MX2007005361A - Tratamientos para cancer. - Google Patents

Abstract

Se describen metodos y composiciones para el tratamiento de canceres caracterizados por celulas cancerosas resistentes a la muerte. En general, dichos metodos involucran la administracion de una cantidad efectiva de un compuesto que induce catastrofe mitotica en algunas, y preferiblemente en la mayoria o todas las celulas cancerosas. Tambien se describen metodos para evaluar la eficacia de dichos tratamientos.

Description

TRATAMIENTOS PARA CÁNCER CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere de manera general al tratamiento de cáncer, particularmente cánceres resistentes a apoptosis inducida por fármacos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION 1. Introducción Esta solicitud reclama el beneficio de, y prioridad a, cada una de las siguientes solicitudes de patente provisionales de E.U.A. números de serie 60/625,193, titulada "Tratamientos de Cáncer" y presentada el 5 de Noviembre de 2004; y 60/660,266, titulada "Tratamientos de Cáncer" y presentada el 10 de Marzo de 2005. Cada una de estas solicitudes se incorpora a la presente para referencia en su totalidad, incluyendo figuras, cuadros y reivindicaciones. La siguiente descripción incluye información que puede ser útil para el entendimiento de la presente invención. No es una admisión de que cualquier información sea de la técnica previa, o relevante, para las invenciones reclamadas actualmente, o de que cualquier publicación referenciada específica o implícitamente es técnica previa. 2. Antecedentes El cáncer actualmente es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos y más de 8,000,000 de personas en los Estados Unidos se han diagnosticado con cáncer. En 1995, el cáncer produjo el 23.3% de todas las muertes en los Estados Unidos. Véase Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Centro Nacional de Estadísticas en Salud, Estados Unidos en Salud 1996-97 y Estadísticas de Trauma 117 (1997). El cáncer no está completamente entendido a nivel molecular. Se sabe que la exposición de una célula a un carcinógeno tales como ciertos virus, ciertos químicos, o radiación, conduce a la alteración del ADN que inactiva un gen "supresor" o activa un "oncogén". Los genes supresores son genes reguladores del crecimiento, que al mutarse, no pueden controlar más el crecimiento celular. Los oncogenes son genes normales ¡nicialmente (llamados proto-oncogenes) que al mutarse o alterarse su contexto de expresión se vuelven genes transformados. Los productos de los genes transformados causan crecimiento celular inapropiado. Más de veinte genes celulares normales diferentes pueden volverse oncogenes por alteración genética. Las células transformadas difieren de las células normales en muchas formas, incluyendo morfología celular, interacciones célula a célula, contenido membranal, estructura del citoesqueleto, secreción de proteínas, expresión génica y mortalidad (las células transformadas pueden crecer indefinidamente). Un neoplasma, o tumor, es una proliferación anormal, desregulada y desorganizada del crecimiento celular, y es referida generalmente como cáncer. Una neoplasia es maligna, o cancerosa, si tiene propiedades de crecimiento destructivo, invasividad y metástasis. La invasividad se refiere a la diseminación local de una neoplasia por infiltración o destrucción del tejido circundante, típicamente rompiendo a través de las láminas básales que definen los límites de los tejidos, por lo cual entran frecuentemente al sistema circulatorio del cuerpo. La metástasis típicamente se refiere a la diseminación de las células tumorales por los vasos linfáticos o sanguíneos. La metástasis también se refiere a la migración de células tumorales por la extensión directa a través de cavidades serosas, o subaracnoideas u otros espacios. A través del proceso de metástasis, la migración celular tumoral a otras áreas del cuerpo establece neoplasias en áreas más allá del sitio de aparición inicial. El cáncer actualmente se trata de manera primaria con o una combinación de tres tipos de terapias: cirugía; radiación; y quimioterapia. La cirugía involucra la remoción completa del tejido enfermo. Mientras que la cirugía algunas veces es efectiva en remover tumores ubicados en ciertos sitios, por ejemplo, en la mama, colon y piel, no pude utilizarse en tratamiento de tumores localizados en otras áreas, tal como la médula espinal, ni en el tratamiento de condiciones neoplásicas diseminadas tal como la leucemia. La terapia de radiación involucra la exposición del tejido vivo a radiación ionizante que causa muerte o daño de las células expuestas. Los efectos colaterales de la terapia de radiación pueden ser agudos y temporales, mientras otros pueden ser irreversibles. La quimioterapia involucra la interrupción de la replicación celular o el metabolismo celular. Se utiliza con mayor frecuencia en el tratamiento de cáncer de mama, pulmonar y testicular. Los efectos adversos de la quimioterapia sistémica utilizada en tratamiento de la enfermedad neoplásica son más temidos por los pacientes que experimentan tratamiento de cáncer. De estos efectos adversos, la nausea y el vómito son los más comunes. Otros efectos colaterales adversos incluyen citopenia, infección, caquexia, mucositis en pacientes que reciben altas dosis de quimioterapia con rescate de la médula ósea o terapia de radiación; alopecia, (pérdida de cabello); complicaciones cutáneas tales como pruritis, urticaria y angioedema; complicaciones neurológicas; complicaciones pulmonares y cardiacas; y complicaciones reproductivas y endocrinas. Los efectos colaterales inducidos por la quimioterapia impactan de manera significativa la calidad de vida del paciente y pueden influenciar dramáticamente la conformidad del paciente con el tratamiento. Por ello, se necesitan métodos mejorados de tratamiento. 3. Definiciones Un "agente alquilante" se refiere a un compuesto quimioterapéutico que modifica químicamente el ADN e interrumpe su función. Algunos agentes alquilantes causan formación de entrecruzamientos entre nucleótidos en la misma estructura, o en la estructura complementaria, de una molécula de ADN de estructura de cadena doble, mientras que aún otros causan correspondencia equivocada de pares de bases entre las estructuras de cadena del ADN. Los agentes alquilantes ejemplares incluyen bendamustina, bisulfano, carboplatina, carmustina, cisplatina, clorambucil, ciclofosfamida, dacarbacina, hexametilmelamina, ifosfamida, lomustina, mecloretamina, melfalano, mitotano, mitomicina, pipobromano, procarbacina, estreptozocina, tiotepa y trietilenmelamina. Un "anti-metabolito" se refiere a un agente quimioterapéutico que interfiere con la síntesis de biomoléculas, incluyendo aquellas requeridas para la síntesis de ADN (por ejemplo, nucleósidos y nucleótidos) necesarias para sintetizar ADN. Ejemplos de antimetabolitos incluyen capecitabina, clorodesoxiadenosina, citarabina (y su forma activada, ara-CMP), arabinósido de citosina, dacabacina, floxuridina, fludarabina, 5-fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, 6-mercaptopurina, metotrexato, pentostatina, trimetrexato y 6-tioguanina. Un "anti-mitótico" se refiere a un agente quimioterapéutico que interfiere con la mitosis, típicamente a través de la interrupción de la formación de microtúbulos. Ejemplos de compuestos anti-mitóticos incluyen navelbina, paclitaxel, taxotere, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina. En el contexto de esta invención, un "agente quimioterapéutico" se refiere a un químico con el que se pretende destruir células y tejidos malignos. Los agentes quimioterapéuticos incluyen pequeñas moléculas, ácidos nucleicos (por ejemplo, moléculas anti-sentido, ribozimas, pequeñas moléculas de ARN de interferencia, etc.) y proteínas (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, citocinas, enzimas y hormonas peptídicas) que tienen efectos antitumorales cuando se administran a un paciente a fin de evitar o tratar un cáncer u otra malignidad. Los agentes quimioterapéuticos con frecuencia son clases divididas con base en el mecanismo de acción, por ejemplo, agentes alquilantes, anti-metabolitos, y agentes anti-mitóticos. El término "terapia de combinación" se refiere a un régimen terapéutico que involucra la provisión de por io menos dos terapias distintas para alcanzar un efecto terapéutico indicado. Por ejemplo, una terapia de combinación puede involucrar la administración de dos o más ingredientes activos químicamente distintos, por ejemplo, un agente quimioterapéutico de rápida acción y un agente mieloprotector. Alternativamente, una terapia de combinación puede involucrar la administración de uno o más agentes quimioterapéuticos así también como la entrega de terapia de radiación y/o cirugía u otras técnicas para mejorar la calidad de vida del paciente o para tratar el cáncer. En el contexto de la administración de dos o más ingredientes activos químicamente distintos, se entiende que los ingredientes activos pueden administrarse como parte de la misma composición o como composiciones diferentes. Cuando se administran como composiciones separadas, las composiciones que comprenden los ingredientes activos diferentes pueden administrarse al mismo o diferentes tiempos, por la misma o diferentes rutas, utilizando el mismo o diferentes regímenes de dosificación, todo como el contexto particular lo requiera y como se determine por el médico tratante. De manera similar, cuando uno o más agentes quimioterapéuticos se combinan con, por ejemplo, radiación y/o cirugía, el o los fármacos pueden entregarse antes o después del tratamiento de cirugía o radiación. Un "agente intercalador" se refiere a un agente quimioterapéutico que se inserta el mismo eníre pares de bases adyacentes en una molécula de ADN de doble estructura de cadena, interrumpiendo la estructura del ADN e interfiriendo con la replicación del ADN, la transcripción génica, y/o la unión al ADN de las proteínas de unión a ADN. "Monoterapia" se refiere a un régimen de tratamiento basado en la entrega de un compuesto terapéuticamente efectivo, administrado como una dosis sencilla o como varias dosis en el tiempo. En el contexto de la comercialización de productos farmacéuticos, los términos "promoción",' "promover", "de promoción", y los similares se refieren a cualquiera o todas las actividades de información, persuasivas y científicas conducidas por o en el nombre del fabricante, distribuidor u otra entidad involucrada en el descubrimiento, investigación, desarrollo y/o comercialización del compuesto, composición, o régimen de tratamiento farmacéutico particular pretendido, directa o indirectamente, para inducir la prescripción, suministro, adquisición y/o uso del compuesto, composición o régimen de tratamiento. Tales actividades pueden dirigirse hacia cualquiera en la cadena de suministro y distribución incluyendo, sin limitación, profesionales médicos (por ejemplo, médicos y enfermeras), farmacéuticos, administradores del cuidado de la salud, compañías de seguros o representantes del gobierno, y pacientes (incluyendo pacientes potenciales). En otras palabras, el fin primario de la promoción es estimular la venta o uso de, y/o interés en, un compuesto, composición o régimen de tratamiento farmacéutico particular, y de esta manera cualquier actividad pretendida para servir a este fin constituye la "promoción" del compuesto, composición, o régimen de tratamiento farmacéutico particular. Una composición, proceso, máquina o artículo de fabricación "patentable" de acuerdo con la invención significa que el asunto satisface todos los requerimientos estatutarios de patentabilidad en el tiempo en que se realiza el análisis. Por ejemplo, con respecto a la novedad, la no obviedad o los similares, si la última investigación revela que una o más reivindicaciones abarcan una o más modalidades que podrían negar la novedad, la no obviedad, etc., la o las reivindicaciones, al limitarse por la definición a modalidades "patentables", excluyen específicamente la o las modalidades no patentables. También, las reivindicaciones anexas a ello se interpretarán para proporcionar el alcance razonable más amplio, así también como para preservar su validez. Adicionalmente, si uno o más de los requerimientos estatutarios de patentabilidad se enmienda o si los estándares cambian para valorar si un requerimiento estatutario de la patentabilidad en particular se satisface desde el tiempo en que esta solicitud se presenta o expide como una patente hasta un tiempo en que la validez de una o más de las reivindicaciones anexas se cuestiona, las reivindicaciones se interpretarán de una manera que (1) preserven su validez y (2) proporcionen la interpretación razonable más amplia bajo las circunstancias. El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales que retienen la efectividad y propiedades biológicas de los compuestos de esta invención y que no son indeseables biológicamente o de otra manera. En muchos casos, los compuestos de esta invención son capaces de formar sales acidas y/o básicas en virtud de la presencia de grupos amino y/o carboxilo o grupos similares a los mismos. Las sales de adición acidas farmacéuticamente aceptables pueden prepararse de ácidos inorgánicos y orgánicos, mientras que las sales de adición básicas farmacéuticamente aceptables pueden prepararse de bases inorgánicas y orgánicas. Para una revisión de sales farmacéuticamente aceptables véase Berge, et al. ((1977) J. Pharm. Sci., vol. 66,1). La expresión "sales farmacéuticamente aceptables no tóxicas" se refiere a sales no tóxicas formadas con ácidos inorgánicos u orgánicos o bases inorgánicas u orgánicas farmacéuticamente aceptables no tóxicas. Por ejemplo, las sales incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico y los similares, así también como sales preparadas de ácidos orgánicos tales como ácido acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamoico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, sulfanílico, fumárico, metansulfónico y toluensulfónico y los similares. Las sales también incluyen aquellas de bases inorgánicas, tales como amoniaco, hidroxietilamina e hidracina. Las bases orgánicas adecuadas incluyen metilamina, etilamina, propilamina, dimetilamina, dietilamina, trimetilamina, trietilamina, etilendiamina, hidroxietilamina, morfolma, piperazina y guanidina. Una "pluralidad" significa más de uno. El término "refractario a rituximab" significa tratamiento previo con rituximab, pero inapropiado para tratamiento posterior debido a enfermedad refractaria a la terapia con rituximab, dado como un solo agente o en combinación (definido como no respuesta, o progreso dentro de 6 meses de completar el tratamiento con rituximab), y/o reacción adversa a la terapia con rituximab previa, haciendo injustificado el tratamiento posterior, determinado por el médico o especialista tratante. El término "refractario a anti-CD20 " significa tratamiento previo con un agente que interactúa con el antígeno CD-20, pero inapropiado para tratamiento posterior debido a enfermedad refractaria al agente anti-CD20 dado como un solo agente o en combinación (definido como no respuesta o progreso dentro de 6 meses de completar el tratamiento con anti-CD20), y/o reacción adversa a la terapia con anti-CD20 previa, haciendo injustificado el tratamiento posterior, determinado por el médico o especialista tratante. La "fase S" del ciclo celular se refiere a la fase en la que los cromosomas se replican. El término "especie" se utiliza en la presente en varios contextos, por ejemplo, una especie particular de agente quimioterapéutico. En cada contexto, el término se refiere a una población de moléculas químicamente indistintas de la clase referida en el contexto particular. Un "sujeto" o "paciente" se refiere a un animal en necesidad de tratamiento que puede efectuarse por moléculas de la invención. Los animales que pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen vertebrados, con mamíferos tales como animales bovinos, caninos, equinos, felinos, ovinos, porcinos y primates (incluyendo humanos y primates no humanos) que son ejemplos particularmente preferidos. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un ingrediente activo suficiente para efectuar el tratamiento cuando se administra a un sujeto en necesidad de tal tratamiento. En el contexto de la terapia del cáncer, una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una que produce un cambio medido de manera objetiva en uno o más parámetros asociados con la supervivencia o metabolismo de la célula cancerosa, incluyendo un incremento o disminución en la expresión de uno o mas genes correlacionados con ei cáncer particular, reducción en el peso del tumor, lisis de la célula cancerosa, la detección de uno o más marcadores de muerte de la célula cancerosa en una muestra biológica (por ejemplo, una biopsia y una alícuota de un fluido corporal tales como sangre completa, plasma, suero, orina, etc.), inducción de apoptosis u otras rutas de muerte celular, etc. Por supuesto, la cantidad terapéuticamente efectiva variará dependiendo del sujeto y condición particular que se trata, el peso y edad del sujeto, la severidad de la condición de enfermedad, el compuesto particular elegido, el régimen de dosificación que se seguirá, el tiempo de administración, la manera de administración y los similares, todos los cuales pueden determinarse rápidamente por alguien con experiencia ordinaria en la técnica. Se apreciará que en el contexto de la terapia de combinación, lo que constituye una cantidad terapéuticamente efectiva de un ingrediente activo particular puede diferir de lo que constituye una cantidad terapéuticamente efectiva del ingrediente activo cuando se administra como una monoterapia (es decir, un régimen terapéutico que emplea sólo una entidad química como el ingrediente activo). El término "tratamiento" o "tratar" significa cualquier tratamiento de una enfermedad o trastorno, incluyendo prevenir o proteger contra la enfermedad o trastorno (esto es, causar que los síntomas clínicos no se desarrollen); inhibir la enfermedad o trastorno (es decir, arrestar o suprimir el desarrollo de los síntomas clínicos; y /o aliviar la enfermedad o trastorno (es decir, causar la reversión de los síntomas clínicos). Como se apreciará, no siempre es posible distinguir entre "prevenir" y "suprimir" una enfermedad o trastorno ya que el último evento o eventos inductores pueden ser desconocidos o latentes. En consecuencia, el término "profilaxis" se entenderá como constituyente de un tipo de "tratamiento" que abarca "prevenir" y "suprimir". De esta manera, el término "protección" incluye "profilaxis".

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA iNVENCION Un objeto de esta invención es proporcionar métodos patentables para tratar cánceres caracterizados por células cancerosas resistentes a muerte por la administración de un compuesto (por ejemplo, bendamustina) que induce una catástrofe mitótica en las células cancerosas, sola o en conjunto con otros compuestos y/o tratamientos. En modalidades preferidas, estos métodos involucran determinar si un paciente tiene un cáncer caracterizado por células cancerosas resistentes a muerte, y, si es así, administrar entonces al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de bendamustina. Aún otro objeto de la invención concierne a métodos para valorar la eficacia de los tratamientos de cáncer basados en la detección de un marcador de muerte de célula cancerosa en una muestra biológica tomada de un paciente en uno o más periodos durante o después de la administración de la terapia de cáncer. De esta manera, un aspecto de la invención se relaciona con métodos patentables para tratar a pacientes de cáncer cuyos cánceres se caracterizan por células cancerosas resistentes a muerte, es decir, células cancerosas que resisten la apoptosis u otras rutas de muerte celular programada, así también como células que exhiben resistencia a fármacos múltiples (MDR), que puede inducirse, por ejemplo, por la administración de uno o más agentes alquilantes, solos o en conjunto con un agente anti-CD20, por ejemplo, rituximab. Estos métodos comprenden administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que induce una catástrofe mitótica en las células cancerosas resistentes a muerte. Tales células incluyen aquellas que son resistentes a. apoptosis inducida por fármacos. Ejemplos de tales células ¡ncluyen aquellas que tienen una deficiencia en p53, típicamente como un resultado de una mutación de, incluyendo eliminaciones en o de, un gen que codifica p53. Ejemplos representativos de tales cánceres incluyen linfoma no de Hodgkin ("NHL") y leucemia linfocítica crónica ("CLL"). Un compuesto particularmente preferido para inducir una catástrofe mitótica es ei agente alquilante bendamustina. De esta manera, un aspecto relacionado concierne a métodos de tratamiento que involucran la caracterización de las células de un cáncer particular como células cancerosas resistentes a muerte, seguida por el tratamiento con un compuesto (por ejemplo, bendamustina) que induce una catástrofe mitótica en tales células, sola o en conjunto con otros agentes quimioterapéuticos, adyuvantes, cirugía y/o radiación. Además, la eficacia de tales regímenes de tratamiento puede monitorearse para valorar si el tratamiento de monoterapia o terapia de combinación particular está alcanzando el efecto deseado. Otro aspecto de la invención concierne a ciertos métodos patentables relacionados para tratar un cáncer, particularmente cánceres caracterizados por células cancerosas resistentes a muerte. Estos métodos comprenden la administración a un paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto en un tiempo donde por lo menos una porción de las células que comprenden el cáncer están en la fase S del ciclo celular. En algunas modalidades, por lo menos una porción de las células cancerosas del paciente se conducen en la fase S como un resultado de administrar al paciente un compuesto que conduce a las células en la fase S. La bendamustina es un compuesto particularmente preferido para conducir células cancerosas en la fase S. Ya que la bendamustina es útil en conducir células cancerosas en la fase S, modalidades preferidas adicionales involucran la administración subsecuente de una o más de otras especies de agentes quimioterapéutlcos que son más activos (es decir, ejercen un efecto terapéutico mayor, por ejemplo, citotoxicidad, cuando las células están en la fase S del ciclo celular. En tales métodos, la administración subsecuente de uno o más de otros agentes quimioterapéuticos ocurre de preferencia en por lo menos aproximadamente 10 minutos, y de preferencia en por lo menos aproximadamente de 30 a aproximadamente 60 minutos o más después de la administración de bendamustina, aunque se prefiere que la administración del o los otros agentes ocurra dentro de aproximadamente 72 horas, de preferencia alrededor de 48 horas o menos, después de que se administra la bendamustina. En algunas de estas modalidades preferidas, el o los otros agentes quimioterapéuticos se da o dan dentro de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 36 horas después de la administración de bendamustina, de preferencia dentro de aproximadamente 30 minutos a 24 horas después de la administración de bendamustina, y en algunos casos, dentro de aproximadamente 30 minutos a seis a aproximadamente doce horas después de la administración de bendamustina. Métodos relacionados involucran reducir la toxicidad asociada con una terapia de cáncer. Tales métodos comprenden administrar una pluralidad de dosis de cantidades terapéuticamente efectivas de bendamustina a un paciente con cáncer. La primera dosis puede bien resultar en una toxicidad indeseada. En tal caso, la administración de la segunda (u otras dosis subsecuentes) puede retardarse hasta después de que la toxicidad indeseada comience a descender. En algunos casos, las dosis de bendamustina administradas en tiempos diferentes pueden también variar. Aún otro aspecto de la invención se relaciona de esta manera con métodos patentables para valorar la eficacia de un tratamiento de cáncer con base en la administración de un agente alquilante (por ejemplo, bendamustina), durante el curso de o después de completar el tratamiento, como una monoterapia o una terapia de combinación. Cuando la valoración se realiza después de la administración de un régimen terapéutico que involucra la administración de un agente alqulante (por ejemplo, bendamustina), de preferencia se permite que transcurra un periodo suficiente de manera que el agente alquilante pueda ejercer su efecto terapéutico pretendido o deseado. En tales métodos, un marcador de muerte de la célula cancerosa (es decir, una molécula (por ejemplo, una proteína, carbohidrato, lípido, ácido nucleico u otra molécula) producida por o liberada de una célula cancerosa muriendo o muerta, así también como un fenotipo, tales como una carencia de viabilidad celular, incapacidad de proliferar, senescencia, etc.) que se correlaciona con la eficacia del tratamiento, se detecta en una muestra biológica obtenida del paciente para determinar si el tratamiento fue eficaz. Los marcadores preferidos de muerte celular incluyen niveles de actividad de adenilato cinasa, el nivel de los productos de corte de PARP y viabilidad celular reducida. Dependiendo del marcador, tal detección puede ser cualitativa, semi-cuantitativa, o cuantitativa. La presencia o nivel del marcador detectado indica si el tratamiento es o ha sido eficaz. Aún en otro aspecto de la invención, la invención concierne a tratamientos para cáncer basados en administrar bendamustina a pacientes que tienen un cáncer resistente, o refractario, a uno o más agentes alquilantes y un agente anti-CD20 (por ejemplo, rituximab). De preferencia, estos métodos se despliegan contra cánceres caracterizados por células cancerosas resistentes a muerte. Un aspecto relacionado a la Invención concierne a métodos para hacer negocio en el tratamiento de tales cánceres, que involucran promover el uso de la bendamustina para íratar un cáncer refractario o un cáncer caracterizado por células cancerosas resistentes a muerte, particularmente un cáncer refractario al tratamiento con una combinación de uno o más agentes alquilantes y un agente anti-CD20, por ejemplo, rituximab. Aún otro aspecto concierne a si un cáncer del paciente es sensible al tratamiento con bendamustina. Como se apreciará, cualquier valoración adecuada de la susceptibilidad a bendamustina puede emplearse. En algunas modalidades preferidas de estos métodos, alguna parte o toda una muestra celular de tejido canceroso, tomada de un paciente se expone a bendamustina bajo condiciones de crecimiento que, en la ausencia de un compuesto que es tóxico para las células cancerosas, permite a las células cancerosas proliferar. La valoración de la susceptibilidad se hace entonces con base en los resultados del ensayo. Por ejemplo, la proliferación reducida, cuando se compara con controles, podría indicar que las células, y por lo tanto el cáncer del paciente, son susceptibles a una terapia basada en bendamustina. En contraste, ningún efecto en (o la proliferación aumentada) podría indicar una carencia de susceptibilidad. Aún otro aspecto de la invención se relaciona con el uso de bendamustina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer caracterizado por células cancerosas resistentes a muerte o para el traíamiento de un cáncer refractario, particularmente un cáncer refractario al tratamienío con una combinación de uno o más ageníes alquilantes y un agente anti-CD20 por ejemplo, rituximab. De preferencia, tales medicamentos incluyen una cantidad terapéuticamente efectiva de bendamustina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Esta solicitud de patenle coníiene por lo menos una Figura realizada en color. Copias de esía solicitud de pateníe con el o los dibujos en color se proporcionarán con la pefición y pago de la íarifa necesaria. La Figura 1 íiene dos paneles, A y B, que muesíran cada uno perfiles de expresión génica. Los paneles muesíran cambios en la expresión génica medida en la línea celular de Linfoma No de Hodgkin SU-DHL-1, utilizando un chip génico Affymetrix (U133A) que coníiene más de 12000 genes conocidos. La bendamusíina se probó a IC50 (25µM; línea 1) e IC90 (35µM; línea 2). Clorambucil (5µM; línea 3) y mosíaza de fosforamida, un meíaboliío de la ciclofosfamida (50µM; línea 4), se probaron a IC90. El aislamiento de ARNm se realizó 8 horas después de la exposición. A. El dendograma mostrado representa los primeros 100 genes más modulados cuando se comparan con un control (diluyente, DMSO). El color rojo representa los genes que se sobremodularon; el azul representa los genes que se subregularon. B. El dendograma representa los genes que se inducen de manera concomitanle por los tres fármacos probados. La Figura 2 tiene íres gráficas de barras, 2A, 2B y 2C. Un análisis de PCR-Q se realizó como se describe en la sección de Méíodos, en lo siguieníe, en células SU-DHL-1 expuesías a concentraciones igualmente tóxicas de bendamustina, mostaza de fosforamida y clorambucil. Los niveles de ADNc de entrada se normalizaron utilizando un ensayo para ARN 18s y el nivel de transcritos en la muestra sin tratar se estableció a 1. La Figura 2A muestra los niveles relativos de ARN de dos genes dependientes de p53 representaíivos, p21 y NOXA. La Figura 2B muestra los niveles de ARN de cuatro genes involucrados en el punto de verificación del ciclo celular de la fase M, cinasa 1 tipo polo (PLK-1), las cinasas A y B aurora y ciclina B1. La Figura 2C muestra los niveles de ARN relativos de los genes involucrados en mecanismos de reparación de ADN, EXO1 y Fenl. Las columnas representan la media +/- SE de las veces que cambian a partir de los controles traíados con DMSO. Los resulíados se obfuvieron de íres experimeníos independieníes. La Figura 3 muesíra varias inmunoabsorciones que demuesíran ese efecío apopíóíico aumeníado de la bendamusíina (50µM) cuando se compara con ciclofosfamida (50µM) y clorambucil (4µ.M) en células NHL (SU-DHL-1). Para generar esías inmunoabsorciones, los lisados celulares se prepararon después de 20 horas de exposición como se describe en la sección de Métodos, en lo siguiente. Probar la membrana con ß-actina sirvió como un control de carga y se muestra debajo de las proteínas reguladas. El panel izquierdo superior representa la expresión de p53 forsforilado en Ser15, detecíado uíilizando un aníicuerpo específico para fosforilación. El panel izquierdo medio muesíra la expresión de p53 y p21 íofal. El panel izquierdo inferior représenla la expresión de Bax. Los paneles derechos muesíran la expresión de PARP compleío (superior) y el fragmenío de PARP corlado por caspasa uíilizando un anticuerpo que reconoce el sitio de corte específico de caspasa. La Figura 4 consiste de dos gráficas, A y B que representan análisis funcionales de mecanismos de reparación del ADN seleccionados. La Figura 4A muestra que la bendamustina, pero no la ciclofosfamida, conduce a reparación del daño en el ADN mediante reparación por escisión de base (BER). El papel de la enzima de reparación Ape-1, una endonucleasa apurínica que juega un papel crítico en la ruta de BER en la actividad ciíotóxica de la bendamusíina y un meíaboliío de la ciclofosfamida, la mostaza de fosforamida (PM), se valoraron utilizando el inhibidor de Ape-1 metoxiamina (MX). El desplazamienío izquierdo de la curva observado con bendamusíina y MX muestra que el daño al ADN producido por la bendamustina se repara por BER. La Figura 4B muestra que la inhibición de la acíividad de reparación por MGMT no afecta la citoíoxicidad de la bendamusíina. El papel de la enzima de reparación MGMT (meíiltransferasa de O6-metilguanina ADN) en la acíividad cifoíóxica de la bendamusíina se valoró uíilizando el inhibidor de MGMT O6-bencilguanina (O6-BG). La adición de O6-bencilguanina no cambió de manera significaíiva la IC50 de la bendamusíina, de manera que es improbable que la bendamusíina induzca aducios de ADN O6-alquilguanina. En contrasíe, la O6-bencilguanina sensibilizó de manera siginificaíiva a las células para oirás mostazas de nitrógeno tales como carmustina y mosíaza de fosforamida (PM). La Figura 5 ilustra que la bendamusíina eníra de manera eficieníe en las células íumorales e induce daño al ADN prolongado y extenso, lo que resulta en el inicio de por lo menos tres rutas de señalización: 1) acíivación de la ruta de estrés dependiente de p53 "canónica" que resulla en una fuerte activación de apoptosis intrínseca, mediada probablemente por miembros de la familia de BCL-2 pro-apoptóticos tales como NOXA y Bax; 2) activación de. un mecanismo de reparación del ADN, tal- como la maquinaria de reparación por escisión de base, que no se activa por otros agentes alquilantes frecuentemeníe uíilizados en los pacientes de NHL o CLL; y 3) inhibición de varios puntos de verificación mitóíicos, íales como la cinasas PLK-1 y Aurora A y B. Mieníras no se desee unirse a una teoría particular, la inducción concomitaníe de daño a ADN e inhibición de punios de verificación miíóticos presumiblemente evita que las células tumorales expuestas a la bendamustina reparen eficientemente el daño al ADN antes de experimentar mitosis. De esta manera las células que entran a mitosis con el ADN dañado, o las células que no pueden proceder a apoptosis dependiente de p53 "convencional", morirán por una catásírofe mitóíica. Se cree que esta ruta de muerte celular programada alternativa, junto con la fuerte activación de la apoptosis tradicional, es el porqué de que la bendamustina es muy efectiva en eliminar células cancerosas resistentes a fármaco in vitro, así también como en pacientes que tienen tumores refractarios a quimioterapia. La Figura 6 es un histograma que muestra los resultados de ensayos de adenilato cinasa realizados en el curso de varios de los experimentos de "limpieza" descritos en el Ejemplo 3, en lo siguiente. En estos experimentos, células SU-DHL-1 se traíaron con bendamustina 50µM, mostaza de fosforamida 20µM o clorambucil 2µ.M durante 30, 60 o 90 minutos. Después de la incubación del fármaco temporizada, las células se lavaron en PBS 1X para "limpiar" el ageníe quimiolerapéuíico particular y entonces se agregó medio fresco. Las células se culíivaron entonces durante 48 horas, tiempo después dei cual se realizaron ensayos de adelinato cinasa en los sobrenadaníes celulares. Las barras rosas represenían minutos cero de la incubación con fármaco (o sin fármaco). Las barras verdes representan incubaciones de 30 minutos, las barras naranjas representan incubaciones de 60 minutos y las barras púrpura representan incubaciones de 120 minutos. Los resultados representan el nivel de actividad adelinato cinasa en los sobrenadantes versus los tres fármacos y un control "sin fármaco". La desviación estándar se representa en la parte superior de cada barra en la gráfica. La Figura 7, como la Figura 6, es un hisíograma que muesíra los resulíados de los ensayos de adenilaío cinasa realizados en el curso de varios de los experimentos de "limpieza" descritos en el ejemplo 3, en lo siguiente. La diferencia entre los resultados ilustrados en las Figuras 6 y 7 es que los datos representados en la Figura 6 conciernen a 48 horas de cultivo celular después de que cada uno de los fármacos se "limpió" del cultivo, mientras que los datos en la Figura 7 conciernen a 72 de cultivo celular posflimpieza" del fármaco particular. Como apreciarán aquellos en la técnica, la siguiente descripción describe ciertas modalidades preferidas de la invención en detalle, y de esta manera sólo es representativa y no ilustra el alcance real de la invención. Antes de describir la presente invención en detalle, se entiende que la invención no se limita a las moléculas, sistemas y metodologías particulares descritas, ya que estas pueden variar. También se entenderá que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la invención definido por las reivindicaciones anexas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que el agente alquilante bendamustina ejerce efectos citotóxicos muy rápidos en una serie de tipos celulares cancerosos, incluyendo aquellos refractarios a regímenes quimioterapéulicos convencionales. También se ha descubierío que la bendamusíina ejerce sus efecíos léxicos a través de distiníos modos de acción, cuando se compara con otros fármacos anticancerosos, como se describe en detalle en lo siguiente. La bendamustina, 4-{5-[bis(2-cloroetil)amino]-1-metil-2-benzimidazolil}, es una agente quimioterapéutico de la clase mostaza de nitrógeno. La bendamustina exhibe de manera primaria actividad alquilante, es decir, es un agente que daña el ADN. Cuando se administra a humanos (típicamente por infusión intravenosa de bolo), la bendamustina tiene una vida media sérica corta, del orden de 2 horas. De esta manera, se depura rápidamente del sistema de un paciente. Sorprendentemente, se ha descubierto que, después de la asimilación celular, la bendamustina ejerce rápidamente sus efectos citoíóxicos durables. En efecto, como se reporta en el Ejemplo 3, en lo siguiente, la gran mayoría de los efectos citoíóxicos del compuesío se ejercen al exponer las células cancerosas al ageníe duraníe ían solo aproximadamente 30 minutos. Los protocolos actuales para el traíamiento con bendamuslina típicameníe involucran la enírega de tres infusiones intravenosas de bolo separadas que contiene cada una conteniendo una cantidad equivalente de bendamustina. La segunda infusión se da generalmente un día después de la primera infusión, seguida por la tercera infusión tres semanas después de la primera infusión. Este régimen se ha utilizado debido a las toxicidades relacionadas con el tratamiento con bendamustina, incluyendo mielosupresión. Dada la « corta vida media sérica de la bendamustina y su naturaleza de acción rápida, la toxicidad relacionada con el fármaco puede reducirse al retardar la segunda y las administraciones subsecuentes. En efecto, ya que la lisis tumoral extensa y quizás letal se ha reportado ocasionalmente en conexión con el traíamienlo con bendamustina del linfoma no de Hodgkin, una mayor separación de las múltiples administraciones del fármaco puede servir para reducir la incidencia de lisis íumoral. Además de reducir la íoxicidad ¡ndeseada, la mayor separación de adminisíraciones de bendamustina en un régimen de traiamienlo paríicular lambién servirá para incremeníar la venlana terapéuíica, es decir, el periodo de tiempo en el que el fármaco ejerce su beneficio terapéuíico pretendido. La o las composiciones utilizadas en la práctica de la invención pueden procesarse de acuerdo con méíodos convencionales de lécnicas de síntesis de compuestos farmacéuticos para producir agentes medicínales, (es decir, medicamentos o composiciones terapéuticas) para administración a sujetos, incluyendo humanos y otros mamíferos, es decir, administración "farmacéutica" y "veterinaria", respectivamente. Véase, por ejemplo, la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Típicamente, un compuesto tal como la bendamusíina se combina como una composición con un poríador farmacéuticamente aceptable. La o las composiciones pueden también incluir uno o más de los siguientes: agentes preservadores; agentes solubilizantes; agentes estabilizantes; agentes humidificantes; emulsificantes; endulzantes; colorantes; odorizantes; sales; reguladores de pH; agentes de recubrimiento; y antioxidantes. Los fármacos utilizados en la prácíica de la invención pueden prepararse como ácidos o bases libres, los cuales se combinan eníonces de preferencia con un compuesío adecuado para producir una sal farmacéuticamente aceptable. La expresión "sales farmacéuticameníe aceptables" se refiere a sales no tóxicas formadas con ácidos inorgánicos u orgánicos o bases inorgánicas u orgánicas farmacéuticameníe aceptables no tóxicas. Por ejemplo, las sales incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico y los similares, así también como sales preparadas de ácidos orgánicos tales como ácido acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamoico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicíclico, sulfanílico, fumárico, metansulfónico y toluensulfónico y los similares. Las sales también incluyen aquellas de bases inorgánicas, tales como amoniaco, hidroxietilamina e hidracina. Las bases orgánicas adecuadas incluyen metilamina, etilamina, propilamina, dimetilamina, dietilamina, trimetilamina, trietilamina, etilendiamina, hidroxietilamina, morfolina, piperazina y guanidina. En cualquier caso, las composiciones íerapéuíicas se fabrican de preferencia en la forma de una unidad de dosificación que coníiene una caníidad dada de un ageníe terapéutico deseado (por ejemplo, bendamustina) y un portador (es decir, un excipiente fisiológicamente aceptable). Lo que constiíuya una cantidad terapéuíicamente efecliva de cualquier molécula para un humano u otro mamífero (u otro animal) dependerá de una variedad de factores, incluyendo, entre otros, el tipo de enfermedad o trasíorno, la edad, peso, género, condición médica del sujeto, la severidad de la condición, ia ruta administración y el compuesto particular empleado. De esta manera, los regímenes de dosificación pueden variar ampliamente, pero pueden determinarse de manera rutinaria utilizando métodos estándar. En cualquier caso, una "cantidad efectiva" de agente quimioterapéuíico es una cantidad que provoca el citotóxico deseado. La cantidad de tal molécula quimioterapéuíica requerida para alcanzar el efecto deseado dependerá de numerosas consideraciones, incluyendo la molécula particular misma, la enfermedad o trastorno que se tratará, la capacidad del cáncer del sujeto para responder a la molécula, ruta de administración, etc. Las cantidades precisas de la molécula requeridas para alcanzar el efecto deseado dependerán del juicio del médico y son peculiares para cada sujeto individual. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas pueden variar desde aproximadamente varios nanogramos (ng) hasta aproximadamente varios miligramos (mg) de ingrediente activo por kilogramo de peso corporal por día. La preparación de composiciones terapéuíicas es bien comprendida en la técnica. Típicamente, tales composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, sin embargo, formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido previo a la inyección pueden también prepararse. La preparación también puede emulsificarse. El ingrediente terapéutico activo se mezcla frecuentemente con excipientes que son fisiológicamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua para inyección, solución salina, dexírosa, glicerol, eíanol o los similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede conlener cantidades menores de sustancias auxiliares íales como agentes humidificantes o emulsificantes, antipiréíicos, agentes estabilizaníes, agentes espesantes, agentes de suspensión, anestésicos, preservadores, aníioxidantes, ageníes bacteriostáticos, analgésicos, agentes reguladores del pH, etc. que aumentan la efectividad del ingrediente activo. Tales componentes pueden proporcionar beneficio terapéutico adicional, o actuar hacia la prevención de cualesquiera efectos colaterales potenciales que pueden colocarse como un resultado de la administración de la composición farmacéutica. Las composiciones de la invención pueden administrarse de manera oral, parenteral, por rocío de inhalación, de manera rectal, intranodal, intraíecal o lópicamente en formulaciones de unidad de dosificación que coníienen portadores, adyuvantes y vehículos convencionales. En el contexlo de las composiciones íerapéuticas preíendidas para la adminisíración humana, se utilizan portadores farmacéuticamente aceptables. Los términos "portador farmacéuticamente aceptable" y "portador fisiológicamente aceptable" se refieren a entidades y composiciones moleculares que son fisiológicamente tolerables y típicamenie no producen una reacción alérgica no intencionada o similar adversa, tai como malestar gástrico, mareo y los similares, cuando se administra a un sujeío. Para la adminisíración oral, la composición puede ser cualquier forma adecuada, incluyendo, por ejemplo, una cápsula, íableta, comprimido, pastilla, polvo, suspensión o líquido, entre otros. Los líquidos pueden administrarse por inyección como una composición con portadores adecuados incluyendo solución salina, dextrosa o agua. El término "parenteral" incluye infusión (incluyendo infusión continua o intermitente) e inyección mediante una ruta subcutánea, iníravenosa, intramuscular, intraesíernal o intraperiíoneal. Los suposilorios para la adminisíración recial pueden prepararse al mezclar el o los ingredieníes acíivos con un excipiente no irritaníe adecuado tales como mantequilla de cacao y/o polietilen glicoles que son sólidos a temperaíuras ordinarias pero líquidos a íemperaíuras fisiológicas. Las composiciones pueden íambién prepararse en una forma sólida (incluyendo granulos, polvos o suposiíorios). Las composiciones pueden sujetarse a operaciones farmacéuticas convencionales tales como esterilización y/o pueden coníener adyuvantes convencionales tales como conservadores, estabilizaníes, ageníes humidificantes, emulsificantes, reguladores del pH, etc. Las formas de dosificación sólidas para la administración oral pueden incluir cápsulas, tabletas, pildoras, polvos y granulos. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto acíivo puede mezclarse con por lo menos un excipieníe ineríe tales como sacarosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosificación pueden también comprender sustancias adicionales diferentes a los diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tal como estearaío de magnesio. En el caso de las cápsulas, íableías y pildoras, las formas de dosificación pueden también comprender agentes de regulación de pH. Las tabletas y pildoras pueden prepararse adicionalmente con recubrimientos entéricos. Las formas de dosificación líquida para la administración oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elíxires farmacéuticameníe acepíables que coníienen diluyeníes ineríes comúnmente utilizados en la técnica, tal como agua. Tales composiciones pueden íambién comprender adyuvaníes, tales como agentes humidificantes, endulzantes, saborizantes y agentes proporcionadores de perfume. Las preparaciones inyectables, íales como suspensiones acuosas u oleaginosas inyeclables estériles, pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos utilizando agentes de dispersión o humidificantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable puede también ser una solución o suspensión inyectable estéril en un díluyente o solvenle parenleralmeníe acepíable no tóxico. Los vehículos y solventes adecuados que pueden emplearse son agua para inyección, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónica, entre otras. Además, aceites fijos estériles pueden emplearse como un solveníe o medio de suspensión. Para esíe propósilo, cualquier aceiíe fijo blando puede emplearse, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además los ácidos grasos tal como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables. Para la administración tópica, una dosis tópica adecuada de una composición puede administrarse de una a cuatro, y de preferencia dos o tres veces diariamente. Las dosis pueden íambién adminisírarse con días intermedios durante los cuales no se aplica la dosis. Las composiciones adecuadas para la entrega tópica comprenden frecuentemeníe de 0.001% a 10% p/p de ingredieníe acíivo, por ejemplo de 1% a 2% en peso de la formulación, aunque puede comprende tanto como 10% p/p, pero de preferencia no más de 5% p/p, y con más preferencia de 0.1% a 1% de la formulación. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen preparaciones líquidas o semiiíquidas adecuadas para la penetración a través de la piel (por ejemplo, linimentos, lociones, ungüentos, cremas o pastas) y gotas adecuadas para la administración a los ojos, oídos o nariz. Los métodos ejemplares para administrar las composiciones de la invención (por ejemplo, de manera que se alcancen condiciones estériles o asépticas) serán apare.ntes para el técnico experto.

Ciertos métodos adecuados para tales propósitos se establecen en Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeuíics, 7íh Ed. (1985). La adminisíración al pacieníe puede ser intermitente; 0 a una velocidad gradual, continua, constante o controlada. Las dosis terapéuticamente efectivas típicas para la bendamustina para el traíamienío de linfoma no de Hodgkin pueden ser de aproximadamente 60-120 mg/m2 dada como una sola dosis en dos días consecutivos, o con varios días entre dosis. El ciclo puede repetirse aproximadamente cada tres a cuatro semanas. Para el traíamiento de la leucemia linfocítica crónica (CLL) la bendamustina puede darse a aproximadamente 80-100 mg/m2 en los días 1 y 2. El ciclo puede repetirse después de aproximadamente 4 semanas. Para el íraíamiento de la enfermedad de Hodgkin (etapas ll-IV), la bendamustina puede darse en el "régimen DBVBe" con 25 mg/m2 de daunorubicina en los días 1 y 15, 10 mg/m2 de bleomicina en los días 1 y 15, 1.4 mg/m2 de vincristina en los días 1 y 15 y 50 mg/m2 de bendamustina en los días 1-5 con repetición del ciclo aproximadamente cada 4 semanas. Para el cáncer de mama, la bendamustina (120 mg/m2) en los días 1 y 8 puede darse en combinación con 40 mg/m2 de metotrexato en los días 1 y 8, y 600 mg/m2 de 5-fluorouracilo en los dias 1 y 8 con repetición del ciclo aproximadamente cada 4 semanas. Como una segunda línea de terapia para ei cáncer de mama, la bendamustina puede darse a aproximadamente 100-150 mg/m2 en los días 1 y 2 con repetición del ciclo aproximadamente cada 4 semanas.

Los métodos de la invención involucran monoterapia y terapia de combinación. En el contexto de la terapia de combinación, la invención visualiza la administración de dos o más agentes quimioterapéuticos. Una amplia variedad de agentes quimioterapéuíicos se conocen en la técnica. Algunos de estos componentes ya se han aprobado para su uso en el traíamiento de una o más indicaciones de cáncer. Otros están en varias etapas de desarrollo pre-clínico y clínico. Ejemplos de agentes quimioterapéuíicos úíiles en la prácííca de íerapias de combinación de acuerdo con la invención incluyen los agentes alquilantes busulfano,, carboplatina, carmustina, cisplatina, clorambucil, ciclofosfamida, dacarbacina, hexametilmelamina, ifosfamida, lomustina, mecloretamina, melfalano, mitotano, mitomicina, pipobromano, procarbacina, estreptozocina, tiotepa y trietilenemelamina. Los antí-metabolitos preferidos para su uso en conjunción con la bendamustina incluyen capecitabina, clorodesoxiadenosina, ciíarabina (y su forma acíivada, ara-CMP), arabinósido de ciíosina, dacabacina, floxuridina, fludarabina, 5-fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, 6-mercaptopurina, meloírexalo, pentostatina, trimetrexato y 6-tioguanina. Los compuesíos anti-mitólicos preferidos que pueden utilizarse en terapias de combinación con bendamustina incluyen navelbina, paclitaxel, taxotere, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina.

Otras clases de agentes quimioterapéulicos incluyen inhibidores de la íopoisomerasa I (por ejemplo, campfotecina, irinotecano, topotecano, etc.); inhibidores de la topoisomerasa II tales como daunorubicina, doxorubucina, etopósido, idarubicina, mitoxanírona y tenipósido; inhibidores de la angiogénesis (por ejemplo, dalteparina, suramina, eíc.); aníicuerpos, incluyendo alemíuzumab, bevacizumab, bexaroteno, epratuzumab, gemtuzumab ozogamicina, ibritumomab tiuxetano, mesilalo de imaíinib, ralíiírexed, revlimid, rituximab, trastuzumab; inhibidores de cinasa de tirosina; agentes intercaladores; y hormonas tales como anastrozol, estrógeno, anti-estrógeno (por ejemplo, fulvesírant y tamoxifeno), exemestano, flutamida, goserelina, leuprólido, niluíamida, levimasol, letrozol, prednisona y toremifeno. Otros agentes quimioterapéuíicos incluyen proíeínas íales como angioslaíina, asparaginasa, diniluecina difíiíox, endosíatina, imiquimod, interferón, interleucina-11 y pegaspargasa. Aún otros agentes quimioterapéuíicos incluyen moléculas íales como alitretinoina, alíretamina, amifostina, amsacrina, trióxido de arsénico, bleomicina, capecitabina, carboxiamidoíriazol, celecoxib, dactinomicina, epirubicina, geldanmicina, 17-Alilamino-17-desmetoxigeldanamicina (17 AAG), irinoíecano, 2-meíoxiestradiol, mitramicina, mitomicina C, oxaliplatina, escualamina, temozolamida, talidomida, tretinoin triapína y valrubicina. Como apreciarán aquellos en la técnica, estos y otros agentes quimíoíerapéuticos no conocidos o descubiertos después pueden utilizarse en combinación con la bendamusíina para íraíar varias neoplasias, incluyendo cánceres.

EJEMPLOS Los siguieníes ejemplos se proporcionan para ilusírar cieríos aspecíos de la preseníe invención y para ayudar a aquellos de experiencia en la íécnica en la práctica de la invención. No se considera de ninguna forma que estos ejemplos limitan el alcance de la invención de ninguna manera.

Eiemplo 1 Análisis Molecular del Mecanismo de Acción de Bendamustina A. Introducción La Bendamustina (Treanda™, Salmedix, Inc. CA; Ribomustin™ (Ribosepharm GmbH, Munich Germany)) es un ageníe anti-tumor con actividad pre-clínica y clínica demosírada coníra varios cánceres humanos, íales como Linfomas sin relación a Hodgkln (NHL), leucemias linfocííicas crónicas, fumores sólidos, cánceres pulmonares de mama y de célula pequeña y mielomas múlíiples, incluyendo aquellos resisíentes a agentes que dañan el ADN convencional. La Bendamustina, clorhidraío del ácido 4-{5-[bis(2-cloroeíil)amino3-1-meíil-2-bencimidazolil}buíírico, se siníeíizó originalmeníe con la iníención de producir un agente con baja toxicidad y propiedades de alquiiación y anti-metabolito. Éste tiene tres elementos sub-estrucíurales: un grupo de alquilación de 2-cloroeíilamina; un anillo de bencimidazol; y una cadena laíeral de ácido butírico. El grupo de alquilación de 2-cloroetilamina se comparte con otras mostazas de nitrógeno, lales como ciclofosfamida, clorambucilo y melfalán. El sisíema de anillo central de benzimidazol es una única caracterísiica de bendamusíina, aunque la cadena laíeral de ácido butírico se presenta en clorambucilo. Esta estruclura de múltiples facetas puede contribuir a su único perfil de actividad anti-neoplásico y se disíingue de sus ageníes de alquilación convencionales. Los agenles de alquilación de ADN son extremadamente útiles en el arsenal quimioterapéuíico. Tales fármacos pueden poseer mecanismos inesperados de acción, íales como capacidad de algunos de esíos compuestos para inducir necrosis programada y la capacidad de otros (por ejemplo, platinas) que induce apoptosis incluso en células desprovistas del núcleo. En el caso de las "mostazas de nitrógeno", existen mayores diferencias en su perfil de actividad como se refleja por su uso diferenciado en varias indicaciones; ciclofosfamida, la cual se utiliza principalmente para tratar NHL; clorambucilo, el cual se utiliza para traíar leucemia linfocítica crónica; y melfalán, el cual se utiliza para íratar mieloma múltiple. La acción anti-íumor principal de la bendamustina, en común con otros agentes de alquilación, resulta a partir de la formación de reticulados entre las estrucíuras de cadena complemeníadas de ADN, aunque otros modos de acción pueden también implicarse. De este modo, la acción aníi-tumor de bendamustina puede derivarse de mecanismos los cuales son más complejos que la actividad de alquilación simplemente clásica, ya que los rompimientos de estructura de cadena doble de ADN provocados por bendamustina son notablemeníe más durables que aquellos provocados por ciclofosfamida o BNCU, la bendamustina muestra actividad contra líneas celulares las cuales son resisteníes in vitro y ex vivo a otros agentes de alquilación, y se ha demostrado una única actividad pro-apoptótica por bendamustina como un agente sencillo y en combinación con otros agentes anti-cáncer en varios modelos de tumor in vitro. Estudios moleculares detallados en el mecanismo exacto de acción de la bendamustina siguen siendo escasos. Por esta razón se utilizaron herramienías moleculares de última generación para analizar completamente el mecanismo de acción de la bendamustina. Este ejemplo presenta resultados derivados de ensayos farmacogenómicos para analizar los cambios del perfil de expresión genéíica inducidos por bendamusíina en líneas celulares de NHL. Esíos análisis farmacogenómicos fueron validados por ensayos funcionales tratando con el inicio de señalización apoptótica, el mecanismo de reparación de ADN, y la modulación de puntos de control mitóíicos. Finalmente, la bendamustina se ha perfilado en el tamiz in vitro de 60 líneas celulares de tumor humano del Instituto Nacional de Cáncer, y se estudió su actividad comparativa contra una biblioteca de otros agentes de alquílación (por ejemplo, clorambucilo y mostaza de fosforamida (el metaboliio de ciclofosfamida)). Se generaron íambién resulíados uíilizando ensayo farmacogenómico para analizar los cambios de perfil de expresión genética inducidos por bendamustina en líneas celulares NHL. Estos análisis farmacogenómicos se validaron por ensayos Q-PCR y funcionales que traían con el inicio de señalización apoptótica, mecanismos de reparación de ADN, y la modulación de puntos recontrol mitóíicos. Junios, esíos resultados demuestran que la bendamusíina posee múlíiples mecanismos de acción que son distintos de otros fármacos de alquilación de ADN, explicando la actividad de bendamustina en pacientes que tienen íumores resisíentes a íerapia convencional.

B. Materiales y Métodos a. Células Se obtuvieron células SU-DHL-1 de la Universidad de San Diego California. Se cultivaron células en RMPI 1650 (Hyclone) suplementadas con 10% de FBS (Invitrogen) y 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina. b. Reactivos Se obiuvo clorhidrato de bendamustina de Fujisawa Deutschland (Munich, Alemania). La sal de ciclohexilamina de mosíaza de fosforamida (PM, NSC69945), un metaboliío activo de ciclofosfamida, se obtuvo de depósito sintéíico del Programa de Terapias en Desarrollo (DTP) en el Instituío Nacional de cáncer (NCl). Oíros reacíivos se obíuvieron a paríir de fueníes comerciales íales como Sigma-Aldrich. c. Tratamientos Farmacológicos Para la mayoría de los ensayos preseníados en este ejemplo, las concentraciones utilizadas para bendamustina, mostaza de fosforamida (el metabolito activo de ciclofosfamida), y clorambucilo se seleccionaron con base en su actividad citotóxica medida con el ensayo MTT durante el periodo de tres días. Los fármacos se prepararon en DMSO y luego se diluyeron en un medio de cultivo. d. Preparación de Muestras de ARN y Análisis de Datos de Expresión Se cosecharon células (5 x 106 células) en 1 ml de solución de TRIZOL (Invitrogen, San Diego, CA) y el ARN toíal se aisló conforme a insírucciones del fabricante. Se hibridizó ADNc etiquetado con Biotina (15 µg) a cada disposición GeneChip (Affymetrix, Santa Clara). En resumen, el procedimiento para preparar el maíerial para hibridización a las piezas implicó múltiples etapas. El ARN total se aisló y cuantificó por densidad óptica. Se generó ADNc utilizando un iniciador específico que reconoce el extremo poly A acoplado con el promotor T7 (dT7-(T)24) con dNTP, DTT, y Superscript II para generar el ADNc de la primera estructura de cadena. Este método disminuye la necesidad de aislar poly-A( + )mRNA. La segunda estrucíura de cadena se sintetizó agregando dNTPs con ADN ligasa, ADN pol I y ARNse H, e incubando durante 2 horas a 16°C antes de agregar ADN polimerasa T4 durante 5 minutos adicionales. El ADNc se purificó y cuantificó en columna. Se realizó la transcripción in vitro (IVT) antes de la hibridización a las disposiciones de oligonucleótido de alta densidad. El material de partida para esta reacción fue 1 µg de ADNc al cual se agregaron NTPs con 25% menos de CTP y UTP que se compensa al agregar 10 mM de 11-CTP biotinilado y 10 mM de 16-UTP biotinilado. La adición final de la enzima T7 en el regulador de pH apropiado durante 6 horas a 37°C produjo el ARN de IVT biotinilado el cual se purificó entonces en columna (RNeasy, Qiagen). Se mezcló ARN de IVT químicamente fragmentado (15 µg) con oligonucleótidos control, estándares (incluyendo un gen de gobierno), y ADN de esperma de salmón en el regulador de pH apropiado, calentado a 95°C durante 5 minutos, e híbridízado a la pieza durante 16 horas a 42°C. Se removió el material no hibridizado con 2XSSPE y se agregó entonces a la reacción avidina etiqueíada con ficoeriírina. El exceso de fluorocromo se removió y la pieza se barrió eníonces para iníensidad de fluorescencia en cada caracíerísíica de síníesis (las características de síntesis son 7.5 mieras cuadradas). e. Análisis de Bioinformática Se desarrolló una estrategia y un proceso para el análisis de datos de expresión genética, el cual implica el uso del método CORGON para analizar imágenes de barrido de Affymetrix GeneChips. CORGON es un software libremente disponible, cuyo método esíadísíico de núcleo se conoce (Sasik, eí al. (2002), Bioinformaíics, voi. 18. no. 12:1633-40). Sólo genes que se preseníaron en p < 0.05 (95% del nivel de confidencia) en al menos una de las condiciones se consideraron para análisis adicional. Una comparación de CORGON con el sofíware 5.0 Affymetriz Microarray Suite (AMS) revelaron un 4.4% de índice erróneo positivo falso para CORGON como se compara al 29% para AMS 5.0. Los genes seleccionados se clasificaron de acuerdo al promedio o magnitud pico de modulación. Los mejores 100 genes más modulados se eligieron para agrupamiento basado en similaridad de su patrón de expresión. Se utilizaron métodos de agrupamiento jerárquico. Esía clasificación inicial fue exíremadameníe útil para determinar cuales fueron los genes primarios y trayectorias moduladas por ei proceso bajo investigación. Los grupos de genes que parecen co-regularse se sometieron a análisis promotor. La siguiente etapa fue el análisis GO3, y la herramienta imparcial y no supervisada para encontrar íérminos esíadísíicameníe noíables en la base de daíos Gene Oníology (websiíe: www.geneoniologv.org) se relaciona al proceso. GO3 faciliía el proceso para ideníificar los componentes críticos del sistema que se modularon notablemente. Hubo tres ontologías en la base de datos: función molecular, proceso biológico; y componente celular. El análisis se realizó en el Centro UCSD para el Centro Genómico de Investigación sobre SIDA. f. Análisis Cuantitativo de PCR. Los niveles de expresión de transcripciones específicas se determinaron utilizando PCR cuantitativa (Q-PCR). El ARN total de cada granulo celular SU-DHL-1 tratado se aisló utilizando un equipo mini-prep RNeasy (Qiagen, Valencia, Ca). Los ADNcs se hicieron utilizando un equipo de tranecriptasa inversa ThermoScript (Invitrogen) e iniciadores oligo-dT de acuerdo al protocolo del fabricante. La amplificación y cuantificación de Q-PCR se llevó a cabo .utilizando una máquina iCycler (Bio-RAD, Hercules, CA). Se realizó la amplificación de muestra en un volumen de 25 µl que contiene 12.5 µl de 2 x 1Q SybrGreen™ Mix (Bio-Rad), 1 µM de cada iniciador, y un volumen de ADNc que corresponde a 80 ng del ARN total. Las condiciones de periodo de ciclo fueron: 95°C durante 5 segundos; 30 segundos a la temperaíura de recocido íotal para cada iniciador; y 72°C duraníe 30 segundos. La especificidad objeíivo de los ensayos se validó por análisis de curva de fusión. La expresión de cada gen se normalizó con relación a los niveles de expresión de 18 s para cada muesíra. La expresión de cada gen con relación al conírol no íratado se calculó eníonces por el méíodo de Livak y Schmiíígen ((2001), Meíhods, vol. 25:402-408). Los inciadores se diseñaron uíilizando Beacon Designer™ (Premier Biosofí, Palo Alto, CA), o diseñaron con base en la literatura.. Las secuencias iniciadoras y temperaíuras de recocido son como sigue (cada iniciador se escribe 5' a 3', seguido por su SEC. de IDENT. NO): IID de gene Iniciador Delantero Iniciador Inverso Temp. de Recocido 18s CGCCGCTAGAGGTGAAATTC (1) TTGGCAAATGCTTTCGCT (2) 55°C p21 CCTCATCCCGTGTTCTCCTTT (3) GTACCACCCAGCGGACAAGT (4) 57°C Noxa ATTTCTTCGGTCACTACACAA (5) AACGCCCAACAGGAACAC (6) 55°C PLK-1 CTCAACACGCCTCATCCT (7) GTGCTCGCTCATGTAATTGC (8) 57°C Aurora A TCCTTGTCAGAATCCATTACCTGT (9) GAATGCGCTGGGAAGAATTTG (10) 55°C Aurora B AGAGTGCATCACACAACGAGA (11) CTGAGCAGTTTGGAGATGAGGTC (12) 56°C Ciclina B1 AGTGTGACCCAGACTGCCTC(13) CAAGCCAGGTCCACCTCCTC (14) 57°C Exol TTGGTCTGGAGGTCTTGGAGA (15) GAATCGCTCTTTCTTCGGAACTG (16) 57°C g. Análisis COMPARE Se probó la bendamustina en tamiz anti-tumor in vitro de NCl que consiste de 60 líneas celulares de tumor humano. La prueba implicó un mínimo de cinco concentraciones en diluciones 10 veces y cada tamiz se repitió dos veces. Se utilizó un protocolo de exposición de fármaco continuo 48 horas. Una proteína B de sulforhodamina B estimó la viabilidad o crecimiento celular. El método COMPARE y daíos asociados están libremente disponibles en el sitio web del Programa de Terapia en Desarrollo (DTP (website: dpi.nci.nih.gov). La bendamustina de NCl asignó el número:NSC138783. h. Análisis de Tinción Western Se incubaron células SU-DHL-1 con 50 µM de bendamustina, 2 µM de clorambucilo, o 20 µM de mostaza de fosforamida durante 20 horas. Se lavaron dos veces células con 1 x PBS y se disolvieron duraníe 1 hora con regulador de pH de lisis helado (1 M de Tris-HCl (pH 7.4), 1 M de KCl, 5 mM de EDTA, 1% de NP-40, 0.5% de desoxicolina de sodio, con 1 mM de oríovanidato de sodio, 1 mM de fluoruro de sodio, cócíel inhibidor de proteasa (Roche, Nutley, NJ), y coctel inhibidor de fosfatasa (Sigma, Sí. Louis, MO)) agregado direcíamente antes de la lisis. Membranas no solubles, ADN, y otros precipitantes se granularon y el sobrenadante de proteínas se obtuvo. Las concentraciones de proteínas se deíerminaron utilizando el ensayo Bradford (Pierce, Rockford, IL). 20 µg de lisato se separaron por elecíroforesis en gel en un gel de poliacrilamida 4- 12%, se íransfirieron a membranas de nitrocelulosa (Invitrogen) y se detecíaron por inmunoíransferencia uíilizando los siguieníes aníicuerpos monoclonales primarios: aníi-p53, p53 aníi-fosforilado (Ser15-específico), aníi-p21, y PARP aníi-desdoblado (caspase-sitio de desdoblamienío específico), los cuales se adquirieron de Cell Signaling (Beverly, MA); anti-Bax y anti-PARP, ios cuales se adquirieron de BD Pharmingen (San Diego, CA), y aníí-beía-acíina, uíilizados para un control de carga, la cual se adquirió de Sigma (St. Louis, MO). Los anticuerpos primarios se incubaron duraníe la noche a 4°C con agitación suave. Se lavaron membranas tres veces con 1 x PBS y se incubaron con anticuerpo secundario anti-raíón de cabra Alexa Flour 680 (1:4000) (Molecular Probes, Eugene, OR) duraníe 2 horas a íemperaíura ambieníe con agiíación suave. Las manchas se lavaron íres veces con 1 x PBS y se barrieron en un escáner LiCor Odyssey. i. Ensayos Ape-1 y AGT basados en células in vitro Se pre-incubaron células duraníe 30 minuíos con 6 M de metoxiamina (Sigma) o 50 µM de O6-bencilguanina (Sigma), inhibidores de enzima de reparación de excisión base y enzima de alquilguanil transferasa (AGT), respectivamente. Las células se expusieron entonces a varias concentraciones de los agentes indicados durante 72 horas. La citotoxicidad se evalúo por el ensayo MTT (13) y una 1C50 se midió como la concentración de fármaco que inhibió 50% del valor del control no tratado. Los análisis se realizaron utilizando Software GraphPad, GraphPad Prism Versión 3.00 (San Diego, CA). j. Análisis de ciclo celular Se incubaron células SU-DHL-1 con concentraciones equitóxicas (IC50) de bendamusíina (50 µM), clorambucilo (4 µM) o mosíaza de fosforamida (50 µM) duraníe 8 horas. Las células se lavaron con PBS y se fijaron en 70% de eíanol 20°C duraníe al menos una hora. Las células fijas se re-hidrafaron al lavar con PBS. Las células se volvieron a suspender en una solución de íinción de yoduro de propidio que consisíe de 10 µg/ml de yoduro de propidio (Calbiochem, La Jolla, CA), 10 µg/ml de ARNse (DNase libre, Novagen, Madison, Wl) y 10 µl/ml de Triíon-X (Sigma) en PBS. Las muesíras se analizaron uíilizando un FACSCalibur (BD Bioscíences, San José, CA). Los análisis de la distribución del ciclo celular se realizaron utilizando software de modelado DNA ModFit LT (Veríía House Sofíware, Inc. Sunnyvale, CA). k. Formación de foco H2AX. Se culíivaron células en poríaobjefos en cámara Lab-Tek (Nalge Nunc Int., Naperville, IL) en un medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS. Después de permitir a las células unirse durante al menos un día, las células se traíaron en un medio ya sea con DMSO o 50 µM de bendamustina. Las células se incubaron durante 30 minutos a 37°C y luego se lavaron dos veces con PBS. Éstas se incubaron durante 4 horas adicionales a 37°C. Las células se lavaron entonces dos veces con 1 x PBS y se incubaron 10 minutos en 100% de metanol a -20°C para fijar las células. Se lavaron entonces tres veces durante cinco minutos cada una con 1 x PBS. Se incubaron a íemperaíura ambieníe duraníe 1 hora en regulador de pH de bloqueo (10% de FBS en 1 x PBS, 1% de BSA). Los porlaobjeíos se incubaron a 4°C con balanceo duraníe la noche con el anlicuerpo aníi-H2AX policlonal primario (R & D Sysfems, Minneapolis, MN). El aníicuerpo se diluyó en regulador de pH de bloqueo en una relación de 1:10,000. Los poríaobjeíos se lavaron tres veces con 1 x PBS e incubaron con anticuerpo secundario anticonejo de cabra Alexa Flour 488 (1:4000) (Molecular Probes, Eugene, OR), durante 45 minutos a temperaíura ambieníe y con agiíación suave. Los poríaobjetos se lavaron tres veces con 1 x PBS y luego las cámaras se removieron y SlowFade Lighí Aníifade con DAPI (Molecular Probes) se agregó a las células y las cubierías de vidrio se sellaron en los poríaobjeíos. Se realizó en análisis uíilizando un microscopio de creación de imágenes moíorizado Zeiss AxioPlan 2e con ópíicas DIC y fluorescencia, una cámara Zeiss AxioCam HRm y sofíware Zeiss Axiovision versión 4.2.

I. Fosforilación de H2AX en inmunotinción de residuo Ser139. Se culíivaron líneas celulares para confluencia en un medio RAMPI 1640 suplemenfado con 10% de FBS. Las células se lavaron eníonces dos veces con 1 x PBS y usaron durante 1 hora con regulador de pH de lisis helado (1 M de Tris-HCl (pH 7.4), 1 M de KCl, 5 mM de EDTA, 1% de NP-40, 0.5% de desoxicolina de sodio, don 1 mM de ortovanidaío de sodio, 1 mM de NaF, cocíel de inhibidor de proíeasa (Roche, Nuíley, NJ), y cócíel de inhibidor de fosfaíasa (Sigma St. Louis, MO)) agregado directameníe aníes de lisis. Membranas no solubles, ADN y oíros precipííaníes se granularon y se obíuvieron sobrenadaníe de profeínas. Las conceníraciones de proteínas se determinaron utilizando ensayo Bradford (Pierce, Rockford, IL). Veinte microgramos de lisato se separaron por electroforesis de gel en un gel de poliacrilamida 4-12%, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se deíecíaron por inmunoíinción uíilizando un anlicuerpo anlí-H2AX policlonal (R & D Sysíems, Minneapolis, MN). El aníicuerpo se diluyó en regulador de pH de bloqueo en una relación de 1:2000, y las membranas se incubaron durante 2 horas a temperaíura ambieníe con agiíación suave. Las membranas se lavaron íres veces con 1 x PBS y se incubaron con aníicuerpo secundario anli-conejo de cabra Alexa Flour 6.80 (1:5000) (Molecular Probes, Eugene, OR) duraníe 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Las manchas se lavaron tres veces con 1 x PBS y se barrieron en un escáner LiCor Odyssey.

C. Resultados a. Perfil de Expresión Genética Identifica genes distintivos que se regulan por bendamustina que son distintos de clorambucilo o ciclofosfamida. Concentraciones equitóxicas de bendamusíina, ciorambucilo y mosíaza de fosforamída (el meíaboliío acíivo dé ciclofosfamida) se deíerminaron al medir la viabilidad celular después de íres días de exposición al fármaco. Para los ensayos preseníados en esíe esíudio, las conceníraciones uíilizadas para bendamusíina, mosíaza de fosforamida, y clorambucilo se seleccionaron en base en estos datos (Cuadro 1, posteriormeníe). Esías concenfraciones también reflejan los niveles clínicamente logrables para cada fármaco. Se utilizó el análisis Affymeírix GeneChip para comparar los niveles de expresión de más de 120,000 genes en SU-DHL-1 íraíados con fármacos, una línea celular de linfoma sin relación a Hodgkin, células comparadas a células conírol. Células SU-DHL-1 se incubaron con bendamusíina en la conceníración de IC50 (25 µM) y en la conceníración de IC90 (35 µM). Se probaron clorambucilo y mosíazada de fosforamida de meíaboliío de ciclofosfamída en IC90, es decir, 5 µM y 50 µM, respecíivameníe. La expresión genéíica se moniíoreo después de 8 horas de traíamienío con fármaco para ideníificar los eveníos próximos en esía respuesía de iensión íemprana. El análisis genómico reveló que la mayoría de los genes se regulan de forma similar eníre los íres fármacos probados, como se demuesíra por clusíergrama de los mejores 100 genes modulados (Figura 1A). La mayoría de genes se sobre-regularon (color rojo) para exponerse a los fármacos. Un subconjunto de genes se reprimió transcripcionalmeníe siguiendo el tratamiento de fármaco (color azul). De forma importante, se identificó que un grupo de genes que despliega regulación diferencial por bendamusíina comparada a los oíros dos fármacos probados. Se sabe que muchos de los genes inducidos (Figura 1B) poseen elemeníos de respuesía p53 en sus regiones promoíoras y se consideran dependieníes de p53. Ejemplos de esíos genes son: p21 (inhibidor de cinasa de división celular inducida por p53); wipl (fosfaíasa 1 de proíeína inducida por p53); NOXA (miembro de la familia Bcl-2 pro-apoptóíica inducida por p53); DR5/K1LLER (recepíor de mueríe celular inducible por daño de ADN regulado por p53); y BTG2. De forma interesante, cuatro miembros de la superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral (miembros 6, 0, 10 y 10b) se ideníificaron en los mejores 100 genes modulados. Varios de esíos genes han demosírado que juegan un papel crííico en la regulación de la írayecíoria apoptótica extrínseca (REF, apoptosis TRAIL/TNF). Varios otros genes despliegan una tendencia opuesta entre bendamustina y los otros dos compuestos (datos no mostrados). Estos genes se sobre-regulan por bendamustina, en ambas concentraciones, pero se des-regulan por clorambucilo y mostaza de fosforamida. Para evaluar diferencias farmacogenómicas entre bendamustina, clorambucilo, y mostaza de fosforamida, los resultados del perfil genéíico se re-analizan con el sofíware GO3, una herramienía imparcial y no supervisada para enconírar íérminos esíadísíicameníe noíables en la base de daíos Gene Ontology (GO) (website: www.geneoniology.org) relacionada al proceso. Los genes sobre o des-regulan noíablemente en células íraíadas con bendamusíina y al menos 1.5 veces sobre o debajo de los niveles de expresión en células íraíadas con conírol reconecíaron a anoíaciones de proceso biológico provistas por el consorcio Gene Ontology (GO). Con base en la estrucíura jerárquica de las anofaciones de GO, la probabilidad de que cada íérmino hija (un valor P) se une al número de genes seleccionados por casualidad se calculó. Los resulíados del análisis de GO comparando el conírol íratado con DMSO y las células íraíadas con bendamusíina (en dosis de IC90) se reporían en el Cuadro 2, posíeriormeníe. En el Cuadro 2 posíeriormeníe, la primera columna represenía caíegorías generales, la segunda y tercera columnas son el número y nombre del proceso biológico específico, y la última columna es el valor p para cada proceso. El valor p se calculó utilizando software GO3. Se encontró que cuatro grupos funcionales mayores se modulan estadísticamente por bendamustina: (1) daño por ADN, respuesta a la tensión, apoptosis; (2) metabolismo de ADN, reparación de ADN, transcripción; (3) proliferación celular, ciclo celular, punto de control mitótico; y (4) regulación celular. Cada uno de estos grupos abarca varios procesos biológicos que se encontraron se modulan notablemente por bendamustina. Los procesos biológicos que proporcionan los valores p más bajos por consiguiente fueron los más estadísíicamente noíables, fueron; respuesla por íensión de daño a ADN (GO6974); metabolismo de ADN (GO6259); y proliferación celular (GO8283). Un análisis similar realizado con clorambucilo y mostaza de fosforamida sugiere que exisíe poco íraslape eníre el perfil obíenido con bendamusfina y clorambucilo. Algunas similaridades en ia modulación genéiica se observaron enlre bendamusíina y mosíaza de fosforamida, aunque éstas se limitaron al grupo de "metabolismo de ADN, reparación de ADN, y transcripción". Estos resultados proporcionan la base para la sección de productos genéticos específicos para la validación cuaníiíafiva de lo resuliados de disposición genéíica y diferenciación más definifiva de bendamuslina. b. Validación de análisis genómico por análisis de Q-PCR cuantitativo en tiempo real La confirmación y validación de daíos de disposición se realizó por análisis de PCR cuaníiíaíivos en íiempo real (Q-PCR). Varios genes implicados en señalización de p53, apopíosis, reparación de ADN, ciclo celular/punios de conírol miíóíicos se regularon iodos diferencialmeníe cuando se compara la bendamustina a otros ageníes de alquilación probados. Dos ejemplos de genes dependieníes de p53 "canónicos" seleccionados para validación de Q-PCR fueron p21 (Cip1/Waf1 ), el inhibidor 1A cinasa dependieníe de ciclina, y el miembro de la familia Bcl-2 BH3 solo pro-apoptóíica, NOXA. Se encontró que ambos genes se inducen en células SU-DHL-1, 8 horas después de la exposición a bendamustina. Ambos genes se indujeron también por concentraciones equitóxicas de mostaza de fosforamida y clorambucilo, pero a un grado mucho más bajo (Figura 2A). Uno de los resulíados más noíables que emergió del análisis de validación fue la regulación diferencial de varios genes relacionados con miíosis, incluyendo cinasa 1 del íipo polo (PLK-1), las Cinasas A y B Aurora, y ciclina B1. Esos genes se consideran juegan un papel imporíante en la regulación del punió de conírol miíóíico. El íratamienío con bendamusíina conduce a una desregulación del 60 a 80% de la expresión de ARNm de iodos esíos genes. En contraste, la mostaza de fosforamida o clorambucilo solo ejerce un efecto menor en las transcripciones de estos genes, con posiblemente la excepción de las cinasas Aurora (Figura 2B). Las diferencias emergen también en el análisis de la expresión de ARNm de la exonucleasa-1 (EXO1) del gen de reparación de ADN. La bendamustina induce a sobre-regulación ligeramente más fuerte (2.5 veces) de expresión Exol (Figura 2C) comparada con aquella observada con mostaza de fosforamida (1.5 veces) o clorambucilo (1.8 veces). Fen1 (endonucleasa 1 de estructura de aleta) se sobre-regula también por bendamustina, y la mostaza de fosforamida sobre-regula esíe gen al mismo nivel cuando se utilizan en concentraciones equitóxicas (Figura 2C). c. Señalización de apoptosis por bendamustina en células NHL. Para diseccionar los eventos moleculares implicados en muerte celular programada inducida por bendamustina en células NHL, la expresión de proteínas apoptóíicas clave se moniioreo por análisis de inmunolransferencia. Los resulíados muesíran clarameníe que la bendamusiina puede accionar eficiente y rápidamente la írayecíoria apoptótica dependiente de p53, clásica. Uno de los eventos iniciales y apicales es la inducción de fosforilación p53, como se deíectó uíilizando aníicuerpos que reconocen específícameníe la fosforilación del residuo serina-15. Una sobre-regulación de 8 veces de p53 Ser-15-fosforilado se observó en células SU-DHL-1 expuesías a bendamusíina, mieníras sólo una sobre-regulación menor se observó en células íraíadas con mosíaza de fosforamida y no se observaron cambios en células tratadas con clorambucilo (Figura 3, panel izquierdo superior). En paralelo con la inducción de p53 fosforilado, un incremento fuerte en la expresión del p53 íoíal se observó en células traíadas con bendamusíina. Las células íratadas con clorambucilo despliegan un incremento pequeño en p53 total, mientras la expresión a mostaza de fosforamida no indujo cambio en niveles de p53. Los cambios observados en la expresión de proteína p21 fueron menores para cada uno de los fármacos cuando se compara a los cambios en los niveles de expresión de proteína de p53. Un incremento en la expresión de proteínas de Bax, un miembro de la familia Bcl-1 pro-apoptótica BH3-sólo clave, se observó solamente en células SU-DHL-1 tratadas con bendamustina (Figura 3, panel izquierdo inferior). La diferencia más notable observada al comparar el efecto de bendamustina con mostaza de fosforamida y clorambucilo se encontró cuando la expresión de PARP, polimerasa.1 poly-ADP-ribosa, se comparó. PARP es una enzima que requiere NAD crítica importanfe en mecanismos de reparación de ADN. PARP es íambién uh susíraío "íemprano" de las enzimas caspase proíeolííicas pro-apopíóíicas. Células SU-DHL-1 írafadas con bendamusíina mosíraron una reducción dramáíica de expresión de proteína PARP (Figura 3, panel derecho superior). La razón para la reducción de expresión de PARP fue su desdoblamiento por caspasas, como se demuestra por la aparición de productos proteolíticos desdoblados reconocidos por un aníicuerpo "específico de desdoblamienío]" (Figura 3, panel derecho medio). Noíablemeníe, no se deíecíaron cambios en la expresión de PARP en células NHL írafadas por concenfraciones equiíóxicas de mosíaza de fosforamida o clorambucilo. Resulfados similares se observaron cuando se uíilizan dobles dosis equiíóxicas de mosíaza de fosforamida (40 µM) y clorambucilo (4 µM) mieníras se mantiene la dosis de bendamusíina (50 µM) (datos no mostrados). De este modo, una evaluación de los niveles de expresión de PARP pueden utilizarse para varios propósitos. Por ejemplo, un ensayo PARP puede proporcionar una indicación como la eficacia de un régimen terapéuííco paríicular, en donde la expresión de PARP reducida (de preferencia medida en el nivel de proíeína, por ejemplo por acíividad de PARP, para la presencia de producios de desdoblamienío PARP, etc.) indica que el fármaco adminisírado está teniendo el efecto deseado. Además, el ensayo PARP puede utilizarse de forma prevista para determinar, por ejemplo, si las células de un tejido (por ejemplo, células derivadas de una biopsia u otra muesíra biológica) probablemeníe respondan a una terapia particular (por ejemplo, monoterapia de bendamustina o una terapia de combinación en donde una de las terapias utiliza bendamustina). d. Inhibición de reparación por excisión base, pero no reparación de O6-metilguanina-ADN metiltransferasa, actividad de bendamustina en bloques. El papel de la enzima Ape-1 reparadora, una endonucleasa apurínica que juega un papel crítico en la trayectoria de reparación por excisión base (BER) en la actividad citotóxica de bendamustina y el metaboliío de cíclofosfamida, la mosíaza de fosforamida se evaluó uíilizando el inhibidor meíoxiamina Ape-1. La IC50 de bendamusíina se redujo aproximadameníe cuaíro veces (de aproximadameníe 50 µM a aproximadameníe 12 µM) con adición de meíoxiamina (Figura 4A). En coníraste, la IC50 de mostaza de fosforamida sólo cambió ligeramente cuando se agregó meíoxiamina. Los resulíados sugieren que BER puede jugar un papel imporíaníe en la reparación de daño de ADN inducido por bendamusíina, pero no en la reparación del daño inducido por ciclofosfamida. El efecío de la O6-bencilguanina, un inhibidor conocido de O6-alquilguanina-ADN alquilíransferasa (AGT) en la acíividad aníi-t?mor de bendamustina, se probó también en las células SU-DHL- . Los resultados demuestran que'la potencia citoíóxica de la bendamustina no se mejoró al agregar O6-benciIguanina. Resultados opuestos se obtuvieron con ciclofosfamida, sugiriendo que disíinfa ciclofosfamida, bendamusíina no se basa apreciablemeníe en el mecanismo de reparación de ADN O6-met¡lguanina-ADN melilíransferasa (Figura 4B). e. HCl de Bendamustina induce rápidamente la formación de rompimientos de estructura de cadena doble que resultan en alteraciones de ciclo celular únicas. Para invesíigar la capacidad de HCL de bendamusíina para inducir rompimieníos de esírucíura de cadena doble (DSBs), dos marcadores bioquímicos se analizaron: localización nuclear de hisíona gamma-H2AX por inmunofluorescencia; y fosforilación de HSA2 en el residuo Ser139 por análisis de inmunoíransferencia. Los resulíados confirmaron que HCl de bendamusíina induce poíencial y rápidameníe DSBs en una variedad de células íumorales, incluyendo líneas deficieníes de p53 y resistentes a fármacos múltiples. La incubación con 50 µM de HCl de bendamustina conduce a la formación de foco intranuclear deíecíable después ían poco como 30 minutos. El análisis de transcurso de tiempo mostró que la fosforilación de Ser139 de gamma-H2AX fue detectable después de 24 horas de exposición continua a HCl de bendamusíina así como después de una exposición muy corla al fármaco (30 minutos), seguida por la remoción de fármaco (eliminación). La fosforilación inducida por HCl de bendamustina de H2AX ocurrió previamente que con otros alquiladores de ADN 2-cloroetilamino tal como ciclofosfamida. El análisis de ciclo celular de células de linfoma SU-HDL-1 expuestas durante ocho horas a 50 µM de HCl de bendamustina mostró un incremenío de distribución de fase S promedio de más de 40% sin una detención de G2M presente. La exposición a concentraciones equitóxicas de clorambucilo y ciclofosfamida incrementó la distribución de fase S aproximadamente 20% y 15% respecíivameníe. Estos hallazgos ilustran que el HCl de bendamustina puede inducir a rompimientos de estructura de cadena doble de ADN, incluso después de una exposición transitoria de 30 minutos. f. La bendamustina despliega un único perfil de actividad utilizando el análisis COMPARE de NCl Se evalúo la citoíoxicidad de la bendamusíina en las 60 líneas celulares del íamiz de descubrimienío del fármaco aníi-íumor pre-clínico del Instituto Nacional de Cáncer (tamiz de NCl). El tamiz de NCl es útil para comparar potencia relativa de agentes aníi-neoplásicos polenciales con ageníes íerapéuíicos conocidos a paríir de una base de daíos exíensa de más de 45,000 compuesíos y producios naíurales. El análisis COMPARE se activó utilizando los resultados de GI50 generados con bendamustina como una "semilla". Los compuestos con coeficieníes de correlación Pearson elevados (PCC) con frecuencia íienen mecanismos similares de acción. La bendamusíina no demosíró una correlación fueríe (>0.8) en el íamiz de NCl con cualquier ageníe (Cuadro 3, posíeriormeníe). De las seis equivalencias superiores con bendamusíina, sólo el ageníe DTIC de muíilación (dacarbazina) mosíró aproximadameníe 80% de concordancia correlaíiva (valor r). En contraste, un total de 25 compuestos con coeficientes de correlación sobre 0.83 se identificaron para melfalán, clorambucilo, o el metabolito activo de ciclofosfamida. Además, la comparación direcía de los patrones de sensibilidad de melfalán, clorambucilo y ciclofosfamida en este tamiz demuestran coeficientes de correlación altos entre los tres fármacos (datos de 0.762-0.934 no mostrados). Esíos daíos muesíran una concordancia esíadísíica en el perfil de sensibilidad de los ageníes y una probabilidad elevada de un mecanismo común de acción. La carencia de correlación eníre la bendamusíina y oíros miembros de la clase de mosíaza de niírógeno se compele y revela que la bendamuslina liene un paírón dislinto de actividad anti-íumor.

D. Discusión Los resuliados de esíos experimenfos, obíenidos utilizando una variedad de herramientas biológicas y analíticas, demosíraron que la bendamusíina posee un disíinío mecanismo de acción cuando se compara a oíros compuesíos clínicameníe utilizados que comparten la misma porción acíiva de la "mosíaza de niírógeno" íal como ciclofosfamida y clorambucilo. Una de las herramienías empleadas en este estudio fue un método farmacogenómico, el cual permite el análisis simultáneo y la verificación de niveles de expresión de miles de genes completameníe caracíerizados en la incubación de líneas celulares objeíivo con un fármaco seleccionado, se ha utilizado exitosameníe para explicar el mecanismo de acción de oíros fármacos aníi-cáncer. Su mayor veníaja fue la generación de información imparcial que conduce a la ¡deníificación de un mecanismo disíinío de acción para la bendamusíina, diferenciándolo de oíros ageníes de alquilación de ADN. Con esíe méíodo, se deíecíó una "ideníificación" de respuesía a la tensión dependiente de p53 clásica fuerte para bendamustina, y se presenta, aunque en una intensidad en gran medida reducida, en células tratadas con mostaza de fosforamida y clorambucilo. El análisis de Q-PCR confirmó el análisis de disposición genéíica, validando la sobre-regulación de genes que coníienen elemenfos de respuesía p53, íales como p21 (Waf/Cip1) y NOXA. Como un inhibidor para cinasas dependientes de ciclina, particularmente aquellas que funcionan durante la fase Gi del ciclo celular, se cree que p21/Waf1/Cip1 media al menos en parte, detención de G^ inducida por p53. Los mecanismos que conducen a detención de ciclo celular inducido por p53 y apoptosis se han investigado y reportado ampliamente. Noxa codifica un miembro de solo (BHE) de homología 3 de Bcl-2 de la familia Bcl-2 de proteínas. Se mostró que NOXA es un objetivo de íransacíivación mediada por p53 y que funciona como un mediador de apopiosis dependieníe de p53 a íravés de disfunción mitocondrial. Los fibroblastos embriónicos de ratón deficientes en Noxa mostraron resistencia notable a apoptosis dependiente de encogen en respuesta a daño por ADN. La activación de la trayecíoria pro-apopíóíica de p53 se confirmó eníonces por análisis de inmunotransferencia, con la detección de p53 (Ser15) fosforilado, así como con la sobre-regulación de Bax. Aunque otras mostazas de niirógeno se han reporíado previameníe para inducir una repuesía a la íensión mediada por p53, la bendamustina proporciona una señal más fuerte y más rápidamente inducida cuando se compara a dosis equiíóxicas del meíaboliío de ciclofosfamida (PM) o clorambucilo. Se enconíró fambién que la bendamusíina induce un desdoblamienío rápida y exíenso de PARP, una enzima que cataliza poli(ADP-ribosilación) de una variedad de proíeínas. Aunque la bendamusíina induce desdoblamienío de PARP, la diferencia eníre la capacidad de los íres fármacos para provocar desdoblamienfo de PARP en células SU-DHL-1 fue noíable. Esía rápida inducción de desdoblamienío de PARP puede jugar un papel orifico en el mecanismo de acción de la bendamuslina, dada la imporfancia de PARP para mecanismos de reparación de ADN. Cieríameníe, en respuesía a daño por ADN, las células acíivan inicialmeníe PARP, resulíando en un incremenío de la accesibilidad de ADN a enzimas de reparación de ADN y facíores de íranscripción. Además, la PARP ha estado implicada en iniciar muerte celular por apopíosis o necrosis. Oíra diferencia mayor que emerge del perfil farmacogenómico de la bendamustina y las otras mostazas de nitrógeno probadas fue el efecto en los niveles de expresión de la cinasa 1 del tipo polo (PLK-1), cinasas Aurora (A y B) y Ciclina B1. Las cinasas PLK-1 de punto de control mitófico y Aurora esíán implicadas en muchos aspecíos de la regulación del ciclo celular, íal como la acíivación e inacíivación de compiejos de CDK/ciclina, ensamble y maduración de cenírosoma, y acíivación del complejo que promueve anafase (APC) duraníe la íransición de meíafase-anafase, y cifocinesis. De forma iníeresaníe, cuando esíos reguladores de punió de conírol se inhiben uíilizando ARNsi o uíilizando pequeñas moléculas objeíivo, la poíenciación del efecío de fármacos que dañan ADN se observa, unfo con la aparición de caíástrofe mitóíica. La caíásírofe miíóíica es una forma de mueríe celular que ocurre durante la metafase y es morfológicameníe disíinía de apopíosis. La caíásírofe miíóíica puede ocurrir en ausencia de p53 funcional o en células en donde se suprime la apopíosis dependienle de caspase convencional. Por esía razón, el inicio de la caíástrofe mitóíica es un mecanismo iníeresaníe de mueríe celular tumoral, ya que puede funcionar también en células tumorales que han sido seleccionadas por varios ciclos de quimioterapia utilizando fármacos quimioterapéuíicos convencionales. El daño por ADN exíenso y durable producido por bendamusíina y la inhibición concomiíaníe de punios de conírol específicos de fase M por bendamusíina pueden accionar caíástrofe mitótica en células traíadas. Esto puede explicar la actividad clínicameníe documeníada de bendamusíina en pacieníes resisíeníes a regímenes que coníienen ciclofosfamida y clorambucilo. Los mecanismos de reparación de ADN eficieníes han demosírado que juegan un papel crííico en el mecanismo de acción de fármacos de alquilación de ADN. La acíivación de mecanismos de reparación de ADN discretos puede conferir también a un distinto perfil de actividad a fármacos que comparten caracterísíicas químicas similares. El análisis farmacogenómico descriío en la preseníe identifica genes de reparación de ADN diferencialmente regulados por bendamustina comparados a mostaza de fosforamida y clorambucilo. Un gen, exonucleasa (Exo1) es una exonucleasa 5'-3' que interacíúa con los homólogos MuíS y Mulí y ha esfado implicada en la eíapa de excisión de reparación de incompaíibilidad de ADN y en el procesamienfo y reparación de rompimientos de estructura de cadena doble. Exo1 ha esíado implicada en hipermuíación somáíica y recombinación del interruptor de clase y es por lo tanío muy portanle en la función de la célula B y la generación de anficuerpos. Para invesíigar además las diferencias en los mecanismos de reparación eníre la bendamusíina, ciclofosfamida y clorambucilo, se realizan ensayos funcionales. Dos mayores mecanismos se investigaron: la proteína de reparación de ADN, O6-alquilguanina-ADN alquiltransferasa (AGT); y la endonucleasa Ape-1 apuríníca/apirimidínca. AGT, una enzima ubicuoía, remueve el aducío de ADN O6.alquílguanina provocado por varios agenies de alquilación, incluyendo niírosureas y íriacenos. Evidencia clínica sugiere que íumores cerebrales que expresan niveles elevados de AGT, y pueden así ser más resisíeníes a algunos alquiladores de ADN íales como íemozolomida. El nucieósido O6-bencilguanina (O6-BG) proporciona un medio para inacíivar efecíivameníe la proíeína AGT. En algunas líneas celulares, la bencllguanina mejora clarameníe la toxicidad de la forma activada de la ciclofosfamida. Como se muestra aquí, la poíencia ciíoíóxica de ciciofosfamida, pero no de bendamustina, se mejoró al agregar O6-bencilguanina, indicando que la bendamustina no induce aductos de ADN O6-alquilguanina los cuales pueden repararse por AGT. Ape-1/Ref-1 es una endonucleasa apurínica/apirimidínica que juegan un papel crítico en la trayecíoria de reparación de excisión base (BER). BER se acíiva por daño inducido por una variedad de fármacos que dañan el ADN, incluyendo alquiladores de ADN y ageníes de muiilación de ADN tales como temozolomida. El papel de Ape-1 se probó al utilizar el compuesto meíoxamina (MX), un inhibidor específico de su acíividad enzimáíica. La acíividad ciíoíóxica de bendamusíina se mejoró por la adición de Ape-1 por MX, indicando un papel para BER. No se observaron cambios al uíilizar el meíaboliío de ciclofosfamida, al ser base de una mayor diferencia eníre los mecanismos de reparación de ADN acíivados por esíos fármacos. El Tamiz in vitro de 60' líneas celulares de Tumor Humano de NCl es úíil al comparar la poíencia relaíiva de los ageníes aníi-neoplásicos con oíros agentes terapéulicos conocidos. Se ha demosírado íambién en muchos casos que cuando pares de compuesíos se encueníran que fienen un coeficieníe de correlación elevada entre sus resultados de tamización al utilizar ei panel, como se evalúa por el programa de análisis estadísíicos COMPARE, los agenfes a menudo fienen mecanismos similares de acción. La correlación elevada observada para las mostazas de nitrógeno melfalán, clorambucilo y ciclofosfamida son todos agentes de alquilación conocidos, confirmando la capacidad del análisis COMPARE para encontrar mecanismos comunes de acción. De las mejores seis equivalencias con bendamusíina, sólo el ageníe de mulilación DTIC (dacarbazina) mosíró aproximadameníe una concordancia correlafiva (valor r). Esíos resulfados revelan que la bendamusíina despliega un mecanismo disíinto de acción en relación a otros agentes de alquilación conocidos.

Con base en los resultados presentados en este ejemplo, el mecanismo de acción deducido de la bendamustina se ilustra en la Figura 5. La bendamustina puede i.ntroducir eficientemente células tumorales e inducir alquilación y fragmentación de ADN prolongado y extenso, probablemeníe debido a la esíabilidad química del anillo de aziridinio en esíado de íransición conferido por el sisfema de anillo de bencimidazol de la bendamusíina. El íraíamienío de bendamusíina resulía en el inicio de íres írayecíorias de señalización: 1) acíivación de la írayecíoria de íensión dependiente de p53 "canónica", que resulta en una activación fuerte de apoptosis inírínseca, la cual se media por miembros de la familia BCL-2 pro-apopíótica tales como NOXA y Bax; 2) activación de mecanismos de reparación de AND, fales como la maquinaria de reparación de base-excisión, que no se acíivan por oirás mosíazas de niirógeno frecueníemente uíilizadas en pacieníes con NHL o CLL; y 3) inhibición de varios punios de conírol miíóíicos, tales como las cinasas PLK-1 y Aurora A y B. La inducción concomitaníe de daño e inhibición de ADN de puntos de control mitóíicos pueden no permitir a las células tumorales exponerse a bendamustina para reparar eficientemente el daño de ADN antes de experimentar mitosis. Células que incorporan mitosis con ADN extensamente dañado, o células que no pueden proseguir apoptosis dependiente de p53 "convencional", experimentarán muerte por catástrofe mitótica. Esta trayectoria de muerte celular programada, allernativa junto con la activación fuerte de apoptosis tradicional, indica porque la bendamustina es efectiva en células resistenles a fármacos in vitro, así como en pacieníes que padecen íumores resisíeníes a quimioíerapia. Consecuentemente, el traíamienío con bendamusíina represeníará una imporíanfe adición al arsenal del clínico para el íratamiento de pacientes con linfoma sin relación a Hodgkin indoloro y otros cánceres hematológicos, eníre oíros.

Eiemplo 2 La Actividad de Bendamustina en Células NHL Induce la Trayectoria de Muerte por Catástrofe Mitótica Como se describe en el Ejemplo 1 aníerior, la bendamustina es un agente de alquilación con un mecanismo distinío de acción, y está experimentando pruebas clínicas en pacientes NHL y CLL resistentes a agentes que dañan el ADN tradicional. La bendamustina induce cambios únicos en expresión genética en células NHL y despliega una carencia de resistencia cruzada con otros agentes de alquilación 2-cloroetilamina. El análisis de PCR cuantitativo confirma que los reguladores cinasa 1 del tipo Polo de punto de conírol G2/M (PLK-1) y cinasa Aurora A (AurkA) se des-regulan en la línea celular SU-DHL-1 NHL después de 8 horas de exposición a conceníraciones clínicameníe relevaníes del fármaco. Ningunos cambios en estos mismos genes se observaron cuando las células se expusieron a dosis equitóxicas de clorambucilo o un metabolifo acíivo de ciclofosfamida. La capacidad de la bendamusíina para inducir ciíoíoxicidad en células permite experimentar apoptosis mediada por caspase clásica se investigó. Células MCF-7/ADR resistentes a fármacos múltiples y células de adenocarcinoma de colon RKO-E6 deficiente de p53 se expusieron durante dos o tres días ya sea a 50 µM de bendamustina sola o 50 µM de bendamusíina y 20 µM de inhibidor pan-caspase zVAD-fmk. Aunque zVAD-fmk fue capaz de inhibir incremeníos inducidos por bendamustina en células positivas V Annexin, el análisis microscópico de morfología nuclear que utiliza DAPI de mancha de ADN en células traíadas ya sea con bendamusíina sola o en combinación con zVAD-fmk mosíró incidencia íncremeníada de micronucleación. La multi/micro-nucleación y la condensación de cromatina anormal son ambas sellos de catástrofe mitótica y se han observado en células tumorales expuestas a fármacos de unión de microíúbulo lal como los vinca alcaloides y láxanos. La aclivación de caíástrofe mitófica puede amplificar la citotoxicidad de bendamustina y su actividad en células tumorales en donde se inhibidores las trayectorias apoptóticas clásicas.

Eiemplo 3 La Bendamustina de Acción Rápida Activa Apoptosis Potente v Muerte Celular en Linfoma y Células de Leucemia Como se describe anteriormeníe, el ageníe de alquílación de bendamusíina exhibe acíividad quimioíerapéuíica coníra cánceres resistentes a fármacos, entre otros, y posee un mecanismo único de acción cuando se compara a otros ageníes aníi-tumor relacionados. Como es el caso con otras mostazas de nitrógeno anti-neoplásicas, la bendamustina tiene una vida media en suero relativamente corta en seres humanos (aproximadamente 2 horas) y se administra clínicameníe por infusión de bolo intravenoso. El propósito del trabajo reportado en esle ejemplo fue evaluar la capacidad de la bendamustina para inducir muerte celular y apoptosis cuando se expone durante periodos breves a células cancerosas in vitro. La actividad de la bendamustina en tales modelos experimentales se comparó a otros agentes estrucíuralmeníe relacionados. Los resulíados obíenidos indican que la bendamustina ejerce máxima actividad anti-tumor después de una exposición breve (30 minutos) a las células. Para obtener estos resultados, la línea celular SU-DHL-1 de NHL se expuso a 50 µM de bendamustina durante periodos breves variando de 30 minutos a 4 horas, se lavó y se permitió recuperar duraníe 20 horas en un medio libre de fármaco. Las células expuesías a bendamustina tan poco como 30 minutos despliegan pérdida extensa de viabilidad como se mide por una variedad de ensayos biológicos, incluyendo la medición de ATP intracelular y la liberación de adenilato cinasa en el sobrenadante en 48 y 72 horas después de la exposición al fármaco (Figuras 6 y 7). En contrasíe, las células tratadas con otros miembros de esta clase de ageníes de alquilación (aquí, clorambucilo, melfalán y mosíaza de fosforamida del meíaboliío de ciclofosfamida; daíos mosírados para clorambucilo y moslaza de fosforamida) experimeníaron pérdida mínima de viabilidad cuando se exponen a esíos ageníes duraníe 30, 60 y 120 minufos. Esías oirás mosíazas de nitrógeno requieren un periodo de exposición mucho más largo (al menos 4 horas) para inducir un efecto citotóxico comparable a la bendamustina en estos ensayos. Estos hallazgos se confirmaron utilizando un ensayo con base en MTT en el cual la bendamustina tuvo una IC50 similar en células SU-DHL-1 y HL-60 en 72 horas después de la exposición al fármaco durante 30 minutos, 4 horas ó 72 horas. En comparación, el clorambucilo, melfalán y la mostaza de fosforamida exhibieron 10 a 20 veces IC50s más elevadas cuando se incubaron con estas mismas líneas celulares durante 30 minutos comparadas a exposición continua (72 horas). Los niveles de ATP intracelulares se analizaron utilizando el siguiente ensayo ATP con base en luciferasa. 10 ml de reactivo CelITiter-Glo® se mezcló con la cantidad apropiada de sustrato CelITitter-Glo (por las instrucciones del fabricante: Promega Corp.), y la mezcla se permitió equilibrar duraníe diez minulos. 100 µl de esta solución se combinó entonces con 100 µl de un medio de cultivo coníeniendo células, y la mezcla se permiíió incubar duraníe diez minuíos. Se deíecíó luminiscencia utilizando un lecíor de placas con base en CCD. Un ensayo de adenílaío cinasa (ADK) se seleccionó porque como una membrana celular de una célula íraíada pierde iníegridad, ADK se libera en el medio de culíivo (o en el contexto de una muestra biológica, en el espacio extracelular, sangre, etc. Para realizar los ensayos de ADK en placas de 96 pozos, en. cada pozo de prueba de 20 µl del sobrenadaníe a paríir de una alícuoía del medio de culíivo brevemeníe cenfrifugado a células aglomeradas se mezcló con 100 µl del reacíivo ADK (20 ml del reactivo Cambrex ToxiLight más la cantidad apropiada del sustraío Cambrex ToxiLighl por las insírucciones del fabricaníe: Cambrex Corp., NJ) que habían sido preparadas y se permiíieron equilibrar durante 15 minutos. La mezcla de reacción se incubó entonces duraníe dos minufos para permiíir que ocurriera la reacción de la cinasa. La luminiscencia a partir de las muestras se leyó entonces inmedíatamepíe en un lecíor de placas. La viabilidad celular se evaluó íambién al mezclar 20 µl de alícuoías del culíivo celular paríicular con 180 µl de Reaclivo Guava ViaCouní (Guava Technologies, Hayward.CA), se diluyó 1:10 dilución justo antes del uso. Cada mezcla se incubó entonces durante cinco minutos. Un ensayo de conteo celular ViaCount se realizó entonces " utilizando el Citómetro de Flujo Guava PC, el cual permitió que se determinara el número de células vivas por 1,000 células totales.

Células vivas contra muertas se distinguieron utilizando el tinte 7AAD, el cual puede difundir en células muertas o agonizantes a través de sus membranas celulares deterioradas. Como se describe en el Ejemplo 1, la rápida inducción del desdoblamiento de PARP (poli[ADP-ribosa]polimerasa) es un sello de muerte celular inducida por bendamustina en células NHL. El desdoblamiento de PARP máximo se observó en células SU-DHL-1 expuestas tan poco como 30 minutos a 50 µM de SDX-105, y siguiendo la remoción de fármaco, incubadas además durante 8 horas. No se observó ningún desdoblamiento de PARP en células traíadas en una manera similar durante 30 minutos con 40 µM de mostaza de fosforamida, 4 µM de clorambucilo, o 2 µM de melfalán. Las concentraciones de cada fármaco utilizado representan concentraciones equiíóxicas cuando se comparan a 50 µM de bendamuslina como se mide por un ensayo basado en MTT [bromuro de 3-(4,5-dimeíilíiazol-2-il)-2,5-difenilíetrazoilo] después de un periodo de 72 horas de exposición al fármaco. Se realizaron ensayos de MTT para titular dosis de varios fármacos que determinan las concentraciones efectivas requeridas para eliminar 50% de las células íratadas. Estos ensayos se realizaron en placas de 96 pozos. Las concentraciones representaron un máximo de 500 µM. En cada ensayo, ios controles incluyeron células no traíadas y conírol de eliminación. Para placas uíilizadas para probar células en los experimentos de "lavado", las placas se centrifugaron durante 5 minutos a células aglomeradas. El medio se removió entonces, las células aglomeradas se enjuagaron una vez con 1X de PBS, y luego se volvieron a suspender en un medio fresco. Las células se incubaron con la dosis paríicular del fármaco duraníe 3 días a 37° en una atmósfera que contiene 5.0% de CO2. Después de tres días, 10 µl dei Reactivo MTT (12 mm) (5 mg/ml de MTT (Promega) se disolvió en un medio de cultivo fresco, esterilizado por fillro, almacenado a 2-8°C) se agregó a cada pozo. Después de cuatro horas de incubación, 100 µl de regulador de pH de lisis (20% de SDS, 0.015M de HCL) se agregó a cada pozo. Las mezclas se colocaron durante la noche a 37°C en una atmósfera que contiene 5.0% de CO2 que permite a las células usarse. La siguiente mañana, el grado de lisis celular se determinó utilizando una lectura de espectrofotómetro de barrido de multipozo a 595 nm. Resultados comparables se obtuvieron traíando la línea celular HL-60 de cáncer humano con 100 µM de bendamusíina o 12 µM de clorambucilo. Periodos de exposición al fármaco fueron 30 minuíos, 1 hora ó 2.5 horas, en donde el medio de culíivo que confiene el fármaco se removió después del periodo de íiempo observado y se reemplazó con un medio fresco que no coníiene fármaco. Tomados juntos, estos resultados ilustran la única capacidad de la bendamuslina para acíivar una trayectoria de muerte celular irreversible siguiendo incluso breve incubación con células cancerosas, las cuales la distinguen de otros agentes de alquilación relacionados. Tal citofoxicidad de acción rápida confirma la actividad clínica pótenle de la bendamusíina e indica que será úíil para íratar varios cánceres, incluyendo aquellos que son resistenles a quimioferapia convencional.

Ejemplo 4 Datos Clínicos Este estudio evalúa la eficacia y toxicidad de la bendamustina en pacientes con NHL quienes han reincidido o son resistentes a regímenes previos de quimioterapia. Los pacientes resistentes a rituximab tuvieron progreso de la enfermedad en 6 meses de traíamiento. Métodos: Esta prueba de centro múlíiple de Fase II recluíó pacíeníes con células B NHL resisíeníes a rituxímab indoloras o transformadas reincideníes de 17 sifios en los. Esíados Unidos y Canadá. El fenoíipo histológico indoloro se observó en 84% de pacientes, mientras el 16% tuvo enfermedad transformada. La edad media de pacientes fue 63 años (rango: 38-84) y 88% tuvo enfermedad en Eíapa lll/IV. Los pacieníes recibieron 120 mg/m2 de bendamustina IV durante 30-60 minutos, los días 1 y 2, cada 21 días hasta por 6 ciclos. La respuesía se midió utilizando el criterio del Grupo de Trabajo Internacional. Resultados: La población determinada a tratamiento (ITT) consistió de 75 pacientes fuertemente pre-traíados con una media de 2 quimioterapias anteriores. La tasa de respuesía objeíivo ioíal (ORR) en la población ITT fue 74%; 25% íuvo una respuesía compleía, 49% íuvo una respuesía parcial, 12% tuvo una enfermedad estable, y 14% tuvo un progreso de enfermedad. De 15 pacientes quienes fueron resistentes a traíamienlo alquilador aníerior (pacienles quienes mejoraron después al menos una terapia que contiene el alquilador anterior), 10 (67%) experimentaron una respuesta objetivo a la bendamuslina. La duración mediana de respuesía fue 6.6 meses para todos los pacientes, 9.3 meses para pacientes indoloros, y 2.4 meses para pacientes transformados. Conclusiones: La bendamustina de agente único produjo respuestas objetivo durables con toxicidad aceptable, a pesar de las caracterísíicas de pronóstico desfavorable, en pacientes NHL indoloros y transformados resistentes a rituximab fuertemeníe pre-tratados, incluyendo aquellos pacientes quienes fueron resistentes también a tratamiento alquilador anterior. Aunque la invención se ha descrito con referencia a los ejemplos aníeriores, se entenderá que modificaciones y variaciones están abarcadas dentro del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, la invención se limita sólo por las reivindicaciones anexas. Todas las composiciones y métodos descritos y reclamados en la preseníe pueden hacerse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de las modalidades preferidas, será aparente por aquellos de experiencia en la técnica que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en la preseníe sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como se define por las reivindicaciones anexas. Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones mencionadas en la especificación son indicativas de los niveles de aquellos de experiencia ordinaria en la técnica a la cual la invención pertenece. Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones, incluyendo aquellas a la cual la prioridad u otro beneficio se reclaman, e incorporadas en la presente para referencia en su totalidad al mismo grado como si cada publicación individual se indicara específica e individualmente para incorporarse por referencia.. La invención descrita ilustrativameníe en la preseníe puede pracíicarse apropiadamente en la ausencia de cualquier elemento(s) no descriíos específicamente en la presente. De este modo, por ejemplo, en cada caso en la presente, cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente de" y "que consiste de" pueden reemplazarse con cualquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones las cuales se han empleado se utilizan como términos de descripción y no de limitación, y no existe intención de que en uso de tales términos y expresiones al excluir cualesquiera evidentes de las caracterísíicas mostradas y descritas o porciones de las mismas, pero puede reconocerse que varias modificaciones son posibles dentro del alcance de la invención reclamada. De este modo, se debe entender que aunque la presente invención se ha descrito específicameníe por modalidades preferidas y caracíerísticas opcionales, la modificación y variación de los conceptos en la presente descritos pueden recurrirse por aquellos expertos en la técnica, y que tales modificaciones y variaciones se consideran para estar dentro del alcance de esta invención como se define por las reivindicaciones anexas.

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar cáncer, que comprende determinar que un paciente tiene un cáncer, caracterizado células cancerosas resisteníes a mueríe, seguidas al administrar al paciente una cantidad terapéuíicamente efectiva de bendamustina.

2. El método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el cáncer es resistente a apoptosis.

3. El método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde las células cancerosas resistentes a muerte comprenden una deficiencia por p53.

4. El método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste de linfoma sin relación a Hodgkin y leucemia linfocítica crónica.

5. Un método para tratar un paciente con cáncer, que comprende administrar bendamustina, esperando al menos aproximadamente 30 minutos, pero no más de aproximadamenle 48 horas, y adminisírando otro agente o agentes quimioterapéuticos que son más activos cuando ias células están en la fase S del ciclo celular.

6. El método de acuerdo a la reivindicación 5, en donde el agente quimioterapéuíico se da alrededor de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 36 horas después de la administración de la bendamustina.

7. El método de acuerdo a la reivindicación 5, en donde el agente quimioterapéutico se da aproximadamente 30 minutos a 24 horas después de la administración de bendamustina.

8. El método de acuerdo a la reivindicación 5, en donde el agente quimioterapéutico se da aproximadamente 30 minutos a doce horas después de la administración de bendamustina.

9. El método de acuerdo a la reivindicación 5, en donde el quimioterapéutico se da aproximadamente 30 minutos a seis horas después de la administración de la bendamustina.

10. El método de acuerdo a la reivindicación 5, en donde el paciente tiene un cáncer caracterizado por células cancerosas resistentes a muerte.

11. Un método para evaluar la eficacia de un tratamienío de cáncer, que comprende deíerminar si un nivel de un marcador de mueríe de la célula cancerosa en una muestra biológica tomada de un paciente con cáncer se correlaciona con la eficacia de íratamiento, en donde la determinación se hace durante o después de la administración de un régimen terapéuíico preíendido para íratar el cáncer, en donde el régimen terapéulico comprende la administración de un agente de alquilación.

12. El método de acuerdo a la reivindicación 11, en donde el agente de alquilación es bendamustina.

13. Un método para evaluar la eficacia de un íraíamienlo de cáncer, que comprende: a. tratar un cáncer con una cantidad terapéuticamente efectiva de bendamustina; b. esperar un periodo de tiempo suficiente para permitir a la bendamustina ejercer un efecto terapéutico deseado; y c. determinar un nivel de un marcador de muerte de la célula cancerosa para determinar sí el traíamiento con bendamustina fue eficaz.

14. Un método para reducir toxicidad asociada con una terapia de cáncer que comprende administrar una pluralidad de dosis de bendamustina a un paciente con cáncer, que comprende administrar una primera dosis de una cantidad terapéuticamente efectiva de bendamustina al paciente, cuya primera dosis de bendamustina resulta en una toxicidad indeseada, y retarda la administración de una segunda dosis de una cantidad íerapéuticamente efectiva de bendamustina al paciente hasta después que la toxicidad indeseada comienza a aminorar.

15. Un método para evaluar si el cáncer de un pacieníe es suscepfible a bendamusíina, que comprende: a. exponer al menos una porción de una muesíra celular a paríir de tejido canceroso de un paciente a bendamustina bajo condiciones de crecimiento que, en ausencia de un compuesto que es tóxico a células cancerosas, permite proliferar células cancerosas; y b. evaluar si el cáncer es susceptible a exposición a bendamustina.

16. El méíodo de acuerdo a la reivindicación 15, en donde la evaluación de si el cáncer es suscepfible a exposición de bendamustina comprende determinar el nivel de un marcador de muerte de la célula cancerosa.

17. El méíodo de acuerdo a la reivindicación 16, en donde el marcador de mueríe de la célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste de un nivel de actividad de adenilato cinasa, la viabilidad de las células, y un nivel de un producto de desdoblamiento de PARP.

18. Un método para tratar cáncer, que comprende determinar que un paciente tiene un cáncer caracterizado como resisteníe a uno o más agentes de alquilación y un agente anti-CD20, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuíicameníe efectiva de bendamustina.

19. El método de acuerdo a la reivindicación 18, en donde el cáncer es linfoma sin relación a Hodgkin.

20. El método de acuerdo a la reivindicación 18, en donde el agente anti-CD20 es riluximab.

21. Un método de práctica ordinaria junto con el tratamiento de un cáncer caracterizado por células cancerosas resistentes a muerte, que comprende promover bendamustina para usarse para traíar un cáncer caracterizado por células cancerosas resistentes a muerte.

22. El método de acuerdo a la reivindicación 21, en donde el cáncer es un cáncer resistente a un tratamiento que comprende una combinación de uno o más agentes de alquilación y un agente anti-CD20.

23. Un método de práctica ordinaria junto con el tratamiento de un cáncer resistente, que comprende promover el uso de bendamustina para tratar un cáncer resistente al tratamiento.

24. El método de acuerdo a la reivindicación 23, en donde el cáncer resisteníe es un cáncer resistente al traíamiento con una combinación de uno o más agentes de alquilación y un agente anti-CD20.

25. El uso de bendamustina en la fabricación de un medicamento para el tralamiento de un cáncer caracterizado por células cancerosas resistentes a muerte.

26. El uso de bendamustina en la fabricación de un medicamento para tratamiento de un cáncer resistente al tratamiento.

27. El uso de acuerdo a la reivindicación 26, en donde el cáncer resistente es un cáncer resistente a tratamiento con una combinación de uno o más agentes de alquilación y un agente anti-CD20.