MX2007006442A

MX2007006442A - Antagonistas del receptor 3 tipo larga distancia, metodos y usos.

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Publication number: MX2007006442A
Application number: MX2007006442A
Authority: MX
Inventors: Jill Giles-Komar; David M Knight; Kristen Picha; Mark Cunningham; Karen Duffy; Roberta Lamb; Mouhamadou L Mbow; Gopalan Raghunathan; Mateo Lani San; Robert T Sarisky; Nicole Stowell; Raymond Sweet; Shanrong Zhao; Zhizhong Chen; Vedrana Stojanovic-Susulic; Theresa J Goletz; Anuk Das; Jill Carton
Original assignee: Johnson & Johnson
Priority date: 2004-11-30
Filing date: 2005-11-30
Publication date: 2007-10-23
Also published as: JP2008521440A; NZ555475A; AR051836A1; EP1824514B1; IL183541A0; IL183541A; KR20070090969A; JP5039560B2; AU2005311894A1; KR101317264B1; BRPI0518664A2; WO2006060513A3; US8153583B2; TWI487535B; TW200631594A; US20060115475A1; NO20073293L; HK1111360A1; CA2589636A1; EP1824514A2

Abstract

Se describen los antagonistas del receptor 3 tipo toll (TLR3), polinucleotidos que codifican a los antagonistas TLR3 o fragmentos de los mismos, metodos para elaborar y utilizar lo anterior.

Description

ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR 3 TIPO LARGA DISTANCIA, MÉTODOS Y USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a antagonistas del receptor 3 tipo larga distancia (TLR3), polinucleótidos que codifican para antagonistas de TLR3 o fragmentos de los mismos, y métodos para obtener y usar los anteriores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las patologías asociadas con condiciones inflamatorias representan un reto significativo en el cuidado de la salud, y pueden ser dolorosas, debilitantes y letales. Por ejemplo, la sepsis y condiciones asociadas con la sepsis, afectan a más de 750,000 personas anualmente en los Estados Unidos, con índices de mortalidad de 28 a 50%, que resultan en 215,000 muertes anuales (Natanson et al., Crit Care Med. 26: 1927-1931 (1998); Angus et al., Crit. Care Med. 29: 1303-1310 (2001 )). Otras condiciones inflamatorias, tales como las enfermedades inflamatorias del intestino (IBD), enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, afectan a más de 1 millón de personas por año en los Estados Unidos (Hanauer et al., Rev. Gastroenterol. Disord. 3: 81-92 (2003)).

Condiciones inflamatorias pulmonares que afectan la función pulmonar, tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD = EPOC), asma e infecciones pulmonares, afectan también a números significativos de personas en los Estados Unidos. La COPD, por ejemplo, afecta a una cifra estimada de 10 millones de norteamericanos adultos, y su frecuencia está aumentando (Mapel et al., Manag. Care Interface 17: 61-66 (2004)). Las patologías asociadas con estas condiciones inflamatorias, y exacerbaciones de estas condiciones, tienen impactos significativos sobre la salud y economía. La exacerbación en enfermedades pulmonares tales como el asma y la COPD se caracteriza por el empeoramiento de los síntomas, y una disminución en una función pulmonar. Las infecciones virales se asocian con exacerbaciones de muchas enfermedades pulmonares (Johnston, Am. J. Respir. Crit Care Med. 152: S46-52 (1995); Bandi et al, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 37: 69-75 (2003)), y se cree que son una causa importante de exacerbaciones. La secreción de citocinas proinflamatorias en los pulmones después de la infección viral, representa un paso crucial en la promoción de la respuesta inflamatoria en varias enfermedades pulmonares (Gern et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 28: 731-737 (2003); Panina-Bordignon et al., Curr. Opin. Pulm. Med. 9: 104-110 (2003)). La resistencia a la insulina se ha reconocido como una característica integral del síndrome metabólico, que incluye intolerancia a la glucosa, resistencia a la insulina, obesidad, hipertrigliceridemia, colesterol- HDL baja, hipertensión y aterosclerosis acelerada (Wisse, J. Am. Soc. Nephrol. 15: 2792-800 (2004)). Mientras que la predisposición entre la obesidad, diabetes tipo 2 y resistencia a la insulina está bien establecida, continúan siendo aún oscuros los mecanismos moleculares y celulares que controlan la diabetes tipo 2 y la resistencia a la insulina asociada con la obesidad. El hecho de que los individuos obesos exhiban niveles elevados de citocinas proinflamatorias tales como FNT-a, IL-1 b e IL-6, ha aprontado a la hipótesis de que la resistencia a la insulina inducida por la obesidad es una condición inflamatoria (Karin eí al., Nat. Rev. Drug Discov. 3: 17-26 (2004)). De esta manera, la inflamación, obesidad, resistencia a la insulina y el metabolismo aberrante de lípidos, pueden constituir características comunes del síndrome metabólico. De hecho, fármacos no esteroidales tales como los inhibidores de ciclooxigenasa, que pueden interferir con factores de transcripción inflamatorios clave, tales como NF-?ß e IKKß, incrementan la sensibilidad a la insulina en modelos animales ^pacientes humanos con diabetes tipo 2 (Karin et al., citado anteriormente). Además, datos recientes dan apoyo al enlace entre la resistencia a la insulina y la inflamación, según se muestra por la capacidad de ratones con expresión bloqueada condicional de IKKb en células mieloides para exhibir sensibilidad global a la insulina y llegar a ser protegidos contra la resistencia a la insulina, así como ratones que sobreexpresan IKKb en el hígado desarrollan resistencia sistémica a la insulina (Arkan eí al., Nat Med. 11: 191-198 (2005); Cai eí al., Nat. Med. 11: 183-90 (2005)). En conjunto, estos resultados proveen una razón fundamental fuerte para el enlace entre obesidad, resistencia a la insulina y diabetes tipo 2, con enfermedades inflamatorias. El reconocimiento de antígenos microbianos por el sistema inmune del hospedero es mediado a través de receptores inmunes innatos, cuya activación representa un paso importante en el inicio de una respuesta inflamatoria. Los receptores tipo larga distancia (TLR), representan una familia de receptores inmunes innatos que desempeñan una función crucial en la mediación de una respuesta inmune a antígenos extraños. TLR3, por ejemplo, es un receptor de reconocimiento patrón de mamíferos que reconoce ARN de doble cadena (ds), así como el análogo de ARN de doble cadena sintético ácido poli-riboinosínico-ribocitid ílico (poli (l:C)), (Alexopoulou eí al., Nature 413: 732-238 (2001 )). Además, se ha mostrado que TLR3 reconoce ligandos endógenos tales como el ARN mensajero liberado de células necróticas (Kariko eí al., J. Biol. Chem. 26: 12542-12550 (2004)), sugiriendo que la muerte de células necróticas en sitios de inflamación puede contribuir a la activación de TLR3. La activación de TLR3 por poli (l:C) o por ligandos de ARN mensajero endógenos, induce la secreción de citocinas y quimiocinas proinflamatorias, un hallazgo que sugiere que los agonistas de TLR3 modulan el resultado de enfermedad durante la inflamación asociada con infección. De esta manera, se piensa que ocurre ligación de TLR3 in vivo en el contexto de infección viral (Tabeta eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101: 3516-3521 (2004)) o necrosis asociada con inflamación (Kariko eí al., J. Biol. Chem. 26: 12542-12550 (2004)). En general, estos datos demuestran que la ligación de TLR3 inicia cascadas de fosforilación y eventos de activación de la transcripción que resultan en la producción de numerosas citocinas inflamatorias que se piensa contribuyen a la inmunidad innata (revisado por Takeda y Akira, J. Derm. Sci. 34: 73-82 (2004)). Además, estos datos sugieren que la activación sostenida de TLR3 puede ser un componente crítico en la modulación de enfermedades inflamatorias asociadas con infección. Los datos publicados dan apoyo a esta hipótesis, según se muestra por hallazgos que asocian la sobreproducción de citocinas proinflamatorias al síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, tormentas de citocinas agudas asociadas con infección (revisado por Van Amersfoort eí al., Clin. Microbiol. Rev. 16: 379-414 (2003)), y condiciones crónicas mediadas por la respuesta inmune, tales como artritis reumatoide (revisado por Miossec et al., Curr. Opin. Rheumatol. 16: 218-222 (2004)) y enfermedades inflamatorias del intestino (revisado por Ogata y Hibi, Curr. Pharm. Des. 9: 1107-1113 (2003)). Aunque estudios in vitro han demostrado que la estimulación de células epiteliales pulmonares con poli (l:C) indujo la secreción de citocinas múltiples, quimiocinas y la inducción de factores de transcripción y expresión incrementada de TLRs (leki eí al., Clin. Exp. Allergy 34: 745-52 (2004); Sha eí al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 31: 358-64 (2004)), la relevancia fisiológica de dichos eventos continúa siendo incierta. Estas patologías asociadas con condiciones inflamatorias y otras condiciones, tales como las asociadas con infecciones, tienen impacto significativo sobre la salud y economía. Sin embargo, a pesar de los avances en muchas áreas de medicina, comparativamente pocas opciones de tratamiento y terapias están disponibles para muchas de estas condiciones. Por ejemplo, las exacerbaciones de enfermedades pulmonares se tratan con altas dosis de corticosteroides y anti-lgE, tal como XOLAIR®, marca de omalizumab. Se ha mostrado que los corticosteroides inhalados en combinación con agonistas ß2, son efectivos para reducir la incidencia de exacerbaciones. Sin embargo, puesto que estas terapéuticas sólo reducen el riesgo de desarrollo de exacerbaciones, y se asocian con efectos secundarios significativos, se necesitan modalidades terapéuticas alternativas para la prevención y el tratamiento de exacerbaciones de enfermedades pulmonares. De esta manera, existe la necesidad de entender la función de TLR3 en condiciones inflamatorias, y explotar esta función para desarrollar agentes, tales como antagonistas, que traten efectivamente esas condiciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra secuencias de la región variable de cadena pesada de un antagonista de anticuerpo monoclonal de TLR3 anti-humano (hTLR3) (las CDRs están subrayadas). La figura 2 muestra secuencias de la región variable de cadena ligera de un antagonista de anticuerpo monoclonal anti-hTLR3 (las CDRs están subrayadas). La figura 3 muestra la inhibición de la producción de la citocina IL-6 inducida por poli (l:C) en células derivadas de epitelio pulmonar humano por un antagonista de TLR3. La figura 4 muestra la inhibición de la producción de la citocina IL-8 inducida por poli (l:C) en células derivadas de epitelio pulmonar humano por un antagonista de TLR3. La figura 5 muestra la inhibición de la producción de la citocina RANTES inducida por poli (l:C) en células derivadas de pulmón humano por un antagonista de TLR3. La figura 6 muestra la inhibición de la producción de la citocina MIP1-alfa inducida por poli (l:C) en células broncoepiteliales humanas primarias por un antagonista de TLR3. La figura 7 muestra la inhibición de la producción de la citocina IL-6 inducida por poli (l:C) en células broncoepiteliales humanas primarias por un antagonista de TLR3. La figura 8 muestra el efecto de bloquear la expresión de la actividad de TLR3 sobre la pérdida de peso asociada con IBD. La figura 9 muestra la inhibición de la pérdida de peso asociada con IBD por un antagonista de TLR3. La figura 10 muestra la supervivencia incrementada de un modelo de sepsis en murinos a través del tratamiento con un antagonista de TLR3.

La figura 11 muestra una disminución en la producción de la citocina IL-6 en un modelo de sepsis en murinos por un antagonista de TLR3. La figura 12 muestra una disminución en una producción de la citocina FNT-alfa en un modelo de sepsis en murinos por un antagonista de TLR3. La figura 13 muestra incrementos inducidos por poli (l:C) en el número total de células inflamatorias en tejido pulmonar de murino. La figura 14 muestra incrementos inducidos por poli (l:C) en neutrófilos en tejido pulmonar de murino. La figura 15 muestra incrementos inducidos por poli (l:C) en células inflamatorias mononucleares en tejido pulmonar de murino. La figura 16 muestra que la activación de TLR3 con una dosis individual de poli (l:C), deteriora además la función pulmonar en ratones desafiados con metacolina. La figura 17 muestra que la activación de TLR3 con dosis múltiples de poli (l:C), deteriora además la función pulmonar en ratones desafiados con metacolina. La figura 18 muestra que ratones con expresión bloqueada de TLR3, son protegidos del deterioro de la función pulmonar inducido por una dosis individual de poli (l:C) durante el desafío con metacolina. La figura 19 muestra que ratones con expresión bloqueada de TLR3 son protegidos del deterioro de la función pulmonar inducido por dosis múltiples de poli (l:C) durante el desafío con metacolina.

La figura 20A-figura 20E muestran el efecto de un antagonista de TLR3 sobre la producción de citocinas y quimiocinas en células epiteliales bronquiales de pulmón humano. La figura 21 muestra supervivencia incrementada en un modelo de neumonía letal en murinos a través de profilaxis y tratamiento con un antagonista de TLR3. La figura 22 muestra el desarrollo de neumonía letal en un modelo en murinos después de infección con dosis subletales de virus de la influenza A/PR/8 y Streptococcus pneumoniae. La figura 23 muestra la carga bacteriana en los pulmones de ratones infectados con virus de la influenza A/PR/8 y S. pneumoniae. La figura 24A-figura 24D muestran la unión de anticuerpos monoclonales anti-TLR3 adaptados de humano a hTLR3 en pruebas de ELISA. La figura 25 muestra la evaluación de anticuerpos monoclonales anti-TLR3 adaptados de humano en una prueba de liberación de citocinas basada en células. La figura 26 muestra la evaluación de anticuerpos monoclonales variantes HBV1 a HBV8 (excluyendo HBV4), en una prueba de bioactividad basada en células con una lectura de IP-10. La figura 27 muestra la evaluación de anticuerpos monoclonales variantes HBV1 a HBV8 (excluyendo HBV4), en una prueba de bioactividad basada en células con una lectura de RANTES.

La figura 28 muestra la evaluación de anticuerpos monoclonales variantes HBV1 a HBV8 (excluyendo HBV4), en una prueba de bioactividad basada en células con una lectura de IL-8. La figura 29 muestra la evaluación de anticuerpos monoclonales variantes HBV1 a HBV8 (excluyendo HBV4), en una prueba de bioactividad basada en células con una lectura de MCP-1. La figura 30 muestra la evaluación de anticuerpos monoclonales variantes HBV1 a HBV8 (excluyendo HBV4), en una prueba de bioactividad basada en células con una lectura de IL-6. La figura 31 A y la figura 31 B muestran que ratones con expresión bloqueada de TLR3 bajo una dieta de alto contenido de grasa, son protegidos del desarrollo de tolerancia deteriorada a la glucosa asociada con una alimentación de alto contenido de grasa. La figura 32 muestra que ratones con expresión bloqueada de TLR3 tienen niveles normales de glucosa en sangre en ayuno después de 26 semanas bajo una dieta de alto contenido de grasa. La figura 33A-figura 33C muestran un incremento en los niveles de insulina en ayuno antes y después de un desafío con glucosa en ratones con expresión bloqueada de TLR3 después de 26 semanas bajo una dieta de alto contenido de grasa. La figura 34A-figura 34E muestran perfiles mejorados de lípidos de ratones con expresión bloqueada de TLR3 alimentados con una dieta de alto contenido de grasa por 30 semanas, en comparación con ratones de tipo silvestre bajo una dieta de alto contenido de grasa. La figura 35 muestra un protocolo experimental para el tratamiento profiláctico (Pr) y terapéutico (T) con un antagonista de TLR3 durante la inducción de colitis crónica por DSS. La figura 36 muestra la protección por un antagonista de TLR3, de la pérdida de peso que ocurre con cada ciclo de ingestión de DSS. La figura 37 muestra pérdida de peso corporal y recuperación con un antagonista de TLR3, después de un segundo ciclo de DSS. La figura 38 muestra pérdida de peso corporal y recuperación con un antagonista de TLR3 después de un tercer ciclo de DSS. La figura 39 muestra el efecto del tratamiento con un antagonista de TLR3 sobre la pérdida neta de peso corporal asociada con colitis crónica por DSS. La figura 40 muestra el efecto del tratamiento con un antagonista de TLR3 sobre el acortamiento del colon asociado con colitis crónica por DSS. La figura 41 A-figura 41 F muestran el efecto del tratamiento con un antagonista de TLR3 sobre la severidad de colitis crónica por DSS. La figura 41 A-figura 41 F muestran los efectos histopatológicos del tratamiento con un antagonista de hTLR3 en colitis crónica por DSS. La figura 42A-figura 42D muestran la activación de células T en colitis crónica por DSS. La figura 43 muestra el efecto del tratamiento profiláctico con un antagonista de TLR3 sobre el incremento de células CD11 b+ asociado con DSS en el bazo. La figura 44A y la figura 44B muestran el efecto del tratamiento con un antagonista de TLR3 sobre los niveles sistémicos de IL-4 e IL-10 en colitis crónica por DSS.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención, es un antagonista del receptor 3 tipo larga distancia (TLR3) que inhibe la producción celular de RANTES. - Otro aspecto de la invención, es un anticuerpo aislado reactivo con TLR3 que tiene la capacidad de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NOs: 9, 11 y 13, y las secuencias de aminoácidos de las CDRs de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23. Otro aspecto de la invención, es un anticuerpo aislado reactivo con TLR3 que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NOs: 9, 11 y 13, y las secuencias de aminoácidos de las CDRs de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23. Otro aspecto de la invención, es un anticuerpo aislado que tiene una secuencia de aminoácidos de CDR1 de V como se muestra en la fórmula (I): Thr Thr Tyr Trp Xaai His O) en donde Xaa1 es lie o Met (SEQ ID NO: 61 ); una secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH como se muestra en la fórmula (II): Glu lie Asn Pro Asn Asn Gly Arg lie Asn Xaa2 Xaa3 Glu Lys Xaa4 Lys Thr (II) en donde Xaa2 es Tyr o Gly, Xaa3 es Asn o Ala y Xaa4 es Phe o Gly (SEQ ID NO: 62); y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH como se muestra en la fórmula (lll): Val Gly Val Xaa5 He Thr Thr Phe Pro Tyr (lll) en donde Xaa^es Met o lie (SEQ ID NO: 63); y CDRs de VL que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23. Otro aspecto de la invención, es un polinucleótido aislado que codifica para una cadena pesada de anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR mostradas en SEQ ID NOs: 9, 11 y 13. Otro aspecto de la invención, es un polinucleótido aislado que codifica para una cadena ligera de anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR mostradas en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23. Otro aspecto de la invención, es un polinucleótido aislado que codifica para una cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 6, 25, 27, 29, 31 , 45, 47, 49, 51 ó 53. Otro aspecto de la invención, es un polinucleótido aislado que codifica para una cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 16, 33, 35, 37 ó 39. Otro aspecto de la invención es un método para tratar o prevenir una condición inflamatoria, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de TLR3 a un paciente que necesita del mismo, por un tiempo suficiente para tratar o prevenir la condición inflamatoria. Otro aspecto de la invención es un método para incrementar la velocidad de proliferación de una célula, que comprende poner en contacto un antagonista de TLR3 con una célula que expresa un receptor de TLR3, por un tiempo suficiente para incrementar la velocidad de proliferación de la célula.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las publicaciones que incluyen, pero no están limitadas a, patentes y solicitudes de patente citadas en esta especificación, se incorporan en su totalidad en la presente como referencia.

El término "antagonista", como se usa en la presente, significa una molécula que inhibe parcialmente o completamente, por cualquier mecanismo, un efecto de otra molécula tal como un receptor. Como se usa en la presente, un "antagonista de TLR3" o un compuesto "reactivo con TLR3", describe una molécula que es capaz, directamente o indirectamente, de contrarrestar, reducir o inhibir sustancialmente la actividad biológica de TLR3 o la activación del receptor de TLR3. Dichos antagonistas pueden ser, por ejemplo, pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, polipéptidos, proteínas de fusión, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, mimeticuerpos o polinucleótidos. El término "anticuerpos", como se usa en la presente, se entiende en un sentido amplio, e incluye moléculas de inmunoglobulina o anticuerpo que incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales que incluyen anticuerpos monoclonales de murino, humano, adaptados de humano, humanizados y quiméricos, y fragmentos de anticuerpo. En general, los anticuerpos son proteínas o cadenas peptídicas que exhiben especificidad de unión a un antígeno específico. Anticuerpos intactos son glucoproteínas heterotetraméricas compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Típicamente, cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada por medio de un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de ¡nmunoglobulina. Cada cadena ligera y pesada tiene también puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V ), y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras de anticuerpo de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, a saber, kappa (K) y lambda (?), con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio de constante de la cadena pesada. La IgA y la IgG se subclasifican además como los isotipos IgA-t, lgA2 IgGi, lgG2, lgG3 e lgG4. El término "fragmentos de anticuerpo" significa una porción de un anticuerpo intacto, en general la región variable o de unión al antígeno del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, cuerpos completos, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados de por lo menos dos anticuerpos intactos. El término "antígeno", como se usa en la presente, significa cualquier molécula que tenga la capacidad de generar anticuerpos directamente o indirectamente (en forma alternativa, denominado un inmunógeno). Incluido dentro de la definición de "antígeno", es un ácido nucleico que codifica para proteínas. Las "CDRs" se definen como las secuencias de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de un anticuerpo, que son las regiones hípervariables de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Kabat eí al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a. ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Existen tres CDRs o regiones CDR de cadena pesada, y tres CDRs o regiones CDR de cadena ligera en la porción variable de una inmunoglobulina. De esta manera, el término "CDRs", como se usa en la presente, se refiere a las tres CDRs de cadena pesada, o las tres CDRs de cadena ligera, o todas las CDRs de cadena ligera y pesada, si es adecuado. Las CDRs proveen la mayoría de los residuos de contacto para la unión del anticuerpo a un antígeno o epítope. Las CDRs de interés en esta invención se derivan de secuencias de cadena ligera y pesada variables del anticuerpo donador, e incluyen análogos de las CDRs de ocurrencia natural, cuyos análogos comparten o retienen también la misma especificidad de unión al antígeno y/o capacidad neutralizante, que el anticuerpo donador del cual se derivaron. El término "célula epitelial", como se usa en la presente, significa una célula que se origina de un tejido celular membranoso que cubre una porción de una superficie libre (por ejemplo, piel), o que reviste un tubo o cavidad (por ejemplo, colon) de un animal. Dichas células pueden aislarse, o pueden comprender parte de un grupo más altamente organizado de células, tales como las que se encuentran en tejidos, órganos o modelos in vitro de éstas. El término "homólogo" significa secuencias de proteína que tienen entre 40% y 100% de identidad de secuencia con una secuencia de referencia. Homólogos de hTLR3 incluyen polipéptidos de otra especie que tienen entre 40% y 100% de identidad de secuencia con una secuencia de hTLR3 conocida. Puede determinarse el por ciento de identidad entre dos cadenas peptídicas por alineación de pares, usando los valores predeterminados del módulo AlignX de Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Por "TLR3" se entiende hTLR3 y sus homólogos. Una secuencia de aminoácidos de TLR3 de humano de longitud completa y secuencia de polinucleótidos codificante, se muestra en SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente. El término "en combinación con", como se usa en la presente, significa que los agentes descritos pueden administrarse a un animal en conjunto en una mezcla, concurrentemente como agentes individuales, o secuencialmente como agentes individuales en cualquier orden. El término "condición inflamatoria", como se usa en la presente, significa una respuesta localizada a lesión celular que es mediada en parte por la actividad de citocinas, quimiocinas o células inflamatorias (por ejemplo, neutrófilos, monocitos y linfocitos) que se caracteriza en la mayoría de los casos por dolor, rojez, hinchamiento y pérdida de la función del tejido. El término "condición pulmonar inflamatoria", como se usa en la presente, significa una condición inflamatoria que afecta a los pulmones o se asocia con los mismos. El término "mimeticuerpo", como se usa en la presente, significa una proteína que tiene la fórmula genérica (I): (V1 -Pep-Lk-V2-Hg-CH2-CH3?t) ( en donde V1 es una porción de un extremo N-terminal de una región variable de inmunoglobulina, Pep es un polipéptido que se une a TLR3 de la superficie de la célula, Lk es un enlace químico o polipeptídico, V2 es una porción de un extremo C-terminal de una región variable de inmunoglobulina, Hg es una porción de una región de gozne de inmunoglobulina, CH2 es una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina, y CH3 es una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina, y t es independientemente un entero de 1 a 10. Un mimeticuerpo puede imitar propiedades y funciones de diferentes tipos de moléculas de ¡nmunoglobulina, tales como lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgD e IgE dependiente de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada presente en la construcción. En algunas modalidades de mimeticuerpo, V1 puede estar ausente. Un antagonista de mimeticuerpo de la presente invención afecta la actividad biológica de TLR3 a través de la unión a TLR3 de la superficie de la célula. El término "anticuerpo monoclonal" (mAb), como se usa en la presente, significa un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, típicamente siendo dirigidos contra un determinante antigénico individual. El modificador "monoclonal" indica el carácter sustancialmente homogéneo del anticuerpo, y no requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales de murino por medio del método de hibridomas de Kohler eí al., Nature 256: 495-497 (1975). Pueden prepararse anticuerpos monoclonales quiméricos que contengan una región variable de cadena pesada y de cadena ligera derivada de un anticuerpo donador (típicamente murino), en asociación con regiones constantes de cadena pesada y ligera derivadas de un anticuerpo aceptor (típicamente otra especie de mamífero tal como humano), por medio del método descrito en la patente de los Estados Unidos No. 4,816,567. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales adaptados de humano que tengan CDRs derivadas de una inmunoglobulina de donador no humano (típicamente murino), y las partes restantes de la molécula derivadas de inmunoglobulina siendo derivadas de una o más inmunoglobulinas humanas, por medio de técnicas conocidas por los expertos en la materia, tal como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,225,539. Opcionalmente, pueden modificarse además anticuerpos monoclonales adaptados de humano, incorporando residuos de soporte de estructura alterados que preserven la afinidad de unión, por medio de técnicas tales como las descritas en Queen eí al., Proc. Nati. Acad. Sci.

(USA), 86: 10029-10032 (1989) y Hodgson eí al., Bio/Technology, 9: 421 (1991 ). Ejemplos de secuencias de estructura de humano útiles para adaptación en humanos se describen, por ejemplo, en www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.ncbi.nih.gov/igblast; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php; www.kabatdatabase.com/top.html; ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat; www.sciquest.com; www.abcam.com; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html; www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html; mcb.harvard.edu/BioLinks/lmmunology.html; www.immunologylink.com; pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html; www.appliedbiosystems.com; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody; www.m.ehime-u. ac.jp/~yasuhito/Elisa. html; www.biodesign.com; www.cancerresearchuk.org; www.biotech.ufl.edu; www.isac-net.org; baserv.uci.kun.nl/~jraats/links1.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu; www.mrc-cpe.cam.ac.uk; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; http://www.bioinf.org.uk/abs; antibody.bath.ac.uk; www.unizh.ch; www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.jerini.de; imgt.cines.fr; y en Kabat eí al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1987), cada sitio incorporado enteramente en la presente como referencia. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales completamente humanos que carezcan de alguna secuencia no humana, a partir de ratones transgénicos e inmunoglobulina humana por medio de técnicas referidas, por ejemplo, en Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-851 (1996) y Méndez eí al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997). Pueden prepararse y optimizarse también anticuerpos monoclonales de humano a partir de colecciones de exhibición de fagos por medio de técnicas referidas, por ejemplo, en Knappik eí al., J. Mol. Biol. 296: 57-86 (2000) y Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254: 67-84 (2001 ). El término "velocidad de proliferación", como se usa en la presente, se refiere al cambio en el número de células por unidad de tiempo, o el cambio en el número de células que exhiben un marcador de progresión a través del ciclo celular hacia la división celular, por unidad de tiempo. Dichos marcadores pueden ser morfológicos, indicadores de replicación de ADN, o productos de genes expresados. El término "actividad biológica de TLR3" o "activación del receptor de TLR3", como se usa en la presente, se refiere a cualquier actividad que ocurra como resultado de la unión del ligando a TLR3 de la superficie de la célula. Se usan en la presente códigos de aminoácidos de una y tres letras convencionales, de la manera siguiente: Composiciones de materia La presente invención se refiere a antagonistas capaces de inhibir la señalización mediada por el receptor de TLR3, y usos de dichos antagonistas. Dichos antagonistas de TLR3 pueden tener las propiedades de unir un receptor de TLR3, y de inhibir la señalización mediada por el receptor de TLR3. Ejemplos de mecanismos por los cuales la señalización de TLR3 puede ser inhibida por dichos antagonistas, incluyen inhibición de actividad de cinasa, reducción de transcritos o antagonismo del receptor. Otros antagonistas capaces de inhibir la señalización mediada por el receptor de TLR3 por otros mecanismos, están también dentro del alcance de los varios aspectos y modalidades de la invención. Estos antagonistas son útiles como reactivos de investigación, reactivos de diagnóstico y agentes terapéuticos. Un aspecto de la presente invención es un antagonista del receptor 3 tipo larga distancia (TLR3) que inhibe la producción celular de la citocina RANTES (regulada en la activación, normalmente expresada y secretada por células T). Otro aspecto de la invención es un antagonista de TLR3 que inhibe la producción celular de RANTES y una citocina seleccionada del grupo que consiste de interleucina-6 (IL-6), ¡nterleucina-8 (IL-8) y proteína-1 alfa inflamatoria de macrófagos (MIP1-alfa). En otro aspecto, la invención provee un anticuerpo aislado reactivo con TLR3 que tiene la capacidad de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal que tiene las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NOs: 9 (CDR1 de VH), 11 (CDR2 de VH) y 13 (CDR3 de VH), y las secuencias de aminoácidos de la CDRs de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NOs: 19 (CDR1 de VL), 21 (CDR2 de VL) y 23 (CDR3 de VL). Un ejemplo de anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que comprende secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NOs: 9, 11 y 13, y secuencias de aminoácidos de CDR de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo aislado reactivo con TLR3, que comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6, y una V que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 16. Otro aspecto de la invención son polinucleótidos aislados que codifican para cualquiera de los anticuerpos u otros antagonistas de TLR3 de proteínas de la invención, o su complemento. Algunos ejemplos de polinucleótidos se describen en la presente; sin embargo, otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o preferencias por codones en un sistema de expresión determinado codifican para los anticuerpos u otros antagonistas de TLR3 de proteínas de la invención, están también dentro del alcance de la invención. Otro aspecto de la invención es una cadena pesada de anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR mostradas en SEQ ID NOs: 9, 11 y 13. Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que codifica para una cadena ligera de anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR mostradas en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23. Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que codifica para una cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6. Un ejemplo de secuencia de polinucleótidos se muestra en SEQ ID NO: 5. Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado que codifica para una cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 16. Un ejemplo de secuencia de polinucleótidos se muestra en SEQ ID NO: 15. Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo monoclonal adaptado de humano que comprende una secuencia de aminoácidos de VH como se muestra en SEQ ID NOs: 25, 27, 29 ó 31, y una secuencia de aminoácidos de VL como se muestra en SEQ ID NOs: 33, 35, 37 ó 39. Polinucleótidos aislados que codifican para las secuencias de aminoácidos de VH mostradas en SEQ ID NOs: 25, 27, 29 y 31 , y las secuencias de aminoácidos de V mostradas en SEQ ID NOs: 33, 35, 37 y 39, son también un aspecto de la invención. Estos anticuerpos monoclonales adaptados de humano comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR de VH mostradas en SEQ ID NOs: 9, 11 y 13, y las secuencias de aminoácidos de CDR de VL mostradas en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23. Ejemplos de secuencias de ácido nucleico que codifican para las secuencias de aminoácidos de VH de SEQ ID NOs: 25, 27, 29 y 31 , se muestran en SEQ ID NOs: 26, 28, 30 y 32, respectivamente. Ejemplos de secuencias de ácido nucleico que codifican para las secuencias de aminoácidos de VL de SEQ ID NOs: 33, 35, 37 y 39, se muestran en SEQ ID NOs: 34, 36, 38 y 40, respectivamente. Una modalidad particular de un anticuerpo monoclonal adaptado de humano de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de VH como se muestra en SEQ ID NO: 25, y una secuencia de aminoácidos de V como se muestra en SEQ ID NO: 33.

Otra modalidad de la presente invención es un anticuerpo aislado que tiene una secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH como se muestra en la fórmula (I): (I) en donde Xaa? es lie o Met (SEQ ID NO: 61 ); una secuencia de aminoácidos de CDR2-de-VH-como_se muestra en la fórmula (II): Glu He Asn Pro Asn Asn Gly Arg He Asn Xaa2 Xaa3 Glu Lys Xaa4 Lys Thr (II) en donde Xaa2 es Tyr o Gly, Xaa3 es Asn o Ala y Xaa4 es Phe o Gly (SEQ ID NO: 62); y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH como se muestra en la fórmula (lll): Val Gly Val Xaa5 lie Thr Thr Phe Pro Tyr (lll) en donde Xaa5 es Met o lie (SEQ ID NO: 63); y CDRs de VL que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23. Ejemplos de especies incluyen un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos de VL como se muestra en SEQ ID NO: 33, y una secuencia de aminoácidos de VH que comprende una CDR1 de V de fórmula (I), en donde Xaai es Met, y secuencias de aminoácidos de CDR2 de VL y CDR3 de V como se muestra en SEQ ID NOs: 11 y 13, respectivamente (SEQ ID NO: 45, ejemplo de ácido nucleico mostrado en SEQ ID NO: 46). En esta especie, Xaai es Met; Xaa2 es Tyr; Xaa3 es Asn; Xaa4 es Phe; y Xaa5 es Met. Otros ejemplos de especies incluyen anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos de VL como se muestra en SEQ ID NO: 33, y una secuencia de aminoácidos de VH que comprende secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH y CDR3 de VH como se muestra en SEQ ID NOs: 9 y 13, respectivamente, y una CDR2 de VH de fórmula (II), en donde: Xaa2 es Gly, Xaa3 es Asn y Xaa4 es Phe (SEQ ID NO: 47, ejemplo de secuencia de ácido nucleico mostrada en SED ID NO: 48); Xaa2 es Tyr, Xaa3 es Ala y Xaa4 es Phe (SEQ ID NO: 49, ejemplo de secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 50); y Xaa2 es Tyr, Xaa3 es Asn y Xaa4 es Gly (SEQ ID NO: 51, ejemplo de secuencia de ácido nucleico mostrada en SED ID NO: 52). Otro ejemplo de especie incluye un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos de VL como se muestra en SEQ ID NO: 33, y una secuencia de aminoácidos de VH que comprende secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH y CDR2 de VH como se muestra en SEQ ID NOs: 9 y 11 , respectivamente, y una CDR3 de VH de fórmula (lll), en donde Xaa5 es lie (SEQ ID NO: 53, ejemplo de secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 54). En suma, los ejemplos de especies incluyen anticuerpos que tienen una de las siguientes combinaciones de secuencias de aminoácidos de VL y VH: VL, SEQ ID NO: VM, SEQ ID NO: 33 45 33 47 33 49 33 51 33 53 La invención incluye además anticuerpos aislados en donde la VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 45, 47, 49, 51 ó 53, y la VL tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 33, 35, 37 0 39. Ejemplos de antagonistas de anticuerpos pueden ser anticuerpos de los isotipos IgG, IgD, IgGA o IgM. Además, dichos anticuerpos antagonistas pueden ser modificados post-traducción por medio de procedimientos tales como glucosilación, isomerización, desglucosilación o modificación covalente de ocurrencia no natural, tal como la adición de porciones de polietilenglicol (pegilación) y lipidación. Dichas modificaciones pueden ocurrir in vivo o in vitro. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden ser conjugados con polietilenglicol (PEGilados) para mejorar sus perfiles farmacocinéticos. La conjugación puede llevarse a cabo por medio de técnicas conocidas por los expertos en la materia. Se ha mostrado que la conjugación de anticuerpos terapéuticos con PEG mejora la farmacodinámica, mientras que no interfiere con la función. Véase Deckert eí al., Int. J. Cáncer 87: 382-390, 2000; Knight eí al., Platelets 15: 409-418, 2004; Leong eí al., Cytokine 16: 106-119, 2001 ; y Yang et al., Protein Eng. 16: 761-770, 2003. Las propiedades farmacocinéticas de los anticuerpos de la invención podrían mejorarse también a través de modificaciones de Fe por medio de técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, las cadenas pesadas del isotipo lgG4 contienen un motivo de Cys-Pro-Ser-Cys (CPSC) en sus regiones de gozne capaz de formar enlaces disulfuro inter-cadena o intra-cadena pesada, es decir, los dos residuos de Cys en el motivo de CPSC pueden formar un enlace disulfuro con los residuos de Cys correspondientes en la otra cadena pesada (inter-cadena), o los dos residuos de Cys dentro de un motivo de CPSC determinado pueden formar enlaces disulfuro entre sí (intra-cadena). Se cree que enzimas isomerasa in vivo son capaces de convertir enlaces inter-cadena pesada de moléculas de lgG4 a enlaces de ¡ntra-cadena pesada, y viceversa (Aalberse y Schuurman, Immunology 105: 9-19 (2002)). Por consiguiente, puesto que los pares de cadena pesada: ligera (HL) en aquellas moléculas de lgG4 con enlaces intra-cadena pesada en la región de gozne no están asociados covalentemente entre sí, pueden disociarse en monómeros de HL que entonces se reasocian con monómeros de HL derivados de otras moléculas de lgG4, formando moléculas de lgG4 heterodiméricas biespecíficas. En un anticuerpo de IgG biespecífico, los dos Fabs de la molécula de anticuerpo difieren en los epítopes que unen. La sustitución de Ser228 en la región de gozne de lgG4 con Pro, resulta en un "comportamiento tipo lgG1", es decir, las moléculas forman enlaces disulfuro estables entre las cadenas pesadas y, por lo tanto, no son susceptibles al intercambio de HL con otras moléculas de lgG4. En una modalidad, los anticuerpos de la invención comprenderán un dominio Fe de lgG4 con una mutación S228P. Además, pueden removerse sitios que afecten la unión a receptores de Fe diferentes del receptor silvestre FcRn en los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, los receptores de Fe implicados en la actividad de ADCC pueden removerse en los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, la mutación de Leu234/Leu235 en la región de gozne de lgG1 a L234A L235A o Phe234/Leu235 en la región de gozne de lgG4 a P234A/L235A, reduce al mínimo la unión a FcR, y reduce la capacidad de la inmunoglobulina para mediar la citotoxicidad dependiente del complemento y ADCC. En una modalidad, los anticuerpos de la invención comprenderán un dominio Fe de lgG4 con mutaciones P234A/L235A. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos comprenderán un dominio Fe de lgG4 con mutaciones S108P, P114A y L115A, el dominio Fe teniendo la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 41. Un ejemplo de secuencia de ácido nucleico que codifica para SEQ ID NO: 41 se muestra en SEQ ID NO: 42. En una cadena pesada de lgG4 de longitud completa, las coordenadas de mutación son S228P, P234A y L235A. Moléculas de anticuerpo o fragmentos de anticuerpo completamente humanos, adaptados de humano, humanizados y madurados por afinidad, están dentro del alcance de la invención, así como mimeticuerpos, proteínas de fusión y proteínas quiméricas. Los antagonistas de la invención pueden unir TLR3 con una K menor que o igual a aproximadamente 10~7, 10"8, 10"9, 10"10, 10"11 o 10"12 M. La afinidad de una molécula determinada por un receptor de TLR3, tal como hTLR3, puede determinarse experimentalmente usando cualquier método adecuado. Dichos métodos pueden usar instrumentación Biacore o KinExA, ELISA o pruebas de unión competitiva conocidas por los expertos en la técnica. Moléculas de antagonista que unen un homólogo de TLR3 determinado con una afinidad deseada pueden seleccionarse de colecciones de variantes o fragmentos, por medio de técnicas que incluyen maduración por afinidad del anticuerpo y otras técnicas reconocidas en la materia adecuadas para moléculas diferentes de anticuerpos. Otra modalidad de la invención es un vector que comprende por lo menos un polinucleótido de la invención. Dichos vectores pueden ser vectores de plásmido, vectores virales, vectores basados en transposones, o cualquier otro vector adecuado para la introducción de los polinucleótidos de la invención en una base genética u organismo determinado, por cualquier medio. Otra modalidad de la invención es una célula hospedera que comprende cualquiera de los polinucleótidos de la invención, tai como un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 13, y un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 23. Otros ejemplos de células hospederas comprenden un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende una de SEQ ID NOs: 25, 27, 29, 31 , 45, 47, 49, 51 ó 53, y un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende SEQ ID NOs: 33, 35, 37 ó 39. Dichas células hospederas pueden ser células eucarióticas, células bacterianas, células vegetales o células primitivas. Ejemplos de células eucarióticas pueden originarse de mamíferos, insectos, aves u otros animales. Células eucarióticas de mamífero incluyen líneas de células inmortalizadas tales como hibridomas o líneas de células de mieloma tales como líneas de células de murino SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581 ), NSO (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC No. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) y Ag653 (ATCC CRL-1580). Un ejemplo de línea de células de mieloma humano es U266 (ATTC CRL-TIB-196). Otras líneas de células útiles incluyen las derivadas de células de ovario de hámster chino (CHO), tales como CHO-K1 (ATCC CRL-61) o DG44. Otra modalidad de la invención es un método para obtener un anticuerpo reactivo con TLR3, que comprende cultivar una célula hospedera de la invención, y recuperar el anticuerpo producido por la célula hospedera. Dicho anticuerpo puede ser el anticuerpo antagonista de TLR3 ejemplificado más adelante como anticuerpo monoclonal 1068 que comprende secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada como se muestra en SEQ ID NOs: 6 y 16, respectivamente, o una variante de CDR adaptada de humano del anticuerpo monoclonal 1068 que comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NOs: 25, 27, 29, 31 , 45, 47, 49, 51 ó 53, y secuencias de aminoácidos de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NOs: 33, 35, 37 ó 39. Otra modalidad de la invención es una línea de células de hibridoma que produce un anticuerpo de la invención.

Métodos de tratamiento La presente invención provee métodos de prevención y tratamiento para condiciones en donde es deseable la atenuación de la actividad de TLR3. Condiciones que pueden tratarse o prevenirse con un antagonista de TLR3 incluyen las mediadas por citocinas, y las que resultan completamente o parcialmente de la activación de TLR3 o señalización a través de la vía de TLR3. La invención incluye un método para inhibir la producción celular de RANTES o RANTES junto con IL-6, IL-8 o MIP1-alfa, que comprende poner en contacto un antagonista de TLR3 tal como un anticuerpo aislado descrito en la presente, con una célula que expresa un receptor de TLR3 por un tiempo suficiente para inhibir la producción de estas citocinas. Los métodos de la invención pueden usarse para tratar a un paciente animal que pertenezca a cualquier clasificación. Ejemplos de dichos animales incluyen mamíferos tales como humanos, roedores, perros, gatos y animales de granjas y otras clases de animales tales como aves, reptiles y peces. Sin que se desee que sea limitado por alguna teoría en particular, se cree que el beneficio terapéutico de los antagonistas de TLR3 se deberá a la capacidad de dichos antagonistas para inhibir la secreción de quimiocinas y citocinas proinflamatorias implicadas en algunas condiciones inflamatorias. Se cree también que el beneficio terapéutico de los antagonistas de TLR3 se deberá a la capacidad de dichos antagonistas para incrementar la proliferación celular, y de esta manera promover la reconstrucción de tejidos. Por ejemplo, los métodos de la invención son útiles para tratar o prevenir condiciones inflamatorias, y promover la reconstrucción de tejidos (tal como curación de heridas o quemaduras después de lesión traumática) en un paciente. Además, los métodos de la invención proveen también densidades de células in vitro. Cualquier antagonista de TLR3 podría usarse en los métodos de prevención y tratamiento de la invención. Como ejemplo, cualquiera de los anticuerpos aislados descritos en la presente es útil como un antagonista de TLR3 en el tratamiento o prevención de condiciones inflamatorias o que promueven la reconstrucción de tejidos. En particular, es útil un anticuerpo aislado reactivo con TLR3 que tenga la capacidad de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal que comprende secuencias de aminoácidos de CDR de VH como se muestra en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 13, y secuencias de aminoácidos de CDR de V como se muestra en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 23. Otros anticuerpos útiles comprenden una VH que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NOs: 25, 27, 29, 31 , 45, 47, 49, 51 ó 53, y una V que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NOs: 33, 35, 37 ó 39. Las cantidades de un antagonista de TLR3 determinado suficientes para tratar o prevenir una condición inflamatoria determinada, pueden determinarse fácilmente. En los métodos de la invención, el antagonista de TLR3 puede administrarse individualmente o en combinación con por lo menos alguna otra molécula. Dichas moléculas adicionales pueden ser otras moléculas antagonistas de TLR3, o moléculas con un beneficio terapéutico no mediado por la señalización del receptor de TLR3. Antibióticos, antivirales, paliativos y otros compuestos que reduzcan los niveles o la actividad de citocinas, son ejemplos de dichas moléculas adicionales. En otra modalidad de los métodos para tratar o prevenir condiciones inflamatorias, la actividad de TLR3 es disminuida inhibiendo la expresión génica de TLR3. La expresión génica de TLR3 puede ser inhibida por cualquier medio que disminuya la expresión de la actividad biológica de TLR3, para inhibir la señalización mediada por TLR3. Dichos medios incluyen, por ejemplo, inactivación génica a través de recombinación para inactivar moléculas de ADN genómico (por ejemplo, expresión bloqueada de genes, salteamiento de promotor u otros métodos de mutagénesis génica), e inactivación de transcritos de genes (por ejemplo, moléculas de ARN de silenciamiento o moléculas de ARN antisentido). Los expertos en la técnica reconocerán muchos otros medios para disminuir la expresión de TLR3 activo. De esta manera, un aspecto de la invención es un método para tratar o prevenir una condición inflamatoria, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de TLR3 a un paciente que necesita del mismo, por un tiempo suficiente para tratar o prevenir la condición inflamatoria. Un ejemplo de dichas condiciones inflamatorias, son condiciones asociadas con sepsis. La sepsis es una respuesta sistémica a la infección, que causa falla de órganos y muerte en casos severos. La sepsis se define médicamente como síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) que resulta de una infección viral, bacteriana, micótica o parasitaria. El ARNds liberado por la infección viral, bacteriana, micótica o parasitaria, y por células necróticas, puede contribuir al inicio de la sepsis. Las condiciones asociadas con sepsis pueden incluir SIRS, choque séptico o síndrome de disfunción de órganos múltiples (MODS). Aunque sin que se desee que sea limitado por una teoría en particular, se cree que el tratamiento con antagonistas de TLR3 puede proveer un beneficio terapéutico extendiendo los tiempos de supervivencia en pacientes que sufren de condiciones inflamatorias asociadas con sepsis, o puede prevenir que un evento inflamatorio local (por ejemplo, en el pulmón) se extienda a una condición sistémica, potenciando actividad antimicrobiana innata, demostrando actividad sinergística cuando se combina con agentes antimicrobianos, reduciendo al mínimo el estado inflamatorio local que contribuye a la patología, o cualquier combinación de las anteriores. Dicha intervención puede ser suficiente para permitir tratamiento adicional (por ejemplo, tratamiento de infección subyacente o reducción de los niveles de citocinas) necesario para asegurar la supervivencia del paciente. Otro ejemplo de dichas condiciones inflamatorias, son las enfermedades inflamatorias del intestino. La enfermedad inflamatoria del intestino puede ser enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa. Los expertos en la técnica reconocerán otras enfermedades inflamatorias del intestino de etiología conocida o desconocida que causan inflamación del intestino. Además, los antagonistas de TLR3 serán útiles para el tratamiento o prevención de secuelas extraintestinales asociadas con colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn, tales como artralgias y artritis que incluyen espondilitis anquilosante, sácroilítis y espondiloartritis psoriática. Otras secuelas extraintestinales incluyen lesiones mucocutáneas tales como úlceras orales, eritema nudoso (el desarrollo de nodulos ovoides endurecidos dolorosos) y pioderma gangrenoso caracterizado por una ulceración severa profunda de la piel; complicaciones oftalmológicas tales como episcleritis, iritis y uveítis; enfermedades renales tales como nefrolitiasis; enfermedades hepatobiliares tales como colangitis esclerosante primaria, una enfermedad crónica del hígado caracterizada por inflamación Abrasante asociada con colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn; y enfermedades óseas que incluyen osteoporosis y osteopenia que puede ocurrir como una complicación del uso prolongado de corticosteroides. Incluidos también son disfunción pulmonar inducida por IBD, y trastornos respiratorios que incluyen neumonitis intersticial, estenosis traqueal, bronquiolitis, bronquiolitis obliterante, neumonía organizada, vasculitis pulmonar, sarcoidosis, bronquitis crónica y condiciones clínicas que muestran infiltrados pulmonares con eosinofilia. Otro ejemplo de dichas condiciones inflamatorias, son condiciones asociadas con infección. Las condiciones asociadas con infección pueden incluir neumonía viral o bacteriana, que incluye neumonía severa, fibrosis quística, bronquitis, exacerbaciones de vías respiratorias y síndrome de sufrimiento respiratorio agudo (ARDS). Dichas condiciones asociadas con infección pueden implicar infecciones múltiples tales como una infección viral primaria y una infección bacteriana secundaria. Otro ejemplo de dichas condiciones inflamatorias, es una condición pulmonar inflamatoria. Ejemplos de condiciones pulmonares inflamatorias, incluyen condiciones pulmonares inducidas por infección que incluyen las asociadas con infecciones virales, bacterianas, micóticas, parasitarias o por priones; condiciones pulmonares inducidas por alérgenos; condiciones pulmonares inducidas por contaminantes, tales como asbestosis, silicosis o beriliosis; condiciones pulmonares inducidas por aspiración gástrica; disregulación inmune; condiciones pulmonares inflamatorias genéticamente inducidas, tales como fibrosis quística; y condiciones pulmonares inducidas por trauma físico, tales como lesión por ventilador. Estas condiciones inflamatorias incluyen también asma, enfisema, bronquitis, COPD, sarcoidosis, histiocitosis, linfangiomiomatosis, lesión pulmonar aguda, síndrome de sufrimiento respiratorio agudo, enfermedad pulmonar crónica, displasia broncopulmonar, neumonía adquirida en la comunidad, neumonía nosocomial, neumonía asociada a ventilador, sepsis, neumonía viral, infección por influenza, infección por parainfluenza, infección por metaneumovirus humano, infección por virus sincicial respiratorio e infecciones por Aspergillus u otros hongos. Otro ejemplo de dichas condiciones inflamatorias, son diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia y síndrome metabólico. Los antagonistas de TLR3 son útiles para la inhibición de procesos inflamatorios asociados con obesidad y resistencia a la insulina. La inhibición de la señalización de TLR3 mejoraría el perfil de lípidos de un paciente, a saber, una disminución en los niveles de colesterol total e incremento en la relación HDLc/LDLc. La inhibición de la señalización de TLR3 llevaría también a un incremento en la secreción de insulina, llevando de esta manera a una mejora en la resistencia a la insulina. Los tratamientos comunes para la diabetes tipo 2 se asocian con una variedad de efectos secundarios deletéreos que incluyen hipoglicemia y aumento de peso. Mediante el uso de un antagonista de TLR3 para el tratamiento de la diabetes tipo 2, se espera tener menos efectos secundarios y un perfil farmacocinético sostenido. Además, el tratamiento con un compuesto que tenga una vida media larga en la circulación, tal como un anticuerpo aislado de la invención, requeriría una dosificación poco frecuente. Además, es probable que las mejoras en el perfil de lípidos retarden o prevengan el desarrollo de enfermedades cardiovasculares asociadas con obesidad y diabetes tipo 2, tal como aterosclerosis. Además, la inhibición de la señalización de TLR3 podría llevar al incremento en los niveles de insulina en la circulación, ya sea por medio de efectos directos sobre las células de los islotes pancreáticos, o afectando el perfil de lípidos y protegiendo a los islotes del deterioro inducido por los altos niveles de lípidos. Por lo tanto, es probable que la inhibición de TLR3 sola o en combinación con otras terapias, posponga la introducción del tratamiento con insulina en diabéticos tipo 2, y evite efectos secundarios no deseados asociados con el tratamiento con insulina. Además, los pacientes con infecciones por hepatitis C y VIH, están propensos al desarrollo de resistencia a la insulina y diabetes tipo 2 debido a la acumulación de lípidos en el hígado, o la incapacidad del hígado para responder a la estimulación por la insulina debido a cirrosis o fibrosis que resultan de los agentes de tratamiento. La inhibición de la señalización de TLR3 por un antagonista de TLR3, podría dirigir la infección y la resistencia a la insulina en esta población de pacientes altamente comprometidos. Otras condiciones inflamatorias y neuropatías que pueden prevenirse o tratarse por medio del método de la invención, incluyen esclerosis múltiple, lupus eritematoso por esclerosis y trastornos neurodegenerativos y del sistema nervioso central (SNC), que incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, trastorno bipolar y esclerosis lateral amiotrófica (ALS), enfermedades del hígado que incluyen fibrosis, virus de la hepatitis C (HCV) y virus de la hepatitis B (HBV), artritis, artritis reumatoide, artritis psoriática y artritis reumatoide juvenil (JRA), osteoporosis, osteoartritis, pancreatitis, fibrosis, encefalitis, psoriasis, arteritis de células gigantes, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmune, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), condiciones inflamatorias de la piel, trasplante, cáncer, alergias, enfermedades endocrinas, otros trastornos autoinmunes e hipersensibilidad de vías respiratorias. Otro aspecto de la presente invención es un método para incrementar la velocidad de proliferación de una célula, que comprende disminuir la actividad de TLR3 en la célula, por ejemplo, poniendo en contacto la célula con un antagonista de TLR3. En una modalidad de este aspecto de la invención, la célula puede ser de un tejido tal como epitelio o tejido colónico. Pueden originarse células epiteliales de cualquier tejido epitelial tal como, por ejemplo, epitelio del tracto gastrointestinal, epitelio de la piel, epitelio pulmonar o epitelio broncopulmonar. Las condiciones inflamatorias pueden afectar a cualquier tejido tal como, por ejemplo, tejido cardiaco y tejidos del tracto gastrointestinal que resultan en desviaciones estructurales y funcionales del tejido normal. En algunos casos, dichas condiciones inflamatorias pueden ser el resultado de factores genéticos o infección. En otras situaciones, dichas condiciones inflamatorias pueden ser el resultado de lesiones traumáticas tales como, por ejemplo, quemaduras. Los expertos en la técnica reconocerán muchas condiciones inflamatorias diferentes y las patologías asociadas exhibidas por los diferentes tejidos implicados. Otro aspecto de la invención es un método para tratar una condición que resulta de muerte celular, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de TLR3 a un paciente que necesita del mismo, por un tiempo suficiente para tratar la condición. Otro aspecto de la invención es un método para prevenir una condición que resulta de muerte celular, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de TLR3 a un paciente que necesita del mismo, por un tiempo suficiente para prevenir la condición.

Administración/composiciones farmacéuticas El modo de administración para uso terapéutico de los antagonistas de la invención, puede ser cualquier vía adecuada que suministre el agente al hospedero. Las proteínas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y mimeticuerpos y composiciones farmacéuticas de estos agentes, son particularmente útiles para administración parenteral, es decir, subcutáneamente, intramuscularmente, intradérmicamente, intravenosamente, intranasalmente o por inhalación. Pueden prepararse antagonistas de la invención, como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad efectiva del antagonista como un ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se prefiere una solución o suspensión acuosa que contenga al antagonista, de preferencia regulada en su pH a pH fisiológico, en una forma lista para inyección. Las composiciones para administración parenteral comprenderán comúnmente una solución del antagonista de la invención o un coctel del mismo disuelto en un vehículo farmacéuticamente aceptable, de preferencia un vehículo acuoso. Puede usarse una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina a 0.4%, glicina a 0.3%, y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de materia en partículas. Estas soluciones pueden esterilizarse por medio de técnicas de esterilización bien conocidas convencionales (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes para el ajuste del pH y reguladores de pH, etc. La concentración del antagonista de la invención en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente 0.5%, usualmente a aproximadamente 1 % o por lo menos a esta concentración, hasta tanto como 15% o 20% en peso, y se seleccionará principalmente con base en volumen de fluidos, viscosidades, etc., de acuerdo al modo de administración particular seleccionado. De esta manera, podría prepararse una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular que contenga 1 ml de agua estéril regulada en su pH, y entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 100 mg, por ejemplo, aproximadamente 50 ng a aproximadamente 30 mg o más preferiblemente, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg, de un antagonista de la invención. Asimismo, podría prepararse una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa que contenga aproximadamente 250 ml de solución de Ringer estéril, y aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg, y de preferencia 5 mg a aproximadamente 25 mg de un antagonista de la invención. Métodos reales para preparar composiciones parenteralmente administrables se conocen bien y se describen en más detalle, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Science", decimoquinta edición, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Los antagonistas de la invención, cuando están en una preparación farmacéutica, pueden presentarse en formas de dosis unitaria. La dosis terapéuticamente efectiva adecuada puede ser determinada fácilmente por los expertos en la técnica. Una dosis determinada puede repetirse, si es necesario, a intervalos_ e iempo_adeouados_seleccionados como adecuados por un médico durante el período de tratamiento.

Los antagonistas de la invención pueden liofilizarse para almacenamiento, y pueden reconstituirse en un vehículo adecuado antes de su uso. Se ha mostrado que esta técnica es efectiva con inmunoglobulinas y preparaciones de proteína convencionales, y pueden usarse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica.

Pueden administrarse antagonistas por medio de cualquier técnica que provea dichas moléculas a una célula. Para una célula, la administración de antagonistas in vitro puede ser, por ejemplo, complementando el medio de cultivo con el antagonista. Para una célula, la administración de antagonistas in vivo puede ser, por ejemplo, por inyección intravenosa del antagonista en un animal o tejido. Los expertos en la técnica recocerán otros medios para administrar antagonistas a una célula in vitro o in vivo. Dichos medios incluyen también aquellos modos para el suministro de un agente a un hospedero, que se discutieron anteriormente.

La presente invención se describirá ahora con relación a los siguientes ejemplos no limitativos específicos.

EJEMPLO 1 Identificación de anticuerpos monoclonales de antagonistas anti-hTLR3 Se identificaron anticuerpos-monoclonales-de-antagonistas-anti-hTLR3 capaces de bloquear la señalización a través del receptor hTLR3 por medio de pruebas de selección basadas en células. Se generó un grupo de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales anti-hTLR3 en ratones BALB/C, usando técnicas estándar (Kohler eí al., 1976). Se inmunizó a los ratones con hTLR3 por medio de inyecciones intradérmicas de ADN de plásmido que codifica para los aminoácidos 1 a 703 de hTLR3 (SEQ ID NO: 3). Los aminoácidos 1 a 703 corresponden al dominio extracelular predicho de hTLR3 (SEQ ID NO: 4). Se inyectó inicialmente a los ratones con 10 µg de ADN de plásmido seguido de una segunda inyección de 10 µg de ADN dos semanas después. Se administró una inyección de refuerzo de 15 µg de ADN a cada ratón dos semanas después de la segunda inyección de 10 µg de ADN de plásmido. Tres días antes de la fusión de células B, se inyectó intravenosamente a los ratones con 15 µg de proteína de hTLR3 en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS; fosfato a 10 mM, NaCI a 150 mM, pH 7.4). Los bazos de los ratones inmunizados se cosecharon entonces, y se llevó a cabo la fusión de células B usando métodos estándar (Kohler eí al., 1976). Se seleccionaron hibridomas usando medio que contenía hipoxantina-aminopterina-timidina, y se seleccionaron inicialmente para anticuerpos anti-TLR3 por medio de prueba de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Hibridomas individuales que producen anticuerpos monoclonales anti-hTLR3, fueron clonados por dilución limitativa. Se identificaron hibridomas que producen anticuerpos monoclonales-de-añtagonistas-anti-T R3— por medio de pruebas de-selección basadas en células usando una línea de células epiteliales de pulmón derivadas de A549 de humano que sobreexpresan establemente hTLR3. Se obtuvieron células A549 (ATCC CRL: CCL-185) usadas para la generación de las líneas de células control y de selección para estas pruebas, de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). La línea de células de selección fue una línea de células derivada de A549 nombrada como A549-hTLR3. Las células A549-hTLR3 son transfectadas establemente con un vector de expresión de plásmido de mamífero que codifica para hTLR3 y un gen de resistencia a neomicina. La línea de células derivada de A549 control fue nombrada como A549-neo. Las células A549-neo son transfectadas establemente con el vector de expresión de plásmido de mamífero que codifica para el gen de resistencia a neomicina solo. Estas líneas de células transfectadas establemente se generaron por transfección con Lipofectamine® (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y métodos estándar de selección y clonación. Se cultivaron células A549-hTRL3 y A549-neo bajo condiciones estándar en medio mínimo esencial (MEM) que contenía FBS a 10%, MEM a 1 %, aminoácidos no esenciales (Gibco Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), glutamina a 1 mM, piruvato de sodio a 1 mM, HEPES a 20 mM y 0.5 mg/ml de G418. Las pruebas de selección basadas en células usando células A549-hTLR3, permitieron identificar un anticuerpo monoclonal de antagonistas de hTLR3 designado como anticuerpo monoclonal 1068. El principio que sustenta estas pruebas de selección, fue que la estimulación con poli (l:C) del receptor hTLR3 presente en células A549-hTLR3, resulta en la producción incrementada de citocinas celulares. Los anticuerpos monoclonales de antagonistas de hTLR3 candidatos identificados por medio de las pruebas de selección, inhibirán la señalización mediada por poli (l:C) a través del receptor hTLR3 en células A549-hTLR3, y causarán producción disminuida de citocinas respecto a células A549-hTLR3 control no expuestas a anticuerpos monoclonales.

Se llevaron a cabo pruebas de selección incubando células A549-hTLR3 con un anticuerpo monoclonal de prueba por 30 minutos a 37°C antes de la adición de 5 µg/ml de poli (l:C) (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ); 24 horas después, se midieron los niveles de citocinas en los sobrenadantes del cultivo de células. Se trataron células A549-hTLR3 control idénticamente, aunque estas células no se incubaron con un anticuerpo monoclonal de prueba. Se usaron análisis de canales múltiples Luminex® (Luminex Corp., Austin, TX) y perlas conjugadas con anticuerpo monoclonal específico de IL-6 (interleucina-6), IL-8 (interleucina-8) y RANTES (regulada en la activación, normalmente expresada y secretada por células T), según instrucciones del fabricante, para medir los niveles de producción de citocinas celulares en pruebas de selección. Se identificó el anticuerpo monoclonal 1068 antagonista de la unión a hTLR3, por medio de dichas pruebas. Secuencias de ácido nucleico de cadena ligera y pesada que codifican para las cadenas ligera y pesada del anticuerpo monoclonal 1068, fueron clonadas a partir del hibridoma que expresa al anticuerpo monoclonal 1068 usando métodos estándar. Las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico de la cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo monoclonal 1068 se muestran en las figuras 1 y 2 y en SEQ ID NOs: 6 y 16, respectivamente. Mediante el uso de métodos estándar, se generó una línea de células que comprende las secuencias de ácido nucleico de la cadena ligera y cadena pesada que codifica para el anticuerpo monoclonal recombinante 1068 ( 068).

EJEMPLO 2 Inhibición de lá producción de las citocinas IL-6, IL-8 y RANTES por el antagonista de hTLR3 en células derivadas de pulmón humano Se llevaron a cabo pruebas de citocinas específicas de IL-6, 1L-8 y RANTES incubando células A549-hTLR3 con el anticuerpo monoclonal 1068 o el anticuerpo monoclonal TLR3.7 por 30 minutos a 37°C antes de la adición de 5 µg/ml de poli (l:C) (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ), como se indica en la figura 3, figura 4 y figura 5. Se midieron los niveles de citocinas en los sobrenadantes del cultivo de células 24 horas después usando instrumentación Luminex® (Luminex Corp., Austin, TX) y perlas conjugadas con anticuerpo monoclonal específicas de IL-6, IL-8 o RANTES, según fuese adecuado. Las pruebas con Luminex® para cada citocina se llevaron a cabo según instrucciones del fabricante. Los resultados indican que el anticuerpo monoclonal 1068 antagonista de hTLR3 inhibe la producción de las citocinas IL-6 (figura 3), IL-8 (figura 4) y RANTES (figura 5) mediada por hTLR3 en células A549-hTLR3 derivadas de epitelio pulmonar humano. Sin embargo, el anticuerpo monoclonal TLR3.7 de murino específico de hTLR3 (eBioscience, San Diego, CA), no inhibió la producción de IL-6 (figura 3) e IL-8 (figura 4) inducida por poli (l:C) y mediada por hTLR3, al mismo grado que el anticuerpo monoclonal 1068. Con respecto a la producción de RANTES (figura 5) en estas células derivadas de pulmón humano el anticuerpo monoclonal 1068 inhibió la producción, mientras que el anticuerpo monoclonal TLR3.7 incrementó la producción de RANTES. Estas distinciones entre los anticuerpos monoclonales 1068 y TLR3.7 son importantes, ya que el trabajo previo sugirió que el anticuerpo monoclonal TLR3.7 podría antagonizar al receptor hTLR3 (Matsumoto M. eí al., Biochem. Biophys Res. Commun. 24: 1364-1369 (2002)). Este trabajo previo reportó que el anticuerpo monoclonal TLR3.7 pareció inhibir la producción de IFN-beta inducida por poli (l:C) en células MRC-5 derivadas de fibroblastos humanos (Matsumoto M. eí al., Biochem. Biophys Res. Commun. 24: 1364-1369 (2002)). Los resultados indican claramente aquí que el anticuerpo monoclonal 1068 antagonista de hTLR3 inhibe la producción de un espectro mucho más amplio de citocinas que el anticuerpo monoclonal TLR3.7, y que estos dos anticuerpos monoclonales pueden distinguirse entre sí sobre esta base.

EJEMPLO 3 Inhibición de la producción de las citocinas MIP1-alfa e IL-6 por el antagonista de hTLR3 en células broncoepiteliales humanas primarías El anticuerpo monoclonal 1068 antagonista de hTLR3 inhibe la producción de las citocinas MIP1-alfa (figura 6) e IL-6 (figura 7) mediada por hTLR3 en células broncoepiteliales humanas primarias. Se llevaron a cabo pruebas específicas de las citocinas MIP1-alfa e IL-6, incubando células broncoepiteliales humanas primarias con el anticuerpo monoclonal 1068 o una preparación de IgG de ratón policlonal no específica por 30 minutos a 37°C, antes de la adición de 5 µg/ml de poli (l:C) (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ) como se indica en la figura 6 o en la figura 7. Los niveles de citocinas en los sobrenadantes del cultivo de células se midieron 24 horas después usando instrumentación Luminex® (Luminex Corp., Austin, TX) y perlas conjugadas con anticuerpo monoclonal específico de MIP1-alfa o IL-6, según fuese adecuado. Se llevaron a cabo pruebas con Luminex® para cada citocina, según instrucciones del fabricante. Se aislaron células broncoepiteliales humanas primarias de muestras de tejido humano, y se cultivaron usando métodos estándar.

EJEMPLO 4 El bloqueo de la expresión de la actividad de TLR3, facilita la severidad de los síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino Se disminuyó la severidad de los síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) en un modelo de IBD en murinos, bloqueando la expresión de la actividad del gen del receptor TLR3 (figura 8). Pueden construirse modelos de enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, en animales que han ingerido sulfato sódico de dextrán (DSS) (Hendrickson B. A. eí al., Clin Microbiol Rev. 15: 79-94, 2002). Los síntomas observados en estos modelos animales, incluyen pérdida sustancial de peso (figura 8) y ulceración de células epiteliales. Estos síntomas imitan los síntomas observados en pacientes con IBD, tales como colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn. En este modelo de IBD en murinos, ratones con expresión bloqueada de TLR3 tratados con DSS no perdieron peso sustancial (figura 8), y desarrollaron daño más leve de células epiteliales evaluado por análisis histopatológico respecto a ratones de tipo silvestre tratados con DSS. Estos resultados indicaron que la señalización de TLR3 puede desempeñar una función crucial en procesos inflamatorios tales como los implicados en IBD. En estos experimentos, se les dio a ratones C57BL/6 hembras de tipo silvestre o ratones con expresión bloqueada de TLR3 (Alexopoulou eí al., Nature, 413: 732-738 (2001 )), sulfato sódico de dextrán (DSS) a 5% (p/v) en el agua de beber o agua no complementada a voluntad, como se indica en la figura 8 por 5 días, para inducir colitis ulcerativa aguda. Todos los ratones tenían de 6 a 8 semanas, y cada grupo de tratamiento tuvo por lo menos 5 ratones. El desarrollo de colitis después del tratamiento con DSS se evaluó observando cambios en el peso corporal (figura 8), peso del colon, consistencia de las heces, sangrado rectal e histopatología del colon. Dichas evaluaciones se llevaron a cabo de acuerdo con las normas del Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Los datos de la figura 8 se muestran como por ciento de cambio de peso de los días de tratamiento 1 a 5. Cada símbolo representa datos de un ratón. WT designa ratones de tipo silvestre; KO designa ratones con expresión bloqueada de TLR3. Las barras horizontales indican las medias. Los datos mostrados son una mezcla de tres experimentos independientes. Los ratones con expresión bloqueada de TLR3 y de tipo silvestre control, que no recibieron DSS (figura 8), mostraron cambios similares en peso (P = 0.6, prueba t). Los ratones con expresión bloqueada de TLR3 y de tipo silvestre que recibieron (DSS) (figura 8), mostraron cambios significativamente diferentes en peso (P = 0.003, prueba t). Se cosecharon muestras de colon para análisis histopatológicos de animales en el día 5 del experimento. Las muestras de colon fueron incluidas en parafina, seccionadas y teñidas con hematoxilina y eosina, usando métodos estándar. Secciones de colon representativas de ratones de tipo silvestre que recibieron DSS, exhibieron ulceración de mucosas e infiltrados inflamatorios densos, así como pérdida de células caliciformes y foliculares. Secciones de colon representativas de ratones con expresión bloqueada de TLR3 que recibieron agua no complementada, tuvieron una morfología e histología similar a la observada en muestras de colon de ratones de tipo silvestre que recibieron agua no complementada. Las muestras de colon representativas de ratones con expresión bloqueada de TLR3 que recibieron DSS, incluyeron algunos infiltrados densos de células, pero de otra manera exhibieron epitelio intacto en mucosas y pérdida mínima de células caliciformes. Estos datos histopatológicos indican que los ratones con expresión bloqueada de TLR3 que recibieron DSS desarrollaron menos ulceración epitelial que los ratones de tipo silvestre que recibieron DSS, y revelaron que la actividad de TLR3 puede desempeñar una función crucial en procesos inflamatorios, tales como los implicados en IBD.

EJEMPLO 5 El tratamiento con antagonistas de hTLR3 detiene la pérdida de peso asociada con enfermedad inflamatoria del intestino El tratamiento con antagonistas de hTLR3 disminuye la severidad de la pérdida de peso asociada con enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) en un modelo de IBD en murinos (figura 9). Los datos revelan que el tratamiento con un antagonista de TLR3 puede atenuar síntomas asociados con IBD, tales como colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. Además, este resultado indica además que la señalización de TLR3 puede desempeñar una función importante en condiciones inflamatorias tales como IBD. En estos experimentos, se administró a ratones C57BL/6 hembras de tipo silvestre sulfato sódico de dextrán (DSS) a 5% (p/v) en el agua de beber o agua no complementada a voluntad como se indica en la figura 9 por 5 días, para inducir colitis ulcerativa aguda. Se administraron 0.2 mg de anticuerpo monoclonal 1068 en vehículo de PBS, 0.2 mg de una preparación de anticuerpo policlonal de IgG de ratón no específico en vehículo de PBS, o vehículo de PBS solo, por inyección intraperitoneal, a ratones cada día por los primeros 4 días del tratamiento con DSS como se indica en la figura 9. Cada inyección comprendió 0.9 ml de anticuerpo monoclonal o preparación de IgG no específica en PBS o 0.9 ml de vehículo de PBS solo. Todos los ratones tenían de 6 a 8 semanas, y cada grupo de tratamiento contenía por lo menos 5 ratones. El desarrollo de colitis después del tratamiento con DSS se evaluó observando cambios en peso corporal (figura 9), peso del colon, consistencia de las heces, sangrado rectal e inmunohistopatología del colon. Dichas evaluaciones se llevaron a cabo de acuerdo con normas establecidas para el cuidado y uso de animales. Los datos de la figura 9 se muestran como por ciento de cambio de peso de los días de tratamiento 1 a 4. Cada símbolo representa datos de un ratón. Las barras horizontales indican valores medios. Los datos mostrados son una mezcla de dos experimentos independientes. No hubo diferencia significativa en cambio de peso entre los ratones que recibieron DSS y anticuerpo monoclonal 1068, y los ratones que no recibieron DSS (P>0.05, prueba de Dunn; figura 9). El cambio de peso en ratones que recibieron DSS y anticuerpo monoclonal 1068, fue significativamente diferente del cambio de peso observado en ratones que recibieron DSS e IgG no específica en PBS o PBS sola (P<0.01 para ambos; prueba de Dunn; figura 9).

EJEMPLO 6 Severidad disminuida de colitis crónica en ratones con expresión bloqueada de TLR3 o ratones tratados con antagonistas de hTLR3 Se usaron en todos los estudios ratones C57BL/6 hembras de tipo silvestre de 6 a 8 semanas, y ratones con expresión bloqueada (KO) de TLR3 sobre una base de C57BL/6 (Alexopoulou eí al., Nature 413: 732-738, (2001 )). Se dio a los ratones un total de tres ciclos de sulfato sódico de dextrán (DSS) a 2% (p/v) en el agua de beber (Okayasu eí al., Gastroenterology 98: 694-702 (1990)). Se dio agua con DSS a voluntad por 5 días para inducir colitis ulcerativa, y entonces se dio agua de beber simple por 9 días. Un segundo ciclo de 5 días de DSS a 2% se inició en el día 14, el cual fue seguido por un descanso de 9 días. Un tercer ciclo de DSS a 2%, esta vez por 7 días, se inició en el día 28. Se sacrificó a los ratones en dos puntos de tiempo diferentes: después del segundo período de descanso en el día 25 del estudio, o después del tercer ciclo de DSS en el día 37 del estudio. Cada grupo de tratamiento consistió de por lo menos 8 ratones. El desarrollo de colitis se evaluó observando cambios en el peso corporal a lo largo del estudio, así como evaluando otros parámetros tras el sacrificio, incluyendo longitud del colon, peso del colon, consistencia de las heces, sangrado rectal e histopatología del colon después del tratamiento con DSS. La histopatología fue evaluada por un patólogo veterinario independiente que desconocía el diseño del estudio. Secciones longitudinales del colon fueron calificadas por un panel de cambios, incluyendo necrosis de células epiteliales, ulceración y desprendimiento epitelial, pérdida de folículos, proliferación de células foliculares, formación de tejido de granulación en la lámina propia, tejido de granulación en la submucosa, infiltrado de células inflamatorias en la submucosa, y edema submucoso. Se dieron puntuaciones que reflejaban la extensión de las lesiones, como sigue: 0, no existente; 1 , leve, focal; 2, leve, multifocal; 3, moderada, encontrada con frecuencia pero en áreas limitadas; 4, severa, encontrada con frecuencia en muchas áreas del tejido referido; 5, muy severa, extendiéndose hacia grandes porciones del tejido referido. Se llevaron a cabo análisis estadísticos usando pruebas t de Student (JMP, SAS Institute; GraphPad Prism). Los síntomas en pacientes con colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn, incluyen pérdida de peso, presencia de sangre en las heces y ulceración de la capa epitelial en el colon. De esta manera, los síntomas inducidos en ratones tratados con sulfato sódico de dextrán, imitan parcialmente los síntomas vistos en pacientes con colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn (Hendrickson eí al., Clin. Microbiol. Rev. 15: 79-94 (2002)). Cada ciclo de ingestión de DSS induce pérdida de peso corporal en este modelo, en ratones KO de TLR3 y de tipo silvestre. Sin embargo, los ratones KO de TLR3 experimentaron significativamente menos pérdida de peso que los ratones de tipo silvestre. Los ratones KO de TLR3 mostraron también severidad disminuida de la enfermedad, según se evaluó por medidas generales de inflamación y daño colónico: el acortamiento del colon en los ratones KO de TLR3 fue significativamente menor que el observado en ratones WT, y los ratones KO de TLR3 mostraron una frecuencia mucho menor de sangrado rectal. Las evaluaciones histo pato lógicas del daño de la mucosa colónica fueron consistentes con estas medidas generales. Las puntuaciones medias para necrosis de células individuales, ulceración epitelial, desprendimiento epitelial, abandono de folículos y abscesos de folículos, fueron menores para ratones KO de TLR3 que para ratones WT.

Estos datos, considerados en conjunto, muestran que la ausencia de señalización de TLR3 confiere protección parcial ante la enfermedad en un modelo de colitis crónica en ratones, y sugiere que es probable que la señalización de TLR3 exacerbe la severidad de la enfermedad en IBD en humanos. Para demostrar además una función para TLR3 en la modulación de enfermedad, se trató a ratones C57BL/6 WT con anticuerpo monoclonal 1068 anti-TLR3 antagonista. Grupos de ratones expuestos a DSS recibieron 0.2 mg de anticuerpo monoclonal 1068 anti-TLR3 ya sea profilácticamente (partiendo con el primer ciclo de DSS, "Pr") o "terapéuticamente" (partiendo con el segundo ciclo de DSS, "Th"; figura 35). Grupos control de ratones expuestos a DSS recibieron PBS (control de vehículo) o 0.2 mg de un anticuerpo monoclonal control negativo no específico. A un grupo control adicional no se le dio DSS. Los asteriscos en la figura 35 representan los puntos de tiempo de la dosificación de anticuerpo monoclonal antagonista anti-TLR3. Cada ciclo de ingestión de DSS fue seguido por pérdida de peso en todos los grupos de ratones expuestos a DSS (figura 36). Cada símbolo en la figura 36 representa la media de por lo menos ocho ratones, y las barras de errores representan desviaciones estándar. Se administró DSS a partir de los días 0 a 4, 14 a 18 y 28 a 35. Sin embargo, los grupos tratados con el anticuerpo monoclonal anti-TLR3 mostraron pérdida de peso reducida, y una velocidad más rápida de recuperación de peso después del segundo ciclo de DSS, en comparación con los grupos tratados con PBS o el anticuerpo monoclonal control (figura 37). La pérdida de peso después del tercer ciclo de DSS fue también ampliamente reducida en los grupos tratados con anticuerpo monoclonal anti-TLR3 (figura 38). La pérdida de peso corporal neta media del inicio del estudio (día 0) al final del estudio (día 37), fue de aproximadamente 20% en los ratones expuestos a DSS que recibieron PBS o anticuerpo monoclonal control. El tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-TLR3 redujo significativamente la pérdida de peso hasta aproximadamente 10% (figura 39). En la figura 39, se muestran datos como % de cambio en el peso corporal del inicio del estudio (día 0) al final del estudio (día 37), de modo que los números positivos muestran ganancia neta, y los números negativos muestran pérdida neta. El % de pérdida de peso corporal en grupos tratados con anticuerpo monoclonal anti-TLR3 fue significativamente menor que en grupos tratados con control de vehículo (PBS) o IgG no específica (tratamiento profiláctico con anti-TLR3 (P anti-TLR3) contra PBS, P = 0.006; P anti-TLR3 contra IgG no específica, P = 0.006); tratamiento terapéutico con anti-TLR3 (Th anti-TLR3) contra PBS, P = 0.001 ; Th anti-TLR3 contra IgG no específica, P = 0.009). Cada símbolo representa un ratón; las barras horizontales representan las medias. El tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-TLR3 redujo también el grado de acortamiento del colon. Las longitudes del colon en grupos de ratones tratados con anticuerpo monoclonal anti-TLR3 ya sea profilácticamente o terapéuticamente, fueron significativamente mayores que las de los grupos a los que se les dio vehículo o anticuerpo monoclonal control (figura 40). (P anti-TLR3 contra PBS, P = 0.009; P anti-TLR3 contra IgG no específica, P = 0.01 ; Th anti-TLR3 contra PBS, P = 0.03; Th anti-TLR3 contra IgG no específica, P = 0.04). Además, el daño a la mucosa colónica fue significativamente menos severo en el grupo tratado terapéuticamente con anticuerpo monoclonal anti-TLR3, en comparación con los grupos control a los que se les dieron PBS o anticuerpo monoclonal control no específico, según se evaluó por medio de cambios histopatológicos leves (incluyendo necrosis de células epiteliales, abandono de folículos, ulceración y desprendimiento epitelial, pérdida de folículos y proliferación de células foliculares) y cambios histopatológicos restauradores crónicos (incluyendo formación de tejido de granulación en la lámina propia, tejido de granulación en la submucosa, infiltrado de células inflamatorias submucosas y edema submucoso; figura 41 A). Los datos mostrados en las gráficas representan sumas para todas las puntuaciones histopatológicas, sumas para cambios leves, o sumas para cambios crónicos para cada grupo de ratones que recibieron DSS y diferentes tratamientos (grupos: 1 , tratado con vehículo de PBS; 3, anticuerpo monoclonal anti-TLR3 profiláctico; 4, anticuerpo monoclonal anti-TLR3 terapéutico; 5, anticuerpo monoclonal control no específico). Los círculos en el panel de la derecha de cada gráfica, encierran las medias y las desviaciones estándar de las puntuaciones para cada grupo de tratamiento. Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se representan como círculos con traslape mínimo. En particular, el tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-TLR3 redujo la ulceración epitelial, y previno la formación de tejido de granulación en la submucosa y lámina propia, en comparación con PBS o anticuerpo monoclonal no específico (figura 41 B). Los datos mostrados en las gráficas representan puntuaciones histopatológicas para cada grupo de ratones que recibieron DSS y diferentes tratamientos (grupos: 1 , tratado con vehículo de PBS; 3, anticuerpo monoclonal anti-TLR3 profiláctico; 4, anticuerpo monoclonal anti-TLR3 terapéutico; 5, anticuerpo monoclonal control no específico). Los círculos en el panel de la derecha de cada gráfica encierran las medias y las desviaciones estándar de las puntuaciones para cada grupo de tratamiento. Las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos se representan como círculos con traslape mínimo. Para determinar conceptos correlativos inmunes potenciales de la protección conferida por anti-TLR3, se examinaron poblaciones de células inmunes y niveles de citocinas sistémicos. Se observó que la exposición a DSS se asoció con incrementos en los números de células T activadas en el bazo y nodulos linfáticos mesentéricos (figura 42A-figura 42D), consistentes con reportes publicados que demuestran implicación de células T en este modelo de colitis crónica. Se usó citometría de flujo para medir las frecuencias de células T CD62Lbaja en el bazo y nodulos linfáticos mesentéricos, que representan activación sistémica y regional de células T, respectivamente. La colitis crónica se asoció con frecuencias incrementadas de células T CD4+ activadas (auxiliares) en el bazo y nodulos linfáticos mesentéricos, sugiriendo un incremento general en la activación de células T auxiliares. Frecuencias disminuidas de células T efectoras CD8+ activadas en el bazo, fueron acompañadas por frecuencias incrementadas de células T CD8+ activadas en los nodulos linfáticos mesentéricos, sugiriendo tráfico de células T efectoras hacia el sitio del intestino. Se muestran datos del día 25, después del segundo ciclo de DSS. Cada símbolo representa datos de un ratón; las barras horizontales indican las medias. Además, se encontraron mayores frecuencias de células CD11 b+ en los bazos de ratones expuestos a DSS, reflejando posiblemente un incremento en macrófagos inflamatorios asociado con colitis. Notablemente, el tratamiento profiláctico con anticuerpo monoclonal anti-TLR3 se asoció con frecuencias significativamente reducidas de células CD11 b+ esplénicas, disminuidas hasta niveles vistos en ratones control no expuestos a DSS (figura 43). Los porcentajes de células CD11 b+ en los bazos de ratones tratados con anticuerpo monoclonal anti-TLR3 expuestos a DSS fueron similares a los de ratones que no recibieron DSS, y fueron significativamente menores que los de ratones expuestos a DSS que recibieron PBS (P = 0.001 ) o IgG no específica (P = 0.02). Se muestran datos del día 25, después del segundo ciclo de DSS. Cada símbolo representa datos de un ratón; las barras horizontales indican las medias. Los perfiles de citocinas en suero de ratones expuestos a DSS, muestran también alteraciones asociadas con el tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-TLR3: se midieron niveles incrementados de IL-4 e IL-10 en ratones que recibieron profilácticamente anticuerpo monoclonal anti-TLR3 (figura 44A y figura 44B). El tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-TLR3 durante la inducción de colitis crónica por DSS, intensificó los niveles sistémicos de IL-4 e IL-10. Se muestran datos de los días 25 y 37 que representan puntos de tiempo después del segundo y tercer ciclos de DSS, respectivamente. Cada símbolo representa datos de un ratón; las barras horizontales indican las medias. Se ha demostrado que IL-4 e IL-10 desempeñan funciones clave en la regulación de la inflamación. Una función específica para IL-10 en el control de la inmunopatogénesis en IBD, es sugerida por la observación de que ratones con expresión bloqueada de IL-10 desarrollan espontáneamente colitis. Estos resultados sugieren que el tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-TLR3 altera las respuestas inflamatorias y de células T inducidas por la ingestión de DSS. Considerados en conjunto, estos datos demuestran que el bloqueo de la señalización de TLR3 con anticuerpos monoclonales anti-TLR3 puede mejorar la severidad de la enfermedad en un modelo de colitis crónica, y provee evidencia para la eficacia potencial de anticuerpos monoclonales anti-TLR3 para el tratamiento de IBD en humanos.

EJEMPLO 7 El tratamiento con antagonistas de hTLR3 incrementa la supervivencia a la sepsis Pueden elaborarse modelos de sepsis en animales, tales como ratones, por medio de la administración de D-galactosamina y poli (l:C). En dichos modelos, la D-galactosamina es una hepatotoxina que funciona como un "sensibilizador" de sepsis, y poli (l:C) es una molécula inductora de sepsis que imita al ARNds y activa a TLR3. Los resultados indicaron que el tratamiento con antagonistas de TLR3 puede casi doblar el índice de supervivencia de los animales en un modelo de sepsis en murinos. En estos experimentos, a ratones C57BL/6 hembras de tipo silvestre se les administraron inyecciones intraperitoneales de 1 mg del anticuerpo monoclonal 1068 antagonista de hTLR3 en vehículo de PBS, 1 mg de una preparación de IgG policlonal de murino no específica en vehículo de PBS, o vehículo de PBS solo, como se indica en la figura 10. Cada inyección comprendía 1 ml de anticuerpo monoclonal o preparación de IgG no específica en PBS o 1 ml de vehículo de PBS solo. Al día siguiente, los ratones recibieron 10 µg de poli (l:C) y 20 mg de D-galactosamina (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) en 100 µl de PBS estéril por medio de inyección intraperitoneal como se indica en la figura 10. La supervivencia de los ratones se monitoreó dos veces al día por 3 días. Todas las evaluaciones se llevaron a cabo de acuerdo con normas establecidas para el cuidado y uso de animales. Los resultados muestran que el tratamiento con antagonistas de hTLR3 incrementa el índice de supervivencia de los animales en un modelo de sepsis en murinos (figura 10).

EJEMPLO 8 El tratamiento con antagonistas de hTLR3 disminuye la producción de las citocinas IL-6 y FNT-alfa en un modelo de sepsis en murinos El tratamiento con antagonistas de hTLR3 disminuye los niveles en suero de las citocinas IL-6 (figura 11 ) y FNT-alfa (figura 12) asociadas con inflamación, en un modelo de sepsis en murinos. Este resultado indica que la inhibición de la actividad de TLR3 puede promover la supervivencia a la sepsis disminuyendo la producción de citocinas mediada por TLR3 que contribuye a la sepsis. Se prepararon sueros de ratones tratados como se describió en el ejemplo 6 anterior, por medio de sangrías del seno retro-orbital de ratones anestesiados con C02/02 dos horas después de la administración de poli (l:C). Se prepararon sueros por incubación de sangre a temperatura ambiente, seguida de centrifugación a 2,500 rpm por 15 minutos. Se almacenaron los sueros a -80°C antes de las pruebas de citocinas. Los niveles de citocinas en las muestras de suero se midieron usando instrumentación Luminex® (Luminex Corp., Austin, TX) y perlas conjugadas con anticuerpo monoclonal específico de IL-6 (figura 11) o FNT-alfa (figura 12), según fuese adecuado.

Se llevaron a cabo pruebas con Luminex® para cada citocina, según instrucciones del fabricante. Todas las evaluaciones se llevaron a cabo de acuerdo con normas establecidas para el cuidado y uso de animales. Cada símbolo en la figura 11 y la figura 12 representa datos de un ratón. Las barras horizontales indican las medias. Los datos mostrados son una mezcla de dos experimentos independientes. El tratamiento con anticuerpo monoclonal 1068 redujo significativamente los niveles de IL-6 en suero dos horas después de la administración de poli (l:C) (P = 0.04, prueba t; figura 11 ). El tratamiento con anticuerpo monoclonal 1068 redujo significativamente los niveles de FNT-alfa en suero dos horas después de la administración de poli (l:C) (P = 0.03, prueba t; figura 12).

EJEMPLO 9 La administración de poli (l:C) induce la secreción de citocinas proinflamatorias y la sobrerregulación de la expresión génica de TLR en los pulmones Ratones C57BL/6 machos o hembras de tipo silvestre anestesiados con isoflurano, recibieron tres dosis de poli (l:C) administrado intranasalmente en PBS o PBS solo cada 24 horas por tres días. Todos los ratones tenían doce semanas. Cada dosis de poli (l:C) contenía 50 µg o 100 µg de poli (l:C), como se indica en el cuadro 1. El volumen de cada dosis fue de 50 µl. Cada grupo de tratamiento contenía 6 a 8 ratones. Se sacrificó a los ratones por tratamiento con C02, y los pulmones fueron canulados 24 horas después de la última dosis. Se realizaron entonces lavados broncoalveolares (BAL) inyectando 1 mL de PBS en los pulmones, y recuperando el efluente. Se centrifugaron entonces las preparaciones de BAL para transformar las células a pellas, y los sobrenadantes libres de células se colectaron y almacenaron a -80°C hasta que se usaran para pruebas de citocinas en canales múltiples. Todas las evaluaciones se hicieron de acuerdo con normas establecidas para el cuidado y uso de animales. Los niveles de citocinas en los sobrenadantes de BAL se midieron usando análisis de canales múltiples Luminex® (Luminex Corp., Austin, TX) y perlas conjugadas con anticuerpo monoclonal específico de IFN?, IL-1a, IL-6, CXCL10, JE, KC, MGCSF, MIP1 , RANTES, FNT o GMCSF (LINCO Research, St. Charles, MO), según fuese adecuado. Se llevaron a cabo pruebas con Luminex® para cada citocina, según instrucciones del fabricante. Los datos se expresan como pg medios/ml ± error estándar de la media (SEM) de 6 a 8 ratones. Los resultados indicaron que las administraciones múltiples de 50 ó 100 µg de poli (l:C) indujeron niveles elevados de proteína de cítocinas, quimiocinas y factores de crecimiento, incluyendo interferón-? (IFN?), interleucina-6 (IL-6), factor de necrosis tumoral alfa (FNTa), quimiocina (motivo CXC), ligando 10 (CXCL10), quimiocina (motivo CC), ligando 2 (JE), quimiocina KC (KC), proteína inflamatoria de macrófagos-1a (MIP-1a), regulada en la activación, normalmente expresada y secretada por células T ( RANTES )/CCL5, factor estimulador de colonias de granulocitos de murino (mG-CSF) y factor estimulador de colonias de macrófagos-granulocitos (GMCSF) (cuadro 1 ). Este resultado indica que la activación de TLR3 puede desempeñar una función importante en patologías del pulmón mediadas por citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento, como es el caso de COPD. Además, los análisis de PCR en tiempo real Taqman de los tejidos de pulmón, demostraron que las administraciones múltiples indujeron sobrerregulación de genes de citocinas, así como el ARN mensajero para TLRs múltiples y sus moléculas de señalización intracelular asociadas (cuadro 2). Estos datos demuestran que poli (l:C), un análogo de ARN de doble cadena sintético, administrado in vivo, induce una cascada de eventos que resultan en la secreción de citocinas proinflamatorias múltiples, quimiocinas, y sobrerregulación de la expresión génica de TLR, tales como TLR2, TLR3, TLR7 y TLR9.

CUADRO 1 Las administraciones múltiples de poli (l:C) a los pulmones de ratones C57BL/6, induce la secreción de citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento en las vías respiratorias Los datos se expresan como pg medios/ml ± error estándar de la media (SEM) de 6 a 8 ratones.

EJEMPLO 10 La activación de TLR3 incrementa los niveles de transcritos de genes de citocinas, quimiocinas, factor de crecimiento y de larga distancia en tejido pulmonar Se midieron por medio de PCR en tiempo real (RT-PCR) los niveles de transcritos en ARN total extraído de los pulmones de ratones C57BL/6 machos o hembras tratados como se describió en el ejemplo 8 anterior. Se extrajo ARN total de muestras de tejido pulmonar de ratón usando Trizol™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), y se aisló usando el miniequipo RNEasy (Qiagen Inc., Valencia, CA). Se reunió entonces el ARN de 6 a 8 ratones tratados idénticamente. Se prepararon moléculas de ADNc de cada grupo de ARN usando el equipo Omniscript™ (Qiagen Inc., Valencia, CA), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se amplificaron 100 ng de ADNc usando tarjetas de agrupación para análisis de inmunidad de baja densidad TaqMan™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) o tarjetas de agrupación de baja densidad (LDA) de costumbre, según instrucciones del fabricante. Se usó el software Primer Express™ (Applied Biosystems) para diseñar las combinaciones de sonda e iniciadores. Se llevaron a cabo entonces RT-PCR TaqMan™ (Applied Biosystems) en un formato de 384 cavidades usando instrumentación 7000HT ABI PRISM™ (Applied Biosystems), según instrucciones del fabricante. La colecta de datos y la cuantificación de transcritos en la fase exponencial temprana de la PCR, se llevaron a cabo con instrumentación 7000HT ABI PRISM™ y software asociado. Los niveles de transcritos individuales fueron normalizados contra niveles de transcritos para ARN ribosomal 18S. Los datos del cuadro 2 se expresan como veces incremento medio en los niveles de transcritos de ARN mensajero en ratones que reciben administraciones múltiples de poli (l:C) respecto a ratones tratados con vehículo de PBS. Los datos representan ARN reunido de 6 a 8 ratones. Los datos indican que la activación de TLR3 incrementa la transcripción de genes de citocinas, quimiocinas, factor de crecimiento y de larga distancia (por ejemplo, TLR3 y otros receptores tipo larga distancia) en tejidos pulmonares de murino (cuadro 2). Este resultado indica además que la activación de TLR3 y la activación de otros receptores tipo larga distancia (TLRs), pueden desempeñar una función importante en las patologías del pulmón mediadas por citocinas, quimiocinas y factor de crecimiento.

CUADRO 2 La activación de TLR3 por administraciones múltiples de poli (l:C) a los pulmones de ratones C57BL/6, incrementa los niveles de transcritos de genes de citocinas, quimiocinas, factor de crecimiento y de larga distancia CUADRO 2 (CONTINUACIÓN) Los datos se expresan como veces incremento medio en los niveles de transcritos de ARN mensajero en ratones que reciben administraciones múltiples de poli (l:C) respecto a ratones tratados con vehículo de PBS. Los datos representan ARN reunido de 6 a 8 ratones.

EJEMPLO 11 La activación de TLR3 incrementa los niveles de células inflamatorias en el tejido pulmonar La activación de TLR3 incrementa los niveles de células inflamatorias en tejidos pulmonares de murino (figura 13, figura 14 y figura 15). Este resultado indica que la activación de TLR3 puede desempeñar una ld función importante en patologías del pulmón asociadas con la infiltración incrementada de células inflamatorias en el pulmón (figura 13), tales como neutrófilos (figura 14) y células mononucleares (figura 15) (por ejemplo, monocitos o linfocitos). Se evaluó la infiltración de células inflamatorias en los pulmones 15 de ratones C57BL/6 que recibieron poli (l:C), por enumeración en hemocitómetro (figura 13) o tinción diferencial (figura 14 y figura 15). Los ratones recibieron dosis múltiples de poli (l:C) como se describió en el ejemplo 9 anterior, o una dosis individual de poli (l:C). Se administraron intranasalmente dosis individuales de poli (l:C) a ratones C57BL/6 machos o 20 hembras anestesiados con isoflurano. Todos los ratones tenían entre 8 y 12 semanas. Las dosis individuales comprendieron 50 µg o 100 µg de poli (l:C) en 50 µL de PBS. Se llevó a cabo BAL para recuperar las células infiltrantes en el pulmón 24 horas después de la administración de poli (l:C) para animales que recibieron una dosis individual de poli (l:C), o 24 horas después de la administración final de poli (l:C) para animales que recibieron dosis múltiples. El BAL se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 8 anterior.

Se resuspendieron pellas de células recuperadas después de BAL en pulmones de ratón tratados en 200 µl de solución salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco (DPBS) que contenía BSA a 0.1%. Una alícuota de 50 µL de las células suspendidas se añadió entonces a 50 µL de fluido de dilución de sangre de Turk (Red Bird Service, Osgood, IN), se mezcló completamente, y el número total de células se enumeró por conteo en hemocitómetro (figura 13). Una alícuota de 100 µL de una suspensión que contenía menos de 1 x 105 células/µL, se cargó entonces en un ensamble de portaobjetos Cytospin™, y se centrifugó por 4 minutos a 400 rpm. Se removieron los portaobjetos de los ensambles Cytospin™, y se dejó que se secaran por cuando menos una hora. Los portaobjetos se sumergieron entonces en colorante dé Wrigñ Giérrisa poT90 segundos, y se destiñeron en ddH2O por 5 minutos. Se dejó que los portaobjetos se secaran durante la noche. Bajo inmersión en aceite usando un objetivo de 100x, los portaobjetos se contaron diferencialmente, y se contó el número total de neutrófilos (figura 14) y células mononucleares (figura 15). Se graficaron entonces la media y el SEM para los datos de células infiltrantes en el pulmón colectadas de 6 a 8 ratones de cada grupo de tratamiento (figura 13, figura 14 y figura 15).

EJEMPLO 12 Los animales con expresión bloqueada de TLR3, son protegidos de los incrementos en el nivel de células inflamatorias inducidos por poli (l:C) en tejidos pulmonares Se evaluó la infiltración de células inflamatorias en los pulmones de ratones C57BL/6 o con expresión bloqueada de TLR3, o que recibieron administraciones individuales o múltiples de poli (l:C), por enumeración en hemocitómetro y tinción diferencial, para identificar neutrófilos y células mononucleares. Los ratones recibieron dosis múltiples de poli (l:C) como se describió en el ejemplo 8, o una dosis individual de poli (l:C) como se describió en el ejemplo 10. Se llevó a cabo BAL para recuperar las células infiltrantes en el pulmón 24 horas después de la administración de poli (l:C) para animales que recibieron una dosis individual de poli (l:C), o 24 horas después de la administración final de poli (l:C) para animales que recibieron dosis múltiples. Se llevó a cabo BAL como se describió en el ejemplo 8 anterior. La evaluación de la infiltración de células inflamatorias en los pulmones de ratones C57BL/6 de tipo silvestre o con expresión bloqueada de TLR3, fue por enumeración en hemocitómetro o tinción diferencial como se describió en el ejemplo 10. Los datos se expresaron como veces incremento en el conteo medio de células infiltrantes en el pulmón en animales tratados con poli (l:C) respecto al conteo medio de células infiltrantes en el pulmón en animales que recibieron PBS sola. Los datos representan valores obtenidos de 6 ratones. Los resultados mostrados en el cuadro 3 indican que los ratones con expresión bloqueada de TLR3 son protegidos de los incrementos en el nivel de células inflamatorias inducidos por poli (l:C) en los tejidos pulmonares respecto a ratones de tipo silvestre, y que los efectos de la administración de poli (l:C) se deben principalmente a la activación de TLR3. Además, los resultados indican que la activación de TLR3 puede desempeñar una función importante en patologías del pulmón asociadas con infiltración incrementada de células inflamatorias en el pulmón, tales como neutrófilos y células mononucleares (por ejemplo, monocitos o linfocitos).

CUADRO 3 Los ratones con expresión bloqueada (KO) de TLR3, son protegidos de los incrementos en el nivel de células inflamatorias inducidos por poli (l:C) en los tejidos pulmonares, respecto a ratones de tipo silvestre (WT) Los datos se expresaron como veces incremento en el conteo medio de células infiltrantes en el pulmón en animales tratados con poli (l:C) respecto al conteo medio de células infiltrantes en el pulmón en animales que recibieron PBS sola. Los datos representan valores obtenidos de 6 ratones.

EJEMPLO 13 La activación de TLR3 con poli (l:C) deteriora además la función pulmonar en animales desafiados con metacolina Ratones C57BL/6 machos o hembras de tipo silvestre recibieron una dosis individual de poli (l:C) en PBS o PBS sola (figura 16), o tres dosis administradas intranasalmente de poli (l:C) en PBS o PBS sola cada 24 horas por tres días (figura 17). Poli (l:C) activa a TLR3. Todos los ratones tenían doce semanas. Cada dosis de poli (l:C) contenía 50 µg o 100 µg de poli (l:C), y comprendía un volumen de 50 µL. Cada grupo de tratamiento contenía de 6 a 8 ratones. Se evaluó la función pulmonar usando valores de PenH como un marcador de obstrucción de vías respiratorias y esfuerzo respiratorio 24 horas después de la última dosis de poli (l:C). Se colectaron valores de PenH por medio de pletismógrafo de cuerpo entero (WBP) de ratones desafiados con exposiciones crecientes de metacolina como se indica en la figura 16 o la figura 17. La metacolina incrementa el esfuerzo respiratorio y deteriora la función pulmonar. Se disolvió metacolina en PBS, y se administró como un aerosol nebulizado. Todas las evaluaciones se hicieron de acuerdo con normas establecidas para el cuidado y uso de animales. Los datos de la figura 16 y la figura 17 representan los valores medios de cada grupo de tratamiento de 6 a 8 ratones y el SEM. Los resultados indican que la activación de TLR3 deteriora además la función pulmonar en ratones de tipo silvestre desafiados con metacolina (figura 16 y figura 17). Este resultado sugiere que la activación de TLR3 puede deteriorar además la función pulmonar en individuos que sufren ya de deterioro pulmonar debido a infección, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), u otros trastornos. En consecuencia, las intervenciones terapéuticas que antagonizan la actividad de TLR3 pueden prevenir el deterioro adicional de la función pulmonar en individuos que sufren ya de función pulmonar deteriorada.

EJEMPL0 14 Los animales con expresión blogueada de TLR3 son protegidos del deterioro de la función pulmonar inducido por poli (l:C) durante el desafío con metacolina Se llevó a cabo la administración de dosis individuales (figura 18) y dosis múltiples (figura 19) de poli (l:C) en ratones C57BL/6 hembras de tipo silvestre o ratones con expresión bloqueada de TLR3, como se describió en el ejemplo 12. Se evaluó la función pulmonar usando valores de PenH colectados por WBP como se describió en el ejemplo 12. La administración de metacolina fue también como se describió en el ejemplo 12. Todas las evaluaciones se hicieron de acuerdo con normas establecidas para el cuidado y uso de animales. Los datos de la figura 18 y la figura 19 representan los valores medios de cada grupo de tratamiento de 6 a 8 ratones y el SEM. Los ratones con expresión bloqueada de TLR3 son protegidos del deterioro de la función pulmonar inducido por poli (l:C) durante el desafío con metacolina (figura 18 y figura 19). Este resultado indica que las intervenciones terapéuticas que antagonizan la actividad de TLR3, pueden prevenir el deterioro adicional de la función pulmonar en individuos que sufren ya de función pulmonar deteriorada debido a infección, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) u otros trastornos tales como asma. Además, este resultado indica también que los efectos de la administración de poli (l:C) se deben principalmente a la activación de TLR3.

EJEMPLO 15 Efecto de antagonistas de hTLR3 sobre la producción de citocinas y quimiocinas en células epiteliales bronguiales de pulmón humano La línea de células epiteliales bronquiales de pulmón humano BEAS-2B se obtuvo de la American Type Culture Collection (CRL-9609). Se desarrollaron BEAS-2B en matraces revestidos de colágena I (BD Biosciences) en medio libre de suero LHC-9, y se cosecharon después de un breve lavado en EDTA/tripsina a 0.25%. Las células se lavaron entonces en medio libre de suero LHC-9 (Biosource), y se resuspendieron en medio LHC-9 a 1x106/ml. Las células se sembraron en placas de fondo plano de 96 cavidades revestidas de colágena I a 200 µl/cavidad, y se prepararon cavidades de cultivo por triplicado para cada condición. Después de un período de incubación de 6 horas que permite la unión de las células, el medio se removió y se reemplazó con 200 µl de medio fresco. Se incubaron diez veces diluciones en serie de anticuerpo monoclonal 1068 partiendo a 100 µg/ml por 40 minutos a 37°C, antes de la adición de 125 ng/cavidad del agonista de TLR3 poli (l:C). Los sobrenadantes de cultivo se colectaron 24 horas post- estimulación con poli (l:C), y se llevó a cabo análisis de canales múltiples Luminex® (Luminex Corp., Austin, TX) en muestras para poner a prueba los niveles de expresión de IL-6, IL-8, RANTES, MCP-1 , IP-10, IFN-a, IFN-?, IL-1ß, IL-12, FNT-a, MCP-1 e IL-10. Los resultados indicaron que el anticuerpo monoclonal 1068 antagonista anti-T- R3 - (identificado— en— la— figura— 2-OA-figura- 20E como anticuerpo monoclonal CNTO260), disminuye la producción de IL-6, IL-8, FIANTES, MCP-1 e IP-10 en células BEAS-2B estimuladas con poli (l:C). La expresión de IL-6, IL-8, RANTES, MCP-1 e IP-10 fue disminuida en una forma dependiente de la dosis de anticuerpo monoclonal 1068, como se muestra en la figura 20A-figura 20E. No se detectó expresión de IFN-a, IFN-?, IL-1ß, IL-12, FNT-a, MCP-1 e IL-10 en las muestras.

EJEMPLO 16 El tratamiento con antagonista de hTLR3, incrementa la supervivencia a la neumonía letal En estos experimentos, ratones C57BL/6 hembras de tipo silvestre de 8 a 10 semanas, fueron infectados intranasalmente con 5 unidades formadoras de placa (PFU) de virus de la influenza A/PR 8 en 50 µL de PBS, y entonces fueron infectados intranasalmente siete días después con 50 unidades formadoras de colonias (CFU) de la bacteria S. pneumoniae en 50 µL de PBS. Solas, las dosis viral y bacteriana administradas fueron subletales, pero en conjunto estas dosis fueron letales para la mayoría de los ratones (figura 22). Grupos control de ratones pseudoinfectados recibieron PBS en lugar de virus de la influenza A/PR 8 o S. pneumoniae. Los ratones tratados con antagonista de hTLR3 recibieron 0.6 mg o 0.06 mg en 0.2 ml de PBS administrados por inyección intraperitoneal 2 horas antes de la inoculación de S. pneumoniae en el día 7 (administración profiláctica), y fueron dosificados idénticamente de nuevo en el día 8 (administración terapéutica). Grupos control de ratones pseudotratados recibieron 0.6 mg o 0.06 mg en PBS de una IgG no específica administrada intraperitonealmente. Cada grupo de tratamiento o control contenía 7 ratones. Todas las evaluaciones descritas aquí se llevaron a cabo de acuerdo con normas del IACUC. Se cultivó virus de la influenza A/PR/8 en huevos de pollo, se determinó el título de PFU usando pruebas estándar con células MDCK, y se mantuvieron como existencia viral congelada para inoculaciones. Se desarrollaron durante la noche inóculos de Streptococcus pneumoniae (número de ATCC®: 6301 ™) en placas de agar de soya y tripticasa que contenían sangre de oveja a 5% (TSA/sangre), y las bacterias se removieron entonces de las placas y se suspendieron en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS). El título de CFU bacterianas en la suspensión de PBS, se calculó usando la densidad óptica a 600 nm y métodos estándar. Se prepararon entonces inóculos bacterianos en PBS. Se confirmaron la CFU en los inóculos bacterianos por medio de pruebas formadoras de colonias estándar para determinar el número de bacterias realmente presentes en el inoculo administrado a los ratones. Después de la preparación de los inóculos, se infectó a los ratones intranasalmente con virus de la influenza A PR 8 o S. pneumoniae como se describió anteriormente. Ratones control pseudoinfectados recibieron PBS administrada intranasalmente como se describió anteriormente. Los ratones tratados con antagonistas de hTLR3 recibieron anticuerpo monoclonal 1068 administrado intraperitonealmente, tanto profilácticamente como terapéuticamente, como se describió anteriormente. Ratones control pseudotratados recibieron IgG no específica administrada intraperitonealmente en PBS como se describió anteriormente. Las dosis de virus de la influenza A/PR 8 y S. pneumoniae solas fueron subletales, ya que 100% de los ratones infectados con virus o bacterias solas sobrevivieron (figura 22). Sin embargo, las infecciones viral o bacteriana juntas a estas dosis de otra manera subletales, generaron neumonía letal en la mayoría de los ratones (figura 22). Se sometió a eutanasia a los ratones 48 horas después de la infección bacteriana, se cosecharon los pulmones asépticamente, se homogenizaron en PBS estéril, se prepararon diluciones del homogenizado en PBS, y se pusieron las diluciones en placas de TSA/sangre para determinar la carga bacteriana en los pulmones. Se incubaron entonces las placas hasta que las colonias se hicieron visibles, y se hizo el conteo de CFU. Como se muestra en la figura 23, antes de la infección con una dosis subletal de virus de la influenza, se incrementaron las cargas bacterianas en los pulmones de los ratones 2 días después de la infección con S. pneumoniae. La administración de 0.6 mg o 0.06 mg de anticuerpo monoclonal 1068 anti-TLR3 por ratón en los días 8 y 9, incrementó el índice de supervivencia de los ratones en ratones infectados con virus de la influenza A/PR/8 y S. pneumoniae respecto a ratones control que recibieron una dosis de 0.6 mg o 0.06 mg de un anticuerpo monoclonal control de IgG no específico (figura 21 ). De modo importante, el peso corporal del ratón C57BL/6 hembra promedio está entre 18 g y 20 g; en consecuencia, la escala de dosis del antagonista de TLR3 administrado estuvo entre aproximadamente 3.0 mg/kg y 3.3 mg/kg de peso corporal para ratones que recibieron 0.6 mg de anticuerpo monoclonal 1068, o entre aproximadamente 30 mg/kg y 33 mg/kg de peso corporal para ratones que recibieron 0.06 mg de anticuerpo monoclonal 1068. La figura 21 está marcada para indicar el extremo inferior de esta escala.

EJEMPLO 17 Efecto de la actividad de TLR3 sobre la velocidad de proliferación de células epiteliales colónicas La velocidad de proliferación de células epiteliales colónicas en un modelo en murinos, se incrementó bloqueando la expresión de la actividad del gen del receptor TLR3 (datos mostrados en el cuadro 4). En estos experimentos, a ratones C57BL/6 hembras de tipo silvestre o los ratones con expresión bloqueada de TLR3 descritos anteriormente, se les administraron intraperitonealmente 1 mg de bromodesoxiuridina (BrdU) en 1 ml de PBS, y fueron sacrificados 2 horas después. Todos los ratones tenían de 6 a 8 semanas, y cada grupo de tratamiento tuvo por lo menos 3 ratones. Se cosecharon entonces muestras de colon para análisis histopatológicos. Las muestras de tejido de colon fueron fijadas, cortadas en segmentos, incluidas en parafina, y se prepararon secciones de 5 µm. Las secciones se incubaron secuencialmente con un anticuerpo monoclonal de IgG anti-BrDU de ratón (Becton-Dickinson Biosciences, Inc., San José, CA), un conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRP) y anticuerpo monoclonal de IgG anti-ratón de cabra (Becton-Dickinson Biosciences, Inc., San José, CA), y substrato de diaminobencidina (DAB) (Becton-Dickinson Biosciences, Inc., San José, CA), según las instrucciones del fabricante. Las secciones incubadas fueron contrateñidas con hematoxilina por medio de métodos estándar. Las secciones incubadas se inspeccionaron entonces visualmente, y se hizo el conteo del número de células en los folículos del colon que muestran tinción positiva para la incorporación de BrdU en el ADN. Se contaron las células en 24 folículos consecutivos orientados en la cavidad en una sección del mismo segmento del colon. Se usó la incorporación de BrdU como un marcador sustituto para identificar las células que progresan a través del ciclo celular, es decir, células proliferantes. En el cuadro 4, se expresan los datos de la velocidad de proliferación como el número medio de células teñidas con BrdU por folículo del colon por animal por 2 horas. Estos datos se presentan como la velocidad de proliferación media ± desviación estándar (P<0.0001 , prueba T). Los datos indican que la inactivación de TLR3 incrementa la proliferación colónica de células epiteliales.

CUADRO 4 Velocidades incrementadas de proliferación de células epiteliales colónicas en ratones con expresión bloqueada (KO) de TLR3 EJEMPLO 18 Efecto de la actividad de TLR3 sobre la velocidad de proliferación de células epiteliales colónicas durante la recuperación a la enfermedad inflamatoria del intestino Se incrementó la velocidad de proliferación de células epiteliales colónicas durante la recuperación en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) en murinos, bloqueando la expresión de la actividad del gen del receptor TLR3 (cuadro 5). En estos experimentos, se administró a ratones C57BL/6 hembras de tipo silvestre o los ratones KO de TLR3 descritos anteriormente, sulfato sódico de dextrán (DSS) a 5% (p/v) en el agua de beber por 3 días, para inducir colitis ulcerativa aguda. Se proveyó entonces a los ratones con agua simple hasta el final del experimento 30 horas después. Se inyectó a los ratones con BrdU, como se describió anteriormente, 6 horas después de que comenzaron a recibir el agua simple. Se dejó entonces que los ratones se recuperaran de la colitis ulcerativa inducida por DSS por 24 horas, y fueron sacrificados entonces. Todos los ratones tenían de 6 a 8 semanas, y cada grupo de tratamiento tuvo por lo menos 3 ratones. Muestras de colon para análisis histopatológico de la proliferación de células foliculares colónicas, se prepararon y analizaron como se describió en el ejemplo 15 anterior. Los datos de la velocidad de proliferación se expresan como el número medio de células teñidas con BrdU por folículo del colon por animal por 24 horas. Estos datos se presentan como la velocidad de proliferación media ± desviación estándar (P<0.004, prueba T). Los datos del cuadro 5 indican que la inactivación de TLR3, incrementa la velocidad de proliferación de células epiteliales colónicas durante la recuperación a la enfermedad inflamatoria del intestino.

CUADRO 5 Velocidades incrementadas de proliferación de células epiteliales colónicas durante la recuperación en un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino inducida por DSS en ratones KO de TLR3 EJEMPLO 19 Sensibilidad a la insulina en ratones con expresión blogueada de TLR3 Se proveyó a ratones con expresión bloqueada (KO) de TLR3 (sobre una base de C57BL/6) y a ratones control de tipo silvestre (WT) (C57 BL/6), con una dieta de alto contenido de grasa (dieta de prueba Purina #58126) que consistía de 60.9% de kilocalorías por grasa y 20.8% de kilocalorías por carbohidratos. Ratones WT y KO de TLR3 control, fueron provistos con alimento normal. Se dejó en ayuno a los animales durante la noche, y se llevó a cabo una prueba de tolerancia a la glucosa (GTT), inyectando intraperitonealmente 1.0 mg/g de glucosa, y se obtuvieron lecturas de glucosa en sangre a 0, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos. La figura 31 A y la figura 31 B muestran que los ratones KO de TLR3 bajo una dieta de alto contenido de grasa por 14 y 26 semanas, mostraron mejoras en una prueba de tolerancia a la glucosa cuando se compararon con ratones de tipo silvestre bajo una dieta de alto contenido de grasa. Como era de esperarse, los ratones provistos con alimento normal no exhibieron cambio alguno. Estos resultados mostraron que la señalización de TLR3 podría tener un impacto sobre la sensibilidad a la insulina, y proveer una base para la utilidad de los antagonistas de TLR3 para el tratamiento de la diabetes tipo 2. La figura 32 muestra los niveles de glucosa en sangre en ayuno en ratones bajo una dieta con alimento regular y de alto contenido de grasa. Los animales KO de TLR3 normalizan sus niveles de glucosa en sangre en ayuno, cuando se comparan con ratones de tipo silvestre bajo una dieta de alto contenido de grasa. Estos datos sugieren que la señalización de TLR3 podría interferir con el metabolismo de la glucosa en el hígado, que contribuye a un deterioro en la tolerancia a la glucosa y el desarrollo de resistencia a la insulina. Después, se evaluaron los niveles de insulina en ratones de tipo silvestre y KO de TLR3 provistos con una dieta de alimento normal y de alto contenido de grasa. Se midieron los niveles de insulina en sangre en ratones en ayuno la noche anterior, antes y después del desafío con glucosa. Se cuantificó la insulina usando el equipo de prueba de ELISA ultrasensible Crystal Chem (Downers Grave, IL) (número de catálogo 90060). Los ratones KO de TLR3 provistos con una dieta de alto contenido de grasa mostraron niveles de insulina incrementados a la línea de referencia (sin desafío con glucosa), y 20 y 60 minutos post-desafío con glucosa (figura 33A-figura 33C). En general, los datos obtenidos en la prueba de tolerancia a la glucosa, sugieren que la ausencia de señalización de TLR3 tiene un impacto sobre los niveles de insulina y la sensibilidad a la insulina. A 30 semanas bajo una dieta de alto contenido de grasa, los ratones KO de TLR3 fueron sacrificados, y se determinaron sus perfiles de lípidos en muestras de suero. Se determinaron los niveles de colesterol total, HDL, LDL, triglicéridos y FFA. En resumen, todas las pruebas de lípidos se calibraron haciendo referencia al cambio en absorbancia de las muestras desconocidas al cambio en absorbancia de los estándares usando el suero de referencia GEMCAL (Alfa Wassermann Diagnostic Technologies, LCC, West Caldwell, NJ). Dos niveles de controles se llevaron a cabo cada día antes del reporte de los resultados. Se cargaron las muestras, y se adquirieron datos de lípidos y se expresaron en unidades convencionales de mg/dL. Los niveles de FFA se determinaron usando el equipo NEFA (Wako). Los animales KO de TLR3 mostraron menores niveles en colesterol circulante, LDL y HDL, así como FFA, en comparación con ratones de tipo silvestre bajo la misma dieta.

Estos resultados muestran que la ausencia de señalización de TLR3 tiene una función benéfica para disminuir los niveles de colesterol, mostrando una utilidad para los anticuerpos monoclonales antagonistas de TLR3 para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, así como prevención del desarrollo de complicaciones cardiovasculares asociadas con la diabetes tipo 2. En resumen, los resultados presentados muestran que los ratones KO de TLR3 provistos con una dieta de alto contenido de grasa, fueron protegidos del desarrollo de tolerancia deteriorada a la glucosa como una característica de la resistencia a la insulina en comparación con ratones de tipo silvestre, demostrando que la ausencia de señalización de TLR3 protege a los ratones contra la diabetes tipo 2. Además, los datos muestran que los ratones KO de TLR3 bajo una dieta de alto contenido de grasa tuvieron menores niveles de colesterol total, LDH y colesterol-HDL, así como relación de HDLc/LDLc en comparación con ratones de tipo silvestre bajo una dieta de alto contenido de grasa, indicando de esta manera una función benéfica del antagonista de TLR3 para submodular factores de riesgo asociados con enfermedades cardiovasculares. Estos hallazgos sugieren el uso de inhibidores de TLR3 como un método para tratar diabetes tipo 2, dislipidemia y síndrome metabólico.

EJEMPLO 20 Generación y caracterización de anticuerpos monoclonales anti-TLR3 adaptados de humano Se usó la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal C1068 anti-TLR3 de murino, para consultar una base de datos de anticuerpos humanos compilada de bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. La región variable de la cadena pesada de C1068 (SEQ ID NO: 6) mostró alta homología con cuatro secuencias de línea germinal de la cadena pesada, a saber, VB_1-03/JH1 72, VB_1-02/JH1 71 , VB_1-08/JH1 71 y VB_1-69/JH2 70, de la familia de la cadena pesada VH1 humana. Se sintetizaron cuatro construcciones de ácido nucleico en las cuales las regiones CDR de la cadena pesada de C1068 se transfirieron entonces en las secuencias de cadena pesada de la línea germinal humana seleccionadas, para generar cuatro cadenas pesadas de anticuerpo monoclonal anti-TLR3 adaptado de humano designadas como HV1 , HV4, HV5 y HV7 que tienen las secuencias de aminoácidos de la región variable mostradas en SEQ ID NOs: 25, 27, 29 y 31 , respectivamente. La región variable de la cadena ligera de C1068 (SEQ ID NO: 16) mostró alta homología con cuatro secuencias de línea germinal de la cadena ligera, a saber, VB_012/JK2 78, VB_A30/JK2 77, VB_A20/JK4 76 y VB_L1/JK2 76 de la familia de VK 1 humana. Se sintetizaron cuatro construcciones de ácido nucleico en las cuales las regiones CDR de la cadena ligera de C1068 fueron transferidas entonces en las secuencias de la cadena ligera de la línea germinal humana seleccionadas, para generar cuatro cadenas ligeras de anticuerpo monoclonal anti-TLR3 adaptado de humano designadas como LV1 , LV3, LV5 y LV7 que tienen las secuencias de aminoácidos de la región variable mostradas en SEQ ID NOs: 33, 35, 37 y 39, respectivamente. Dieciséis anticuerpos monoclonales que representan todas las combinaciones posibles de las cuatro construcciones de la región variable de cadena ligera y cuatro construcciones de la región variable de cadena pesada, fueron expresados. Todas las estructuras de la región variable de cadena pesada fueron expresadas con una región constante de cadena pesada de lgG4 humana que tiene una sustitución Ser a Pro en el residuo 108 y sustituciones Phe114 y Leu115 a Ala (SEQ ID NO: 41 ); S228P, F234A y L235A en la cadena pesada de longitud completa. Todas las estructuras de la región variable de cadena ligera fueron expresadas usando una región constante K humana (SEQ ID NO: 4). Los anticuerpos fueron expresados transitoriamente en células de mamífero, por co-transfección de plásmidos adecuados que contenían cadena ligera y pesada. Los anticuerpos fueron purificados usando purificación estándar de proteína A, y dializados en PBS para caracterización. Se evaluaron los 16 anticuerpos monoclonales para unión al dominio extracelular de TLR3 humano (SEQ ID NO: 4) usando un formato de ELISA, en comparación con el anticuerpo monoclonal C1068 precursor de murino. En resumen, el dominio extracelular soluble de TLR3 humano fue revestido en las cavidades de una placa de 96 cavidades, y se incubaron anticuerpos monoclonales candidatos a varias concentraciones (10~3 a 103 ng/ml), y se detectó anticuerpo unido con IgG-HRP anti-ratón de conejo para isotipos de lgG1 de murino (Zymed, South San Francisco, CA) o IgG antihumana marcada con HRP (Jackson 109-036-088) para isotipos de lgG4 humanos. Se determinaron los valores de EC 0, y los resultados se muestran en la figura 24A-figura 24D y el cuadro 6 siguiente.

CUADRO 6 Valores de ECsn calculados para anticuerpos monoclonales combinatorios La EC50 calculada para C1068 fue de 8 ng/ml; los resultados indicaron que 12 de los anticuerpos monoclonales adaptados de humano tuvieron menos de una reducción de 40 veces en la EC50 calculada respecto al anticuerpo monoclonal 1068 precursor de murino. Los anticuerpos monoclonales que tienen los valores de EC50 en el texto en negritas, fueron caracterizados además determinando la afinidad de unión por medio de Biacore, y la actividad de unión en una prueba de liberación de citocinas basada en células. La medición de la afinidad de unión por medio de Biacore, se llevó a cabo por medio de técnicas de captura del anticuerpo monoclonal y de captura de TLR3. Se llevó a cabo el análisis de la captura de anticuerpos monoclonales a 25°C, usando un biosensor Biacore 2000 equipado con un chip CM5 con superficies modificadas con proteína A (6,000 RU) a 25°C, por medio de acoplamiento de amina estándar. El anticuerpo fue diluido a 30 nM, y capturado por 1 minuto sobre diferentes superficies de proteína A. Se inyectó TLR3 a 0, 0.1 , 0.3, 1.0, 3.0 y 9.0 nM, y se monitorearon asociaciones y disociaciones por 5 minutos. Las superficies modificadas de proteína A se regeneraron usando dos pulsos de 6 segundos de ácido fosfórico a 100 mM. Grupos de datos de unión disponibles fueron ajustados a un modelo de interacción 1 :1 (CLAMP™). Se calcularon las constantes de velocidad y su relación (KD= kd/ka) y el error de ajuste llevado sobre la estimación de las constantes de equilibrio aparentes. Se llevó a cabo análisis de captura de TLR3 a 25°C, usando un biosensor Biacore 3000 equipado con un chip CM5 con superficies modificadas con anticuerpo anti-His (R&D Systems) (10,000 RU) a 30°C, por acoplamiento de amina estándar. Se capturó hexa-histidina-TLR3 de humano a una densidad de 80, 120 y 130 RU sobre tres superficies, mientras que se usó una cuarta superficie como referencia. Se inyectó anticuerpo por duplicado a 0, 0.4, 1.1 , 3.3, 10 y 30 nM. Se monitorearon las fases de asociación por 3 minutos, y se monitorearon las disociaciones por 7 minutos.

Se regeneraron las superficies de anticuerpos anti-His, usando dos pulsos de 3 segundos de ácido fosfórico a 50 mM. Grupos de datos de unión disponibles fueron ajustados a un modelo de interacción 1 :1 (BIAeval™) corregido para diferentes derivas de cada perfil de concentración de anticuerpo monoclonal. Se calcularon las constantes de velocidad y su relación (KD= kd/ka), y el error de ajuste llevado sobre la estimación de las constantes de equilibrio aparentes. Los resultados de KD calculados se muestran en el cuadro 8 siguiente. Las dos mediciones representan 1 ) la afinidad de unión con anticuerpo monoclonal anti-TLR3 capturado sobre la superficie del chip con TLR3 de humano aplicado en solución, y 2) TLR3 capturado sobre la superficie del chip y anticuerpo monoclonal anti-TLR3 aplicado en fase en solución. Los resultados indican que todos los candidatos retienen afinidad cuando TLR3 basado en solución es capturado por anticuerpo monoclonal inmovilizado, confirmando que los anticuerpos monoclonales combinatorios han retenido las características de unión de 1068. Cuando TLR3 es inmovilizado sobre el chip, la mayor parte de los candidatos retienen las características de unión hermética, un resultado que es consistente con las curvas de unión de ELISA.

CUADRO 7 Valores de Kp calculados para anticuerpos monoclonales combinatorios La actividad de unión de los anticuerpos monoclonales anti-TLR3 adaptados de humano puestos a prueba por medio de Biacore, se determinó también en una prueba de liberación de citocinas basada en células. La línea de células epiteliales de pulmón humano BEAS-2B se sembró en una placa de 96 cavidades, y se añadió a las células poli (l:C) o poli (l:C) preincubado con un anticuerpo candidato en una matriz libre de suero. Después de 4 días, se removió el medio acondicionado, y se midieron los niveles de citocinas solubles por medio de tecnología Luminex®. Los resultados se muestran en la figura 25, y demuestran que la actividad biológica del anticuerpo monoclonal precursor C1068, es decir, neutralización de la actividad de TLR3 medida por una disminución en la generación de citocinas proinflamatorias por células desafiadas con el ligando de TLR3 poli (l:C), es retenida en los anticuerpos monoclonales adaptados de humano.

EJEMPLO 21 Generación y caracterización de variantes de cadena ligera y pesada de C1068 adaptado de humano El análisis de inmunogenicidad in silico de las CDRs del anticuerpo monoclonal 1068 anti-TLR3 de murino, reveló una serie de agretopos dentro de los límites de la CDR que pudieron manipularse para reducir la puntuación de inmunogenicidad de la secuencia. Una vez que se identificaron las regiones que pudieron manipularse, se aplicaron criterios de secuencia y estructura para decidir qué sustituciones de aminoácido debían usarse. Mediante el uso de estos criterios, se identificaron cuatro sustituciones de aminoácido de punto individual en la región variable de cadena pesada (VH), y se identificaron tres mutaciones (una individual, una doble y una triple) en la región variable de cadena ligera (VK). Las ocho mutaciones se produjeron independientemente en la base de HV1/LV1 , y se enlistan en el cuadro 8. Una vez que se aplicó también otro tipo de sustitución para determinar el efecto del cambio del residuo M102 a una isoleucina, este fue completado para reducir el número general de metioninas en las CDRs, ya que estos residuos pueden ser oxidados post-traducción, una modificación potencialmente perjudicial para la solubilidad de las proteínas. Estos anticuerpos se generaron y se evaluaron para unión a TLR3 (véase cuadros 10 y 11 ) y bioactividad (véase figuras 26-30) como se describió anteriormente.

CUADRO 8 Ubicación e identidad de las mutaciones de punto de la CDR CUADRO 9 ECM calculada para variantes de CDR de Vh en la prueba de unión a TLR3 CUADRO 10 ECgn calculada para variantes de CDR de VK en la prueba de unión a TLR3 Las cinco mutaciones de punto individuales producidas en la Vh de las CDRs de 1068 injertadas en la base de HV1/LV1 fueron bien toleradas, según se indica por la EC50 de unión contra el TLR3 de humano. La EC50 de la base de HV1/LV1 se midió a 29.2 ng/ml; los valores para 134M e Y60G fueron menores que esto, 17 y 14.6 ng/ml, respectivamente. Esto sugiere que estos cambios no sólo reducen la inmunogenicidad in silico de HV1/LV1 , sino mejoran también la unión a TLR3. Las otras tres mutaciones se unen un poco más débiles que HV1/LV1. Ninguna de las mutaciones en la CDR1 de la V1 fue tolerada (EC50 > 1000 mg/ml), sugiriendo que esta región es crucial para cómo 1068 reconoce al TLR3 de humano. Siendo ahora descrita completamente la presente invención, será evidente para los expertos en la técnica que pueden hacerse muchos cambios y modificaciones a la misma sin que se aparten del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un antagonista del receptor 3 tipo larga distancia (TLR3) que inhibe la producción celular de la citocina regulada en la activación, normalmente expresada y secretada por células T (RANTES).

2.- El antagonista de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la producción celular de una citocina seleccionada del grupo que consiste de interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8) y proteína inflamatoria de macrófagos-1 alfa (MIP1-alfa), es también inhibida.

3.- El antagonista de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el antagonista es un anticuerpo.

4.- Un anticuerpo aislado reactivo con TLR3 que tiene la capacidad de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NOs: 9, 11 y 13, y las secuencias de aminoácidos de las CDRs de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23.

5.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende las secuencias de aminoácidos de las CDRs de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NOs: 9, 11 y 13, y las secuencias de aminoácidos de las CDRs de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23.

6.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende una región variable de cadena pesada (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6, y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 16.

7.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 25, 27, 29 ó 31 , y una secuencia de aminoácidos VL como se muestra en SEQ ID NOs: 33, 35, 37 ó 39.

8.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 25, y la V tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33.

9.- Un anticuerpo aislado que tiene una secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH como se muestra en la fórmula (I): Thr Thr Tyr Trp Xaa-i His (I), en donde Xaai es lie o Met (SEQ ID NO: 61 ); una secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH como se muestra en la fórmula (ll): Glu He Asn Pro Asn Asn Gly Arg He Asn Xaa2 Xaa3 Glu Lys Xaa4 Lys Thr (II), en donde Xaa2 es Tyr o Gly, Xaa3 es Asn o Ala y Xaa4 es Phe o Gly (SEQ ID NO: 62); y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH como se muestra en la fórmula (lll): Val Gly Val Xaa5 He Thr Thr Phe Pro Tyr (lll), en donde Xaa5 es Met o He (SEQ ID NO: 63); y CDRs de VL que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23.

10.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque Xaai es Met; Xaa2 es Tyr; Xaa3 es Asn; Xaa4 es Phe; y Xaa5 es Met.

11.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 45, y la V tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33.

12.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque Xaai es He; Xaa2 es Gly; Xaa3 es Asn; Xaa4 es Phe; y Xaa5 es Met.

13.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 47, y la VL tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33.

14.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque Xaai es He; Xaa2 es Tyr; Xaa3 es Ala; Xaa4 es Phe; y Xaa5 es Met.

15.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 49, y la VL tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33.

16.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque Xaai es He; Xaa2 es Tyr; Xaa3 es Asn; Xaa es Gly; y Xaa5 es Met.

17.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 51 , y la V tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33.

18.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque Xaai es He; Xaa2 es Tyr; Xaa3 es Asn; Xaa4 es Phe; y Xaa5 es He.

19.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la VH tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 53, y la V tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33.

20.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la V tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 45, 47, 49, 51 ó 53, y la VL tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 33, 35, 37 ó 39.

21.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el anticuerpo se origina de humano.

22.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el anticuerpo se origina de murino.

23.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el anticuerpo comprende un fragmento Fab.

24.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el anticuerpo comprende un fragmento scFv.

25.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento es adaptado de humano.

26.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento comprende un anticuerpo quimérico.

27.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el anticuerpo es conjugado con polietilenglicol.

28.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento comprende residuos de unión al antígeno de murino y residuos de anticuerpo de humano.

29.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque tiene un isotipo lgG4.

30.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el dominio Fe comprende mutaciones S228P, P234A y L235A.

31.- Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

32.- Un polinucleótido aislado que codifica para una cadena pesada de anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR mostradas en SEQ ID NOs: 9, 11 y 13.

33.- Un polinucleótido aislado que codifica para una cadena ligera de anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR mostradas en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23.

34.- Un polinucleótido aislado que codifica para una cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 6, 25, 27, 29, 31 , 45, 47, 49, 51 ó 53.

35.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NOs: 5, 26, 28, 30, 32, 46, 48, 50, 52 ó 54.

36.- Un polinucleótido aislado que codifica para una cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 16, 33, 35, 37 ó 39.

37.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NOs: 15, 34, 36, 38 ó 40.

38.- Un vector que comprende por lo menos un polinucleótido de conformidad con las reivindicaciones 32, 33, 34, 35, 36 ó 37.

39.- Una célula hospedera que comprende el vector de conformidad con la reivindicación 38.

40.- Un método para obtener un anticuerpo reactivo con TLR3, que comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 39, y recuperar el anticuerpo producido por la célula hospedera.

41.- Una línea de células de hibridoma que produce el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4.

42.- Un método para inhibir la producción celular de RANTES, que comprende poner en contacto el anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 4 con una célula que expresa un receptor TLR3 por un tiempo suficiente para inhibir la producción de RANTES.

43.- El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la producción celular de IL-6, IL-8 o MIP1-alfa es también inhibida.

44.- El uso de un antagonista de TLR3 para la fabricación de un medicamento útil para tratar o prevenir una condición inflamatoria.

45.- El uso como se reclama en la reivindicación 44, en donde la condición inflamatoria es una condición asociada con sepsis.

46.- El uso como se reclama en la reivindicación 44, en donde la condición inflamatoria es una enfermedad inflamatoria del intestino.

47.- El uso como se reclama en la reivindicación 44, en donde la condición inflamatoria es una condición asociada con infección.

48.-. El uso como se reclama en la reivindicación 44, en donde la condición inflamatoria es una condición pulmonar inflamatoria.

49.- El uso como se reclama en la reivindicación 44, en donde la condición inflamatoria es diabetes tipo 2, dislipidemia o síndrome metabólico.

50.- El uso como se reclama en la reivindicación 44, en donde la condición inflamatoria es causada por una enfermedad autoinmune.

51.- Un método para incrementar la velocidad de proliferación de una célula, que comprende poner en contacto un antagonista de TLR3 con una célula que expresa un receptor TLR3 por un fiempo suficiente para incrementar la velocidad de proliferación de la célula.

52.- El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado además porque la célula está presente en el tejido de un animal.

53.- El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque la célula es una célula epitelial.

54.- El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque el tejido es tejido colónico.

55.- El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque el tejido exhibe una patología asociada con una condición inflamatoria.

56.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque la condición inflamatoria es una enfermedad inflamatoria del intestino.

57.- El uso de un antagonista de TLR3 para la fabricación de un medicamento útil para tratar o prevenir una condición que resulta de muerte celular.

58.- El uso como se reclama en la reivindicación 44 ó 57, en donde el antagonista de TLR3 es un anticuerpo aislado reactivo con TLR3 que tiene la capacidad de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias de aminoácidos de las CDRs de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NOs: 9, 11 y 13, y las secuencias de aminoácidos de las CDRs de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23. 5

59.- El uso como se reclama en la reivindicación 58, en donde el anticuerpo aislado reactivo con TLR3 comprende las secuencias de aminoácidos de las CDRs de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NOs: 9, 11 y 13, y las secuencias de aminoácidos de las CDRs de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23. 0

60.- El uso como se reclama en la reivindicación 59, en donde el > anticuerpo aislado comprende una V que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 6, 25, 27, 29 ó 31 , y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 16, 33, 35, 37 ó 39.

61.- El uso como se reclama en la reivindicación 44 ó 57, en 5 donde el antagonista de TLR3 es un anticuerpo aislado reactivo con TLR3 que tiene la capacidad de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal que comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 45, 47, 49, 51 ó 53, y una V que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 33, 35, 37 ó 39. 0

62.- El uso como se reclama en la reivindicación 61 , en donde el anticuerpo aislado comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 45, 47, 49, 51 ó 53, y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 33, 35, 37 ó 39.

63.- El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado además porque el antagonista de TLR3 es un anticuerpo aislado reactivo con TLR3 que tiene la capacidad de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias de aminoácidos de las CDRs de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NOs: 9, 11 y 13, y las secuencias de aminoácidos de las CDRs de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23.

64.- El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado además porque el anticuerpo aislado reactivo con TLR3 comprende las secuencias de aminoácidos de las CDRs de cadena pesada como se muestra en SEQ ID NOs: 9, 11 y 13, y las secuencias de aminoácidos de las CDRs de cadena ligera como se muestra en SEQ ID NOs: 19, 21 y 23.

65.- El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque ei anticuerpo aislado comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 6, 25, 27, 29 ó 31 , y una V que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 16, 33, 35, 37 0 39.

66.- El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque el antagonista de TLR3 es un anticuerpo aislado reactivo con TLR3 que tiene la capacidad de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal que comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 45, 47, 49, 51 ó 53, y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 33, 35, 37 ó 39.

67.- El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado además porque el anticuerpo aislado comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 45, 47, 49, 51 ó 53, y una VL que fiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 33, 35, 37 ó 39.