 mmol) en dioxano (50 ml) a 0°C se agrega LiOH (50 ml , 1 N) . La mezcla fue agitada a la misma temperatura durante 30 minutos y luego enfriada con ácido cítrico (20 g) y diluida con H20 (200 ml) . La mezcla fue extraída con EtOAc. La capa orgánica fue lavada sucesivamente con H20 y salmuera, luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrado para proporcionar un sólido blanco (9.52 g, 88%). Síntesis de: A una solución del ácido anterior (9.5 g, 22.6 mmol) en CH2C12 (50 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (50 ml) . La mezcla fue agitada a 0°C durante 1 hora y concentrada in vacuo. Al residuo se agrega HCl (7 ml, 4 N en dioxano) seguido por éter (500 ml) . El precipitado fue recolectado como un sólido blanco (7.25 g, 90%).
Ejemplo 55 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene oxima presentado en la figura 46A. Síntesis de: A una solución del aldehido (3.0 g) en MeOH/H+ se agrega 2 equivalentes de clorhidrato de hidroxilamina. La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 2 horas y concentrada. Al residuo se agrega H20 (200 ml) seguido por CH2C12. La capa orgánica fue separada y concentrada in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 3:7 — 1:9 hexano:EtOAc) produjo el producto (96%) como un sólido.
Síntesis de A una solución del metil éster anterior (3.0 g) en dioxano (10 ml) a 0°C se agrega LiOH (10 ml , 1 N) . La mezcla fue agitada a la misma temperatura durante 3 horas y luego enfriada mediante la adición de ácido cítrico (5 g) y diluida con H20. La mezcla fue extraída con EtOAc. La capa orgánica fue lavada sucesivamente con H20 y salmuera, luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada para proporcionar un sólido. Luego, a una solución del ácido resultante en CH2C12 (20 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (20 ml) . La mezcla de reacción fue agitada a 0°C durante 1 hora y concentrada. Al residuo se agrega MeOH (1 ml) seguido por la adición de HCl (2.0 ml, 4 N en dioxano) . Luego se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto (87%) como un sólido.
Ejemplo 56 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene oxima presentado en la figura 46B. Síntesis de: A una solución del aldehido (3.0 g) en MeOH/H+ se agrega 2 equivalentes de clorhidrato de metoxiamina. La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 2 horas y concentrad. Al residuo se agrega H20 (200 ml) seguido por CH2C12. La capa orgánica fue separada y concentrada in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 3:7 — 1:9 hexano: EtOAc) produjo el producto (93! como un sólido. e Síntesis de: A una solución del metil éster anterior (3.0 g) en dioxano (10 ml) a 0°C se agrega LiOH (10 ml , 1 N) . La mezcla fue agitada a la misma temperatura durante 3 horas y luego enfriada mediante la adición de ácido cítrico (5 g) y diluida con H20. La mezcla fue extraída con EtOAc. La capa orgánica fue lavada sucesivamente con H20 y salmuera, luego secada sobre NaS0 anhidro, filtrada y concentrada para proporcionar un sólido. Después, a una solución del ácido resultante en CH2C12 (20 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (20 ml) . La mezcla de reacción fue agitada a 0°C durante 1 hora y concentrada. Al residuo se agrega MeOH (1 ml) seguido por la adición de HCl (2.0 ml, 4 N en dioxano) . Luego se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto (89%) como un sólido.
Ejemplo 57 Este ejemplo detalla la síntesis del aminoácido que contiene hidrazina en la figura 46C.
Síntesis de: A una solución del aldehido (3.0 g) en MeOH/H+ se agrega 2 equivalentes de metilhidrazida . La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 2 horas y concentrada. Al residuo se agrega H20 (200 ml) seguido por CH2C12. La capa orgánica fue separada y concentrada in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 3:7 — 1:9 hexano : EtOAc) produjo el producto (93%) como un sólido. Síntesis de: A una solución del metil éster anterior (3.0 g) en dioxano (10 ml) a 0°C se agrega LiOH (10 ml , 1 N) . La mezcla fue agitada a la misma temperatura durante 3 horas y luego enfriada mediante la adición de ácido cítrico (5 g) y diluida con H20. La mezcla fue extraída con EtOAc. La capa orgánica fue lavada sucesivamente con H20 y salmuera, luego secada sobre NaS0 anhidro, filtrada y concentrada para proporcionar un sólido. Después, a una solución del ácido resultante en CH2C12 (20 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (20 ml) . La mezcla de reacción fue agitada a 0°C durante 1 hora y concentrada. Al residuo se agrega MeOH (1 ml) seguido por la adición de HCl (2.0 ml, 4 N en dioxano) . Luego se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto (89%) como un sólido.
Ejemplo 58 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 48A. Síntesis de: A una solución de mPEG(30K)-OH (1.0 g, 0.033 mmol) en CH2C12 anhidro (10 ml) se agrega cloroformiato de p-nitrofenol (60 mg, 0.28 mmol) . La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas. Se agrega éter (200 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el producto (1.0 g, 100%) como un polvo blanco.
Síntesis de: A una solución de 3-hidroxietilcarbamato de t-butilo (1.75 g, 10 mmol) en THF (60 ml) fueron agregados N-hidroxiftalimida (3.2 g, 20 mmol), trifenilfosfina (2.0 g, 15 mmol) . La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego enfriada a 0°C. Se agrega diisopropilazodicarboxilato (DIAD, 2.0 ml , 10.5 mmol) gota a gota vía una jeringa durante 1 hora. El baño de hielo fue removido y la mezcla fue agitada durante toda la noche y concentrada. El sólido blanco fue disuelto en acetato de etilo (100 ml) . La mezcla de reacción fue lavada sucesivamente con una solución bicarbonato de sodio solución acuosa saturada (100 ml) , H20 (100 ml) y salmuera (100 ml) , luego secada sobre MgS04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. El producto crudo fue purificado mediante cromatografía instantánea (sílice, 100:1-10:1 hexano: EtOAc) para proporcionar el compuesto de título (2.6 g, 81%) como un sólido blanco. Síntesis de: A una solución del enlazador Boc-protegido (2.0 g, 9.1 mmol) en CH2C12 (5 ml) se agrega ácido trifluoroacético (5 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 1 hora y concentrada. Al residuo se agrega HCl (4 N en dioxano, 1.5 ml) seguido por la adición de Et20 (150 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el enlazador de amina (1.1 g, 85%) como un sólido blanco.
Síntesis de : A una mezcla de mPEG(30 K) p-nitrofenolcarbonato (1.0 g, 0.033 mmol) y amina enlazador (53 mg, 0.21 mmol) en DMF-CH2C12 (10 ml, 1:2) se agrega diisopropiletilamina (50 µL, 0.28 mmol) y DMAP (5 mg, 0.041 mmol) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas. Luego se agrega éter (200 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el producto (0.83 g, 83%) como un polvo blanco. Síntesis de: A una solución de mPEG ftalimida (30K, 0.8 g, 0.0266 mmol) en MeOH (5 ml) se agrega hidrazina (8.5 µL, 0.27 mmol) . La mezcla resultante fue agitada a 45 °C durante 1.0 hora. Después la reacción fue enfriada a temperatura ambiente, se agrega CH2C12 (150 ml) y la solución fue lavada con una solución HCl acuosa (0.1 N, 100 ml) . La capa acuosa fue extraída CH2C12 (150 ml) . Las capas orgánicas fueron combinadas y lavadas con H20 (100 ml) , luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrado. El residuo fue disuelto en CH2C12 (5 ml) . Luego se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto de hidroxilamina (0.72 g, 90%) como un polvo blanco.
Ejemplo 59 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 48B. Síntesis de: O mPEG<30K}-?rSD-<( ?-N?2 A una solución de mPEG (3 OK) -OH (1.0 g, 0.033 mmol) en CH2C12 anhidro (10 ml) se agrega formiato de cloro p-nitrofenol (60 mg, 0.28 mmol). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas. Luego se agrega éter (200 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el producto (1.0 g, 100%) como un polvo blanco. Síntesis de: A una solución de 2 -hidroxietilcarbamato de t-butilo (2.8 ml, 18 mmol) en THF (60 ml) se agregan N-hidroxiftalimida (5.8 g, 36 mmol), trifenilfosfina (3.6 g, 27 mmol) . La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego enfriada a 0°C. Se agrega diisopropilazodicarboxilato (DIAD, 3.6 ml , 19 mmol) gota a gota vía una jeringa durante 1 hora. El baño de hielo fue removido y la mezcla fue agitada durante toda la noche y concentrada. El sólido blanco se disolvió en acetato de etilo (100 ml) . La mezcla de reacción fue lavada sucesivamente con saturado una solución de bicarbonato de sodio acuosa (2 X 50 ml) , H20 (50 ml) y salmuera (50 ml) , luego secada sobre MgS04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. El producto crudo fue purificado mediante cromatografía instantánea utilizando un sistema de cromatografía HORIZON™ de Biotage Inc. para proporcionar el compuesto de título con impurezas (12 g, 206%) como un sólido blanco. Síntesis de: A una solución del enlazador Boc-protegido (12 g) en CH2C12 (5 ml) se agrega ácido trifluoroacético (5 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 1 hora y concentrada. Al residuo se agrega HCl (4 N en dioxano, 1.5 ml) seguido por la adición de Et20 (150 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el enlazador de amina (3.0 g, 68% para dos etapas) como un sólido blanco.
Síntesis de: A una mezcla de mPEG (30 K) p-nitrofenolcarbonato (1.0 g, 0.033 mmol) y enlazador de amina (50 mg, 0.21 mmol) en DMF-CH2C12 (10 ml, 1:2) se agregan diisopropiletilamina (50 µL, 0.28 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (4 mg, 0.033 mmol). La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas. Se agrega éter (200 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el producto (0.81 g, 81%) como un polvo blanco. Síntesis de: A una solución de mPEG(30K) ftalimida (0.8 g, 0.0266 mmol) en MeOH (5 ml) se agrega hidrazina (8.5 µL, 0.27 mmol) . La mezcla resultante fue agitada a 45°C durante 1 hora. Después la reacción fue enfriada a temperatura ambiente, se agrega CH2C12 (150 ml) y la solución fue lavada con solución HCl acuosa (0.1 N, 100 ml) . La capa acuosa fue extraída con CH2C12 (150 ml) . Las capas orgánicas fueron combinadas y lavadas con H20 (100 ml) , luego secadas sobre Na2S04 anhidro, filtradas y concentradas. El residuo fue disuelto en CH2C12 (5 ml) . Se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto de hidroxilamina (0.68 g, 85%) como un polvo blanco.
Ejemplo 60 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 49 A. Síntesis de: A una solución de N- (3 -bromopropil) ftalimida (4.0 g, 15.0 mmol) en DMF (50 ml) a 0°C se agrega K2C03 (10 g, 73 mmol) y N-hidroxicarbamato de t-butilo (2.5 g, 18.8 mmol) . La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla fue diluida con H20 (200 ml) y extraída con EtOAc (200 ml) . La capa orgánica fue lavada con H20 y salmuera, luego secada sobre Na S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo.
La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 20:1 — 3:1 hexano : EtOAc) proporcionó el producto (3.5 g, 72%) como un aceite incoloro. Síntesis de: ,. M H2N~^-^O-NHBoc A una solución de la ftalamida anterior (500 mg, 1.6 mmol) en EtOH (10 ml) se agrega hidrazina (0.25 ml , 8.0 mmol) .
La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de la remoción del precipitado, el filtrado fue concentrado. El residuo se deja en alto vacío durante toda la noche. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 3:1 — 1:1 EtOAc :MeOH) proporcionó el enlazador de amina (252 mg, 85%) como un sólido blanco. Síntesis de: A una solución de mPEG(30K)-OH (1.0 g, 0.033 mmol) en CH2C12 anhidro (10 ml) se agrega cloroformiato de p-nitrofenol (60 mg, 0.28 mmol) . La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas. Se agrega éter (200 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el producto (1.0 g, 100%) como un sólido blanco . Síntesis de: A una solución de la mPEG(30K) activada anterior (3.0 g, 0.1 mmol) en CH2C12 anhidro (30 ml) ser agregan diisopropiletilamina (88 µL, 0.5 mmol) y el enlazador de amina (76 mg, 0.4 mmol) . La mezcla resultante,, fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas. Se agrega éter (700 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (2.8 g, 93%) .
Síntesis de: A una solución de mPEG (30 K) Boc-protegido (2.0 g, 0.067 mmol) en CH2C12 anhidro (10 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (10 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 5 horas. Se agrega éter (500 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (1.8 g, 90%) .
Ejemplo 61 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 49B. Síntesis de: A una solución de N-hidroxicarbamato de t-butilo (5.0 g, 37.6 mmol) en DMF (30 ml) a 0°C se agrega K2C03 (12 g, 87.6 mmol) y N- (2-bromoetil) ftalimida (10.0 g, 39.7 mmol). La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 3 horas .
La mezcla fue diluida con H20 (200 ml) y extraída con EtOAc (200 ml) . La capa orgánica fue lavada con H20 y salmuera, luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 20:1 — 1:1 hexano : EtOAc) proporcionó el producto (5.2 g, 55%) como un sólido blanco.
Síntesis de: H2N^.O- HB?C A una solución de la ftalamida anterior (500 mg, 1.6 mmol) en EtOH (10 ml) se agrega hidrazina (0.25 ml , 8.0 mmol) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de la remoción del precipitado, el filtrado fue concentrado. El residuo se dejó en alto vacío durante toda la noche. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 3:1 — 1:1 EtOAcMeOH) proporcionó el enlazador de amina (301 mg, 86%) como un sólido blanco.
Síntesis de: A una solución del mPEG(30K) activado anterior (1.0 g, 0.033 mmol) en CH2C12 anhidro (10 ml) se agregaron diisopropiletilamina (58 µL, 0.33 mmol), 4-dimetilaminopiridina (4 mg, 0.033 mmol) y el enlazador de amina anterior (64 mg, 0.31 mmol). La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas. Se agrega éter (200 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.85 g, 85%) .
Síntesis de: A una solución de mPEG(30K) Boc-protegido (0.85 g, 0.028 mmol) en CH2C12 anhidro (10 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (10 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 5 horas. Se agrega éter (200 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.68 g, 80%) .
Ejemplo 62 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 50A. Síntesis de: A una solución de mono-Boc ftalimida (2.1 g, 6.9 mmol) en piridina (50 ml) a 0°C se agrega Boc20 (3.3 g, 15.1 mmol) . La mezcla resultante fue calentada a 60°C durante toda la noche. Después el solvente fue removido in vacuo, el residuo fue diluido con EtOAc (200 ml) y lavado con ácido cítrico (5%, 200 ml) , agua (200 ml) y salmuera (200 ml) , luego secado sobre Na2S04 anhidro, filtrado y concentrado in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 20:1 — 3:1 hexano :EtOAc) proporcionó el producto (2.37 g, 85%) como aceite amarillo.
Síntesis de: A una solución de di-Boc ftalimida (1.21 g, 2.98 mmol) en MeOH (15 ml) a 0°C se agrega amoníaco en MeOH (15 ml , 7 N, 105 mmol) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. El precipitado fue filtrado y el filtrado fue concentrado in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 10:1 — 6:4 EtOAc :MeOH) proporcionó el enlazador de amina (0.61 g, 74%) como un sólido blanco.
Síntesis de: A una solución de mPEG(30K)-OH (1.0 g, 0.033 mmol) en CH2C12 anhidro (10 ml) se agrega formiato de cloro p-nitrofenol (60 mg, 0.28 mmol) . La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas. Se agrega éter (200 ml) para precipitar el mPEG(30K). El producto fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo (1.0 g, 100%) .
Síntesis de : A una solución del mPEG (30K) activado anterior ( 1 . 0 g , 0 . 033 mmol ) en CH2C12 anhidro ( 10 ml ) ser agregan diisopropiletilamina (58 µL, 0.33 mmol), 4-dimetilaminopiridina (5 mg, 0.041 mmol) y el enlazador de amina diBoc (90 mg, 0.33 mmol) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas. Se agrega éter (200 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.82 g, 82%) . Síntesis de: A una solución de mPEG(30K) Boc-protegido (0.82 g, 0.027 mmol) en CH2C12 anhidro (8 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (8 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 5 horas. Se agrega éter (200 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.57 g, 70%) .
Ejemplo 63 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentado en la figura 50B.
Síntesis de: A una solución de mono-Boc ftalimida (1.5 g, 4.7 mmol) en piridina a 0°C se agrega BoC20 (2.2 g, 10.0 mmol). La mezcla resultante fue calentada a 60°C durante toda la noche. Después el solvente fue removido in vacuo, el residuo fue diluido con EtOAc (200 ml) y lavado con ácido cítrico (5%, 200 ml) , agua (200 ml) y salmuera (200 ml) , luego secado sobre Na2S04 anhidro, filtrado y concentrado in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 20: 1 — 3:1 hexano : EtOAc) proporcionó el producto (1.6 g, 81%) como un aceite.
Síntesis de: A una solución de di-Boc ftalimida (1.5 g, 3.6 mmol) en MeOH (15 ml) a 0°C se agrega amoníaco en MeOH (15 ml , 7 N, 105 mmol) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. El precipitado fue filtrado y el filtrado fue concentrado in vacuo. La purificación del residuo mediante cromatografía instantánea (sílice, 10:1 — 6:4 EtOAc :MeOH) proporcionó el enlazador de amina (0.85 g, 82%) como un sólido blanco.
Síntesis de: A una solución de mPEG(30K)-OH (1.0 g, 0.033 mmol) en CH2C1 anhidro (10 ml) se agrega cloroformiato de p-nitrofenol (60 mg, 0.28 mmol) . La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas. Se agrega éter (200 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el producto (1.0 g, 100%) como un polvo blanco.
Síntesis de: A una solución del mPEG(30K) activado anterior (1.0 g, 0.033 mmol) en CH2C12 anhidro (10 ml) se agregan diisopropiletilamina (58 µL, 0.33 mmol), 4-dimetilaminopiridina (5 mg, 0.041 mmol) y el enlazador de amina di-Boc anterior (100 mg, 0.34 mmol) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas. Se agrega (200 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.89 g, 89%) .
Síntesis de: A una solución de mPEG(30K) Boc-protegido (0.89 g, 0.030 mmol) en CH2C12 anhidro (8 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (8 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 5 horas. Se agrega éter (200 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.65 g, 73%) .
Ejemplo 64 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 51A.
Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) propionaldehído (0.5 g, 0.0166 mmol) y enlazador de amina (73 mg, 0.25 mmol) en MeOH (10 ml) se agrega NaCNBH3 (20 mg, 0.30 mmol) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 48 horas. Después que la mayoría del solvente fue removido, se agrega éter (200 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.43 g, 86%) . mPEG{30K>-< Síntesis de: A una solución de mPEG(30K) di-Boc protegido (0.42 g, 0.014 mmol) en CH2C12 anhidro (4 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (4 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 8 horas. Se agrega éter (100 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.35 g, 83%) .
Ejemplo 65 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 51B.
Síntesis de: mPEG(3ÜK)-O'''^ A una solución agitada de mPEG(30K) (6.0 g, 0.2 mmol) y piridina (0.1 ml , 1.2 mmol) en CH2C12 (60 ml) a 0°C se agrega peryodinano de Dess-Martin (0.2 g, 0.47 mmol) . La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción es luego enfriada con Na2S203-NaHC03 acuoso saturado (1:1, 100 ml) y extraída con CH2C12 (500 ml x 2). Las capas orgánicas son combinadas y lavadas con H20 y salmuera, luego secadas sobre Na2S04 anhidro, filtradas y concentradas in vacuo. El residuo es disuelto en CH2C12 (50 ml) . Se agrega éter (1 L) a la solución. El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (4.9 g, 82%) .
Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) aldehido (0.5 g, 0.0166 mmol) y enlazador de amina (73 mg, 0.25 mmol) en MeOH (10 ml) es agregado NaCNBH3 (20 mg, 0.30 mmol). La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 48 horas. Después que la mayoría del solvente es removido, se agrega éter (200 ml) . El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.43 g, 85%) . mPEG(30K)- ^ ^ ^ ^^ Síntesis de: " A una solución de mPEG(30K) di -Boc protegido (0.42 g, 0.014 mmol) en CH2C12 anhidro (4 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (4 ml) . La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 8 horas. Se agrega éter (100 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.35 g, 83%) .
Ejemplo 66 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 52A.
Síntesis de: A una solución de mPEG (30K) -NH2 (6.0 g, 0.2 mmol) en DMF (60 ml) se agregan Boc-Ser-OH (205 mg, 1.0 mmol), clorhidrato de l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC, 190 mg, 1.0 mmol) y N,N' -diisopropiletilamina (0.17 ml , 1.0 mmol) . La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 10 horas y diluida con EtOAc (500 ml) . La mezcla resultante es lavada sucesivamente con NaHC03 acuoso saturado (300 ml) , H20 (300 ml) y salmuera (300 ml) , luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. El residuo es disuelto en CH2C12 (50 ml) . Se agrega éter (700 ml) . El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (5.1 g, 82%) .
Síntesis de: A una solución del mPEG(30K) anterior (3.0 g, 0.1 mmol) en CH2C12 (15 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (15 ml) . La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 3 horas y concentrada. Al residuo se agrega CH2C12 (5 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 2 ml) . Se agrega éter (400 ml) para precipitar dihidroxilamina (2.6 g, 85%) como un sólido blanco.
Síntesis de: A una solución del mPEG(30K) anterior (2.0 g, 0.067 mmol) en H20-CH3CN (1:1, 20 ml) es agregado NaI04 (15 mg, 0.07 mmol) . La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 4 horas y diluida con CH2C12 (500 ml) . La mezcla resultante es lavada con H20 (100 ml) y salmuera (100 ml) , luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. El residuo es disuelto en CH2C12 (50 ml) . Se agrega éter (700 ml) . El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (1.8 g, 90%) .
Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) aldehido (0.5 g, 0.0166 mmol) y enlazador de amina (73 mg, 0.25 mmol) en MeOH (10 ml) se agrega NaCNBH3 (20 mg, 0.30 mmol). La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 48 horas. Después que la mayoría del solvente es removido, se agrega éter (200 ml) . El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.43 g, 86%) .
Síntesis de: A una solución de mPEG(30K) di-Boc protegido (0.42 g, 0.014 mmol) en CH2C12 anhidro (4 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroácético (4 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 8 horas. Se agrega éter (100 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.35 g, 83%) .
Ejemplo 67 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 52B.
Síntesis de: A una mezcla de mPEG propionaldehído (30 K, 0.5 g, 0.0166 mmol) y enlazador de amina (70 mg, 0.25 mmol) en MeOH (10 ml) se agrega NaCNBH3 (20 mg, 0.30 mmol). La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 48 horas.
Después que la mayoría del solvente fue removido, se agrega éter (200 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.40 g, 80%) . mPE {30 )-O'^ /^ '^s^'O~NH2 H Síntesis de: A una solución de mPEG(30K) di-Boc protegido (0.40 g, 0.013 mmol) en CH2C12 anhidro (4 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroácético (4 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 8 horas. Se agrega éter (100 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.35 g, 87%) .
Ejemplo 68 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 53A.
Síntesis de: mPEG(30K)-O^^° A una solución agitada de mPEG(30K) (6.0 g, 0.2 mmol) y piridina (0.1 ml , 1.2 mmol) en CH2C12 (60 ml) a 0°C se agrega peryodinano de Dess-Martin (0.2 g, 0.47 mmol) . La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción es luego enfriada con NaS203-NaHC03 acuoso saturado (1:1, 100 ml) y extraída con CH2C12 (500 ml x 2) . Las capas orgánicas están combinadas y lavadas con H20 y salmuera, luego secadas sobre Na2S04 anhidro. filtradas y concentradas in vacuo. El residuo es disuelto en CH2C12 (50 ml) . Se agrega éter (1 L) a la solución. El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (4.9 g, 82%) .
Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) aldehido (0.5 g, 0.0166 mmol) y enlazador de amina (70 mg, 0.25 mmol) en MeOH (10 ml) se agrega NaCNBH3 (20 mg, 0.30 mmol) . La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 48 horas. Después que la mayoría del solvente es removido, se agrega éter (200 ml) . El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.40 g, 80%). mPEG(30K)-O' ^ N v Síntesis de: '' A una solución de mPEG(30K) di-Boc protegido (0.40 g, 0.013 mmol) en CH2C12 anhidro (4 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (4 ml) . La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 8 horas. Se agrega éter (100 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.35 g, 87%) .
Ejemplo 69 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 53B.
Síntesis de: A una solución de mPEG (30K) -NH2 (6.0 g, 0.2 mmol) en DMF (60 ml) se agregan Boc-Ser-OH (205 mg , 1.0 mmol), clorhidrato de l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC, 190 mg, 1.0 mmol) y N,N' -diisopropiletilamina (0.17 ml , 1.0 mmol). La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 10 horas y diluida con EtOAc (500 ml) . La mezcla resultante es lavada sucesivamente con NaHC03 acuoso saturado (300 ml) , H20 (300 ml) y salmuera (300 ml) , luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. El residuo es disuelto en CH2C12 (50 ml) . Se agrega éter (700 ml) . El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (5.1 g, 82%) .
Síntesis de: A una solución del mPEG(30K) anterior (3.0 g, 0.1 mmol) en CH2C12 (15 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (15 ml) . La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 3 horas y concentrada. Se agrega CH2C12 al residuo (5 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 2 ml) . Se agrega éter (400 ml) para precipitar dihidroxilamina (2.6 g, 85%) como un sólido blanco.
Síntesis de: A una solución del mPEG(30K) anterior (2.0 g, 0.067 mmol) en H20-CH3CN (1:1, 20 ml) se agrega NaI04 (15 mg, 0.07 mmol) . La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 4 horas y diluida con CH2C12 (500 ml) . La mezcla resultante es lavada con H20 (100 ml) y salmuera (100 ml) , luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. El residuo es disuelto en CH2C12 (50 ml) . Se agrega éter (700 ml) . El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (1.8 g, 90%) .
Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) aldehido (0.5 g, 0.0166 mmol) y enlazador de amina (70 mg, 0.25 mmol) en MeOH (10 ml) se agrega NaCNBH3 (20 mg, 0.30 mmol) . La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 48 horas. Después que la mayoría del solvente es removido, se agrega éter (200 ml) . El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.40 g, 80%) .
Síntesis de: A una solución de mPEG(30K) di-Boc protegido (0.40 g, 0.013 mmol) en CH2C12 anhidro (4 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (4 ml) . La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 8 horas. Se agrega éter (100 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (0.35 g, 87%) .
Ejemplo 70 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 54A.
Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) propionaldehído (0.5 g, 0.0166 mmol) y enlazador de amina (40 mg, 0.16 mmol) en MeOH (10 ml) se agrega NaCNBH3 (12 mg, 0.17 mmol). La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 60 horas.
Después que la mayoría del solvente fue removido, el residuo fue disuelto en CH2C12 (200 ml) y lavado con ácido cítrico (5%, 100 ml) . La capa orgánica fue secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo para proporcionar un sólido blanco (0.42 g, 84%) . mPEG(3CK)- '^V ^* '^v/ ~ 2 Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) ftalimida (0.4 g, 0.013 mmol) en MeOH (4 ml) se agrega H2NNH2 (4.2 µL, 0.13 mmol). La mezcla fue agitada a 45°C durante 1.0 hora y concentrada. El residuo fue disuelto en CH2C12 (100 ml) y lavado con HCl (0.1 N, 100 ml) . La capa acuosa fue extraída con CH2C12 (100 ml) . Las capas orgánicas fueron combinadas y lavadas con H0, luego secadas sobre Na2S04, anhidro, filtradas y concentradas. El residuo fue disuelto en CH2C12 (5 ml) . Se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto de hidroxilamina (0.34 g, 85%) como un polvo blanco.
Ejemplo 71 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 54B. mPEG(30K)-O^-^ Síntesis de: A una solución agitada de mPEG(30K) (6.0 g, 0.2 mmol) y piridina (0.1 ml, 1.2 mmol) en CH2C12 (60 ml) a 0°C se agrega peryodinano de Dess-Martin (0.2 g, 0.47 mmol) . La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción es luego enfriada con Na2S203-NaHC03 acuoso saturado (1:1, 100 ml) y extraída con CH2C12 (500 ml x 2). Las capas orgánicas son combinadas y lavadas con H20 y salmuera, luego secadas sobre Na2S04 anhidro, filtradas y concentradas in vacuo. El residuo es disuelto en CH2C12 (50 ml) . Se agrega éter (1 L) a la solución. El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (4.9 Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) aldehido (0.5 g, 0.0166 mmol) y enlazador de amina (40 mg, 0.16 mmol) en MeOH (10 ml) se agrega NaCNBH3 (12 mg, 0.17 mmol). La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 60 horas. Después que la mayoría del solvente es removido, el residuo es disuelto en CH2C12 (200 ml) y lavado con ácido cítrico (5%, 100 ml) . La capa orgánica es secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo para proporcionar un sólido blanco (0.42 g, 84%) . mPEG(30K)- ^ ^N^.^^ Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) ftalimida (0.4 g, 0.013 mmol) en MeOH (4 ml) se agrega H2NNH2 (4.2 µL, 0.13 mmol). La mezcla es agitada a 45°C durante 1.0 hora y concentrada. El residuo es disuelto en CH2C12 (100 ml) y lavado con HCl (0.1 N, 100 ml) . La capa acuosa es extraída con CH2C12 (100 ml) . Las capas orgánicas son combinados y lavadas con H20, luego secadas sobre Na2SCt anhidro, filtradas y concentradas. El residuo es disuelto en CH2C12 (5 ml) . Se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto de hidroxilamina (0.34 g, 85%) como un polvo blanco.
Ejemplo 72 Este ejemplo detalla la síntesis de mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 55.
Síntesis de: A una solución de mPEG (30K) -NH2 (6.0 g, 0.2 mmol) en DMF (60 ml) se agregan Boc-Ser-OH (205 mg , 1.0 mmol), clorhidrato de l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC, 190 mg, 1.0 mmol) y N,N' -diisopropiletilamina (0.17 ml , 1.0 mmol) . La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 10 horas y diluida con EtOAc (500 ml) . La mezcla resultante es lavada sucesivamente con NaHC03 acuoso saturado (300 ml) , H0 (300 ml) y salmuera (300 ml) , luego secada sobre NaS04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. El residuo es disuelto en CH2C12 (50 ml) . Se agrega éter (700 ml) . El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (5.1 g, 82%) .
Síntesis de: A una solución del mPEG(30K) anterior (3.0 g, 0.1 mmol) en CH2C12 (15 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (15 ml) . La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 3 horas y concentrada. Se agrega al residuo CH2C12 (5 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 2 ml) . Se agrega éter (400 ml) para precipitar dihidroxilamina (2.6 g, 85%) como un sólido blanco.
Síntesis de: A una solución del mPEG ( 30K) anterior ( 2 . 0 g , 0 . 067 mmol ) en H20-CH3CN ( 1 : 1 , 20 ml ) se agrega NaI04 ( 15 mg, 0 . 07 mmol) . La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 4 horas y diluida con CH2C12 (500 ml) . La mezcla resultante es lavada con H20 (100 ml) y salmuera (100 ml) , luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. El residuo es disuelto en CH2C12 (50 ml) . Se agrega éter (700 ml) . El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (1.8 g, 90%) .
Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) aldehido (0.5 g, 0.0166 mmol) y enlazador de amina (40 mg, 0.16 mmol) en MeOH (10 ml) se agrega NaCNBH3 (12 mg, 0.17 mmol). La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 60 horas. Después que la mayoría del solvente es removido, el residuo es disuelto en CH2C12 (200 ml) y lavado con ácido cítrico (5%, 100 ml) . La capa orgánica es secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo para proporcionar un sólido blanco (0.42 Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) ftalimida (0.4 g, 0.013 mmol) en MeOH (4 ml) es agregado H2NNH2 (4.2 µL, 0.13 mmol). La mezcla es agitada a 45°C durante 1.0 hora y concentrada. El residuo es disuelto en CH2C12 (100 ml) y lavado con HCl (0.1 N, 100 ml) . La capa acuosa es extraída con CH2C12 (100 ml) . Las capas orgánicas son combinadas y lavadas con H20, luego secadas sobre Na2S04, filtradas y concentradas. El residuo es disuelto en CH2C12 (5 ml) . Se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto de hidroxilamina (0.34 g, 85%) como un polvo blanco.
Ejemplo 73 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 56A.
Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) propionaldehído (0.5 g, 0.0166 mmol) y enlazador de amina (40 mg, 0.16 mmol) en MeOH (10 ml) es agregado NaCNBH3 (12 mg, 0.17 mmol). La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 60 horas.
Después que la mayoría del solvente es removido, el residuo es disuelto en CH2C12 (200 ml) y lavado con ácido cítrico (5%, 100 ml) . La capa orgánica es secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo para proporcionar un sólido blanco (0.41 g, 82%) . mPEG(30K}-O ^-^ N ^^ 0-NH2 Síntesis de : A una mezcla de mPEG(30K) ftalimida (0.4 g, 0.013 mmol) en MeOH (4 ml) se agrega H2NNH2 (4.2 µL, 0.13 mmol). La mezcla es agitada a 45°C durante 1.0 hora y concentrada. El residuo fes disuelto en CH2C12 (100 ml) y lavado con HCl (0.1 N, 100 ml) . La capa acuosa es extraída con CH2C12 (100 ml) . Las capas orgánicas son combinadas y lavadas con H20, luego secadas sobre Na2S04 anhidro, filtradas y concentradas. El residuo fue disuelto en CH2C12 (5 ml) . Se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto de hidroxilamina (0.34 g, 83%) como un polvo blanco.
Ejemplo 74 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 56B.
Síntesis de: A una solución agitada de mPEG(30K) (6.0 g, 0.2 mmol) y piridina (0.1 ml , 1.2 mmol) en CH2C12 (60 ml) a 0°C se agrega peryodinano de Dess-Martin (0.2 g, 0.47 mmol) . La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción es luego enfriada con Na2S2?3- aHC?3 acuoso saturado (1:1, 100 ml) y extraída con CH2C12 (500 ml x 2) . Las capas orgánicas son combinadas y lavadas con H20 y salmuera, luego secada sobre Na2S0 anhidro, filtradas y concentradas in vacuo. El residuo es disuelto en CH2C12 (50 ml) . Se agrega éter (1 L) a la solución. El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (4.9 g, 82%) .
Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) aldehido (0.5 g, 0.0166 mmol) y enlazador de amina (40 mg, 0.16 mmol) en MeOH (10 ml) se agrega NaCNBH3 (12 mg, 0.17 mmol). La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 60 horas. Después que la mayoría del solvente es removido, el residuo es disuelto en CH2C12 (200 ml) y lavado con ácido cítrico (5%, 100 ml) . La capa orgánica es secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo para proporcionar un sólido blanco (0.41 g, 82%) . mPEGÍSOKJ-O^^ j ^ O-NHa Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) ftalimida (0.4 g, 0.013 mmol) en MeOH (4 ml) se agrega H2NNH2 (4.2 µL, 0.13 mmol). La mezcla es agitada a 45°C durante 1.0 hora y concentrada. El residuo es disuelto en CH2C12 (100 ml) y lavado con HCl (0.1 N, 100 ml) . La capa acuosa es extraída con CH2C12 (100 ml) . Las capas orgánicas son combinadas y lavadas con H20, luego secadas sobre Na2S04 anhidro, filtradas y concentradas. El residuo es disuelto en CH2C12 (5 ml) . Se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto de hidroxilamina (0.34 g, 83%) como un polvo blanco.
Ejemplo 75 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 57.
Síntesis de: A una solución de mPEG (30K) -NH2 (6.0 g, 0.2 mmol) en DMF (60 ml) se agregan Boc-Ser-OH (205 mg, 1.0 mmol), clorhidrato de l-etil-3- (3 -dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC, 190 mg, 1.0 mmol) y N,N' -diisopropiletilamina (0.17 ml , 1.0 mmol) . La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 10 horas y diluida con EtOAc (500 ml) . La mezcla resultante es lavada sucesivamente con NaHC03 acuoso saturado (300 ml) , H20 (300 ml) y salmuera (300 ml) , luego secada sobre Na2S0 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. El residuo es disuelto en CH2C12 (50 ml) . Se agrega éter (700 ml) . El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (5.1 g, 82%) .
Síntesis de: A una solución del mPEG(30K) anterior (3.0 g, 0.1 mmol) en CH2C12 (15 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroácético (15 ml) . La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 3 horas y concentrada. Se agrega CH2C12 al residuo (5 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 2 ml) . Se agrega éter (400 ml) para precipitar dihidroxilamina (2.6 g, 85%) como un sólido blanco.
Síntesis de: A una solución del mPEG(30K) anterior (2.0 g, 0.067 mmol) en H20-CH3CN (1:1, 20 ml) se agrega NaI04 (15 mg, 0.07 mmol) . La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 4 horas y diluida con CH2C12 (500 ml) . La mezcla resultante es lavada con H20 (100 ml) y salmuera (100 ml) , luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. El residuo es disuelto en CH2C12 (50 ml) . Se agrega éter (700 ml) . El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (1.8 g, 90%) .
Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) aldehido (0.5 g, 0.0166 mmol) y enlazador de amina (40 mg, 0.16 mmol) en MeOH (10 ml) se agrega NaCNBH3 (12 mg, 0.17 mmol) . La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 60 horas. Después que la mayoría del solvente es removido, el residuo es disuelto en CH2C12 (200 ml) y lavado con ácido cítrico (5%, 100 ml) . La capa orgánica es secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo para proporcionar un sólido blanco (0.41 g, 82%) .
Síntesis de: A una mezcla de mPEG(30K) ftalimida (0.4 g, 0.013 mmol) en MeOH (4 ml) se agrega H2NNH2 (4.2 µL, 0.13 mmol). La mezcla es agitada a 45°C durante 1.0 hora y concentrada. El residuo es disuelto en CH2C12 (100 ml) y lavado con HCl (0.1 N, 100 ml) . La capa acuosa es extraída con CH2C12 (100 ml) . Las capas orgánicas son combinadas y lavadas con H0, luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrado y concentrado. El residuo es disuelto en CH2C12 (5 ml) . Se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto de hidroxilamina (0.34 g, 83%) como un polvo blanco.
Ejemplo 76 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 58 A. mPEG(5K)-0Ms Síntesis de: A una solución de mPEG(5K)-0H (1.0 g, 0.2 mmol) en CH2C12 (40 ml) se agregan trietilamina (110 µL, 0.79 mmol) y MsCl (50 µL, 0.64 mmol). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 10 horas y concentrada. El producto crudo (1.0 g) fue usado directamente para la siguiente etapa sin purificación. mPEG(5K)-O-NHBoc Síntesis de: A una solución del mPEG(5K)-0Ms crudo (1.0 g, 0.2 mmol) en CH2C12 (10 ml) se agregaron N-hidroxicarbamato de t-butilo (0.3 g, 2.2 mmol) y trietilamina (0.4 ml , 2.9 mmol) . La mezcla resultante fue agitada a 45°C durante 10 horas y enfriada a temperatura ambiente. Se agrega éter (200 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado y secado in vacuo para proporcionar el producto (0.42, 42%) como un sólido blanco. Síntesis de: mPEG(5K)-0-NH3*Ct A una solución de mPEG (5K) -ONHBoc (0.2 g, 0.04 mmol) en CH2C12 (3 ml) a °C se agrega ácido trifluoroacético (7 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 1 hora y concentrada. Se agrega CH2C12 al residuo (5 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 2 ml) . Se agrega éter (300 ml) para precipitar el derivado de PEG dihidroxilamina (170 mg, 85%) como un sólido blanco.
Ejemplo 77 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 58B. Síntesis de: mPEG(30K)-OTf A una solución de mPEG(30K)-OH (3.0 g, 0.1 mmol) en CH2C12 (30 ml) se agregan 2,6-lutidina (60 µL, 0.5 mmol) y Tf20 (65 µL, 0.4 mmol) . La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 10 horas. Se agrega éter (400 ml) a la mezcla. El precipitado es filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar un polvo blanco (2.7 g, 90%) . Síntesis de: mPEG{30K)-O-NHBoc A una solución de mPEG (30K) -OTf (2.5 g, 0.083 mmol) en CH2C12 (25 ml) se agregan N-hidroxicarbamato de t-butilo (110 mg, 0.84 mmol) y diisopropiletilamina (0.2 ml , 1,1 mmol) .
La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. Se agrega éter (200 ml) para precipitar el producto (2.2 g, 88%) como un polvo blanco. Síntesis de: mPEG(30K)-O~NH3*Cr A una solución del mPEG(30K) anterior-ONHBoc (2.0 g, 0.067 mmol) en CH2C12 (15 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (15 ml) . La mezcla resultante es agitada a temperatura ambiente durante 3 horas y concentrada. Se agrega CH2C12 al residuo (5 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 2 ml) . Se agrega éter (300 ml) para precipitar el derivado de PEG dihidroxilamina (1.72 g, 86%) como un sólido blanco .
Ejemplo 78 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 59A.
Síntesis de : A una solución de 2- (2 -hidroxietoxi) ftalimida (0.5 g, 2.4 mmol) en CH2C12 (20 ml) se agrega fosgeno (20% en tolueno, 8.0 ml , 15.0 mmol). La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 10 horas y concentrada in vacuo. El residuo (0.45 g, 70%) fue usado directamente para la siguiente reacción sin purificación.
Síntesis de: A una mezcla de mPEG (30K) -NH2 (3 g, 0.1 mmol) y enlazador de cloroformiato (0.27 g, 1.0 mmol) en CH2C12 (30 ml) se agrega diisopropiletilamina (0.2 ml , 1.1 mmol). La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas.
Se agrega éter (500 ml) a la mezcla. El precipitado fue filtrado, lavado y secado in vacuo para proporcionar el producto (2.7 g, 90%) como un sólido blanco.
Síntesis de: A una solución de mPEG(30K) ftalimida (2.1 g, 0.07 mmol) en MeOH (15 ml) se agrega amoníaco (7 N en metanol, 15 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas y concentrada. Al residuo se agrega CH2C12 (5 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 1 ml) . Se agrega éter (300 ml) para precipitar el producto (2.4 g, 89%) como un sólido blanco.
Ejemplo 79 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 59B.
Síntesis de : A una solución de ácido (Boc-aminooxi) acético (3.0 g, 16 mmol) en CH2C12 (80 ml) se agrega N-N' -diisopropilcarbodiimida (DIC, 1.3 ml , 8 mmol) . La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 1 hora y concentrada in vacuo. El producto crudo (4.9 g, 84%) fue usado directamente para la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis de: A una solución de anhídrido (7.3 g, 20 mmol) en DMF (20 ml) se agrega mPEG(5K)-NH2 (20 g, 4 mmol). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 10 horas y diluida con H20 (200 ml) . La mezcla fue extraída con CH2C12 (500 ml) . La capa orgánica fue lavada con H20 y salmuera (100 ml) , luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. Se agrega CH2C12 al residuo (10 ml) seguido por éter (500 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el producto (19.8 g. 99%) como un polvo blanco .
Síntesis de: A una solución de mPEG(5K) Boc protegido (1.0 g, 0.2 mmol) en CH2C12 (5 ml) se agrega ácido trifluoroacético (5 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 1 hora y concentrada. Al residuo se agrega CH2C12 (2 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 0.1 ml) y éter (40 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el producto (0.75 g, 75%) .
Ejemplo 80 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 60A.
Síntesis d Je: A una solución de mPEG(30K)-OH (4.5 g, 0.15 mmol) en CH2C12 (50 ml) se agrega fosgeno (20% en tolueno, 1.6 ml , 3.0 mmol) . La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 10 horas y concentrada in vacuo. El residuo (4.2 g, 93%) fue usado directamente para la siguiente reacción sin purificación.
Síntesis de: A una mezcla de la mPEG(30K) II activado anteriormente (4.2 g, 0.14 mmol) y el enlazador de amina VIII (67 mg, 0.28 mmol) en DMF-CH2C12 (10 ml , 1:2) se agregaron diisopropiletilamina (75 µL, 0.42 mmol). Después la mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas, Se agrega éter (200 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el producto (3.8 g, 90%) como un polvo blanco.
Síntesis de: A una solución de mPEG(30K) ftalimida III (3.5 g, 0.12 mmol) en MeOH (15 ml) se agrega amoníaco (7 N en metanol, 15 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas y concentrada. Al residuo se agrega CH2C12 (5 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 1 ml) . Se agrega éter (300 ml) para precipitar el producto (3.0 g, 86%) como un sólido blanco.
Síntesis de: A una solución de 2 -hidroxietilcarbamato de t-butilo (2.8 ml , 18 mmol) en THF (60 ml) se agregan N-hidroxiftalimida (5.8 g, 36 mmol), trifenilfosfina (3.6 g, 27 mmol). La mezcla de reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego enfriada a 0°C. Se agrega diisopropilazodicarboxilato (DIAD, 3.6 ml , 19 mmol) gota a gota vía una jeringa durante 1 hora. El baño de hilo fue removido y la mezcla fue agitada durante toda la noche y concentrada. El sólido blanco es disuelto en acetato de etilo (100 ml) . La mezcla de reacción fue lavada sucesivamente con solución de bicarbonato de sodio acuosa saturada (2 X 50 ml) , agua desionizada (50 ml) y salmuera (50 ml) , luego secada sobre MgS04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. El producto crudo fue purificado mediante cromatografía instantánea utilizando un sistema de cromatografía HORIZON™ de Biotage Inc. para proporcionar el compuesto de título con impurezas (12 g, 206%) como un sólido blanco.
Síntesis de A una solución del enlazador Boc-protegido crudo (12 g) en CH2C12 (5 ml) se agrega ácido trifluoroacético (5 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 1 hora y concentrada. Al residuo se agrega HCl (4 N en dioxano, 1.5 ml) seguido por la adición de Et20 (150 ml) . El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el enlazador de amina (3.0 g, 68% para dos etapas) como un sólido blanco.
Ejemplo 81 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 60B.
Síntesis de: A una solución de mPEG(5K)-0H (10 g, 2.0 mmol), Ph3P (790 mg, 3.0 mmol) y N-hidroxiftalimida (0.49 g, 3.0 mmol) en CH2C12-THF (2:3, 45 ml) a 0°C se agrega azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD, 409 µL, 2.0 mmol) . Después la mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas, se agrega éter (1 L) a la mezcla. El precipitado fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar mPEG (5K) -ftalimida (9.8 g, 98%) como un polvo blanco.
PEG(6K)-O-NH2 Síntesis de: A una solución de mPEG(5K) ftalimida (3 g, 0.6 mmol) en MeOH (25 ml) se agrega amoníaco (7 N en metanol, 25 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas y concentrada. Al residuo se agrega CH2C12 (5 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 1 ml) . Se agrega éter (300 ml) para precipitar la hidroxilamina (2.5 g, 83%) como un sólido blanco.
Síntesis de: A una solución de mPEG(30K)-OH (6 g, 0.2 mmol) , Ph3P (80 mg, 0.3 mmol) y N-hidroxiftalimida (49 mg, 0.3 mmol) en CH2C12-THF (2:3, 45 ml) a 0°C se agrega azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD, 41 µL, 0.2 mmol). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas. Se agrega éter (200 ml) a la mezcla. El precipitado fue lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el producto de mPEG (30K) -ftalimida (5.8 g, 96%) como un polvo blanco. mPEG(30K)-O-NH2 Síntesis de: A una solución de mPEG(30K) ftalimida (3 g, 0.1 mmol) en MeOH (20 ml) se agrega amoníaco (7 N en metanol, 20 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas y concentrada. Al residuo se agrega CH2C1 (5 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 1 ml) . Se agrega éter (300 ml) para precipitar el mPEG (30K) -ONH2 (2.6 g, 87%) como un sólido blanco.
Ejemplo 82 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 61A. Síntesis de : A una solución de 2- (2- (2-aminoetoxi) etoxi) etanamina (5.0 g, 33.8 mmol) en DMF (100 ml) se agregan ácido (Boc-aminooxi) acético (14.2 g, 74.2 mmol), clorhidrato de l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC, 28.5 g, 0.15 mol) y N,N' -diisopropiletilamina (26 ml , 0.15 mol). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 10 horas y diluida con EtOAc (500 ml) . La mezcla resultante fue lavada sucesivamente con NaHC03 acuoso saturado (300 ml) , H20 (300 ml) y salmuera (300 ml) , luego secada sobre Na2S04 anhidro, filtrada y concentrada in vacuo. El producto crudo (14.2 g, 85%) fue usado directamente para la siguiente reacción sin purificación. Síntesis de: A una solución del enlazador diBoc anterior (3.0 g, 6.1 mmol) en CH2C12 (15 ml) a 0°C se agrega ácido trifluoroacético (15 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 3 horas y concentrada. Al residuo se agrega CH2C12 (5 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 2 ml) . Se agrega éter (400 ml) para precipitar la dihidroxilamina (1.47 g, 82%) como un sólido blanco.
Ejemplo 83 Este ejemplo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 61B.
Síntesis de: A una solución de tri (etilenglicol) (1.5 g, 10 mmol) en THF (100 ml) a 0°C se agrega Ph3P (8.0 g, 30 mmol) y N-hidroxilftalamida (4.9 g, 30 mmol) . A la mezcla se agrega lentamente azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD, 4.08 ml , 20 mmol) . La mezcla resultante fue agitada a 0°C durante 4 horas y temperatura ambiente durante 2 días. Se agrega éter (25 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado fue lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el producto de di-ftalimida (3.72 g, 82%) como un polvo blanco. Síntesis de: H9N-U O-NBa A una solución de diftalamida (2.2 g, 5.0 mmol) en MeOH (20 ml) se agrega amoníaco (7 N en metanol, 20 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas y concentrada. Al residuo se agrega CH2C12 (5 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 1 ml) . Se agrega éter (300 ml) para precipitar el enlazador tri (etilenglicol) dihidroxilamina (1.1 g, 87%) como un sólido blanco.
Ejemplo 84 Este ejemploo detalla la síntesis de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 61C.
Síntesis de A una solución de tetra (etilenglicol) (1.94 g, 10 mmol) en THF (100 ml) a 0°C se agregan Ph3P (8.0 g, 30 mmol) e hidroxilftalimida (4.9 g, 30 mmol) . A la mezcla se agrega lentamente azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD, 4.08 ml , 20 mmol) . La mezcla resultante fue agitada a 0°C durante 4 horas y temperatura ambiente por 2 días. Se agrega éter (25 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado fue lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el producto de di-ftalimida (3.58 g, 74%) como un polvo blanco.
Síntesis de H2N-0^^^ ^^ O ^ ^ 0~NH2 A una solución de diftalimida (2.42 g, 5.0 mmol) en MeOH (20 ml) se agrega amoniaco (7 N en metanol, 20 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 15 horas y concentrada. Al residuo se agrega CH2C12 (5 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 1 ml) . Se agrega éter (300 ml) para precipitar el enlazador de tetra (etilenglicol) dihidroxilamina (1.27 g, 85%) como un sólido blanco.
Ejemplo 85 Este ejemplo detalla la síntesi de la mPEG-hidroxilamina presentada en la figura 62A.
Síntesis de A una solución de hexa (etilenglicol) (2.82 g, 10 mmol) en THF (100 ml) a 0°C se agregan Ph3P (8.0 g, 30 mmol) y N-hidroxilftalimida (4.9 g, 30 mmol) . A la mezcla se agrega lentamente azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD, 4.08 ml , 20 mmol) . La mezcla resultante fue agitada a 0°C durante 4 horas y temperatura ambiente por 2 días. Se agrega éter (25 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado fue lavado con éter y secado in vacuo para proporcionar el producto de di-ftalimida (4.40 g, 77%) como un polvo blanco.
H2N-( )-NH2 Síntesis de A una solución de diftalimida (2.86 g, 5.0 mmol) en MeOH (20 ml) se agrega amoniaco (7 N en metanol, 20 ml) . La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente por 15 horas y concentrada. Al residuo se agrega CH2C12 (5 ml) seguido por la adición de HCl (4 N en dioxano, 1 ml) . Se agrega éter (300 ml) para precipitar el enlazador de hexa (etilenglicol) dihidroxilamina (1.68 g, 87%) como sólido blanco.
Ejemplo 86 Este ejemplo detalla la síntesis del compuesto de mPEG presentado en la figura 62B.
Síntesis de: A una solución de mPEG-OH (30 K, 3.0 g, 0.1 mmol) en CH2C12 anhidro (30 ml) se agrega difósgeno (63 µl , 0.5 mmol). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. Se agrega éter (700 ml) para precipitar el mPEG. El producto fue filtrado, lavado con éter y secado in vacuo (3.0 g, 100%) . Los siguientes ejemplos describen métodos para medir y comparar la actividad in vitro e in vivo de un polipéptido de aminoácido no natural terapéuticamente activo modificado con la actividad in vitro e in vivo de un polipéptido de aminoácido natural terapéuticamente activo.
Ejemplo 87; Análisis de enlace celular Células (3 x 106) son incubados por duplicado en PBS/BSA al 1% (100 µl) de GH sin marcar o GM-CSF y en presencia de 125I-GH (aproximadamente 100,000 cpm o 1 ng) a 0°C durante 90 minutos (volumen total: 120 µl) . Luego las células son resuspendidas y estratificadas sobre 200 µl de FCS helado en un tubo de centrífuga de 350 µl de plástico y son centrifugadas (1000 g; 1 minuto) . El aglomerado es recolectado mediante corte del extremo del tubo y el aglomerado y el sobrenadante son contados separadamente en un contador gamma (Packard) . El enlace específico (cpm) es determinado como enlace total en ausencia de un competidor (media de duplicados) de enlace mínimo (cpm) en presencia de un exceso de 100 veces de GH sin marcar (enlace no específico) . El enlace no específico es medido para cada uno de los tipos de células usadas. Se realizan experimentos en días separados usando la misma preparación de 125I-GH y deben mostrar consistencia interna. 125I-GH demuestra enlace a las células productoras de receptor GH. El enlace es inhibido de manera dependiente de la dosis mediante GH natural sin marcar o hGH, pero no por GM-CSF u otro control negativo. La habilidad de hGH para competir por el enlace de 125I-GH natural, similar a GH natural, sugiere que los receptores reconocen ambas formas igualmente bien.
Ejemplo 88; Estudios in vivo de hGH PEG-ilado PEG-hGH, hGH sin modificar y solución reguladora del pH son administrados a ratones o ratas. Los resultados mostrarán actividad superior y vida media prolongada del hGH PEG-ilado de la presente invención, en comparación con hGH sin modificar que se indica por el peso corporal significativamente incrementado .
Ejemplo 39; Medición de la vida media in vivo de hGH conjugado y no conjugado y variantes de los mismos Toda la experimentación animal se lleva a cabo en una instalación acreditada por AAALAC y bajo protocolos aprobados por el Institucional Animal Care and Use Comité de St . Louis University. Las ratas son alojadas individualmente en jaulas en salas con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se proporciona acceso a los animales a Purina roden chow 5001 certificado y agua ad libitum. Para ratas hipofisectomizadas, el agua para beber contiene adicionalmente glucosa al 5%.
Ejemplo 90; Estudios de farmacocinética La calidad de cada hGH mutante PEG-ilado fue evaluada mediante tres análisis antes de entrar a los experimentos de animales. La pureza del PEG-hGH fue examinada al hacer correr un gel de 4-12% acrilamida NuPAGE Bis-Tris con solución reguladora del pH de corrida MES SDS bajo condiciones no reductoras (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Los geles fueron teñidos con azul de Coomassie. La banda de PEG-hGH fue más de 95% pura en base a barrido de densitometría. El nivel de endotoxina en cada PEG-hGH fue probado por un análisis de LAL cinético usando el equipo KTA2 de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) y fue menor de 5 EU por dosis. La actividad biológica del PEG-hGH fue determinada con un bioanálisis de IM-9-pSTAT5 y se confirmó que el valor de EC50 era menor de 15 nM.
Las propiedades farmacocinéticas de los compuestos de hormona del crecimiento PEG-modificados fueron comparadas entre sí y con la hormona de crecimiento sin PEG en ratas macho Sprague-Dawley (261-425 g) obtenidas de Charles River Laboratories. Se instalaron catéteres quirúrgicamente a la arteria carótida para la recolección de sangre. Enseguida de la instalación exitosa del catéter, los animales fueron asignados a grupos de tratamiento (tres a seis por grupo) antes de la dosificación. Los animales fueron dosificados subcutáneamente con 1 mg/Kg del compuesto en un volumen de dosis de 0.41 - 0.55 ml/Kg. Muestras de sangre fueron recolectadas a varios puntos en el tiempo vía la sonda a permanencia y a tubos de microfuga EDTA-recubiertos . El plasma fue recolectado después de la centrifugación y almacenado a -80°C hasta el análisis. Las concentraciones del compuesto fueron medidas usando equipos de ELISA para hormona de crecimiento de emparedado de anticuerpo, ya sea de BioSource International (Camarillo, CA) o Diagnostic Systems Laboratorios (Webster, TX) . Las concentraciones fueron calculadas usando estándares correspondientes al análogo que fue dosificado. Los parámetros farmacocinéticos fueron estimados usando el programa de modelado WinNonlin (Pharsight, verión 4.1) . Se usó análisis no compartamental con integración trapezoidal lineal hacia arriba/logarítmica hacia abajo y los datos de concentración fueron ponderados uniformemente. Las concentraciones en el plasma fueron obtenidas a intervalos regulares enseguida de una sola dosis subcutánea en ratas. Se administró a ratas (n = 3-6 por grupo) una sola dosis de bolo de 1 mg/Kg de proteína. Proteína tipo silvestre hGH (WHO hGH) , polipéptido de hGH His-marcado (his-hGH) o polipéptido de hGH His-marcado que comprende el aminoácido no natural p-acetil-fenilalanina enlazado covalentemente a PEG de 30 KDa en cada una de seis posiciones diferentes fueron comparados con WHO hGH y (his) -hGH. Se tomaron muestras de plasma a intervalos de tiempo regulares y se analizaron en cuanto al compuesto inyectado como se describe. La tabla a continuación muestra los valores de parámetros farmacocinéticas para la administración de una sola dosis de los varios polipéptidos de hGH. Las curvas de concentración vs tiempo fueron evaluadas mediante análisis no compartamental (Pharsight, versión 4.1). Los valores mostrados son promedios (+/- desviación estándar) . Cmax: concentración máxima; terminalt?/2 : vida media Terminal; AUC0>inf: área bajo la curva de concentración - tiempo, extrapolada a infinito; MRT : tiempo de residencia medio; Cl/f: despeje de plasma, total aparente; Vz/f: volumen aparente de distribución durante fase Terminal. Se observó que (his) hGH pAF92 PEG 30K prolongaba espectacularmente la circulación, incrementaba la vida media en el suero e incrementaba la biodisponibilidad, en comparación con hGH de control .
Tabla 2: valores de parámetro farmacocinética para la administración s.c. de una sola dosis de 1 mg/Kg de bolo en ratas macho Sprague-Da ley normales Ejemplo 91; Estudios farmacodinámicos Ratas macho Sprague-Dawley hipofisectomizadas fueron obtenidas de Charles River Laboratories. Las pituitarias fueron removidas quirúrgicamente a 3 - 4 semanas de edad. Se permite que los animales se aclimaten por un período de tres semanas, tiempo durante el cual el peso corporal fue monitoreado. Animales con una ganancia de peso corporal de 0 - 8 g en un período de siete días antes del inicio del estudio fueron incluidos y aleatorizados a grupos de tratamiento. Se administró a las ratas ya sea una dosis de bolo o dosis diaria subcutáneamente. En todo el estudio las ratas fueron pesadas diaria y secuencialmente, anestesiadas, sangradas y dosificadas (cuando sea aplicable) . Se recolectó sangre del orbital sinus usando un tubo capilar heparinizado y fue colocada en un tubo de microfuga recubierto con EDTA. El plasma fue aislado mediante centrifugación y almacenado a -80°C hasta el análisis. Las concentraciones en el plasma promedio (+/- desviación estándar) fueron graficadas contra intervalos de tiempo. El IGF-1 de péptido es un miembro de la familia de somatomedinas o factores de crecimiento semejantes a insulina. El IGF-1 modera muchos de los efectos promotores del crecimiento de la hormona del crecimiento. Las concentraciones de IGF-1 fueron medidas usando un equipo de pruebas inmunológicas de enzima de enlace competitivo contra los estándares de IGF-1 de rata/ratón proporcionados (Diagnostic Systems Laboratories) . Se administró a las ratas hipofisectomizadas (n = 5-7 por grupo) una sola dosis o dosis diaria subcutáneamente. Los animales fueron secuencialmente pesados, anestesiados, sangrados y dosificados (cuando sea aplicable) diariamente. Los resultados de peso corporal son tomados para tratamientos con placebo, hGH tipo silvestre (hGH), hGH His-marcado ((his)hHG) y polipéptidos de hGH que comprenden p-acetil-fenilalanina enlazado covalentemente a PEG 30 KDa en posiciones 35 y 92. Se observó que la ganancia de peso corporal en el día 9 para el compuesto 30KPEG-pAF35 (his) hGH era estadísticamente diferente (p<0.005) del compuesto de 30KPEG-pAF92 (his) hGH, en que se observó mayor ganancia de peso. El efecto sobre los niveles de IGF-1 de plasma circulante, después de la administración de una sola dosis de polipéptidos de hGH que comprenden un aminoácido codificado no naturalmente que está PEG-ilado, con diferencia significativa determinada mediante prueba t, usando distribución de dos colas, sin aparear, de igual varianza.
Ejemplo 92; Estudio clínico humano de la seguridad y/o eficacia de hGH PEG-ilado que comprende un aminoácido codificado no naturalmente Objetivo : Comparar la seguridad y farmacocinética de hGH humano recombinante PEG-ilado administrado subcutáneamente que comprende un aminoácido codificado no naturalmente con uno o más de los productos de hGH disponibles comercialmente (en los que se incluyen, pero no limitados a Humatrope™ (Eli Lilly & Co.), Nutropin™ (Genentech), Norditropin™ (Novo-Nordisk) , Genotropin™ (Pfizer) y Sainen/Serostotim™ (Serono) ) . Pacientes : Dieciocho voluntarios saludables que fluctúan entre 20 - 40 años de edad „y que pesan entre 60 - 90 Kg son reclutados en el estudio. Los sujetos no tendrán ningún valor de laboratorio anormal clínicamente significativo en cuanto a hematología o química de suero y una selección de toxicología de orina negativa, selección de HIV y antígeno de superficie de hepatitis B. No deben tener ninguna evidencia de lo siguiente: hipertensión; historia de alguna enfermedad hematológica primaria; historia de enfermedad hepática, renal, cardiovascular, gastrointestinal, genitourinaria, metabólica, neurológica significativa; historia de anemia o alteración de ataque; sensibilidad conocida a productos bacterianos o derivados de mamíferos, PEG o albúmina de suero humano; consumo habitual o fuerte a bebidas que contienen cafeína; participación en algún otro estudio clínico o que hayan experimentado transfusión de sangre o donado en el transcurso de 30 días de entrada al estudio; hayan tenido exposición a hGH en el transcurso de tres días de entrada al estudio; hayan tenido una enfermedad en el transcurso de siete días de entrada al estudio y que tengan anormalidades significativas en el examen físico pre-estudio lo las evaluaciones de laboratorio clínicas en el transcurso de 14 días de entrada al estudio. Todos los sujetos son evaluados en cuanto a seguridad y todas las recolecciones de sangre para análisis farmacocinética son recolectados como está programado. Todos los estudios son efectuados con aprobación de comité de ética institucional y consentimiento por escrito del paciente. Diseño de estudio. Este será un estudio cruzado de dos períodos, de fase I, de un solo centro, de etiqueta abierta, aleatorizado, en voluntarios saludables varones. Dieciocho sujetos son asignados aleatoriamente a uno de dos grupos de secuencia de tratamiento (nueve sujetos/grupo) . Se administra GH en dos períodos de dosificación separados como una inyección s.c. de bolo en el muslo superior usando dosis equivalentes de hGH PEG-ilado que comprende un aminoácido codificado no naturalmente y el producto disponible comercialmente escogido. La dosis y frecuencia de administración del producto disponible comercialmente es como se instruye en la etiqueta de empaque. La dosificación adicional, frecuencia de dosificación u otros parámetros como se desee, usando los productos disponibles comercialmente, pueden ser agregados al estudio al incluir grupos adicionales de sujetos. Cada período de dosificación está separado por un período de lavado de 14 días. Los sujetos son confinados al centro de estudio por lo menos 12 horas antes de y 72 horas enseguida de la dosificación para cada uno de los dos períodos de dosificación, pero no entre dos períodos de dosificación. Grupos adicionales de sujetos pueden ser agregados si habrá dosificación adicional, frecuencia u otro parámetro a ser probado en cuanto al hGH PEG-ilado también. Múltiples formulaciones de GH que están aprobadas para uso humano pueden ser usadas en este estudio. Humatrope™ (Eli Lilly & Co . ) , Nutropin™ (Genentech) , Norditropin™ (Novo-Nordisk) , Genotropin™ (Pfizer) y Sainen/Serostotim™ (Serono) ) son productos de GH disponibles comercialmente aprobados para uso humano. La formulación experimental de hGH es el hGH PEG-ilado que comprende un aminoácido codificado no naturalmente.
Toma de muestras de sangre. Se extrae sangre serialmente mediante punción de vena directa antes y después de la administración de hGH. Muestras de sangre venosa (5 ml) para la determinación de concentraciones de GH en el suero son obtenidas a aproximadamente 30, 20 y 10 minutos antes de la dosificación (3 muestras de referencia) y a aproximadamente los siguientes tiempos después de la dosificación: 30 minutos y a 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 y 72 horas. Cada muestra de suero es dividida en dos alícuotas. Todas las muestras de suero son almacenadas a -20°C. Las muestras de suero son embaladas sobre hielo seco. Se efectúan pruebas de laboratorio clínicas en ayunas (hematología, química de suero y urinálisis) inmediatamente antes de la dosis inicial en el día 1, la mañana del día 4, inmediatamente antes de la dosificación en el día 16 y la mañana del día 19. Métodos bioanalíticos . Un procedimiento con equipo de ELISA (Diagnostic Systems Laboratory [DSL] , Webster, TX) , es usado para la determinación de concentraciones de GH en el suero. Determinaciones de seguridad. Los signos vitales son registrados inmediatamente antes de cada dosificación (días 1 y 16) y a 6, 24, 48 y 72 horas después de cada dosificación. Las determinaciones de seguridad están basadas en la incidencia y tipo de eventos adversos y los cambios en las pruebas de laboratorio clínicas de la referencia. Además, cambios del pre-estudio en mediciones de signos vitales, en los que se incluyen presión sanguínea y resultados de examen físico son revaluados . Análisis de datos. Los valores de concentración en el suero post-dosis son corregidos en cuanto a concentraciones de GH de referencia al restar de cada uno de los valores de post-dosis la concentración de GH de referencia media, determinada de la premediación de los niveles de GH de las tres muestras recolectadas a 30, 20 y 10 minutos antes de la dosificación. Las concentraciones de GH en el suero pre-dosis no son incluidas en el cálculo del valor medio si están debajo del nivel de cuantificación del análisis. Los parámetros farmacocinéticas son determinados de los datos de concentración en el suero corregidos en cuanto a concentraciones de GH de referencia. Los parámetros farmacocinéticas son calculados mediante métodos independientes modelo en un sistema de computadora de Digital Equipment Corporation VAX 8600, usando la última versión de los elementos de programación BIOAVL. Los siguientes parámetros farmacocinéticas son determinados: concentración de suero pico (Cmax) ; tiempo para la concentración de suero pico (tmax) ; área bajo la curva de concentración -tiempo (AUC) desde tiempo cero al tiempo de la última toma de muestra (AUC0-72) calculado con el uso de la regla trapezoidal lineal y vida media de eliminación terminal (t?/ ) , calculada a partir de la constante de velocidad de eliminación. La constante de velocidad de eliminación es estimada mediante regresión lineal de puntos de datos consecutivos en la región lineal terminal de la gráfica de concentración - tiempo logarítmica - lineal. La media, desviación estándar (SD) y coeficiente de variación (CV) de los parámetros farmacocinéticas son calculados para cada tratamiento. La proporción de los promedios de parámetro (formulación conservada/formulación sin conservar) es calculada. Resultados de seguridad. La incidencia de eventos adversos está distribuida igualmente a través de los grupos de tratamiento. No hay cambios clínicamente significativos de la referencia o pruebas de laboratorio clínicas pre-estudio o presiones sanguíneas y ningún cambio notable del pre-estudio en resultados de examen físico y mediciones de signos vitales. Los perfiles de seguridad para los dos grupos de tratamiento deben parecer similares. Resultados armacocinéticos. Los perfiles de concentración de GH en el suero media - tiempo (sin corregir par niveles de GH de referencia) en 18 sujetos después de recibir una sola dosis de uno o más productos de hGH disponibles comercialmente (en los que se incluyen, pero no limtados a Humatrope™ (Eli Lilly & Co.), Nutropin™ (Genentech) , Norditropin™ (Novo-Nordisk) , Genotropin™ (Pfizer) y Sainen/Serostotim™ (Serono) ) son comparados con el hGH PEGilado que comprende un aminoácido codificado no naturalmente en cada punto en el tiempo medido. Todos los sujetos deben tener concentraciones de GH de referencia pre-dosis dentro del intervalo fisiológico normal. Los parámetros farmacocinéticas son determinados de datos de suero corregidos en cuanto a concentraciones de GH de referencia medias pre-dosis y la Cmax y tmax son determinados. El tmax para el (los) comparador (es) clínico(s) escogido(s) (Humatrope™ (Eli Lilly & Co . ) , Nutropin™ (Genentech) , Norditropin™ (Novo-Nordisk) , Genotropin™ (Pfizer) y Sainen/Serostotim™ (Serono) ) es significativamente más corto que el tmax para el hGH PEG-ilado que comprende el aminoácido codificado no naturalmente. Los valores de vida media terminal son significativamente más cortos para los productos de hGH disponibles comercialmente probados, en comparación con la vida media terminal para el hGH PEG-ilado que comprende un aminoácido codificado no naturalmente . Aunque el presente estudio se lleva a cabo en sujetos varones saludables, características de absorción y perfiles de seguridad similares serían anticipados en otras poblaciones de pacientes; tales como pacientes masculinos o femeninos con cáncer o insuficiencia renal crónica, insuficiencia renal pediátrica, pacientes en programas de pre-depósito antólogos o pacientes programados para cirugía electiva. En conclusión, dosis individuales administradas subcutáneamente de hGH PEG-ilados que comprenden aminoácido codificado no naturalmente serán seguras y bien toleradas por sujetos varones saludables. En base a una incidencia comparativa de eventos adversos, valores de laboratorio clínicos, signos vitales y resultados de examen físico, los perfiles de seguridad de las formas disponibles comercialmente de hGH y hGH PEG-ilados que comprenden aminoácido codificado no naturalmente serán equivalentes. El hGH PEG-ilado que comprende aminoácido codificado no naturalmente proporciona potencialmente gran utilidad clínica a pacientes y proveedores de cuidado de salud.
Ejemplo 93; Comparación de solubilidad en agua de hGH PEG-ilado y hGH sin PEG La solubilidad en agua de proteína tipo silvestre de hGH (WHO hGH) , polipéptido de hGH His-marcado (his-hGH) o polipéptido de hGH His-marcado que comprende el aminoácido no natural p-acetil -fenilalanina enlazado covalentemente a PEG de 30 KDa en posición 92 son obtenidas al determinar la cantidad de los respectivos polipéptidos que se pueden disolver en 100 µl de agua. La cantidad de hGH PEG-ilado es mayor que las cantidades para WHO hGH y hGH que muestran que la PEG-ilación de polipéptidos de aminoácido no naturales incrementa la solubilidad en agua.
Ejemplo 94; Estudios in vivo de polipéptido de aminoácido no natural terapéuticamente activo modificado Xenoinjertos de tumor de cáncer de próstata son implantados en ratones que luego son separados en dos grupos. Un grupo es tratado diariamente con un polipéptido de aminoácido no natural terapéuticamente activo modificado y el otro grupo es tratado diariamente con polipéptido de aminoácido natural terapéuticamente activo. El tamaño del tumor es medido diariamente y el polipéptido de aminoácido no natural terapéuticamente activo modificado tiene efectividad terapéutica mejorada en comparación con el polipéptido de aminoácido natural terapéuticamente activo, como se indica por una disminución en tamaño de tumor para el grupo tratado con el polipéptido de aminoácido no natural terapéuticamente activo modificado.
Ejemplo 95; Estudios in vivo de polipéptido de aminoácido no natural terapéuticamente activo modificado Xenoinjertos de tumor de cáncer de próstata son implantados en ratones que luego son separados en dos grupos. Un grupo es tratado diariamente con un polipéptido de aminoácido no natural terapéuticamente activo modificado y el otro grupo es tratado diariamente con polipéptido de aminoácido natural terapéuticamente activo. El tamaño del tumor es medido diariamente y el polipéptido de aminoácido no natural terapéuticamente activo modificado tiene efectividad terapéutica mejorada en comparación con el polipéptido de aminoácido natural terapéuticamente activo, como se indica por una disminución en tamaño de tumor para el grupo tratado con el polipéptido de aminoácido no natural terapéuticamente activo modificado. Se comprenderá que los ejemplos y modalidades descritos en la presente son por propósitos ilustrativos solamente y que varias modificaciones y cambios a la luz de los mismos serán sugeridos a las personas experimentadas en el arte para ser incluidos en el espíritu y alcance de la presente solicitud y alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente son incorporadas por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
LISTADO DE SECUENCIAS

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto o sal del mismo, que comprende la fórmula (I) : en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior • sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno o sustituido alquileno)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)]N(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N(R' ) C (S)N(R' ) - -N(R')S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; cada R" es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido o un grupo protector o cuando más de un grupo R" está presente, dos R" forman opcionalmente un heterocicloalquilo; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R4 ó dos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; o los grupos -A-B-J-R forman conjuntamente un cicloalquilo o heterocicloalquilo bicíclico o tricíclico que comprende por lo menos un carbonilo grupo, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo enmascarado; o el grupo -J-R forma conjuntamente un cicloalquilo o heterocicloalquilo monocíclico o bicíclico que comprende por lo menos un grupo carbonilo, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado, incluyendo un grupo dicarbonilo enmascarado; con la condición de que cuando A es fenileno y cada R3 es H, B está presente; y que cuando A es -(CH2) - y cada R3 es H, B no es -NHC(O) (CH2CH2) - y que cuando A y B están ausentes y cada R3 es H, R no es metilo o un metabolito activo o un profármaco o solvato aceptable farmacéuticamente del mismo. 2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque A es alquileno inferior sustituido o sin sustituir o un amileno sin sustituir o sustituido, seleccionado del grupo que consiste de fenileno, piridinileno, pirimidinileno o tiofenileno. 3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque corresponde a la fórmula (XXXIII) : R (xxxpi); en donde Xi es C, S o S (O) y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido) . 4. El compuesto de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque corresponde a la fórmula (XXXI I I -A) : RiHN (XXXHI-A). 5. El compuesto de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque corresponde a la fórmula (XXXIII-B) : R,H (XXX?I-B). 6. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque corresponde a la fórmula (XXXIV) : (?????). en donde Xi es C, S o S (O) y n es O, 1, 2, 3, 4 o 5 y cada uno de R8 y R9 sobre cada grupo CR8R9 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, alcoxi, alquilamina, halógeno, alquilo, arilo o cualquier R8 y R9 pueden formar conjuntamente =0 o un cicloalquilo o cualquiera a grupos R8 adyacentes pueden formar conjuntamente un cicloalquilo . 7. El compuesto de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque corresponde a la fórmula (XXXIV-A) : R (XXXIV-A). 8. El compuesto de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque corresponde a la fórmula (XXXIV-B) : R (XXXIV-B). 9. El compuesto de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque corresponde a la fórmula (XXXV) : en donde Xi es C, S o S (0) y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido) . 10. El compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque corresponde a la fórmula (XXXV-A) : R 11. El compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque corresponde a la fórmula (XXXV-B) : 12. El compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque corresponde a la fórmula (XXXX) : (XXXX) en donde : indica enlace al grupo A y (b) indica enlace a respectivos grupos carbonilo y T3 es un enlace, C(R) (R) , O o S y R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. 13. El compuesto de conformidad con la reivindicación , caracterizado porque corresponde a la fórmula (XXXXIII) : (xxxxip) 14. El compuesto de conformidad con la reivindicación , caracterizado porque es seleccionado de: 15. El compuesto de conformidad con la reivindicación , caracterizado porque corresponde a la fórmula (III): en donde cada Ra es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, - C(0)kR' en donde k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -OR' y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. 16. El compuesto de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque es seleccionado del grupo que consiste de : 17. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque corresponde a la fórmula (VI) : (VI) en donde cada Ra es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, - C(0)kR' en donde k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -OR' y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. 18. El compuesto de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque es seleccionado del grupo que consiste de: 19. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque corresponde a la fórmula (IX) : (D() en donde cada Ra es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, - C(0)kR' en donde k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -OR' y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. 20. El compuesto de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque es seleccionado del grupo que consiste de: 21. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los grupos -A-B-J-R forman conjuntamente un cicloalquilo o heterocicloalquilo bicíclico o tricíclico que comprende por lo menos un grupo carbonilo, grupo carbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado. 22. El compuesto de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque es seleccionado del grupo que consiste de: 23. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los grupos -J-R forman conjuntamente un cicloalquilo o heterocicloalquilo monocíclico o bicíclico que comprende por lo menos un grupo carbonilo, grupo carbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado. 24. El compuesto de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque tiene la estructura: 25. Un polipéptido, caracterizado porque incorpora por lo menos un compuesto de conformidad con la reivindicación 1. 26. Un compuesto o sal del mismo, caracterizado porque comprende la fórmula (XI] (XI) en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -O- (alquíleno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)0-, -S (0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R>, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , - C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R4 ó dos grupos R3 opcionalmente forman un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R5 es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -(alquileno o alquileno sustituido) -ON (R" ) 2, -(alquileno o alquileno sustituido) -C (O) SR" , -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- (arilo o arilo sustituido), -C(0)R", -C(0)2R" o -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R5 es L-X, en donde: X es seleccionado del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un indicador detectable; y cualquier combinación de los mismos; y es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -(alquileno o alquileno sustituido) -0-N=CR' - , - (alquileno o alquileno sustituido) -C (0) NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) -S (0)k- (alquileno o alquileno sustituido) -S- , -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- , -S (0) kN (R' ) - , -N(R' ) C (O)N(R' ) -, -N(R' )C(S)N(R' ) , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; con la condición de que cuando A y B están ausentes, R no es metilo; o un metabolito activo o un profármaco o solvato aceptable farmacéuticamente del mismo. 27. El compuesto de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque A es fenileno o fenileno sustituido. 28. El compuesto de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque corresponde a la fórmula (XII) : (xp). 29. Un polipéptido, caracterizado porque incorpora por lo menos un compuesto de conformidad con la reivindicación 26. 30. El compuesto de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque X es un agente biológicamente activo seleccionado del grupo que consiste de un péptido, proteína, enzima, anticuerpo, fármaco, tinte, lípido, nucleósidos, oligonucleótido, célula, virus, liposoma, micropartícula y micela. 31. El compuesto de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque X es un fármaco seleccionado del grupo que consiste de un antibiótico, fungicida, agente anti-viral, agente anti-inflamatorio, agente anti-tumor, agente cardiovascular, agente anti-ansiedad, hormona, factor de crecimiento y agente esferoidal . 32. El compuesto de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque X es una enzima seleccionada del grupo que consiste de peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa y glucosa oxidasa. 33. El compuesto de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque X es un indicador detectable seleccionado del grupo que consiste de una porción fluorescente, fosforescente, quimioluminiscente, quelante, grupo denso de electrones, magnética, intercalante, radioactiva, cromófora y porción de transferencia de energía. 34. Un método para producir un polipéptido que comprende por lo menos un aminoácido que tiene la estructura de fórmula (I) : (I) caracterizado porque el método comprende incorporar el aminoácido de fórmula (I) a una posición terminal o interna dentro del polipéptido, en donde: A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno o sustituido alquileno)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)0-, -S (0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N(R' ) C (S)N(R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , - C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; cada R" es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido o un grupo protector o cuando más de un grupo R" está presente, dos R" forman opcionalmente un heterocicloalquilo; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R ó dos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; o los grupos -A-B-J-R forman conjuntamente un cicloalquilo o heterocicloalquilo bicíclico o tricíclico que comprende por lo menos un carbonilo grupo, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo enmascarado; o el grupo -J-R forma conjuntamente un cicloalquilo o heterocicloalquilo monocíclico o bicíclico que comprende por lo menos un grupo carbonilo, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, en los que se incluyen un grupo dicarbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado, incluyendo un grupo dicarbonilo enmascarado; con la condición de que cuando A es fenileno y cada R3 es H, B está presente; y que cuando A es -(CH2)4- y cada R3 es H, B no es -NHC (O) (CH2CH2) - y que cuando A y B están ausentes y cada R3 es H, R no es metilo. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el aminoácido es incorporado a un sitio específico en el polipéptido usando un sistema de traducción que comprende: (i) un polinucleótido que codifica el polipéptido, en donde el polinucleótido comprende un codón selector correspondiente al sitio pre-designado de incorporación del aminoácido de fórmula (I) y (ii) un tARN que comprende el aminácido, en donde el tARN es específico al codón selector. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el sistema de traducción es un sistema de traducción in vivo que comprende una célula seleccionada del grupo que consiste de una célula bacteriana, una célula de arqueobacteria y célula eucarióntica. 38. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el aminoácido tiene la estructura correspondiente a la fórmula (III) : (III) en donde cada Ra es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, - C(0)kR' en donde k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -OR' y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el aminoácido es seleccionado del grupo que consiste de 40. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el aminoácido tiene una estructura correspondiente a la fórmula (VI) : (VI) en donde cada Ra es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, - C(0)kR' en donde k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -OR' y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el aminoácido es seleccionado del grupo que consiste de: 42. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el aminoácido tiene una estructura correspondiente a la fórmula (IX) : (IX) en donde cada Ra es seleccionado independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, - C(0)kR' en donde k es 1, 2 ó 3, -C(0)N(R')2, -OR' y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. 43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el aminoácido es seleccionado del grupo que consiste de: 44. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque los grupos -A-B-J-R forman conjuntamente un cicloalquilo o heterocicloalquilo bicíclico o tricíclico que comprende por lo menos un grupo carbonilo, grupo carbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el aminoácido es seleccionado del grupo que consiste de: 46. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque los grupos -J-R forman conjuntamente un cicloalquilo o heterocicloalquilo monocíclico o bicíclico que comprende por lo menos un grupo carbonilo, grupo carbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el aminoácido es: 48. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el aminácido de fórmula (I) tiene la estructura de fórmula (XXX) : en donde Xx es C, S o S (0) ; y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido) . 49. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el aminoácido de fórmula (I) tiene la estructura de fórmula (XXXIII) : R (XXXIII); en donde Xx es C, S o S (0) ; y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido) . 50. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque corresponde a la fórmula (XXXX): (XXXX) en donde : • en donde (a indica enlace al grupo A y (b) indica enlace a respectivos grupos carbonilo y T3 es un enlace C (R) (R) , O o S y R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque corresponde a la fórmula (XXXXIII) : 52. Un método para derivar un polipéptido que comprende un aminoácido de fórmula (I) , el método está caracterizado porque comprende poner en contacto el polipéptido con un reactivo de fórmula (XIX), en donde la fórmula (I) corresponde a : (I) en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno o sustituido alquileno)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; cada R" es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido o un grupo protector o cuando más de un grupo R" está presente, dos R" forman opcionalmente un heterocicloalquilo; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido; en donde la fórmula (XIX) corresponde a: (XIX) en donde : cada X es independientemente un indicador detectable, un agente biológicamente activo o un polímero; cada es un enlazador seleccionado independientemente del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno o sustituido alquileno)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) N (R' ) C (O) 0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -N (R' ) C (O) O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S (0) kN (R' ) - , -N(R' ) C (O)N(R' ) -, -N(R' ) C(0)N(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')S(0)kN(R' ) -, -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, - C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; Li es opcional y cuando está presente es -C (R' )p-NR' -C (0) 0- (alquileno o alquileno sustituido)- en donde p es 0, 1 o 2; es -0N(R?)2 o -C(=0)R2 en donde cada R es independientemente H o un grupo protector amino y R2 es H u OR' y n es 1 a 3. 53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el reactivo corresponde a la fórmula (H). 54. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el reactivo corresponde a la fórmula (XXVII) : PEG -L O -NH; (XXVII). 55. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el polipéptido derivado comprende por lo menos un aminoácido que contiene oxima que tiene la estructura de fórmula (XI) : en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) C (O) O- , -S (O) kN (R' ) - , -N(R')C(0)N(R') -, -N(R')C(S)N(R') -, -N (R' ) S (O) kN (R' ) - , -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C(R' )2-N(R' ) -N(R' ) -, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido; R5 es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -C(0)R", -C(0)2R" o -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R5 es L-X, en donde: X es un indicador detectable; un agente biológicamente activo o polímero y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' ) C (O) O-, -(alquileno o alquileno sustituido) -0-N=CR' - , -(alquileno o alquileno sustituido) -C (0) NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) -S (O) k- (alquileno o alquileno sustituido) -S- , -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- , -S (O) kN (R' ) - , -N(R' ) C (O)N(R' ) - , -N(R' )C(S)N(R' ) , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, C(R' ) =N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N(R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; con la condición de que cuando A y B están ausentes, R no es metilo. 56. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el polipéptido se pone en contacto con el reactivo de fórmula (XIX) en solución acuosa bajo condiciones moderadamente acidas. 57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque las condiciones son pH 2 a 8. 58. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el polipéptido se pone en contacto con el reactivo de fórmula (XIX) en presencia de un acelerante seleccionado del grupo que consiste de: 59. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el aminoácido de fórmula (I) tiene la estructura de fórmula (XXX) : en donde Xi es C, S o S (0) ; y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido) . 60. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el aminoácido de fórmula (I) tiene la estructura de fórmula (XXXIII) : R,HN (XXXpi); en donde Xi es C, S o S (0) ; y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido) . 61. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el aminoácido de fórmula (I) tiene la estructura de fórmula (XXXX) : (XXXX) en donde : , en donde (a) indica enlace al grupo A y (b) indica enlace a respectivos grupos carbonilo y T3 es un enlace C(R) (R) , O o S y R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido . 62. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque corresponde a la fórmula (XXXXIII) : (xxxxpi). 62. Un método para el tratamiento de una alteración, condición o enfermedad, el método está caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de aminoácido no natural que comprende por lo menos un aminoácido no natural que contiene oxima, en donde el aminoácido no natural que contiene oxima es incorporado en un sitio específico dentro del polipéptido usando un sistema de traducción que comprende: (i) un polinucleótido que codifica el polipéptido, en donde el polinucleótido comprende un codón selector correspondiente al sitio pre-designado de incorporación del aminoácido que contiene oxima y (ii) un tARN que comprende el aminácido que contiene oxima, en donde el tARN es específico al codón selector. 64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el sistema de traducción es un sistema de traducción in vivo que comprende una célula seleccionada del siguiente grupo de organismos: un procarionte, un eucarionte, un mamífero, un Escherichia coli, un hongo, una especie de Pseudomonas, una levadura, una arqueobacteria, una eubacteria, una planta, un insecto y una protista. 65. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el aminoácido no natural es un aminoácido que contiene oxima y el aminoácido no natural que contiene oxima tiene la estructura correspondiente a la fórmula (XI) en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, -C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R' ) C (S) N (R' ) - , -N(R' )S(0)kN(R) , -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R' ) =N-N (R' ) - , - C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R ó dos grupos R3 opcionalmente forman un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R5 es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -(alquileno o alquileno sustituido) -ON (R" ) 2, -(alquileno o alquileno sustituido) -C (O) SR" , -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- (arilo o arilo sustituido), -C(0)R", -C(0)2R" o -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R5 es L-X, en donde: X es seleccionado del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co- factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un indicador detectable; y cualquier combinación de los mismos; y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -(alquileno o alquileno sustituido) -0-N=CR' - , (alquileno o alquileno sustituido) -C (0) NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) -S (0) - (alquileno o alquileno sustituido) -S- , -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- , -S (O) kN (R' ) - , -N(R' ) C (O)N(R' ) -, -N(R' )C(S)N(R' ) , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; con la condición de que cuando A y B están ausentes, R no es metilo. 66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el aminoácido que contiene oxima tiene la estructura correspondiente a la fórmula (XII) : (XII). 67. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el aminoácido que contiene oxima tiene la estructura correspondiente a la fórmula (XIII) : (xm). 68. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque X es un polímero soluble en agua. 69. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque X es un derivado de polietilenglicol. 70. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque X es un compuesto citotóxico. 71. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque X es un fármaco. 72. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque es un segundo polipéptido. 73. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el segundo polipéptido es un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima. 74. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el segundo polipéptido tiene la misma estructura de aminoácidos como el polipéptido de aminoácido no natural de la reivindicación 63. 75. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque comprende además un portador aceptable farmacéuticamente . 76. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el polipéptido de aminácido no natural que contiene oxima es un polipéptido de amioácido no natural 5 que contiene oxima modificado. 77. Un método para detectar la presencia de un polipéptido en un paciente, el método está caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de un polipéptido de aminoácido no natural homólogo que comprende por lo menos un 10 aminoácido no natural que contiene oxima, en donde el aminoácido que contiene oxima es incorporado en un sitio específico dentro del polipéptido usando un sistema de traducción que comprende: (i) un polinucleótido que codifica el polipéptido, en 15. donde el polinucleótido comprende un codón selector correspondiente al sitio pre-designado de incorporación del aminoácido que contiene oxima y (ii) un tARN que comprende el aminácido que contiene oxima, en donde el tAR? es específico al codón selector. 20 78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el sistema de traducción es un sistema de traducción in vivo que comprende una célula seleccionada del siguiente grupo de organismos: un procarionte, un eucarionte, un mamífero, un Escherichia coli, un hongo, una especie de 25 Pseudomonas, una levadura, una arqueobacteria, una eubacteria, una planta, un insecto y una protista. 79. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima comprende por lo menos un aminoácido que contiene oxima que tiene la estructura de fórmula (XI) : (XI) en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (0) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) C (O) O- , -S (0) kN (R' ) - , -N(R')C(0)N(R') -, -N(R')C(S)N(R') -, -N (R' ) S (O) kN (R' ) - , -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R') -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N (R' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido; R5 es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -C(0)R", -C(0)2R" o -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R5 es L-X, en donde: X es seleccionado del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co-factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un indicador detectable; y cualquier combinación de los mismos; y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0) - en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)- (alquil.eno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -(alquileno o alquileno sustituido) -0-N=CR' - , (alquileno o alquileno sustituido) -C (O) NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) -S (0) k- (alquileno o alquileno sustituido) -S- , -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- , -S (O) kN (R' ) - , -N(R' ) C (O)N(R' ) - , -N(R')C(S)N(R' ) , -N(R')S(0)kN(R') -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; con la condición de que cuando A y B están ausentes, R no es metilo. 80. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque el aminoácido que contiene oxima tiene la estructura correspondiente a la fórmula (XII) : (XII). 81. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque el aminoácido que contiene oxima tiene la estructura correspondiente a la fórmula (XIII) : (XIII). 82. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque X es seleccionado del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un indicación de spín; un fluoróforo, una porción radioactiva; una porción que incorpora un átomo pesado; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un indicador detectable y cualquier combinación de los anteriores. 83. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima biosintético es un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima biosintético modificado. 84. Un método para facilitar las propiedades de aislamiento de un polipéptido, caracterizado porque comprende utilizar un polipéptido de aminoácido no natural homólogo que comprende por lo menos un aminoácido no natural que contiene oxima, en donde el aminoácido que contiene oxima es incorporado en un sitio específico dentro del polipéptido usando un sistema de traducción que comprende: (i) un polinucleótido que codifica el polipéptido, en donde el polinucleótido comprende un codón selector correspondiente al sitio pre-designado de incorporación del aminoácido que contiene oxima y (ii) un tARN que comprende el aminácido que contiene oxima, en donde el tARN es específico al codón selector. 85. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el sistema de traducción es un sistema de traducción in vivo que comprende una célula seleccionada del siguiente grupo de organismos: un procarionte, un eucarionte, un mamífero, un Escherichia coli, un hongo, una especie de Pseudomonas, una levadura, una arqueobacteria, una eubacteria, una planta, un insecto y una protista. 86. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima comprende por lo menos un aminoácido que contiene oxima que tiene la estructura de fórmula (XI) : en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0) - en donde k es 1, 2 ó 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileño o alquileno sustituido)-, -N (R' ) C (0) 0- , -S (0) kN (R' ) - , -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N(R' )C(S)N(R' ) -, -N (R' ) S (O) kN (R' ) - , -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C(R' )2-N(R' ) -N(R' ) -, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector amino, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido; R5 es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -C(0)R", -C(0)2R" o -C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R5 es L-X, en donde: X es seleccionado del grupo que consiste de un indicador; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un agente de foto-reticulación; un compuesto citotóxico; un fármaco; un indicador de afinidad; un indicador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un co- factor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartícula; un indicador de espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo escindible químicamente; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar carbono-enlazado; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción marcada isotópicamente; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un indicador detectable; y cualquier combinación de los mismos; y L es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 ó 3, -S (0)k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' -(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -(alquileno o alquileno sustituido) -0-N=CR' - , (alquileno o alquileno sustituido) -C (0) NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido) -S (O) k- (alquileno o alquileno sustituido) -S- , -(alquileno o alquileno sustituido) -S-S- , -S (O) kN (R' ) - , -N(R' ) C (O)N(R' ) -, -N(R' )C(S)N(R' ) , -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; con la condición de que cuando A y B están ausentes, R no es metilo. 87. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el aminoácido que contiene oxima tiene la estructura correspondiente a la fórmula (XII) : (xp). 88. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el aminoácido que contiene oxima tiene la estructura correspondiente a la fórmula (XIII): (xpi). 89. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque X es un polímero soluble en agua. 90. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque X es un derivado de polietilenglicol. 91. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima es un polipéptido de aminoácido no natural que contiene oxima modificado.
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