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MX2007003400A - Composicion inmunogena. - Google Patents

Composicion inmunogena.

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Publication number
MX2007003400A
MX2007003400A MX2007003400A MX2007003400A MX2007003400A MX 2007003400 A MX2007003400 A MX 2007003400A MX 2007003400 A MX2007003400 A MX 2007003400A MX 2007003400 A MX2007003400 A MX 2007003400A MX 2007003400 A MX2007003400 A MX 2007003400A
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MX
Mexico
Prior art keywords
protein
immunogenic composition
staphylococcal
transporter
alpha toxin
Prior art date
Application number
MX2007003400A
Other languages
English (en)
Inventor
Cindy Castado
Nicolas Pierre Fernand Lecrenier
Cecile Anne Neyt
Jan Poolman
Original Assignee
Glaxosmithkline Biolog Sa
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Filing date
Publication date
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Priority claimed from GB0421082A external-priority patent/GB0421082D0/en
Priority claimed from GB0421079A external-priority patent/GB0421079D0/en
Priority claimed from GB0421078A external-priority patent/GB0421078D0/en
Priority claimed from GB0503143A external-priority patent/GB0503143D0/en
Application filed by Glaxosmithkline Biolog Sa filed Critical Glaxosmithkline Biolog Sa
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Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones inmunogenas que contienen PNAG estafilococica y polisacarido capsular de tipo 5 y/o de tipo 8, u oligosacarido de S. Aureus. Tambien se describen vacunas, metodos de tratamiento utilizados y procesos para elaborar una composicion inmunogena que contiene PNAG y polisacaridos capsulares de tipo 5 y/o de tipo 8.

Description

COMPOSICIÓN INMUNOGENA Campo técnico La presente invención se refiere al campo de composiciones y vacunas inmunógenas, a su fabricación y al uso de estas composiciones en medicina. Más particularmente, se refiere a composiciones de vacuna que contienen polisacárido PNAG (PÍA) y polisacáridos de tipo 5 y/o de tipo 8 de S. aureus. También se proporcionan métodos para el tratamiento o prevención de infecciones por estafilococos usando estas vacunas. Antecedentes de la invención La cantidad de infecciones adquiridas en la comunidad y de infecciones adquiridas en el hospital ha aumentado en años recientes con el aumento de dispositivos ¡ntravasculares. Las infecciones adquiridas en hospitales (nosocomiales) son una causa principal de morbilidad y de mortalidad, más particularmente en Estados Unidos, en donde afectan a más de 2 millones de pacientes anualmente. Después de diversos estudios, se ha determinado que aproximadamente el 6 por ciento de los pacientes estadounidenses adquirirán una infección durante su estancia en el hospital. La carga económica en Estados Unidos se estimó en más de 4.5 billones de dólares en 1992 (Emori y Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428). Las infecciones más frecuentes son infecciones del tracto urinario (UTI-33% de las infecciones), seguidas por neumonía (15.5%), infecciones en sitio quirúrgico (14.8%) e infecciones primarias de la corriente sangu ínea (13%) Emori y Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428) . Staphylococcus aureus, los estafilococos negativos a la Coagulasa (mayormente Staphylococcus epidermidis), enterococcus spp, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa son los patógenos nosocomiales principales. Si bien estos patógenos casi ocasionan la misma cantidad de infecciones, la gravedad de los trastornos que pueden producir combinada con la frecuencia de aislados resistentes a antibióticos, mueve la balanza en esta clasificación hacia S. aureus y S. epidermidis como los patógenos nosocomiales más significativos. El Staphylococcus aureus es la causa más común de infecciones nosocomiales con una morbilidad y una mortalidad significativas (Romero-Vivas ef al 1995, Infect. Dis. 21 ; 1417). Es la causa de algunos casos de osteomielitis, endocarditis, artritis séptica, neumonía, abcesos y síndrome de shock tóxico. El S. epidermidis es un comensal normal en la piel que también es un patógeno oportuno responsable de infecciones de dispositivos médicos implantados y de infecciones en lugares donde se realiza cirug ía. Los dispositivos médicos infectados por S. epidermidis incluyen estimuladores cardiacos, derivaciones para fluido cerebroespinal, catéteres para diálisis peritoneal ambulatoria continua, dispositivos ortopédicos y válvulas cardiacas prostésicas. Las infecciones con S. aureus y S. epidermidis se tratan con antibióticos, siendo la penicilina el fármaco de elección, mientras que la vancomicina se usa para los aislados resistentes a la meticilina. El porcentaje de cepas estafilocócicas que muestran resistencia de amplio espectro a los antibióticos se ha generalizado y está en aumento desde los años 80. (Panlilo ef al 1992, Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 13; 582), lo que supone una amenaza para la terapia antimicrobiana efectiva. Además, la reciente aparición de la cepa de S. aureus resistente a la vancomicina ha dado lugar al temor de que las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina aparezcan y se extiendan, para las cuales no hay disponible una terapia efectiva. Un enfoque alternativo podría ser el uso de la vacunación activa para generar una respuesta inmunológica contra los estafilococos. Varios candidatos para su inclusión como componentes de vacunas han sido identificados. Estos incluyen proteína fijadora de fibronectina (US5840846), análogo de MHC II (US5648240), proteína fijadora de fibrinógeno (US6008341), GehD (US 2002/0169288), proteína fijadora de colágeno (US6288214), SdrF, SdrG y SdrH (WO 00/12689), exotoxinas mutantes SEA y SEB (WO 00/02523) y proteína fijadora de fibronectina de 52kDa (WO 01/60852). El genoma del S. aureus ha sido secuenciado y muchas de las secuencias codificadoras han sido identificadas (EP786519, WO02/094868). Lo mismo es cierto para S. epidermidis (WO 01/34809). Como un refinamiento de este enfoque, otros han identificado proteínas que son reconocidas por los sueros hiperinmunitarios de pacientes que han sufrido de infección por estafilococos (WO01/98499, WO 02/059148). La primera generación de vacunas dirigidas contra S. aureus o contra las exoproteínas que éste produce, han tenido éxito limitado (Lee 1996 Trends Microbiol. 4; 162). Todavía permanece una necesidad de desarrollar vacunas efectivas contra infecciones por estafilococos. Descripción de las figuras Figura 1 - Secuencias de polipéptidos de proteínas preferidas. La Tabla 1 proporciona información acerca de cuál proteína está representada por cada SEQ ID. Figura 2 - Secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas preferidas. La Tabla 1 proporciona información sobre qué proteína está codificada por cada SEQ ID. Figura 3 - Purificación de toxina alfa bajo condiciones naturales. El panel A muestra un SDS-PAGE de muestras preparadas durante la purificación de la toxina alfa. Línea 1 -marcadores de peso molecular, línea 2 - fracción soluble que contiene toxina alfa sobre-expresada, línea 3 - flujo a través de la columna de Ni-NTA, línea 4 - fracciones eluidas con 10% de regulador de pH B, línea 5 - fracciones eluidas con 20% de regulador de pH B, línea 6 - fracciones eluidas con 30% de regulador de pH B, línea 7 - fracciones eluidas con 50% de regulador de pH B, línea 8 -fracciones eluidas con 75% de regulador de pH B, línea 9 y 10 fracciones eluidas con 100% de regulador de pH B, línea 11 bacterias en T=0 antes de la inducción, línea 12 - bacterias en T=4 horas después de la inducción, línea 13 - lisado de células, línea 14 - fracción soluble, línea 15 - fracción insoluble. El panel B muestra un SDS-PAGE teñido con Coomassie de 10, 5, 2 y 1µL de la toxina alfa purificada. Figura 4 - Purificación de condiciones desnaturalizantes de SdrC. El panel A muestra un SDS-PAGE teñido con Coomassie de muestras preparadas durante la purificación de la toxina alfa. Línea M - marcadores de peso molecular, línea Inicio - supernadante formado a partir de la fracción insoluble que contiene SdrC sobre-expresado, línea FT1 - flujo a través de la columna Ni-NTA, línea C -fracciones eluidas con regulador de pH para lavado C, línea D -fracciones eluidas con regulador de pH D, línea E - fracciones eluidas con regulador de pH E. Panel B muestra un SDS-PAGE teñido con Coomassie de 1, 2, 5 y 10µL del SdrC purificado. Figura 5 - Resultados de ELISA para antisuero con proteínas estafilocócicas en placas recubiertas con proteínas purificadas Ratones agrupado pre - resultado usando sueros agrupados extraídos de ratones antes de la inoculación. Ratones agrupado post lll - resultado usando sueros de ratón agrupados extraídos después de la inmunización. Conejo agrupado pre - resultado usando sueros agrupados extraídos de conejos antes de la inoculación. Conejo agrupado post lll - resultado usando sueros de conejo agrupados extraídos después de la inmunización. Ble- control negativo. Figura 6 - Resultados de ELISA para antisuero de ratón cultivado contra proteínas estafilocócicas en placas recubiertas con estafilococos muertos. El panel A usa placas recubiertas con células enteras muertas con serotipo 5 de S. aureus. El panel B usa placas recubiertas con células enteras muertas con serotipo 8 de S. aureus. El panel C usa placas recubiertas con células enteras muertas de S. epidermidis. La línea marcada con símbolos cuadrados muestra el resultado de ELISA usando antisuero de ratones inmunizados tres veces con la proteína estafilocócica indicada. La línea marcada con símbolos romboidales muestra el resultado de ELISA para los sueros de ratones inmunizados previamente. Figura 7 - Resultados de ELISA para antisuero de conejo cultivado contra proteínas estafilocócicas en placas recubiertas con estafilococos muertos. El panel A usa placas recubiertas con células enteras muertas con serotipo 5 de S. aureus. El panel B usa placas recubiertas con células enteras muertas con serotipo 8 de S. aureus. El panel C usa placas recubiertas con células enteras muertas de S. epidermidis. La línea marcada con símbolos cuadrados muestra el resultado de ELISA usando antisueros de ratones inmunizados tres veces con la proteína estafilocócica indicada (excepto para HarA, en donde sólo se administró una inmunización). La línea marcada con símbolos de diamante muestra los resultados de ELISA para los sueros de conejos inmunizados previamente. Descripción detallada de la invención La presente invención describe combinaciones particulares de antígenos estafilocócicos que cuando se combinan, conducen a la producción de una composición inmunógena para tratar o para prevenir infección estafilocócica. Las composiciones inmunógenas de la invención incorporan PNAG (PÍA) y polisacáridos tipo 5 y/o tipo 8 de S. aureus. Esta combinación de antígenos es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria contra una gama de infecciones estafilocócicas. El PNAG (PÍA) es conservado entre bacterias Gram positivas, y proporciona protección contra una amplia gama de bacterias, mientras que los polisacáridos de tipo 5 y de tipo 8 son potentes inmunógenos que desencadenan una respuesta inmunitaria contra la mayoría de las cepas de S. aureus que son la causa más común de infecciones nosocomiales. Polisacáridos Las composiciones inmunógenas de la invención contienen PÍA (también conocido como PNAG) y polisacáridos de tipo 5 y de tipo 8 de S. aureus. PÍA (PNAG) Está claro ahora que las diversas formas de polisacáridos estafilocócicos superficiales identificados como PS/A, PÍA y SAA son la misma entidad química - PNAG (Maira-Litran et al Vacuna 22; 872-879 (2004)). por lo tanto, el término PÍA o PNAG comprende todos estos polisacáridos u oligosacáridos que provienen de ellos. El PÍA es una adhesina intracelular polisacárida, y está compuesto de un polímero de glucosamína ß-(1-?6)-ligada sustituida con constituyentes N-acetilo y O-succinilo. Este polisacárido está presente tanto en S. aureus como en S. epidermidis y puede ser aislado de cualquier fuente (Joyce et al 2003, Carbohydrate Research 338; 903; Maira-Litran ef al 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Por ejemplo, el PNAG puede ser aislado de la cepa MN8m de S. aureus (WO 04/43407). El PÍA aislado de S. epidermidis es un constituyente integral de biopelícula. Es responsable de mediar la adhesión célula-célula y probablemente también funciona para proteger la colonia en crecimiento de la respuesta inmunitaria del anfitrión. Recientemente se demostró que el polisacárido conocido previamente como poli-N-succinil-ß-(1 — >6)-glucosamina (PNSG) no tiene la estructura esperada dado que la identificación de la N-succinilación era incorrecta (Maira-Litran ef al 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Por lo tanto el polisacárido conocido formalmente como PNSG y que ahora se encuentra que es PNAG también está comprendido en el término PÍA. El PÍA (o PNAG) puede tener tamaños diferentes que varían desde 400 kDa hasta entre 75 y 400 kDa hasta entre 10 y 75 kDa para oligosacáridos compuestos de hasta 30 unidades de repetición (de glucosamina ß-(1?6)-ligada sustituida con constituyentes N-acetilo y O-succinilo). Cualquier tamaño de polisacárido PÍA u oligosacárido puede usarse en una composición inmunógena de la invención, sin embargo se prefiere un tamaño de más de 40 kDa. El tamaño se puede lograr mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo mediante micro fluidización, irradiación ultrasónica o mediante escisión química (WO 03/53462, EP497524, EP497525). Los rangos de tamaño preferidos de PÍA (PNAG) son 40-400 kDa, 50-350 kDa, 40-300 kDa, 60-300 kDa, 50-250 kDa y 60-200 kDa. El PÍA (PNAG) puede tener grados de acetilación diferentes debido a la sustitución en los grupos amino por acetato. El PÍA producido en vitro está casi sustituido en los grupos amino (95-100%). De manera alternativa, se puede usar un PÍA (PNAG) desacetilado que tenga menos de 60%, preferiblemente menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 10% de acetilación. El uso de un PÍA (PNAG) desacetilado se prefiere, dado que los epítopos no acetílados del PNAG son eficientes para mediar la eliminación opsónica de las bacterias Gram positivas, preferiblemente S. aureus y/o S. epidermidis. Mucho más preferiblemente, el PÍA (PNAG) tiene un tamaño de entre 40 kDa y 300 kDa y está desacetilado de manera que menos de 60%, 50%, 40%, 30% o 20% de los grupos amino están acetilados. El término PNAG desacetilado (dPNAG) se refiere a un polisacárido u oligosacárido PNAG en el cual menos de 60%, 50%, 40%, 30%, 20% o 10% de los grupos amino están acetilados. En una modalidad, el PNAG es desacetilado para formar dPNAG tratando químicamente el polisacárido natural. Por ejemplo, el PNAG natural se trata con una solución básica, de tal forma que el pH aumente a más de 10. Por ejemplo el PNAG se trata con OJ-5 M, 0.2-4 M, 0.3-3 M, 0.5-2 M, 0.75-1.5 M o 1 M de NaOH, KOH o NH4OH. El tratamiento es durante al menos 10 o 30 minutos, o 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 o 20 horas a una temperatura de 20-100, 25-80, 30-60 o 30-50 o 35-45 °C. dPNAG se puede preparar como se describe en WO 04/43405. El o los polisacáridos incluidos en la composición inmunógena de la invención preferiblemente están conjugados con una proteína portadora como se describe más adelante o de manera alternativa, no están conjugados. Polisacáridos tipo 5 y tipo 8 de S. aureus La mayoría de las cepas de S. aureus que ocasionan infección en el hombre contiene polisacáridos de tipo 5 o de tipo 8.
Aproximadamente 60% de las cepas humanas son de Tipo 8 y aproximadamente 30% son de Tipo 5. Las estructuras de los antígenos polisacáridos capsulares de tipo 5 y tipo 8 se describen en Moreau et al Carbohydrate Res. 201 ; 285 (1990) y Foumier ef al Infect. Immun. 45; 87 (1984). Ambas tienen FucNAcp en su unidad de repetición, así como también ManNAcA, lo que puede usarse para introducir un grupo sulfhidrilo. Tipo 5 -?4)-ß-D-ManNAcA(3OAc)-(1?4)-a-L-FucNAc(1?3)-ß-D-FucNAc-(1 ? Tipo 8 ?3)-ß-D-ManNAcA(4OAc)-(1?3)-a-L-FucNAc(1?3)-ß-D- FucNAc-(1 ? Recientemente (Jones Carbohydrate Research 340, 1097-1106 (2005)) la espectroscopia con NMR produjo una revisión de las estructuras así: Tipo 5 ?4)-ß-D-ManNAcA-(1?4)-a-L-FucNAc(3OAc)-(1?3)-ß-D-FucNAc-(1 ? Tipo 8 ?3)-ß-D-ManNAcA(4OAc)-(1?3)-a-L-FucNAc(1?3)-a-D-FucNAc(1 ? Los polisacáridos pueden ser extraídos de la cepa apropiada de S. aureus usando métodos que son familiares para el conocedor de la materia, por ejemplo como se describe en US6294177. Por ejemplo, ATCC 12902 es una cepa de S. aureus Tipo 5 y ATCC 12605 es una cepa de S. aureus Tipo 8. Los polisacáridos son de tamaño natural, o de manera alternativa, pueden ser dimensionados, por ejemplo mediante micro fluidización, irradiación ultrasónica o mediante tratamiento químico.
La invención también cubre oligosacáridos provenientes de los polisacáridos tipo 5 y tipo 8 de S. aureus. Los polisacáridos tipo 5 y tipo 8 incluidos en la composición inmunógena de la invención preferiblemente están conjugados con una proteína portadora como se describe más adelante o de manera alternativa, no están conjugados. La composición inmunógenas de la invención de manera alternativa, contiene polisacárido de tipo 5 o de tipo 8. Antígeno 336 de S. aureus En una modalidad, la composición inmunógena de la invención contiene el antígeno 336 de S. aureus que se describe en US 6294177. El antígeno 336 contiene hexosamina ß-ligada, no contiene grupos O-acetilo y específicamente se fija a anticuerpos para S. aureus Tipo 336 depositados bajo ATCC 55804. En una modalidad, el antígeno 336 es un polisacárido que es de tamaño natural o de manera alternativa, puede ser dimensionado, por ejemplo mediante micro fluidización, irradiación ultrasónica o mediante tratamiento químico. La invención también cubre oligosacáridos provenientes del antígeno 336. El antígeno 336, cuando se incluye en la composición inmunógena de la invención preferiblemente está conjugado con una proteína portadora como se describe más adelante, o de manera alternativa, no están conjugados. Polisacáridos de tipo I. II y lll de S. epidermidis. Las cepas ATCC-31432, SE-360 y SE-10 de S. epidermidis, son características de tres tipos capsulares diferentes, I , II y l l l respectivamente (Ichiman y Yoshida 1981 , J . Appl. Bacteriol. 51 ; 229). Los polisacáridos capsulares extraídos de cada serotipo de S. epidermidis constituyen polisacáridos de Tipo I , II y l l l . Los polisacáridos se pueden extraer mediante varios métodos, incluyendo el método que se describe en US4197290 o como se describe en Ichiman et al 1991 , J . Appl. Bacteriol. 71 ; 176. En una modalidad de la invención , la composición inmunógena contiene polisacáridos u oligosacáridos de tipo I y/o I I y/o l l l de S. epidermidis. Los polisacáridos son de tamaño natural o de manera alternativa , pueden ser dimensionados, por ejemplo mediante micro fluidización , irradiación ultrasónica o escisión qu ímica . La invención también cubre oligosacáridos extraídos de cepas de S. epidermídis.
Estos polisacáridos no están conjugados, o preferiblemente están conjugados como se describe más adelante. Conjugación de polisacáridos Entre los problemas asociados con el uso de polisacáridos en vacunación, el hecho es que los polisacáridos per se son inmunógenos deficientes. Las estrategias que se han diseñado para superar esta falta de inmunogenicidad, incluyen en enlace del polisacárido a proteínas portadoras grandes, que proporcionan ayuda de células T presenciales. Se prefiere que los polisacáridos utilizados en la invención estén ligados con una proteína portadora que proporcione ayuda de células T presenciales. Los ejemplos de estos portadores que se usan actualmente para acoplarse a inmunógenos polisacáridos u oligosacáridos incluyen los toxoides de Difteria y Tétano (DT, DT Crm 197 y TT), Hemocianina de lapa californiana (KLH), exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) y el derivado de proteína purificado de Tuberculina (PPD) , proteína D de Haemophilus influenzae, neumolisina o fragmentos de cualquiera de los anteriores. Los fragmentos apropiados para su uso incluyen fragmentos que contienen epítopos de células T auxiliares. En particular, el fragmento de proteína D preferiblemente contendrá el terminal N 1/3 de la proteína. La proteína D es una proteína fijadora con IgD de Haemophilus influenzae (EP 0594610 B1). A pesar del uso común de estos portadores y su éxito en la inducción de respuestas de anticuerpo anti polisacáridos, están asociados con varias desventajas. Por ejemplo, se sabe que las respuestas inmunitarias específicas para el antígeno pueden ser suprimidas por la presencia de anticuerpos preexistentes dirigidos contra el portador, en este caso la toxina tetánica (Di John et al; Lancet, 16 de diciembre, 1989). En la población, un porcentaje muy grande de personas tendrán inmunidad pre-existente tanto a DT como a TT, dado que la gente se vacuna rutinariamente con estos antígenos. En el Reino Unido, por ejemplo, 95% de los niños reciben la vacuna de DTR, que contiene tanto DT como TT. Otros autores han descrito el problema de la supresión de epítopo para vacunas péptidas en modelos animales. (Sad et al, Immunology, 1991 ; 74:223-227; Schutze et al, J. Immunol. 135: 4, 1985; 2319-2322). El KLH se conoce como un potente inmunógeno y ya ha sido usado como un portador para péptidos IgE en pruebas clínicas en seres humanos. Sin embargo, se ha observado algunas reacciones adversas (reacciones similares a DTH o sensibilización a IgE) así como también respuestas de anticuerpo contra anticuerpo. Una proteína portadora alternativa para su uso en la composición inmunógena de la invención es una proteína estafilocócica sola o un fragmento de ella, o una proteína de fusión que contiene al menos o exactamente 1, 2, 3 o 4 o más de las proteínas estafilocócicas enumeradas en la siguiente sección, o fragmentos de ellas. Una nueva proteína portadora que podría ser particularmente ventajosa para su uso en el contexto de una vacuna estafilocócica es el toxoide alfa estafilocócico. La forma natural puede estar conjugada con un polisacárido, dado que el proceso de conjugación reduce la toxicidad. Preferiblemente se usa una toxina alfa destoxificada genéticamente, tal como las variantes His35Leu o His 35 Arg como portadores, dado que la toxicidad residual es menor. De manera alternativa, la toxina alfa es destoxificada químicamente mediante tratamiento con un reactivo reticulante, formaldehido o glutaraldehído. Una toxina alfa destoxificada genéticamente es destoxificada químicamente de manera opcional, preferiblemente mediante tratamiento con un reactivo reticulante, formaldehido o glutaraldehído para reducir aún más la toxicidad. Otras proteínas estafilocócicas o fragmentos de ellas, particularmente las que se mencionan aquí anteriormente, se pueden usar como proteína portadora para los polisacáridos enumerados antes. La proteína portadora puede ser una proteína de fusión que contiene al menos o exactamente 1, 2, 3, 4 o 5 de las proteínas estafilocócicas enumeradas anteriormente. Los polisacáridos pueden ser ligados a la proteína o proteínas portadoras mediante cualquier método conocido (por ejemplo, mediante Likhite, patente estadounidense número 4,372,945 de Armor ef al., patente estadounidense número 4,474,757, y Jennings ef al., patente estadounidense número 4,356,170). Preferiblemente se lleva a cabo la química de conjugación CDAP (véase WO95/08348). En la CDAP, el reactivo cianilante tetrafluoroborato de 1-ciano-dimetilaminopiridinio (CDAP) preferiblemente se usa para la síntesis de conjugados de polisacárido-proteína. La reacción de cianilación puede realizarse bajo condiciones relativamente suaves, lo que permite la hidrólisis de los polisacáridos sensibles a la alcalinidad. Esta síntesis permite acoplamiento directo con una proteína portadora. El polisacárido puede ser solubilizado en agua o en una solución salina. El CDAP se puede disolver en acetonitrilo y añadirse inmediatamente a la solución de polisacárido. El CDAP reacciona con los grupos hidroxilo del polisacárido para formar un éster de cianato. Después del paso de activación, se añade la proteína portadora. Los grupos amino de lisina reaccionan con el polisacárido activado para formar un enlace covalente isourea. Después de la reacción de acoplamiento, se le añade un gran excedente de glicina para extinguir los grupos funcionales residuales activados. Luego se hace pasar el producto a través de una columna de permeación de gel para eliminar la proteína portadora y los reactivos residuales que no reaccionaron.
Proteínas La composición inmunógena de la invención preferiblemente contiene además una proteína estafilocócica, más preferiblemente una proteína de S. aureus o de S. epidermidis. Algunas modalidades de la invención contienen proteínas tanto de S. aureus como de S. epidermidis. Las composiciones inmunógenas de la invención incluyen una proteína aislada que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad , preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad , mucho más preferiblemente al menos 97-99% o identidad exacta con la de cualquier secuencia de la figura 1 . Cuando se menciona específicamente una proteína aquí , preferiblemente es una referencia a una proteína de longitud completa, natural o recombinante, u opcionalmente una proteína madura en la cual se ha eliminado cualquier secuencia de señal. La proteína puede ser aislada directamente de la cepa estafilocócica o producida mediante técnicas de ADN recombinante. Se puede incorporar fragmentos inmunógenos de la proteína en la composición inmunógena de la invención . Estos son fragmentos que contiene al menos 10 aminoácidos, preferiblemente 20 aminoácidos, más preferiblemente 30 aminoácidos, más preferiblemente 40 aminoácidos o 50 aminoácidos, mucho más preferiblemente 100 aminoácidos, tomados de manera contigua de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Además, estos fragmentos inmunógenos típicamente son reactivos inmunológicamente con los anticuerpos generados contra la proteínas estafilocócicas o con los anticuerpos generados mediante infección de un anfitrión mamífero con estafilococos o contienen epítopos de células T. Los fragmentos inmunógenos también incluyen fragmentos que cuando se administran en una dosis efectiva , (ya sea solos o como un hapteno unido a un portador), desencadenan una respuesta inmunitaria protectora contra la infección estafilocócica, más preferiblemente es protector contra infección por S. aureus y/o S. epidermidis. Un fragmento inmunógeno como este puede incluir, por ejemplo, la proteína que carece de una secuencia guía en el terminal N , y/o un dominio transmembrana y/o un dominio ancla en el terminal C . En un aspecto preferido, el fragmento inmunógeno de acuerdo con la invención contiene sustancialmente todo el dominio extracelular de una proteína que tiene al menos 85% de identidad , preferiblemente al menos 90% de identidad , más preferiblemente al menos 95% de identidad , mucho más preferiblemente al menos 97-99% de identidad , con la de la secuencia seleccionada de la Figura 1 en la longitud completa de la secuencia del fragmento. En una modalidad , las composiciones inmunógenas de la ¡nvención pueden contener proteínas de fusión de proteínas estafilocócicas, o fragmentos de proteínas estafilocócicas. Estas proteínas de fusión se pueden elaborar de manera recombinante, y pueden contener una porción de al menos 2, 3, 4, 5 o 6 proteínas estafilocócicas. De manera alternativa, una proteína de fusión puede contener múltiples porciones de al menos 2, 3, 4 o 5 proteínas estafilocócicas. Estas pueden combinar diferentes proteínas estafilocócicas o fragmentos de ellas en la misma proteína. De manera alternativa, la invención también incluye proteínas de fusión individuales de proteínas estafilocócicas o fragmentos de ellas, como una proteína de fusión con secuencias heterólogas tal como una proveedora de epítopos de células T o etiquetas de purificación, por ejemplo: ß-galactosidasa, glutatión-S-transferasa, proteína verde fluorescente (GFP), etiquetas de epítopo tales como FLAG , etiqueta myc, poli histidina , o proteínas superficiales virales tales como hemaglutinina del virus de la influenza, o proteínas bacterianas tales como toxoide tetánico, toxoide diftérico, CRM 197. Proteínas En una modalidad , la composición inmunógena de la invención contiene además una o más de las proteínas mencionadas más adelante. Muchas de las proteínas preferidas caen en las categorías de proteínas fijadoras de componente extracelular, proteínas transportadoras o toxinas y reguladores de virulencia. La composición inmunógena de la invención además contiene opcionalmente a proteína fijadora de componente extracelular estafilocócica o una proteína transportadora estafilocócica o una toxina estafilocócica o regulador de virulencia. La composición inmunógena de la invención contiene opcionalmente al menos o exactamente 1 , 2, 3, 4, 5 o 6 proteínas estafilocócicas. Tabla 1 La siguiente tabla presenta los números de SEQ I D de las secuencias de proteína y de las secuencias de ADN q ue se encuentran en la Figura 1 y en la Figura 2 respectivamente. SA indica u na secuencia de S. aureus y SE indica una secuencia de S. epidermidis.
Proteínas fijadoras de componente extracelular Las proteínas fijadoras de componente extracelular son proteínas que se unen a componentes extracelulares del anfitrión. El término incluye las adhesinas, pero no se limita a ellas. Los ejemplos de proteínas fijadoras de componente extracelular incluyen receptor de laminina (Naidu ef al J. Med. Microbiol. 1992, 36; 177), proteína fijadora de SitC/MntC/saliva (US5801234, Wiltshire y Foster Infec. Immun. 2001, 69; 5198), EbhA (Williams et al Infect. Immun. 2002, 70; 6805), EbhB, Proteína fijadora de elastina (EbpS) (Park et al 1999, J. Biol. Chem.274; 2845), EFB (FIB) (Wastfelt y Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347), SBI (Zhang ef al FEMS Immun. Med. Microbiol. 2000, 28; 211), autolisina (Rupp et al 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), ClfA (US6008341, McDevitt ef al Mol. Microbiol. 1994, 11 ; 237), SdrC, SdrG (McCrea ef al Microbiology 2000, 146; 1535), SdrH (McCrea et al Microbiology 2000, 146; 1535), Lipasa GehD (US2002/0169288), SasA, FnbA (Flock ef al Mol Microbiol. 1994, 12; 599, US6054572), FnbB (WO 97/14799, Booth ef al 2001 Infec. Immun.69; 345), proteína fijadora de colágeno Cna (Visai ef al 2000, J. Biol. Chem. 275; 39837), ClfB (WO 99/27109), FbpA (Phonimdaeng et al 1988 J. Gen MicrobioM34; 75), Npasa (Flock 2001 J. Bacteriol. 183; 3999), IsaA/PisA (Lonenz ef al FEMS Immuno. Med. Microbiol. 2000, 29; 145), SsaA (Lang ef al FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29; 213), EPB (Hussain y Hermann Simposio en Staph Dinamarca 14-17 2000), SSP-1 (Veenstra ef al 1996, J. Bacteriol. 178; 537), SSP-2 (Veenstra ef al 1996, J. Bacteriol. 178; 537), proteína fijadora de heparina HBP de 17 kDA (Fallgren et al 2001, J. Med. Mícrobiol. 50; 547), proteína fijadora de vitronectina (Li ef al 2001, Curr. Microbiol. 42; 361 ), proteína fijadora de fibrinógeno, coagulasa, Fig (WO 97/48727) y MAP (US5648240) Proteína fijadora de SitC/MntC/saliva Esta es una proteína transportadora ABC, la cual es un homólogo de adhesina PsaA en S. pneumoniae. Es una lipoproteína altamente inmunógena de 32 kDa que está distribuida en la pared celular bacterial (Cockayne ef al Infect. Immun. 1998 66; 3767). Se expresa en S. aureus y S. epidermidis como una lipoproteína de 32 kDa y un homólogo de 40 kDa está presente en S. hominis. En S. epidermidis, es un componente de un operón regulado por hierro. Muestra considerable homología con ambas adhesinas, incluyendo FimA de Streptococcus parasanguis, y con lipoproteínas de una familia de transportadores ABC con funciones de transporte de ion metálico probadas o supuestas. Por lo tanto la SitC está incluida como una proteína fijadora extracelular y como un transportador de ion metálico. La proteína fijadora de saliva descrita en US 5,801,234 también es una forma de SitC y puede ser incluida en una composición inmunógena de la invención. ClfA y ClfB Ambas de estas proteínas tienen actividad fijadora de fibrinógeno y impulsan la formación de agrupamientos de S. aureus en la presencia de plasma. Ellas contienen un motivo LPXTG común a las proteínas asociadas a la pared. La ClfA es como se describe en US6008341 y la ClfB es como se describe en WO 99/27109. Coagulasa (FbpA) Esta es una proteína fijadora de fibrinógeno que impulsa la formación de agrupamientos de S. aureus en la presencia de plasma. Es como se describe en las referencias relacionadas con la coagulasa : Phonimdaeng ef al (J. Gen. Microbio. 1988, 134:75-83), Phonimdaeng ef al. (Mol Microbiol 1990; 4:393- 404), Cheung et al. (Infect Immun 1995; 63:1914-1920) y Shopsin et al. (J. Clin. Microbiol.2000; 38:3453-3456). Los fragmentos preferidos para su inclusión en la composición inmunógena de la invención incluyen la proteína madura en la cual el péptido señal ha sido eliminado (aminoácidos 27 hasta el término C).
La coagulasa tiene tres dominios distintos. Los aminoácidos 59-297 que forman una región en doble espiral, los aminoácidos 326- 505 que son una región rica en prolina y en glicina y el dominio del terminal C desde el aminoácido 506 hasta el 645, el cual tiene una conformación en lámina beta. Cada uno de estos dominios es un fragmento que puede ser incorporado en la composición inmunógena de la invención. SdrG Esta proteína está descrita en WO 00/12689. La SdrG se encuentra en los estafilococos negativos a la coagulasa, y es una proteína asociada a la pared celular, que contiene una secuencia LPXTG. La SdrG contiene un péptido señal (aminoácidos 1-51 ), una región que contiene sitios de fijación de fibrinógeno y sitios de fijación de colágeno (aminoácidos 51-825), dos dominios CnaB (aminoácidos 627-698 y 738-809), una región de repetición de SD(aminoácidos 825-1000) y un dominio ancla (aminoácidos 1009- 1056). Los fragmentos preferidos de SdrG incluyen polipéptidos en los cuales el péptido señal y/o las repeticiones de SD y el dominio ancla han sido eliminados. Estos incluyen polipéptidos que contienen o que consisten en aminoácidos 50-825, aminoácidos 50-633, aminoácidos 50-597 (SEQ ID NO 2 de WO 03/76470), aminoácidos 273-597 (SEQ ID NO 4 de WO 03/76470), aminoácidos 273-577 (SEQ ID NO 6 de WO 03/76470) aminoácidos 1-549, aminoácidos 219-549, aminoácidos 225-549, aminoácidos 219-528, aminoácidos 225-528 de SEQ ID NO: 70 o 20 o 21. Preferiblemente, un polipéptido SdrG que tiene una secuencia con al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% de homología con la secuencia de SEQ ID NO: 70, 20 o 21 está incorporado en la composición inmunógena de la invención. Las composiciones de la invención opcionalmente contienen un fragmento de los polipéptidos SdrG descritos anteriormente. Los fragmentos preferidos tienen el péptido señal y/o el dominio de repetición de SD y/o el dominio ancla eliminado. Por ejemplo, las secuencias que corresponden a los aminoácidos 1-713, 1-549, 225-549, 225-529, 24-717, 1-707, 1-690, 1-680, 1-670, 1-660, 1-650, 1-640, 1-630, 1-620, 1-610, 1-600, 34-707, 44-697, 36-689 de SEQ ID 70 o las secuencias que tienen 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la SEQ ID 70 o 20 o 21. Los fragmentos preferidos con el péptido señal eliminado tienen un residuo metionina en el término N del fragmento para asegurar la traducción correcta. Un fragmento más preferido tiene la siguiente secuencia: MEENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVINNNQSINTDD NNQIIKKEETNNYDGIEKRSEDRTESTTNVDENEATFLQKTPQDNTHLT EEEVKESSSVESSNSSIDTAQQPSHTTINREESVQTSDNVEDSHVSDF ANSKIKESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPEGYTNIDEKISNQDE LLNLPINEYENKARPLSTTSAQPSIKRVTVNQLAAEQGSNVNHLIK VTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKN TVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKA HLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTAN LQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEGST IIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNN NDVNINFGNIDSPYIIKVISKYDPNKDDYTTIQQTVTMQTTINEYTGEFRT ASYDNTIAFSTSSGQGQGDLPPEKTYKIGDYVWEDVDKDGIQNTNDNE KPLSNVLVTLTYPDGTSKSVRTDEDGKYQFDGLKNGLTYKITFETPEGY TPTLKHSGTNPALDSEGNSVWVTINGQDDMTIDSGFYQTPKYSLGNY VWYDTNKDGIQGDDEKGISGVKVTLKDENGNIISTTTTDENGKYQ FDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDSGDDDEQDADGEEV'HVTITDHDD FSIDNGYYDDE EbhA y EbhB EbhA y EbhB son proteínas que se expresan tanto en S. aureus como en S. epidermidis (Clarke y Foster Infect. Immun. 2002, 70; 6680, Williams et al Infect. Immun. 2002, 20; 6805) y las cuales se fijan a la fibronectina. Dado que la fibronectina es un componente importante de la matriz extracelular, la EbhA y la EbhB tienen una función importante en la adherencia de los estafilococos a la matriz extracelular del anfitrión. Las proteínas Ebh son grandes, tienen un peso molecular de 1.1 mega Dalton. Es ventajoso usar un fragmento de la proteína Ebh en lugar de la secuencia completa, debido a la facilidad de producción y formulación. La región central de la proteína contiene repeticiones imperfectas que contienen sitios de fijación de fibronectina. Los fragmentos que contienen uno o más de los dominios de repetición descritos más adelante son los fragmentos preferidos para su incorporación en la composición inmunógena de la invención. Las proteínas Ebh contienen unidades de repetición imperfectas de 127 aminoácidos de longitud, las cuales están caracterizadas porque contienen la secuencia de consenso: L.G. {1O}A.{13}Q.{26}L...M..L. {33}A Preferiblemente . {19}L.G.{10}A.{13}Q. {26}L...M..L.{33}A. {12} Más preferiblemente I/V..A..J/V..AK.ALN/DG..NL..AK..A.{6}L..LN.AQK..L..QI/V..
A..V..V.{6}A..LN/D.AM..L...I/V.D/E...TK.S.NY/F.N/DAD..K..AY/F..AV..
A..I/V. N/D En donde "." significa cualquier aminoácido y ".{10}" significa cualesquiera 10 aminoácidos y l/V indica elecciones alternativas de aminoácido . Mediante referencia a la secuencia descrita en Kuroda ef al (2001 ) Lancet 357; 1225-1240, y en la Tabla 2, las secuencias de repetición dentro de las proteínas Ebh se deduce fácilmente. Los fragmentos preferidos para ser incluidos en la composición inmunógena de la invención incluyen proteínas que están constituidas por uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de 10 de las 127 unidades de repetición del aminoácido. Estos fragmentos pueden consistir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más repeticiones de la región de repetición 127 del aminoácido, o pueden consistir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más repeticiones con residuos adicionales de aminoácidos presentes en cualquiera de los extremos o en ambos extremos del fragmento. Otro fragmento preferido es el polipéptido H2 de 44 kDa, que abarca tres repeticiones (aminoácidos 3202-3595) como se describe en Clarke ef al Infection and Immunity 70, 6680- 6687, 2002. Estos fragmentos preferiblemente serán capaces de fijar la fibronectina y/o de producir anticuerpos que sean reactivos contra la proteína Ebh completa. Las proteínas Ebh son capaces de fijarse a la fibronectina. Los fragmentos preferidos de estas secuencias de polipéptidos mantienen la capacidad de fijarse a la fibronectina. La fijación a la fibronectina se puede evaluar mediante ELISA según se describe en Clarke ef al (Infection and Immunity 70; 6680-66872002). Todavía adicionalmente, los fragmentos preferidos son los que contienen un epítopo de célula B o de auxiliar T, por ejemplo los fragmentos/péptidos que se describen en las Tablas 3 y 4. Tabla 2: Secuencias de repetición en la secuencia de longitud completa de Ebh. La secuencia de longitud completa de Ebh se describe en Kuroda ef al (2001 ) Lancet 357; 1225- 1240. La siguiente tabla muestra los residuos de aminoácidos en los cuales el aminoácido 127 principia y finaliza las repeticiones en la secuencia de longitud completa. 10 15 20 25 10 15 20 25 Tabla 3. Predicción de epítopo de células B para una repetición del aminoácido 127: La secuencia de longitud completa se describe en Kuroda ef al (2001 ) Lancet 357; 1225-1240. Una de estas repeticiones, codificada por los aminoácidos 3204-3331 de la secuencia de longitud completa, se escogió para llevar a cabo una predicción de epítopo: MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDLN QAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQV VQSDNYVNADTNKK NDYNNAYNHANDIINGNAQHPVI Las columnas "principio" y "final" presenta la posición de los epítopos de células B predichos en la repetición del aminoácido 127.
Las columnas "inicio" y "fin" presentan la posición de los epítopos de células B predichos en la secuencia de Ebh de longitud completa. Tabla 4: Predicción de epítopo de células T auxiliares en Ebh : La secuencia de longitud completa se describe en la base de datos TrEMBL, referencia de secuencia Q8NWQ6. Una de estas repeticiones, codificada por los aminoácidos 3204-3331 de la secuencia de longitud completa, se escogió para llevar a cabo una predicción de epítopo: MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDLN QAQBCNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQ VVQSDNYVNADTNKK NDYNNAYNHANDIINGNAQHPVI 10 15 20 25 La columna "Posición de repetición" presenta la posición de los epítopos de células T predichos en la repetición La columna "Posición en la secuencia" presenta la posición de los epítopos de células T predichos en la secuencia de Ebh de longitud completa. Los fragmentos de las proteínas de la invención pueden ser empleados para producir el correspondiente polipéptido de longitud completa mediante síntesis de péptidos; por lo tanto, estos fragmentos se pueden emplear como productos intermedios para producir las proteínas de longitud completa de la invención. Se prefiere particularmente a las variantes en las cuales varios, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 o 1 aminoácidos están sustituidos, eliminados, o añadidos en cualquier combinación. Proteína fijadora de elastina (EbpS) La EbpS es una proteína que contiene 486 aminoácidos con un peso molecular de 83kDa. Está asociada con la membrana citoplásmica de S. aureus y tiene tres regiones hidrofóbicas que mantienen la proteína en la membrana (Downer et al 2002, J. Biol. Chem.277; 243; Park et al 1996, J. Biol. Chem.271 ; 15803).
Dos regiones entre los aminoácidos 1-205 y 343-486 están expuestas superficialmente en la cara exterior de la membrana citoplásmica. El dominio de fijación del ligando EbpS está localizado entre los residuos 14-34 en el término N (Park ef al 1999, J. Biol. Chem.274; 2845). Un fragmento preferido para ser incorporado en la composición inmunógena de la invención es el fragmento expuesto superficialmente que contiene la región de fijación a elastina (aminoácidos 1-205). Algunos de los fragmentos preferidos no contienen el lazo entero expuesto, pero deben contener la región de fijación a elastina (aminoácidos 14-34). Un fragmento alternativo que podría usarse consiste en los aminoácidos que forman el segundo lazo expuesto superficialmente (aminoácidos 343-486). También son posibles fragmentos que contengan hasta 1, 2, 5, 10, 20, 50 aminoácidos menos en uno o en ambos extremos. Receptores de laminina El receptor de laminina de S. aureus juega un papel importante en la patogenicidad. Un característica clave de la infección es la invasión del torrente sanguíneo, lo que permite la formación de abcesos metastásicos diseminada ampliamente. La invasión del torrente sanguíneo requiere la habilidad para extravasarse a través de la membrana de base vascular. Esto se logra mediante la fijación a la laminina a través del receptor de laminina (Lopes ef al Science 1985, 229; 275). Los receptores de laminina están expuestos superficialmente y están presentes en muchas cepas de estafilococos, incluyendo S. aureus y S. epidermidis. SBI La Sbi es una seg u nda proteína de fijación a IgG además de la proteína A, y se expresa en la mayoría de las cepas de S. aureus (Zhang ef al 1 998 , M icrobiology 144; 985) . El término N de la secuencia de Sbi tiene u na secuencia de señal típica con u n sitio de escisión después del aminoácido 29. Por lo tanto, u n fragmento preferido de Sbi para ser incorporado en una composición inmu nógena de la invención comienza en el residuo de aminoácido 30, 31 , 32 o 33 y contin úa hasta el término C de la Sbi , por ejemplo de SEQ I D NO : 26. El dominio de fijación de IgG de Sbi ha sido identificado como una región hacia el término N de la proteína de los aminoácidos 41 -92. Este dominio es homólogo con el dominio de fijación a IgGs de la proteína A. El dominio de fijación de IgG de Sbí mínimo contiene la sig uiente secuencia : QTTQNNYVTDQQKAFYQVLHLKGITEEQRNQYIKTLREHPERAQEVFSESLK * indica aminoácidos que son simila res entre domin ios de fijación a IgGs El frag mento preferido de Sbi pa ra ser incluido en la composición inmunógena de la invención contiene un dominio de fijación a IgG . Este fragmento contiene la secuencia de consenso para un dominio de fijación a IgG según se indica medíante * tal como se muestra en la secuencia anterior. Preferiblemente el fragmento contiene o consiste en la secuencia completa mostrada anteriormente. Más preferiblemente, el fragmento contiene o consiste en los aminoácidos 30-92, 33-92, 30-94, 33-94, 30-146, 33- 146, 30-150, 33-150, 30-160, 33-160, 33-170, 33-180, 33-190, 33-200, 33-205 o 33-210 de Sbi, por ejemplo de SEQ ID NO:26. El fragmento preferido puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sustituciones de aminoácido de las secuencias indicadas. Los fragmentos preferidos pueden contener repeticiones múltiples (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) del dominio de fijación de IgG. EFB - FIB La Fib es una proteína fijadora de fibrinógeno de 19 kDa que es secretada en el medio extracelular por S. aureus. Es producida por todos los aislados de S. aureus sometidos a prueba (Wastfeit y Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347). El S. aureus forma agrupaciones en la presencia de fibrinógeno y se fija a las superficies recubiertas con fibrinógeno. Esta capacidad facilita la colonización estafilocócica de catéteres y células endoteliales. La Fib contiene a secuencia de señal en el término N de la proteína con un sitio de escisión simulado aproximadamente en el aminoácido 30. Por lo tanto, el fragmento preferido para ser introducido en la composición inmunógena de la invención podría contener la secuencia de la proteína madura (aproximadamente desde el aminoácido 30 hasta el término C de la proteína).
Fbe - EfB/FIG La Fbe es una proteína fijadora de fibrinógeno que se encuentra en muchos aislados de S. epidermidis y tiene un peso molecular deducido de 119 kDa (Nilsson ef al 1998. Infect. Immun. 66; 2666). Su secuencia está relacionada con la del factor de agrupamiento de S. aureus (ClfA). Los anticuerpos contra Fbe pueden bloquear la fijación de S. epidermidis a placas recubiertas con fibrinógeno y a catéteres (Pei y Flock 2001, J. Infect. Dis. 184; 52). La Fbe tiene una secuencia de señal simulada con un sitio de escisión entre los aminoácidos 51 y 52. Por lo tanto un fragmento preferido de Fbe que contiene la forma madura de Fbe se extiende desde el aminoácido 52 hasta el término C (aminoácido 1,092). El dominio de Fbe desde el aminoácido 52 hasta el aminoácido 825 es responsable de la fijación al fibrinógeno. Por lo tanto un fragmento preferido de Fbe consiste en, o contiene, los aminoácidos 52- 825. La región entre el aminoácido 373 y 516 de Fbe muestra la mayor conservación entre Fbe y ClfA. El fragmento preferido, por lo tanto, contendrá los aminoácidos 373-516 de la Fbe. Los aminoácidos 825 - 1041 de la Fbe contienen una región altamente repetitiva compuesta por ácido aspártico y residuos de serina repetidos en tándem. IsaA/PisA La IsaA es una proteína de 29 kDa, también conocida como PisA, que ha demostrado ser una proteína inmunodominante estafilocócica durante la sepsis en pacientes de hospital (Lorenz ef al 2000, FEMS Immunol. Med. Microb.29; 145). Se piensa que los primeros 29 aminoácidos de la secuencia de IsaA son una secuencia de señal. Por lo tanto, un fragmento preferido de IsaA para ser incluido en una composición inmunógena de la invención podría contener residuos de los aminoácidos 30 en adelante, hasta el final de la secuencia codificada. Proteína fijadora de fibronectina La proteína fijadora de fibronectina A contiene varios dominios que están involucrados en la fijación a la fibronectina (WO 94/18327). Estos se denominan D1, D2, D3 y D4. Los fragmentos preferidos de proteína fijadora de fibronectina A o B comprenden o consisten en D1, D2, D3, D4, D1-D2, D2-D3, D3-D4, D1-D3, D2-D4 o D1-D4. La proteína fijadora de fibronectina contiene una secuencia de señal de 36 aminoácidos. Por ejemplo: VKNNLRYGIRKHKLGAASVFLGTMIWGMGQDKEAA Opcionalmente, la proteína madura, omitiendo esta secuencia de señal, está incluida en la composición inmunógena de la invención. Proteínas transportadoras La pared celular de las bacterias Gram positivas actúa como una barrera que previene la difusión libre de metabolitos en la bacteria. Una familia de proteínas orquesta el paso de nutrientes esenciales en la bacteria y por lo tanto es esencial para la viabilidad de la bacteria. El término proteína transportadora cubre proteínas involucradas en el paso inicial de fijación a metabolitos, tales como hierro, así como también los involucrados en transportar realmente el metabolito en la bacteria. El hierro molecular es un co-factor esencial para el crecimiento bacteriano. Se secretan sideróforas que fijan el hierro libre y luego se capturan mediante receptores superficiales bacterianos que suministran hierro para transportarlo a través de la membrana citoplásmica. La absorción de hierro es crítica para el establecimiento de infecciones humanas, de tal forma que la generación de una respuesta inmunitaria contra esta clase de proteínas conduce a una pérdida de viabilidad estafilocócica. Los ejemplos de proteínas transportadoras incluyen el transportador inmunodominante ABC (Burnie et al 2000 Infecí. Imun. 68; 3200), IsdA (Mazmanian et al 2002 PNAS 99; 2293), IsdB (Mazmanian ef al 2002 PNAS 99; 2293), el transportador Mg2 + , SitC (Wiltshire y Foster 2001 Infecí. Immun. 69; 5198) y el transportador ABC Ni. Transportador inmunodominante ABC El transportador inmunodominante ABC es una proteína muy bien conservada que puede ser capaz de generar una respuesta inmunitaria que tiene protección cruzada contra diferentes cepas estafilocócicas (Mei ef al 1997, Mol. Microbiol. 26; 399). Los anticuerpos contra esta proteína se han encontrado en pacientes con septicemia (Burnie et al 2000, Infect. Immun.68; 3200). Los fragmentos preferidos de transportador inmunodominante ABC incluirán los péptidos DRHFLN, GNYD, RRYPF, KTTLLK, GVTTSLS, VDWLR, RGFL, más preferiblemente KIKVYVGNYDFWYQS, TVIVVSHDRHFLYNNV y/o TETFLRGFLGRMLFS, dado que estas secuencias contienen epítopos que son reconocidos por el sistema inmunológico humano. IsdA-IsdB Los genes isd (determinantes superficiales regulados por hierro) de S. aureus codifican las proteínas responsables de la fijación a hemoglobina y del paso de hierro del grupo hemo hacia el citoplasma, en donde actúa como un nutriente esencial. IsdA y IsdB están localizadas en la pared celular de los estafilococos. La IsdA parece estar expuesta en la superficie de la bacteria, dado que es susceptible de digestión por la proteinasa K. La IsdB fue digerida parcialmente, lo que sugiere que está expuesta parcialmente sobre la superficie de la bacteria (Mazmanian ef al 2003 Science 299; 906). La IsdA y la IsdB son ambas proteínas de 29 kDa que se fijan al grupo hemo. Su expresión está regulada por la disponibilidad y hierro por medio del represor Fur. Su expresión será alta durante la infección en un anfitrión, en donde la concentración de hierro será baja. También son conocidas como FrpA y FrpB (Morrissey ef al 2002, Infect. Immun. 70; 2399). FrpA y FrpB son proteínas con una alta carga. Han demostrado que proporcionan una contribución principal a la adhesión al plástico. En una modalidad, la composición inmunógena de la invención contiene un fragmento de IsdA y/o IsdB que es como se describe en WO 01/98499 o en WO 03/11899. Toxinas y reguladores de virulencia Los miembros de esta familia de proteínas incluyen toxinas tales como la toxina alfa, hemolisina, enterotoxina B y TSST-1, así como también proteínas que regulan la producción de toxinas tales como RAP. Toxina alfa (Hia) La toxina alfa es un importante determinante de virulencia producida por la mayoría de las cepas de S. aureus. Es una toxina formadora de poros con actividad hemolítica. Se ha demostrado que los anticuerpos contra la toxina alfa neutralizan los efectos perjudiciales y letales de la toxina alfa en modelos animales (Adlam ef al 1977 Infect. immun. 17; 250). Las plaquetas humanas, las células endoteliales y las células mononucleares son susceptibles a los efectos de la toxina alfa. La alta toxicidad de la toxina alfa requiere que sea destoxificada antes de usarse como inmunógeno. Esto se puede lograr mediante tratamiento químico, por ejemplo mediante tratamiento con formaldehido, glutaraldehído de otros reactivos reticulantes o conjugándolo químicamente con polisacáridos bacterianos o con LTA, como se describe más adelante. Otra manera de eliminar la toxicidad es introducir mutaciones puntuales que eliminan toxicidad mientras que mantienen la antigenicidad de la toxina. La introducción de una mutación puntual en el aminoácido 35 de la toxina alfa en donde se reemplaza un residuo de histidina con un residuo de leucina, da como resultado la eliminación de toxicidad, mientras que mantiene la inmunogenicidad (Menzies y Kemodle 1996; Infect. Immun. 64; 1839). La histidina 35 parece ser crítica para la oligomerización apropiada requerida para la formación de poros, y la mutación de este residuo conduce a la pérdida de toxicidad. Cuando se incorpora en composiciones inmunógenas de la invención, la toxina alfa preferiblemente es destoxificada mediante reemplazo de His 35, más preferiblemente reemplazando His 35 con Leu o Arg. En una modalidad alternativa, la toxina alfa es destoxificada medíante la conjugación con otros componentes de la composición inmunógena, preferiblemente con polisacáridos capsulares o con LTA, mucho más preferiblemente con polisacárido tipo V de S. aureus ylo con polisacárido tipo Vlll de S. aureus y/o con PÍA. Proteína activadora de ARN lll (RAP) La RAP no es en sí misma una toxina, pero es un regulador de factores de expresión de virulencia. La RAP es producida y secretada por estafilococos Activa el sistema regulador de agr de otros estafilococos y activa la expresión y la liberación subsiguiente de factores de virulencia tales como hemolisina, enterotoxina B y TSST-1.
Una respuesta inmunitaria generada contra RAP podría no eliminar la bacteria, pero podría interferir con su patogenicidad.
Esto tiene la ventaja de proporcionar presión menos selectiva para que emerjan nuevas cepas resistentes. Podría haber una segunda ventaja en producir una respuesta inmunitaria que pudiera ser instrumental para reducir la morbilidad de la infección. Es particularmente ventajoso combinar la RAP con otros antígenos en una vacuna, particularmente en donde el antígeno adicional podría proporcionar una respuesta inmunitaria que sea capaz de eliminar la bacteria. Otras proteínas ¡nmunodependientes Proteína asociada a la acumulación (Aap) La Aap es una proteína de 140 kDa que es esencial para la acumulación de cepas de S. epidermidis sobre las superficies (Hussain ef al Infect. Immun. 1997, 65; 519). Las cepas que expresan esta proteína producen significativamente mayores cantidades de biopelícula y la Aap parece estar involucrada en la formación de biopelícula. Los anticuerpos contra la Aap son capaces de inhibir la formación de biopelícula y de inhibir la acumulación de S. epidermidis. Antígeno secretor estafilocócico SsaA La SsaA es una proteína fuertemente inmunógena de 30 kDa que se encuentra tanto en S. aureus como en S. epidermidis (Lang ef al 2000 FEMS Immunol. Med. Microbiol. 29; 213). Su expresión durante la endocarditis sugiere un papel en la virulencia específico para la patogénesis de la enfermedad infecciosa . La SsaA contiene una secuencia conductora en el terminal N y un sitio de escisión de peptidasa señal. El péptido conductor es seguido por una región hidrofílica de aproximadamente 100 aminoácidos desde el residuo 30 hasta el residuo 130. Un fragmento preferido de SsaA para ser incorporado en la composición inmunógena de la invención se elabora de la proteína madura (aminoácidos 27 hasta el término C o aminoácidos 30 hasta el término C). Otros fragmentos preferidos contienen el área hidrofílica de SsaA desde el aminoácido 30 hasta el aminoácido 130. C om b i nac i o n es p refe ri d as Las infecciones estafilocócicas progresan a través de diferentes etapas. Por ejemplo, el ciclo de vida estafilocócico implica la colonización del comensal, la iniciación de la infección accesando tejidos adyacentes o el torrente sangu íneo, multiplicación anaeróbica en la sangre, interrelación entre los determinantes de virulencia de S. aureus y los mecanismos de defensa , e inducción de complicaciones, incluyendo endocarditis, formación de abcesos matastásicos y síndrome de sepsis. Diferentes moléculas en la superficie de la bacteria estarán involucradas en diferentes pasos del ciclo de infección. Dirigiendo la respuesta inmunitaria contra una combinación de antígenos en particular involucrados en diferentes procesos de infección estafilocócica, son afectados múltiples aspectos de la función estafilocócica, y esto puede dar como resultado buena eficacia de la vacuna. En particular, las combinaciones de ciertos antígenos de diferentes clases, algunos de los cuales están involucrados en la adhesión a células anfitrionas, algunos de los cuales están involucrados en la adquisición de hierro o en otras funciones de transporte, algunos de los cuales son toxinas o reguladores de virulencia y antígenos inmunodominantes, pueden desencadenar una respuesta inmunitaria que proteja contra múltiples etapas de la infección . Algunas combinaciones de antígenos son particularmente efectivas para inducir una respuesta inmunitaria . Esta se puede medir ya sea en análisis en modelos animales como se describe en los ejemplos, y/o se puede usar un análisis opsonofagocigótico como se describe en los ejemplos. Sin desear estar limitado por la teoría, se piensa que estas combinaciones efectivas de antígenos se hacen posibles por una cantidad de características de la respuesta inmunitaria a la combinación de antígenos. Los antígenos por sí solos usualmente están expuestos sobre la superficie de las células estafilocócicas, tienden a ser conservados, pero también tienen a no estar presentes en cantidad suficiente sobre la superficie de la célula para que tenga lugar una respuesta bactericida óptima usando anticuerpos producidos contra el antígeno solo. La combinación de los antígenos de la ¡nvención puede dar como resultado una formulación que produzca una combinación ventajosa de anticuerpos que interactúen con la célula estafilocócica más allá de un umbral crítico. En este nivel crítico, suficientes anticuerpos de suficiente calidad se fijan a la superficie de la bacteria para permitir ya sea la eliminación eficiente por complemento o la neutralización de la bacteria. Esto se puede medir en un modelo animal o en un análisis de opsonización como se describe en los ejemplos. Las composiciones inmunógenas preferidas de la invención contienen una pluralidad de proteínas seleccionadas de al menos dos categorías diferentes de proteína, que tienen diferentes funciones con los estafilococos. Los ejemplos de estas categorías de proteínas con proteínas de fijación extracelular, proteínas transportadoras tales como proteínas de adquisición de Fe, toxinas o reguladores de virulencia y otras proteínas inmunodependientes. En una modalidad preferida, la composición inmunógena de la invención contiene además una cantidad de proteínas mayor o igual que 2, 3, 4, 5 o 6 seleccionadas de 2 o 3 grupos diferentes seleccionados de: Grupo a) proteínas fijadoras de componente extracelular; Grupo b) proteínas transportadoras; • Grupo c) toxinas o reguladores de virulencia. En una modalidad preferida, la composición inmunógena de la invención contiene además una cantidad de proteínas mayor o igual que 2, 3, 4, 5 o 6 seleccionadas de 2 o 3 de los siguientes grupos: grupo a) - al menos una proteína fijadora de componente extracelular estafilocócica o fragmento de ella, que se selecciona del grupo que consiste en receptor de laminina, proteína fijadora de SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína fijadora de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolísina, ClfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína fijadora de vitronectina, proteína fijadora de fibrinógeno, coagulasa, Fig y MAP; grupo b) - al menos un proteína transportadora estafilocócica o fragmento de ella, que se selecciona del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC y transportador ABC Ni; grupo c) - al menos un regulador de virulencia estafilocócico, toxina o fragmento de ella que se selecciona del grupo que consiste en toxina alfa (Hia), toxina alfa H35R mutante, proteína activadora de ARN lll (RAP). En una modalidad preferida, la composición inmunógena de la invención contiene al menos una proteína que se selecciona del grupo a) y una proteína adicional que se selecciona del grupo b) y/o del grupo c). En una modalidad adicional, la composición inmunógena de la invención contiene al menos un antígeno que se selecciona del grupo b) y una proteína adicional que se selecciona del grupo c) y/o del grupo a). En una modalidad adicional, la composición inmunógena de la invención contiene al menos un antígeno que se selecciona del grupo c) y una proteína adicional que se selecciona del grupo a) y/o del grupo b). Una combinación preferida de proteínas en la composición inmunógena de la invención contiene receptor de laminina y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene SitC y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene EbhA y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene EbhB y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA.
Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene EbpS y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la ¡nvención contiene EFB(FIB) y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene SBI y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene autolisina y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene ClfA y 1 , 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC , transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de ia invención contiene SdrC y 1 , 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene SdrG y 1 , 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa , mutante H35L o H35R de toxina alfa y RAP. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene SdrH y 1 , 2 , 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni , toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene Lipasa GehD y 1 , 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene SasA y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene FnbA y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene FnbB y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene Cna y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene ClfB y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene FbpA y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene Npasa y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene IsaA/PisA y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC , transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene SsaA y 1 , 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC , transportador ABC Ni, toxina alfa , mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP , Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene EPB y 1 , 2 , 3, 4 o 5 antígenos adicionales seleccionados del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene SSP-1 y 1 , 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC , transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene SSP-2 y 1 , 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni , toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene HPB y 1 , 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni , toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene proteína fijadora de vitronectina y 1 , 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , Site, transportador ABC Ni, toxina alfa , mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene proteína fijadora de fibrinógeno y 1 , 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , Site, transportador ABC Ni, toxina alfa , mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene coagulasa y 1 , 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2+, SítC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene Fig y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene MAP y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene transportador ABC inmunodominante y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en receptor de laminina, proteína fijadora de SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, Proteína fijadora de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1 , SSP-2, HBP, proteína fijadora de vitronectina, proteína fijadora de fibrinógeno, coagulasa, Fig, MAP, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene IsdA y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en receptor de laminina, proteína fijadora de SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína fijadora de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína fijadora de vitronectina, proteína fijadora de fibrinógeno, coagulasa, Fig, MAP, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene IsdB y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en receptor de laminina, proteína fijadora de SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, Proteína fijadora de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína fijadora de vitronectina, proteína fijadora de fibrinógeno, coagulasa, Fig, MAP, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la ¡nvención contiene SitC y 1, 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en receptor de laminina, proteína fijadora de SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, Proteína fijadora de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1 , SSP-2 , HBP, proteína fijadora de vitronectina, proteína fijadora de fibrinógeno, coagulasa, Fig , MAP, toxina alfa, mutante H35L o H35R de toxina alfa, RAP, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene toxina alfa y 1 , 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en receptor de laminina, proteína fijadora de SitC/M ntC/saliva , EbhA, EbhB, proteína fijadora de elastina (EbpS) , EFB (FI B) , SBI , autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH , Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna , ClfB, FbpA, Npasa , IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1 , SSP- 2 , H BP, proteína fijadora de vitronectina, proteína fijadora de fibrinógeno, coagulasa, Fig , MAP, transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC , transportador ABC Ni, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene variante de toxina alfa H35L o H35R y 1 , 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en receptor de laminina, proteína fijadora de SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB , proteína fijadora de elastina (EbpS), EFB (FI B), SBI , autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH , Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1 , SSP-2, HBP, proteína fijadora de vitronectina, proteína fijadora de fibrinógeno, coagulasa, Fig , MAP, transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, Aap y SsaA. Una combinación de proteínas preferida adicional en la composición inmunógena de la invención contiene RAP y 1 , 2, 3, 4 o 5 antígenos adicionales, que se seleccionan del grupo que consiste en receptor de laminina, proteína fijadora de SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, Proteína fijadora de elastina (EbpS), EFB (FI B), SBI , autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna , ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1 , SSP-2 , H BP, proteína fijadora de vitronectina, proteína fijadora de fibrinógeno, coagulasa, Fig , MAP, transportador inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportador Mg2 + , SitC, transportador ABC Ni, Aap y SsaA. En las combinaciones anteriores y siguientes, las proteínas especificadas pueden estar presentes opcionalmente en la composición inmunógena de la invención como un fragmento o proteína de fusión como se describió aquí anteriormente. C om b i n a c i ones d e tres p rote í nas Una composición inmunógena preferida de la invención contiene además tres componentes de proteínas en una combinación de toxina alfa, una proteína fijadora de componente extracelular (preferiblemente una adhesina) y una proteína transportadora (preferiblemente una proteína fijadora de hierro). En una combinación como esta, la toxina alfa puede ser destoxificada químicamente, o destoxificada genéticamente mediante la introducción de mutación o mutaciones puntuales, preferiblemente la mutación en el punto His35Leu. La toxina alfa está presente como base libre, o de manera alternativa, está conjugada con un polisacárido o con un componente LTA de la composición ¡nmunógena. Las combinaciones preferidas incluyen: Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y una proteína fijadora de componente extracelular que se selecciona del grupo que consiste en receptor de laminina, proteína fijadora de SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, Proteína fijadora de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína fijadora de vitronectina, proteína fijadora de fibrinógeno, coagulasa, Fig y MAP. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdB y una proteína fijadora de componente extracelular que se selecciona del grupo que consiste en receptor de laminina, proteína fijadora de SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, Proteína fijadora de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína fijadora de vitronectina, proteína fijadora de fibrinógeno, coagulasa, Fig y MAP. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y una adhesina que se selecciona del grupo que consiste en receptor de laminina, EbhA, EbhB, proteína fijadora de elastina (EbpS), EFB (FIB), CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, autolisina, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, SSP-1, SSP-2, proteína fijadora de vitronectina, proteina fijadora de fibrinógeno, coagulasa, Fig y MAP. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdB y una adhesina que se selecciona del grupo que consiste en receptor de laminina, EbhA, EbhB, proteína fijadora de elastina (EbpS), EFB (FIB), autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, SSP-1, SSP-2, proteína fijadora de vitronectina, proteína fijadora de fibrinógeno, coagulasa, Fig y MAP. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y receptor de laminina. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y EbhA. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y EbhB. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y EbpS. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y EFB (FIB). Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y SdrG. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y ClfA. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y ClfB. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y FnbA.
Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y coagulasa. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y Fig. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y SdrH. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y SdrC. Una composición inmunógena que contiene toxina alfa, IsdA y MAP. Una composición inmunógena que contiene IsaA y Sbi. Una composición inmunógena que contiene IsaA y IsdB. Una composición ¡nmunógena que contiene IsaA y IsdA. Una composición inmunógena que contiene IsaA y SdrC. Una composición inmunógena que contiene IsaA y Ebh o fragmento de ella como se describió aquí anteriormente. Una composición inmunógena que contiene Sbi y SdrC. Una composición inmunógena que contiene Sbi y Ebh o fragmento de ella como se describió aquí anteriormente. Una composición ¡nmunógena de la invención que contiene IsaA, Sbi o SdrC Selección de antígenos expresados en diferentes linajes clónales El análisis de la aparición de factores de virulencia en relación con la estructura de la población de Staphylococcus aureus mostró la presencia variable de genes de virulencia en las poblaciones naturales de S. aureus. Entre los aislados clínicos de Staphylococcus aureus, al menos cinco linajes clónales mostraron ser muy frecuentes (Booth ef al., 2001 Infecí Immun. 69(1):345-52). La alfa-hemolisina (hia), proteína A fijadora de fibronectina (fnbA) y factor de agrupamiento A (clfA) mostraron estar presentes en la mayoría de los aislados, sin considerar la identidad del linaje, lo que sugiere un papel importante de estas proteínas en la supervivencia del S. aureus (Booth ef al., 2001 Infect Immun.69(1):345-52). Más aún, de acuerdo con Peacock et al. 2002 las distribuciones de fnbA, clfA, coagulasa, spa, map, pvl (leucocidina Panton-Valentine), hlg (toxina gamma), toxina alfa e ica perecieron no estar relacionadas con la estructura clonal subyacente, lo que sugiere una transferencia horizontal considerable de estos genes. Por el contrario, otros genes de virulencia tales como la proteína fijadora de fibronectina B (fnbB), beta-hemolisina (hlb), proteína fijadora de colágeno (cna), TSST-1 (tst) y gen de resistencia a la meticilina (mecA) están fuertemente asociados con linajes específicos (Booth et al., 2001 Infecí Immun. 69(l):345-52). De manera similar, Peacock ef al. 2002 (Infecí Immun. 70(9):4987-96) demostraron que las disíribuciones de las enterotoxinas, tst, las exfolaíinas (eta y etb), bela- y delta-toxinas, los genes sdr (sdrD, sdrE y bbp), cna, ebpS y efb dentro de la población, son todos altamente significativos con relación a los complejos clónales derivados de MLST. Los datos de MLST no proporcionan evidencia de que las cepas responsables de la enfermedad nosocomial representen una sub población distinta de las cepas que ocasionan enfermedad adquirida en la comunidad o de las cepas recuperadas de portadores asintomáticos (Feil ef al., 2003 J Bacteriol. 185(11):3307-16). Las composiciones inmunógenas preferidas de la invención son efectivas contra estafilococos de diferentes linajes clónales. En una modalidad, la composición inmunógena contiene 1, 2, 3, 4, preferiblemente al menos 1 proteína que se expresa en la mayoría de los aislados de estafilococos. Los ejemplos de estas proteínas incluyen alfa-hemolisina (hia), proteína A fijadora de fibronectina (fnbA) y factor de agrupamiento A (clfA), coagulasa, spa, map, pvl (leucocidina Panton-Valentine), hlg (toxina gamma), ica, transportador inmunodominante ABC, RAP, autolisina (Rupp ef al 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), receptores de laminina, SitC, IsaA/PisA, SPOIIIE (), SsaA, EbpS, SasF (Roche ef al 2003, Microbiology 149; 643), EFB(FIB), SBI, ClfB, IsdA, IsdB, FnbB, Npasa, EBP, Sialoproteína II fijadora ósea, IsaB/PisB (Lorenz ef al FEMS Immuno. Med. Microb. 2000, 29; 145), SasH (Roche ef al 2003, Microbiology 149; 643), MRPI, SasD (Roche ef al 2003, Microbiology 149; 643), SasH (Roche ef al 2003, Microbiology 149; 643), precursor de aureolisina (AUR)/Sepp1 y autolisina novedosa. En una modalidad alternativa, 2 o más proteínas que se expresan en diferentes conjuntos de cepas clónales están incluidas en la composición inmunógena de la invención. Preferiblemente la combinación de antígenos permitirá que sea generada una respuesta inmunitaria que sea efectiva contra múltiples cepas clónales, mucho más preferiblemente contra todas las cepas clónales. Las combinaciones preferidas incluyen FnbB y betahemolisina, FnbB y Cna, FnbB y TSST-1, FnbB y mecA, FnbB y SdrD, FnbB y SdrF, FnbB y EbpS, FnbB y Efb, beta-hemolisina y Cna, beta-hemolisina y TSST-1, beta-hemolisina y mecA, beta-hemolisina y SdrD, beta-hemolisina y SdrF, beta-hemolisína y EbpS, beta- hemolisina y Efb, Cna y TSST-1, Cna y mecA, Cna y SdrD, Cna y SdrF, Cna y EbpS, Cna y Efb, TSST-1 y mecA, TSST-1 y SdrD, TSST-1 y SdrF, TSST-1 y EbpS, TssT-1 y Efb, MecA y SdrD, MecA y SdrF, MecA y EbpS, MecA y Efb, SdrD y SdrF, SdrD y EbpS, SdeD y Efb, SdrF y EbpS, SdrF y Efb, y, EbpS y Efb. Las combinaciones preferidas descritas aquí anteriormente pueden ser combinadas con componentes adicionales descritos anteriormente. Protección contra S. aureus y S. epidermidis En una modalidad preferida de la invención, la composición inmunógena proporciona una respuesta inmunitaria efectiva contra más de una cepa de estafilococos, preferiblemente contra cepas tanto de S. aureus como de S. epidermidis. Más preferiblemente, se genera una respuesta inmunitaria protectora contra los serotipos de tipo 5 y 8 de S. aureus. Más preferiblemente, se genera una respuesta inmunitaria protectora contra los serotipos I, II y lll de S. epidermidis. Un uso de la composición inmunógena de la invención es prevenir infecciones nosocomiales, por ejemplo en pacientes de cirugía electiva, mediante inoculación antes del tratamiento en el hospital. En esta etapa, es difícil predecir con exactitud a cuáles cepas estafilocócicas estará expuesto el paciente. Por lo tanto, es ventajoso inocularlo con una vacuna que sea capaz de generar una respuesta inmunitaria efectiva contra diversas cepas de estafilococos. Una respuesta inmunitaria efectiva se define como una respuesta inmunítaria que da protección significativa en un modelo de exposición con ratón o en un análisis de opsonofagocitosis como se describe en los ejemplos. La protección significativa en un modelo de exposición con ratón, por ejemplo la del ejemplo 5, se define como un aumento en la LD50 en comparación con ratones inoculados con portador de al menos 10%, 20%, 50%, 100% o 200%. La protección significativa en un modelo de exposición con rata del algodón, por ejemplo la del ejemplo 8, se define como una disminución en la media Log de CFU/nariz observada de al menos 10%, 20%, 50%, 70% o 90%. Se sabe que la presencia de anticuerpos opsonizantes está correlacionada con la protección, por lo tanto está indicada una protección significativa por una disminución de al menos 10%, 20%, 50%, 70% o 90% en un análisis de opsonofagocitosis, por ejemplo el del ejemplo 7. Varias de las proteínas que incluyen el transportador inmunodominante ABC, proteína activadora de ARN II, receptores de laminina, SitC, IsaA/PisA, SsaA, EbhA/EbhB, EbpS y Aap están bien conservados entre S. aureus y S. epidermidis, y el ejemplo 8 muestra que IsaA, CIfA, IsdB, SdrG, HarA, FnbpA y Sbi pueden generar una respuesta inmunitaria de reacción cruzada (por ejemplo reacción cruzada entre al menos una cepa de S. aureus y al menos una cepa de S. epidermidis). La PÍA también es bien conservada entre S. aureus y S. epidermidis. Por lo tanto, en una modalidad preferida, la composición inmunógena de la invención contendrá PÍA y polisacárídos tipo 5 y tipo 8 y contendrá además una, dos, tres o cuatro de las proteínas anteriores. Vacunas En una modalidad preferida, la composición inmunógena de la invención está mezclada con un excipiente aceptable para uso farmacéutico, más preferiblemente con un adyuvante, para formar una vacuna. Las vacunas de la presente invención preferiblemente están auxiliadas. Los adyuvante apropiados incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alum) o fosfato de aluminio, pero también pueden ser una sal de calcio, magnesio, hiero o zinc, o pueden ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o de azúcares acilados, polisacáridos catiónica o aniónicamente producidos, o polifosfazenos. Se prefiere que el adyuvante sea seleccionado para que sea un inductor preferencial de un tipo de respuesta TH1 o TH2. Los altos niveles de citocinas de tipo Th1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por células para un antígeno dado, mientras que los altos niveles de citocinas de tipo Th2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales al antígeno. Es importante recordar que la distinción de la respuesta inmunitaria de tipo Th1 y de tipo Th2 no es absoluta. En realidad, un individuo admitirá una respuesta inmunitaria que se describe como predominantemente Th1 o predominantemente Th2. Sin embargo, con frecuencia es conveniente considerar las familias de citocinas en términos de lo que se describe en clones de células T CD4 +ve por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 y TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo Th1 están asociadas con la producción de citocinas INF-? e I L-2 por los linfocitos T. Otras citocinas con frecuencia asociadas directamente con la inducción de las respuestas inmunitarias de tipo Th1 no son producidas por las células T, tal como la IL-12. En contraste, las respuestas de tipo Th2 están asociadas con la secreción de I L-4, I L-5, IL-6, I L-10. Los sistemas adyuvantes que promueven una respuesta predominantemente Th1 incluyen: lípido A monofosforilado o un derivado de él, particularmente lípido A monofosforilado 3-des-O-acilado (3D-MPL) (para su preparación, véase GB 2220211 A); y una combinación de lípido A monofosforilado, preferiblemente lípido A monofosforilado 3-des-O-acilado, junto con cualquier sal de aluminio (por ejemplo, fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) o una emulsión de aceite en agua. En estas combinaciones, el antígeno y 3D-MPL están contenidos en las mismas estructuras en partículas, lo que permite un suministro más eficiente de señales antígenas e inmunoestimuladoras. Los estudios han demostrado que el 3D-MPL es capaz de mejorar más la inmunogenicidad de un antígeno adsorbido en alum [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1]. Un sistema mejorado implica la combinación de un lípido A monofosforilado y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y el 3D-MPL según se describe en WO 94/00153, o una composición menos reactógena en donde la QS21 es extinguida con colesterol según se describe en WO 96/33739. Una formulación adyuvante particularmente potente que involucra QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua está descrita en WO 95/17210, y es una formulación preferida. Preferiblemente la vacuna contiene adicionalmente una saponina, más preferiblemente QS21. La formulación también puede contener una emulsión de aceite en agua y tocoferol (WO 95/17210). La presente invención también proporciona un método para producir una formulación para vacuna que comprende mezclar una proteína de la presente invención junto con un excipiente aceptable para uso farmacéutico, tal como 3D-MPL. Las CpG no metiladas que contienen oligonucleótidos (WO 96/02555) también son inductores preferenciales de una respuesta TH 1 y son apropiadas para su uso en la presente invención. Las composiciones preferidas de la invención son las que forman una estructura de liposoma. Las composiciones en donde la fracción esterol/saponina activa inmunológicamente forma una estructura ISCOM también forman un aspecto de la invención. La proporción de QS21 :esterol típicamente estará en el orden de 1 : 100 hasta 1 : 1 peso por peso. Preferiblemente está presente un exceso de esterol, la proporción de QS21 :esterol es de al menos 1 :2 p/p. Típicamente para la administración a seres humanos, QS21 y el esterol estarán presentes en una vacuna en el rango desde aproximadamente 1 µg hasta aproximadamente 100 µg , preferiblemente desde aproximadamente 10 µg hasta aproximadamente 50 µg por dosis. Los liposomas preferiblemente contienen un lípido neutro, por ejemplo fosfatidilcolina, que preferiblemente es no cristalina a temperatura ambiente, por ejemplo fosfatidilcolina de yema de huevo, dioleoil fosfatidilcolina o dilauril fosfatidilcolina . Los liposomas también pueden contener un lípido cargado que aumente la estabilidad de la estructura liposoma-QS21 para los liposomas compuestos de lípidos saturados. En estos casos, la cantidad de lípido cargado preferiblemente es de 1 -20% p/p, mucho más preferiblemente 5-10%. La proporción de esterol con respecto a fosfolípido es de 1 -50% (mol/mol), mucho más preferiblemente 20- 25%. Preferiblemente las composiciones de la invención contienen MPL (lípido A monofosforilado 3-desacilado), también conocido como 3D-MPL). El 3D-MPL se conoce a partir de GB 2220211 (Ribi) como una mezcla de 3 tipos de lípido A monofosforilado des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas, y es fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida se describe en la solicitud de patente internacional 92/116556. Las composiciones apropiadas de la invención son aquellas en donde los liposomas están preparados inicialmente sin MPL, y luego se les añade el MPL, preferiblemente como partículas de 100 nm. El MPL por lo tanto no está contenido en la membrana de la vesícula (conocidas como MPL fuera). Las composiciones en donde el MPL está contenido dentro de la membrana de la vesícula (conocidas como MPL dentro) también forman un aspecto de la invención. El antígeno puede estar contenido dentro de la membrana de la vesícula o contenido fuera de la membrana de la vesícula. Preferiblemente los antígenos solubles están fuera y los antígenos hidrofóbicos o lipidados están contenidos ya sea dentro o fuera de la membrana. Las preparaciones para vacuna de la presente invención pueden usarse para proteger o para tratar un mamífero susceptible de infección, por medio de administrar dicha vacuna por ruta sistémica o mucosa. Estas administraciones pueden incluir inyección por las rutas intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o por medio de administración mucosa a los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. La administración intranasal de vacunas para el tratamiento de neumonía o de otitis media se prefiere (dado que el acarreo nasofaríngeo de neumococos puede ser prevenido más efectivamente, atenuando así la infección en su etapa más temprana). Si bien la vacuna de la invención puede ser administrada como una sola dosis, los componentes de ella pueden ser co-administrados también juntos en el mismo momento o en diferentes momentos (por ejemplo se puede administrar polisacáridos neumocócicos por separado, al mismo tiempo, o 1 -2 semanas después de la administración de cualquier componente de proteína bacterial de la vacuna para la coordinación óptima de las respuestas inmunitarias una con respecto a la otra). Para su coadministración, el adyuvante opcional Th 1 puede estar presente en cualquiera o en todas las diferentes administraciones, sin embargo se prefiere su éste está presente en combinación con el componente de proteína bacterial de la vacuna. Además para una sola ruta de administración, se puede usar dos diferentes rutas de administración . Por ejemplo, se puede administrar polisacáridos I M (o I D) y las proteínas bacterianas se pueden administrar I N (o I D) . Además, las vacunas de la invención se pueden administrar I M para dosis de sensibilización e IN para dosis de refuerzo. La cantidad de antígeno conjugado en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios en vacunas típicas. Esta cantidad variará dependiendo de cuál inmunógeno específico se emplee y de cómo esté presentado. Generalmente, se espera que cada dosis contendrá OJ-100 µg de polisacárido, preferiblemente OJ-50 µg para conjugados de polisacárido, preferiblemente OJ-10 µg, más preferiblemente 1-10 µg, de los cuales 1 hasta 5 µg es un rango más preferido. Sin embargo, para el serotipo 6B, la dosis preferida contendrá 3-10 µg de polisacárido. El contenido de antígenos de proteína en la vacuna típicamente estará en el rango de 1-100 µg, preferiblemente 5-50 µg, mucho más típicamente en el rango de 5 - 25 µg. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo separadas adecuadamente. La preparación de vacuna está descrita en general en Vaccine Design ("The subunit y adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). La encapsulación dentro de liposomas está descrita por Fullerton, patente estadounidense número 4,235,877. Las vacunas de la presente invención pueden ser almacenadas en solución o liofilizadas. Preferiblemente la solución es liofilizada en la presencia de un azúcar tal como sacarosa, trehalosa o lactosa. Es todavía preferible además que estén liofilizadas y sean reconstituidas extemporáneamente antes de su uso. La liofilización puede dar como resultado una composición más estable (vacuna) y puede conducir posiblemente a títulos de anticuerpo más altos en la presencia de 3D-MPL y en la ausencia de un adyuvante basado en aluminio.
Anticuerpos e inmunización pasiva Otro aspecto de la invención es un método para preparar una inmunoglobulina para su uso en la prevención o tratamiento de infección estafilocócica, que comprende los pasos de inmunizar a un receptor con la vacuna de la invención y aislar la inmunoglobulina del receptor. Una inmunoglobulina preparada mediante este método es un aspecto adicional de la invención. Una composición farmacéutica que contiene la inmunoglobulina de la invención y un portador aceptable para uso farmacéutico es un aspecto adicional de la invención que puede usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedad estafilocócica. Un método para el tratamiento o prevención de infección estafilocócica que comprende un paso de administrar a un paciente una cantidad efectiva de la preparación farmacéutica de la invención es un aspecto adicional de la invención. Los inóculos para la producción de anticuerpo policlonal se preparan típicamente dispersando la composición de antígenos en un diluyente tolerable fisiológicamente, tal como salina u otros adyuvantes apropiados para uso humano, para formar una composición acuosa. Una cantidad de inoculo inmunoestimulante se administra a un mamífero, y el mamífero inoculado se mantiene luego durante un tiempo suficiente para que la composición antígena induzca anticuerpos protectores. Los anticuerpos se pueden aislar en la extensión deseada mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatografía por afinidad (Harlow and Lañe Antibodies; a laboratory manual 1988). Los anticuerpos pueden incluir preparaciones de antisuero de una variedad de animales usados comúnmente, por ejemplo cabras, primates, burros, cerdos, caballos, cerdos de guinea, ratas o humanos. Se le extrae sangre a los animales y se recuperan los sueros. Una inmunoglobulina producidos de acuerdo con la presente invención pueden incluir anticuerpos completos, fragmentos o sub fragmentos de anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas completas de cualquier clase, por ejemplo IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con especificidad dual para dos o más antígenos de la invención. También pueden ser fragmentos, por ejemplo F(ab')2, Fab', Fab, Fv y similares, incluyendo fragmentos híbridos. Una inmunoglobulina también incluye proteínas naturales, sintéticas o diseñadas genéticamente, que actúan como un anticuerpo fijándose a antígenos específicos para formar un complejo. Una vacuna de la presente invención se puede administrar a un receptor que luego actúa como una fuente de inmunoglobulina, producida en respuesta a la exposición de la vacuna específica. Un sujeto tratado así, podría donar plasma para el cual la globulina hiperinmunitaria podría ser obtenida por medio de metodología convencional de fraccionamiento de plasma. La hiperinmunoglobulina podría ser administrada a otro sujeto con el fin de impartirle resistencia contra infección estafilocócica o tratarla.
Las hiperinmunoglobulinas de la invención son particularmente útiles para el tratamiento o prevención de enfermedad estafilocócica en niños, individuos comprometidos inmunológicamente o cuando se requiere tratamiento y no hay tiempo para que el individuo produzca anticuerpos en respuesta a la vacunación. Un aspecto adicional de la invención es una composición farmacéutica que contiene dos o más anticuerpos monoclonales (o fragmentos de ellos; preferiblemente humanos o humanizados) reactivos contra al menos dos constituyentes de la composición inmunógena de la invención, la cual podría ser usada para tratar o para prevenir infección con bacterias Gram positivas, preferiblemente estafilococos, más preferiblemente S. aureus o S. epidermidis. Estas composiciones farmacéuticas contienen anticuerpos monoclonales que pueden ser inmunoglobulinas completas de cualquier clase, por ejemplo IgG, IgM , IgA, IgD o IgE, anticuerpos quiméricos o anticuerpos h íbridos con especificidad para dos o más antígenos de la invención. También pueden ser fragmentos, por ejemplo F.(ab')2, Fab', Fab, Fv y similares, incluyendo fragmentos h íbridos. Los métodos para elaborar anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica y pueden incluir la fusión de esplenocitos con células de mieloma (Kohier y Milstein 1975 Nature 256; 495; Antibodies - a laboratory manual Harlow y Lañe 1988). De manera alternativa, se puede obtener fragmentos monoclonales de Fv examinando una biblioteca que muestre fagos apropiados (Vaughan TJ ef al 1998 Nature Biotechnology 16; 535). Los anticuerpos monoclonales pueden ser humanizados o parcialmente humanizados mediante métodos conocidos. Métodos La invención también comprende métodos para elaborar las composiciones inmunógenas y vacunas de la invención . Un proceso preferido de la invención, es un método para elaborar una vacuna que comprende los pasos de mezclar antígenos para elaborar la composición inmunógena de la invención y añadir un excipiente aceptable para uso farmacéutico. Métod os de tratam iento La invención también comprende métodos de tratamiento de infección estafilocócica, particularmente infecciones nosocomiales adquiridas en el hospital. Esta composición inmunógena o vacuna de la invención es particularmente ventajosa de usar en casos de cirugía electiva.
Estos pacientes conocerán la fecha de la cirugía con anterioridad, y podrían ser inoculados previamente. Dado que no se sabe si el paciente estará expuesto a infección por S. aureus o por S. epidermidis, se prefiere inocularlo con una vacuna de la invención que lo proteja contra ambos, como se describió aquí anteriormente.
Preferiblemente los adultos de más de 16 que están esperando cirug ía electiva, se tratan con las composiciones inmunógenas y vacunas de la invención.
También es ventajoso inocular a los trabajadores de la salud con la vacuna de la invención. Las preparaciones para vacuna de la presente invención pueden usarse para proteger o para tratar a un mamífero susceptible de infección, por medio de administrar dicha vacuna por vía sistémica o mucosa. Estas administraciones pueden incluir inyección por medio de las rutas intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o por medio de administración a los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. La cantidad de antígeno en cada dosis de vacuna se selecciona como una dosis que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en las vacunas típicas. Esta cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno específico se emplee y de cómo se presenta. El contenido de proteína de la vacuna típicamente estará en el rango de 1 -100 µg, preferiblemente 5-50 µg, mucho más comúnmente en el rango de 10 - 25 µg. Generalmente, se espera que cada dosis contenga 0J-100 µg de polisacárido cuando esté presente, preferiblemente OJ-50 µg, preferiblemente 0J-10 µg, de los cuales 1 hasta 5 µg es el rango más preferible. Una cantidad óptima para una vacuna en particular, se puede determinar mediante estudios estándar que involucran observación de respuestas inmunitarias apropiadas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o más inmunizaciones de refuerzo separadas adecuadamente. Si bien las vacunas de la presente invención se pueden administrar por cualquier ruta, la administración de las vacunas descritas en la piel (ID) forma una modalidad de la presente invención. La piel humana contiene una cutícula exterior "callosa" denominada el stratum corneum, la cual cubre la epidermis. Debajo de esta epidermis está una capa denominada la dermis, la cual a su vez cubre el tejido cutáneo. Los investigadores han demostrado que la inyección de una vacuna en la piel, y en particular en la dermis, estimula una respuesta inmunitaria, la cual también puede estar asociada con una cantidad de ventajas adicionales. La vacunación intradérmica con las vacunas descritas aquí forma una característica preferida de la presente invención. La técnica convencional de inyección intradérmica "procedimiento Mantoux", comprende los pasos de limpiar la piel, y luego estirarla con una mano, y con el bisel de una aguja calibrada delgada (calibre 26-31) dirigido hacia arriba, se inserta la aguja en un ángulo de entre 10-15°. Una vez que el bisel de la aguja es insertado, se baja el cilindro de la aguja y se empuja más mientras se proporciona una ligera presión para elevarlo bajo la piel. Luego se inyecta el líquido muy lentamente, formando una ampolla o protuberancia sobre la superficie de la piel, y luego se retira lentamente la aguja. Más recientemente, se han descrito dispositivos que están diseñados específicamente para administrar agentes líquidos en o a través de la piel, por ejemplo los dispositivos que se describen en WO 99/34850 y EP 1092444, también los dispositivos de inyección presurizada descritos por ejemplo en WO 01/13977; US 5,480,381, US 5,599,302, US 5,334,144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569,189, US 5,704,911, US 5,383,851, US 5,893,397, US 5,466,220, US 5,339,163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520, 639, US 4,596,556, US 4,790,824, US 4,941,880, US 4,940,460, WO 97/37705 y WO 97/13537. Los métodos alternativos de administración intradérmica de las preparaciones para vacuna pueden incluir jeringas y agujas convencionales, o dispositivos diseñados para el suministro balístico de vacunas sólidas (WO 99/27961 ), o parches transdérmicos (WO 97/48440; WO 98/28037); o aplicados a la superficie de la piel (suministro transdérmico o transcutáneo WO 98/20734; WO 98/28037). Cuando las vacunas de la presente ¡nvención se van a administrar en la piel, o más específicamente en la dermis, la vacuna tiene poco volumen de líquido, particularmente un volumen de entre aproximadamente 0.05 mL y 0.2 mL. El contenido de antígenos en las vacunas cutáneas o intradérmicas de la presente invención puede ser similar a las dosis convencionales que se encuentran en las vacunas intramusculares (véase más arriba). Sin embargo, es una característica de las vacunas cutáneas o intradérmicas que las formulaciones puedan ser de "dosis baja". De acuerdo con esto, los antígenos de proteína en las vacunas de "dosis baja" preferiblemente están presentes en tan poco como 0J hasta 10 µg, preferiblemente 0J hasta 5 µg por dosis; y los antígenos polisacáridos (preferiblemente conjugados) pueden estar presentes en el rango de 0.01 -1 µg, y preferiblemente entre 0.01 y 0.5 µg de polisacárido por dosis. Como se usa aquí, el término "suministro intradérmico" significa el suministro de la vacuna a la región de la dermis en la piel. Sin embargo, la vacuna no necesariamente será colocada exclusivamente en la dermis. La dermis es la capa en la piel ubicada entre aproximadamente 1 .0 y aproximadamente 2.0 mm desde la superficie en la piel humana, pero hay una cierta cantidad de variación entre individuos y en diferentes partes del cuerpo. En general, se puede esperar alcanzar la dermis yendo 1 .5 mm por debajo de la superficie de la piel. La dermis está ubicada entre el stratum corneum y la epidermis en la superficie y la capa subcutánea que está por debajo. Dependiendo del modo de suministro, la vacuna estará localizada finalmente sólo o principalmente dentro de la dermis, o puede ser distribuida finalmente dentro de la epidermis y la dermis. Una modalidad preferida de la invención es un método de prevención o tratamiento de infección o enfermedad estafilocócica que comprende el paso de administrar la composición inmunógena o vacuna de la invención a un paciente que lo necesita. En una modalidad preferida, el paciente está esperando por cirugía electiva. Una modalidad preferida adicional de la invención es el uso de la composición inmunógena de la invención en la fabricación de una vacuna para el tratamiento o prevención de infección o enfermedad estafilocócica, preferiblemente infección estafilocócica posterior a una cirugía. El término 'infección estafilocócica' comprende infección ocasionada por S. aureus y/o S. epidermidis y otras cepas estafilocócicas capaces de ocasionar infección en un mamífero, preferiblemente en un anfitrión humano. Los términos "que contiene", "contienen" y "contiene" que se usan aquí, tienen la intención de los inventores de ser sustituibles opcionalmente con los términos "que consiste en" "consisten" y "consiste", respectivamente, en cada caso. Todas las referencias o solicitudes de patente citadas dentro de esta especificación de patente están incorporadas aquí mediante referencia. Con el fin de que esta invención sea comprendida mejor, se presentan los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son para propósitos de ilustración solamente, y no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la invención de ninguna manera. Ejemplos Ejemplo 1. Construcción de plásmido para expresar proteínas recombinantes A: Clonación. Se diseñaron sitios de restricción apropiados en oligonucleótidos específicos para el gen estafilocócico, los cuales permitieron la clonación direccional del producto de PCR en el plásmido de expresión pET24d o pQ E-30 de E. coli de tal forma que se pudiera expresar u na proteína como una proteína de fusión que contuviera una etiq ueta (H is)6 de cromatografía por afin idad en el término C o N . Los sensibilizadores usados fueron : Toxina alfa - 5'- CGCGGATCCGCAGATTCTGATATTAATATTAAAAC-3' y 5'CCCAAGCTTTTAATTTGTCATTTCTTCTTTTTC-3' EbpS - d'-CGCGGATCCGCTGGGTCTAATAATTTTAAAGATG-S' y 5'CCCAAGCTTTTATGGAATAACGATTTGTTG-3' C IfA - 5'-CGCGGATCCAGTGAAAATAGTGTTACGCAATC-3' y 5'CCCAAGCTTTTACTCTGGAATTGGTTCAATTTC-3' FnbpA - 5'-CGCGGATCCACACAAACAACTGCAACTAACG-3' y 5'CCCAAGCTTTTATGCTTTGTGATTCTTTTTCAAACS' Sbi - 5'-CGCGGATCCAACACGCAACAAACTTC-3' y 5'GGAACTGCAGTTATTTCCAGAATGATAATAAATTAC-3' Sd rC - 5'-CGCGGATCCGCAGAACATACGAATGGAG-3' y 5'CCCAAGCTTTTATGTTTCTTCTTCGTAGTAGC-3' SdrG - 5'-CGCGGATCCGAGGAGAATTCAGTACAAG-3' y 5'CCCAAGCTTTTATTCGTCATCATAGTATCCG-3' Ebh - 5'-AAAAGTACTCACCACCACCACCACC-3' y 5?AAAGTACTCACTTGATTCATCGCTTCAG-3' Aaa - 5'-GCGCGCCATGGCACAAGCTTCTACACAACATAC-3' y 5'GCGCGCTCGAGATGGATGAATGCATAGCTAGA-3' IsaA - 5'- GCATCCATGGCACCATCACCATCACCACGAAGTAAACGTTGATCAAG C-3' y 5'-AGCACTCGAGTTAGAATCCCCAAGCACCTAAACC-3' HarA - 5'-GCACCCATGGCAGAAAATACAAATACTTC-3' y 5TTTTCTCGAGCATTTTAGATTGACTAAGTTG-3' Autolisina glucosaminidasa - 5'- CAAGTCCCATGGCTGAGACGACACAAGATCAAC-3' y 5'- CAGTCTCGAGTTTTACAGCTGTTTTTGGTTG-3' Autolísina amidasa - 5'- AGCTCATATGGCTTATACTGTTACTAAACC-3' y 5'GCGCCTCGAGTTTATATTGTGGGATGTCG-3' IsdA - 5'-CAAGTCCCATGGCAACAGAAGCTACGAACGCAAC-3' y 5?CCAGTCTCGAGTAATTCTTTAGCTTTAGAGCTTG-3' IsdB - 5'-TATTCTCGAGGCTTTGAGTGTGTCCATCATTTG-3' y 5' GAAGCCATGGCAGCAGCTGAAGAAACAGGTGG-3' M RPI I - 5'-GATTACACCATGGTTAAACCTCAAGCGAAA-3' y 5?GGTGTCTCGAGTGCGATTGTAGCTTCATT-3' Los prod uctos de la PCR fueron introducidos primero en el vector de clonación pGEM-T (Novagen) usa ndo células bacteriales Top 1 0, de acuerdo con las instrucciones del fabrica nte. Esta construcción intermedia se elaboró para facilitar la clonación adicional en un vector de expresión . Los transformantes q ue conten ían el inserto de ADN fueron seleccionados med iante a nálisis de enzima de restricción . Después de la d igestión , se ana lizó una alícuota de ~20µ L de la reacción med íante electroforesis en gel de agarosa (0.8 % agarosa en un reg ulador de pH Tris-acetato-EDTA (TAE)). Los fragmentos de ADN se visualizaron mediante iluminación con rayos UV después de electroforesis en gel y de tinción con bromuro de etidio. Un estándar molecular de tamaño de ADN (cadena de 1 Kb, Life Technologies) se sometió a electroforesis en paralelo con las muestras de prueba y se usó para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN. El plásmido purificado de transformantes seleccionados para cada clonación fue digerido luego secuencíalmente hasta que estuvo completo con enzimas de restricción apropiadas según lo recomendado por el fabricante (Life Technologies). El fragmento de ADN se purificó luego usando columnas con espín, con base de gel de sílice antes de la ligación con el plásmido pET24d o pQE-30. La clonación de Ebh (fragmento H2), AaA, IsdA, IsdB, HarA, Atl-amidasa, Atl-glucosamina, MRP, IsaA se llevó a cabo usando el plásmido pET24d y la clonación de CIfA, SdrC, SdrE, FnbpA, SdrG/Fbe, toxina alfa y Sbi se llevó a cabo usando el plásmido pQE-30. B: Producción de vector de expresión Para preparar el plásmido de expresión pET24d o pQE-30 para ligación, se digirió de manera similar hasta su terminación con las enzimas de restricción apropiadas. Se usó un exceso molar de aproximadamente 5 veces de los fragmentos digeridos para el vector preparado, para programar la reacción de ligación. Se realizó una reacción de ligación estándar de -20 µL (-16 °C, -16 horas), usando métodos bien conocidos en la técnica, se realizó usando ADN T4 ligasa (-2.0 unidades / reacción, Life Technologies). Una alícuota de la ligación (-5 µL) se usó para transformar células electro competentes M15(pREP4) o BT21 ::DE3 de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Después de un periodo de excrecencia de -2-3 horas a 37°C en -1.0 mL de caldo de cultivo LB, las células transformadas se colocaron en placas de agar LB que contenían ampicilina (100 µg/mL) y/o kanamicina (30 µg/mL). Se incluyeron antibióticos en la selección. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C durante -16 horas. Se escogieron colonias individuales de ApR/KanR con palillos estériles y se usaron para "parchar" placas LB ApR/KanR recién inoculadas, así como también un cultivo en -1.0 mL de caldo LB Ap/ Kan. Tanto las placas con parche como el cultivo en caldo fueron incubados durante la noche a 37 °C en una incubadora estándar (placas) o en un baño de agua con agitación. Se empleó un análisis de PCR basado en células enteras para verificar que los transformante contenían el inserto de ADN. Aquí, el cultivo en caldo LB Ap/Kan de -1.0 mL de un día para otro, fue transferido a un tubo de polipropileno de 1.5 mL y se recolectaron las células mediante centrifugación en una microcentrífuga Beckmann (-3 min., temperatura ambiente, -12,000 X g). Los granulos de células fueron suspendidos en ~200µL de agua estéril, y se usó una alícuota de -10 µL para programar un volumen final de -50 µL de reacción PCR que contuviera ambos sensibilizadores de amplificación directa e inversa. El paso de desnaturalización a 95°C se aumentó a 3 minutos para asegurar la alteración térmica de las células bacterianas y la liberación de ADN plásmido. Se usó un ciclizador térmico ABI Modelo 9700 y un perfil de amplificación térmica de tres pasos de 32 ciclos, es decir, 95 °C, 45 seg; 55-58 °C, 45 seg, 72 °C, 1min., para amplificar el fragmento BASB203 de las muestras trasnformante lisadas. Después de la amplificación térmica, se analizó una alícuota de ~20µL de la reacción mediante electroforesis en gel de agarosa (0.8 % de agarosa en un regulador de pH Ths-acetato-EDTA (TAE)). Los fragmentos de ADN se visualizaron mediante iluminación con rayos UV después de electroforesis en gel y de tinción con bromuro de etidio. Un estándar molecular de tamaño de ADN (cadena de 1 Kb, Life Technologies) se sometió a electroforesis en paralelo con las muestras de prueba y se usó para estimar el tamaño de los productos de la PCR. Los transformantes que produjeron el producto de PCR del tamaño esperado fueron identificados como cepas que contenían una construcción de expresión de proteína. Las cepas que contenían el plásmido de expresión fueron analizadas luego para determinar la expresión inducible de proteína recombinante. C: Análisis de expresión de transformantes positivos a la PCR Una alícuota del cultivo sembrado durante la noche (-1.0 mL) fue inoculada en un matraz Erlenmeyer de 125 mL que contenía -25 mL de caldo de cultivo LB Ap/Kan, y se cultivó a 37 °C con agitación (-250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó una O.D.600 de -0.5, es decir, fase semi logarítmica (usualmente de aproximadamente 1.5 - 2.0 horas). En este tiempo, aproximadamente la mitad del cultivo (-12.5 mL) fue transferida a un segundo matraz de 125 mL y se indujo la expresión de proteína recombinante mediante la adición de IPTG (solución madre 1.0 M preparada en agua estéril, Sigma) para una concentración final de 1.0 mM. La incubación tanto de los cultivos inducidos por IPTG como de lo son inducidos, continuó durante -4 horas más a 37 C con agitación. Se sacaron muestras (-1.0 mL) de ambos cultivos inducido y no inducido después del periodo de inducción, y se recolectaron las células mediante centrifugación a temperatura ambiente durante -3 minutos. Se suspendieron los granulos de células individuales en -50 µL de agua estéril, luego se mezclaron con un volumen igual de regulador de pH para muestras para SDS-PAGE 2X Laemelli que contenía 2-mercaptoetanol, y se colocaron en un baño de agua hirviendo durante ~3 min para desnaturalizar la proteína. Se cargaron volúmenes iguales (-15 µL) tanto de lisados celulares crudos inducidos por IPTG como de lisados celulares no inducidos, en gel de poliacrilamida con 12% de Ths/glicina (1 mm de espesor, Mini-gels, Novex) por duplicado. Las muestras de lisado inducidas y no inducidas fueron sometidas a electroforesis junto con marcadores de peso molecular teñidos previamente (véase Blue, Novex) bajo condiciones convencionales usando un regulador corriente estándar de SDS/Tris/glicina (BioRad). Después de la electroforesis, un gel se tiñó con azul Commassie brillante R250 (BioRad) y luego se eliminó el teñido para visualizar la nueva proteína o proteínas inducibles por IPTG. El segundo gel se elctrotransfirió sobre una membrana de PVDF (tamaño de poro de 0.45 mieras, Novex) durante -2 h a 4 °C usando un aparato para transferencia BioRad Mini-Protean II y regulador de pH para transferencia metanol de Towbin (20 %). El bloqueo de la membrana y las incubaciones del anticuerpo se realizaron de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Se usó un anticuerpo monoclonal (His)3 anti-RGS, seguido por un segundo anticuerpo de conejo anti-ratón conjugado con HRP (QiaGen), para confirmar la expresión y la identidad de la proteína recombinante. La visualización del patrón reactivo del anticuerpo anti-His se logró usando un sustrato insoluble ABT o usando hiperpelícula con el sistema de quimiolumíniscencia Amersham ECL. Eiemplo 2: Producción de proteína recombinante Cepa bacteriana Se usó una cepa de expresión recombinante de E. coli M15(pREP4) que contenía un plásmido (pQE30) o BL21::DE3 que contenía plásmido pET24d codificador de proteína estafilocócica para producir masa celular para la purificación de proteína recombinante. Medios El medio de fermentación usado para la producción de proteína recombinante consistió en caldo de cultivo 2X YT (Difco) que contenía 100 µg/mL de Ap y/o 30 µg/mL de Km. Se le añadió antiespumante al medio para la fermentadora en 0.25 mL/L (Antifoam 204, Sigma). Para inducir la expresión de la proteína recombinante, se le añadió IPTG (Isopropil ß-D-Tiogalactopiranosida) a la fermentadora (1 mM, final). Producción de proteínas recombinantes Bajo condiciones naturales Se añadió IPTG en una concentración final de 1 mM, y el cultivo se dejó crecer durante 4 horas adicionales. Luego se centrifugó el cultivo a 6,000 rpm durante 10 minutos y se resuspendió el granulado en regulador de pH fosfatado (50 mM de K2HPO4, KH2PO4 pH 7) incluyendo un coctel inhibidor de proteasa. Esta muestra fue sometida a lisis por presión francesa usando una presión de 1500 bar (2 corridas). Después de centrifugación durante 30 minutos a 15,000 rpm, se reservó el supernadante para purificación adicional, y se le añadió NaCI hasta 0.5 M. La muestra se cargó luego en una resina Ni-NTA (columna XK 16 Pharmacia, resina Ni-NTA Qiagen) acondicionada en 50 mM de K2HPO4, KH2PO4 con pH 7. Después de cargar la muestra, se lavó la columna con regulador de pH A (0.2M NaH2PO4 pH7, 0.3M NaCI, 10% de glicerol). Para eluir la proteína unida, se usó un paso gradiente en donde se le añadieron diferentes proporciones de regulador de pH B (0.2 M de NaH2PO4 con pH7, 0.3 M de NaCI, 10% de glicerol y 200 mM de imidazol) al regulador de pH A. La proporción de regulador de pH B fue aumentada gradualmente desde 10% hasta 100%. Después de la purificación, las fracciones eluidas que contenían la proteína fueron agrupadas, concentradas y dializadas contra 0.002 M de KH2PO4/K2HPO4 con pH7, 0J5 M de NaCl. Este método se usó para purificar CIfA, SdrG, IsdA, IsaB, HarA, Atl-glucosamina y toxina alfa. Baio condiciones desnaturalizantes Se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM y el cultivo se dejó crecer durante 4 horas adicionales. Luego se centrifugó el cultivo a 6,000 rpm durante 10 minutos y se resuspendió el granulado en regulador de pH fosfatado (50 mM de K2HPO4, KH2PO4 con pH 7) incluyendo un coctel inhibidor de proteasa. Esta muestra se sometió a lisis por presión francesa usando una presión de 1500 (2 corridas). Después de centrifugación durante 30 minutos a 15,000 rpm, se lavó el granulado con regulador de pH fosfatado incluyendo 1 M de urea. La muestra se centrifugó durante 30 min a 15000 rpm y se resuspendió el granulado en 8 M de urea, 0.1 M de NaH2PO4, 0.5 M de NaCI, 0.01 M de Tris-HCl pH8 y se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente. La muestra fue centrifugada durante 20 minutos a 15000 rpm y se recolectó el supernadante para purificación adicional. La muestra se cargó luego en una resina de Ni-NTA (columna XK 16 Pharmacia, resina Ni-NTA Qiagen) acondicionada en 8 M de urea, 0J M de NaH2PO4, 0.5 M de NaCI, 0.01 M de Tris-Hcl con pH 8. Después del paso del flujo a través, la columna se lavó sucesivamente con regulador de pH A (8M de Urea, 0J M de NaH2PO4, 0,5 M de NaCI, 0.01 M de Tris, pH 8.0), regulador de pH C (8M de Urea, 0J M de NaH2PO4, 0.5 M de NaCI, 0.01 M de Tris, pH 6.3), regulador de pH D (8M de Urea, 0J M de NaH2PO4, 0.5 M de NaCI, 0.01 M de Tris, pH 5.9) y regulador de pH E (8 M de Urea, 0J M de NaH2PO4, 0.5 M de NaCI, 0.01 M de Tris, pH 4.5). La proteína recombinante se eluyó de la columna durante los lavados con regulador de pH D y E. La proteína recombinante desnaturalizante se pudo solubilizar en una solución desprovista de urea. Para este fin, la proteína desnaturalizante contenida en 8M de urea fue dializada sucesivamente contra 4 M de urea, OJ M de Na2PO4, 0.01 M de Tris-HCl, pH7J, 2 M de urea, OJ M de NaH2PO4, 0.01 M de Tris-HCl, pH 7?, 0.5 M de arginina y 0.002 M de KH2PO4/K2HPO4 con pH7J, 0J5 M de NaCI, 0.5 M de argínina.
Este método se usó para purificar Ebh (fragmento H2), AaA, SdrC, FnbpA, Sbi, Atl-amidasa y IsaA. Las proteínas purificadas fueron analizadas por SDS-PAGE. Los resultados para una proteína purificada bajo condiciones naturales (toxina alfa) y una proteína purificada bajo condiciones desnaturalizantes (SdrC) se muestran en las Figuras 3 y 4. Eiemplo 3. Preparación de Polisacáridos Se prepara PNAG como se describe en Joyce ef al 2003, Carbohydrate Research 338; 903- 922. Los polisacáridos tipo 5 y tipo 8 son extraídos de S. aureus como se describe en Infection and Immunity (1990) 58(7); 2367. El LTA es extraído de estafilococos como se describe en Fischer W, et al Eur. J. Bíochem. (1983) 133; 523 o como se describe en Morath ef al J. Exp. Med.2001 ; 193; 393-397. Química de activación y acoplamiento Se disuelve el polisacárido natural en NaCI 2 M o en agua. La concentración óptima del polisacárido se evalúa para todos los serotipos, y está entre 2mg/mL y 5mg/mL. De una solución madre de 100 mg/mL en acetonitrilo, se le añade CDAP (proporción CDAP/PS:0.75 mg/mg de PS) a la solución de polisacárido. 1.5 minutos después, se le añade 0.2 M de trietilamina para obtener el pH de activación específico (pH 8.5-10.0). La activación del polisacárido se realiza con este pH durante 2 minutos a 25 °C. Se añade la proteína portadora al polisacárido activado en una cantidad suficiente para dar una proporción molar de 1/1 y la reacción de acoplamiento se realiza en el pH específico durante 1 hora. Luego se extingue la reacción con glicina durante 30 minutos a 25 °C y durante la noche a 4°C. Los conjugados se purifican mediante filtración en gel usando una columna de filtración con gel Sephacryl 500HR equilibrada con 0.2 M de NaCl. Se determinan los contenidos de carbohidratos y proteínas de las fracciones eluidas. Los conjugados se agrupan y se filtran de manera estéril en una membrana esterilizante de 0.22 µm. Se determinan las proporciones de PS/Proteína en las preparaciones de conjugados. Caracterización: Cada conjugado se caracteriza según su contenido de proteína y polisacárido. Se mide el contenido de polisacárido mediante la prueba con Resorcinol y el contenido de proteína se mide mediante la prueba Lowry. Se determina la proporción final de PS/PD ratio (p/p) mediante la proporción de las concentraciones. Contenido residual de DMAP (ng/µq PS): La activación del polisacárido con CDAP introduce un grupo cianato en el polisacárido y se libera DMAP (4-dimetilamino-piridina).
El contenido residual de DMAP se determina mediante un análisis específico desarrollado, y se valida en GSK. Contenido de polisacárido libre (%): Se determina el contenido de polisacárido libre en los conjugados mantenidos a 4 °C o almacenados durante 7 días a 37 °C en el supernadante obtenido después de la incubación con anticuerpos portadores a y sulfato de amonio saturado, seguido por una centrifugación. Se usa un ELISA a-PS/a-PS para la cuantificación de polisacárido libre en el supernadante. La ausencia de conjugado se controla también mediante un ELISA de portador a/PS a. Eiemplo 4. Formulación Composiciones adyuvantes La proteína, ya sea individualmente o junta, de los ejemplos anteriores, puede ser formulada con la combinación de polisacáridos estafilocócicos y como adyuvante, la formulación puede contener una mezcla de lípido A monofosforilado 3 des-O-acilado (3D-MPL) e hidróxido de aluminio, o de lípido A monofosforilado 3 des-O-acilado (3D-MPL) y fosfato de aluminio, o de 3D-MPL y/o QS21 opcionalmente en una emulsión de aceite/agua, y opcionalmente formulado con colesterol, o sal de aluminio sola, preferiblemente fosfato de aluminio. 3D-MPL: es una forma químicamente destoxifícada del lipopolisacárido (LPS) de la bacteria Gram-negativa Salmonella minnesota. Experimentos realizados en GSK Biologicals han demostrado que el 3D-MPL combinado con diversos vehículos mejora fuertemente tanto el tipo de inmunidad celular humoral como el TH1.
QS21 : es una saponina purificada de un extracto crudo de la corteza del árbol Quillaja Saponaria Molina, la cual tiene una fuerte actividad adyuvante: activa tanto la linfoproliferación específica para antígeno como la CTL para diversos antígenos. La vacuna que contiene un antígeno de la invención que contiene 3D-MPL y alum se puede preparar de manera análoga a la que se describe en WO93/19780 o en 92/16231. Experimentos realizados en GSK Biologicals han demostrado un claro efecto sinérgico de combinaciones de 3D-MPL y QS21 en la inducción de las respuestas inmunitarias celulares tanto humoral como de tipo TH1. Las vacunas que contienen un antígeno de estos se describen en US 5750110. La emulsión de aceite/agua está compuesta de dos aceites (un tocoferol y escualeno), y de PBS que contiene Tween 80 como emulsificante. La emulsión contenía 5% de escualeno, 5% de tocoferol, 0.4% de Tween 80 y tuvo un tamaño promedio de partícula de 180 nm y se conoce como SB62 (véase WO 95/17210).
Experimentos realizados en GSK Biologicals han probado que la adjunción de esta emulsión de aceite en agua a MPL/QS21 aumenta adicionalmente sus propiedades inmunoestimulantes. Preparación de emulsión SB62 (concentrada 2 veces) Se disuelve Tween 80 en salina fosfatada regulada (PBS) para dar una solución al 2% en la PBS. Para proporcionar 100 mL de emulsión concentrada 2 veces, se sometieron a vórtice 5g de DL alfa tocoferol y 5 mL de escualeno hasta mezclar por completo. Se le añadió 90 mL de solución de PBS/Tween y se mezcló completamente. La solución resultante se hizo pasar entonces a través de una jeringa y finalmente se microfluidizó usando una máquina para microfluidos M110S. Las gotitas resultantes de aceite tenían un tamaño de aproximadamente 180 nm. Eiemplo 5 Experimentos con animales Se obtuvieron ratones CD-1 hembras de 8 a 10 semanas de edad en Charles River Laboratories, Kingston, Mass. Para los estudios de letalidad, cinco grupos de 9 a 11 ratones CD-1 se expusieron por vía intraperitoneal (i.p.) con diluciones en serie de S. aureus cultivados en placas CSA. Los tamaños inoculares abarcan desde -1010 hasta 108 CFU/ratón. La mortalidad se evalúa sobre una base diaria durante 3 días. La dosis letal del 50% (LD50) se estima usando un modelo Probit de la relación dosis-respuesta. La hipótesis nula de las LD50 comunes fue sometida a prueba mediante la prueba de índice de probabilidad. La bacteremia subletal se inicia exponiendo grupos de 8 a 20 ratones por vía intravenosa (i.v.) con -2 x 106 CFU/ratón o por vía i.p. con - 2 x 107 CFU/ratón. Después de la inoculación, se extrae sangre de la cola de grupos de animales por separado, en momentos especificados, y se estiman los niveles de bacteremia mediante conteos en placa cuantitativos realizados por duplicado en placas de agar con soya trípticas con 5% de sangre de oveja (Becton Dickinson Microbíology Systems). La significación estadística se determina con la modificación Welch de la prueba t de Student no apareada. Eiemplo 6 Metodología general para determinar respuestas de anticuerpos en diversos mamíferos Los sueros fueron analizados mediante ELISA con respecto a los anticuerpos IgG para los polisacáridos estafilocócícos. De manera resumida, se recubren polisacáridos capsulares purificados de ATCC (Rockville, Md, 20852) a 25 µg/mL en salina fosfatada regulada (PBS) en placas para microtitulación de alta fijación (Nunc Maxisorp) durante la noche a 4 °C. Las placas se bloquean con 10% de suero fetal de ternera (FCS), 1 hora a 37 °C. Las muestras de suero se incuban previamente con 20 µg/mL del polisacárido de pared celular c (Statens Serum Institute, Copenhague) y 10% de FCS a temperatura ambiente durante 30 minutos para neutralizar los anticuerpos para este antígeno. La muestras se diluyen luego dos veces en la microplaca en 10% de FCS en PBS, y se equilibran a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación. Después de lavarse, las microplacas se equilibran con anticuerpo monoclonal Fc anti IgG humana marcados con peroxidasa (HP6043-HRP, Stratech Scientific Ltd) diluidos 1:4000 en 10% de FCS en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. El análisis ELISA se realiza para medir la IgG de rata usando IgG de cabra anti-rata AffiniPure conjugado con peroxidasa de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (H + L) (código 112-035-003) a 1:5000. Las curvas de titulación se refieren a suero estándar para cada serotipo usando comparación logarítmica logística mediante el software SoftMax Pro. Las concentraciones de polisacáridos usadas para recubrir la placa ELISA son de 10-20 µg/mL. El color se revela usando 4 mg de OPD (Sigma) por 10 mL de regulador citrato 0.1 M con pH 4.5, con 14 µL de H2O2 durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detiene con 50 µL de HCl, y la densidad óptica se lee a 490 nm con relación a 650 nm. Las concentraciones de IgG se determinan mediante referencia de titulación con respecto a la curva de calibración modelada usando una ecuación logarítmica logística de 4 parámetros calculada mediante el software SoftMax Pro. La prueba ELISA para medir la IgG murina y de rata con respecto a los polisacáridos estafilocócicos es similar, con las siguientes excepciones. Se empleó IgG anti-ratón de cabra AffiniPure conjugado con peroxidasa (H + L) e IgG anti-rata de cabra AffiniPure (H + L) de Jackson ImmunoLaboratories Inc. para detectar la fijación a IgG.
El HP6043-HRP reacciona igualmente con IgG purificada humana y de Rhesus, y por ello este reactivo se usa para antisuero de Rhesus. La prueba ELISA de la proteína se realiza de manera similar a la ELISA del polisacárido con las siguientes modificaciones. La proteína es recubierta durante la noche a 2.0 µg/mL en PBS. Las muestras de suero se diluyen en PBS que contiene 10% de suero fetal bovino y OJ % de alcohol polivinílico. El anticuerpo en suero humano fijado se detecta usando anticuerpo purificado por afinidad de cabra conjugado con peroxidasa Sigma para Fc de IgG humana (referencia A-2290). Eiemplo 7 Análisis de opsonofagocitosis. La eliminación opsonofagocitósica in vitro de S. aureus por leucocitos humanos polimorfonucleares (PMN) se realiza como se describe en Xu ef al 1992 Infect. Immun. 60; 1358. Los PMN humanos se preparan a partir de sangre heparinizada mediante sedimentación en 3% de dextran T- 250. La mezcla de reacción opsónica (1 mL) contiene - 106 PMN en medio RPMl 1640 complementado con 10% de suero fetal de ternera inactivado por calor, - 108 CFU de S. aureus, y 0.1 mL del suero o preparación de IgG de prueba. Se usa suero de conejo hiperinmunizado como control positivo, y se usó 0.1 mL de suero de conejo no inmune como una fuente completa para las muestras de IgG. Las mezclas de la reacción se incuban a 37 °C, y se transfieren las muestras bacteriales a 0, 60, y 120 min en agua y se diluyen subsiguientemente, se diseminan en placas de agar de soya trípticas y se incuban a 37 °C para el conteo bacterial después de ¡ncubación de un día para otro. Eiemplo 8 Immunogenicidad de proteínas estafilocócicas en ratones v conejos Se inmunizó a los animales con proteínas estafilocócicas purificadas con el fin de generar sueros hiperinmunes. Se inmunizó a los ratones tres veces (días 0, 14 y 28) con 10 µg de cada una de las proteínas auxiliadas en Specol. Los conejos se inmunizaron tres veces (días 0, 21 y 42) con 20 µg de cada una de las proteínas, auxiliadas en Specol. Se recolectaron los sueros inmunes y se evaluaron en ELISA en células enteras anti proteína y en células enteras anti muertas. ELISA Anti-Proteína: Se recubrió la proteína purificada a 1 µg/mL en salina fosfatada regulada (PBS) en placas para microtitulación de alta fijación (Nunc Maxisorp) durante la noche a 4° C. Las placas fueron bloqueadas con PBS-BSA 1 %, durante 30 min a temperatura ambiente con agitación. Luego se diluyeron las muestras de la prueba 1/1000 y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación. Después del lavado, se detectó anticuerpo murina o de conejo fijado usando IgG anti-ratón de cabra AffiniPure conjugada con peroxidasa de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (ref: 115-035-003) o IgG anti- conejo de cabra AffiniPure (H + L) (ref: 11-035-003) diluida 1:5000 en PBS-Tween al 0.05%. Los anticuerpos de detección se incubaron durante 30 min. a temperatura ambiente con agitación. Se reveló el color usando 4 mg OPD (Sigma) + 5 µL H2O2 por 10 mL pH 4.5 0J M regulador citrato de pH durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Se detuvo la reacción con 50 µL de HCl, y la densidad óptica se leyó a 490 nm con relación a 650 nm. La O.D. para una dilución de 1/1000 de Post lll se comparó con la O.D. obtenida con la misma dilución de sueros previamente inmunizados. Los resultados generados con sueros de ratones y conejo se presentan en la Figura 5. SE observó una buena seroconversión contra cada antígeno La evaluación de suero dirigido contra SBI fue impedida debido a la actividad fijadora a Ig de esta proteína. ELISA en células enteras anti muertas: Se recubrieron células enteras muertas (inactivadas por calor o por formaldehido) de S. aureus tipo 5 y 8 o de la cepa Hay de S. epidermidis a 20 µg/mL en salina fosfatada regulada (PBS), en placas para microtitulación de alta fijación (Nunc Maxisorp) durante la noche a 4° C con evaporación. Las placas fueron bloqueadas con PBS-BSA 1% 30 min a temperatura ambiente con agitación. Se neutralizó la proteína A mediante la adición de 10µg/mL de anti-proteína A de pollo purificada por afinidad (ref. ICL: CPA-65A-2) diluida en PBS-Tween al 0.05% seguida por incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se diluyeron las muestras de prueba dos veces en la microplaca en PBS-0.05% de una dilución inicial a 1/10 y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Después del lavado, se detectó el anticuerpo murino o de ratón fijado usando IgG anti-ratón de cabra AffiniPure conjugada con peroxidasa (H + L) de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (ref: 115-035-003) o IgG anti-conejo de cabra AffiníPure (H + L) (ref: 11-035-003) diluido 1:5000 en PBS-Tween al 0.05%. Estos anticuerpos de detección se incubaron durante 30 min. a temperatura ambiente con agitación. Se reveló el color usando 4 mg OPD (Sigma) + 5 µL H2O2 por 10 mL pH 4.50.1 M de regulador citrato durante 15 minutos en la oscuridad, a temperatura ambiente. Se detuvo la reacción con 50 µL HCl, y la densidad óptica se leyó a 490 nm con relación a 650 nm. Se debe notar que los niveles de expresión de proteínas en estafilococos variarán dependiendo de las condiciones de cultivo. Por lo tanto, un resultado negativo puede reflejar la elección de condiciones de cultivo incorrectas en lugar de una carencia de inmunogenicidad. Los resultados usando sueros de ratón se muestran en la Tabla 5 y algunos de los gráficos se muestran en la figura 6. Se observa un débil reconocimiento de la cepa 5 de S. aureus con el suero dirigido contra SdrC, FnbpA, Ebh, Sbi e IsaA. El reconocimiento de la cepa 8 de S. aureus solamente se observa con el suero dirigido contra Sbi. Se observa un débil reconocimiento de Hay de S. epidermidis con el suero dirigido contra Atl amidasa, MRP, IsdA, IsaA, Ebh, Aaa y Sbi. Una selección de los resultados generados usando suero de conejo se muestra en la figura 7 y se resume en la Tabla 6. Se observó un reconocimiento muy bueno de las tres cepas con IsaA y con IsdB. Se observó un débil reconocimiento de las tres cepas con HarA, a pesar de que los animales solamente recibieron una inyección en lugar de las tres inyecciones usadas para las otras proteínas. Ta b l a 5 Tabla 6 Eiemplo 8 Eficacia de combinaciones de proteínas estafilocócicas en un modelo de colonización nasal Se inoculó a quince grupos de tres ratas del algodón con combinaciones de ocho antígenos estafílocócicos y cinco ratas del algodón que actuaron como controles fueron tratadas sin antígeno. Estos dieciséis grupos son los siguientes: Grupo 1 - Atl-glucosamina, Atl-amidasa, AAA, toxina alfa, SdrC, SdrG, Ebh, Sbi Grupo 2 - Atl-glucosamina, Atl-amidasa, IsdA, IsdB, CIfA, SdrC, Ebh, FnbpA Grupo 3 - Atl-glucosamina, Atl-amidasa, HarA, IsdA, MRP, IsdB, AAA, toxina alfa Grupo 4 - Atl-glucosamina, HarA, IsdA, AAA, CIfA, IsaA, Ebh, Sbi Grupo 5 - HarA, MRP, AAA, toxina alfa, CIfA, SdrC, Ebh, FnbpA Grupo 6 - IsdA, IsdB, AAA, toxina alfa, CIfA, SdrG, Sbi, FnbpA Grupo 7 - Atl-aminidasa, IsdA, MRP, AAA, IsaA, SdrG, Ebh, FnbpA Grupo 8 - Control Grupo 9 - Atl-glucosamina, IsdA, MRP, toxina alfa, IsaA, SdrC, Sbi, FnbpA Grupo 10 - Atl-glucosamina, MRP, IsdB, AAA, CIfA, IsaA, SdrC, SdrG Grupo 11- Atl-amidasa, MRP, IsdB, toxina alfa, CIfA, IsaA, Ebh, Sbi Grupo 12 - Atl-glucosamina, HarA, IsdB, toxina alfa, IsaA, SdrG, Ebh, FnbpA Grupo 13 - Atl-amidasa, HarA, IsdB, AAA, IsaA, SdrC, Sbi, FnbpA Grupo 14 - Atl-glucosamina, Atl-amidasa, HarA, MRP, CIfA, SdrG, Sbi, FnbpA Grupo 15 - Atl-amidasa, HarA, IsdA, toxina alfa, CIfA, IsaA, SdfC, SdrG Grupo 16 - HarA, IsdA, MRP, IsdB, SdrC, SdrG, Ebh, Sbi Cada mezcla de antígenos contenía 3µg de cada antígeno mezclado con un adyuvante elaborado de liposomas que contenía MPL y QS21. Las ratas del algodón fueron inoculadas tres veces los días 1, 14 y 28 del experimento. Dos semanas después de la inoculación, se evaluó la eficacia de las inmunizaciones usando un análisis de colonización nasal como se describe en Kokai-Kun et al (2003) Antimicrob. Agents. Chemother.47; 1589-1597. Se llevó a cabo un análisis clásico de regresión lineal múltiple de los datos, usando el software "Design Expert 6". La presencia de un antígeno se codificó como +1 y la ausencia de un antígeno se codificó como -1. Usando la ecuación del modelo fue posible determinar cuáles antígenos fueron los antígenos clave que produjeron una gran disminución en la cantidad de colonias por nariz. Resultados Los resultados del análisis de colonización nasal se muestran en la Tabla 7. El grupo de control tuvo una media logarítmica de CFU/nariz de 3.51335 y se pudo observar una disminución en la colonización nasal para todos los grupos de rata del algodón inoculados con proteínas estafilocócicas. Los grupos 4, 9 y 13 mostraron la mayor disminución en la colonización nasal con una disminución por encima de 2 log en CFU/nariz. Los grupos 12 y 16 también dieron buenos resultados, mostrando una disminución de aproximadamente 2 log en CFU/nariz. Tabla 7 La contribución de antígenos específicos dentro de la mezcla de antígenos se calculó usando análisis de regresión múltiple de los datos de colonización nasal. El modelo final contiene los siete mejores antígenos. Los resultados para estos antígenos se muestran en la Tabla 8. Dentro del contexto de la mezcla de proteínas, la inclusión de HarA dio la mayor disminución en la colonización nasal, seguida por IsaA, Sbi, SdrC, autolisina-glucosamina, MRP y Ebh. Tabla 8 Efectos en diferencia de log CFU/nariz e índice de CFU/nariz para los siete meiores antígenos en el modelo y valores de p correspondientes.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunógena que contiene PNAG estafilocócico y polisacárido u oligosacárido capsular de tipo 8 de S. aureus.
2. La composición inmunógena de la reivindicación 1, que contiene además polisacárido u oligosacárído capsular de tipo 5 de S. aureus.
3. La composición inmunógena de la reivindicación 1 o 2, que contiene además polisacárido u oligosacárido capsular de tipo I y/o de tipo II y/o de tipo lll de S. epidermidis.
4. La composición inmunógena de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizada además porque el PNAG proviene de una bacteria estafilocócica.
5. La composición inmunógena de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 4, que además contiene una proteína estafilocócica o un fragmento de ella.
6. La composición inmunógena de la reivindicación 5, caracterizada además porque la proteína estafilocócica o fragmento de ella es una proteína fijadora de componente extracelular seleccionada del grupo que consiste en receptor de laminina, proteína fijadora de SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína fijadora de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, lipasa GehD, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína fijadora de vitronectina, coagulasa, y MAP.
7. La composición inmunógena de la reivindicación 5, caracterizada además porque la proteína estafilocócica o fragmento de ella es una proteína transportadora seleccionada del grupo que consiste en transportadora inmunodominante ABC, IsdA, IsdB, transportadora de Mg2 + , transportadora ABC SitC y Ni.
8. La composición inmunógena de la reivindicación 5, caracterizada además porque la proteína estafilocócica o fragmento de ella es una toxina o regulador de virulencia seleccionada del grupo que consiste en toxina alfa (Hia), toxina alfa mutante H35R, proteína activadora de ARN lll (RAP).
9. La composición inmunógena de cualquiera de las reivindicaciones 5 hasta 8 que contiene 2 o más proteínas estafilocócicas seleccionadas de al menos 2 grupos diferentes seleccionados de: a) al menos una proteína fijadora de componente extracelular estafilocócica o fragmento de ella, seleccionada del grupo que consiste en receptor de laminina, EbhA, EbhB, proteína fijadora de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, lipasa GehD, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, proteína fijadora de vitronectina, coagulasa, y MAP; b) al menos una proteína transportadora estafilocócica o fragmento de ella seleccionada del grupo que consiste en transportadora ABC inmunodominante, IsdA, IsdB, transportadora de Mg2 + , transportadora ABC SitC y Ni; c) al menos un regulador de virulencia estafilocócico, toxina o fragmento de ella seleccionado del grupo que consiste en toxina alfa (Hia), mutante H35R de toxina alfa, proteína activadora de ARN II (RAP).
10. La composición inmunógena de cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 9, caracterizada además porque un polisacárido estafilocócico se conjuga con un portador de proteína.
11. La composición ¡nmunógena de la reivindicación 10 u 11, caracterizada además porque el portador de proteína contiene una proteína estafilocócica o fragmento de ella seleccionado del grupo que consiste en receptor de laminína, EbhA, EbhB, proteína fijadora de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, lipasa GehD, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína fijadora de vitronectina, coagulasa, MAP, transportadora ABC inmunodominante, IsdA, IsdB, transportadora de Mg2 + , SitC, transportadora ABC NI, toxina alfa (Hia), mutante H35R de toxina alfa, y proteína activadora de ARN II (RAP). 13. La composición inmunógena de la reivindicación 10 u 11, caracterizada además porque la proteína portadora se selecciona del grupo que consiste en toxoide tetánico, toxoide diftérico, CRM197, proteína D de Haemophilus influenzae, exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa, neumolísina neumocócica y toxoide alfa. 14. La composición inmunógena de las reivindicaciones 1 hasta 13, la cual es capaz de generar una respuesta inmunitaria efectiva contra S. aureus y S. epidermidis. 15. Una vacuna que contiene la composición inmunítaria de las reivindicaciones 1 hasta 14 y un excipiente aceptable para uso farmacéutico. 16. Un método para elaborar una vacuna, que comprende los pasos de mezclar antígenos para elaborar la composición inmunógena de las reivindicaciones 1 hasta 14 y añadir un excipiente aceptable para uso farmacéutico. 17. Un método para prevenir o tratar infección estafilocócica , que comprende el paso de administrar la vacuna de la reivindicación 15 a un paciente que lo necesita. 18. Un uso de la composición inmunógena de las reivindicaciones 1 hasta 14, en la fabricación de una vacuna para el tratamiento o prevención de infección estafilocócica.
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