MX2007002094A

MX2007002094A - Dominios y epitopos de proteina nmb1870 de meningococos.

Info

Publication number: MX2007002094A
Application number: MX2007002094A
Authority: MX
Inventors: Vega Masignani; Mariagrazia Pizza; Rino Rappuoli; Maria Scarselli; Marzia Giuliani; Federica Di Marcello; Daniele Veggi; Laura Ciucchi
Original assignee: Chiron Srl
Priority date: 2004-09-01
Filing date: 2005-09-01
Publication date: 2007-04-24
Also published as: WO2006024954A9; EP1784419A2; PT1784419E; CN101031584B; RS52634B; JP2011168611A; BRPI0514829A; JP4827196B2; GB0419408D0; AU2005278904B2; PL1784419T3; CY1113554T1; WO2006024954A3; HRP20130036T1; ES2396422T3; CA2578014A1; SI1784419T1; RU2375374C2; JP2008511306A; EP1784419B1

Abstract

La `NMB1870?? es un proteina de superficie conocida en Neisseria meningitidis expresada a traves de todos los serogrupos. Hay tres familias distintas. El suero producido contra una familia dada es bactericida dentro de la misma familia, pero no es activo contra cepas que expresan una de las otras dos familias, esto es, proteccion cruzada intra-familia pero no Inter.-familia. Los inventores han encontrado que NMB1870 puede dividirse en dominios, y que no todos los dominios se requieren para antigenicidad. Los dominios antigenicos pueden tomarse de cada uno de las tres familias NMB1870 y expresarse como una cadena de polipeptido sencilla. Los inventores tambien han encontrado que NMB1870 expone algunos de sus epitopos en los rizos de superficie situados entre helices alfa, y que la substitucion de epitopos de rizo de una familia en la posicion del rizo en otra familia permite que la NMB1870 quimerica se produzca con antigenicidad multi-familia. De esta manera, se proporcionan proteinas NMB1870 quimericas que comprenden porciones de NMB1870 de diferentes familias.

Description

DOMINIOS Y EPITOPOS DE PROTEINA NMB1870 DE MENINGOCOCOS Campo de la Invención Esta invención está en el campo de inmunización y, en particular, la inmunización contra enfermedades causadas por bacterias patogénicas en el género Neisseria, tales como N.meningi tidie (meningococos) .

Antecedentes de la Invención La Neisseria meningi tidis es un bacteria encapsulada Gram negativa que coloniza el tracto respiratorio superior de aproximadamente el 10% de la población humana. No obstante que el polisacárido y vacunas conjugadas están disponibles contra los serogrupos A, C, W135 e Y, este enfoque no aplica al serogrupo B debido a que el polisacárido capsular es un polímero de ácido polisiálico, que es un autoantígeno en humanos. Para desarrollar una vacuna contra el serogrupo B, se han usado las proteínas expuestas a la superficie contenidas en las vesículas de membrana exterior (OMVs) . Estas vacunas ejercen respuestas de anticuerpo bactericida de suero y protegen contra la enfermedad, pero fallan para inducir la protección de cepa cruzada [1] . Algunos trabajadores se han enfocado por lo tanto en antígenos meningococales específicos para usarse en vacunas. Ref: 179848 Uno de tales antígenos es 'NMB 1870 X Esta proteína se describió originalmente como la proteína '741' de la cepa MC58 [SEQ IDs 2535 y 2536 en ref. 2; SEQ ID 1 en la presente], y se ha referido también como XGNA1870' [ref. 3, seguido por ref. 4] y como ?ORF2086' [5,6]. Esta proteína se expresa a través de todos los serogrupos de meningococos y se han encontrado en múltiples cepas de meningococos. La secuencia NMB1870 se agrupa en tres familias, y se ha encontrado que el suero que resulta contra una familia dada es bactericida dentro de la misma familia, pero no es activo contra cepas que expresan una de las otras dos familias, esto es, hay protección cruzada intra-familia, pero no protección cruzada inter-familia. Para alcanzar la protección de cepa cruzada usando NMB1870, por lo tanto, más de una familia se usa. Para evitar la necesidad de expresar y purificar proteínas separadas, se ha propuesto expresar diferentes familias como proteínas híbridas [7] , incluyendo dos o tres de las familias en una cadena de polipéptido sencilla. Varios híbridos se han probado y dan una eficacia anti-meningococal alentadora. Es un objeto de la invención proporcionar metodologías adicionales y mejoradas para vencer la especificidad de familia de protección proporcionada por NMB1870, y usar estas metodologías para proporcionar inmunidad contra enfermedad e/o infección meningococal, particularmente para el serogrupo B.

Breve Descripción de la Invención Los inventores han encontrado que NMB1870 puede dividirse en dominios, y que no todos los dominios se requieren para antigenicidad. Los dominios antigénicos pueden tomarse de cada una de las tres familias NMB1870 y se expresan como una cadena de polipéptido sencillo. Este enfoque es más simple que el que expresa las secuencias NMB1870 completas final a final en una cadena de polipéptido sencilla. Los inventores también han encontrado que NMB1870 expone algunos de sus epítopos en los rizos de superficie situados entre las hélices alfa. La substitución de los epítopos de rizo de una familia en la posición de rizo en otra familia permite que el NMB1870 quimérico se produzca con una antigenicidad multi-familia. De esta manera, la invención proporciona proteínas NMB1870 quiméricas que comprenden las porciones de NB1870 de diferentes familias. Aunque cada familia NMB1870 puede producir anticuerpos (por ejemplo, en ratones) que son efectivos sólo contra cepas en la misma familia NMB1870, los polipéptidos quiméricos de la invención pueden producir anticuerpos que reconocen proteínas N B1870 de más de una familia. Las respuestas de anticuerpo bactericidas se miden convenientemente en ratones y son un indicador estándar de la eficacia de la vacuna [por ejemplo, ver la nota final 14 de la referencia 4] . Las proteínas quiméricas puede producir preferiblemente una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra al menos una cepa N. meningi tidis de cada uno de al menos dos de los siguientes tres grupos de cepas: (I) MC58, gbl85 (=M01-240185) , m4030, m2197, m2937, isslOOl, NZ394/98, 67/00, 93/114, bzl98, ml390, nge28, Inpl7592, 00-241341, f6124, 205900, ml98/172, bzl33, gbl49 (=M01-240149) , nm008, nm092, 30/00, 39/99, 72/00, 95330, bzl69, bz83, cu385, h44/76, ml590, m2934, m2969, m3370, m4215, m4318, n44/89, 14847. (II) 961-5945, 2996, 96217, 312294, 11327, a22, gb013 (=M01-240013) , e32, ml090, m4287, 860800, 599, 95N477, 90-18311, cll, m986, m2671, 1000, ml096, m3279, bz232, dk353, m3697, ngh38, L93/4286. (III) M1239, 16889, gb355 (=M01-240355) , m3369, m3813, ngpl65. Por ejemplo, un polipéptido quimérico puede producir una respuesta bactericida contra dos o más de los serogrupos B de N. meningi tidis de cepas MC58, 961-5945 y M1239. El polipéptido quimérico puede producir preferiblemente una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra al menos 50% de las. cepas del serogrupo B meningococal clínicamente relevantes (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más) . El polipéptido quimérico puede producir una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra cepas del serogrupo B N.meningitidis y cepas de al menos uno (por ejemplo, 1, 2, 3, 4) de serogrupos A, C, W135 e Y. El polipéptido quimérico puede producir una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra cepas de N. gonococcus y/o N. cinérea . El polipéptido quimérico puede producir una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra cepas de al menos dos de las tres ramificaciones principales del dendrograma mostrado en la Figura 5 de la referencia 3. El polipéptido quimérico puede producir una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra las cepas de N. meningi tidis en al menos 2 (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7) de los linajes hipervirulentos ET-37, ET-5, grupo A4, linaje 3, subgrupo I, subgrupo III, y subgrupo IV-1 [8,9]. Las quimeras pueden inducir adicionalmente respuestas de anticuerpo bactericidas contra uno o más linajes hiperinvasivos . Las quimeras pueden producir una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra cepas de N. meningi tidis en al menos 2 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7) de los siguientes tipos de secuencia multiubicación: ST1, ST4, ST5, ST8, ST11, ST32 y ST41 [10]. La quimera también puede producir una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra cepas ST44.

La composición no necesita inducir anticuerpos bactericidas contra cada una y todas las cepas MenB dentro de los linajes específicos o MLST; al contrario, para cada grupo dado de cuatro o más cepas de meningococos del serogrupo B son bactericidas contra al menos 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90% o más) del grupo. Los grupos preferidos de cepas incluirán cepas aisladas de en al menos cuatro de los siguientes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR, y CU. El suero preferiblemente tiene una concentración bactericida de al menos 1024 (por ejemplo, 210, 211 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 o superior, preferiblemente al menos 214) esto es, el suero es capaz de eliminar al menos 50% de la bacteria de prueba de una cepa particular cuando se diluye 1:1024 por ejemplo, como se describe en la nota final 14 de la referencia 4. Los polipéptidos quiméricos preferidos pueden producir una respuesta de anticuerpo en ratones que se mantiene bactericida aún cuando el suero se diluye 1:4096 o adicional .

Dominios NMB1870 La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de familia I N B1870 de longitud completa del serogrupo B cepa MC58: MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLK LAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQ IQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNG KIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNG IRHIGLAAKQ La terminal N de la lipoproteína procesada madura está subrayada (Cys-20) . La secuencia de longitud completa se ha dividido en tres dominios (aa. 1-119, 120-183 y 184-274): MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLK LAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQ IQDSEHSGKMVAKROFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNG KIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGS'VLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNG IRHIGLAAKQ De la terminal N a la terminal C estos tres dominios se llaman ?A' , ' B' y ?CX La forma madura del dominio 'A', de la cisteína de terminal C madura, se llama 'Ardura. Para MC58, los dominios son: 'A' = SEQ ID NO: 4; 4B' = SEQ ID NO: 5; 'C = SEQ ID NO: 6; y 'Anadura' = SEQ ID NO: 13. Las secuencias NMB1870 múltiples se conocen [por ejemplo, ver refs. 3, 6 y 7] y pueden fácilmente alinearse usando métodos estándar. Por tales alineaciones, la persona experta puede identificar los dominios 'A' (y ?-?pad to ' ) > 'B' y 'C en cualquier secuencia NMB1870 dada en comparación con los coordinados en la secuencia MC58. Para facilidad de referencia, sin embargo, los dominios se definen abajo: — Dominio 'A' en una secuencia NMB1870 dada es el fragmento de tal secuencia que, cuando se alinea a la SEQ ID NO: 1 usa un algoritmo de alineación en pares, iniciando con el aminoácido alineado a Met-1 de la SEQ ID NO: 1 y termina con el aminoácido alineado a Lys-119 de la SEQ ID NO: 1. — Dominio 'Amaduro' en una secuencia NMB1870 dada es el fragmento de tal secuencia que, cuando se alinea a SEQ ID NO: 1 usa un algoritmo de alineación en pares, iniciando con el aminoácido alineado a .Cys-20 de la SEQ ID NO: 1 y terminando con el aminoácido alineado a Lys-119 de la SEQ ID NO: 1. — Dominio 'B' en una secuencia NMB1870 dada es el fragmento de tal secuencia que, cuando se alinea a SEQ ID NO: 1 usa un algoritmo de alineación en pares, iniciando con el aminoácido alineado a Gln-120 de la SEQ ID NO: 1 y terminando con el aminoácido alineado a Gly-183 de la SEQ ID NO: 1. Dominio ' C en una secuencia NMB1870 dada es el fragmento de tal secuencia que, cuando se alinea a SEQ ID NO: 1 usa un algoritmo de alineación en pares, iniciando con el aminoácido alineado a Lys-184 de la SEQ ID NO: 1 y terminando con el aminoácido alineado a Gln-274 de la SEQ ID NO: 1. El algoritmo de alineación en pares preferidos para definir los dominios en el algoritmo de alineación global Needleman-Wunsch [11] , usando parámetros por deflaut (por ejemplo, con penalización por apertura Gap = 10.0, y con penalización por extensión Gap = 0.5, usando la matriz de registro EBLOSUM62) . Este algoritmo se implementa convenientemente en la herramienta de aguja en el paquete EMBOSS [12] .

Las secuencias NMB1870 caen en tres familias [3,7] que se refieren en la presente como familias I, II y III. Las secuencias prototípicas para las familias I-III son, respectivamente, SEQ ID NOS: 1-3. Los métodos filogenéticos y dendrograma de la referencia 3 pueden seguirse con objeto de determinar fácilmente la familia para cualquier secuencia NMB1870 dada, y una alineación en pares con cada una de las tres secuencias NMB1870 prototípicas también puede usarse para encontrar la alineación de familia más cercana. Las secuencias caen distintamente en las tres familias, con la identidad de secuencia siendo del 74.1% entre las familias I y II, 62.8% entre las familias I y III y 84.7% entre las familias II y III, y con variación de secuencia dentro de cada familia siendo bajo (por ejemplo, un mínimo de 91.6% de identidad en la familia I, 93.4% en la familia II y 93.2% en la familia III) . Como una manera rápida de determinar la familia de la secuencia sin requerir un análisis filogenético, puede colocarse una secuencia en la familia I si esta tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, puede colocarse en la familia II si esta tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y puede colocarse en la familia III si esta tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3. Con base en el alineado en la Figura 6 de la referencia 3, los dominios ejemplares A, B y C para las tres familias rototípicas de NMB1870 (SEQ ID NOS: 1 hasta 3) son como sigue: Los dominios preferidos para usarse con la invención comprenden secuencias de aminoácidos que (a) tienen al menos x% de identidad de secuencia con una o más de las SEQ ID NOS: 4 hasta 12, y/o (a) comprende un fragmento de al menos la secuencia de aminoácidos consecutiva ? de una o más de las SEQ ID NOS: 4 hasta 12. El valor de ? se selecciona de 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 o más. El valor de ? se selecciona de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50 o más. En los polipéptidos que comprenden las secuencias NMB1870 de diferentes familias, los valores de % y ? para cada familia pueden ser los mismos o diferentes. La secuencia A' de dominio está preferiblemente entre la longitud de aminoácidos ai y ar2 (inclusive), donde: ai se selecciona de 110, 115, 120, 125 y 130; y a? se selecciona de 115, 120, 125, 130 y 135.

La secuencia 'B' de dominio está preferiblemente entre la longitud de aminoácidos bi y b? (inclusive), donde: bi se selecciona de 55, 60, 65 y 70; y b2 se selecciona de 60, 65, 70 y 75. Una secuencia de un dominio "C" está preferiblemente entre ci y c2 (incluso) de aminoácidos de largo, en donde; Ci se selecciona de 80, 85, 90, 95 y 100; y c2 se selecciona de 85, 90, 95, 100 y 105.

Rizos de superficie NMB1870 Los rizos de superficie de SEQ ID NO: 1, que se encuentran entre las hélices alfa, son: (1) aminoácidos 134-141; (2) aminoácidos 162-168; (3) aminoácidos 181-182; (4) aminoácido 197; (5) aminoácidos 219-223; (6) aminoácidos 234-236; (7) aminoácidos 261-267: MNRTAFO SLTTALILTACSSGGGGV?ADIGA^ IAAQGAEKI?GNGESD I GKLKNDKVSRFDFI^ IQDSEHSG MV?KRQFRIGDIAGEHTSFDKL^ KIEHLKSPEUWDIAAADÍI PDGKRH?V^^ IRHIGLAAKQ Al alinear la SEQ ID NO: 1 con cualquier otra secuencia de NMB 1870, la persona experimentada puede identificar las posiciones de rizos (1) a (7) en esa secuencia. Por facilidad de referencia, sin embargo, las coordenadas de un rizo se definen en la presente como la cadena de aminoácido (s) en una secuencia de NMB 1870 que, cuando es alineada a SEQ ID NO: 1 al usar un algoritmo de alineación por pares, inicia con el aminoácido alineado al primer residuo de aminoácidos del rizo antes definido en SEQ ID NO: 1 anterior, y termina con el último aminoácido del rizo antes definido en SEQ ID NO: 1.

Proteínas Quiméricas Unión de los dominios heterólogos B y C La invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende: (a) una secuencia del dominio "B" de una primer familia de NMB 1870; y (b) una secuencia del dominio "C" de una segunda familia de NMB 1870. La primera y segunda familias se seleccionan cada una de I, II o III, pero no son iguales una con la otra. El polipéptido quimérico preferiblemente no contiene una secuencia del dominio "C" de la primera familia de NMB 1870 y/o no contiene una secuencia del dominio "B" de la segunda familia de NMB 1870. El polipéptido quimérico tiene preferiblemente menos de 495 aminoácidos de largo. Los polipéptidos preferidos comprenden una secuencia de aminoácidos -X?-B-X2-C-X3-, en donde: -Xi- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X2- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X3- es una secuencia opcional de aminoácidos; -B- es una secuencia de aminoácidos del dominio B de una secuencia de NMB 1870 en una primera familia; y -C- es una secuencia de aminoácidos del dominio C de una secuencia de NMB 1870 en una segunda familia. El dominio -B- para la terminación C del dominio -C-, pero es preferiblemente a la terminación N del dominio -C- . Preferiblemente: (1) la secuencia del dominio B d la primera familia NMB1870 (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 11, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 11; y (2) la secuencia del dominio C de la segunda familia de NMB 1870 (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 12, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 12; con la condición de que las dos SEQ ID NOS elegidas para (1) y (2) no son (i) 5 y 6 juntos, (2) 8 y 9 juntos o (3) 11 y 12 juntos. Los pares adecuados de SEQ ID NOS a combinarse para (1) y (2) son así 5 y 9, 5 y 12, 8 y 6, 8 y 12, 11 y 6 y 11 y 9.

Unión de los Dominios heterólogos BC La invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende: (a) una secuencia del dominio "B" y una secuencia del dominio "C" de una primera familia de NMB1870; y (b) una secuencia del dominio "B" y una secuencia del dominio "C" de una segunda familia de NMB 1870. El polipéptido quimérico preferiblemente no contiene una secuencia del dominio 'A' de la primera familia y/o no contiene una secuencia del dominio 'A' de la segunda familia. La primera y segunda familia se seleccionan cada vina de I, II o III, pero no son iguales una con la otra. Las secuencias de dominios 'B' y ' C de la primera familia son preferiblemente contiguas (un dominio 'BC'). Del mismo modo, las secuencias del dominio 'B' y ' C de la segunda familia son preferiblemente contiguas . Los polipéptidos preferidos comprenden una secuencia de aminoácidos -X?-Bj-X2-Cj-X3-Bk-X4-Ck-Xs- , en donde: -Xi- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X2- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X3- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X5-es una secuencia opcional de aminoácidos; -Bj- es una secuencia de aminoácidos del dominio "B" de una primera familia NMB1870; -Cj- es una secuencia de aminoácidos del dominio "C" de la primera familia; -Bk- es una secuencia de aminoácidos del dominio "B" de una segunda familia NMB1870; y -Ck- es una secuencia de aminoácidos del dominio "C" de la segunda familia. Las secuencias -X2- y -X- están preferiblemente ausentes, esto es, para dar -X?-Bj-X2-Cj-X3-Bk-X4-Ck-X5- . Se prefiere tener los dominios -Bj- y -Cj- para la terminación N de los dominios -B^- y -C*- . Preferiblemente: (1) la secuencia del dominio B de la primera familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: Jl, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: Jl; (2) la secuencia del dominio C de la primera familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: J2, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: J2 ; (3) la secuencia del dominio B de la segunda familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: Kl, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: KJ; y (4) la secuencia del dominio C de la segunda familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: K2, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: K2 , donde Jl, J2 , Kl y Z2 se seleccionan como siguen: Los polipéptidos anteriores comprenden así los dominios BC desde al menos dos de las tres familias NMB1870. Más preferiblemente, los polipéptidos comprenden un dominio BC de cada una de las tres familias. Así la invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende: (a) una secuencia del dominio "B" y una secuencia del dominio "C de una primera familia NMB1870; (b) una secuencia del dominio "B" y una secuencia del dominio "C" de una segunda familia NMB1870; y (c) una secuencia del dominio "B" y una secuencia del dominio "C" de una tercera familia NMB1870. El polipéptido quimérico preferiblemente no contiene una secuencia del dominio "A" de la primera familia y/o no contiene una secuencia del dominio "A" de la segunda familia y/o no contiene una secuencia del dominio "A" de la tercera familia. Las secuencias de dominio 'B' y 'C" de la primera familia son preferiblemente contiguas. Del mismo modo, las secuencias del dominio "B" y "C" de la segunda familia son preferiblemente contiguas. Del mismo modo, las secuencias del dominio "B" y "C" de la tercera familia son preferiblemente contiguas . Los polipéptidos preferidos comprenden una secuencia de aminoácidos -X-Bj-X2-Cj-X3-Bk-X-Ck-X5-B-X6-CL-X7- en donde: -Xi- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X2-es una secuencia opcional de aminoácidos; -X3- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X4- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X5- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X6- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X7- es una secuencia opcional de aminoácidos; -Bj- es una secuencia de aminoácidos del dominio B de una primera familia de NMB 1870; -Cj- es una secuencia de aminoácidos del dominio C de la primera familia; -Bk- es una secuencia de aminoácidos del dominio B de una segunda familia de NMB 1870; -Ck- es una secuencia de aminoácidos del dominio C de la segunda familia; -B- es una secuencia de aminoácidos del dominio B de una tercera familia de NMB 1870; y -CL- es una secuencia de aminoácidos del dominio C de la tercera familia. Las secuencias -X2-, -X4- y -X6- están ausentes preferiblemente, esto es, para dar -Xi-Bj-X2-Cj-X3-Bk-X4-Ck-X5-BL-X6-C -X7- . Preferiblemente: (1) la secuencia del dominio B de la primera familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: Jl, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO : Jl ; (2) la secuencia del dominio C de la primera familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: J2 , y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO : J2 ; (3) la secuencia del dominio B de la segunda familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: Kl , y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: Kl ; (4) la secuencia del dominio C de la segunda familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: K2 , y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: K2 ; (5) la secuencia del dominio B de la tercera familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: Ll, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: Ll; y (6) la secuencia del dominio C de la tercera familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: L2 , y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: L2 , donde Jl , J2 , Kl, K2 , Ll y L2 se seleccionan como siguen: Unión de los Dominios heterólogos AB La invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende: (a) una secuencia del dominio "A" y una secuencia del dominio "B" de una primera familia de NMB1870; y (b) una secuencia del dominio "A" y una secuencia del dominio "B" de una segunda familia de NMB 1870. El polipéptido quimérico preferiblemente no contiene una secuencia del dominio "C" de la primera familia y/o no contiene una secuencia del dominio "C" de la segunda familia. La primera y segunda familia se seleccionan cada una de I, II o III, pero no son iguales una con la otra. Las secuencias del dominio 'A' y 'B' de la primera familia son preferiblemente contiguas. Del mismo modo, las secuencias del dominio 'A' y 'B' de la segunda familia son preferiblemente contiguas. Los polipéptidos preferidos comprenden una secuencia de aminoácidos -Xi-Aj-X2-Bj-X3-A)C-X4-B?<-X5- , en donde: -Xi-es una secuencia opcional de aminoácidos; -X2- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X3- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X4- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X5- es una secuencia opcional de aminoácidos; -Aj - es una secuencia de aminoácidos del dominio A de una primera familia de NMB 1870; -Bj- es una secuencia de aminoácidos del dominio B de la primera familia; -Ak- es una secuencia de aminoácidos del dominio A de una segunda familia de NMB 1870; y -Bk- es una secuencia de aminoácidos del dominio B de la segunda familia. Las secuencias -X2- y -X4- están preferiblemente ausentes, esto es, para dar -Xi-Aj-X2-Bj-X3-Ak-X4-Bj?-X5- . Se prefiere tener los dominios -Aj- y -Bj- a la terminación N de los dominios -Ak- y -Bk- . Preferiblemente: (1) la secuencia del dominio A de la primera familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: Jl, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: Jl; (2) la secuencia del dominio B de la primera familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: J2 , y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: J2 ; (3) la secuencia del dominio A de la segunda familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: Kl, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: Kl ; y (4) la secuencia del dominio B de la segunda familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: K2 , y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: K2 , donde Jl, J2 , Kl y K2 se seleccionan como siguen: Los polipéptidos anteriores comprenden así dominios AB de al menos dos de las tres familias NMB 1870. Más preferiblemente, los polipéptidos comprenden ún dominio AB de cada una de las tres familias. Así, la invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende: (a) una secuencia del dominio "A" y una secuencia del dominio "B" de una primera familia de NMB1870; (b) una secuencia del dominio "A" y una secuencia del dominio "B" de una segunda familia de NMB 1870; y (c) una secuencia del dominio "A" y una secuencia del dominio "B" de una tercera familia de NMB 1870. El polipéptido quimérico preferiblemente no contiene una secuencia del dominio "C" de la primera familia y/o no contiene una secuencia del dominio "C" de la segunda familia y/o no contiene una secuencia del dominio "C" de la tercera familia. Las secuencias del dominio "A" y "B" de la primera familia son preferiblemente contiguas. Del mismo modo, las secuencias del dominio "A" y "B" de la segunda familia son preferiblemente contiguas. Del mismo modo, las secuencias del dominio "A" y "B" de la tercera familia son preferiblemente contiguas . Los polipéptidos preferidos tienen una secuencia de aminoácidos -Xi-A-,-X2-Bj-X3-Ak-X-Bk-X5-AL-X6-B-X7-, en donde: -Xl- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X2- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X3- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X4- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X5- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X6- es una secuencia opcional de aminoácidos; -X7- es una secuencia opcional de aminoácidos; -Aj- es una secuencia de aminoácidos del dominio A de una primera familia de NMB 1870; -Bj- es una secuencia de aminoácidos del dominio B de la primera familia; -Ak- es una secuencia de aminoácidos del dominio A de una segunda familia de NMB 1870; -Bk- es una secuencia de aminoácidos del dominio B de la segunda familia; -Ai- es una secuencia de aminoácidos del dominio A de una tercera familia de NMB 1870; y -Bi- es una secuencia de aminoácidos del dominio B de la tercera familia. As secuencias -X2-, -X4- y -X6- están preferiblemente ausentes, esto es, para dar -Xi-Aj-X2-Bj-X3-Ak-X-Bk-X5-A-X6-BL-X7- . Preferiblemente: (1) la secuencia del dominio A de la primera familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: Jl, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: Jl; (2) la secuencia del dominio B de la primera familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: J2, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: J2 ; (3) la secuencia del dominio A de la segunda familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: Kl, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: Kl; (4) la secuencia del dominio B de la segunda familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: K2 , y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: K2; (5) la secuencia del dominio A de la tercera familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: Ll, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: Ll; y (6) la secuencia del dominio B de la tercera familia (i) tiene al menos x% identidad de secuencia para SEQ ID NO: L2, y/o (ii) comprende un fragmento de al menos y secuencia consecutiva de aminoácidos de SEQ ID NO: L2 , donde Jl, J2 , Kl, K2 , Ll y L2 se seleccionan como siguen: Secuencias Opcionales Xn Los polipéptidos de la invención pueden incluir secuencias que ligan secuencias derivadas de NMB1870 y/o pueden incluir secuencias en el N y C terminales que no se deriven de NMB 1870. Tales secuencias se designan en la presente "Xn" (Xi, X2, X3, X4, X5, X6, X7, etc.). Cada Xn puede estar presente o ausente, y la secuencia de cada uno puede ser la misma o diferente. La(s) secuencia (s) de ligadura de aminoácidos, serán típicamente cortas (por ejemplo, 20 o menos aminoácidos esto es, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias cortas de péptidos las cuales facilitan la clonación, ligaduras de poli-glicina (esto es, Glyn en donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), y etiquetas de histidina (esto es, Hisn, where n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Q. más). Otras secuencias ligadoras de aminoácidos adecuadas serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Una ligadura útil es GSGGGG (SEQ ID NO: 17), con el dipéptido Gly-Ser que se forma de un sitio de restricción BamHI, ayudando así a la clonación y manipulación, y otra ligadura útil es GKGGGG (SEQ ID NO: 45), con el dipéptido Gly-Lys que se forma de un sitio de restricción HindIII. Los sitios de restricción se siguen del tetrapéptido Gly (SEQ ID NO: 18), el cual es un ligador típico de poli-glicina. Otras ligaduras putiles con SEQ ID NOS: 19 y 20. Las secuencias opcionales de aminoácidos en la terminación N serán típicamente cortas (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos esto es, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen las secuencias líderes para dirigir el movimiento del polipéptido, o secuencias cortas de péptidos las cuales facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, etiquetas de histidina esto es, Hisn, donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) . Otras secuencias de aminoácidos apropiadas en la terminal N serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Si una secuencia carece de su propia metionina en la terminación N, entonces una secuencia útil en la terminación N proporcionará tal residuo de metionina en el polipéptido traducido (por ejemplo, un residuo sencillo Met) . Las secuencias opcionales de aminoácidos en la terminación C serán típicamente cortas (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos esto es, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen las secuencias para dirigir el movimiento del polipéptido, o secuencias cortas de péptidos las cuales facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, que comprenden etiquetas de histidina esto es, Hisn, donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), o secuencias que potencian la estabilidad del polipéptido. Otras secuencias de aminoácidos apropiadas en la terminal C serán evidentes para aquellos expertos en la técnica.

Construcción de secuencias quiméricas NMB1870 La invención proporciona un proceso para la producción de una secuencia de aminoácidos quimérica NMB 1870, que comprende las etapas de: (a) alinear una primera secuencia de aminoácidos NMB 1870 con una segunda secuencia de aminoácidos NMB 1870, para dar un par de secuencias alineadas; (b) seleccionar una porción de la primera secuencia de aminoácidos, iniciando en el aminoácido aj de la primera secuencia de aminoácidos y terminando en el aminoácido bj de la primera secuencia de aminoácidos; (c) seleccionar una porción de la segunda secuencia de aminoácidos, iniciando en el aminoácido a2 de la segunda secuencia de aminoácidos y terminando en el aminoácido b2 de la segunda secuencia de aminoácidos, en donde los residuos ai y a2 y bi y b2 se alinean en el par de secuencias alineadas; y (d) reemplazar la porción de la primera secuencia de aminoácidos con la porción de la segunda secuencia de aminoácidos, con lo cual se suministra la secuencia de aminoácidos NMB 1870 quimérica. La primera y segunda secuencias son diferentes, y son preferiblemente de familias diferentes de NMB 1870. Las etapas (b) a (d) se puede efectuar más de una vez para la misma alineación de etapa (a) esto es, substituciones múltiples de la segunda secuencia dentro de la primera secuencia se pueden efectuar. Del mismo modo, las etapas (a) a (d) se puede efectuar más de una vez, con una "segunda secuencia de aminoácidos" diferente que se usa opcionalmente durante las etapas posteriores (a) esto es, una primera secuencia se puede alinear con una segunda secuencia y someterse al procedimiento de substitución, y luego se puede alinear con una segunda secuencia diferente y someterse a substitución adicional, etc. Así, la invención proporciona un proceso para la producción de una secuencia de aminoácidos quimérica NMB 1870, que comprende las etapas de: (a) alinear una primera secuencia de aminoácidos NMB 1870 con una segunda secuencia de aminoácidos NMB 1870, para dar un primer par de secuencias alineadas; (b) seleccionar una porción de la primera secuencia de aminoácidos, iniciando en el aminoácido ai; de la primera secuencia de aminoácidos y terminando en el aminoácido bi de la primera secuencia de aminoácidos; (c) seleccionando una porción de la segunda secuencia de aminoácidos, iniciando en el aminoácido a2 de la segunda secuencia de aminoácidos y terminando en el aminoácido b2 de la segunda secuencia de aminoácidos, en donde los residuos ai y a2 y bi y b2 se alinean en el primer par de secuencias alineadas; (d) reemplazar la porción de la primera secuencia de aminoácidos con la porción de la segunda secuencia de aminoácidos, con lo que se proporciona una secuencia de aminoácidos quimérica NMB 1870 intermediaria; (e) alinear la primera secuencia de aminoácidos NMB 1870, o la secuencia quimérica intermediaria, con una tercera secuencia de aminoácidos NMB 1870, para dar un segundo par de secuencias alineadas; (f) seleccionar una porción de la secuencia quimérica intermediaria, iniciando en aminoácido a3 de la secuencia quimérica intermediaria, y terminando en el aminoácido b3 de la secuencia quimérica intermediaria; (g) seleccionar una porción de la tercera secuencia de aminoácidos, iniciando en aminoácido a de la tercera secuencia de aminoácidos y terminando en el aminoácido b4 de la tercera secuencia de aminoácidos, en donde los residuos a3 y a4 y b3 y b4 se alinean en el segundo par de secuencias alineadas; y (h) reemplazar la porción de la secuencia quimérica intermediaria, con la porción de la tercera secuencia de aminoácidos, con lo cual se proporciona la secuencia de aminoácidos quimérica NMB 1870. Las porciones seleccionadas son preferiblemente al menos c aminoácidos de largo, donde c es 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más. Las secuencias substituidas son preferiblemente secuencias de superficie de rizo. La invención incluye situaciones que incluyen hasta 10 substituciones (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) o más. La invención también proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos quimérica NMB 1870, en donde la secuencia de aminoácidos NMB 1870 quimérica se obtiene por el proceso anterior. El proceso de la invención se puede seguir por una etapa adicional de producir un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos NMB 1870 quimérica por ejemplo, por la expresión de proteínas recombinantes . La invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos F?-X?-F2, donde: Fi es un fragmento en la terminación N de una primera secuencia de aminoácidos NMB 1870; F2 es un fragmento en la terminación C de una segunda secuencia de aminoácidos NMB 1870; -X?~ es una secuencia opcional de aminoácidos; la primera y segunda secuencia de aminoácidos NMB 1870 son de diferentes familias de NMB 1870; fragmentos Fi y F2 tienen ambos al menos 10 aminoácidos de longitud; y los fragmentos Fi y F2 tienen una longitud combinada de al menos ff aminoácidos. El valor de ff is 200, 210, 220, 230, 240, 250 o 260. La secuencia -Xi- está preferiblemente ausente, para dar la secuencia F?-F2, la cual es una fusión de las terminaciones N y C de las proteínas NMB 1870 en diferentes familias. La invención también proporciona un fragmento de al menos g aminoácidos consecutivos del polipéptido, con la condición de que el fragmento incluye al menos un aminoácido de cada uno de Fi y F2 (esto es, el fragmento ponteado en la unión entre Fi y F2. El valor de g es 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 o más. La invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos (F-Xm)n, donde: cada Fm es un fragmento de una Secuencia de aminoácidos NMB 1870 enésima; cada -Xm- es una secuencia opcional de aminoácidos; cada fragmento F™ es al menos g aminoácidos de longitud; y los n casos de Fm incluyen fragmentos de al menos dos de las tres familias NMB 1870 I, II y III. El valor de g es como antes definido. El valor de n es l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más. La invención proporciona un polipéptido que comprende al menos dos de: (i) un fragmento de no más de 240 aminoácidos de una secuencia de NMB 1870 de la familia I, en donde el fragmento comprende un epítopo de la secuencia de NMB 1870 de la familia I; (ii) un fragmento de no más de 240 aminoácidos de una secuencia de NMB 1870 de la familia II, en donde el fragmento comprende un epítopo de la secuencia de NMB 1870 de la familia II; y (iii) un fragmento de no más de 240 aminoácidos de una secuencia de NMB 1870 de la familia III, en donde el fragmento comprende un epítopo de la secuencia de la familia III de NMB 1870.

Substitución de Rizos Los inventores han encontrado que NMB 1870 expone algunos de sus epítopos en rizos de superficie situados entre las hélices alfa. La substitución de epítopos de rizo de una familia en la posición del rizo en otra familia permite que se produzca el NMB 1870 quimérico con antigenicidad de muítifamilias. Así, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia modificada de aminoácidos de una primera familia de NMB 1870, en donde la secuencia modificada incluye al menos una (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7) secuencia de superficie de rizo de una segunda familia de NMB 1870 en lugar de una secuencia de superficie de rizo de la primera familia. La invención también proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos : -B?-L?-B2-L-B3-L3-B-L-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8- en donde: (a) cada uno de Bl, B2, B3, B4, B5, B6, B7 y B8 es: (i) un fragmento de SEQ ID NO: M; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos m% identidad de secuencia para el fragmento de (i) y/o que comprende un fragmento de al menos mm aminoácidos contiguos del fragmento de (i) ; (b) cada uno de Li, L2, L3, L4, L5, Le y L7 es: (iii) un fragmento de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2 y/o de SEQ ID NO: 3; (iv) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos n% identidad de secuencia para el fragmento de (iii) y/o que comprende un fragmento de al menos nn aminoácidos contiguos del fragmento de (iii), con la condición de que al menos uno de Li, L2, L3, L4, L5, L6 y L7 no es un fragmento de SEQ ID NO: M. Así, el polipéptido comprende una secuencia básica de columna, en ocho partes y siete rizos, uno entre cada parte consecutiva de la secuencia de columna, pero al menos una de las secuencias de rizo se toma de una secuencia de NMB 1870 que es de una familia de NMB 1870 diferente de la secuencia básica de columna. Se prefiere usar rizos de superficie de más de una secuencia diferente de NMB 1870, y es posible insertar estos rizos en una secuencia de columna sencilla. El valor de M se selecciona de 1, 2 o 3, y las definiciones de Bi, B2, B3, B4, B5, B? , B7 y Bs y de Li# L2, L3 , L , L5, L6 y L7 varían dependiendo del valor de M. El significado de " (i) un fragmento de SEQ ID NO: M" es como sigue: Del mismo modo, "(iii) un fragmento de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y/o de SEQ ID NO: 3" se define como sigue: Por ejemplo, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: -B?-L?-B2-L2-B3-L3-B-L-B5-Ls-B6- 6-B7-L7-B8- en donde: Bi es aminoácidos 1-139 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos m% identidad de secuencia para los aminoácidos 1-133 y/o que comprende un fragmento de al menos mm aminoácidos contiguos de los aminoácidos 1-133; B2 es aminoácidos 142-161 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos m% identidad de secuencia para los aminoácidos 142-161 y/o que comprende un fragmento de al menos mm aminoácidos contiguos de los aminoácidos 142-161 ... B7 es aminoácidos 268-274 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos m% identidad de secuencia para los aminoácidos 268-274 y/o que comprende un fragmento de al menos mm aminoácidos contiguos de los aminoácidos 268-274; Li es aminoácidos 134-141 de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos n% identidad de secuencia para los aminoácidos 134-141 y/o que comprende un fragmento de al menos nn aminoácidos contiguos de los aminoácidos 134-141; L2 es aminoácidos 162-167 de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos n% identidad de secuencia para los aminoácidos 162-167 y/o que comprende un fragmento de al menos nn aminoácidos contiguos de los aminoácidos 162-167, ... L7 es aminoácidos 268-274 de SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos n% identidad de secuencia para los aminoácidos 268-274 y/o que comprende un fragmento de al menos nn aminoácidos contiguos de los aminoácidos 268-274; etc. El valor de m se selecciona de 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 o más. El valor de n se selecciona de 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 o más. El valor de mm se selecciona de 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 75, 100 o más. El valor de nn se selecciona de l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. El valor de nn tiene preferiblemente menos de 20. La invención también proporciona un polipéptido que comprende la secuencia quimérica de aminoácidos: -B?-L?-B-L2-B3-L3-B-L-B5-L5-B6-L6~B7-L7-B8- como antes definida, y además que comprende, ya sea el N terminal para o C terminal para la secuencia quimérica, una secuencia de NMB 1870, en donde la secuencia de NMB 1870 es de la misma familia de NMB 1870 como SEQ ID NO: M. Así, el polipéptido comprende ambos (i) un NMB 1870 de una familia en particular y (ii) también un NMBl 870 de la misma familia, pero con al menos uno de sus rizos de superficie substituidos para una familia diferentes de NMB 1870. La invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia global para SEQ ID NO: Q de q%, en donde: el valor de q es al menos r; la identidad de secuencia de la secuencia de aminoácidos para SEQ ID NO: Q es más que q% en las regiones de columna de SEQ ID NO: Q; y la identidad de secuencia de la secuencia de aminoácidos para SEQ ID NO: Q es menos que q% en las regiones de rizo de SEQ ID NO: Q. El valor de r se selecciona de 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, y 99.5. El valor de Q es 1, 2 o 3, y los límites de las regiones de rizo y de las regiones de columna se seleccionan de acuerdo con las tablas anteriores (Li a L7 que son los rizos, y Bi a Bs que es la columna) . Donde Q es 1, la secuencia de aminoácidos en una región de rizo puede tener más que q% identidad de secuencia para la región correspondiente de rizo de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. Donde Q es 2 , la secuencia de aminoácidos en una región de rizo puede tener más que q% identidad de secuencia para la región correspondiente de rizo de SEQ ID NO: l o SEQ ID NO: 3. Donde Q es 3, la secuencia de aminoácidos en una región de rizo puede tener más que q% identidad de secuencia para la región correspondiente de rizo de SEQ ID NO: l o SEQ ID NO: 2.

Fragmentos de NMBl 870 La invención proporciona un polipéptido que comprende un fragmento de una secuencia de la familia I de NMB 1870, con la condición de que (a) el fragmento incluye el aminoácido Arg-223 (b) el polipéptido no comprende (i) una familia I completa de la secuencia de aminoácidos NMB 1870 ni (ii) una familia I? completa de G-NMB1 870 en la secuencia de aminoácidos. La numeración de los residuos de aminoácidos sigue el número de SEQ ID NO: 1 en la presente. El fragmento puede incluir los dominios completos B y C. Si el polipéptido incluye un aminoácido a la terminación N del fragmento, luego el aminoácido inmediatamente a la terminación N del fragmento en el polipéptido es preferiblemente diferente del aminoácido que se encuentra inmediatamente a la terminación N del fragmento en SEQ ID NO: 1. Del mismo modo, si el polipéptido incluye un aminoácido a la terminación C del fragmento, luego el aminoácido inmediatamente a la terminación C del fragmento en el polipéptido es preferiblemente diferente del aminoácido que se encuentra inmediatamente a la terminación C del fragmento en SEQ ID NO: 1. La invención también proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos -Z?-Arg-Z2-, en donde: (a) -Zi- es una secuencia de aminoácidos que consiste de yi aminoácidos, en donde el valor de yi es al menos 10 (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220 o más) . (b) -Z2- es una secuencia de aminoácidos que consiste de y 2 aminoácidos, en donde el valor de y2 es al menos 10 (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50 o más) . (c) -Zi- tiene al menos x% identidad de secuencia (como es antes definido) a los aminoácidos y¿ localizados inmediatamente en dirección 5" del aminoácido Arg-223 en SEQ ID NO: 1; y (d) -Z2- tiene al menos x% identidad de secuencia (como es antes definido) a los aminoácidos y? localizados inmediatamente en dirección 3' del aminoácido Arg-223 in SEQ ID NO: 1. El valor de yi tiene preferiblemente menos de 220. El valor de y? tiene preferiblemente menos de 50. Si el polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos en dirección 5" de -Zi- luego la secuencia es preferiblemente diferente de la secuencia que se encuentra inmediatamente en dirección 5" de los y± aminoácidos localizados inmediatamente en dirección 5" del aminoácido Arg-223 en SEQ ID NO: 1. Si el polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos en dirección 3 ' de -Z2- luego la secuencia es preferiblemente diferente de la secuencia que se encuentra inmediatamente en dirección 3' de los y2 aminoácidos localizados inmediatamente en dirección 3' del aminoácido Arg-223 en SEQ ID NO: 1. Estos polipéptidos que incluyen fragmentos de la invención preferiblemente no incluyen ningunos polipéptidos conocidos por ejemplo, descritos en las referencias 2, 3, 6, 7, etc.

La invención también proporciona una mezcla que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, donde el primer polipéptido es un fragmento del dominio B de un NMB 1870 y el segundo polipéptido es un fragmento del dominio C de un NMB 1870, en donde el primero y segundo polipéptidos pueden asociarse para producir un epítopo que no se encuentra en el primero o segundo polipéptido solo. Para cualquier NMB 1870 dada es directo identificar los dominios B y C usando la información aquí proporcionada, y el truncamiento y/o disección de los dominios separados, seguido por mezclado, se puede usar para ver si se asocian los polipéptidos. Un ensayo conveniente para determinar la asociación y formación del epítopo de conformación involucra el uso de un anticuerpo monoclonal que reconoce un fragmento del dominio BC de NMB 1870 pero no reconoce al dominio B o C solo. Tales anticuerpos se pueden aislar del antisuero anti-NMB1870 policlonal de ratón por métodos de selección estándar.

Polipéptidos La invención proporciona los polipéptidos antes descritos. También proporciona un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 23, 24, 43, 44, 52, 53, 61, 62, 63, 64 y 65. También proporciona polipéptidos que tiene una secuencia de aminoácidos (a) que tienen identidad de secuencia para una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 23, 24, 43, 44, 52, 53, 61, 62, 63, 64 y 65 y/o (b) que comprende un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 23, 24, 43, 44, 52, 53, 61, 62, 63, 64 y 65. El grado de identidad de secuencia es preferiblemente mayor que 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más). El fragmento preferiblemente comprende 7 o más aminoácidos consecutivos de la secuencia de inicio (por ejemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 70, 85, 90, 95, 100 o más) . NMB 1870 es naturalmente una lipoproteína en N. meningi tidis . También se ha encontrado que hace lípidos cuando se expresa en E. coli . Los polipéptidos preferidos de la invención tienen un residuo de cisterna en la terminación C, el cual puede formar lípidos por ejemplo, que comprende un grupo palmitoilo. Una característica de los polipéptidos preferidos de la invención es la capacidad para inducir anticuerpos bactericidas anti-meningococos después de la administración a un animal hospedero.

Los polipéptidos de la invención se pueden preparar por diversos medios por ejemplo, por síntesis química (al menos en parte) , al digerir polipéptidos más largos usando proteasas, por traducción del ARN, por purificación de cultivo de células (por ejemplo, de expresión recombinante o de cultivo de N. meningi tidis) , etc. La expresión heteróloga en un hospedero de E. coli es una vía de expresión preferida (por ejemplo, en DH5a, BL21(DE3), BLR, etc.). Los polipéptidos de la invención se pueden unir o inmovilizar a un soporte sólido. Los polipéptidos de la invención pueden comprender una etiqueta detectable por ejemplo, una etiqueta radioactiva, una etiqueta fluorescente, o una etiqueta de biotina. Esto es particularmente útil en técnicas de inmunoensayos. Los polipéptidos pueden tomar diversas formas (por ejemplo, nativas, fusiones, glicosilado, no glicosilado, con lípidos, puentes de bisulfuro, etc.). Los polipéptidos se preparan preferiblemente en forma substancialmente pura o substancialmente aislada (esto es, substancialmente libre de otros polipéptidos de célula hospedera o de ?eisseria) o en forma substancialmente aislada. En general, se proporcionan los polipéptidos en un ambiente que no se presenta naturalmente por ejemplo, se separan de su ambiente que se presenta naturalmente. En ciertas modalidades, el polipéptido objetivo está presente en una composición que se enriquece para el polipéptido en comparación con un control. Como tal, el polipéptido purificado es suministrado, por lo cual significa purificado que el polipéptido está present en una composición que está substancialmente libre de otros polipéptidos expresados, por lo que substancialmente libre significa que menos de 90%, usualmente menos de 60% y más usualmente menos de 50% de la composición está hecha de otros polipéptidos expresados. El término "polipéptido" se refiere a polímeros de aminoácido de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede interrumpirse por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que se ha modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de enlace de bisulfuro, glicosilación, lapidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de etiquetado. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden presentarse como cadenas sencillas o cadenas asociadas.

Acido nucleicos La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la invención como es antes definido. La invención también proporciona ácido nucleico que comprende: (a) un fragmento de al menos n nucleótidos consecutivos del ácido nucleico, en donde n es 10 o más {por ejemplo, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 o más) ; y/o (b) una secuencia que tiene al menos 50% {por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más) identidad de secuencia para el ácido nucleico. Adicionalmente, la invención proporciona ácido nucleico que puede quimerizarse para el ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, preferiblemente bajo condiciones de "alta severidad" {por ejemplo, 65°C en una solución O.lxSSC, 0.5% SDS) . Los ácidos nucleicos de la invención se pueden usar en reacciones de hibridación {por ejemplo, técnicas Northern o Southern blot, o en micromatrices de ácido nucleico o 'chips de genes') y reacciones de amplificación {por ejemplo, PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA, etc.) y otras técnicas de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar ed muchas maneras por ejemplo, por síntesis química (por ejemplo, síntesis de fosforamidita de ADN) en todo o en parte, al digerir ácidos nucleicos más largos usando nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción) , al unir ácidos nucleicos o nucleótidos más cortos (por ejemplo, usando ligasas o polimerasas) , de colecciones genómicas o de ADNc, etc . Los ácidos nucleicos de la invención pueden tomar varias formas por ejemplo, hebra sencilla, hebra doble, vectores, cebadores, sondas, etiquetados, no etiquetados, etc. Los ácidos nucleicos de la invención están preferiblemente en forma aislada o substancialmente aislada. La invención incluye secuencias que comprenden ácido nucleico complementarias a aquellas antes descritas por ejemplo, para antisentido o sondas, o para su uso como cebadores . El término "ácido nucleico" incluye ADN y ARN, y también sus análogos, tales como aquellos que contienen columnas modificadas, y también ácidos nucleicos de péptidos (PNA) , etc. El ácido nucleico de acuerdo con la invención puede ser etiquetado por ejemplo, con una etiqueta radioactiva o fluorescente. Esto es particularmente útil donde el ácido nucleico se va a usar en técnicas de detección de ácido" nucleico por ejemplo, donde el ácido nucleico es un cebador o una sonda para su uso en técnicas tales como PCR, LCR, TMA, NASBA, etc.

La invención también proporciona vectores que comprenden secuencias de nucleótidos de la invención {por ejemplo, vectores de expresión o clonación, tales como aquellas adecuadas para inmunización con ácido nucleico) y células hospederas transformadas con tales vectores.

Inmunización Los polipéptidos de la invención se suministran preferiblemente como composiciones inmunogénicas, y la invención proporciona una composición inmunogénica de la invención para uso como un medicamento . La invención también proporciona un método para elevar una respuesta de anticuerpos en un mamífero, que comprende administrar una composición inmunogénica de la invención al mamífero. La respuesta de anticuerpos es preferiblemente una respuesta de anticuerpos protectora y/o bactericida. La invención también proporciona un método para proteger a un mamífero contra una infección por Neisseria (por ejemplo, meningococos) , que comprende administrar al mamífero una composición inmunogénica de la invención. La invención proporciona polipéptidos quiméricos de la invención para su uso como medicamentos (por ejemplo, como composiciones inmunogénicas o como vacunas) o como reactivos de diagnóstico. También proporciona el uso de ácido nucleico, polipéptido, o anticuerpo de la invención en la manufactura de un medicamento para prevenir la infección por Neisseria (por ejemplo, meningococos) en un mamífero. El mamífero es preferiblemente un humano. El humano puede ser un adulto o, preferiblemente, un niño. En donde la vacuna es para uso profiláctico, el humano es preferiblemente un niño (por ejemplo, un bebé o un infante) ; sonde la vacuna es para uso terapéutco, el humano es preferiblemente un adulto. Una vacuna pretendida para niños también se puede administrara a adultos por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc. Los usos y métodos son particularmente útiles para la prevención/tratamiento de enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, meningitis (particularmente meningitis bacteriana) y bacteremia. La eficacia del tratamiento terapéutico se puede probar al observar la infección por Neisseria después de la administración de la composición de la invención. La eficacia del tratamiento profiláctico se puede probar al observar las respuestas inmunes contra NMB1870 después de la administración de la composición. La inmunogenicidad de composiciones de la invención se puede determinar al administrarlas a sujetos de prueba (por ejemplo, niños de 12-16 meses de edad, o modelos de animales [13]) y luego determinar los parámetros estándar incluyendo anticuerpos bactericidas de suero (SBA) y concentraciones de ELISA (GMT) .

Estas respuestas inmunes se determinarán generalmente alrededor de 4 semanas después de la administración de la composición, y comparada con los valores determinados antes de la administración de la composición. Se prefiere un incremento de SBA de al menos 4 veces u 8 veces . En donde más de una dosis de la composición se administra, más de una determinación post-administración se puede hacer. Las composiciones preferidas de la invención pueden otorgar una concentración de anticuerpos en un paciente que sea superior al criterio de seroprotección para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de pacientes humanos. Son bien conocidos los antígenos con una concentración de anticuerpos asociada arriba de la cual un hospedero se considera que está seroconvertido contra el antígeno, y tales concentraciones se publican en organizaciones tales como la OMS. Preferiblemente más del 80% de una muestra estadísticamente representativa de sujetos es seroconvertida, más preferiblemente más del 90%, todavía más preferiblemente más del 93% y lo más preferiblemente 96-100%. Las composiciones de la invención se administrarán generalmente directamente al paciente. El suministro directo se puede lograr por inyección parenteral (por ejemplo, subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, o al espacio intersticial de un tejido) , o por administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración en la mucosa. La administración intramuscular en el muslo o en el antebrazo se prefiere. La inyección puede ser por medio de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica) , pero se puede usar alternativamente una inyección libre de aguja. Una dosis intramuscular típica es 0.5 ml. La invención también se puede usar para obtener inmunidad sistémica y/o en la mucosa. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis sencilla o un programa de dosis múltiples. Se pueden usar las dosis múltiples en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización con refuerzo. Se puede seguir un programa de dosis primaria por un programa de dosis de refuerzo. El tiempo adecuado entre las dosis primarias (por ejemplo, entre 4-16 semanas) , y entre primarias y refuerzos, se puede determinar de rutina. La composición inmunogénica de la invención incluirá generalmente un portador farmacéuticamente aceptable, el cual puede ser cualquier substancia que no induzca en sí misma la producción de anticuerpos perjudiciales para el paciente que recibe la composición, y que se puedan administrar sin toxicidad indebida. Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, y partículas inactivas de virus. Tales portadores son bien conocidos por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden incluir líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Substancias auxiliares, tales como agentes humectantes y emulsificantes, substancias amortiguadoras del pH, y los similares, también pueden estar presentes en tales vehículos. Los liposomas son portadores adecuados. Una discusión completa de los portadores farmacéuticos está disponible en la ref. 14. Las infecciones por Neisseria afectan a diversas áreas del cuerpo y así las composiciones de la invención se pueden preparar en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos previo a la inyección también se pueden preparar. La composición se puede preparar para administración local por ejemplo, como un ungüento, crema o polvo. La composición se puede preparar para administración oral por ejemplo, como una tableta o cápsula, o como un jarabe (opcionalmente con sabor) . La composición se puede preparar para administración pulmonar por ejemplo, como un inhalador, al usar un polvo fino o un rocío. La composición se puede preparar como un supositorio o un pesario. La composición se puede preparar para administración nasal, aural u ocular por ejemplo, como gotas. La composición es preferiblemente estéril. Está preferiblemente libre de pirógenos. Está preferiblemente amortiguada por ejemplo, a entre pH 6 y pH 8, generalmente alrededor de pH 7. Donde una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, se prefiere usar una solución amortiguadora de histidina [15] . Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los humanos. Las composiciones inmunogénicas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de inmunógeno, así como algunos otros de otros componentes especificados, como sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente efectiva" significa que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis sencilla o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y la condición física del individuo a tratarse, edad, el grupo taxonómico del individuo a tratarse (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema immune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico tratante de la situación médica y otros factores relevantes . Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que se pueda determinar a través de ensayos de rutina. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis sencilla o un programa de dosis múltiples (por ejemplo, que incluya dosis de refuerzo) . La composición se puede administrar en conjunto con otros agentes inmunoreguladores . Los adyuvantes que se pueden usar en las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a: A. Composiciones que contienen minerales Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos) , fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos) , sulfatos, etc. [por ejemplo, ver capítulos 8 y 9 de ref. 16], o mezclas de diferentes compuestos minerales, con los compuestos que toman cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalino, amorfo, etc.), y con la adsorción que es preferida. Las composiciones que contienen minerales también se pueden formular como una partícula de sal de metal [17] . Se prefieren particularmente los fosfatos de aluminio, particularmente en composiciones las cuales incluyen un antígeno de H. influenzae sacárido, y un adyuvante típico es el hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar P0/A1 entre 0.84 y 0.92, incluida a 0.6mg Al3+/ml. La adsorción con una dosis baja de fosfato de aluminio se puede usar por ejemplo, entre 50 y lOOµg de Al3+ por conjugado por dosis. En donde hay más de un conjugado en una composición, no necesitan adsorberse todos los conjugados.

B. Emulsiones en Aceite Las composiciones de emulsiones en aceite adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno y agua, tales como MF59 [Capítulo 10 de ref. 16; ver también ref. 18] (5% de escualeno, 0.5% Tween 80, y 0.5% Span 85, formulada en partículas de submicras que usan un microfluidizador) . Adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA) también se pueden usar.

C. Formulaciones de Saponina [capítulo 22 de ref. 16] Las formulaciones de saponina también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterólogo de glicósidos de esterol y glicósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, vastagos, raíces e incluso flores de una amplia variedad de especies de plantas. La saponina de la corteza del árbol de Molina de Quillaia saponaria se han estudiado ampliamente como adyuvantes . La saponina también se puede obtener comercialmente de Smilax ornata (sarsaprilla) , Gypsophilla paniculata (velo de novia), y Saponaria officianalis (raíz de jabonera) . Las formulaciones del adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones de lípidos, tales como ISCOMs. QS21 se comercializa como Stimulon™. Las composiciones de saponina se han purificado al usar CLAR y RP-CLAR. Las fracciones específicas purificadas con el uso de estas técnicas se han indetificado, incluyendo QS7, QS 17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferiblemente, la saponina es QS21. Un método de producción de QS21 se describe en la ref. 19. Las formulaciones de saponina también comprenden un esterol, tales como colesterol [20] . Las combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden usar para formar partículas únicas denominadas complejos de inmunoestimulación (ISCOMs) [capítulo 23 de ref. 16]. Los ISCOM típicamente también incluyen un fosfolípido tales como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Cualquier saponina conocida se puede usar en ISCOM. Preferiblemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen además en las refs. 20-22. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de detergente adicional [23] . Una revisión del desarrollo de los adyuvantes de base saponina se puede encontrar en las refs. 24 y 25.

D. Virosomas y partículas tipo virus Los virosomas y las partículas tipo virus (VLP) también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Estas estructuras generalmente contienen una o más proteínas de un virus opcionalmente combinado o formulado con un fosfolípido. Son generalmente no patogénicas, no replicantes y generalmente no contienen ninguno del genoma nativo viral. Las proteínas virales pueden producirse de forma recombinante o aislarse de virus enteros. Estas proteínas virales adecuadas para su uso en virosomas o VLPs incluyen proteínas derivadas del virus de influenza (tales como HA o NA) , virus de Hepatitis B (tales como proteínas cápsidas o de núcleo) , virus de Hepatitis E, virus de sarampión, virus de Sindbis, Rotavirus, virus de la enfermedad de la fiebre aftosa, Retrovirus, virus de Norwalk, virus de Papiloma humano, VIH, fagos de ARN, QD-fago (tales como proteínas de recubrimiento) , GA-fago, fr-fago, AP205 fago, y Ty (tales como proteína de retrotransposon Ty pl) . Las VLPs se discuten además en las refs. 26-31. Los virosomas se discuten además en, por ejemplo, ref. 32 E . Derivados bacterianos o microbianos Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS) , derivados del lípido A, oligonucleótidos inmunoestimuladores y toxinas ribosiladoras del ADP y derivados destoxificados de los mismos.

Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil lípido A (MPL) y 3-0-desacilado MPL (3dMPL) . 3dMPL es una mezcla de 3 de-O-acilado monofosforil lípido A con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma de "partícula pequeña" preferida de 3 De-O-acilado monofosforil lípido A se describe en la ref. 33. Tales "partículas pequeñas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas para filtrarse de forma estéril a través de una membrana de 0.22µm [33]. Otros derivados no tóxicos de LPS incluyen imitaciones de monofosforil lípido A, tales como los derivados de aminoalquil glucosaminida fosfato por ejemplo, RC-529 [34,35]. Los derivados del lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli tales como OM- 174. OM- 174 se describe por ejemplo en las refs. 36 y 37. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen una porción de CpG (una secuencia de dinucleótido que contiene una citosina no metilada ligada a un enlace de fosfato a una guanosina) . Los ARN de hebra doble y oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) también han demostrado ser inmunoestimuladores . Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de hebra doble o de hebra sencilla. Las referencias 38, 39 y 40 describen substituciones de análogos posibles por ejemplo, reemplazo de guanosina con 2'-desoxi-7-deazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se discute además en las refs. 41-46. La secuencia CpG se puede dirigir a TLR9, tales como la porción GTCGTT o TTCGTT [47] . La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune Thl, tales como un CpG-A ODN, o puede ser más específico para inducir una respuesta de células B, tal como CpG-B ODN. CpG-A y CpG-B ODNs se discuten en las refs. 48-50. Preferiblemente, la CpG es un CpG-A ODN. Preferiblemente, el oligonucleótido CpG se construye de manera que el extremo 5 ' es accesible para reconocimiento del receptor. Opcionalmente dos secuencias de oligonucleótido CpG se pueden unir en sus extremos 3' para formar "inmunómeros" . Ver, por ejemplo, refs. 47 y 51-53. Las toxinas bacterianas ribosiladoras de ADP y los derivados destoxificados de las mismas, se pueden usar como adyuvantes en la invención. Preferiblemente, la proteína se deriva de E. coli (enterotoxina "LT" afín al calor de E. coli ) , cólera ("CT"), o pertussis ("PT"). El uso de las toxinas destoxificadas ribosiladoras de ADP como adyuvantes de la mucosa se describe en ref. 54 y como adyuvantes parenterales en la ref. 55. La toxina o toxoide está preferiblemente en la forma de una holotoxina, que comprende ambas subunidades A y B. Preferiblemente, la subunidad A contiene una mutación destoxificadora; preferiblemente la subunidad B no está mutada. Preferiblemente, el adyuvante es un mutante destoxificado de LT tales como LT-K63, LT-R72, y LT-G192. El uso de toxinas ribosiladoras de ADP y derivados destoxificados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes se pueden encontrar en las refs. 56- 63. La referencia numérica para las substituciones de aminoácidos se basa preferiblemente en las alineaciones de las subunidades A y B de toxinas ribosiladoras de ADP establecidas en la ref. 64, incorporada específicamente en la presente como referencia en su totalidad.

F . Inmunomoduladores humanos Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen citoquinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-I, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [65], etc.) [66], interferones {por ejemplo, interferon-?) , factor estimulador de la colonia de macrófagos, y factor de necrosis de tumor.

G. Bioadhesivos y Mucoadhesivos Los bioadhesivos y mucoadhesivos también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen micoresferas esterificadas de ácido hialurónico [67] o mucoadhesivos tales derivados reticulados del ácido poli (acrílico) , alcohol polivinílico, polivinil pirolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. El quitosán y los derivados del mismo se pueden usar como adyuvantes en la invención [68] .

H. Micropartículas Las micropartículas se pueden usar como adyuvantes en la invención. Las micropartículas {esto es, una partícula de -lOOnm a ~150µm de diámetro, más preferiblemente ~200nm a ~30µm de diámetro, y lo más preferiblemente ~500nm a -lOµrn de diámetro) formada de materiales que son biodegradables y no tóxicos {por ejemplo, un ácido poli (hidroxi) , un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhidrido, una policaprolactona, etc.), con poli (lacturo-co-glicólido) se prefieren, opcionalmente tratados para tener una superficie de carga negativa (por ejemplo, con SDS) o una superficie de carga positiva {por ejemplo, con un detergente catiónico, tales como CTAB) .

I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de ref. 16) Ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes se describen en las refs. 69-71.

J. Formulaciones de éter polioxietileno y éster de polioxietileno Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y éster de polioxietileno [72] . Tales formulación incluyen además tensioactivos de éster de polioxietileno sorbitan en combinación con un octoxinol [73] así como éteres de polioxietileno alquilo o tensioactivos de éster en combinación con al menos un tensoactivo no iónico adicional tal como un octoxinol [74] . Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: éter de polioxietileno-9-laurilo (laureto 9) , éter de polioxietileno-9-esteorilo, éter de polioxiteileno-8-esteorilo, éter de polioxietileno-4-laurilo, éter de polioxietileno-35-laurilo, y éter de polioxietileno-23-laurilo.

K. Polifosfaceno (PCPP*) Las formulaciones PCPP se describen, por ejemplo, en las referencias 75 y 76.

L. Péptidos de muramilo Ejemplos de péptidos muramilo adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (no -MDP) , y N-acetilmuramil-L-alanil- D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1' -2 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina MTP-PE) .

M. Compuestos de imidazo uinolona. Ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adeucados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen imiquamod y sus homólogos (por ejemplo "Resiquimod 3M" ) , descritos además en las referencias 77 y 78. La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados arriba. Por ejemplo, las siguientes composiciones de adyuvantes pueden usarse en la invención: (1) una saponina y un emulsión aceite en agua [79]; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) [80] ; (3) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [81]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones aceite en agua [82] ; (6) SAF, que contienen 10% de escualeno, 0.4% Tween 80™, 5% polímero de bloque pluronico L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizador en una emulsión de submicron o vórtice para generar una partícula grande de emulsión de tamaño. (7) El sistema de adyuvante Ribi™ (RAS) , (Ribi Immunochem) que contiene 2% de escualeno, 0.2% Tween 80, y uno o más componentes de las paredes de células bacteriales del grupo que consiste de monofosforilípido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM) , y esqueleto de pared celular (CWS) , preferiblemente MPL + C S (Detox™) ; y (8) una o más sales minerales (tales como una sal de aluminio) + un derivado de LPS no tóxico (tales como 3dMPL) . Otras substancias que actúan como agents inmunoestimulantes se describen en el capítulo 7 de la referencia 16. Las sales de aluminio (fosfatos de aluminio y particularmente hidroxifosfatos, y/o hidróxidos y particularmente oxihidróxido) y MF59 son adyuvantes preferidos para la inmunización parenteral. Los mutantes de toxina son adyuvantes mucosal preferidos. QS21 es otro adyuvante útil para NMB1870, el cual puede usarse solo o en combinación con uno o más de otros adyuvantes por ejemplo, con una sal de aluminio. Los péptidos de muramilo incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (no MDP) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1 ' -2 ' -dipalmitoil-OT-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina MTP-PE) , etc.

Componentes antigénicos adicionales Las composiciones de la invención incluyen polipéptidos NMB1870 quiméricos. Es particularmente preferido que la composición no deberá incluir complejo o mezclas de antígenos no definidas por ejemplo, se prefiere para no incluir vesículas de membrana exterior en la composición. Los polipéptidos de la invención preferiblemente se expresan recombinantemente en un hospedera heteróloga y luego se purifica. La composición de la invención incluye un polipéptido NMB1870 quimérico. También se puede incluir uno o más antígenos neisseria adicionales, como una vacuna en la cual los objetivos más que un antígeno por la bacteria disminuye la posibilidad de seleccionar los mutantes de escape. Los antígeno Neisseria para inclusión en las composiciones que incluyen proteínas que comprenden: (a) la 446 aún SEQ IDs (esto es, 2, 4, 6, ... , 890, 892) descrita en la referencia 83. (b) la 45 aún SEQ IDs (esto es, 2, 4, 6, ... , 88, 90) descrita en la referencia 84; (c) la 1674 aún SEQ IDs 2-3020, aún SEQ IDs 3040-3114, y todas las SEQ IDs 3115-3241, descritas en la referencia 2; (d) la 2160 secuencia de aminoácidos NMB0001 hasta NMB2160 de referencia 4; (e) una proteína meningococo PorA, de cualquier subtipo, preferiblemente se expresa recombinantemente; (f) una variante, homólogo, ortólogo, paralogo, mutante etc. de (a) hasta (e) ; o (g) una preparación de vesícula de membrana exterior N. meningitidis [por ejemplo, ver referencia 177] . Además los antígenos de proteína Neisseria, la composición pueden incluir antígenos para inmunizar contra enfermedades o infecciones. Por ejemplo, la composición pueden incluir uno o más de los siguientes antígenos adicionales: - un antígeno sacárido de N. meningitidis del serogrupo A, C, W135 y/o Y, tales como el oligosacárido descrito en la referencia 85 del serogrupo C [ver también referencia 86] o los oligosacáridos de la referencia 87. - un antígeno sacárido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, 88, 89, 90] . - un antígeno del virus de la hepatitis A, tales como virus inactivado [por ejemplo, 91, 92]. - un antígeno del virus de la hepatitis B virus, tales como los antígenos de superficie y/o de núcleo [por ejemplo, 92, 93]. - un antígeno de difteria, tal como un toxoide de difteria [por ejemplo, capítulo 3 de la referencia 94] por ejemplo, el mutante CRM?97 [por ejemplo, 95] . - un antígeno de tétanos, tal como un toxoide de tétanos [por ejemplo, capítulo 4 de la referencia 94] . un antígeno de Bordetella pertussis, tales como holotoxina de pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinogenos 2 y 3 [por ejemplo, referencias 96 y 97] . — un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, 86] . — antígenos de polio [por ejemplo, 98, 99] tal como IPV. antígenos de sarampión, paperas y/o rubéola [por ejemplo, capítulos 9, 10 y 11 de referencia 94] . — antígenos de influenza [por ejemplo, capítulo 19 de la referencia 94] , tales como las proteínas de superficie de hemaglutinina y/o neuraminidasa. — un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 100] . — un antígeno de proteína de Streptococcus agalactiae (grupo B de estreptococos) [por ejemplo, 101, 102] . — un antígeno sacárido de Streptococcus agalactiae (grupo B de estreptococos) . — un antígeno de Streptococcus pyogenes (grupo A de estreptococos) [por ejemplo, 102, 103, 104]. — un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo, 105] . La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales. Los antígenos de proteína tóxica pueden destoxificarse cuando sea necesario (por ejemplo, destoxificación de la toxina pertussis por medios químicos y/o genéticos [97]).

En donde un antígeno de difteria se incluye en la composición y también se prefiere para incluir el antígeno de tétanos y antígeno pertussis. Del mismo modo, donde un antígeno de tétanos se incluye también se prefiere para incluir los antígenos de difteria y pertussis. Del mismo modo, donde un antígeno pértussis se incluye se prefiere también para incluir los antígenos de difteria y tétanos. Las combinaciones DTP son así preferidas. Los antígenos de sacárido están preferiblemente en la forma de conjugados. Las proteínas portadoras para los conjugados incluyen la proteína de membrana exterior N. meningitidis [106], péptidos sintéticos [107,108], proteínas de choque de calor [109,110], proteínas pertussis [111,112], proteína D de H. influenzae [113], citoquinas [114], linfocinas [114], proteínas de estreptococo, hormonas [114], factores de crecimiento [114], toxina A o B de C. difficile

[115], proteínas absorbente de hierro [116], etc. Una proteína portador preferida es el toxoide de difteria CRM197

[117] . Los antígenos en la composición típicamente estarán presentes a una concentración de al menos 1 µg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para producir una respuesta inmune con el antígeno . Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden usarse terapéuticamente (esto es, para tratar una infección existente) o profilácticamente (esto es, para prevenir una infección a futuro) . Como una alternativa para usar antígenos de proteínas en las composiciones inmunogénicas de la invención, el ácido nucleico (preferiblemente ADN por ejemplo en la forma de un plásmido) que codifica el antígeno puede usarse. Las composiciones preferidas particularmente de la invención incluyen, uno, dos o tres de: (a) antígenos sacáridos de meningococos serogrupos Y, W135, C y (opcionalmente) A; (b) un antígeno de sacárido Haemophilus influenzae tipo B; y/o (c) un antígeno de Streptococcus pneumoniae .

Serogrupos de Meningococos Y, 135, C y (opcionalmente) A Las vacunas de polisacárido contra serogrupos A, C, W135 e Y se han conocido por muchos años. Estas vacunas (MENCEVAX ACWY™ y MENOMUNE™) son con base en los organismos capsulares de polisacáridos y, aunque son efectivos en adolescentes y adultos, dan una respuesta inmune pobre y duración corta de protección, y no se usa en infantes. En contraste a los antígenos de polisacárido no conjugados en estas vacunas, las vacunas C del serogrupo aprobadas recientemente (Menjugate™ [118,85], Meningitec™ y NeisVac-C™) incluyen sacáridos conjugados. Menjugate™ y Meningitec™ tiene antígenos de oligosacárido conjugado a un portador CRM?g7, mientras que NeisVac-C™ usa el polisacárido completo (de-O-acetilado) conjugado hasta un portador toxoide de tétanos. La vacuna Menactra™ contiene antígenos de sacárido capsulares conjugados de cada uno de los serogrupos Y, 135, C y A. Las composiciones de la presente invención preferiblemente incluyen antígenos de sacárido capsulares de uno o más de serogrupos de meningococo Y, W135, C y (opcionalmente) A, en donde los antígenos se conjugan hasta proteínas portadoras y/o son oligosacáridos. Por ejemplo, la composición pueden incluir un antígeno de sacárido capsular de: serogrupo C; serogrupos A y C; serogrupos A, C y W135; serogrupos A, C e Y; serogrupos C, W135 e Y; o desde los cuatro de serogrupos A, C, W135 e Y. Una cantidad típica de cada antígeno sacárido de meningococo por dosis es entre 1 µg y 20 µg por ejemplo, alrededor de 1 µg, alrededor de 2.5 µg, alrededor de 4 µg, alrededor de 5 µg, o alrededor de 10 µg (expresado como sacárido) . Donde una mezcla comprende sacáridos capsulares de ambos serogrupos A y C, la relación (p/p) de sacárido MenA: sacárido MenC puede ser mayor que 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o más). Donde una mezcla comprende sacáridos capsulares de serogrupo Y y uno o ambos de los serogrupos C y W135, la relación (p/p) de sacárido MenY: sacárido Men l35 puede ser mayor que 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor) y/o que la relación (p/p) de sacárido MenY: sacárido MenC puede ser menor que 1 (por ejemplo, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, o inferior) . Las relaciones preferidas (p/p) para sacáridos de serogrupos A:C: 135:Y son: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2: 1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; y 2:2:2:1. Las relaciones preferidas (p/p) para sacáridos de serogrupos C:W135:Y son: 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1; y 2:1:1. Usando una masa substancialmente igual de cada sacárido se prefiere. Los sacáridos capsulares generalmente se usaran en la forma de oligosacáridos. Esto se forma convenientemente por la fragmentación de polisacárido capsular purificado (por ejemplo, por hidrólisis) , el cual usualmente se seguirá por purificación de los productos del tamaño deseado. La fragmentación de polisacáridos es preferiblemente llevada a cabo para dar un grado promedio final de polimerización (DP) en el oligosacárido de menos de 30 (por ejemplo, entre 10 y 20, preferiblemente alrededor de 10 para serogrupo A; entre 15 y 25 para serogrupos W135 e Y, preferiblemente alrededor de 15-20; entre 12 y 22 para serogrupo C; etc.). DP puede convenientemente medirse por una cromatografía de intercambio de ion o por ensayo colorimétrico [119] . Si la hidrólisis se lleva a cabo, el hidrolizado generalmente será el tamaño en orden para remover los oligosacáridos de longitud corta [86] . Esto puede lograrse en varias modos, tales como ultrafiltración seguida por cromatografía de intercambio de iones. Los oligosacáridos con un grado de polimerización de menos de o igual a alrededor de 6 se remueven preferiblemente para el serogrupo A, y aquellos de menos de alrededor de 4 se remueven preferiblemente para los serogrupos W135 e Y. Los antígenos de sacárido MenC preferidos están descritos en la referencia 118, como se usa en Menjugate™. El antígeno sacárido puede modificarse químicamente. Esto es particularmente útil para reducir la hidrólisis para el serogrupo A [120; ver a continuación] . La de-O-acetilación de sacáridos de meningococo pueden llevarse a cabo. Para los oligosacáridos, la modificación puede tomar lugar antes o después de la despolimerización. Donde una composición de la invención incluye un antígeno sacárido MenA, el antígeno es preferiblemente un sacárido modificado el cual uno o más de los grupos hidroxilo en el sacárido nativo se ha/se han reemplazado por un grupo de bloqueo [120] . Esta modificación mejora la resistencia a la hidrólisis.

El número de unidades de monosacárido que tienen grupos de bloqueo puede variar. Por ejemplo, todas o substancialmente todas las unidades de monosacárido puede tener grupos de bloqueo. Alternativamente, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de las unidades de monosacárido pueden tener grupos de bloqueo. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 unidades de monosacárido pueden tener grupos de bloqueo . Similarmente, el número de grupos de bloqueo en una unidad de monosacárido puede variar. Por ejemplo, el número de grupos de bloqueo en una unidad de monosacárido puede ser 1 ó 2. El grupo de bloqueo generalmente será en la posición 4 y/o en la posición 3 de las unidades de monosacárido. La unidad de monosacárido terminal puede o no puede tener un grupo de bloqueo en lugar de su hidroxilo nativo. Se prefiere para mantener un grupo hidroxilo anomérico libre en una unidad de monosacárido terminal en orden para proporcionar un manejo para reacciones adicionales (por ejemplo, conjugación) . Los grupos hidroxilo anomérico pueden convertirse a grupo amino (-NH2 o -NH-E, donde E es un grupo protector de nitrógeno) por aminación reductiva (usando, por ejemplo, NaBH3CN/NH4Cl) , y luego puede regenerarse después con otros grupos hidroxilo que se han convertido a grupos de bloqueo.

Los grupos de bloqueo para reemplazar a grupos hidroxilo pueden directamente ser accesible por medio de una reacción derivada del grupo hidroxilo esto es, al reemplazar el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo con otro grupo. Los derivados adecuados de grupos hidroxilo que actúan como grupos de bloqueo son, por ejemplo, carbamatos, sulfonatos, carbonatos, esteres, éteres (por ejemplo, éteres de sililo o éteres alquilo) y acétales. Algunos ejemplos específicos de tales grupos de bloqueo son alilo, aloe, bencilo, BOM, t-butilo, tritilo, TBS, TBDPS, TES, TMS, TIPS, PMB, MEM, MOM, MTM, THP, etc. Otros grupos de bloqueo que no son directamente accesibles y los cuales completamente reemplazan el grupo hidroxilo incluyen alquilo C?-?2, alquilo C3_?2, arilo C5-?2, arilo Cs-?2-alquilo C?-ß , NRR2 (R1 y R2 se definen en el siguiente párrafo), H, F, Cl, Br, C02H, C02(alquilo C?_6) , CN, CF3, CC13, etc. Los grupos de bloqueo preferidos son grupos retirados del electrón. Los grupos de bloqueo preferidos son de la fórmula: -0-X-Y o -OR3 en donde: X es C(0), S(0) o S02; Y es alquilo C?_?2, alcoxi C?-?2, cicloalquilo C3_?2, arilo Cs-?2 o arilo C5_?2-alquilo Ci-ß, cada uno de los cuales puede opcionalmente substituirse con 1, 2 ó 3 grupos independientemente seleccionados de F, Cl, Br, C02H, C02 (alquilo Ci-e) , CN, CF3 o CC13; o Y es NR1R2; R1 y R2 son independientemente seleccionados de H, alquilo C?_?2, cicloalquilo C3-?2, arilo C5- X2, arilo C5-?2-alquilo C?_6; o R1 y R2 puede unirse para formar un grupo heterocíclico C3-?2 saturado; R3 es alquilo C?-?2 o cicloalquilo C3-?2, cada uno de los cuales puede opcionalmente substituirse con 1, 2 ó 3 grupos independientemente seleccionados de F, Cl, Br, C02(alquilo C?_6) , CN, CF3 o CC13; o R3 es arilo Cs-?2 o arilo C5-?2-alquilo C?_6, cada uno de los cuales puede opcionalmente substituirse con 1, 2, 3, 4 ó 5 grupos seleccionados de F, Cl, Br, C02H, C02(alquilo Ci-e) , CN, CF3 o CC13. Cuando R3 es alquilo C?-?2 o cicloalquilo C3_?2, se substituye típicamente con 1, 2 ó 3 grupos como se define antes . Cuando R1 y R2 se unen para formar un grupo heterocíclico C3_?2 saturado, esto significa que R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno forman un grupo heterocíclico saturado que contiene cualquier número de átomos de carbono entre 3 y 12 (por ejemplo, C3, C , C5, Ce, C , Ce, Cg, Cío, Cu, C?2) . El grupo heterocíclico puede contener 1 ó 2 heteroátomos (tales como N, O u S) diferente al átomo de nitrógeno. Los ejemplos de grupos heterocíclico C_?2 saturado son pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, piperazinilo, imidazolidinilo, azetidinilo y aziridinilo. Los grupos de bloqueo -O-X-Y y -OR3 pueden prepararse de grupos -OH por procedimientos derivantes estándar, tales como reacción del grupo hidroxilo con un haluro acilo, haluro alquilo, haluro sulfonilo, etc. Por lo tanto, el átomo de oxígeno en -O-X-Y es preferiblemente el átomo de oxígeno del grupo hidroxilo, mientras que el grupo -X-Y en -O-X-Y preferiblemente reemplaza el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo. Alternativamente, los grupos de bloqueo pueden ser accesibles por medio de una reacción de substitución, tales como una substitución tipo Mitsonobu. Estos y otros métodos para preparar los grupos de bloqueo de grupos hidroxilo son bien conocidos. Más preferiblemente, el grupo de bloqueo es -OC(0)CF3 [121], o un grupo carbamato -OCÍOJNR^2, donde R1 y R2 son independientemente seleccionados de alquilo C?-6- Más preferiblemente, R1 y R2 son ambos metilo esto es, el grupo de bloqueo es -0C(0)NMe2. Los grupos de bloqueo carbamato tienen un efecto estabilizante en el enlace glicosidico y se puede preparar bajo condiciones suaves. Los sacáridos MenA modificados preferidos contienen unidades de monosacárido n, donde al menos h% de las unidades de monosacárido no tienen grupos -OH a ambas posiciones 3 y 4. El valor de h es 24 o más (por ejemplo, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 ó 100) y es preferiblemente 50 o más. Los grupos -OH ausentes son preferiblemente grupos de bloqueo como se define antes . Otros sacáridos MenA modificados preferidos comprenden unidades de monosacárido, en donde al menos s de las unidades de monosacárido no tienen -OH en la posición 3 y no tienen -OH en la posición 4. El valor de j es al menos 1 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90). Los grupos -OH ausentes son preferiblemente grupos de bloqueo como se define antes. Los sacáridos MenA modificados adecuados para uso con la invención tienen la fórmula: , en donde n es un entero desde 1 hasta 100 (preferiblemente un entero desde 15 hasta 25); T es de la fórmula (A) o (B) : cada grupo Z es independientemente seleccionado de OH o un grupo de bloqueo como se define antes; y cada grupo Q es independientemente seleccionado de OH o un grupo de bloqueo como se define antes; Y se selecciona de OH o un grupo de bloqueo como se define antes; E es H o un grupo protector de nitrógeno; y en donde más que alrededor del 7% (por ejemplo, 8%, 9%, 10% o más) de los grupos Q son grupos de bloqueo . Cada uno de los grupos n+2 Z puede ser el mismo o diferente uno del otro. Similarmente, cada uno de los grupos n+2 Q puede ser el mismo o diferente uno del otro. Todos los grupos Z pueden ser OH. Alternativamente, al menos 10%, 20, 30%, 40%, 50% o 60% de los grupos Z pueden ser OAc. Preferiblemente, alrededor de 70% de los grupos Z son OAc, con el resto de los grupos Z son OH o grupos de bloqueo como se define antes. Al menos alrededor del 7% de los grupos Q son grupos de bloqueo. Preferiblemente, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o aún el 100% de los grupos Q son grupos de bloqueo. Los polisacáridos capsulares de meningococo se preparan típicamente por un proceso que comprende las etapas de precipitación de polisacárido (por ejemplo, usando un detergente catiónico), fraccionación de etanol, extracción de fenol frío (para remover la proteína) y ultracentrifugación (para remover el LPS) [por ejemplo, referencia 122] . Un proceso más preferido [87], sin embargo, involucra la precipitación de polisacárido seguido por solubilización del polisacárido precipitado usando un alcohol inferior. La precipitación puede alcanzarse usando un detergente catiónico tales como sales de tetrabutilamonio y cetiltrimetilamonio (por ejemplo, la sal de bromuro) , o bromuro de hexadimetrina y sales de miristiltrimetilamonio. El bromuro de cetiltrimetilamonio ('CTAB') es particularmente preferido

[123] . La solubilización del material precipitado puede alcanzarse usando un alcohol inferior tales como metanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-1-ol, 2-metil-propan-2-ol, dioles, etc., pero etanol es particularmente adecuado para solubilizar los complejos de CTAB-polisacárido. El etanol se agrega preferiblemente al polisacárido precipitado para dar una concentración final (con base en el contenido total de etanol y agua) de entre 50% y 95%. Después de la re-solubilización, el polisacárido puede tratarse además para remover contaminantes . Esto es particularmente importante en situaciones donde aún- la contaminación menor no es aceptable (por ejemplo, para producción de vacuna humana) . Esto involucrará típicamente una o más etapas de filtración por ejemplo, filtración profunda, filtración a través de carbono activado puede usarse, filtración de tamaño y/o ultrafiltración. Una vez filtrado para remover los contaminantes, el polisacárido puede ser precipitado para tratamiento y/o procesamiento adicional. Esto puede alcanzarse convenientemente por cationes de intercambio (por ejemplo, por la adición sales de calcio o sodio) . Como una alternativa para purificación, los sacáridos capsulares pueden obtenerse por síntesis total o parcial por ejemplo, síntesis Hib como se describe en la referencia 124, y síntesis MenA en la referencia 125. Las composiciones de la invención comprenden sacáridos capsulares de al menos dos serogrupos de N. meningitidis. Los sacáridos preferiblemente se preparan separadamente (incluyendo cualquier fragmentación, conjugación, modificación, etc.) y luego se mezclan para dar una composición de la invención. Donde la composición comprende sacárido capsular de serogrupo A, sin embargo, se prefiere que el sacárido del serogrupo A no se combine con los otros sacáridos hasta antes de usarse cortamente, en orden para minimizar el potencial de hidrólisis. Esto puede alcanzarse convenientemente por tener el componente del serogrupo A (típicamente junto con excipientes apropiados) en forma liofilizada y los otros componentes del serogrupo en forma líquida (también con excipientes apropiados) , con los componentes líquidos se usan para reconstituir el componente liofilizado MenA cuando está listo para usarse. Donde un adyuvante de sal de aluminio se usa, se prefiere para incluir el adyuvante en el vial que contiene la vacuna líquida, y para liofilizar le componente MenA sin adyuvante. Una composición de la invención puede así prepararse de un kit que comprende: (a) sacárido capsular de N. meningitidis serogrupo A, en forma liofilizada; y (b) los antígenos adicionales de la composición, en forma líquida. La invención también proporciona un método para preparar una composición de la invención, que comprende mezcla un sacárido capsular liofilizado de N. meningitidis serogrupo A con los antígenos adicionales, en donde los antígenos adicionales son en forma líquida. La invención también proporciona un kit que comprende: (a) un primer recipiente de cebador que contiene sacáridos capsulares de dos o más de N. meningitidis serogrupos C, W135 e Y, todos en forma liofilizada; y (b) un segundo recipiente que contiene en forma líquida (i) una composición la cual, después de la administración a un sujeto, es capaz para inducir una respuesta del anticuerpo en tal sujeto, en donde la respuesta de anticuerpo es bactericida contra dos o más (por ejemplo, 2 ó 3) de líneas hipervirulentas A4, ET-5 y línea 3 de N. meningitidis serogrupo B, (ii) sacáridos capsulares de ninguno o de uno de N. meningitidis serogrupos C, W135 e Y, y opcionalmente (iii) antígenos adicionales (ver a continuación) que no incluyen sacáridos capsulares de meningococo, en donde, la reconstitución de los contenidos del recipientes (a) por los contenidos del recipiente (b) proporciona a composición de la invención. Dentro de cada dosis, la cantidad de un antígeno sacárido individual generalmente será entre 1-50 µg (medido como masa de sacárido), con alrededor de 2.5 µg, 5 µg o 10 µg de cada uno se prefieren. Con A:C: 135:Y relaciones de peso de 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; y 2:2:2:1, por lo tanto, la cantidad representada por el número 1 es preferiblemente alrededor de 2.5 µg, 5 µg o 10 µg. Para una relación de composición 1:1:1:1 A:C:W:Y y un 10 µg por sacárido, por lo tanto, 40 µg de sacárido se administra por dosis : Las composiciones preferidas de la invención comprenden menos de 50 µg de sacárido meningococal por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <40 µg de sacárido meningococal por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <30 µg de sacárido meningococal por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <25 µg de sacárido meningococal por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <20 µg de sacárido meningococal por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <10 µg de sacárido meningococal por dosis pero, idealmente, las composiciones de la invención comprenden al menos 10 µg de sacárido meningococal por dosis. Los conjugados MenC Menjugate™ y NeisVac™ usan un adyuvante de hidróxido, mientras que Meningitec™ usa un fosfato. Es posible en las composiciones de la invención adsorber algunos antígenos para un hidróxido de aluminio, pero tienen otros antígenos en asociación con un fosfato de aluminio. Para combinaciones del serogrupo tetravalente, por ejemplo, están disponibles las siguientes permutaciones : Para combinaciones de serogrupo N. meningi tidis trivalente, están disponibles las siguientes permutaciones: Influenza hemofilus tipo B Donde la composición incluye un antígeno de H. influenzae tipo B, típicamente será una antígeno sacárido capsular Hib. Los antígenos de sacárido de H. influenzae b son bien conocidos . Ventajosamente, el sacárido Hib se conjuga covalentemente a una proteína protadora, con objeto de aumentar su inmunogenicidad, especialmente en niños. La preparación de conjugados de polisacárido en general, y del polisacárido capsular Hib en particular, está bien documentado [por ejemplo, referencias 126 hasta 134 etc.]. La invención puede usar cualquier conjugado Hib apropiado. Las proteínas portadoras apropiadas se describen abajo, y los portadores preferidos para sacáridos Hib son CRM?9 ('HbOC')/ toxoide tetánico ('PRP-T') y el complejo de membrana exterior de N. meningi tidis ('PRP-OMP'). La porción de sacárido del conjugado puede ser un polisacárido (por ejemplo, fosfato de poliribosilribitol de longitud completa (PRP)), pero se prefiere para polisac+aridos de hidrolisa para formar oligosacáridos (por ejemplo, MW desde -1 hasta ~5 kDa) .

Un conjugado preferido comprende el oligosacárido Hib ligado covalentemente a CRM?97 por medio de un ligador de ácido adípico [135, 136] . El toxoide tetánico también es un portador preferido. Las composiciones de la invención pueden comprender más de un antígeno Hib. Donde la composición incluye un antígeno de sacárido Hib, se prefiere que no incluya también un adyuvante de hidróxido de aluminio. Si la composición incluye un adyuvante de fosfato de aluminio, entonces el antígeno Hib puede adsorber al adyuvante [137] o puede no adsorberlo [138]. Los antígenos Hib pueden liofilizarse por ejemplo, junto con antígenos meningococales .

Neumonía por estreptococos Cuando la composición incluye un antígeno S. pneumoniae, típicamente será un antígeno de sacárido capsular que se conjuga preferiblemente a una proteína portadora [por ejemplo, refs. 88-90]. Se prefiere que incluya sacáridos de más de un serotipo de S. neumoniae. Por ejemplo, las mezclas de polisacáridos de 23 serotipos diferentes se usan ampliamente, como son vacunas conjugadas con polisacáridos de entre 5 y 11 serotipos diferentes [139] . Por ejemplo, PrevNar™ [140] contiene antígenos de siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, y 23F) con cada sacárido conjugado individualmente a CRM197 por aminación reductiva, con 2µg de cada sacárido por 0.5ml de dosis (4µg del serotipo 6B) , y con conjugados que se adsorben en un adyuvante de fosfato de aluminio. Las composiciones de la invención incluyen preferiblemente al menos los serotipos 6B, 14, 19F y 23F. Los conjugados pueden adsorberse en un fosfato de aluminio. Como una alternativa a usar antígenos de sacárido de neumococos, la composición puede incluir uno o más antígenos de polipéptido. Las secuencias de genoma para varias cepas de neumococos están disponibles [141,142] y pueden someterse a vacunología inversa [143-146] para identificar antígenos de polipéptido apropiados [147,148]. Por ejemplo, la composición puede incluir uno o más de los siguientes antígenos: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28 y Spl30, como se define en la referencia 149. En algunas modalidades, la composición puede incluir antígenos tanto sacáridos como de polipéptido de neumococos. Estos pueden usarse en mezcla sencilla, o el antígeno de sacárido neumococal puede conjugarse a una proteína neumococal. Las proteínas portadoras apropiadas para tales modalidades incluyen los antígenos enlistados en el párrafo previo [149] . Los antígenos de neumococos pueden liofilizarse, por ejemplo, junto con antígenos meningococales e/o Hib.

Conjugación covalente Los sacáridos capsulares en composiciones de la invención usualmente se conjugarán a las proteínas portadoras. En general, la conjugación aumenta la inmunogenicidad de sacáridos que se convierten de antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T, permitiendo de esta manera el cebado para memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas y es una técnica bien conocida [por ejemplo, revisión en refs. 150 y 126-134] . Las proteínas portadoras preferidas son toxinas o toxoides bacteriales, tales como toxoide de difteria o toxoide tetánico. La toxina de difteria mutante CRM?97 [117, 151, 152] se prefiere particularmente. Otras proteínas portadoras apropiadas incluyen la proteína de membrana exterior de N. meningi tidis [106] , péptidos sintéticos [107, 108], proteínas de choque de calor [109, 110], proteínas pertussis [111, 112], citoquinas [114], linfocinas [114], hormonas [114], factores de crecimiento [114] , proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de célula CD4+ T humana de varios antígenos derivados de patógenos [153], proteína D de H. influenzae [113, 154], proteína de superficie neumococal PspA [155], proteínas de absorción de hierro [116] , toxina A o B de C . di ffi cil e [115], etc. Los portadores preferidos son toxoide de difteria, toxoide tetánico, proteína D de H. infl uenzae, y CRM?97. Con la composición de la invención, es posible usar más de una proteína portadora, por ejemplo, para reducir el riesgo de supresión del portador. De esta manera, pueden usarse proteínas portadoras diferentes para serogrupos diferentes, por ejemplo, los sacáridos del serogrupo A pueden conjugarse a CRM?97, mientras que los sacáridos del serogrupo C pueden conjugarse al toxoide tetánico. También es posible usar más de una proteína portadora para un antígeno de sacárido particular por ejemplo, los sacáridos de serogrupo A pueden estar en dos grupos, con alguno conjugado a CRM?9 y otros conjugados al toxoide tetánico. En general, sin embargo, se prefiere el uso de la misma proteína portadora para todos los sacáridos. Una proteína portadora sencilla puede portar más de un antígeno de sacárido [156] . Por ejemplo, una proteína portadora sencilla puede conjugarse a su sacárido de los serogrupos A y C. Para alcanzar este punto, los sacáridos pueden mezclarse antes de la reacción de conjugado. En general, sin embargo, se prefiere tener conjugados separados para cada serogrupo. Los conjugados con una relación sacárido:proteína (p/p) de entre 1:5 (esto es, proteína en exceso) y 5:1 (esto es, sacárido en exceso) se prefieren. Las relaciones entre 1:2 y :1 se prefieren, así como las relaciones entre 1:1.25 y 1:2.5 son más preferidas. El exceso de proteína portadora se prefiere para MenA y MenC. Los conjugados pueden usarse en conjunto con proteína portadora libre [157] . Cuando una proteína portadora dada se presenta en forma tanto libre como conjugada en la composición de la invención, la forma no conjugada preferiblemente no es de más del 5% de la cantidad total de la proteína portadora en la composición como un todo, y más preferiblemente menos de 2% en peso. Cualquier reacción de conjugación apropiada puede usarse, con cualquier ligador donde sea necesario. El sacárido típicamente se activará o funcionalizará antes de la conjugación. La activación puede involucrar, por ejemplo, reactivos cianilantes tales como CDAP (por ejemplo, l-ciano-4-dimetilamino piridinio tetrafluoroborato [158, 159, etc.]). Otras técnicas apropiadas usan carbodiimidas, hidrazidas, esteres activos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU; ver también la introducción a la referencia 132) . Los ligados por medio de un grupo ligador pueden hacerse usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 160 y 161. Un tipo de ligadura involucra la aminación reductiva del polisacárido, el acoplamiento del grupo amino resultante con un extremo de un grupo ligador de ácido adípico, y luego acoplar la proteína al otro extremo del grupo ligador de ácido adípico [130, 162, 163] . Otros ligadores incluyen B-propionamido [164] , nitrofenil-etilamina [165] , haluros de haloacilo [166], ligaduras glicosídicas [167], ácido 6-aminocaproico [168], ADH [169], porciones C hasta C?2 [170] etc. Como una alternativa a usar un ligador, puede usarse el ligado directo. Los ligados directos a la proteína pueden comprender la oxidación del polisacárido después de la aminación reductiva con la proteína, como se describe en, por ejemplo, las referencias 171 y 172. El proceso involucra la introducción de grupos amino en el sacárido (por ejemplo al reemplazar los grupos =0 terminales con -NH2) seguido por la derivación con un diéster adípico (por ejemplo, diéster N-hidroxisuccinimido del ácido adípico) y la reacción con la proteína portadora se prefiere. Otra reacción preferida usa la activación CDAP con un portador de proteína D por ejemplo para MenA o MenC. Después de conjugar, los sacáridos libres y conjugados pueden separarse. Hay muchos métodos apropiados, incluyendo cromatografía hidrofóbica, ultrafiltración tangencial, diafiltración etc. [ver también refs. 173 y 174, etc.]. Donde la composición de la invención incluye un oligosacárido conjugado, se prefiere que la conjugación preceda la preparación del oligosacárido.

Vesículas de membrana exterior Se prefiere que las composiciones de la invención no deberán incluir mezclas en complejo o no definidas de antígenos, que son características típicas de los OMV. Sin embargo, una forma en la cual la invención puede aplicarse a los OMV es donde los OMV son capaces de administrarse en programa de dosis múltiple. Donde más de una dosis OMV se administra, cada dosis puede complementarse (ya sea al agregar la proteína purificada o por expresión de la proteína dentro de la bacteria de la cual los OMV se derivan) por una de la primera proteína, segunda proteína o tercera proteína como se define arriba. Preferiblemente, las dosis diferentes se complementan con diferentes familias NMB1870. En un programa OMV de tres dosis, por ejemplo, cada dosis deberá contener una diferente de la primera proteína, segunda proteína y tercera proteína de tal manera que, después de recibir las tres dosis de OMV, las tres familias se han recibido. En un programa OMV de dos dosis, deberá usarse una familia por dosis OMV (de esta manera omitiendo una familia) , o una o ambas dosis OMV deberán complementarse con más de una familia con objeto de dar cobertura con las tres familias. En modalidades preferiferidas, hay tres dosis OMV, y cada una de las tres dosis OMV contienen tres diferentes poblaciones de vesículas producidas por ingeniería genética cada una exhibe tres subtipos, por ello dando nueve diferentes subtipos en todas. Este enfoque puede usarse en general para mejorar preparaciones de microvesículas del serogrupo B de N. meningi tidis [175], OMV nativos' [176], vejigas o vesículas de membrana exterior [por ejemplo, refs. 177 hasta 182, etc.]. Estas pueden prepararse de bacterias que se han manipulado genéticamente [183-186] por ejemplo, para incrementar la inmunogenicidad (por ejemplo, inmunógenos hiperexpresados) , para reducir la toxicidad, para inhibir la síntesis de polisacáridos capsulares, para subregular la expresión PorA, etc. Estos pueden prepararse a partir de cepas en hipervejigas [187-190] . Las vesículas de una Neisseria no patogénica pueden incluirse [191] . Las OMV pueden prepararse sin el uso de detergentes [192, 193]. Estas pueden expresar proteínas no de Neisserial en su superficie

[194] . Estas pueden ser libres de LPS . estas pueden mezclarse con [177, 195] . Las vesículas de bacterias con subtitpos de proteína de membrana exterior clase I diferentes pueden usarse, por ejemplo, seis diferentes subtipos [196, 197] usando poblaciones de vesícula producidas por ingeniería genética diferentes cada una exhibiendo tres subtipos, o nueve diferentes subtipos usando tres diferentes poblaciones de vesículas producidas por ingeniería genética diferentes cada una exhibiendo tres subtipos, etc. Los subtipos útiles incluyen: Pl.7,16; Pl.5-1, 2-2; Pl.19, 15-1; Pl.5-2,10; Pl.12-1,13; Pl.7-2,4; P1.22, 14; Pl.7-1,1; Pl.18-1,3,6. También es posible, por supuesto, complementar preparaciones de vesícula con dos o tres diferentes familias.

Anticuerpos monoclonalea La invención proporciona un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo en una proteína NMB1870 meningococal, en donde el epítopo requiere la presencia de ambos dominios B y C en el NMB1870. De esta manera, el anticuerpo monoclonal no se enlaza a un dominio B separado o a un dominio C separado, pero se enlaza a una combinación de los dominios B y C (y también al NMB1870 completo) . De esta manera, el epítopo puede ser un epítopo discontinuo formado de residuos de aminoácido en ambos dominios B y dominio C. El término "anticuerpo monoclonal' incluye cualesquiera de los diversos anticuerpos artificiales y proteínas derivadas de anticuerpo que están disponibles, por ejemplo anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de dominios sencillo, anticuerpos Fv de cadena sencilla (scFV) , oligocuerpos monoclonales, fragmentos o constructos de anticuerpo dimérico o trimérico, minicuerpos, o fragmentos funcionales de los mismos que se enlazan al antígeno en cuestión. El anticuerpo está preferiblemente en forma substancialmente aislada.

En una molécula de anticuerpo natural, hay dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada y cada cadena ligera tienen en su extremo de terminal N un dominio variable. Cada dominio variable está compuesto de cuatro regiones de columna (FR) que se alternan con tres regiones que determinan la complementariedad (CDR) . Los residuos en los dominios variables se numeran convencionalmente de conformidad con el sistema trazado por Kabat et al. [198]. Las designaciones del residuo de Kabat no siempre corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos de aminoácido y la secuencia de aminoácido lineal puede contener algunos o adicionales aminoácidos que en la numeración de Kabat estricta. Esto puede corresponder a una organización aleatoria de, o inserción en, un componente estructural, si es de estructura o CDR, de la estructura de dominio variable básica. Para evitar una respuesta inmune anti-ratón no específica en humanos, los anticuerpos no humanos son preferiblemente humanizados o quiméricos, [por ejemplo, refs. 199 y 200] . Como una alternativa, los anticuerpos completamente humanos pueden usarse. En anticuerpos quiméricos, las regiones constantes no humanas se substituyen por regiones constantes humanas pero las regiones variables se mantienen no humanas. Los anticuerpos humanizados pueden alcanzarse por una variedad de métodos que incluyen, por ejemplo: (1) injertar regiones complementariamente determinantes (CDRs) de la región variable no humana en una estructura humana ("injertado de CDR"), con la transferencia adicional opcional de una o más residuos de estructura del anticuerpo no humano ("humanizado"); (2) transplantar los dominios de variable no humana completos, pero "cubrirlos" con una superficie tipo humano al reemplazar los residuos de superficie ("chapado"). En la presente invención, los anticuerpos humanizados incluyen aquellos obtenidos por injertado de CDR, humanizado, y chapado de regiones variables [por ejemplo, refs. 201 hasta 207]. Los anticuerpos humanizados o completamente humanos también pueden producirse usando animales transgénicos que son producidos por ingeniería para contener las ubicaciones de inmunoglobulina humanas. Por ejemplo, la ref. 208 describe animales transgénicos que tienen una ubicación Ig humana en donde los animales no producen inmunoglobulinas endógenas funcionales debido a la inactivación de las ubicaciones de cadena pesada y ligera endógenas. La ref. 209 también describe hospederos mamíferos no primates transgénicos capaces de montar una respuesta inmune a un inmunógeno, en donde los anticuerpos tienen regiones constantes y/o variables de primate, y en donde las ubicaciones que codifican la inmunoglobulina endógenas se substituyen o inactivan. La ref. 210 describe el uso del sistema Cre/Lox para modificar la ubicación de inmunoglobulina en un mamífero, tal como reemplazar todo o una porción de la región constante o variable para forman una molécula de anticuerpo modificada. La ref. 211 describe hospederos mamíferos no humanos que tienen ubicaciones Ig endógenas inactivadas y ubicaciones Ig humanas funcionales. La ref. 212 describe métodos para hacer ratones transgénicos en los cuales los ratones carecen de cadenas pesadas endógenas, y expresan una ubicación de inmunoglobulina exógena que comprende una o más regiones xenogénicas. Los anticuerpos naturalmente tienen dos cadenas separadas, sin embargo, se prefieren para usarse como un anticuerpo de cadena sencilla ("sFv") en los cuales los dominios variables de cadena pesada y ligera se unen por un ligador para dar una cadena de polipéptido sencilla. Los kits para preparar sFv están disponibles a la mano, y los sFvs anti-ligandos son las segundas secuencias preferidas para usarse en la invención. Los anticuerpos de dominio sencillo también pueden obtenerse de camélidos o tiburones [213], o por camelización [214] . El polipéptido sFv es un heterodímero VH-V ligado covalentemente que se expresa de una fusión de genes que incluye genes que codifican VH y V ligados por un ligador que codifica el péptido [215] . Se han descrito un número de métodos para discernir y desarrollar estructuras químicas (ligadores) para convertir las cadenas ligera y pesada, naturalmente agregadas, pero separadas químicamente, de una región V de anticuerpo en una molécula sFv que se plega en una estructura tridimensional substancialmente similar a la estructura de un sitio de enlace al antígeno. Ver, por ejemplo, refs. 216-218. Las moléculas sFv pueden producirse usando métodos descritos en el arte. Los criterios de diseño incluyen determinar la longitud apropiada para medir la distancia entre la terminal C de una cadena y la terminal N de la otra, en donde el ligador se forma generalmente de residuos de aminoácidos hidrofílicos pequeños que no enrollan o forman estructuras secundarias. Tales métodos se han descrito en el arte [por ejemplo, refs. 216-218] . Los ligadores apropiados comprende cadenas de polipéptido de conjuntos alternativos de residuos de glicina y serina, y pueden incluir ácido glutámico y residuos de lisina insertados para aumentar la solubilidad. Los "mini-anticuerpos" o "minicuerpos" también encontrarán uso con la presente invención. Los minicuerpos son cadenas de polipéptido sFv que incluyen dominios de oligomerización en cualquier terminal C, separadas del sFv por una región de articulación [219] . El dominio de oligomerización comprende hélices a auto-asociadas, por ejemplo, cremalleras de leucina, que pueden estabilizarse además por enlaces disulfuro adicionales. El dominio de oligomerización se diseña para ser compatible con el pliegue vectorial a través de la membrana, un proceso para falicitar el pliegue in vivo del polipéptido en una proteína de enlace funcional. Generalmente, los minicuerpos se producen usando métodos recombinantes bien conocidos en el arte. Ver, por ejemplo [219] , [220] . Los "Oligocuerpos" también encontrarán el uso con la presente invención. Los oligocuerpos son anticuerpos sintéticos. La especificidad de estos reactivos se han demostrado por análisis Western blot e inmunohisoquímica. Que tiene algunas propiedades deseadas, nombradas como su producción es independiente del sistema inmune, que puede prepararse en unos pocos días y que no se necesita para una proteína objetivo purificada [221] . Los oligocuerpos se producen usando métodos recombinantes bien conocidos en el arte [222] . Los anticuerpos se producen usando técnicas bien conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en el arte [por ejemplo, referencias 223-228] . Los anticuerpos monoclonales se preparan generalmente usando el método de Kohier & Milstein (1975) [229], o una modificación del mismo. Típicamente, un ratón o rata se inmuniza como se describe arriba. También pueden usarse conejos. Sin embargo, en vez de sangrar al animal para extraer el suero, el bazo (y opcionalmente diversos ganglios linfáticos grandes) se remueve y disocia en las células sencillas. Si se desea, las células de bazo pueden separarse por exclusión (después de la eliminación de células específicamente no adherentes) al aplicar una suspensión celular a una placa o pozo recubierta con antígeno. Las células B, expresan inmunoglobulinda enlazada a la membrana específica para el antígeno, se enlazará a la placa, y no se enjuagan con el resto de la suspensión. Las células B resultantes, o todas las células de bazo disociadas, luego se inducen para fusionarse con células de mieloma para formar hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo, medio "HAT") . Los hibridomas resultantes se forman en placas al limitar la dilución, y se hacen en ensayos para la producción de anticuerpos los cuales enlazan específicamente al antígeno inmunizante (y el cual no enlaza a los antígenos no relacionados) . Los hibridomas que secretan anticuerpo monoclonal seleccionados luego se cultivan ya sea in vitro (por ejemplo en botellas de cultivo de tejido o reactores de fibra hueca) , o in vivo (por ejemplo como ascitos en ratones) . La invención también proporciona un hibridoma que expresa el anticuerpo de la invención, este hibridoma puede usarse en varias formas por ejemplo como una fuente de anticuerpos monoclonales o como una fuente de ácido nucleico (ADN o ARNm) que codifica el anticuerpo monoclonal de la invención para la clonación de genes del anticuerpo para expresión recombinante subsecuente. Los anticuerpos pueden producirse por cualquier medio adecuado (por ejemplo, por expresión recombinante) . La expresión de las fuentes recombinantes es más común para propósitos farmacéuticos que se expresan de las células B o hibridomas por ejemplo, por razones de estabilidad, reproducibilidad, fácil cultivo, etc. Los fragmentos de anticuerpo los cuales retienen la capacidad de reconocer NMB1870 también se incluyen dentro del alcance de la invención. un número de fragmentos de anticuerpo son conocidos en el arte los cuales comprenden sitios que enlazan antígeno capaces de mostrar propiedades de enlace inmunológico de una molécula de anticuerpo intacto. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo funcional pueden producirse al desdoblar una región constante, que no responde para el enlace de antígeno, de la molécula de anticuerpo, usando por ejemplo, pepsina, para producir fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos contendrán dos sitios de enlace a antígeno, pero carecen de una porción de la región constante de cada una de las cadenas pesada. De forma similar, si se desea, los fragmentos Fab, comprenden un sitio de enlace a antígeno sencillo, pueden producirse, por ejemplo, por digestión de anticuerpos monoclonales con papaina. Los fragmentos funcionales, que incluyen solo las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, también pueden producirse, usando técnicas estándar tales como producción recombinante o desdoblamiento proteolítico preferencial de las moléculas de inmunoglobulina. Estos fragmentos se conocen como Fv. Ver, por ejemplo, [230], [231] y [232]. Los medios convencionales también pueden usarse para generar e identificar los anticuerpos de la invención, por ejemplo, una colección muestra que el fago puede hacerse por separación por exclusión para anticuerpos de la invención [233-236]. Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo IgA, IgG, IgM, esto es, una cadena pesada a, ? o µ) , pero preferiblemente será IgG. Dentro del isotipo IgG, los anticuerpos pueden ser subclases IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4. Los anticuerpos de la invención pueden tener K o una cadena ligera ?.

Expresión de proteínas Las técnicas de expresión bacterial se conocen en el arte. Un promotor bacterial es cualquier secuencia de ADN capaz de enlazar la polimerasa de ARN bacterial e iniciar la transcripción en dirección en dirección 3' (3') de una secuencia de codificación (por ejemplo gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción el cual usualmente se coloca próximo al extremo 5 ' de la secuencia de codificación. La región de inicio de transcripción usualmente incluye un sitio que enlaza la polimerasa del ARN y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor bacterial también puede tener un segundo dominio llamado un operador, que puede traslapar una polimerasa de ARN adyacente del sitio de enlace en el cual la síntesis de ARN inicia. El operador permite la transcripción negativa regulada (inducible) , como un gen represor de proteína puede enlazar al operador y por ello inhibe la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede ocurrir en ausencia de elementos reguladores negativos, tales como el operador. Además, la regulación positiva puede realizarse por una secuencia de enlace de proteína del gen activador, la cual, si se presenta usualmente próximo (5') a la secuencia de enlace de polimerasa ARN. Un ejemplo de una proteína del gen activador es la proteína de catabolito activador (CAP) , el cual ayuda a la transcripción que inicia del operon lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al. (1984) Annu Rev. Genet. 18:173]. La expresión reguladora puede por lo tanto ser ya sea positiva o negativa, por ello aumenta o reduce la transcripción. Las secuencias que codifican enzimas de trayectoria metabólica proporcionan particularmente secuencias de promotor útiles. Los ejemplos incluyen secuencias de promotor derivadas de enzimas metabolizantes de azúcar, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang et al. (1977) Natura 198:1056], y maltosa.

Los ejemplos adicionales incluyen secuencias de promotor derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptofano (trp) [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981) Nucí. Acids Res. 9:731; Patente de EUA 4,738,921; EP-A- 0036776 y EP-A-0121775] . El sistema de promotor de ß-lactamasa (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes". In Interferon 3 (ed. I. Gresser) ] , bacteriófago lambda PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128] y T5 [Patente de EUA 4,689,406] sistemas de promotor también proporciona secuencias de promotor útiles. Otro promotor de interés es un promotor arabinosa inducible (pBAD) . Además, los promotores sintéticos las cuales no ocurren en la naturaleza también en la función como promotores bacteriales. Por ejemplo, las secuencias de la activación de transcripción de un promotor bacteriófago o bacterial puede unirse con las secuencias de operon de otro promotor bacteriófago o bacterial, creando un promotor híbrido sintético [Patente de EUA 4,551,433]. Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp-lac híbrido que comprende tanto las secuencias de operon lac como el promotor trp que se regula por el represor lac [Amann et al. (1983) Gene 25:167; de Boer et al. (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. 80:21]. Adicionalmente, un promotor bacterial puede incluir promotores que se presentan naturalmente de origen no bacterial que tienen la capacidad para enlazar la polimerasa de ARN bacterial e inicia la transcripción. Un promotor que se presenta naturalmente de origen no bacterial también puede acoplarse con una polimerasa de ARN compatible para producir niveles altos de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema de polimerasa/promotor de ARN T7 de bacteriófago es un ejemplo de un sistema de promotor acoplado [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985) Proc Nati Acad. Sci. 82:1074], Además, un promotor híbrido también se puede comprender de un promotor bacteriófago y una región operador E. coli (EPO-A-0 267 851) . Además para una secuencia de promotor de función, un sitio de enlace de ribosoma eficiente también es útil para la expresión de genes externos en procariotas. En E. coli, el sitio de enlace de ribosoma se llama la secuencia Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos en longitud localizadas en 3-11 nucleótidos en dirección ascendente del codón de inicio [Shine et al. (1975) Nature 254:34]. Las secuencias SD y las 3' y de ARNr 16S de E. coli [Steitz et al. (1979) "Genetic signáis and nucleotide sequences in messenger RNA". In Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F.

Goldberger) ] . Para expresar los genes eucarióticos y genes procarióticos con el sitio de enlace de ribosoma débil [Sambrook et al. (1989) "Expresión of cloned genes in Escherichia coli." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Una secuencia de promotor puede ligarse directamente con la molécula de AND, en la cual el primer caso de aminoácido en la terminal N siempre será una metionina, la cual se codifica por el codón de inicio ATG. Si se desea, la metionina en la terminal N puede desdoblarse de la proteína por incubación in vitro con bromuro de cianogeno o por ya sea incubación in vivo o in vitro con una peptidasa de terminal N de metionina bacterial (EP-A-0219237) . Usualmente, las secuencias de término de transcripción reconocidas por las bacterias son regiones reguladoras localizadas en 3' para el codón detenido de traducción, y así junto con el promotor flanqueado que codifica la secuencia. Estas secuencias se dirigen a la transcripción de un ARNm el cual puede transladarse en el polipéptido que se codifica por el ADN. Las secuencias de terminación transcripcional frecuentemente incluyen secuencias de ADN de alrededor de 50 nucleótidos capaces de formar estructuras de rizo troncales que ayudan en la terminación de la transcripción. Los ejemplos incluyen secuencias de terminación de transcripción derivadas de genes con promotores grandes, tales como el gen trp en E. coli así como otros genes biosintéticos. Usualmente, los componentes descritos arriba, comprenden un promotor, secuencia de señal (si se desea) , secuencia de codificación de interés, y secuencia de terminación de transcripción, se pusieron juntos en los constructos de expresión. Los constructos de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tales como un elemento extracromosomal (por ejerrplo plásmidos) capaces de mantenerse estables en un hospedero, tales como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación, así permite mantenerse en un hospedero procariótico ya sea para expresión o para clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser ya sea un plásmido con alto o bajo número de copia. Un plásmido con alto número de copia generalmente tendrá un rango de número de copia desde alrededor de 5 hasta alrededor de 200, y usualmente alrededor de 10 hasta alrededor de 150. Un hospedero contiene un plásmido con alto número de copia preferiblemente contendrá al menos de alrededor de 10, y más preferiblemente al menos de alrededor de 20 plásmidos. Ya sea un vector con alto o bajo número de copa puede seleccionarse, dependiendo del efecto del vector y la proteína externa en un hospedero. Alternativamente, los constructos de expresión pueden integrarse en el genoma bacterial con un vector integrado. Los vectores integrados usualmente contienen al menos una secuencia homologa para el cromosoma bacterial que permite el vector para integrarse. Las integraciones aparentan para resultar de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacterial. Por ejemplo, los vectores integrados construidos con ADN de diversas cepas de Bacillus integradas en el cromosoma Bacillus (EP-A-0127328) . Los vectores integrados también pueden comprender de secuencias de bacteriófago o transposon.

Usualmente, los constructos de expresión extracromosomales e integrales pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas de bacterias que sean transformado. Los marcadores seleccionables pueden expresarse en la bacteria hospedera y pueden incluir genes los cuales convierten a la bacteria resistente al fármaco tal como, ampicilina, cloramfenicol, eritromicina, canamicina (neomicina) y tetraciclina [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469]. Los marcadores también incluyen genes biosínteticos, tales como en las trayectorias de histidina, triptofano y leucina biosintéticas . Alternativamente, algunos de los componentes descritos arriba pueden colocarse juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación usualmente comprenden un marcador seleccionable que se mantiene ya sea en un replicón o desarrollo en un vector integrante, como se describe arriba. Los vectores de expresión y transformación, ya sea replicones extra-cromosomales o vectores integrados, se desarrollan para la transformación en cualquier bacteria. Por ejemplo, los vectores de expresión se desarrollan por, inter alia, la siguiente bacteria: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:133; EP-A-0 036 776, EP-A-0 136 829 y EP-A-0 136 907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1998) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:556], Streptomyces lividans [Patente de E.U.A. 4,745,056] . Los métodos para introducir ADN exógeno en bacterias hospederas son bien conocidos en el arte, y usualmente incluyen ya sea la transformación de bacterias tratadas con CaCl2 u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. El ADN también puede introducirse en células de bacteria por electroporación. Los procedimientos de transformación usualmente varían con las especies de bacterias a ser transformadas. Ver, por ejemplo [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva et al. (1982) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter] , [Cohén et al. (1973) Proc. Nati. Acad. Sci. 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation fo Escherichia coli with ColEl-derived plasmids. In Genetic Engieering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H. W. Boyer and S. Nicosia) ; Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim.

Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus] , [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect . Immun. 32: 1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus] .

General El término "comprende" abarca "incluye" así como "consiste", por ejemplo, una composición "comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y. El término "alrededor" en la relación a medios x de valores numéricos, por ejemplo, x±10%. La palabra "substancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición la cual es "substancialmente libre" de Y puede ser completamente libre de Y. Donde sea necesaria, la palabra "substancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención. "identidad de secuencia" se determina preferiblemente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) , usando una búsqueda de espacio afín con parámetros de penalización de abertura de espacio = 12 y penalización de extensión de abertura = 1. Después del serogrupo, la clasificación meningococcal incluye serotipo, serosubtipo y luego inmunotipo, y la nomenclatura estándar enlista el serogrupo, serotipo, serosubtipo, e inmunotipo, cada uno separado por un colon, por ejemplo, B: 4 : Pl .15 :L3 , 7, 9. Dentro del serogrupo B, algunos linajes causan la enfermedad frecuentemente (hiperinvasiva) , algunos de los linajes causan más formas severas de enfermedades que otras (hipervirulenta) , y otros raramente causan la enfermedad en todos. Siete linajes hipervirulentos son reconocidos, especialmente los subgrupos I, III y IV-1, complejo ET-5, complejo ET-37, grupo A4 y linaje 3. Estos también se definen por electroforesis de enzima de multiubicación (MLEE) , pero el marcador de secuencia de multiubicación (MLST) también puede usarse para clasificar la meningococci [ref. 10] . Los cuatro grupos hipervirulentos principales son los complejos ST32, ST44, ST8 y ST11. El término "alquilo" se refiere a grupo alquilo en ambas formas recta y ramificada, el grupo alquilo puede ser interrumpido con 1, 2 ó 3 heteroátomos seleccionados de -0-, -NH- ó -S- . El grupo alquilo puede también interrumpirse con 1, 2 ó 3 enlaces dobles y/o triples. Sin embargo, el término "alquilo" usualmente se refiere a grupos alquilo que no tienen interrupciones en el heteroátomo o interrupciones en el enlace dobles o triples. Donde se hace referencia a alquilo C?_?2, significa que el grupo alquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 1 y 12 (por ejemplo, Ci, C2, C3, C , C5, C? , C7, Ce, Cg, Cío Cu, C?2) . Similarmente, donde se hace referencia a alquilo C?_6, significa que el grupo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 1 y 6 (por ejemplo, Ci, C2, C3, C4, C5, C6 ) . El término "cicloalquilo" incluye los grupos cicloalquilo, policicloalquilo, y cicloalquenilo, así como combinaciones de estos con grupos alquilo, tales como grupos cicloalquilalquilo. El grupo cicloalquilo puede también interrumpirse con 1, 2 ó 3 heteroátomos seleccionados de -0-, -NH- o -S-. Sin embargo, el término "cicloalquilo" usualmente se refiere a grupos cicloalquilo que no tienen interrupciones en el heteroátomo. Los ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen grupos ciclopentilo, ciciohexilo, ciciohexenilo, ciclohexilmetilo y adamantilo. Donde se hace referencia a cicloalquilo C3-?2, significa que el grupo cicloalquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 3 y 12 (por ejemplo, C3, C , C5, C6, C7, C8, C9, Cío, Cu, Ci2) . El término "arilo" se refiere a un grupo aromático, tal como fenilo o naftilo. Donde se hace referencia a arilo Cs-?2, significa que el grupo arilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 5 y 12 (por ejemplo, C5, Ce , C7, El término "arilo Cs-?2-alquilo Ci-V se refiere a grupos tales como bencilo, feniletilo y naftilmetilo. Los grupos protectores de nitrógeno incluyen grupos de sililo (tal como TMS, TES, TBS, TIPS) , derivados de acilo (tales como ftalimidas, trifluoroacetamidas, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, t-butoxicarbonilo (Boc) , benciloxicarbonilo (Z o Cbz) , 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) , 2-(trimetilsilil) etoxi carbonilo, 2 , 2 , 2-tricloroetoxicarbonilo (Troc)), derivados de sulfonilo (tal como D-trimetilsililetansulfonilo (SES) ) , derivados de sulfenilo, alquilo C?_?2, bencilo, bencidrilo, tritilo, 9-fenilfluorenilo, etc. Un grupo protector de nitrógeno preferido es Fmoc. En general, la invención no abarca las diversas secuencias NMB1870 específicamente descritas en las referencias 3, 5, 6 y 7, aunque estas secuencias NMB1870 pueden usarse de conformidad a la invención, por ejemplo, para la construcción de secuencias quiméricas, etc.

Breve Descripción de las Figuras Las figuras 1 hasta 6 muestran los modelos 3D de NMB 1870. La figura 7 muestra la transferencia de rizo de la superficie para NMB1870. La figura 8 muestra el mapeo del epítopo 12mer PepScan de una proteína NMB1870 de la familia I. Los 3 paneles superiores hasta inferiores son los resultados usando antisuero generado contra las familias NMB1870 I, II y III. Los resultados son en unidades de teñido arbitrario. La figura 9 muestra un western blot de los fragmentos de NMB1870, teñido usando un suero policlonal. La figura 10 muestra el análisis FACS usando antisuero formulado contra diferentes fragmentos NMB1870. La figura 11 muestra un western blot de la cepas en la familia NMB1870 I, II ó III, teñido ya sea con el anticuerpo monoclonal mAb502 (técnica blot de la izquierda) o con un suero anti-NMBl870 policlonal (técnica blot de la derecha) . La figura 12 muestra un western blot de los fragmentos de NMB1870, teñido usando mAb502. La figura 13 muestra una tinción de punto de fragmentos de NMB1870, teñidos usando mAb502. Los dominios A hasta C se probaron individualmente. Un dominio del fragmento B-C también se probó, como una mezcla de los dominios B & C. Las figuras 14 y 15 muestran el análisis FACS de la bacteria. Las tres hileras se tiñeron con diferentes anticuerpos: superior = mAb502; medio = suero policlonal; inferior = anticuerpo monoclonal contra sacárido capsular (control positivo, SEAM3). Las tres columnas en la figura 14 son todas las cepas de la familia I: MC58, M2934 y BZ83. Las tres columnas en la figura 15 no expresan la familia I NMB1870: que tiene un gen inactivo 7NMB1870 de la cepa MC58; familia II cepa 961-5945; familia III cepa M1239. La figura 16 muestra hidrofilicidad y análisis en la estructura secundaria de la secuencia NMB1870MC58 (SEQ ID NO: 1) de los residuos 120 hasta 274.

Modos para Llevar a Cabo la Invención Mapeo de epítopos Los fragmentos 12mer y lO er de NMBl870Mcs8 se usaron para el mapeo del epítopo "PepScan". Los fragmentos se inmovilizaron en una membrana celulosa y se hicieron reaccionar con antisuero formulado contra una cepa de cada una de las tres familias NMB1870: (I) MC58; (II) 2996; y (III) M1239. Los resultados del análisis 12mer se muestran en la figura 8. La región incluye aproximadamente los primeros 110 aminoácidos de NMB1870 que contienen los epítopos lineales que son comunes a las tres familias. Los residuos 120-183 incluyen los epítopos específicos de familia. No se observaron péptidos positivos además en dirección 3', sugiriendo que ya sea estas secuencias se ocultan en la estructura de la proteína 3D y podría no producir cualquier anticuerpo en el suero, o que los epítopos son discontinuos y no se observaron en el análisis "TepScan" . La siguiente alineación muestra las regiones de la secuencia NMB1870Mc58 (SEQ ID NO: 1) la cual se hace reaccionar con cada antisuero: (1) Anti-MC58 M RTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGIi (2 ) Anti-2996 MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGIADALTAPLDHKDKGL (3) Anti-M1239 MRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGIADALTAPLDHKDKGL (1) Anti-MC58 QSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQ (2) Anti-2996 QSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGK KNDKVSRFDFIRQ (3) Anti-Ml239 QSLTLDQSVRKNEKLKLADQGAEKTYGNGDSLNTGKLK DKVSRFDFIRQ (1) Anti-MC58 IEVPGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEOIQDSEHSGKMVAKRQFRI (2) Anti-2996 IEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI (3) Anti-M1239 IEVPGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI (1) Anti-MC58 GDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFADKQGNGKI (2) Anti-2996 GDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKI (3) Anti-M1239 GDIAGEHTSFDKLPEGGRDTYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKI (1) Anti-MC58 EHLKSPEL VDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKA (2) Anti-2996 EHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKA (3) Anti-M1239 EHLKSPEL VDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKA (1) Anti-MC58 QEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ (2) Anti-2996 QEVAGSAEVKTV GIRHIGLAAKQ (3) Anti-Ml239 QEVAGSAEVKTV GIRHIGLAAKQ Los epítopos comunes para todas las tres familias son así DKGLQSLTLDQSVR (SEQ ID NO: 21) y FDFIRQIEVDGQLI (SEQ ID NO: 22) . Basándose en los resultados del mapeo del epítopo, la secuencia NMB1870 se divide en los tres dominios nocionales: (A) Aminoácidos 1-119 (SEQ ID NO: 4) MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRK NEKL KLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYK (B) Aminoácidos 120-184 (SEQ ID NO: 5) QSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDD AGG (C) Aminoácidos 185-274 (SEQ ID NO: 6) KLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLG IFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ Estos dominios se expresaron individualmente como proteínas que comprenden los dominios A, B o C (SEQ ID NOS: 4 hasta 6) , y juntos como proteínas que comprenden A-B (SEQ ID NO: 23) o B-C (SEQ ID NO: 24). Los siguientes cebadores de oligonucleótidos se usaron durante la construcción de estas proteínas, e introdujeron en los sitios de restricción Ndel & Xhol: Un western blot de los dominios A (truncado para iniciar con VAA... ) , B y C, usando anti-NMBl870Mc58 policlonal como la etiqueta, se muestran en la figura 9. Las fusiones AB y Be también se incluyen. La línea final del blot contiene la proteína de longitud completa. El antisuero contra cada uno de los dominios A, B y C es capaz de enlazarse a las células completas en el análisis FACS (Figura 10) . El cambio de fluorescencia fue más fuerte con los dominios A y C, sugirieron que estos pueden ser más inmunoaccesibles. Ninguno de los antisueros prodía reconocer una cepa que tiene un gen inactivo 7NMB1870. Los sueros se formularon en ratones contra las proteínas (y contra proteína de control) usando ya sea CFA o un hidróxido de aluminio (AH) como adyuvante, y los resultados SBA contra las tres diferentes cepas meningococcal fueron como siguen: Dentro de la SEQ ID NO: 1 (MC58), por lo tanto, los epítopos bactericidas más importantes requieren la presencia de ambos dominios B y C (dominio BC) . Estos sugiere que la proteína puede incluir epítopos discontinuos hechos de las secuencias de ambos de estos dos dominios [cf . ref. 237] . Sin embargo, los anticuerpos monoclonales Jarl, Jar3 , y Jar4, los cuales son capaces de proteger pasivamente las ratas contra la infección meningococcal, reconocer el dominio BC pero no reconocer el dominio B o C solo. Similarmente, el Jar5 reconoce el dominio AB, pero no el dominio A o B solo. Los detalles adicionales de esta preparación pueden encontrarse en la referencia 238.

Proteína quimérica-BMi239-Cuc58 Para investigar la alta actividad bactericida inducida por el dominio BC, un dominio BC híbrido fue construido a partir de un dominio B de la familia III (cepa M1239) y un dominio C de la familia I (cepa MC58) . Los dominios B de las familias I y III muestran 43.8% de identidad. La SEQ ID NO:l es la secuencia NMB1870 de la familia I de longitud completa del serogrupo B de la cepa MC58. esta secuencia se divide en tres dominios: (A) aa 1-119; (B) aa 120-183; (C) aa 184-274. La SEQ ID NO: 3 es la secuencia NMB1870 de la familia III de longitud completa del serogrupo B de la cepa M1239. Esta secuencia también se divide en tres dominios: (A) aa 1-127; (B) aa 128-190; (C) aa 191-286. Los fragmentos de ADN codificados por el dominio B de M1239 y el dominio C de MC58 se amplificaron por PCR usando como plantilla el ADN cromosomal de las cepas específicas y los siguientes cebadores: Los fragmentos amplificados se clonaron secuencialmente en pET 21b+ como fragmentos Ndel/HindIII y HindIII/Xhol. La secuencia BM?23gCMc58 final fue la SEQ ID NO: 43, con la secuencia KL al inicio del dominio CMc58 contribuido por un sitio de restricción HindIII. La proteína se expresó como una proteína de fusión His-tag de terminal C, se purificó y se usó para inmunizar a los ratones, con ya sea AH de FCA como adyuvante. Los sueros se analizaron por la actividad bactericida contra las cepas representativas de las tres familias del NMB1870. las concentraciones fueron como siguen: Las concentraciones inducidas por la quimera B(1239)-C(MC58) fueron bajas contra el MC58 que se induce por un control B (MC58) -C (MC58) , y fueron negativas contra la cepa M1239. Estos resultados demuestran que en las quimeras B-C, la secuencia del dominio B es importante para inducir los anticuerpos bactericidas y que los dominios B y C deberían idealmente no ser separados . Un anticuerpo IgG2a monoclonal (mAb502) que reconoce un epítopo presente solamente en las proteínas de la familia I (Figura 11) no reconoce cualquiera de los dominios individuales A, B y C en western blot (Figura 12), pero si reconoce un fragmento del dominio B-C. Estos resultados también se observan en una tinción de punto de los dominios individuales A, B y C, o un fragmento del dominio B-C (Figura 13). Además, sin embargo, el anticuerpo reconoce una mezcla de los dominios separados B y C, sugiriendo que el epítopo reconocido por el anticuerpo puede reconstituirse in vitro y se forma por residuos de aminoácidos en ambos dominios. El anticuerpo monoclonal no reconoce cualquiera de los fragmentos PepScan. La yuxtaposición de los dominios B y C puede así formar un epítopo conformacional .

Proteína q ímerica-BC2996_BCMi239 La SEQ ID NO: 2 es la secuencia NMB1870 de la familia II de longitud completa del serogrupo B de la cepa 2996. esta secuencia se divide en tres dominios: (A) aa 1-119; (B) aa 120-182; (C) aa 183-273. Los dominios B y C de la cepa 2996 se unieron a los dominios B y C de la cepa M1239, por medio de un ligador rico en glicina (SEQ ID NO: 17; GS de un sitio de restricción BamHI; SEQ ID NO: 18 como un ligador de poli-glicina) para hacer una quimera BCnBCm (SEQ ID NO: 44) . Los dominios del ADN codificado fueron amplificados por PCR usando como plantilla ADN cromosomal de las cepas específicas, usando los siguientes cebadores: La secuencia se clonaron secuencialmente en pET 21b+ como en los fragmentos Ndel/BamHI y Bam Hl/Xhol. La proteína se expresó como la proteína de fusión His-tag de terminal C, se purificó y se usó para inmunizar ratones. Brevemente, los grupos de 10 ratones CDl hembras se inmunizaron intraperitonealmente con 20µg de la proteína usando un aluminio o adyuvante de Freund. La proteína se administró ya sea sola, o en combinación con la combinación de las "tres proteínas" descritas en la página 33 de la ref. 239. Tres inmunizaciones se administraron, y los sueros se tomaron dos semanas después de la tercera y se analizaron por actividad bactericida contra las cepas representativas de las tres familias NMB1870. Las concentraciones contra las tres cepas ejemplares para cada familia NMB1870 fueron como siguen: Así los dominios BC de la fusión de las familias II y III dan buena actividad anti-II y anti-III pero como se esperaba, no ofrece actividad anti-I significante. Los dominios BC fusionados dan concentraciones SBA inferiores diferentes a la fusión de las secuencias (?G) NMB1870 de longitud completa.

Proteína quimérica-BCMC58-BCMi239-BC2996 Usando un enfoque similar, una quimera de los dominios BC para todas las tres familias NMB1870 se construyó. Los siguientes cebadores se usaron para amplificar los dominios: La secuencia final fue SEQ ID NO: 52, con la secuencia de la familia I que se une a la secuencia de la familia III por la SEQ ID NO: 17 (un sitio de restricción Ba HI, luego el ligador poli-Gly) , y la secuencia de la familia III que se une a la secuencia de la familia II por la SEQ ID NO: 45 (un sitio de restricción HindIII, luego el ligador poli-Gly) . Una quimera adicional se produjo, con los dominios BC en el orden I-II-III en vez del I-III-II. Esta quimera se trató en ensayos bactericidas, a lo largo con una quimera de los dominios BC de una cepa de la familia II fusionada a una cepa de la familia III, y el control positivo SEAM-3. los resultados fueron como siguen: En todos los casos excepto uno (NGH38) , por lo tanto, la triple quimera da mejores resultados que la doble quimera. Este se encontró que no sorprende a las cepas de la familia I, como la doble quimera no incluye una secuencia NMB1870 para esta familia. Aun para las familias II y III, sin embargo, los resultados mejoraron. Significativamente, el número de las cepas de la familia II donde las concentraciones fueron >128 fue 9/13 con la triple quimera, contra solamente 6/13 para la doble quimera.

Anticuerpo monoclonal 502 Para seleccionar los anticuerpos monoclonales anti-NMB1870 con la actividad bactericida, los ratones CDl se inmunizaron con la familia I NMB1870Mc5ß- El suero policlonal de los ratones individuales se evaluó por el anticuerpo enlazado por ELISA en la proteína purificada y en las células MC58 completas, y para complementar la actividad bactericida mediada con MC58. En las bases de estos resultados el bazo de un ratón de alta respuesta se selecciona para la fusión con células de mieloma. Varias líneas de células de hibridoma producidas por anticuerpos se aislan y se seleccionan por ELISA positiva contra la proteína purificada o contra las células bacteriales completas MC58. MAb502, un anticuerpo monoclonal de isotipo IgG2a bactericida contra la cepa MC58, se selecciona por estudios adicionales. El anticuerpo reconoce la proteína purificada por ELISA y fue positiva en análisis FACS en la cepa MC58. El análisis Western blot contra NMB1870 para cada una de las tres variantes confirma que mAb502 reconoce un epítopo presente solamente en las secuencias de la familia I. En contraste, el suero policlonal reconoce todas las tres variantes. El mAb502 monoclonal se usó en el análisis FACS contra un número de cepas de la familia I . En cada caso el anticuerpo reconoce los antígenos de superficie celular (Figura 14, hilera superior). El cambio de la fluorescencia no fue grande como cuando se usó el anti-NMBl870 policlonal (hilea de la mitad) o se usó una anti-cápsula SEAM3 monoclonal (hilera inferior) , pero el enlace fue especifico. En contraste, mAb502 no reconoce una cepa que tiene un gen inactivo 7NMB1870 (Figura 15, columna de lado izquierdo) y no reconoce las cepas de la familia II o familia III (mitad y columnas de lado derecho) . El control positivo de la anti-cápsula reconoce todas las cepas no reconocidas (Figura 15, hilera inferior) .

Proteína quimérica-NMB1870Mc58-NMBl870M?239-NMB18702996 Como un enfoque alternativo para proporcionar un polipéptido sencillo que contiene todas las tres familias NMB1870, proteínas de longitud completa (excepto para truncamiento en la terminación N ligera, hasta e incluyendo las secuencias poli-Gly nativas, esto es, proteínas ?G) se fusionaron para hacer una secuencia triple quimérica SEQ ID NO: 53. La secuencia de la familia I se unió a la secuencia de la familia III por la SEQ ID NO: 19 (un sitio de restricción BamHI, luego un ligador gonococal, SEQ ID NO: 20), y la secuencia de la familia III se unió a la secuencia de la familia II por la SEQ ID NO: 54 (un sitio de restricción HindIII, luego el ligador gonococal). La proteína fue expresada como una fusión His-tag en la terminal C después de la amplificación usando los siguientes cebadores: La proteína puede purificarse como un producto soluble después del crecimiento a 30°C. La proteína (3-C) de triple quimera purificada se administró a los ratones y el suero resultante se probo en el ensayo bactericida, usando ya sea un hidróxido de aluminio (AH) o un adyuvante Freund completo. El suero presentado contra la proteína NMB1870 homologa (adyuvante con AH) también se probó: En casi todos los casos, la proteína triple quimérica da un mejor suero bactericida que las proteínas homologas individuales. La triple quimera así ofrece dos ventajas: (1) cubrir todas las familias NMB1870 en una proteína sencilla; y (2) elevar la respuesta bactericida relativa a una proteína NMB1870 homologa sencilla.

Comparación de inmunogenicidad de los dominios Los dominios A, B y C de la secuencia MC58 7G-NMB1870 (familia I) se prepararon individualmente y como fusiones AB y BC, todos con His-tags de terminal C. Estos se usaron para inmunizar ratones y los sueros se probaron para la actividad bactericida contra una cepa de cada familia NMB1870. Para la comparación, el suero se tino en respuesta a las tres familias 7G-NMB1870, la secuencias también se probaron. Las proteínas fueron adyuvantes ya sea con hidróxido de alumino o con FCA. Los resultados fueron como siguen: Así los dominios individuales no son inmunógenos particularmente efectivos, el dominio AB también no es particularmente efectivo, pero el dominio BC mostró buena actividad.

Modelo 3D del dominio BC Una predicción de la estructura super-secundaria para el dominio BC se obtiene por someter la secuencia MC58 a el servidor HMMSTR/Rosetta [240] . La salida se muestra en la figura 1. La estructura 3D se sometió a una búsqueda VAST [241] para encontrar similaridad para resolver las estructuras de la proteína y para purificar los rizos. La salida VAST (Figura 2) fue: NMB1870 RHAVISGSVLYNQa-EKGSYSIg iFGGKa QEVA 1K32_A 311 IAFVSRGQAFIQDvsgTYVLKVpeplrirYVRRggdt vAFIH 353 Usando la salida VAST, el fragmento 229-259 (arriba a la derecha de la Figura 2) se modelo además y se modificó por introducir giros en la columna a lo largo de la línea punteada de la figura 2. El modelo resultante se purificó por minimización de energía, para dar el modelo final de la Figura 3. Este modelo se mostró con altos rizos en la superficie de la Figura 6.

Mapeo del epítopo de la superficie Una alineación de la secuencia múltiple de los dominios BC de las secuencias NMB1870 de las cepas reconocidas en western blots mAb502 revela información de varias secuencias. Todas las cepas que se enlazaron por el anticuerpo incluyen el residuo Arg223, pero este residuo es His en las cepas que no se reconocieron en los blots. Aun así, no en todas las secuencias Arg223 se produjo suero bactericida y así el epítopo bactericida total debe ser mayor que este residuo sencillo. La alineación identificó otros residuos que podrían involucrarse en la formación de un epítopo bactericida especfico: Phel28 (F) , Ilel33 (I), Asnl97 (N) , Gly2217 (G) , Lys249 (K) , Lys260 (K) y Val262 (V). Todos estos aminoácidos (respaldos grises a continuación) se conservaron perfectamente entre cepas ET-5 (tal como MC58) , los cuales son BCA-positivos, pero diferentes en las cepas BCA-negativas: La preparación similar se basó en secuencias alineadas de cepas que se hacen reaccionar con un suero policlonal bactericida identificando los siguientes residuos: Phel28, Ilel33, Asnl97 y Gly221. Los residuos Lys249, Lys260 y Val262, los cuales se identificaron por el anticuerpo monoclonal, se descartaron en esta etapa, como estos tres residuos se conservaron se conservaron en la secuencia NMB1870 de una cepa BCA-negativa (M2197) . A partir del modelo 3D de NMB1870, Phel34 y Ilel39 están dentro de un alfa-hélice predicho, y por lo tanto no son accesibles para los anticuerpos. Por otro lado, tanto Asnl97 y Gly221 están dentro de los rizos de la superficie y están expuestos. Tanto Gly221 y Asnl97 están especialmente cercanos a Arg223, y de esta manera podrían ser parte del mismo epítopo. Observadado en Gly221, las cepas BCA-negativas frecuentemente tienen aminoácido pequeños y neutrales substituidos con Glu o Lys, ambos de los cuales se agrandan y se cargan. Esta substitución podría debilitarse por propiedades de recognición y enlace del anticuerpo a este epítopo. Esta análisis así revela cinco aminoácidos claves: Phel28, Ilel33, Asnl97, Gly221 y Arg223. Cuando estos residuos se mapean en el modelo 3D (Figura 4) , tres de ellos se agrupan en la superficie (Figura 5) . La alineación con una predicción de estructura secundaria (Figura 16) también mostró que Ilel33, Asnl97, Gly221 y Arg223 se localizaron en regiones hidrofílicas (esto es, en los rizos de la superficie) . Otro residuo importante podría ser el dipéptido AD en la posición 215-216, el cual es substituido en más cepas BCA-negativas por AY, y por SD en algunas respuestas semanalmente . Los aminoácidos 197, 221 y 223 se mutaron como sigue: La mutagénesis usó el sistema GeneTailor™ SDM del Invitrogen. Los cebadores internos que contienen cambios de codon se designaron de conformidad a las especificaciones manuales de instrucción, y fueron como siguen: Para generar cada mutante, 100 ng del ADN plásmido pET-? G741(i)-His se usaron como plantilla en una reacción de metilación, luego 12.5ng del plásmido metilado se emplearon como substrato en una reacción de mutagénesis, usando los siguientes pares de cebadores : 74KD-N197H delantero/741 (D-N197H inverso 741(1)-G221K delantero/741 (1) -G221K inverso 741(1)-R223H delantero/741 (1) -R223H inverso El PCR se llevó a cabo de conformidad al manual de introducción del sistema de mutagénesis dirigido al sitio GeneTailor™. Después de la reacción, 10 µl del producto se analizaron en 1% del gel de agarosa, luego 2 µl de la mezcla de reacción de mutagénesis se transformaron en la cepa DH5a™-T1R E.coli de conformidad a las especificaciones del manual. Las colonias positivas se analizaron por aislar el plásmido (QIAprep Spin Miniprep Kit, QIAGEN™) y se analizaron por secuencia. Para generar el mutante doble ?G741 (1) -His-N197H-G221K, el ADN del mutante positivo ?G741 (1) -His-G221K se usó como substrato para el siguiente con el correspondiente par de cebadores 741a)-Nl97H delantero/741 (1) -N197H inverso. Para la expresión de la proteína recombinante como la fusión His-tag de terminal C, 1.5µl de cada constructo se usó para transformar la cepa E.coli BL21-DE3. Las colonias recombinantes sencillas se inocularon en 4ml LB+Amp (lOOµg/ml) , se incubaron a 37°C durante la noche, luego se diluyeron 1:30 en 20ml de LB+Amp (lOOµg/ml) en matraces de 125 ml, para dar un OD6oonm entre 0.1 y 0.2. Los matraces se incubaron a 37 °C en un agitador de baño de agua giratorio hasta que el OD6oonm indicó crecimiento exponencial adecuado para la inducción de la expresión (0.4-0.8 OD) . La expresen de la proteína se induce por la adición de 1. OmM IPTG. Después de 3 horas de incubación a 37°C el ODdoonm se midió y se examinó la expresión. 1. Oml de cada muestra se centrífugo en un microfugo, el peletizado se resuspendió en PBS y se analizó por SDS-PAGE y se tino con azul de Coomassie. Todos los mutantes se expresaron así como tipo silvestre y se purificaron como formas solubles a 37°C.

Substitución de rizo Basándose en el modelo 3D y en la preparación del mapeo del epítopo, los rizos de la superficie de la familia II y familia III del NMB1870 se tranfirieron en una estructura de la familia I.

Para el rizo 1, la secuencia del aminoácido está 100% conservada entre todas las cepas de la familia II y familia III. En todas las tres familias, el rizo 1 se flanquea por dos hélices alfa (no conservado en la secuencia) que similarmente contribuyen a la exposición plegado/correcto del rizo. El residuo Glyl40 no se encontró en la secuencia M6190 de la familia I, y mientras que los monoclonales Jar3 y Jar5 se enlazaron a las secuencias de la familia I estas fallaron en el enlace a M6190, además confirmaron la importancia del epítopo de este rizo. La secuencia de la familia II se elegió para inserción en la estructura de la familia I. El rizo 2 corresponde a un epítopo bactericida. La diferencia solamente entre las familias II y III esta en la posición es una substitución Asp/Gly. El análisis de respuestas de bactericidas entre las cepas de la familia II sugiere un papel crítico para el residuo Asp, de esta manera la secuencia de la familia II se elige. El rizo 3 es altamente variable dentro de las familias II y III, pero se conserva en la familia I. En la familia II, la mayoría de las cepas tiene la secuencia PNG, pero en la familia III la mayoría tiene AGG. Aunque este rizo parece ser dispensable para la protección (las cepas PNG son capaces de protegerse contra las cepas AGG de la familia III) , para cubrir ambas posibilidades de que la secuencia AG de la familia I se substituya con PN.

El Asnl97 en el rizo 4 se identifica previamente como un residuo importante para distinguir entre las cepas BCA-positivas y BCA-negativas de la familia I, y siempre se conserva en las cepas ET-5. Este residuo es substituido por His en todas las cepas de la familia II y en un subgrupo de las cepas de la familia III. Además, His también se presenta en algunas cepas de la familia I. His se usó así en este rizo, para cubrir las familias II y III, más cualquier secuencia de la familia I no cubierta por la secuencia MC58. Los rizos 5, 6 y 7 son iguales en las familias II y III, pero diferentes de la familia I. Para estos tres rizos las secuencias de la familia 11/III se usaron. El segundo residuo en el rizo es Gly preferentemente Val debido a las cepas de la familia II que son susceptibles al suero presentado contra la proteína de la cepa 2996 que tiene este residuo en esta posición. Las substituciones se mostraron en la Figura 7, para cambiar la SEQ ID NO: 1 en la SEQ ID NO: 61. Los rizos 1, 2 y 4 recibieron las secuencias de la familia II; el rizo 3 recibió la secuencia de la familia III; y los rizos 5, 6 y 7 recibieron una secuencia común para ambas familias II y III. Con 28 substituciones de los aminoácidos 274 (SEQ ID NO: 1) y 273 (SEQ ID NO: 61) en total, la identidad general después del intercambio de superficie de rizo se mantiene en >90%.

Los rizos se substituyeron en series. Siete proteínas se hicieron en estas series, cada uno de los rizos de la secuencia ?GNMB1870Mc58 se substituyó en orden. Las siete proteínas substituidas se refieren a LPi, LP2,..., LP7. El mutante LP7 es la SEQ ID NO: 61. El sistema GeneTailor™ SDM se usó para esta preparación (ver arriba), con los siguientes cebadores: Todas las proteínas se expresaron así como la proteínas de tipo silvestre y pueden purificarse como productos solubles después del crecimiento a 37°C. Las proteínas LPi, LP2,..., LP se usaron para inmunizar ratones, y el suero resultante se probó contra diversas cepas diferentes del meningococo del serogrupo B, incluyendo al menos tres de cada familia NMB1870. La proteína de partida (LPO) también se probó. Las proteínas se hicieron adyuvantes ya sea con un adyuvante de hidróxido de aluminio (AH) o con FCA (F) . En la siguiente tabla, cada hilera (excepto para la hilera inferior) muestra el SBA para un suero sencillo, se probó contra nueva cepas ejemplares. La hilera inferior mostró la actividad de un suero obtenido usando el antígeno de tipo silvestre del NMB1870 homólogo (esto es, se probó el suero anti-NMB1870Mc58 contra MC58, etc.): * = El suero fue bacteriostático. El progreso del LPO (sin substituciones; NMB 1870; familia I) al LP7 a través de LPl, LP2, etc., los sueros se formularon contra la proteína hasta llegar a hacer más actividad contra las cepas cuyo NMB1870 está en la familia II o familia III. Como las secuencias de la familia I se substituyen con las secuencias de la familia II/III, lo contrario a la expectaciones a priori, las respuestas bactericidas contra las cepas de la familia I muestra una tendencia ascendente. Así la SEQ ID NO: 61 contiene epítopos de la superficie de las familias II y III, para reemplazar los epítopos de la familia I. El polipéptido quimérico puede usarse para presentar anticuerpo contra NMB1870 de las familias II y III, y puede combinarse con una secuencia de la familia I normal para dar antigenicidad multi-familiar . La combinación puede ser como una mezcla de dos polipéptidos separados, o puede ser en la forma de un híbrido [7] por ejemplo, NH2-X?-SEQ: 61-X2-SEQ:l-X3-COOH, NH2-X?-SEQ : 1-X2-SEQ: 61-X3-COOH, etc.

Secuencias NMB1870 nuevas La información detallada de la secuencia para NMB1870 está disponible [por ejemplo, se refiere a 3, 5, 6 y 7] . Además se han encontrado nuevas secuencias NMB1870. La secuencia para la cepa 4243 se da como en la SEQ ID NO: 62, partiendo en la cisteina de terminal N de la proteína madura. El péptido lider desdoblado es el mismo como una secuencia de la familia I normal.

Una cuarta familia de NMB1870 se observó en la cepa M.01.0240320 Cgb320'; SEQ ID NO : 63) y en la cepa S10026 (SEQ ID NO: 64). La secuencia de m3813 (SEQ ID NO: 21 de ref. 7; SEQ ID NO: 65 en la presente) también puede clasificarse en la familia IV. Se deberá entender que la invención se describe arriba a modo de ejemplo solamente y pueden hacerse modificaciones manteniéndose dentro del alcance y espíritu de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIA REFERENCIAS (los contenidos de las cuales se incorporan para ello en su totalidad para referencia) [1] Jodar et al. (2002) Lancet 359(9316): 1499-1508. [2] WO99/57280. [3] Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-799. [4] Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820. [5] WO03/063766. [6] Fletcher et al. (2004) Infect Immun 72:2088-2100. [7] WO2004/048404. [8] Achtman (1995) Global epidemiology of meningococcal disease. Páginas 159-175 of Meningococcal disease (ed. Cartwight) . ISBN: 0-471-95259-1. [9] Caugant (1998) APMIS 106:505-525. [10] Maiden et al (1998) Proc. Nati Acad. ScL USA 95:3140-3145. [11] Needleman & Wunsch (1970) J. Mol Biol 48, 443-453. [12] Rice et al. (2000) Trends Genet 16:276-277. [13] WO01/30390. [14] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472. [15] WO03/009869. [16] Vaccine Design... (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum. [17] WO00/23105. [18] WO90/14837. [19] Patente de E.U.A. 5,057,540. [20] W096/33739. [21] EP-A-0109942. [22] W096/11711. [23] WO00/07621. [24] Barr et al. (1998) A dvanced Drug Delivery Reviews 32:247-271. [25] Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338.

[26] Niikura et al. (2002) Virology 293:273-280. [27] Lenz et al. (2001) J Immunol 166:5346-5355. [28] Pinto et al. (2003) J Infect Dis 188:327-338. [29] Gerber et al. (2001) Virol 75:4752-4760. [30] WO03/024480 [31] WO03/024481 [32] Gluc et al. (2002) Vaccine 20:B10-B16. [33] EP-A-0689454. [34] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278. [35] Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229. [36] Meraldi et al. (2003) Vaccine 21:2485-2491. [37] Pajak et al. (2003) Vaccine 21:836-842. [38] Kandimalla et al. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400. [39] WO02/26757. [40] W099/62923. [41] Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835. [42] McCluskie et al. (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185. [43] WO98/40100. [44] Patente de E.U.A. 6,207,646. [45] Patente de E.U.A. 6,239,116. [46] Patente de E.U.A. 6,429,199. [47] Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3) : 654-658 [48 Blackwell et al. (2003) J Immunol 170:4061-4068. [49 Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65. [50 WO01/95935. [51 Kandimalla et al. (2003) BBRC 306:948-953. [52 Bhagat et al. (2003) BBRC 300:853-861. [53 WO03/035836. [54 W095/17211. [55 W098/42375. [56 Beignon et al. (2002) Infect Immun 70:3012-3019. [57 Pizza et al. (2001) Vaccine 19:2534-2541. [58 Pizza et al. (2000) Int J Med Microbiol 290:455- 461, [59 Scharton-Kersten et al, (2000) Infect Immun 68:5306-5313 [60 Ryan et al. (1999) Infect Immun 67:6270-6280. [61 Partidos et al. (1999) Immunol Lett 67:209-216. [62 Peppoloni et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:285- 293. [63 Pine et al (2002) J Control Reléase 85:263-270. [64 Domenighini et al. (1995) Mol Microbiol 15:1165- 1167 [65 WO99/40936. [66 W099/44636. [67 Singh et al] (2001) J Cont Reléase 70:267-276. . [69] Patente de E.U.A. 6,090,406 [70] Patente de E.U.A. 5,916,588 [71] EP-A-0626169. [72] W099/52549. [73] WO01/21207. [74] WO01/21152. [75] Andrianov et al. (1998) Biomaterials 19:109-115. [76] Payne et al. (1998) Adv Drug Delivery Review 31:185-196. [77] Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571-577. [78] Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218. [79] W099/11241. [80] WO94/00153. [81] W098/57659. [82] solicitudes Europeas de patente 0835318, 0735898 and 0761231. [83] W099/24578. [84] W099/36544. [85] Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698. [86] Costantino et al. (1999) Vaccine 17:1251-1263. [87] WO03/007985. [88] Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332. [89] Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v. [90] Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.

[91] Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188. [92] Iwarson (1995) APMIS 103:321-326. [93] Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Suppl :S63-68 & 79-80. [94] Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0. [95] Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70. [96] Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349-355. [97] Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238. [98] Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308. [99] Zimmerman & Spann (1999) Am Fatn Physician 59:113-118, 125-126. [100] McMichael (2000) Vaccine 19 Suppl 1:S101-107. [101] Schuchat (1999) Lancet 353 (9146) : 51-6. [102] WO02/34771. [103] Dale (1999) Infect Dis Clin North Am 13:227-43, viii. [104] Ferretti et al. (2001) PNAS USA 98: 4658-4663. [105] Kuroda et al. (2001) Lancet 357(9264): 1225-1240; ver también páginas 1218-1219. [106] EP-A-0372501 [107] EP-A-0378881

[108] EP-A-0427347 [109] W093/17712 [110] WO94/03208 [111] W098/58668 [112] EP-A-0471177 [113] WO00/56360 [114] WO91/01146 [115] WO00/61761 [116] WO01/72337 [117] Research Disclosure, 453077 (Jan 2002) [118] Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49. [119] Ravenscroft et al. (1999) Vaccine 17:2802-2816. [120] WO03/080678. [121] Nilsson & Svensson (1979) Carbohydrate Research 69: 292-296) [122] Frash (1990) p.123-145 of Advances in Biotechnological Processes vol. 13 (eds. Mizrahi & Van Wezel)

[123] Inzana (1987) Infect. Im un. 55:1573-1579. [124] Kandil et al. (1997) Glycoconj J 14:13-17. [125] Berkin et al. (2002) Chemistry 8:4424-4433. [126] Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28-36. [127] Buttery & Moxon (2000) J R Coll Physicians Lond 34:163-168. [128] Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-33, vii.

[129] Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567. [130] Patente europea 0477508. [131] Patente de E.U.A. 5,306,492. [132] W098/42721. [133] Dick et al. in Conjúgate Vaccines (eds. Cruse et al.) Karger, Basel, 1989, 10:48-114. [134] Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) ISBN: 0123423368. [135] Kanra et al. (1999) The Turkish Journal of Paediatrics 42:421-427. [136] Ravenscroft et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103: 35-47. [137] WO97/00697. [138] WO02/00249. [139] Zielen et al. (2000) Infect. Immun. 68:1435-1440. [140] Darkes & Plosker (2002) Paediatr Drugs 4:609-630. [141] Tettelin et al. (2001) Science 293:498-506. [142] Hoskins et al (2001) J Bacteriol 183:5709-5717. [143] Rappuoli (2000) Curr Opin Microbiol 3:445-450 [144] Rappuoli (2001) Vaccine 19:2688-2691. [145] Masignani et al. (2002) Expert Opin Biol Ther 2:895-905. [146] Mora et al. (2003) Drug Discov Today 8:459-464. [147] Wizemann et al (2001) Infect Immun 69:1593-1598. [148] Rigden et el. (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 8:143-168 [149 WO02/22167. [150 Ramsay et al. (2001) Lancet 357 (9251) : 195-196. [151 Anderson (1983) Infect Immun 39 (1) :233-238. [152 Anderson et al. (1985) J Clin Invest 76(l):52-59. [153 Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824. [154 EP-A-0594610. [155 WO02/091998. [156 WO99/42130 [157 WO96/40242 [158 Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198. [159 WO95/08348. [160 Patente de E.U.A. 4,882,317 [161 Patente de E.U.A. 4,695,624 [162 Porro et al. (1985) Mol Immunol 22: 907-919. s [163 EP-A-0208375 [164 WO00/10599 [165 Gever et al. Med. Microbiol. Immunol, 165:171-288 (1979) . [166 Patente de E.U.A. 4,057,685. [167 Patentes de E.U.A. 4,673,574; 4,761,283; ,808,700 [168 Patente de E.U.A. 4,459,286. [169 Patente de E.U.A. 4,965,338 [170 Patente de E.U.A. 4,663,160.

[171] Patente de E.U.A. 4,761,283 [172] Patente de E.U.A. 4,356,170 [172] Lei et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103:259-264.

[174] WOOO/38711; Patente de E.U.A. 6,146,902. [175] WO02/09643. [176] Katial et al. (2002) Infect Immun 70:702-707. [177] WO01/52885. [178] Patente europea 0301992. [179] Bjune et al. (1991) Lancet 338 (8775) : 1093-1096. [180] Fukasawa et al. (1999) Vaccine 17:2951-2958. [181] WO02/09746. [182] Rosenqvist et al. (1998) Dev. Biol. Stand. 92:323-333

[183] WO01/09350. [184] Patente europea 0449958. [185] EP-A-0996712. [186] EP-A-0680512. [187] WO02/062378. [188] W099/59625. [189] Patente de E.U.A. 6,180,111. [190] WO01/34642. [191] WO03/051379. [192] Patente de E.U.A. 6,558,677. [193] WO2004/019977. [194] WO02/062380. [195] WO00/25811.

[196] Peeters et al. (1996) Vaccine 14:1008-1015. [197] Vermont et al. (2003) Infect Immun 71:1650-1655. [198] Kabat et al, 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA [199 Breedveld (2000) Lancet 355 (9205) : 735-740. [200 Gorman & Clark (1990) Semin. Immunol. 2:457-466 [201 Jones et al. (1986) Nature 321:522-525 [202 Morrison et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci, USA., 81:6851-6855 [203] Morrison & Oi, (1988) Adv. Immunol, 44:65-92. [204] Verhoeyer et al. (1988) Science 239:1534-36. [205] Padlan (1991) Molec. Immun. 28:489-98. [206] Padlan (1994) Molec. I munol . 31:169-217. [207] Kettleborough et al. (1991) Protein Eng. 4:773-83. [208] W098/24893 [209] WO91/10741 [210] WO96/30498 [211] WO94/02602 [212] Patente de E.U.A. 5,939,598. [213] Conrath et al. (2003) Dev Comp Immunol 27:87-103. [214] Muyldermans (2001) J Biotechnol 74:277-302. [215] Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:5879-5883. [216] Patente de E.U.A. 5,091,513

[217] Patente de E.U.A. 5,132,405 [218] Patente de E.U.A. 4,946,778 [219] Pack et al, (1992) Biochem 31:1579-1584 [220] Cumber et al (1992) J. Immunology 149B: 120-126 [221] Radrizzani M et al., (1999) Medicina (B Aires) 59(6) :753-8. [222] Radrizzani M et al. (2000) Medicina (B Aires) 60 Suppl 2:55-60. [223] Patente de E.U.A. 4,011,308 [224] Patente de E.U.A. 4,722,890 [225] Patente de E.U.A. 4,016,043 [226] Patente de E.U.A. 3,876,504 [227] Patente de E.U.A. 3,770,380 [228] Patente de E.U.A. 4,372,745 [229] Kohier & Milstein (1975) Nature 256:495-497 [230] Inbar et al (1972) Proc. Nat. Acad. Sci USA 69:2659-2662 [231] Hochman et al (1976) Biochem 15:2706-2710 [232] Ehrlich et al (1980) Biochem 19:4091-4096 [233] Siegel, Transfus. Clin. Biol. (2002) 9(1): 15-22; [234] Sidhu, Curr. Opm. Biotechnol (2000) 11 (6) : 610-616; [235] Sharon, et al, Comb. Chem. High Throughput Screen (2000) 3(3) : 185-196; [236] Schmitz et al, Placenta, (2000) 21 SupplA: S 106-12

[237] Bartoloni et al. (1988) Bio/technology 6:709-712. [238] Giuliani et al (2005) Infect Immun 73:1151-60. [239] WO2004/032958. [240] http: //www.bioinfo. rpi . edu/~bystrc/hmmstr/server .php [241] http: //www.ncbi .nlm.nih. gov/Structure/VAST/vast . shtml Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una proteína NMB1870 quimérica caracterizada porque comprende porciones de NMB1870 a partir de las diferentes familias NMB1870. 2. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: (a) una secuencia del dominio 'B' de una primera familia NMB1870; y (b) una secuencia del dominio %C de una segunda familia
NMB1870, en donde la primera y segunda familia son diferentes una de la otra y se seleccionan de la familia I, familia II o familia III de NMB1870, y en donde (i) el polipéptido quimérico no contiene una secuencia del dominio 'C de la primera familia NMB1870 y/o (ii) el polipéptido quimérico no contiene una secuencia del dominio 'B' de la segunda familia NMB1870, y en donde (1) el dominio ' B' es el fragmento del NMB1870 el cual, cuando se alinea a la SEQ ID NO: 1 usa un algoritmo de alineación en pares, iniciando con el aminoácido alineado a Gln-120 de la SEQ ID NO: 1 y terminando con el aminoácido alineado a Gly-183 de la SEQ ID NO: 1; y (2) el dominio "C" es el fragmento del NMB1870 el cual, cuando se alinea a la SEQ ID NO: 1 usa un algoritmo de alineación en pares, iniciando con el aminoácido alineado a Lys-184 de la
SEQ ID NO: 1 y terminando con el aminoácido alineado a Gln-274 de la SEQ ID NO: 1. 3. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: (a) una secuencia del dominio 'B' de una primera familia NMB1870; y (b) una secuencia del dominio 'C de una segunda familia
NMB1870, en donde la primera y segunda familia son diferentes una de la otra y se seleccionan de la familia I, familia II o familia III del NMB 1870, y en donde el polipéptido quimérico es menos de 495 aminoácidos de longitud. 4. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia del aminoácido -X?-B-X2-C-X3-, en donde: -Xi- es una secuencia del aminoácido opcional; -X2- es una secuencia del aminoácido opcional; -X3- es una secuencia del aminoácido opcional; -B- es una secuencia de aminoácido del dominio B de una secuencia NMB1870 en una primera familia; y -C- es una secuencia de aminoácido del dominio C de una secuencia NMB1870 en una segunda familia, en donde la primera y segunda familia son diferentes una de la otra y se seleccionan de la familia I, familia II o familia III del NMB 1870.
5. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: (a) una secuencia del dominio 4B' y una secuencia del dominio 'C de una primera familia del NMB1870; y (b) una secuencia del dominio ?B' y una secuencia del dominio ' C de una segunda familia del NMB1870, en donde la primera y segunda familia son diferentes una de la otra y se seleccionan de la familia I, familia II o familia III del NMB1870, y en donde el polipéptido quimérico (i) no contiene una secuencia del dominio 'A' de la primera familia y/o (ii) no contiene una secuencia del dominio A' de la segunda familia.
6. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia del aminoácido -X?-Bj-X2-Cj-X3-B)<-X-Ck-X5-, en donde: -Xi- es una secuencia del aminoácido opcional; -X2- es una secuencia del aminoácido opcional; -X3- es una secuencia del aminoácido opcional; -X4- es una secuencia del aminoácido opcional; -X5- es una secuencia del aminoácido opcional; -Bj-es una secuencia de aminoácido del dominio 'B' de una primera familia NMB1870; -Cj- es una secuencia de aminoácido del dominio ?C de la primera familia; -B^- es una secuencia de aminoácido del dominio 'B' de una segunda Familia NMB1870; y -Ck~ es una secuencia de aminoácido del dominio 'C de la segunda familia, en donde la primera y segunda familia son diferentes una de la otra y se seleccionan de la familia I, familia II o familia III del NMB1870.
7. El proceso para producir una secuencia de aminoácido NMB1870 quimérico, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) alinear una primera secuencia de aminoácido NMB1870 con una segunda secuencia de aminoácido NMB1870, para dar un par de secuencias alineadas; (b) seleccionar una porción de la primera secuencia del aminoácido, iniciando en el aminoácido ai de la primera secuencia del aminoácido y finalizando en el aminoácido bi de la primera secuencia del aminoácido; (c) seleccionar una porción de la segunda secuencia del aminoácido, iniciando en el aminoácido a2 de la segunda secuencia del aminoácido y finalizando en el aminoácido b2 de la segunda secuencia del aminoácido, en donde los residuos ai & a2 y bi & b2 se alinean en los pares de las secuencias alineadas; y (d) reemplazar la porción de la primera secuencia del aminoácido con la porción de la segunda secuencia del aminoácido, por ello proporcionando la secuencia de aminoácido NMB1870 quimérica.
8. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la primera y segunda secuencias son diferentes y son de diferentes familias NMB1870.
9. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la primera secuencia es una secuencia de NMB1870 de la familia I.
10. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7 hasta 9, caracterizado porque las porciones seleccionadas tienen al menos 3 aminoácidos de longitud.
11. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7 hasta 10, caracterizado porque las porciones son secuencias de los rizos de superficie.
12. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácido NMB1870 quimérico que se obtiene por el proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7 hasta 11.
13. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácido F?-X?-F2, donde: Fi es un fragmento de terminal N de una primera secuencia de aminoácido NMB1870; F2 es un fragmento de terminal C de una segunda secuencia de aminoácido NMB1870; Xi es una secuencia del aminoácido opcional; la primera y segunda secuencias de aminoácidos NMB1870 son de diferentes familias NMB1870; los fragmentos Fi y F2 son ambos de al menos 10 aminoácidos de longitud; y los fragmentos Fi y F2 tienen una longitud combinada de al menos 200 aminoácidos.
14. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia del aminoácido (Fm-X)n, donde: n es l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10; cada Fm es un fragmento de una secuencia de aminoácido mésima NMB1870; cada -Xm- es una secuencia del aminoácido opcional; cada fragmento F1" es de al menos 7 aminoácidos de longitud; y la n en casos de Fm incluyen fragmentos de al menos dos de las tres familias I, II y III de NMB1870.
15. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque n es 3 y comprende una secuencia del aminoácido F1-X1-F2-X2-F3-X3.
16. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque n es 5 y comprende una secuencia del aminoácido F1-X1-F2-X2-F3-X3-F-X-F5-X5.
17. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos dos de: (i) un fragmento de no más de 240 aminoácidos de una secuencia NMB1870 de la familia I, en donde el fragmento comprende un epítopo de la secuencia NMB1870 de la familia I; (ii) a fragmento de no más de 240 aminoácidos de una secuencia NMB1870 de la familia II, en donde el fragmento comprende un epítopo de la secuencia NMB1870 de la familia II; y (iii) un fragmento de no más de 240 aminoácidos de una secuencia NMB1870 de la familia III, en donde el fragmento comprende un epítopo de la secuencia NMB1870 de la familia III.
18. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácido modificada de una primera familia del NMB1870, en donde la secuencia modificada incluye al menos una secuencia de rizos de la superficie de una segunda familia del NMB1870 en lugar de una secuencia de rizos de la superficie de la primera familia.
19. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia del aminoácido: -B?-L?-B2-L2-B3-L3-B-L-B5-L5-B6-L6-B7-L7-Bß- en donde: (a) Bi es 1-133 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; B2 es 142-161 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; B3 es 169-180 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; B es 183-196 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; B5 es 198-218 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; B6 es 224-233 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; B7 es 237-260 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; y B8 es 268-274 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; (b) Li es ya sea 134-141 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó 142-149 aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; L2 es ya sea 162-167 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó 170-175 aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; L3 es ya sea 180-181 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó 188-189 aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; L es ya sea 196 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó 204 de la SEQ ID NO: 3; L5 es ya sea aminoácidos 218-222 de la SEQ ID NO: 2 ó 226-230 aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; L6 es ya sea 233-235 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó 241-243' aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; y L7 es ya sea 260-266 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 ó 268-274 aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.
20. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia del aminoácido que tiene una secuencia general de identidad en la SEQ ID NO: 1 de al menos 80%, en donde: la secuencia de identidad de una secuencia del aminoácido en la SEQ ID NO: 1 es mayor que 80% en las regiones de estructura de la SEQ ID NO: 1; y la secuencia de identidad de una secuencia del aminoácido en la SEQ ID NO: 1 es menos de 80% en las regiones de rizos de la SEQ ID NO: 1.
21. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácido que tiene una secuencia general de identidad de la SEQ ID NO: 2 de al menos 80%, en donde: la secuencia de identidad de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2 es mayor que 80% en las regiones de estructura de la SEQ ID NO: 2; y la secuencia de identidad de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2 es menos de 80% en las regiones de rizos de la SEQ ID NO: 2.
22. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia del aminoácido que tiene una secuencia general de identidad de la SEQ ID NO: 3 de al menos 80%, en donde: la secuencia de identidad de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 3 es mayor que 80% en las regiones de estructura de la SEQ ID NO: 3; y la identidad de secuencia de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 3 es menos de 80% en las regiones de rizos de la SEQ ID NO: 3.
23. Un polipéptido caracterizado porque comprende un fragmento de una secuencia NMB1870 de la familia I, con la condición que (a) el fragmento incluya aminoácido Arg-223 (b) el polipéptido comprenda ni (i) una secuencia de aminoácido NMB1870 de la familia I completa ni (ii) una secuencia de aminoácido 7G-NMB1870 de la familia I completa.
24. Un polipéptido caracterizado porque comprende una secuencia del aminoácido -Z1-Arg-Z2-, en donde: (a) -Zl- es una secuencia de aminoácido que consiste de al menos 100 aminoácidos; (b) -Z2- es una secuencia de aminoácido que consiste de al menos 30 aminoácidos; (c) -Z1- tiene al menos 75% de identidad de secuencia en los 100 aminoácidos localizados inmediatamente en dirección 3' del aminoácido Arg-223 en la SEQ ID NO: 1; y (d) -Z2- tiene al menos 75% de identidad de secuencia en los 30 aminoácidos localizados inmediatamente en dirección 3' del aminoácido Arg-223 en la SEQ ID NO: 1.
25. Un polipéptido caracterizado porque tiene una secuencia del aminoácido seleccionado del grupo que consiste de la SEQ ID NOS: 4, 5, 6, 7, 23, 24, 43, 44, 52, 53, 61, 62, 63, 64 y 65.
26. Un ácido nucleico caracterizado porque codifica un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes.
27. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes.
28. La composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque comprende un adyuvante de la sal de aluminio.
29. La composición de conformidad con la reivindicación 27 o reivindicación 28, caracterizada además porque comprende una proteína PorA de meningococo.
30. La composición de conformidad con la reivindicación 27 o reivindicación 28, caracterizada además porque comprende una preparación de la vesícula de la membrana exterior de N. meningitidis .
31. El polipéptido quimérico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es para uso como un medicamento.
32. Un método para elevar una respuesta al anticuerpo en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una composición inmunogénica de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 27 hasta 30 al mamífero.