MX2007007143A - Un promotor de oxigenasa dependiente de 2-oxoglutarato de maiz con preferencia por raices e inducible por insectos y por lesiones y su uso - Google Patents

Abstract

Composiciones y métodos para regular la expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta. Las composiciones incluyen una nueva secuencia de nucleótidos para un promotor inducible del gen que codifica una oxigenasa dependiente de 2-oxoglutarato. Se provee un método para expresar una secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta usando las secuencias promotoras descritas en la presente. El método comprende incorporar de manera estable en el genoma de la célula vegetal una secuencia de nucleótidos ligada operativamente al promotor con preferencia por raíces de la presente invención y regenerar una planta transformada en forma estable que exprese la secuencia de nucleótidos.

Description

UN PROMOTOR DE OXIGENASA DEPENDIENTE DE 2-OXOGLUTARATO DE MAÍZ CON PREFERENCIA POR RAÍCES E INDUCIBLE POR INSECTOS Y POR LESIONES Y SU USO REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Patente de EE.UU. N°: 60/636.890, presentada el 17 de diciembre, 2004, cuyo contenido se incorpora por completo en la presente documentación a modo de referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de la biología molecular de plantas, más particularmente con la regulación de la expresión genética en plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances recientes en la ingeniería genética de plantas han permitido diseñar plantas con características o caracteres mejorados, tales como resistencia a enfermedades, resistencia a insectos, resistencia a herbicidas, estabilidad o duración de almacenamiento mejorada del producto de consumo final obtenido de las plantas, y mejoramiento de la calidad nutrícional de las porciones comestibles de la planta. Por consiguiente, en el genoma de la planta pueden incorporarse uno o más genes deseados de una fuente diferente de la planta, pero modificados para impartir características o cualidades diferentes o mejoradas. De este modo, pueden expresarse uno o más genes nuevos en la célula vegetal para que presente el fenotipo deseado, tal como un carácter o una característica nueva. Debe haber señales reguladoras apropiadas presentes, y deben estar en la localización apropiada respecto del gen, con el fin de obtener la expresión del gen recién insertado en la célula vegetal. Estas señales reguladoras pueden incluir, a modo de ejemplo, una región promotora, una secuencia directriz no traducida 5' y una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación 3'.

Un promotor es una secuencia de ADN que dirige la maquinaria celular de una planta para producir ARN a partir de la secuencia codificante contigua 3' con respecto al promotor. La región promotora afecta la velocidad, la etapa del desarrollo y el tipo celular en el que se expresa el transcripto de ARN a partir del gen. El transcripto de ARN se procesa para producir ARN mensajero (ARNm), que sirve como templado para la traducción de la secuencia de ARN en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. La secuencia directriz 5' no traducida es una región del ARNm 5' con respecto a la región codificante de la proteína, que puede participar en el inicio y la traducción del ARNm. La señal de terminación de la transcripción/poliadenilación 3' es una región no traducida 3' con respecto a la región codificante de la proteína, que funciona en las células vegetales para provocar la terminación de la transcripción del ARN y la adición de nucleótidos de poliadenilato en el extremo 3' del ARN. La expresión de las secuencias de ADN heterólogas en un huésped vegetal depende de la presencia de un promotor ligado operativamente que sea funcional en la planta huésped. El tipo de secuencia promotora seleccionada se basa en cuándo y dónde se desea la expresión del ADN heterólogo en el organismo. Cuando se desea la expresión en tejidos u órganos específicos, pueden usarse promotores con preferencia por tejidos. Cuando se desea la expresión genética como respuesta a un estímulo, los promotores inducibles son el elemento regulador de elección. Por el contrarío, cuando se desea una expresión continua en todas las células de una planta, se utilizan promotores constitutivos. Un promotor inducible es un promotor que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripción de una o más secuencias de ADN o genes en repuesta a un inductor. En ausencia de un inductor, las secuencias de ADN o los genes no se transcribirán o se transcribirán a un nivel menor que en un estado inducido. El inductor puede ser un agente químico, tal como un metabolito, un regulador del crecimiento, un compuesto herbicida o fenólico o un estrés fisiológico impuesto directamente sobre la planta, tal como frío, sequía, calor, sales, toxinas. En el caso del combate de plagas vegetales, también es deseable tener un promotor que sea inducido por patógenos vegetales, incluyendo insectos que son plagas de plantas, nematodes o agentes causantes de enfermedades, tales como bacterias, virus u hongos. El contacto con el patógeno inducirá la activación de la transcripción, de modo que se producirá una proteína que combatirá al patógeno en un momento en que sea eficaz para defender la planta. También puede usarse un promotor inducido por patógenos para detectar el contacto con un patógeno, por ejemplo, mediante la expresión de un marcador detectable, de modo que pueda evaluarse la necesidad de aplicación de pesticidas. Una célula vegetal que contiene un promotor inducible puede exponerse a un inductor aplicando el inductor a la célula o a la planta externamente, tal como por medio de rociado, riego, calentamiento o exposición al patógeno operativo. Un promotor constitutivo es un promotor que dirige la expresión de un gen en varias partes de una planta y en forma continua durante el desarrollo de la planta. Los ejemplos de algunos promotores constitutivos utilizados ampliamente para inducir la expresión de genes heterólogos en plantas transgénicas incluyen el promotor del gen de la nopalina sintetasa (NOS), de Agrobacterium tumefaciens , (Patente de EE.UU. N°: 5.034.322), los promotores 35S y 19S del virus en mosaico de la coliflor (CaMv) (Patente de EE.UU. N°: 5.352.605), los que derivan de cualquiera de los numerosos genes de actina, conocidos por expresarse en la mayoría de los tipos celulares (Patente de EE.UU. N°: 6.002.068) y el promotor de ubiquitina, que es un producto genético conocido por acumularse en muchos tipos celulares. Se pueden incluir otras secuencias reguladoras 5' y/o 3' con respecto a la secuencia promotora nuclear en las construcciones de expresión de los vectores de transformación con el propósito de alterar los niveles de expresión de las secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica. Por consiguiente, la modificación genética de plantas mediante el uso de técnicas de ingeniería genética para producir plantas con caracteres útiles requiere de la disponibilidad de una variedad de promotores. Con el fin de maximizar la aplicación comercial de la tecnología de plantas transgénicas, sería de utilidad poder dirigir la expresión del ADN introducido de una forma específica del sitio. Por ejemplo, sería de utilidad producir compuestos defensivos tóxicos en los tejidos que se ven sometidos al ataque de patógenos, pero no en los tejidos que han de ser cosechados e ingeridos por los consumidores. Al dirigir la síntesis o el almacenamiento de proteínas o compuestos deseables de una forma específica del sitio, es posible manipular las plantas como fábricas o sistemas de producción, de modo de obtener una variedad importante de compuestos con utilidad comercial. Los promotores con especificidad celular proporcionan la capacidad de dirigir la síntesis de los compuestos, en forma espacial y temporal, a tejidos u órganos muy especializados, tales como raíces, hojas, tejidos vasculares, embriones, semillas o flores. Como alternativa, sería de utilidad inhibir la expresión de una secuencia de ADN nativa en los tejidos de una planta para obtener el fenotipo deseado. Dicha inhibición se puede lograr con la transformación de la planta para que comprenda un promotor con preferencia por tejidos ligado operativamente a una secuencia de nucleótidos antisentido, de modo tal que la expresión de la secuencia antisentido produce un transcripto de ARN que interfiere con la traducción del ARNm de la secuencia de ADN nativa. Son de particular interés los promotores que son inducidos cuando se alimentan las plagas de insectos. Las plagas de insectos constituyen uno de los principales factores en la pérdida de los cultivos agronómicos en todo el mundo. La pérdida de cultivos relacionada con plagas de insectos debido solamente al gusano de la raíz de maíz ha alcanza mil millones de dólares por año. El gusano de la raíz de maíz del oeste (WCRW) es una de las plagas de insectos más importantes para el maíz en muchas regiones del mundo. Aunque no constituyan una plaga tan importante como el gusano de la raíz de maíz del oeste, el gusano de la raíz de maíz del sur y el gusano de la raíz de maíz del norte también pueden causar daños económicos significativos en el maíz. Los daños debidos a los gusanos de la raíz de maíz pueden dar como resultar una mayor cantidad vuelcos, una menor tolerancia a la sequía y en última instancia reducciones en el rendimiento de los cultivos. Otra de las grandes plagas es Ostrinia nubilalis, comúnmente denominado el barrenador de maíz europeo (ECB). Dado que los patrones de expresión de un gen quimérico (o varios genes quiméricos) introducidos en una planta son controlados usando promotores, existe un interés creciente en el aislamiento y la identificación de nuevos promotores capaces de controlar la expresión de un gen quimérico (o varios genes quiméricos). COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se proveen composiciones y métodos para regular la expresión genética en una planta. Las composiciones comprenden nuevas secuencias de nucleótidos de un promotor inducible que inicia la transcripción como respuesta a la alimentación o lesiones ocasionadas por las plagas de insectos. Más particularmente, se provee una región de inicio de la transcripción aislada de maíz. Otras realizaciones de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N°: 1 , un fragmento de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N°: 1 , y las secuencias promotoras vegetales depositadas con la American Type Culture Collection (ATCC) el 3 de noviembre, 2004, en un huésped bacteriano con el Depósito de Patente N° PTA-6278. Las realizaciones de la invención comprenden además secuencias de nucleótidos que tienen al menos un 95% de identidad de secuencia con las secuencias que se muestran en la SEQ ID N°: 1 , y que dirigen una expresión inducible por insectos y por lesiones de una secuencia de nucleótidos ligada operativamente. También incluye fragmentos funcionales de la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 que dirige una expresión inducible por insectos y por lesiones de una secuencia de nucleótidos ligada operativamente. Las realizaciones de la invención también incluyen construcciones de ADN que comprenden un promotor ligado operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés donde dicho promotor puede dirigir la expresión de dicha secuencia de nucleótidos en una célula vegetal y dicho promotor comprende las secuencias de nucleótidos descritas en la presente. Las realizaciones de la invención proveen además vectores de expresión y plantas o células vegetales que contienen la construcción de ADN mencionada previamente incorporada en forma estable en sus genomas. Además, las composiciones incluyen semillas transgénicas de dichas plantas. Las realizaciones de métodos comprenden un medio para expresar selectivamente una secuencia de nucleótidos en una planta, que comprende transformar una célula vegetal con una construcción de ADN, y regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal, donde la construcción de ADN comprende un promotor y una secuencia de nucleótidos heteróloga ligada operativamente a dicho promotor, donde dicho promotor inicia una transcripción inducible por insectos y por lesiones de dicha secuencia de nucleótidos en una célula vegetal. De esta manera, las secuencias promotoras son de utilidad para controlar la expresión de secuencias codificantes ligadas operativamente de una manera inducible. En posición 3' y bajo la regulación del inicio de la transcripción del promotor habrá una secuencia de interés que proveerá la modificación del fenotipo de la planta. Esta modificación incluye modular la producción de un producto endógeno, en lo referente a la cantidad, la distribución relativa o semejantes, o la producción de un producto de expresión exógeno para obtener una función o un producto nuevo en la planta. Por ejemplo, se incluye una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, a sales, frío, sequía, patógenos o insectos. En una realización adicional, se provee un método para modular la expresión de un gen en una planta transformada de forma estable, que comprende los pasos de (a) transformar una célula vegetal con una construcción de ADN que comprende al promotor de las realizaciones ligado operativamente a por los menos una secuencia de nucleótidos; (b) cultivar la célula vegetal bajo condiciones de crecimiento vegetal y (c) regenerar una planta transformada de forma estable a partir de la célula vegetal, donde la expresión de la secuencia de nucleótidos altera el fenotipo de la planta. DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una transferencia Northern que muestra la expresión de oxigenasa dependiente de 2-oxoglutarato en tejido radicular de plantas de maíz en la etapa V5, ya sea con y sin una infestación por el gusano de la raíz de maíz del oeste. No se detectó expresión en las hojas en ninguno de los casos. El término transplantar se refiere a transferir la planta a tierra fresca. El daño en las raíces causado por este proceso no induce expresión de peroxidasa. Por lo tanto, esta figura demuestra el patrón de expresión en las raíces y la inducibilidad por CRW, según lo predicho por los datos de Lynx MPSS data. En el Ejemplo 2 se proveen detalles adicionales sobre esta transferencia. La Figura 2 es una transferencia Northern que muestra la expresión en el tiempo de oxigenasa dependiente de 2-oxoglutarato en tejido radicular después de una lesión. No se detectó expresión en el tejido foliar en ningún momento en el experimento. Por lo tanto, esta figura demuestra el patrón de expresión radicular y la inducibilidad por lesiones, según lo predicho con los datos Lynx MPSS. En el Ejemplo 2 se proveen detalles adicionales sobre esta transferencia. En la Figura 3 se muestra la secuencia del promotor de oxigenasa maíz dependiente de 2-oxoglutarato. Se indican las posiciones de la caja TATA, el sitio de inicio de la transcripción (TSS) mapeado por 5' RACE y otros motivos de interés en la secuencia promotora. En el ejemplo 4 se proveen detalles adicionales. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las realizaciones de la invención comprenden nuevas secuencias de nucleótidos de promotores vegetales, en particular un promotor inducible por lesiones e insectos para un gen de oxigenasa dependiente de 2-oxoglutarato de maíz (de aquí en adelante denominado gen de oxigenasa 20D), más particularmente, el promotor del gen de la oxigenasa dependiente de 2- oxoglutarato, denominado promotor de oxigenasa 20D de aquí en adelante. En particular, las realizaciones proveen moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N°: 1 , y la secuencia promotora vegetal depositada en un huésped bacteriano con el Depósito de Patente N° PTA-6278, el 3 de noviembre, 2004, y fragmentos, variantes y complementos de la misma. Los plásmidos que contienen las secuencias de nucleótidos promotoras vegetales de las realizaciones se depositaron el 3 de Noviembre de 2004 en el Depósito de Patentes de la Colección Americana de Tipos de Cultivo (ATCC), en 10801 University Blvd., Manassas, VA 201 10-2209, y se le asignó el Depósito de Patente N° PTA-6278. Este depósito se mantendrá bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con Propósitos de Procedimientos de Patentes. Este depósito se realizó meramente con fines de conveniencia para aquellos entrenados en la técnica, y no se admite que sea necesario un depósito bajo 35 USC §1 12. El depósito estará disponible para el público, de forma irrevocable y sin estricciones o condiciones, una vez otorgada la patente. Sin embargo, deberá comprenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la presente invención como derogación de los derechos de patente garantizados por la acción del gobierno. Las secuencias promotoras de las realizaciones son de utilidad para expresar secuencias de nucleótidos ligadas operativamente de una manera inducible, en particular de una manera inducible por la alimentación o lesiones ocasionadas por insectos. Las secuencias también son útiles en la construcción de vectores de expresión para la subsiguiente transformación en las plantas de interés, como sondas para aislar otros promotor de genes oxigenasa 20D, como marcadores moleculares y semejantes. El promotor de oxigenasa 20D de maíz de las realizaciones se aisló a partir de ADN genómico de maíz. El método especifico usado para obtener el promotor de oxigenasa 20D de la presente invención se describe en el Ejemplo 4 en la sección experimental de esta solicitud. Las realizaciones comprenden composiciones de ácidos nucleicos aislados o sustancialmente purificados. Una molécula de ácidos nucleicos "aislada" o "purificada", o una porción de ésta con actividad biológica, está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo, cuando se la produce de acuerdo con técnicas recombinantes, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas, cuando se la sintetiza por medios químicos. Un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (incluyendo secuencias que codifican proteínas) que flanquean naturalmente al ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual deriva dicho ácido nucleico. Por ejemplo, en varias realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0, 1 kb de secuencias de nucleótidos que rodean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico. Este gen de oxigenasa 2OD de maíz se expresa preferencialmente en tejido radicular de maíz como respuesta a los daños provocados cuando se alimenta el gusano de la raíz de maíz o al daño mecánico según indicaciones de Lynx Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS) y se describe además en el Ejemplo 1 . Las oxigenasas 2OD están relacionadas con las reacciones de oxidación que emplean oxígeno y se encuentran en las vías de biosíntesis de muchos metabolitos primarios y secundarios. Otro gen de oxigenasa 2OD estrechamente relacionado que presenta un 81 % de identidad de aminoácidos con el producto genético predicho anterior está relacionado con la biosíntesis de DIMBOA. DIMBOA, un benzoxazinoide, es un pesticida natural y sirve como un importante factor de resistencia de la planta huésped contra enfermedades microbianas e insectos y como aleloquímicos. La secuencia promotora de oxigenasa 20D dirige la expresión de secuencias de nucleótidos ligadas operativamente de una manera inducible. Por ello es que las secuencias promotoras de oxigenasa 20D son de utilidad en la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos de interés ligada operativamente. En particular, el promotor de las realizaciones actúan induciendo la expresión después de la actividad de alimentarse o de lesionar de una plaga de insectos. Las composiciones de las realizaciones incluyen moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden la secuencia promotora de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID N°: 1 . El término "promotor" se refiere a una región de ADN reguladora que habitualmente comprende una caja TATA capaz de dirigir la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el sitio de inicio de la transcripción apropiado para una secuencia de codificación particular. Además, un promotor puede comprender otras secuencias de reconocimiento localizadas generalmente río arriba o 5' de la caja TATA, conocidas como elementos promotores 5', que influyen en la velocidad de inicio de la transcripción. Se reconoce que, al haber identificado las secuencias de nucleótidos para las regiones promotoras descritas en la presente documentación, el aislamiento y la identificación de otros elementos reguladores en la región 5' no traducida de las regiones promotoras particulares identificadas en la presente documentación está dentro del alcance de aquellos entrenados en la técnica. Por consiguiente; por ejemplo, las regiones promotoras descritas en la presente documentación pueden comprender elementos reguladores río arriba adicionales, tales como aquellos responsables de la expresión tisular y temporal de la secuencia codificante, los potenciadores y semejantes. Véase en particular la Patente de Australia N°: AU-A-77751/94 y las Patentes de EE.UU. N°: 5.466.785 y 5.635.618. De la misma manera, es posible identificar, aislar y usar elementos promotores que permitan una expresión inducible junto con otros promotores nucleares para conferir una expresión inducible. En este aspecto de las realizaciones, un "promotor nuclear" designa un promotor sin elementos promotores. En el contexto de esta descripción, el término "elemento regulador" también hace referencia a una secuencia de ADN, comúnmente, pero no siempre, río arriba (5') de la secuencia codificante de un gen estructural, que incluye secuencias que controlan la expresión de la región codificante al proporcionar el reconocimiento por la ARN polimerasa y/u otros factores requeridos para que la transcripción comience en un sitio particular. Un ejemplo de un elemento regulador que permite el reconocimiento por la ARN polimerasa u otros factores de transcripción para asegurar el inicio en un sitio particular es un elemento promotor. Un elemento promotor comprende un elemento promotor nuclear, responsable del inicio de la transcripción, así como otros elementos reguladores (como se describe en otra parte de esta solicitud) que modifican la expresión genética. Debe comprenderse que las secuencias de nucleótidos localizadas en los intrones, o 3' de la secuencia de la región codificante, también pueden contribuir a la regulación de la expresión de una región codificante de interés. Los ejemplos de intrones apropiados incluyen, sin limitaciones, el intrón IVS6 de maíz o el intrón de actina de maíz. Un elemento regulador también puede incluir aquellos elementos localizados río abajo (3') del sitio de inicio de la transcripción, o dentro de regiones transcriptas, o ambos. En el contexto de la presente descripción, un elemento regulador de post-traducción puede incluir los elementos que están activos después del inicio de la transcripción, por ejemplo, potenciadores de la traducción y la transcripción, represores de la traducción y la transcripción, y determinantes de la estabilidad del ARNm. Los elementos reguladores, o fragmentos de los mismos, de las realizaciones pueden estar asociados operativamente con elementos reguladores o promotores heterólogos, con el fin de modular la actividad del elemento regulador heterólogo. Esta modulación incluye el mejoramiento o la represión de la actividad de transcripción del elemento regulador heterólogo, la modulación de los eventos de post-traducción, o el mejoramiento o la represión de la actividad de transcripción del elemento regulador heterólogo, y la modulación de los eventos de post-traducción. Por ejemplo, uno o más elementos reguladores, o fragmentos de los mismos, de las realizaciones puede asociarse operativamente con promotores constitutivos, inducibles o específicos de tejidos, o con fragmentos de los mismos, para modular la actividad de estos promotores en las células vegetales de tejidos deseados. La secuencia promotora de oxigenasa 20D de maíz, cuando se ensambla dentro de una construcción de ADN de modo tal que el promotor queda ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés, permite expresar la secuencia de nucleótidos en las células de una planta transformada de forma estable con esta construcción de ADN. El término "ligada operativamente" denota que la transcripción o la traducción de la secuencia de nucleótidos heteróloga está bajo la influencia de la secuencia promotora. El término "ligado operativamente" también significa la unión de dos secuencias de nucleótidos, de modo tal que la secuencia codificante de cada fragmento de ADN permanece en el marco de lectura apropiado. De este modo, las secuencias de nucleótidos para los promotores de las realizaciones se proporcionan en construcciones de ADN, en combinación con la secuencia de nucleótidos de interés, típicamente una secuencia de nucleótidos heteróloga, para obtener la expresión en la planta de interés. El término "secuencia de nucleótidos heteróloga" designa una secuencia que no está ligada operativamente en forma natural con la secuencia promotora. Si bien esta secuencia de nucleótidos es heteróloga respecto de la secuencia promotora, puede ser homologa, o nativa; o heteróloga, o extraña, respecto de la planta huésped. Se considera que los promotores de las realizaciones pueden usarse con sus secuencias codificantes nativas para incrementar o disminuir la expresión, lo que da como resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada. Las modificaciones de las secuencias promotoras aisladas de las realizaciones pueden proporcionar un rango de expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga. Por consiguiente, es posible modificarlas para que sean promotores débiles o promotores fuertes. En general, un "promotor débil" designa un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante en un nivel bajo. Un nivel de expresión "bajo" hace referencia a niveles de expresión de entre aproximadamente 1/10000 transcriptos, aproximadamente 1/100000 transcriptos y aproximadamente 1 /500000 transcriptos. A la inversa, un promotor fuerte dirige la expresión de una secuencia de codificación a un nivel alto o a niveles entre aproximadamente 1/10 transcriptos y aproximadamente 1/100 transcriptos y aproximadamente 1/1 .000 transcriptos. Los fragmentos y las variantes de las secuencias promotoras descritas también están comprendidos por las realizaciones. Un "fragmento" se refiere a una porción de la secuencia promotora. Los fragmentos de una secuencia promotora pueden retener la actividad biológica, y por consiguiente, abarcar fragmentos capaces de dirigir una expresión inducible de una secuencia de nucleótidos ligada operativamente. Por consiguiente, por ejemplo, puede utilizarse menos que la secuencia promotora completa descrita en la presente documentación para dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés ligada operativamente, tal como una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina heteróloga. Los especialistas en la técnica sabrán determinar si dichos fragmentos disminuyen los niveles de expresión o si alteran la naturaleza de la expresión, es decir, si se trata de una expresión constitutiva o inducible. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos promotora que son útiles como sondas de hibridación, como se describe más adelante, posiblemente no retengan esta actividad reguladora. Por consiguiente, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar en un rango entre al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta la secuencia de nucleótidos de longitud completa de las realizaciones. Por consiguiente, un fragmento de una secuencia de nucleótidos promotora de oxigenasa 20D puede codificar una porción biológicamente activa del promotor de oxigenasa 20D o puede ser un fragmento de utilidad como una sonda de hibridación o un cebador para PCR, usando los métodos que se describen más adelante. Una porción biológicamente activa de un promotor de oxigenasa 2OD se puede preparar aislando una porción de la secuencia de nucleótidos del promotor de oxigenasa 20D y evaluando la actividad de dicha porción del promotor de oxigenasa 20D. Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos promotora comprenden al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000 o hasta la cantidad de nucleótidos presentes en la secuencia de nucleótidos promotora de longitud completa descrita en la presente, por ejemplo 1 1 16 nucleótidos para la SEQ ID N° 1 .

Los nucleótidos de dichos fragmentos comúnmente comprenderán la secuencia de reconocimiento TATA de la secuencia promotora particular. Estos fragmentos pueden obtenerse usando enzimas de restricción paras cortar la secuencia de nucleótidos promotora de ocurrencia natural descrita en la presente documentación; sintetizando una secuencia de nucleótidos de la secuencia de ocurrencia natural de la secuencia de ADN promotora; o pueden obtenerse usando tecnología de PCR. Véase en particular, Mullís et al. (1987) Methods Enzymol 755:335-350, y Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, Nueva York). Las variantes de estos fragmentos promotores, tales como aquellas resultantes de una mutagénesis dirigida a sitios específicos y un procedimiento tal como el "entremezclado de ADN" también están comprendidas por las composiciones de las realizaciones. Un "análogo" de los elementos reguladores de las realizaciones incluye cualquier sustitución, supresión o adición a la secuencia de un elemento regulador, siempre que dicho análogo mantenga al menos una propiedad de regulación asociada con la actividad del elemento regulador de las realizaciones. Estas propiedades incluyen el direccionamiento de la especificidad por órganos, la especificidad por tejidos o una combinación de éstas, o la actividad temporal, la actividad durante el desarrollo o una combinación de éstas. El término "variantes" se refiere a secuencias que tienen una similitud sustancial con una secuencia promotora descrita en la presente documentación. Para las secuencias de nucleótidos, pueden identificarse variantes de ocurrencia natural como éstas mediante el uso de procedimientos conocidos de biología molecular, tales como por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación detalladas más adelante. Las vahantes de las secuencias de nucleótidos también incluyen las secuencias de nucleótidos derivadas en forma sintética, tales como aquellas generadas, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida a sitios específicos. En general, las variantes de una secuencia de nucleótidos particular de las realizaciones tendrán al menos un 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, hasta 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con dicha secuencia de nucleótidos particular, determinada empleando los programas de alineamiento de secuencias descritos en otra parte en la presente, usando los parámetros predeterminados. Las realizaciones también abarcan las variantes biológicamente activas. Las variantes biológicamente activas incluyen, por ejemplo, secuencias promotoras nativas de las realizaciones que tienen una o más sustituciones, supresiones o inserciones de nucleótidos. La actividad promotora puede medirse usando técnicas tales como análisis Northern, mediciones de la actividad informante tomadas de fusiones de transcripción y semejantes. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York), conocido de aquí en adelante como "Sambrook", e incorporado en la presente documentación a modo de referencia. Como alternativa, pueden medirse los niveles de un gen informante, tal como la proteína fluorescente verde (GFP) o semejantes, producidos bajo el control de un fragmento promotor o una variante. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N°: 6.072.050, incorporada en este documento a modo de referencia. Los métodos para efectuar una mutagénesis y alteraciones en la secuencia de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 82:488-492; Kunkel eí al. (1987) Methods in Enzymol. 754:367-382; Patente de EE.UU. N°: 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citadas en las mismas. Las variantes de las secuencias de nucleótidos promotoras también comprenden secuencias derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, tal como el barajado de ADN. Con un procedimiento como este, pueden manipularse una o más secuencias promotoras diferentes para crear un nuevo promotor que posee las propiedades deseadas. De esta manera, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de secuencias de polinucleótidos relacionadas que comprenden regiones de secuencia con una identidad de secuencia sustancial y que pueden ser recombinadas de forma homologa in vitro o in vivo. Las estrategias para dicho entremezclado de ADN son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 91 :10747-10751 ; Stemmer (1994) Nature 370:389-391 ; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (? 997) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 94:4504-4509; Crameri eí al. (1998) Nature 391 :288-291 ; y las Patentes de EE.UU. N°: 5.605.793 y 5.837.458. Las secuencias de nucleótidos de las realizaciones pueden usarse para aislar las secuencias correspondientes de otros organismos, tal como otras plantas, por ejemplo otras monocotiledóneas. De este modo, pueden usarse métodos, tales como PCR, hibridación y semejantes, para identificar estas secuencias sobre la base de su homología de secuencia con la secuencia detallada en la presente documentación. Las secuencias aisladas sobre la base de su identidad de secuencia con la secuencia del promotor de oxigenasa 2OD completo descrito aquí o con fragmentos de la misma, están comprendidas por las realizaciones. Las regiones promotoras de las realizaciones pueden aislarse de cualquier planta, incluyendo, sin limitaciones, maíz (Zea mays), Brassica (Brassica napus, Brassica rapa ssp. ), alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annuus), trigo (Triticum aestivum), soja (Glicine max), tabaco (Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), maní (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), casava (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucífera), ananá (Ananas comosus), árboles de cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), avocado (Persea americana), higo (Ficus casica), guava (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), avena, cebada, alazor, verduras, ornamentales y coniferas. En un enfoque con PCR, se pueden diseñar cebadores de oligonucleótidos para su uso en reacciones de PCR para amplificar las correspondientes secuencias de ADN a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores para PCR y de clonación por PCR son conocidos en general en la técnica y se describen en Sambrook, supra. Véase también Innis et al. , eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, a modo de ejemplo, los métodos que emplean cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores individuales específicos, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vectores, cebadores parcialmente no coincidentes y semejantes. En los procedimientos de hibridación, se utiliza la totalidad o parte de una secuencia de nucleótidos conocida como una sonda, la cual hibridiza selectivamente con otras secuencias de nucleótidos correspondientes presentes una población de fragmentos de ADN genómico o fragmentos de ADNc clonados (es decir, bibliotecas genómicas o bibliotecas de ADNc) de un organismo seleccionado. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos y se pueden marcar con un grupo detectable, tal como 32P o cualquier otro marcador detectable. Por lo tanto, por ejemplo, las sondas de hibridación se pueden obtener marcando oligonucleótidos sintéticos basado en la secuencia del promotor de oxigenasa 20D. Los métodos para preparar sondas para hibridizar y construir bibliotecas de ADNc y genómicas son generalmente conocidos en la técnica, y se describen en Sambrook, supra. Por ejemplo, se puede usar la secuencia promotora de oxigenasa 20D completa descrita en la presente, o una o más porciones de la misma, como una sonda capaz de hibridizarse específicamente con las secuencias del promotor de oxigenasa 20D correspondientes. Para obtener una hibridación especifica bajo diversas condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias del promotor de oxigenasa 20D y preferentemente son de al menos 10 nucleótidos aproximadamente de longitud, incluyendo secuencias de al menos 20 nucleótidos aproximadamente de longitud. Estas sondas se pueden usar para amplificar las secuencias del promotor de oxigenasa 20D correspondientes a partir de una planta seleccionada por PCR. Esta técnica se puede usar para aislar secuencias de codificación adicionales de la planta deseada o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en una planta. Los procedimientos de hibridación incluyen el análisis de hibridación de bibliotecas de ADN plaqueadas (placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook, supra).

La hibridación de dichas secuencias se puede llevar a cabo bajo condiciones severas. Los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" son condiciones bajo las cuales una sonda se hibridizará con su secuencia blanco hasta un grado detectable mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces con respecto al nivel basal). Las condiciones severas dependen de la secuencia y serán diferentes bajo distintas circunstancias. El control de la severidad de las condiciones de hibridación y/o de lavado, permite identificar secuencias blanco que son un 100% complementarias de la sonda (sonda homologas). Como alternativa, es posible ajusfar las condiciones de severidad para permitir alguna falta de coincidencia en las secuencias de modo que se detectan grados más bajos de similitud (sondas heterólogas). En general, una sonda tiene menos que aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, a menudo menos que 500 nucleótidos de longitud. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sales es menor que aproximadamente 1 ,5 M del ion de Na, típicamente entre 0,01 y 1 ,0 M aproximadamente de concentración del ion de Na (u otras sales) a pH entre 7,0 y 8,3 y la temperatura es de al menos 30 °C aproximadamente para sondas cortas (por ejemplo, entre 10 y 50 nucleótidos) y al menos 60 °C aproximadamente para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes, tal como formamida. Los ejemplos de condiciones de severidad baja incluyen una hibridación con una solución amortiguadora con formamida 30 y 35%, NaCI 1 M, SDS 1 % (dodecilsulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en SSC 1 X a 2X (SSC 20X = NaCI 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) a 50-55°C. Los ejemplos de condiciones de severidad moderada incluyen una hibridación en una solución que contiene formamida 40 y 45%, NaCI 1 ,0 M, SDS 1 % a 37°C, y un lavado en SSC 0,5X a 1 X a 55-60°C. Los ejemplos de condiciones de severidad alta incluyen una hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1 % a 37°C, y un lavado final en SSC 0,1 X a 60-65°C por al menos 30 minutos. La duración de la hibridación es generalmente menor que aproximadamente 24 horas, comúnmente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 12 horas. La especificidad depende típicamente de los lavados de post-híbridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución final de lavado. Para los híbridos de ADN-ADN, se puede estimar el punto de fusión térmico (Tm) empleando la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 738:267-284: Tm = 81 ,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/I; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de guanosina y nucleótidos de citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la cual un 50% de una secuencia blanco complementaria se hibridiza con una sonda perfectamente coincidente. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de falta de coincidencia; por lo tanto, es posible ajustar la Tm, las condiciones de hibridación y/o de lavado para hibridizar las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con ("190% de identidad, puede reducirse el Tm en 10°C. Generalmente se seleccionan condiciones severas con temperaturas aproximadamente 5°C menores que el Tm para la secuencia específica y su complemento, a una fuerza iónica y un pH específico. Sin embargo, pueden obtenerse condiciones muy severas utilizando una hibridación y/o un lavado a una temperatura 1 , 2, 3 ó 4°C menor que el Tm; las condiciones de severidad moderada utilizan una hibridación y/o un lavado a una temperatura 6, 7, 8, 9 ó 10°C menor que el punto de fusión térmico (Tm); las condiciones de severidad baja utilizan una hibridación y/o un lavado a una temperatura 1 1 , 12, 13, 14, 1 5 ó 20°C menor que el punto de fusión térmico (Tm). Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado y la Tm deseada, los especialistas comprenderán que se describen inherentemente variaciones en la severidad de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de falta de coincidencia resulta en un Tm menor que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), es preferible incrementar la concentración de SSC para poder usar una temperatura más alta. Se puede consultar una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I , capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al. , eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York), de aquí en adelante "Ausubel". Véase también Sambrook supra. Por lo tanto, las secuencias aisladas que tienen una actividad promotora inducible y que se hibridiza bajo condiciones severas con las secuencias del promotor de oxigenasa 20D descritas en la presente, o con fragmentos de las mismas, están comprendidas por las realizaciones. En general, las secuencias que tienen actividad promotora y que se hibridizan con las secuencias promotoras descritas en la presente serán al menos entre un 40% y 50% homologas, entre aproximadamente 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% homologas, o más, con las secuencias descritas. Es decir, la similitud de secuencias entre las secuencias puede variar, y las secuencias pueden compartir al menos entre un 40% y 50% aproximadamente, entre un 60% y 70% aproximadamente y aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de similitud de secuencia.

Se usan los siguientes términos para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia" y (e) "identidad sustancial". (a) Como se lo usa en la presente documentación, una "secuencia de referencia" es una secuencia definida, usada como la base para realizar una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, un segmento de una secuencia genética o de ADNc de longitud completa o la secuencia completa del gen o del ADNc. (b) Como se lo usa en la presente documentación, una "ventana de comparación" incluye referencias a un segmento contiguo y específico de una secuencia de polinucleótidos, donde la secuencia de polinucleótidos puede compararse con una secuencia de referencia, y donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para alinear ambas secuencias en forma óptima. En general, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos de longitud y, optativamente, puede ser de 30, 40, 50, 100 o más de longitud. Los especialistas en la técnica comprenderán que a fin de evitar una gran similitud con la secuencia de referencia debido a la inclusión de faltas de coincidencia en la secuencia de polinucleótidos, se introduce típicamente una penalízación por falta de coincidencia y se resta de la cantidad de coincidencias. Los métodos de alineación de secuencias para una comparación son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias cualesquiera se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático. Los ejemplos preferidos no limitativos de estos algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:1 1-17; el algoritmo de homología local de Smith et al. (1981 ) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el algoritmo de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlín y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 87:2264, modificado según Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 90:5873-5877. Se pueden utilizar las implementaciones computarizadas de estos algoritmos matemáticos para la comparación de secuencias con el fin de determinar la identidad de secuencia. Dichas implementaciones incluyen, a modo de ejemplo: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible en Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0); el programa ALIGN PLUS (Versión 3.0, copyright 1997): y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Conjunto de Software Wisconsin Genetics del Grupo de Genética Informática, Versión 10 (disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, EEUU). La matriz de calificación usada en la Versión 10 del paquete de software de Wisconsin Genetics GCG es BLOSUM62 (véase, Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 89:10915). Las alineaciones que emplean estos programas se pueden efectuar utilizando los parámetros predeterminados. El programa CLUSTAL está muy bien descrito por Higgins et al., (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet ef al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 -90; Huang et al. (1992) CABIOS: 8:155-65; y Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307- 331 . Los programas ALIGN y ALIGN PLUS se basan en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Se puede usar una tabla de peso de residuos PAM120, una restricción para la falta de coincidencia de 12 y una restricción por falta de coincidencia de 4 con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de AltschuI et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y AltschuI (1990) supra. La búsqueda de nucleótidos BLAST puede realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o un polipéptido de la invención. Con el fin de obtener alineaciones con faltas de coincidencia para efectuar una comparación, se puede emplear Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en AltschuI et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, se puede utilizar PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para efectuar una búsqueda iterada que permite detectar relaciones distantes entre las moléculas. Véase, AltschuI et al. (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase el sitio de Internet del Centro Nacional de Información de Biotecnología. También puede realizarse la alineación por inspección manual. Las alineaciones también se pueden efectuar mediante inspección manual. A menos que se defina de otra manera, los valores de identidad/similitud de secuencia provistos aquí se refieren al valor obtenido usando el programa GAP con los parámetros predeterminados, o cualquier programa equivalente. Un "programa equivalente" abarca cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualquiera en cuestión, genera un alineamiento idéntico de coincidencias de nucleótidos o residuos de aminoácidos, y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico, cuando se lo compara con el alineamiento correspondiente generado con GAP. El programa GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) supra, para hallar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de faltas de coincidencia. GAP tiene en cuenta todas las alineaciones y posiciones posibles de las coincidencias y crea una alineación con la mayor cantidad de bases coincidentes y la menor cantidad de faltas de coincidencias. Permite la provisión de un limite de penalidad por creación de faltas de coincidencias y una penalidad por la extensión de las faltas de coincidencias, expresados en unidades de bases coincidentes. GAP debe obtener una ganancia con la penalidad por creación de faltas de coincidencias en cantidades de coincidencias por cada falta de coincidencia que inserta. Si se elige una penalidad por la extensión de las faltas de coincidencias mayor que cero, GAP debe, además, proveer una ganancia por cada falta de coincidencia insertada, cuya longitud es la cantidad de faltas de coincidencia, con respecto a la penalidad por extensión de las faltas de coincidencias. Los valores por omisión de creación de faltas de coincidencia y extensión de faltas de coincidencia en la Versión 10 del Conjunto de Software Wisconsin Genetics para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos la penalidad por creación de falta de coincidencia predeterminado es de 50, en tanto la penalidad por falta de coincidencia predeterminado es de 3. La penalidad por creación de faltas de coincidencia y de extensión de las faltas de coincidencia se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros de 0 a 200. Asi, por ejemplo, los valores de las penalidades por creación de faltas de coincidencia y de extensión de las faltas de coincidencia pueden ser de 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o mayor. (c) Como se la usa en la presente documentación, la "identidad de secuencia" o la "identidad", en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son idénticos cuando se efectúa un alineamiento de correspondencia máxima para una ventana de comparación específica. Cuando el porcentaje de identidad de secuencias se utiliza con referencia a proteínas se comprenderá que las posiciones de los residuos que no son idénticos a menudo difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos, donde los residuos aminoacidicos son sustituidos por otros residuos aminoacidicos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por ello no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia se puede ajustar hacia arriba con el fin de corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren en dichas sustituciones conservativas presentan "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para efectuar este ajuste son bien conocidos por los especialistas en la técnica. Típicamente, comprende la calificación de una sustitución conservadora como una falta de coincidencia parcial en lugar de completa, con lo cual aumenta el porcentaje de identidad de secuencias. Así, por ejemplo, cuando un aminoácido idéntico recibe una calificación de 1 y una sustitución no conservadora recibe una calificación de cero, la sustitución conservadora recibe una calificación entre cero y 1 . La calificación de sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, como se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View. California). (d) Como se lo usa en la presente documentación, el "porcentaje de identidad de secuencia" designa el valor determinado por medio de la comparación de dos secuencias alineadas en forma óptima a lo largo de una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia), en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones), para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando la cantidad de posiciones en las cuales aparece la base de ácido o residuo aminoacídico en ambas secuencias para obtener la cantidad de posiciones coincidentes, dividiendo la cantidad de posiciones coincidentes por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. (e) (i) El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 70% de identidad de secuencia, al menos 80%, al menos 90% y al menos 95%, en comparación con una secuencia de referencia, usando uno de los programas de alineamiento descritos, con los parámetros convencionales. Aquellos entrenados en la técnica reconocerán que pueden ajustarse apropiadamente estos valores para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos, teniendo en cuenta la degeneración de los codones, la similitud de los aminoácidos, la localización en el marco de lectura y semejantes. La identidad sustancial de secuencias de aminoácidos para este propósito normalmente comprende una identidad de secuencia de al menos un 60%, 70%, 80%, 90% y al menos 95%.

Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es cuando las dos moléculas hibridizan una con otra bajo condiciones severas. Generalmente se seleccionan condiciones severas con temperaturas aproximadamente 5°C menores que el Tm para la secuencia específica, a una fuerza iónica y un pH especifico. Sin embargo, las condiciones severas abarcan temperaturas en el rango de entre aproximadamente 1°C y aproximadamente 20°C menores que el Tm, dependiendo del grado de severidad, como se indica de otro modo en la presente documentación. Los ácidos nucleicos que hibridizan unos con otros bajo condiciones severas aún son sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se crea una copia del ácido nucleico usando la degeneración de codones máxima permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es cuando el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico presenta reactividad inmunológica cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico.

La secuencia del promotor de oxigenasa 2OD descrita en la presente, así como las variantes y los fragmentos de ésta, es útil para la modificación genética de plantas, por ejemplo, para la producción de una planta transformada o transgénica, para expresar un fenotipo de interés. Como se los usa en la presente documentación, los términos "planta transformada" y "planta transgénica" hacen referencia a una planta que comprende un polinucleótido heterólogo en su genoma. En general, el polinucleótido heterólogo se integra en forma estable en el genoma de una planta transgénica o transformada, de modo que el polinucleótido pasa a las generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo se puede integrar en el genoma ya sea solo o como parte de una construcción de ADN recombinante. Debe comprenderse que, como se lo usa en la presente documentación, el término "transgénico" incluye cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de planta o planta cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia del ácido nucleico heterólogo, incluyendo aquellos transgénicos alterados inicialmente de este modo, así como aquellos creados mediante el cruzamiento sexual o la propagación asexual a partir del transgénico inicial. El término "transgénico", como se lo usa en la presente documentación, no comprende la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por métodos convencionales de cruzamiento de plantas o sucesos de ocurrencia natural, tales como fertilización cruzada al azar, infección por virus no recombinantes, transformación con bacterias no recombinantes, transposición no recombinante o mutación espontánea. Un "evento" transgénico se produce transformando las células vegetales con una construcción de ADN heteróloga, que incluye un cásete de expresión de ácido nucleico que comprende un transgen de interés, regenerando una población de plantas resultantes de la inserción del transgen en el genoma de la planta, y seleccionando una planta particular caracterizada por la inserción en una localización particular del genoma. En términos fenotípicos, un evento se caracteriza por la expresión del transgen. A nivel genético, un evento es parte de la composición genética de una planta. El término "evento" también hace referencia a la progenie producida por un cruzamiento sexual entre la transformante y otra variedad que incluye el ADN heterólogo. Como se lo usa en la presente documentación, el término "planta" incluye referencias a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etcétera), semillas y células vegetales, y progenie de éstas. Dentro del alcance de las realizaciones, las partes de las plantas transgénicas comprenden, por ejemplo, células vegetales, protoplastos, tejidos, callos, embriones, así como flores, tallos, frutos, óvulos, hojas o raíces originadas en las plantas transgénicas o su progenie transformada previamente con una molécula de ADN de las realizaciones, por lo que consisten al menos en parte de células transgénicas. Como se lo usa en la presente documentación, el término "célula vegetal" incluye, sin limitaciones, semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callos, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas. La clase de plantas que se puede usar en los métodos descritos aquí es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores que pueden transformarse empleando técnicas convencionales, incluyendo plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las secuencias promotoras y los métodos descritos en la presente documentación son útiles para regular la expresión de cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta huésped. Por consiguiente, la secuencia de nucleótidos heteróloga ligada operativamente a los promotores descritos en la presente documentación puede ser un gen estructural que codifica una proteína de interés. Los genes de interés reflejan los mercados y los intereses comerciales de aquellos que participan en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y los mercados de interés cambian, y a medida que las naciones en desarrollo se abren a los mercados mundiales, también emergen nuevos cultivos y tecnologías. Además, a medida que crece la comprensión de los caracteres y las características agronómicas, tales como el rendimiento y la heterosis, la elección de los genes para la transformación cambia de forma acorde. Las categorías generales de los genes de interés para las realizaciones incluyen, por ejemplo, aquellos genes que participan en la información, tales como dedos de cinc, aquellos que participan en la comunicación, tales como las quinasas, y aquellos que participan en el mantenimiento, tales como las relacionadas con el mantenimiento, tales como las proteínas de shock de calor. Las categorías de transgenes más específicos, por ejemplo, incluyen genes que codifican proteínas que confieren resistencia estrés abiótico, como por ejemplo, sequías, temperatura, salinidad y toxinas, tales como plaguicidas y herbicidas, o estrés biótico, como por ejemplo, ataques de hongos, virus, bacterias, insectos y nematodes, y el desarrollo de enfermedades asociadas con estos organismos. Son de interés diversos cambios en el fenotipo, incluyendo la modificación de la expresión de un gen en una planta, la alteración del mecanismo de defensa contra patógenos o insectos en una planta, el incremento de la tolerancia a herbicidas de la planta, la alteración del desarrollo de la planta como respuesta a un tipo de estrés ambiental y semejantes. Pueden obtenerse estos resultados promoviendo la expresión de productos heterólogos o incrementando la expresión de productos endógenos en plantas. Como alternativa, también pueden obtenerse estos resultados mediante la reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas, transportadores o cofactores, o afectando la asimilación de nutrientes en la planta. Estos cambios resultan en una alteración del fenotipo de la planta transformada. Se considera que se puede ligar operativamente cualquier gen de interés a las secuencias promotoras de las realizaciones y expresarlas en una planta. Puede usarse una construcción de ADN que comprende uno de estos genes de interés en técnicas de transformación, tales como aquellas que se describen más adelante, para crear resistencia a enfermedades o insectos en plantas con fenotipos susceptibles o para mejorar la resistencia a enfermedades o insectos en plantas con fenotipos resistentes. Por consiguiente, las realizaciones abarcan métodos que están dirigidos a la protección de las plantas contra patógenos fúngicos, bacterias, virus, nematodes, insectos y semejantes. La "resistencia a enfermedades" o la "resistencia insectos" denotan que las plantas no presentan los síntomas dañinos resultantes de las interacciones planta-patógeno.

Los genes de resistencia a enfermedades y resistencia a insectos, tales como las lisozimas, las cecropinas, las maganinas o las tioninas para la protección contra bacterias, o las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR), tales como las glucanasas, y las quitinasas para la protección contra hongos, o las endotoxinas de Bacillus thuringiensis, los inhibidores de proteasas, las colagenasas, las lectinas y glicosidasas para el control de nematodes o insectos, son todos ejemplos de productos génicos útiles. Los patógenos de las realizaciones incluyen, sin limitaciones, virus o viroides, bacterias, insectos, nematodes, hongos, y semejantes. Los virus incluyen el virus en mosaico del tabaco o el pepino, el virus de las manchas en anillo, el virus de necrosis, el virus en mosaico del maíz enano, etcétera. Los nematodes incluyen nematodes parásitos, tales como los nematodes de los nudos de las raíces, los quistes y las lesiones, etcétera. Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a plagas que producen grandes mermas en el rendimiento, tales como el gusano de la raíz, el gusano cortador, el barrenador del maíz europeo y semejantes. Dichos genes incluyen, por ejemplo, los genes de las proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patentes de EE.UU. N°: 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881 ; y Geiser et al. (1986) Gene 48: 109; lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol Biol. 24:825); y semejantes. Los genes que codifican caracteres de resistencia a enfermedades incluyen los genes de desintoxicacíón, tales como los genes contra fumonisina (Patente de EE.UU. N°: 5.792.931 ), de avirulencia (avr) y de resistencia a enfermedades (R) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262: 1432; Mindrinos et al. (1994) Ce// 78: 1089); y semejantes. Pueden introducirse caracteres de resistencia a herbicidas en plantas con genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la acetolactato sintetasa (ALS), en particular los herbicidas tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de acetolactato sintetasa (ALS), que contiene mutaciones que permiten obtener dicha resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la glutamina sintetasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), u otros genes como los mencionados conocidos en la técnica. La resistencia a glifosato es impartida por los genes de 5-enol piruvilshiquimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS) muíante y aroA. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N°: 4.940.835 de Shah et al., que describe la secuencia de nucleótidos de una forma de EPSPS que puede conferir resistencia a glifosato. En la Patente de EE.UU. N°: 5.627.061 de Barry et al. también se describen genes que codifican enzimas EPSPS. Véase también las Patentes de EE.UU. N°: 6.248.876; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971 .908; 5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.1 14; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061 ; 5.633.448; 5.510.471 ; RE 36.449; RE 37.287 y 5.491 .288; y las publicaciones internacionales WO 97/04103; WO 97/041 4; WO 00/66746; WO 01 /66704; WO 00/66747 y WO 00/66748, que se incorporan en la presente documentación a modo de referencia con este propósito. La resistencia a glifosato también es conferida a las plantas que expresan un gen que codifica una enzima glifosato oxido-reductasa como se describe con mayor detalle en las Patentes de EE.UU. N°: 5.776.760 y 5.463.175, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia con este propósito. Además, se puede conferir resistencia a glifosato en plantas mediante la sobreexpresión de genes que codifican glifosato N-acetiltransferasa. Véase, por ejemplo, las Solicitudes de Patente de EE.UU. N°: 10/004.357; 10/427.692, y 10/835.615. Los genes de esterilidad también pueden estar codificados en una construcción de ADN y proveer una alternativa para la emasculación física. Los ejemplos de genes usados de dichas maneras incluyen genes con preferencia por tejidos masculinos y genes con fenotipos de esterilidad masculina, tal como QM, como se describe en la Patente de EE.UU. N°: 5.583.210. Otros genes incluyen quinasas y los que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo gametofítico masculino o femenino. Los caracteres comerciales también pueden estar codificados por uno o más genes que, por ejemplo, pueden incrementar el contenido de almidón para producir etanol, o proporcionar la expresión de proteínas. Otro uso comercial importante de las plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos, tal como se describe en la Patente de EE.UU. N°: 5.602.321. Otros genes, tales como /?-cetotiolasa, PHBasa (polihidroxibutrirato sintetasa) y acetoacetil-CoA reductasa (véase Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837- 5847) facilitan la expresión de los polihidroxialcanoatos (PHA). Se pueden alterar caracteres de importancia agrícola que afectan la calidad del grano, tales como los niveles y los tipos de aceite, saturados e insaturados, la calidad y la cantidad de aminoácidos esenciales, los niveles de celulosa, almidón y el contenido de proteínas, usando los métodos de la presente invención. Las modificaciones incluyen el incremento del contenido de ácido oleico, aceites saturados e insaturados, niveles incrementados de lisina y azufre, proporción de aminoácidos esenciales y también la modificación del almidón. Las modificaciones de la proteína hordotionina en maíz se describen en las Patentes de EE.UU. N°: .990.389; 5.885.801 ; 5.885.802 y 5.703.049; incorporadas en este documento a modo de referencia. Otro ejemplo es la proteina de semillas rica en lisina y/o azufre. codificada por la albúmina 2S de soja descrita en la Patente de EE.UU. N°: 5.850.016, presentada el 20 de marzo, 1996, y el inhibidor de quimiotripsina de cebada, Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, cuyas descripciones se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales, así como aquellos de otras fuentes, incluyendo procariotas y otros eucariotas. Estos productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas y semejantes. Los ejemplos de otros genes que pueden aplicarse, y su fenotipo asociado, incluyen el gen y/o el ARN que codifica la proteína de recubrimiento viral, u otros genes virales o vegetales que confieren resistencia a virus; genes que confieren resistencia a hongos; genes que confieren resistencia a insectos; genes que promueven mejoras en el rendimiento; y genes que proporcionan resistencia al estrés, tal como la deshidratación como resultado del calor y la salinidad, los elementos metálicos o traza tóxicos, o semejantes. En otras realizaciones de la presente invención, las secuencias del promotor oxigenasa 2OD están ligadas operativamente a genes de interés que mejoran el crecimiento de la planta o incrementan los rendimientos de los cultivos bajo condiciones de densidad elevada de plantas. Por ejemplo, el promotor de oxigenasa 2OD pueden ligarse operativamente a una secuencia de nucleótidos que expresa genes de importancia agrícola que resultan en sistemas de raíces primarias o laterales mejoradas. Estos genes incluyen, sin limitaciones, transportadores de nutrientes/agua e inductores del crecimiento. Los ejemplos de estos genes incluyen, sin limitaciones, la H+-ATPasa de membrana plasmática de maíz (MHA2) (Frias et al. (1996) Plant Cell 8: 1533-44); AKT1 , un componente del aparato de asimilación de potasio en Arabidopsis (Spalding et al. (1999) J. Gen. Physiol. 1 1 3:909-18); genes RML, que activan el ciclo de división celular en las células apicales de la raíz (Cheng et al. (1995) Plant Physiol. 708:881 ); los genes de glutamina sintetasa de maíz (Sukanya eí al. (1994) Plant Mol Biol. 26: 1935-46); y hemoglobina (Duff eí al. (1997) J. Biol. Chem. 27: 16749-16752; Arredondo-Peter et al. (1997) Plant Physiol. 7 75: 1259-1266; Arredondo-Peter eí al. (1997) Plant Physiol. 7 74:493-500, y las referencias citadas en dichas publicaciones). El promotor de oxigenasa 20D también puede ser útil para expresar secuencias de nucleótidos antisentído de genes que afectan negativamente el desarrollo de la raíz bajo condiciones de densidad de siembra elevada. La secuencia de nucleótidos heteróloga ligada operativamente al promotor de oxigenasa 20D, y sus fragmentos o variantes con actividad biológica relacionados descritos en la presente documentación, puede ser una secuencia antisentido de un gen blanco. La terminología "secuencia de nucleótidos de ADN antisentido" designa una secuencia que está en orientación inversa, en la orientación normal 5' a 3', respecto de dicha secuencia de nucleótidos. Cuando se la administra a una célula vegetal, la expresión de la secuencia de ADN antisentído evita la expresión normal de la secuencia de nucleótidos de ADN del gen blanco. La secuencia de nucleótidos antisentido codifica un transcripto de ARN que es complementario y capaz de híbridizar con el ARN mensajero endógeno (ARNm) producido por la transcripción de la secuencia de nucleótidos de ADN del gen blanco. En este caso, se inhibe la producción de la proteína nativa codificada por el gen blanco para obtener una respuesta fenotípica deseada. Pueden realizarse modificaciones de las secuencias antisentído siempre que las secuencias híbridicen e interfieran con la expresión del ARNm correspondiente. De esta manera, se pueden utilizar construcciones antisentido que tienen un 70%, 80%, 85% de identidad de secuencia con las correspondientes secuencias antisentido. Además, pueden usarse porciones de los nucleótidos antisentido para alterar la expresión del gen blanco. En general, pueden usarse secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos o más. Por consiguiente, las secuencias promotoras descritas en la presente documentación se pueden ligar operativamente a secuencias de ADN antisentido para reducir o inhibir la expresión de una proteína nativa en la planta. En otras realizaciones de la presente invención, las secuencias promotoras de oxigenasa 20D se ligan operativamente a genes de interés que mejoran el crecimiento de la planta o incrementan los rendimientos de los cultivos bajo condiciones de densidad elevada de plantas. Por ejemplo, el promotor de oxigenasa 20D se puede ligar operativamente a una secuencia de nucleótidos que expresa genes de importancia agrícola que dan como resultado sistemas de raíces primarias o laterales mejoradas. Estos genes incluyen, sin limitaciones, transportadores de nutrientes/agua e inductores del crecimiento. Los ejemplos de estos genes incluyen, sin limitaciones, la H+-ATPasa de membrana plasmática de maíz (MHA2) (Frías et al. (1996) Plant Cell 8: 533-44); AKT1 , un componente del aparato de asimilación de potasio en Arabidopsis (Spalding ef al. ( 999) J. Gen. Physiol. 773:909-18); los genes RML, que activan el ciclo de división celular en las células apicales de la raíz (Cheng et al. (1995) Plant Physiol. 708:881 ); los genes de glutamina sintetasa de maíz (Sukanya ef al. (1994) Plant Mol. Biol. 26: 1935-46) y hemoglobina (Duff et al. (1997) J. Biol. Chem. 27: 16749-16752; Arredondo-Peter et al. (1997) Plant Physiol. 7 75: 1259-1266; Arredondo-Peter et al. (1997) Plant Physiol. 7 74:493-500, y las referencias citadas en dichas publicaciones). El promotor de oxigenasa 20D también puede ser útil para expresar secuencias de nucleótidos antisentido de genes que afectan negativamente el desarrollo de la raíz bajo condiciones de densidad de siembra elevada. El término "ARNi" se refiere a una serie de técnicas relacionadas para reducir la expresión de los genes (Véase por ejemplo la Patente de EE.UU. N°: 6.506.559). Se cree que las técnicas más antiguas, conocidas con otros nombres, se basan en el mismo mecanismo, pero reciben otros nombres en la literatura. Estos incluyen "inhibición antisentido", la producción de transcriptos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteina blanco, y "co-supresión" o "supresión en el sentido del marco de lectura", que hace referencia a la producción de transcriptos de ARN orientados en el sentido del marco de lectura capaces de suprimir la expresión de genes extraños o endógenos idénticos o sustancialmente similares (Patente de EE.UU. N°: 5.231 .020, incorporada en este documento a modo de referencia). Estas técnicas se basan en el uso de construcciones que resultan en la acumulación de ARN de cadena doble, con una cadena complementaria con el gen blanco que se desea silenciar. La secuencia del promotor de oxigenasa 20D de las realizaciones, y sus fragmentos o variantes con actividad biológica relacionadas descritas en la presente documentación, puede usarse para dirigir la expresión de construcciones que resultarán en interferencia de ARN, incluyendo microARN y siARN. En una realización, las construcciones de ADN comprenderán una región de inicio de la transcripción que comprenderá una de las secuencias de nucleótidos promotoras descritas en la presente documentación, o variantes o fragmentos de ésta, ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos heterologa cuya expresión se desee controlar con el promotor inducible de las realizaciones. Esta construcción de ADN contiene una pluralidad de sitios de restricción para insertar la secuencia de nucleótidos bajo la regulación de la transcripción de las regiones reguladoras. Además, la construcción de ADN puede contener genes marcadores de selección. La construcción de ADN incluirá en la dirección 5'-3' de la transcripción, una región de inicio de la transcripción (es decir, un promotor inducible de las realizaciones), una región de inicio de la traducción, una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, una región de terminación de la traducción y, opcionalmente, una región de terminación de la transcripción funcionales en el organismo huésped. Las regiones reguladoras (es decir, los promotores, las regiones de regulación de la transcripción y las regiones de terminación de la traducción) y/o el polinucleótido de las realizaciones pueden ser nativos/análogos respecto de la célula huésped o entre sí. Como alternativa, las regiones reguladoras y/o el polinucleótido de la invención pueden ser heterólogos respecto de la célula huésped o unos de otros. Tal como se utiliza en la presente, el término "heteróloga" con referencia a una secuencia es una secuencia originaria de una especie extraña o, si es de la misma especie, está modificada sustancialmente con respecto a su forma nativa en cuanto a composición y/o locus genómico por intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor ligado operativamente a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la cual deriva el polinucleótido o, si es de la misma especie o una especie análoga, uno o ambos están sustancialmente modificadas con respecto a su forma y/o locus genómico original, o el promotor no es el promotor nativo para el polinucleótido ligado operativamente. La región de terminación incluida opcionalmente puede ser nativa respecto de la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa respecto del polinucleótido de interés ligado operativamente, puede ser nativa respecto de la planta huésped, o puede derivar de otra fuente (es decir, puede ser extraña o heteróloga) respecto del promotor, el polinucleótido de interés, el huésped o cualquier combinación de éstos. Las regiones de terminación convenientes se encuentran disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de la octopina sintetasa y nopalina sintetasa. Véase también Guerineau et al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 262:141 -144; Proudfoot (1991 ) Cell 64:671 -674; Sanfacon et al. (1991 ) Genes Dev. 5:141 -149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 261 - 272; Munroe eí al. (1990) Gene 91 :151 -158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891 -7903; y Joshi eí al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639. En realizaciones particulares, se usa el terminador del gen del inhibidor de proteasa de papa II (Pinll). Véanse, por ejemplo, Keil et al. (1986) Nucí. Acids Res. 14:5641 -5650; y An eí al. (1989) Plant Cell 1 :1 15-122, incorporadas por completo en la presente documentación a modo de referencia. La construcción de ADN que comprende una secuencia promotora de las realizaciones, ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga, también contiene al menos una secuencia de nucleótidos adicional de un gen que se desea cotransformar en el organismo. Como alternativa, pueden proporcionarse secuencias adicionales en otra construcción de ADN. Cuando sea apropiado, podrá optimizarse la secuencia de nucleótidos heteróloga, cuya expresión estará bajo el control de la secuencia promotora inducible de las realizaciones y cualquier secuencia de nucleótidos adicional, para obtener una expresión incrementada en la planta transformada. Es decir, podrán sintetizarse estas secuencias de nucleótidos usando codones preferidos por la planta para obtener una expresión mejorada. En la técnica existen métodos disponibles para sintetizar secuencias de nucleótidos con preferencia por las plantas. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N°: 5.380.831 y 5.436.391 , y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporadas en este documento a modo de referencia. Se conocen otras modificaciones de secuencia que mejoran la expresión del gen en una célula huésped. Dichas modificaciones incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espúreas, señales de sitios de procesamiento de exón-intrón, repeticiones tipo transposón y otras secuencias del tipo bien caracterizadas que pueden resultar nocivas para la expresión del gen.

El contenido de G-C de la secuencia de nucleótidos heteróloga puede ser ajustado en los niveles promedio para una célula huésped dada, calculado con referencia a genes conocidos que se expresan en dicha célula huésped. Cuando fuera posible, la secuencia será modificada a fin de evitar las estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas. Además, las construcciones de ADN pueden contener secuencias directrices 5'. Dichas secuencias directrices pueden mejorar la traducción. Las directrices de traducción son conocidas en la técnica e incluyen: directrices de picornavirus, por ejemplo, la directriz EMCV (región no codificante 5' de la encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 86:6126-6130); directrices de potivirus, por ejemplo, la directriz TEV (virus etch de tabaco) (Allison er al. (1986) Virology 154:9-20); la directriz MDMV (Virus en Mosaico del Maíz Enano) y la proteína que se une a las cadenas pesadas de la inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak er al. (1991 ) Nature 353:90-94); la directriz no traducida del ARNm de la proteína de recubrimiento del virus en mosaico de la alfalfa (AMV ARN 4) (Jobling er al. (1987) /Varare, 325:622-625); directriz del virus en mosaico de tabaco (TMV), (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology of ARN, paginas 237-256); y la directriz del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991 ) Virology 81 :382-385). Véase también, Della- Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. también pueden utilizarse otros métodos conocidos para mejorar la traducción y/o la estabilidad del ARNm, por ejemplo, intrones, tales como el intrón de la ubiquitina de maíz (Christensen y Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218; Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689) o el intrón Adhl de maíz (Kyozuka et al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 228:40-48; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357) y semejantes. Las construcciones de ADN de las realizaciones también incluyen otros potenciadores, ya sean potenciadores de la traducción o de la transcripción, según se los necesite. Estas regiones potenciadoras son bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica, y pueden incluir el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. El codón de inicio debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante para asegurar la traducción de la secuencia completa. Las señales de control de la traducción y los codones de inicio pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. Pueden introducirse regiones de inicio de la traducción de la fuente de la región de inicio de la transcripción, o del gen estructural. La secuencia también puede derivar del elemento regulador seleccionado para expresar el gen, y puede modificarse específicamente para incrementar la traducción del ARNm. Se reconoce que puede utilizarse el incremento de los niveles de transcripción en combinación con las regiones promotoras de las realizaciones. Los potenciadores son conocidos en la técnica e incluyen la región del potenciador SV40, el elemento potenciador 35S y semejantes. En la preparación de la construcción de ADN, pueden manipularse los distintos fragmentos de ADN para obtener las secuencias de ADN en la orientación apropiada, y, cuando resulte apropiado, en el marco de lectura apropiado. Con este fin, pueden emplearse adaptadores o conectores para unir los fragmentos de ADN, o puede recurrirse a otras manipulaciones para proporcionar los sitios de restricción convenientes. Pueden agregarse o eliminarse sitios de restricción, puede eliminarse ADN superfluo o pueden efectuarse otras modificaciones semejantes a las secuencias de las realizaciones. Con este propósito, puede emplearse mutagénesis in vitro, reparación con cebadores, restricción, alineamiento, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones. Pueden incluirse genes informantes o genes marcadores de selección en las construcciones de ADN. Por ejemplo, pueden hallarse ejemplos de genes informantes apropiados conocidos en la técnica en Jefferson eí al. (1991 ), en Plant Molecular Biology Manual, editado por Gelvin eí al. (Kluwer Academic Publishers), págs. 1 -33; DeWet er al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737; Goff er al. (1990) EMBO J. 9:2517-2522; Kain er al. (1995) BioTechniques 79:650-655; y Chiu eí al. (1996) Current Biology 6:325-330. Los genes marcadores de selección para seleccionar células o tejidos transformados pueden incluir genes que confieren resistencia a antibióticos o resistencia a herbicidas. Los ejemplos de genes marcadores de selección apropiados incluyen, sin limitaciones, genes que codifican resistencia a cloramfenicol (Herrera Estrella er al. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella er al. (1983) Nature 303:209-213; Meijer er al. (1991 ) Plant Mol Biol. 76:807-820); higromicina (Waldron er al. (1985) Plant Mol Biol. 5:103-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science 708:219-227); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 270:86-91 ); espectinomicina (Bretagne-Sagnard eí al. (? 996) Transgenic Res. 5:131 -137); bleomicina (Hille eí al. (1990) Plant Mol Biol. 7: 171 -176); sulfonamida (Guerineau eí al. (1990) Plant Mol. Biol. 75:127-136); bromoxinilo (Stalker eí al. (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw eí al. (1986) Science 233:478-481 ); fosfinotricina (DeBlock eí al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518). Otros genes que podrían ser útiles en la recuperación de eventos transgénicos pero que posiblemente no sean necesarios en el producto final podrían incluir, en un sentido no limitativo, ejemplos tales como GUS (b-glucuronidasa; Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (proteína fluorescente verde; Chalfie et al. (1994) Science 263:802), luciferasa (Riggs eí al. (1987) Nucleic Acids Res. 75(19):81 15 y Luehrsen et al. (1992) Methods Enzymol. 276:397-414), y los genes de maíz que codifican la producción de antocianina (Ludwig et al. (1990) Science 247:449). Las moléculas de ácidos nucleicos de las realizaciones son útiles en los métodos dirigidos a la expresión de una secuencia de nucleótidos en una planta. Esto puede efectuarse transformando una célula vegetal de interés con una construcción de ADN que comprende un promotor identificado en la presente documentación, ligado operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga, y regenerando una planta transformada en forma estable a partir de dicha célula vegetal. Los métodos de las realizaciones también se relacionan con la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos en una planta. Estos métodos comprenden transformar una célula vegetal con una construcción de ADN que comprende un promotor identificado en la presente documentación, que inicia la transcripción en una célula vegetal de forma inducible, ligado operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga, regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal, y someter la planta al estímulo requerido para inducir la expresión. La construcción de ADN que comprende la secuencia promotora particular de las realizaciones, ligada ligado operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés, puede usarse para transformar cualquier planta. De este modo, pueden obtenerse plantas modificadas genéticamente, es decir, plantas transgénicas o transformadas, células vegetales, tejido vegetal, semillas, raíces y semejantes. Las especies de plantas apropiadas para las realizaciones incluyen, sin limitaciones, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceites de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno {Sécale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perlado {Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro {Setaria itálica), mijo ahusado {Eleusine coracana)), girasol {Helianthus annuus), cártamo {Carthamus tinctorius), trigo {Triticum aestivum), soja {Glycine max), tabaco {Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), maní {Arachis hypogaea), algodón {Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata {Ipomoea batatus), casava {Manihot esculenta), café {Cofea spp.), coco {Cocos nucífera), ananá {Ananas comosus), árboles de cítricos {Citrus spp.), cacao {Theobroma cacao), té {Camellia sinensis), banana {Musa spp.), avocado {Persea americana), higo {Ficus casica), guava {Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya {Carica papaya), anacardio (Anacardium occidentale), macadamia {Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, verduras, plantas ornamentales y coniferas. Las verduras incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), habas verdes {Phaseolus vulgaris), frijol de media luna {Phaseolus limensis), arvejas (Lathyrus spp.) y miembros del género Curcumis tal como pepino (C. sativus), melón cantalupa (C. cantalupensis) y melón amarillo (C. meló). Las plantas ornamentales incluyen azaleas (Rhododendron spp.), hidrangea {Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes { Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrída), claveles (Dianthus caryophyllus), pastora (Euphorbia pulcherrima) y crisantemos. Las coniferas que pueden ser empleadas en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tales como el pino loblolly, (Pinus taeda), pino del incienso (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino Lodgepole (Pinus contorta), y pino de Monterey (Pinus radiata); abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii); Tsuga del Oeste (Tsuga canadensis); abeto Sitka (Picea glauca); secoia (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos, tales como, abeto de oro (Abies amabilis); y abeto balsámico (Abies balsamea); y cedros, tales como el cedro rojo del Oeste (Thuja plicata) y el cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). Las plantas de las realizaciones pueden ser plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, alazor, maní, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc. ). Por ejemplo, esta invención es adecuada para cualquier miembro de la familia de plantas monocotiledóneas, incluyendo, sin limitaciones, maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, ananá, ñame, cebolla, banana, coco y dátiles. Como se lo usa en la presente documentación, un "vector" hace referencia a una molécula de ADN, tal como un plásmido, un cósmido o un fago bacteriano para introducir una construcción de nucleótidos, por ejemplo, una construcción de ADN, en una célula huésped. Los vectores de clonación típicamente contienen uno o una pequeña cantidad de sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, en los que pueden insertarse secuencias de ADN extrañas de forma determinable, sin que se pierda la función biológica esencial del vector, así como un gen marcador apropiado para usar en la identificación y la selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores típicamente incluyen genes que proporcionan resistencia a tetraciclína, resistencia a higromicina o resistencia a ampicilina. Los métodos de las realizaciones comprenden la introducción de una construcción de nucleótidos en una planta. Tal como se utiliza aquí, "introducción" significa la presentación de la construcción de nucleótidos a la planta, de modo que la secuencia accede al interior de una célula de la planta. Los métodos de las realizaciones no dependen de un método particular para introducir una construcción de nucleótidos en una planta, sino solamente de que la construcción de nucleótidos acceda al interior de al menos una célula de la planta. En la técnica se conocen métodos para introducir construcciones de nucleótidos en plantas, incluyendo, sin limitaciones, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus. Una "transformación estable", es aquella en la cual la construcción de nucleótidos introducida en una planta, se integra en el genoma de la planta y puede ser heredada por la progenie de ésta. Una "transformación transitoria" significa que la construcción de nucleótidos introducida en la planta no se íntegra en el genoma de la planta. Las construcciones de nucleótidos de las realizaciones pueden introducirse en las plantas poniendo en contacto las plantas con un virus o con ácidos nucleicos virales. En general, estos métodos comprenden incorporar una construcción de nucleótidos de las realizaciones en una molécula de ADN o ARN viral. Los métodos para introducir construcciones de nucleótidos en plantas y expresar una proteína codificada en las mismas, que comprende moléculas de ADN o ARN virales, son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N°: 5.889.191 ; 5.889.190; 5.866.785; 5.589.367; y 5.361 .931 ; incorporadas en este documento a modo de referencia. Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas, pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal que se desea transformar, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea. Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos en células vegetales e insertarlos posteriormente en el genoma de la planta incluyen microinyección (Crossway eí al. (? 986) Biotechniques 4:320-334; electroporación, Riggs et al. ? 986) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de EE.UU. N°: 5.981.840 y 5.563.055), transferencia directa de genes (Paszkowski eí al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración balística de partículas(véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N°: 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782; Tomes et al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, editado por Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); McCabe eí al. (1988) Biotechnology 6:923-926). También véase Weissinger er al. (1988) Ann Rev. Genet. 22:421 -477; Sanford er al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671 -674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991 ) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh er al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta er a/. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein er a/. (? 988) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Patentes de EE.UU. N°: 5.240.855; 5.322.783 y 5.324.646; Klein er al. (1988) Plant Physiol. 91 :440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren eí al. (1984) Nature (Londres) 37 7:763-764; Patente de EE.UU. N°: 5.736.369 (cereales); Bytebier eí al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet ef al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nueva York), págs. 197-209 (polen); Kaeppler eí al. (1990) Plant Cell Reports 5 9:415-418; y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por fibras); D'Halluin eí al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li eí al. (1993; Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda eí al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz mediante Agrobacterium tumefaciens); cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. l Oio Las células, que fueron transformadas, se pueden cultivar hasta obtener plantas según las maneras convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81 -84. Estas plantas pueden luego cultivarse y polinizarse con la misma cepa transformada o con distintas cepas, y puede identificarse el híbrido resultante que presenta una expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para 1 5 asegurar que se mantenga en forma estable y se herede la expresión inducible de la característica fenotípica deseada, y luego pueden cosecharse las semillas para asegurar que se haya logrado la expresión inducible de la característica fenotípica deseada. Por consiguiente, como se lo usa en la presente documentación, el término "semillas transformadas" hace referencia a las semillas que contienen la 20 construcción de nucleótidos integrada en forma estable en el genoma de la planta. Existe una variedad de métodos para regenerar plantas a partir de tejido vegetal. El método de regeneración particular dependerá del tejido vegetal inicial y la especie de planta particular a regenerar. La regeneración, el desarrollo y el cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos de plantas individuales o a partir de varios explantes transformados son bien conocidos en la técnica (Weissbach y Weissbach, (1988) en: Methods for Plant Molecular Biology, (Editores), Academic Press, Inc., San Diego, CA). Este proceso de regeneración y desarrollo típicamente incluye los pasos de selección de las células transformadas, cultivo de aquellas células individualizadas a través de las etapas usuales del desarrollo embrionario, hasta la etapa de plántula con raíz. Los embriones y las semillas transgénicas se regeneran de forma similar. Luego se siembran los brotes con raíces resultantes en un medio apropiado para el cultivo de plantas, tal como tierra. Preferiblemente, las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transgénicas homocigotas. Caso contrario, se cruza el polen obtenido de las plantas regeneradas con plantas de líneas de importancia agronómica desarrolladas a partir de semillas. Por otro lado, se usa el polen de plantas de estas líneas importantes para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de las realizaciones que contiene un polipéptido deseado se cultiva usando métodos bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica. En las realizaciones se proporcionan composiciones para analizar compuestos que modulan la expresión en las plantas. Los vectores, las células y las plantas pueden usarse para detectar moléculas candidatas en busca de agonistas y antagonistas del promotor de oxigenasa 20D. Por ejemplo, un gen informante puede unirse con un promotor de oxigenasa 20D y puede expresarse como un transgen en una planta. Se agregan los compuestos que se desea expresar, y se mide la expresión genética para determinar el efecto sobre la actividad promotora. Los siguientes ejemplos se ofrecen a efectos ilustrativos y no deben ser interpretados en un sentido limitativo.

EXPERIMENTOS Las realizaciones se definen además en los siguientes ejemplos, donde las partes y los porcentajes se expresan en peso y los grados son Celsius, a menos que se indique lo contrario. Los procedimientos de biología molecular típicamente se realizaron como se describe en Ausubel o Sambrook, supra. Debe comprenderse que estos ejemplos, si bien indican determinadas realizaciones de la invención, se ofrecen solamente a efectos ilustrativos. A partir de la descripción anterior y estos ejemplos, el especialista en la técnica puede evaluar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu y el alcance de ésta, puede realizar varios cambios y modificaciones a las realizaciones para adaptarlas a varios usos y condiciones. Por consiguiente, varias modificaciones de las realizaciones, además de aquellas presentadas y descritas en la presente documentación, serán evidentes para el especialista en la técnica, a partir de la descripción anterior. Dichas modificaciones también pretenden incluirse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. La descripción de cada referencia detallada en la presente se incorpora por completo en este documento a modo de referencia. Ejemplo 1 Identificación del gen de la oxigenasa 20D El gen de la oxigenasa se identificó usando la tecnología Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS) (véase Brenner S, et al. (2000) Nature Biotechnology 18:630-634, Brenner S et al. (2000) Proc Nati Acad Sci EE.UU. 97: 1665-1670). Esta tecnología comprende la generación de 17 marcas de bases características a partir de muestras de ARNm que han sido transcriptas en forma inversa. Las marcas se secuencian en forma simultánea y se asignan a genes o EST. A la abundancia de estas muestras se le asigna un valor numérico, que se normaliza en partes por millón (PPM), lo que luego permite comparar la expresión de las marcas o la abundancia de las marcas en distintos tejidos. Por consiguiente, puede usarse la plataforma MPSS para determinar el patrón de expresión de un gen particular y su nivel de expresión en distintos tejidos. Las búsquedas en la base de datos MPSS de marcas características que eran preferencialmente sensibilizadas como respuesta a los daños ocasionados por la alimentación del gusano de la raíz de maíz (CRW) dieron como resultado la identificación de una marca correspondiente al gen de la oxigenasa 20D de maíz. Las búsquedas permitieron identificar perfiles de marcas de raíces de plantas de maíz en etapa V5 tratadas con CRW. La búsqueda también permitió identificar los perfiles de marcas de raíces de plantas en etapa V6 que no fueron dañadas por CRW. Una comparación de los perfiles mostró que la marca de la oxigenasa 20D era sensibilizada entre 704 ppm y 2566 ppm como respuesta a la alimentación del CRW dentro de las 24 horas. Una comparación efectuada entre todos los experimentos y tejidos en la base de datos MPSS indicó que el gen de la oxigenasa 20D se expresaba preferencialmente en raíces. Ejemplo 2 Inducción de la expresión del gen de la oxigenasa La evidencia que el gen de la oxigenasa se expresa de una manera inducible era sustanciada mediante un análisis por transferencia Northern (Figura 1 ). Se aisló ARN de raíces nodales y la hoja V5 de la etapa V5 (5 hojas en collar) de plantas de maíz B73 cuyas raíces habían sido dañadas por alimentación del gusano de la raíz de maíz durante 24 horas. Los resultados demostraron que la expresión del gen de la oxigenasa 20D era fuertemente sensibilizada por los daños ocasionados por la alimentación de CRW. La inducción solamente se observaba en las raíces. No se observó inducción en las hojas. Para determinar si la alimentación de los insectos directamente del tejido foliar podía inducir expresión de la oxigenasa 20D, se dejó que barrenadores de maíz europeo se alimentaran de plantas de maíz en etapa V5 durante 24 horas. Los daños ocasionados por las larvas no sensibilizaban la expresión en la zona de transición de verticilos/hoja, ya que los niveles de expresión, determinados por MPSS, se encontraban en los niveles básales de 7 ppm. En los experimentos de alimentación con gusanos de la raíz de maíz, las plantas fueron transplantadas, o no, para determinar si este proceso causaba algún daño en las raices que induciría la expresión del gen de oxigenasa. El transplante se refiere a la transferencia de la planta a tierra fresca. Los daños en las raíces causados por este proceso no indujeron expresión de la oxigenasa 20D. Las lesiones mecánicas de las raíces, específicamente por trituración de las puntas de las raíces, inducen al gen de oxigenasa. Los resultados de MPSS mostraron que hubo inducción de picos del gen aproximadamente 3 horas después de provocar la lesión. La expresión va disminuyendo luego de forma constante durante 24 horas, el último tiempo medido en el experimento. Se obtuvieron resultados similares se obtuvieron mediante análisis por transferencia Northern (Figura 2). Se lesiona mecánicamente las puntas de raíces de plantas en etapa V5 y se cosecharon las raíces nodales y hojas V5 a las 0, 2, 6, 12 y 24 horas después de efectuar las lesiones. Los resultados mostraron picos de expresión en las raíces aproximadamente 6 horas después de efectuar las lesiones y luego disminuyeron constantemente hasta la determinación a las 24 horas. No se detectó expresión en las hojas durante el experimento. Por lo tanto, basado en estos datos, el gen de la oxigenasa 20D es inducido en las raíces, en marco de tiempo de 3-6 horas aproximadamente después de efectuar las lesiones. Tomados en su conjunto, los resultados de la expresión muestran que el gen de la oxigenasa es sensibilizado como respuesta a la alimentación por el CRW y las lesiones mecánicas de las raíces. La sensibilización y expresión tiene preferencia por las raíces, lo que convierte al promotor en un candidato adecuado para dirigir niveles significativos de expresión del transgen en plantas, tal como el maíz, en los casos donde se desea una inducción por insectos o lesiones de la expresión del transgen. Materiales y métodos utilizados Se cultivaron plantas de maíz de la línea B73 bajo condiciones de invernadero hasta la etapa de V5 y se infestaron con 75 larvas del 2o instar del CRW. Se cosecharon hojas (hoja V5) y raíces nodales después de permitir que las larvas se alimentaran durante 24 horas. También se tomaron muestras de plantas en etapa V5 no infestadas como controles para los experimentos. Se extrajo ARN de los tejidos usando el conjunto de elementos para ARN Easy Maxi (Qiagen, Valencia, CA.) Las muestras de ARN fueron sometidas a electroforesis a través de un gel de formaldehído estándar usando soluciones amortiguadoras desnaturalizantes Northern Max (Ambion, Austin, TX.) Después se lavó el gel una vez en SSC 20X por un total de 1 5 minutos, luego se transfirió a una membrana de nylon durante la noche en SSC 20X (Turboblotter de S&S). La membrana se entrecruzó con UV durante 2 minutos. Los transferidos fueron prehibrídizados por un total de 3 horas a 50 °C en 1 5 mi de solución DIG Easy Hyb (Roche Applied Sciences, Indíanápolis, IN.) Se elaboraron sondas de ADN de cadena simple a partir de una EST de la oxigenasa 20D por PCR usando el conjunto de elementos para síntesis de sondas para PCR DIG (Roche). Se agregaron 2 pl de sonda desnaturalizada por 1 mi de solución DIG Easy Hyb según las recomendaciones del protocolo del conjunto de elementos. Se dejó que la hibridación avanzara durante la noche a 50 °C en 10 mi de solución. Al día siguiente, la membrana se lavó dos veces en solución amortiguadora de baja severidad (SSC 2X que contenía SDS 0,1 %) a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se lavó dos veces en solución amortiguadora de gran severidad (SSC 0,1 X que contenia SDS 0,1 %) a 55 °C durante 1 5 minutos. La visualización de los transcriptos de oxigenasa 20D se realizó usando el sistema DIG OMNI para sondas para PCR y DIG Wash y solución amortiguadora de bloqueo de Roche. Brevemente, la membrana se equilibró en solución amortiguadora de lavado (ácido maleico 0, 1 M, NaCI 0, 1 5 M, pH 7,5; Tween 20 0,3% (v\v)) durante 2 minutos a temperatura ambiente, luego se introdujo en solución de bloqueo (dilución 1 :10 de solución de bloqueo 10X en solución amortiguadora de ácido maleico (ácido maleico 0, 1 M, NaCI 0, 15 M, pH 7,5)) durante 30 minutos. La membrana se incubó en solución de anticuerpo (fosfato alcalino-anti-DIG diluido 1 : 10.000 en solución de bloqueo (solución de bloqueo 10X diluido 1 : 10 en solución amortiguadora de ácido maleico)) durante 30 minutos y luego se lavó 2 veces en solución amortiguadora de lavado por un total de 30 minutos. Después de equilibrar en solución amortiguadora de detección (Tris-HCI 0, 1 M, NaCI 0, 1 M, pH 9,5) durante 3 minutos, la membrana se colocó en una carpeta de revelado de plástico (Applied BioSystems) y se aplicó 1 mi de solución de trabajo CDP-Star (dilución 1 :100 de CDP-Star (25 mM, 12,38 mg/ml) en solución amortiguadora de detección) por gotas a la membrana. Después de incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente, la membrana fue expuesta a una película de rayos X entre 20 minutos y toda la noche.

Ejemplo 3 Protocolo de 5' RACE para identificar el sitio de inicio de ta transcripción Se usó 5' RACE para mapear el sitio de inicio de la transcripción para el ARNm de la oxigenasa 2OD y se efectuó de acuerdo con el protocolo provisto con el 5' RACE System para la amplificación rápida de extremos de ADNc (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando ARN aislado de raíces de plantas endogámicas B73 de maíz. Se diseñaron cebadores específicos del gen (GSP) para la 3' UTR del gen de la oxigenasa 20D basado en la secuencia EST identificada. Se utilizó el protocolo alternativo para templados ricos en GC junto con transcriptasa inversa SuperScript II (suministrada con el conjunto de elementos) para la síntesis de la primera cadena usando GSP1 R (SEQ ID N°: 2) localizada en la cadena complementaria entre +1321 y + 1340 bp con relación al sitio de inicio de la traducción (ATG) del gen de la oxigenasa 20D, y se empleó el protocolo general del sistema para los subsiguientes pasos de tratamiento con RNasa, limpieza de la reacción y definición de la cola dC del ADNc. La PCR amplificación se efectuó con GSP2R (SEQ ID N°: 3), también ubicado sobre la cadena complementaria de ADN entre +1252 y +1271 bp con relación a ATG, en combinación con el cebador de anclaje Abridged (suministrado con el conjunto de elementos) usando la polimerasa HotStarTaq (Qiagen). Las condiciones de la PCR fueron: 1 ciclo de 95 °C durante 15 min; seguido de 35 ciclos de la combinación de 94 °C durante 30 seg, 55 °C durante 45 seg y 72 °C durante 1 min; y se completó con 1 ciclo de 72 °C durante 10 min. Luego se llevó a cabo una segunda ronda de PCR usando GSP3R (SEQ ID N°: 4) ubicada sobre la cadena complementaria entre +1 141 y +1 160 bp, con el cebador AUAP suministrado con el conjunto de elementos usando los productos de la primera ronda de PCR como templados. Se efectuó una segunda ronda de PCR con la ADN polimerasa HotStarTaq (Qiagen) usando las siguientes condiciones de PCR: 1 ciclo de 95 °C durante 15 min; seguido de 35 ciclos de 94 °C durante 30 seg, 55 °C durante 45 seg y 72 °C durante 1 min; y se completó con 1 ciclo de 72 °C durante 10 min.

Los productos 5' RACE se clonaron con TA en el pCR2.1 (Invitrogen) y se secuenciaron usando los cebadores directo e inverso M13. La RACE 5' RACE secuencia identificó el sitio de inicio de la transcripción para el ARNm de la oxigenasa 20D en -39 bp con relación al sitio de inicio de la traducción de la oxigenasa 20D (ATG).

Ejemplo 4 Aislamiento del promotor para el gen de oxigenasa 20D y análisis de la secuencia El análisis del gen de oxigenasa 20D en los ejemplos 1 y 2 indicó que era inducido con las lesiones mecánicas y la alimentación de los insectos de las raíces. Por lo tanto, se podría usar el promotor de oxigenasa 20D para dirigir la expresión en plantas de maíz sujetas a una infestación por plagas de insecto o a lesiones mecánicas de las raíces. Se aisló un promotor de aproximadamente 1 1 16 bp (SEQ ID N°: 1 ) del gen de la oxigenasa 20D. Se identificó una caja TATA putativa entre -35 y -29 bp con relación al sitio de inicio de la transcripción de la oxigenasa 20D (véase la Figura 3). Se identificaron dos motivos de secuencia que consistían de TTGAC correspondiente a una "caja W" en el extremo dístal de la SEQ ID N°: 1 . El motivo "caja W" se reconoce por las proteínas de unión a WRKY-ADN inducidas por ácido salicílico como respuesta a distintos tipos de estrés ambiental (Chen et al., 2002, Plant Cell. 14: 559-574). La secuencia se aisló usando múltiples búsquedas reiterativas BLASTN en la base de datos Genome Survey Sequence (GSS) basado en la secuencia EST de dos clones EST. Cada búsqueda en la base de datos GSS empleó la secuencia disponible obtenida de la búsqueda anterior para "desplazarse" a lo largo de la secuencia genómica hasta que no se identificaba ya superposición de secuencias. La búsqueda en GSS dio como resultado 597 bp de secuencia 5' con respecto al sitio de inicio de la transcripción de la oxigenasa 20D. Se obtuvieron 486 bp adicionales de secuencia 5' con respecto a la secuencia derivada de GSS por desplazamiento sobre el genoma como se describe a continuación. Las reacciones de Genome Walking se realizaron para obtener más secuencias flanqueadoras 5' usando la secuencia obtenida de la búsqueda en la base de datos GSS. Las reacciones se efectuaron usando el conjunto de elementos Universal Genome Walker de Clontech/BD Biosciences (Palo Alto, CA.) Se construyeron bibliotecas de ADN genómico aplicando el protocolo del conjunto de elementos usando ADN genómico de B73. Las reacciones de PCR se realizaron usando la ADN polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen) y empleando las condiciones de ciclado del Apéndice C para GeneAmp System 9600. Las reacciones de la primera ronda se efectuaron usando GSP1 GW (SEQ ID N°: 5) correspondiente a la cadena complementaria entre -362 bp y -336 bp desde el sitio de inicio de la traducción de la oxigenasa 20D y el cebador AP1 (suministrado con conjunto de elementos). Las reacciones de la segunda ronda se efectuaron usando el producto de la primera ronda como templado y ya sea GSP2GW (SEQ ID N°: 6) o GSP3GW (SEQ ID N°: 7) con AP2 (suministrado con el conjunto de elementos). GSP2GW y GSP3GW corresponden a la cadena complementaria entre —442 bp y -416 bp y entre -468 bp y -440 bp con relación al sitio de inicio de la traducción, respectivamente. El ADN resultante de las reacciones de la segunda ronda se clonó en el vector TA pCR2.1 (Invitrogen) y se secuenció. El promotor de la oxigenasa 2OD se aisló por PCR con ADN genómico usando la ADN polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen) en solución amortiguadora 2 X y los cebadores de oligonucleótidos, OligoXbal (SEQ ID N°: 8) y OligoBamHINcol (SEQ ID N°: 9). Se agregaron sitios de enzimas de restricción correspondientes a Xbal y Ncol y BamHI para facilitar una clonación posterior. Las condiciones de PCR usadas fueron 1 ciclo de 95 °C durante 5 min; seguido de 35 ciclos de 94 °C durante 30 seg, 60 °C durante 45 seg y 68 °C durante 2 min; y se completó con 1 ciclo de 68 °C durante 10 min.

Ejemplo 5 Actividad del promotor de oxigenasa 20D Para demostrar que la secuencia de ADN aislada como el promotor de oxigenasa 20D funciona como un promotor, se realizaron ensayos de bombardeo de partículas transitorio. Estos ensayos permitieron una rápida evaluación de si la secuencia de ADN estudiada puede dirigir la expresión genética. El promotor de 1 1 16 bp se amplificó por PCR a partir de ADN genómico y se clonó en un vector expresión frente al gen de la B-glucuronidasa (GUS) para evaluar si el promotor podía dirigir la expresión. El bombardeo biolístico de plántulas de maíz de 3 días de vida con este cásete de expresión dio como resultado focos de coloración GUS sobre el coleoptilo. El nivel de coloración era menor que el control, que consistía del promotor de raíces constitutivo y fuerte, Rootmetpro2 (Véase la Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 1 1/022,449), dirigiendo la expresión de GUS. Estos resultados indican que el promotor de oxigenasa 20D de 1 1 16 bp puede dirigir la expresión en células de maíz transformadas de forma transitoria.

Materiales y métodos utilizados para el ensayo biolístico de expresión transitoria en raíces Se colocaron semillas B73 a lo largo del borde de una hoja de papel de germinación embebido en una solución de sacarosa al 7%. Se embebió una hoja adicional de germinación de tamaño idéntico a la primera en sacarosa 7% y se usó para cubrir las semillas. Luego se enrolló el sándwich de papel de germinación- granos-papel de germinación, y se lo colocó en un recipiente con solución de sacarosa al 7%, de modo que la solución ascendiera por el papel hasta los granos en la parte superior del rollo. Esto permitió un crecimiento recto de las raíces. Se dejó que los granos germinaran y se desarrollaran durante 2-3 días en oscuridad a 27-28 °C. Antes del bombardeo, se retiró la lámina externa que recubre al coleoptilo y luego las plántulas se ubicaron en una caja de Petri estéril (60 mm) sobre una capa de papel de filtro Whatman N° 1 humedecida con 1 mi de H2O. Se colocaron dos plántulas por placa en orientaciones opuestas, y se los ancló al papel de filtro con una solución de agarosa al 0,5%. Se prepararon mezclas de ADN/partículas de oro para el bombardeo en el siguiente método: se pre-lavaron 60 mg de partículas de oro de entre 0,6 y 1 ,0 micrones con etanol, se lavaron con H20 destilada estéril y se suspendieron nuevamente en un total de 1 mi de H20 estéril. Se guardaron alícuotas de 50 µ? de suspensión de partículas de oro en tubos Eppendorf siliconadas a temperatura ambiente. El ADN se precipitó sobre la superficie de las partículas de oro combinando, en el orden dado, 50 µ? de partículas de oro prelavadas 0,6 µ?, 5-10 pg de ADN de prueba, 50 µ? de CaCI2 2,5 M y 25 µ? de espermidina 0,1 M. La solución se agitó inmediatamente por vortexeo durante 3 minutos y se centrifugó brevemente para agrupar el ADN/partículas de oro en pelets. La mezcla de ADN/partículas de oro se lavó una vez con 500 µ? de etanol al 100% y se suspendió en un volumen final de 50 µ? de etanol al 100%. La solución de ADN/oro se incubó a -20°C por al menos 60 minutos, antes de aplicar 6 µ? de la mezcla de ADN/oro a cada macrovehículo Mylar™ . Las plántulas, preparadas como se indicó precedentemente, fueron bombardeadas con ADN/partículas de oro dos veces usando la pistola PDS- 1000/He a 1 100 psi bajo 27-28 pulgadas de Hg de vacío. La distancia entre el macrovehículo y la pantalla de detención fue de entre 6 y 8 cm. Las placas se incubaron en recipientes sellados por 24 horas en la oscuridad a 27-28 °C después del bombardeo. Después de 18 a 24 horas de incubación, se evaluaron las plántulas por la expresión transitoria de GUS. Las plántulas se sumergieron en 10-15 mi de solución amortiguadora de ensayo GUS que contenía NaH2PO4-H20 100 mM (pH 7,0), EDTA 10 mM, K4Fe(CN)6-3H20 0,5 mM, Tritón X-100 0,1 % y 5-bromo-4-cloro-3-indoíl glucurónido 2 mM. Las plántulas se incubaron en oscuridad por 24 horas a 37°C. El reemplazo de la solución de coloración de GUS por etanol al 100% detuvo el ensayo. Se visualizó la expresión/coloración de GUS bajo un microscopio. Ejemplo 6 Expresión de oxigenasa 20D en plantas transgénicas Se crearon plantas transformadas de forma estable usando los protocolos de transformación con Agrobacterium según el Ejemplo 8, para permitir una caracterización más detallada de la actividad promotora, incluyendo la inducción del promotor mediante lesiones mecánicas y lesiones por alimentación de insectos. El promotor de oxigenasa 20D de 1 1 16 bp (SEQ ID N°: 1 ) se ligó operativamente al intrón Adh1 y al gen GUS (abreviado como oxigenasa 20D(Adh1 intrónl ):GUS) que permitió detectar la actividad del promotor por coloración histoquímica de los tejidos vegetales para la actividad enzimática GUS. El patrón de la coloración GUS refleja el lugar donde el promotor es activo. Se incluyó el intrón Adh1 con el propósito de incrementar la expresión, ya que se ha demostrado que, en células de cereales, la expresión de genes extraños mejora con la presencia de un intrón en las construcciones genéticas (véase Callis et al. (1987) Genes and Development 1 : 1 183-1200; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357).

Se evaluaron plantas (5 hojas en collar) en etapa V5 bajo condiciones de crecimiento normales, bajo estrés por lesiones o bajo presión de alimentación con CRW. Las lesiones de las raices nodales de las plantas oxigenasa 20D se efectuaron triturando aproximadamente 1 pulgada de la punta de la raíz con alicates aserradas y esperando luego 24 horas antes de tomar las muestras de tejido. La infestación con se efectuó colocando aproximadamente 100 larvas de CRW en 2o instar debajo de la masa radicular en la maceta. El material de hojas y raíces se recolectó 48 horas después. Las plantas evaluadas antes del tratamiento (es decir, bajo condiciones de crecimiento en invernadero normales) proporcionaron el nivel basal con el cual calibrar la inducción con cada tratamiento. No se observó expresión en la mayoría de las plantas de invernadero sin ningún tratamiento. Sin embargo, las lesiones dieron como resultado expresión. Cada una de las plantas mostró inducción de la expresión GUS. Inesperadamente, la expresión se localizó en el sitio de lesión y no se detectó en posición adyacente a la lesión ni en las porciones superiores de la raíz. La respuesta localizada también era indicativa de alimentación por el CRW. Se observó expresión de GUS en tejido radicular en o cerca del lugar donde el CRW había dañado o formado túneles a través de las raíces. Pero a diferencia de las raíces mecánicamente lesionadas, la expresión en las raíces de las que se alimentó el CRW era detectada más allá de la punta y hacia las regiones maduras de la raíz. No se detectó expresión en las hojas de estas plantas, lo que era similar a lo observado en las hojas de plantas lesionadas mecánicamente. Tomados en su conjunto, los resultados indican que el promotor de oxigenasa 20D es inducible en las raíces de plantas transgénicas.

Se caracterizaron plantas en etapa R1 -R2 (definida por formación de sedas y liberación de polen) por una expresión dirigida por 20D en polen, espiguillas y sedas. En polen, no se observó expresión para ninguna de las plantas. Sin embargo en espiquillas, el análisis histoquímico de GUS reveló que aproximadamente la mitad de las plantas evaluadas presentaban coloración de actividad GUS. El nivel de coloración en los tejidos tendía a ser baja y en comparación con el nivel de coloración en las raíces, la expresión en las espiguillas era igual o menor que el nivel en las raíces. Para las sedas, todos salvo un evento mostró un cierto nivel de expresión GUS. No se observó expresión en todas las sedas, sino en aproximadamente un 5 a 50% de las sedas en cada muestra. La expresión era mayormente en las venas con coloración inconsistente en toda la seda. Coloración histoquímica de tejidos vegetales para la actividad GUS La detección de la actividad GUS se realizó colocando tejido de las plantas transformadas en placas de 48 cavidades, 12 cavidades o 6 cavidades que contenían entre 0,5 y 5 mi de solución amortiguadora de ensayo GUS (con la receta de la solución amortiguadora de ensayo descrita en el Ejemplo 5). Las placas se colocaron en una recámara al vacío por 10 minutos y luego se incubaron durante la noche a 37°C. Se eliminó la pigmentación del tejido con entre 1 y 3 incubaciones sucesivas de 12 horas en etanol al 100% a temperatura ambiente. Los tejidos se almacenaron en 70% de etanol a 4°C. Ejemplo 8 Transformación de maíz mediada por Agrobacterium y regeneración de plantas transgénicas En la transformación de maíz mediada por Agrobacterium con una secuencia del promotor de oxigenasa 20D de las realizaciones, se empleó el método de Zhao (Patente de EE.UU. N°: 5.981 .840, (de aquí en adelante la patente '840) y la publicación de Patente PCT W098/32326; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia). Se incubaron Agrobacterium en una placa principal con medio 800, se realizó el cultivo a 28°C en la oscuridad por 3 días, y luego se almacenó a 4°C por hasta un mes. Las placas de trabajo de Agrobacterium se cultivaron en placas con medio 810, y se incubaron en la oscuridad a 28°C por uno o dos días. Brevemente, se disecaron embriones a partir de espigas de maíz frescas y esterilizadas, y se los mantuvo en medio 561 Q hasta que se hubieron recolectado todos los embriones requeridos. Luego se pusieron en contacto los embriones con una suspensión de Agrobacterium preparada a partir de la placa de trabajo, donde las Agrobacterium contenían un plásmido que comprendía la secuencia promotora de las realizaciones. Los embriones se co-cultivaron con las Agrobacterium en placas 562P, con los embriones colocados en las placas con el lado del eje hacia abajo, como lo indica el protocolo de la patente '840. Después de una semana en medio 562P, los embriones se transfieren a medio 5630. Los embriones se subcultivaron sobre medio 5630 fresco a intervalos de 2 semanas y se continuó la incubación bajo las mismas condiciones. Los eventos de callos comenzaron a aparecer después de entre 6 y 8 semanas sobre el medio de selección. Una vez que los callos alcanzaron el tamaño apropiado, se cultivaron en medio de regeneración (288W) y se los mantuvo en oscuridad por 2-3 semanas para iniciar la regeneración de las plantas. Después de completar la maduración de los embriones somáticos, se transfirieron embriones somáticos bien desarrollados a un medio de germinación (272V) y luego a un cuarto de cultivo iluminado. Aproximadamente 7-10 días después, se transfirieron las plántulas en desarrollo al medio 272V libre de hormonas en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas estaban bien establecidas. Las plantas fueron luego transferidas a injertos en planos (equivalentes a macetas de 2,5") que contenían suelo para macetas y se hicieron crecer durante una semana en una cámara de crecimiento, haciéndolas crecer posteriormente por 1 -2 semanas adicionales en un invernadero, y luego se las transfirió a macetas clásicas de 600 (1 ,6 galones) y se las hizo crecer hasta madurez. Medios usados en la transformación mediada por Aqrobacterium y la regeneración de plantas de maíz transqénicas: El medio 561 Q comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C-1416), mezcla de vitaminas de Eriksson 1 ,0 ml/l (1000x SIGMA-1 51 1 ), tiamina HCI 0,5 mg/l, sacarosa 68,5 g/l, glucosa 36,0 g/l, 2,4-D 1 ,5 mg/l y L-prolina 0,69 g/l (llevado a volumen con di H20, después de ajustar el pH en 5,2 con KOH); Gelrite™ 2,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con di H2O)¡ y nitrato de plata 8,5 mg/l (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio 800 comprende solución madre A 50,0 ml/l y 850 mi de di H20, y se lleva a un volumen menor que 100 ml/l con di H20, después de lo cual se agregan 9,0 g de fitagar. Después de esterilizar y enfriar, se agrega solución madre B 50,0 ml/l, junto con 5,0 g de glucosa y 2,0 mi una solución madre de espectinomicina 50 mg/ml. La solución madre A comprende 60,0 g de K2HP04 dibásico y 20,0 g de fosfato de sodio monobásico, disuelto en 950 mi de agua, con el pH ajustado en 7,0 con KOH, y llevado hasta un volumen de 1 ,0 I con di H2O. La solución madre B comprende 20,0 g de NH4CI, 6,0 g de MgSO4-7H O, 3,0 g de cloruro de potasio, 0,2 g de CaCI2 y 0,05 g de FeSO4-7H2O, todo llevado a volumen con di H2O, esterilizado y enfriado. El medio 810 comprende 5,0 g de extracto de levadura (Difco), 10,0 g de peptona (Difco), 5,0 g de NaCI, disueltos en H2O di y se llevó a volumen después de ajustar el pH en 6,8. Luego se agregan 15,0 g de bacto-agar, la solución se esteriliza y enfría, y se agrega 1 ,0 mi de una solución madre 50 mg/ml de espectinomicina. El medio 562P comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C-1416), mezcla de vitaminas de Eriksson 1 ,0 ml/l (1000x SIGMA-1 51 1 ), tiamina HCI 0,5 mg/l, sacarosa 30,0 g/l y 2,4-D 2,0 mg/l (llevado a volumen con di H20 después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); Gelrite™ 3,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con di H20); y nitrato de plata 0,85 mg/l y 1 ,0 mi de una solución madre de acetosiringona 100 mM (ambos agregados después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio 5630 comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C-1416), mezcla de vitaminas de Eriksson 1 ,0 ml/l (1000x SIGMA-151 1 ), tiamina HCI 0,5 mg/l, sacarosa 30,0 g/l, 2,4-D 1 ,5 mg/l, 0,69 g de L-prolina y 0,5 g de solución amortiguadora MES (llevado a volumen con di H2O después de ajustar el pH en 5,8 con KOH). Luego se agregan agar-agar Ultrapure™ 6,0 g/l (EM Science) y se esteriliza y enfría el medio. Luego se agregan nitrato de plata 0,85 mg/l, 3,0 mi de una solución madre de Bialaphos 1 mg/ml y 2,0 mi de una solución madre de carbenicilina 50 mg/ml. 288 W comprende sales MS 4,3 g/l (GIBCO 1 1 1 1 7-074), solución madre de vitaminas MS 5,0 ml/l (0,100 g de ácido nicotinico, tiamina HCI 0,02 g/l, piridoxina HCI 0, 10 g/l y glicina 0,40 g/l, llevado a volumen con D-l H2O) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant, 15:473), mio-inositol 100 mg/l, zeatina 0,5 mg/l y sacarosa 60 g/l, luego llevado a volumen con D-l H2O pulida después de ajustar el pH en 5,6. Posteriormente se agregan agar-agar Ultrapure™ 6,0 g/l (EM Science) y se esteriliza y enfría el medio. Luego se agrega 1 ,0 ml/l de ácido abscísico 0,1 mM; ácido indolacético 1 ,0 mg/l y Bialaphos 3,0 mg/l, junto con 2,0 mi de una solución madre de carbenicilina 50 mg/ml. El medio libre de hormonas (272V) comprende sales MS 4,3 g/l (GIBCO 1 1 1 17-074), solución madre de vitaminas MS 5,0 ml/l (ácido nicotínico 0,100 g/l, tiamina HCI 0,02 g/l, piridoxina HCI 0,10 g/l y glicina 0,40 g/l, llevado a volumen con H20 di pulida), mio-inositol 0,1 g/l y sacarosa 40,0 g/l (llevado a volumen con di H20 después de ajustar el pH en 5,6); y bacto-agar 6 g/l (agregado después de llevar a volumen con di H20), esterilizado y enfriado a 60°C. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los especialistas en la técnica a los cuales está dirigida esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en este documento a modo de referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual se incorporara específicamente e individualmente en este documento a modo de referencia. Aunque la invención precedente se ha descrito con cierto detalle a modo ilustrativo y de ejemplo a efectos de ofrecer una mayor claridad para su comprensión, resulta evidente que es posible efectuar determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES: 1 . Una molécula de ácido nucleico aislada, CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 o un complemento de la misma; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias promotoras vegetales de los plásmidos depositados como el Depósito de Patente N° PTA-6278, o un complemento de la misma; c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 , donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula vegetal; y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que presenta al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 , donde dicha secuencia inicia la transcripción en la célula vegetal.
2. 2. Una construcción de ADN, CARACTERIZADA PORQUE comprende la secuencia de nucleótidos de la cláusula 1 , ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés.
3. 3. Un vector, CARACTERIZADO PORQUE comprende la construcción de ADN de la cláusula 2.
4. 4. Una célula vegetal, CARACTERIZADA PORQUE tiene incorporada en forma estable en su genoma la construcción de ADN de la cláusula 2.
5. 5. La célula vegetal de la cláusula 4, CARACTERIZADA PORQUE dicha célula vegetal es de una monocotiledónea.
6. 6. La célula vegetal de la cláusula 5, CARACTERIZADA PORQUE dicha monocotiledónea es maíz.
7. 7. La célula vegetal de la cláusula 4, CARACTERIZADA PORQUE dicha célula vegetal es de una dicotiledónea.
8. 8. Una planta, CARACTERIZADA PORQUE ha incorporado en forma estable en su genoma la construcción de ADN de la cláusula 2.
9. 9. La planta de la cláusula 8, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una monocotiledónea.
10. 10. La planta de la cláusula 9, CARACTERIZADA PORQUE dicha monocotiledónea es maíz. 1 1 . La planta de la cláusula 8, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una dicotiledónea. 12. Una semilla transformada, CARACTERIZADA PORQUE es de la planta de la cláusula 8. 13. La planta de la reivindicación 8, CARACTERIZADA PORQUE la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, a sales, frío, sequía, patógenos o insectos. 14. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos en una planta, CARACTERIZADO PORQUE dicho método comprende introducir una construcción de ADN en una planta, donde dicha construcción de ADN comprende un promotor y una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés ligada operativamente al promotor, donde dicho promotor comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias promotoras vegetales de los plásmidos designados como el Depósito de Patente N° PTA- 6278; c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 , donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en dicha planta; y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que presenta al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 , donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en una célula vegetal. 15. El método de la cláusula 14, CARACTERIZADO PORQUE dicha planta es una dicotiledónea. 16. El método de la reivindicación 14, CARACTERIZADO PORQUE dicha planta es una monocotiledónea. 17. El método de la cláusula 16, CARACTERIZADO PORQUE dicha monocotiledónea es maíz. 18. El método de la cláusula 14, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, a sales, frío, sequía, patógenos o insectos. 19. El método de la cláusula 14, CARACTERIZADO PORQUE dicha secuencia de nucleótidos heteróloga de interés se expresa selectivamente en raíces. 20. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos en una célula vegetal, CARACTERIZADO PORQUE dicho método comprende introducir una construcción de ADN en una célula vegetal, donde la construcción comprende un promotor ligado operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, donde dicho promotor comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias promotoras vegetales de los plásmidos designados como el Depósito de Patente N° PTA-6278; c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 , donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en dicha célula vegetal; y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que presenta al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 , donde dicha secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en una célula vegetal. 21 . El método de la cláusula 20, CARACTERIZADO PORQUE dicha célula vegetal es de una monocotiledónea. 22. El método de la cláusula 21 , CARACTERIZADO PORQUE dicha monocotiledónea es maíz. 23. El método de la cláusula 20, CARACTERIZADO PORQUE dicha célula vegetal es de una dicotiledónea. 24. El método de la cláusula 20, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, a la sal, el frío, la sequía, patógenos o insectos. 25. Un método para expresar selectivamente una secuencia de nucleótidos en la raíz de una planta, CARACTERIZADO PORQUE dicho método comprende introducir una construcción de ADN en una célula vegetal, y regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal, donde dicha construcción de ADN comprende un promotor y una secuencia de nucleótidos heteróloga ligada operativamente al promotor, donde dicho promotor comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias promotoras vegetales de los plásmidos depositados como el Depósito de Patente N° PTA-6278; c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 , donde dicha secuencia inicia la transcripción en las células vegetales de raices; y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que presenta al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID N°: 1 , donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula vegetal de la raíz. 26. El método de la cláusula 25, CARACTERIZADO PORQUE la expresión de dicha secuencia de nucleótidos heteróloga altera el fenotipo de dicha planta. 27. El método de la cláusula 25, CARACTERIZADO PORQUE dicha planta es una monocotiledónea. 28. El método de la cláusula 27, CARACTERIZADO PORQUE dicha monocotiledónea es maíz. 29. El método de la cláusula 25, CARACTERIZADO PORQUE dicha planta es una dicotiledónea. 30. El método de la cláusula 25, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, a sales, frío, sequía, patógenos o insectos.