MC1500A1

MC1500A1 - Adn nouveau et son procede de production

Info

Publication number: MC1500A1
Application number: MC831626A
Authority: MC
Inventors: Masakasu Kikuchi; Kyozo Tsukamoto; Tsutomi Kurokawa
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1982-03-24
Filing date: 1983-03-24
Publication date: 1983-11-17
Also published as: PT76431A; DK132183D0; DK132183A; NZ203661A; PT76431B

Description

1

La présente invention concerne un ADN contenant une séquence de bases codant pour le polypeptide de 1'inter-féron immunitaire humain, un hôte transformé avec cet ADN et un procédé de production d'interféron immunitaire humain utilisant ledit hôte, ainsi que divers interférons obtenus comme produits.

Des interférons (parfois désignés ci-après par l'abréviation IF) sont des protéines élaborées par des cellules d'animaux supérieurs en réponse à la stimulation d'un virus, d'un acide nucléique, etc., et douées d'activité antivirale, d'activité antitumorale et d'autres activités.

On sait à l'heure actuelle qu'il existe trois types d'interférons humains, à savoir les types alpha,

bêta et gamma, qui diffèrent par leurs propriétés. Les types alpha et bêta sont induits par un virus ou un acide nucléique et le type gamma est habituellement induit par des agents mitogènes.

A titre de comparaison, l'étude de l'interféron du type alpha (appelé ci-après "IF-a") et de l'interféron du type bêta (appelé ci-après "IF-g") a considérablement progressé, et les mécanismes de production de ces interférons ont été élucidés dans une mesure considérable. De plus, des progrès dans les techniques de manipulations génétiques ont rendu possible la production de IF-a et de IF-31 par culture d'Escherichia coli ou la production d'IF-a^ par culture d'une levure ; ces interférons peuvent donc être obtenus en grandes quantités en tant que protéines douées d'activité physiologique /""voir D. V.

Goeddel et collaborateurs, Nature, 287, 411 (1980) ; E. Yelverton et collaborateurs, Nucleic Acids Res., 9_, 731 (1981) ; D. V. Goeddel et collaborateurs, Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980) ; R. Hitzeman et collaborateurs,

Nature, 293, 717 (1981)_7. En outre, des tentatives ont été faites en vue de produire ces interférons en quantités suffisamment grandes pour permettre la commercialisation de leur utilisation clinique.

L'interféron du type gamma (parfois appelé ci-après "IF-y") est également appelé interféron immunitaire

2

(parfois désigné ci-après par l'abréviation "IFI") du fait qu'il est produit par des cellules inununocompétentes dans les conditions qui peuvent induire la blasto-formation de lymphocytes ou la production de lymphokine. L'IFI est 5 doué de plus grandes activités antiprolifératives et antitumorales que IF-a et IF-g, et, par conséquent, il est plus prometteur du point de vue de l'application clinique. Toutefois, aucun système de production efficace de cet interféron n'a été établi, parce que des lymphocytes frais 10 sont nécessaires. En outre, il a été suggéré que des espèces cellulaires différentes pouvaient produire des IFI d'espèces moléculaires différentes dans des systèmes expérimentaux différents.

Par ailleurs, attendu que les interférons sont 15 très spécifiques, des interférons issus d'êtres humains doivent être utilisés dans une application à des êtres humains. Toutefois, la production quantitative d'interféron immunitaire humain a été si difficile que son application dans la pratique clinique a jusqu'à présent 20 été impossible. La mise au point d'une technique capable de produire de grandes quantités d'IFI humain très pur, d'une manière simple et à un prix avantageux, a été attendue avec un très vif intérêt.

En utilisant les techniques de manipulation 25 génétique, la Demanderesse a entrepris de mettre au point une technique permettant de produire l'IFI désiré par clonage du gène de l'IFI humain, incorporation dans un hôte de la molécule d'ADN recombinant résultante, pour provoquer ainsi l'expression du gène d'IFI humain dans 30 ledit hôte et isolement de l'IFI humain.

L'invention propose un ADN contenant une séquence de bases codant pour le polypeptide de l'interféron immunitaire humain, un hôte transformé avec ledit ADN, un procédé de production d'interféron immunitaire humain ou 35 d'un polypeptide qui en est l'équivalent, procédé qui consiste à faire croître un hôte transformé avec ledit ADN, et des interférons nouveaux.

3

Ainsi, l'ADN obtenu conformément à la présente invention est un ADN possédant la séquence de bases représentée par la formule

(5') TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA

GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT

TCA GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC

ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT GAC AGA AAA

ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA

CTT TTT AAA AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA

AAG AGT GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC

AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA GAT GAC

TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC TTG

AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC ATC CAA

GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG i c 140

AAG CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA 146

AGA GCA TCC CAG -X (3') (I)

10

dans laquelle X est TAA, TGA ou TAG.

L 1

ADN

de formule (I) code pour le polypeptide formule

(N)

Cys

Tyr

Cys

Gin

Asp

Pro

Tyr

Val

Lys Glu

Ala

Glu

Asn

Leu

Lys

Tyr

Phe

Asn

Ala

Gly

His

Ser

Asp

Val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

Ile

Met

Gin

Ser

Gin

Ile

Val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Gin

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Arg

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

Asn

Tyr

Ser

Val

Thr

Asp

Leu

Asn

Val

Gin

Arg

Lys

Ala

Ile

His

Glu

Leu

Ile

Gin

Val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Ar.g

Arg

Ala

Ser

Gin

(C)

(II)

35

ou pour un polypeptide qui en est l'équivalent par ses activités immunologiques ou biologiques.

4

L'ADN (I) ci-dessus peut avoir à son extrémité 5' l'ADN de formule 5'ATG AAA TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT TTT CAG CTC TGC ATC GTT TTG GGT TCT CTT GGC 3' (III) ou ATG (IV).

5 Lorsque l'ADN (I) porte l'ADN de formule (III) à

l'extrémité 5', il code non seulement pour le polypeptide (II), mais aussi pour le polypeptide au N-terminal duquel est ajouté Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gin Leu Cys Ile Val Leu Gly Ser Leu Gly ou pour un polypeptide 10 qui y équivaut par ses activités. Lorsque l'ADN (I) porte l'ADN de formule (IV) à l'extrémité 5', il code non seulement pour le polypeptide (II), mais aussi pour le polypeptide auquel Met est ajouté au N-terminal ou pour un polypeptide qui y équivaut par ses activités. 15 L'ADN (I) est avantageusement lié au site en aval d'un promoteur. Des promoteurs qui conviennent à cette fin comprennent le promoteur du tryptophane (trp), le promoteur PL du bactériophage lambda ou d'autres promoteurs connus tels que le promoteur du lactose (lac) et le pro-20 moteur du facteur d'allongement de chaîne protéinique

Tu (tufB). On apprécie parmi eux le promoteur trp et le promoteur PL> Le promoteur PL est un promoteur très puissant qui peut être influencé efficacement et de façon pratique par le répresseur cl de X. Le gène codant le 25 répresseur porte une mutation clts2 ou clts857 qui rend le répresseur thermosensible. A 30°, le répresseur fonctionne normalement^ et dans l'intervalle d'environ 3 7 à environ 42 °C, il est inactivé. Ainsi, le promoteur PL subit l'effet répresseur (arrêt) à 30°C et subit l'effet 30 inverse (mise en action) à 4 2°C. Cette particularité est avantageuse en l'occurrence parce que le produit génique en question peut être toxique pour la cellule ou par le fait que s'il est présent en grande quantité, il peut être nuisible à la croissance cellulaire. La possibilité 35 d'influencer le promoteur PL offre le moyen de conduire la culture à environ 30-36°C sans expression du produit génique et, à un moment optimal, de faire passer la température d'environ 37 à environ 4 2°C pour obtenir le

5

produit génique désiré.

Dans la formule générale (I), X, qui est un oligo-déoxyribonucléotide, est avantageusement TAA.

Les symboles utilisés dans le présent mémoire et 5 sur les dessins annexés ont les définitions données sur le tableau I suivant.

TABLEAU I ADN = acide désoxyribonucléique A = adénine 10 T = thymine

G = guanine C = cytosine ARN = acide ribonucléique dATP = désoxyadénosine-triphosphate 15 dTTP = désoxythymidine-triphosphate dGTP = désoxyguanosine-triphosphate dCTP = désoxycytidine-triphosphate ATP = adénosine-triphosphate EDTA = tétra-acétate d1éthylènediamine 20 DSS = dodécylsulfate de sodium

Gly = glycine Ala = alanine Val = valine Leu = leucine 25 Ile = isoleucine

Ser = sérine Thr = thréonine Cys = cystéine Met = méthionine 30 Gly = acide glutamique

Asp = acide aspartique Lys = lysine Arg = arginine His = histidine 35 Phe = phénylalanine

Tyr = tyrosine Trp = tryptophane Pro = proline

6

TABLEAU I (Suite)

Asn = asparagine

Gin = glutamine

L'ADN de la présente invention ayant la séquence 5 de bases représentée par la formule (I) peut être produit, par exemple, par

(a) développement de cellules humaines sécrétant l'IFI, par exemple, des lymphocytes de sang périphérique humain,

10 (b) isolement des cellules d'un ARN messager (m)

codant pour 1'IFI humain,

(c) synthèse d'un ADN complémentaire (c) à brin unique avec l'aide dudit ARN messager et de transcriptase-reverse,

15 (d) transformation dudit (c) ADN en un ADN à

double brin,

(e) insertion dudit ADN à double brin dans un plasmide,

(f) transformation d'un hôte, par exemple

20 Escherichia coli ou Bacillus subtilis avec ledit plasmide recombinant,

(g) isolement d'un plasmide contenant l'ADN désiré de la culture dudit hôte,

(h) le cas échéant, séparation par excision de 25 l'ADN cloné du plasmide, et

(i) le cas échéant, liaison dudit ADN cloné au site en aval d'un promoteur dans un véhicule.

Les lymphocytes de sang périphérique humain que l'on doit utiliser dans la mise en oeuvre de l'invention 30 peuvent être des cellules non induites ou des cellules induites.

L'inducteur d'IFI que l'on doit utiliser dans la mise en oeuvre de l'invention peut être tout agent capable d'induire des cellules lymphocytaires humaines 35 pour produire de l'IFI et comprend, entre autres, la phytohémaglutinine (PHa), la concanavaline A (ConA), 1'entérotoxine staphylococcique A (SEA), la neuraminidase-galactose-oxydase (NAGO), le 12-0-tétradécanoylphorbol-13-

acétate (TPA) et leurs mélanges.

L'induction. d'IFI peut être effectuée par culture des cellules dans un milieu connu tel que le milieu RPMI-1640 ou MEM, de préférence dans le milieu RPMI-1640 con-5 tenant du sérum de foetus de veau. La culture est conduite à une température de 35-39°C, avantageusement de 36-38°, pendant 12 à 72 heures, notamment pendant 22 à 26 heures. Les cellules sont recueillies (par un procédé connu) et,

après addition, par exemple, de thiocyanure de guanidine, 10 de bentonite, d'héparine, de sulfate de polyvinyle, d'acide aurine-tricarboxylique, de complexe de vanadium, de pyro-carbonate de diéthyle (DPC) ou de dodécylsulfate de sodium (DSS) comme inhibiteur d'ARNase, lysées en vue de l'extraction d'ARN par addition de N-lauroylsarcosinate de sodium, de "Tween" 15 80" ou de "Nonidet P-40", par exemple. Après extraction répétée autant que nécessaire par addition de phénol, de phénol-chloroforme, etc.,.à l'extrait contenant l'ARN,

les ARN sont recueillis par précipitation à l'éthanol.

Attendu que l'on sait que de nombreux mARN présents dans 20 le cytoplasme de cellules d'eucaryotes contiennent une séquence poly(A) à l'extrémité 3', on recueille les ARN poly(A) en utilisant une oligo(dT)-cellulose, un poly(U)-sépharose ou une substance similaire et on les fractionne par la méthode de centrifugation impliquant un gradient de 25 densité du saccharose. Les portions aliquotes de chaque fraction obtenue sont injectées dans des ovocytes de Xenopus laevis (espèce de crapaud) en vue de la traduction £~J. B. Gurdon et collaborateurs, Nature, 233, 177 (1971)_/. On effectue un titrage de l'activité antivirale 30 de la protéine produite. On peut obtenir de la sorte l'ARN messager pour l'interféron IFI. Le mARN peut aussi être purifié par électrophorèse sur gel de formamide-polyacryl-amide ou par électrophorèse sur gel d'agarose ou par électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant du glyoxal. 35 En utilisant le mARN ainsi obtenu comme modèle,

on effectue la synthèse de la chaîne d'ADN complémentaire (cADN) à brin unique par un procédé connu, par exemple en utilisant une transcriptase-reverse. Le cADN est ensuite

A

8

10

15

20

25

30

converti en l'ADN à double brin / T. Maniatis et collaborateurs, Cell, 8, 163 (1976) J.

pBR322, par exemple au niveau du site de clivage de l'endo-nucléase de restriction PstI ou Sphl, par exemple par la méthode d'addition de queues d'homopolymère dG-dC ou dA-dT décrite par T. S. Nelson /~Methods in Enzymology, 68, 41 (1979), Academic Press Inc., New York_7- Le plasmide recombinant est ensuite introduit, par exemple dans Escherichia coli x1776, par transformation. Les transformants peuvent être choisis comme colonies résistant à la tétracycline ou résistant à 1'ampicilline. Un oligo-nucléotide d'essai présentant une séquence de bases supposée correspondre à une partie au moins de la séquence d'amino-

acides du polypeptide d'IFI est en même temps synthétisé

32

chimiquement et marqué au P. En utilisant comme échantillon 1'oligonucléotide marqué, on sélectionne secondairement les clones désirés parmi les transformants résistant à la tétracycline ou à 1'ampicilline déjà obtenus, par exemple par la méthode connue d'hybridation de colonies /~M. Grunstein et D. S. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 22/ 3961 (1975)J.

Pour confirmer la présence du gène d'IFI, on détermine la séquence de bases des clones montrant le résultat positif d'hybridation de colonies, par exemple par la méthode de Maxam-Gilbert J_ A. M. Maxam et W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977)_7 ou la méthode de terminaison synthétique de chaîne impliquant un didéoxy-nucléotide et l'utilisation du phage M13 / J. Messing et collaborateurs, Nucleic Acids Res., 9_, 309 (1981) 7"- La totalité ou une partie du gène d'IFI peut aussi être excisée des clones obtenus, puis attachée en aval d'un promoteur convenable et d'une séquence SD (Shine-Delgarno) en vue de l'introduction dans un hôte voulu.

ci-dessus et l'hôte comprend des bactéries telles qu'Escherichia coli ou Bacillus subtilis et d'autres microorganismes tels que la levure Saccharomyces cerevisiae■ On

Cet ADN est inséré, par exemple, dans le plasmide

Le promoteur comprend les promoteurs mentionnés

apprécie comme hôte Escherichia coli, par exemple les souches 294 ou W3110 de E. coli, notamment E. coli 294.

Escherichia coli 294 est une souche bactérienne connue /~~K. Backman et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4174 (1976)_7 et cette souche est également déposée à l'Institute for Fermentation, Osaka (N° de dépôt IFO-14171).

La transformation d'un hôte avec l'ADN de l'invention est effectuée, par exemple, par le procédé connu décrit par S. N. Cohen et collaborateurs /~Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)_/.

Le composé de formule :

Y-Cys

Tyr

Cys

Gin

Asp

Pro

Tyr

Val

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Leu

Lys

Tyr

Phe

Asn

Ala

Gly

His

Ser

Asp

Val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

Ile

Met

Gin

Ser

Gin

Ile

Val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Gin

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Arg

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

Asn

Tyr

Ser

Val

Thr

Asp

Leu

Asn

Val

Gin

Arg

Lys

Ala

Ile

His

Glu

Leu

Ile

Gin

Val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Arg

Ala

Ser

Gin

(II1)

dans laquelle Y représente (a) l'hydrogène, (b) Met ou (c) Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Ala Phe Gin Leu Cys Ile Val Leu Gly Ser Leu Gly, pèut être produit, par exemple, par développement de l'hôte ainsi obtenu, accumulation du composé (II1) dans le bouillon de culture et isolement de ce composé.

L'hôte est cultivé dans un milieu connu.

Le milieu est, par exemple, le milieu M9 contenant du glucose et des casamino-acides /~~J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Labora-tory, New York,1972_7. Pour une action efficace du promoteur

10

on peut ajouter, le cas échéant, un agent de dé-répression tel que l'acide (3-indolylacrylique.

L'incubation est généralement conduite à une température de 15 à 43°C pendant 3 à 24 heures, le cas échéant avec aération et/ou agitation.

Lorsqu'on utilise un transformant ayant un répresseur cl de À et un vecteur d'expression contenant le promoteur PL, on choisit de plus basses températures d'incubation, c'est-à-dire des températures d'environ 30 à environ 36°C et le répresseur cl de X peut avantageusement être désactivé sous incubation à environ 37-42°C.

Après l'incubation, les cellules sont recueillies par un procédé connu et,après mise en suspension dans une solution tampon, elles peuvent être lysées, par exemple, par un traitement aux ultrasons, par le lysozyme et/ou par congélation et décongélation ou par d'autres procédés /""voir, par exemple, Gunsalus, "Extraction of Enzymes from Microorganisms", Methods in Enzymology 1:51 (1955)_7- La liqueur surnageante est recueillie par centrifugation.

L'isolement d'IFI humain de ladite liqueur surnageante peut être effectué par des procédés classiques pour la purification de protéines.

L'interféron IFI ou le polypeptide qui est son équivalent en matière d'activités immunologiques ou biologiques, tel que produit conformément à l'invention, possède des activités immunologiques et biologiques qui équivalent à celles de l'IFI du type produit par des procédés déjà connus, et on peut l'utiliser de la même manière et aux mêmes fins que l'IFI de type connu.

L'IFI a présenté une activité antivirale, antitumorale, inhibitrice de croissance et immunosuppressive. Le composé peut être mélangé avec un support stérile phar-maceutiquement acceptable tel que de l'eau stérilisée, de la sérum-albumine humaine (SAH), une solution normale de chlorure de sodium ou d'autres véhicules bien connus dans l'art antérieur, et le mélange peut être administré oralement ou topiquement. Des doses quotidiennes pour un traitement intraveineux vont d'environ 10 millions à environ

11

100 millions d'unités pour des adultes moyens, notamment d'environ 50 à 60 millions d'unités. Le produit pharmaceutique peut contenir d'autres ingrédients pharmaceutiquement acceptables tels que des sels, des diluants, des adjuvants, 5 d'autres supports, des tampons, des liants, des agents tensio-actifs, des préservateurs, etc. Des préparations à usage parentéral pourraient être présentées sous la forme d'une ampoule de solution ou de suspension stérile du produit dont le véhicule est l'eau ou un autre liquide 10 pharmaceutiquement acceptable, ou sous la forme d'une ampoule de poudre stérile (obtenue de préférence par lyophilisation d'une solution d'IFI) destinée à être diluée avec un liquide pharmaceutiquement acceptable.

En outre, le produit de la présente invention peut 15 contenir d'autres composants pharmaceutiquement actifs qui peuvent être administrés avantageusement avec l'IFI, comprenant, par exemple, un interféron lymphocytaire ou fibro-blastique, en quantités allant d'environ 1 à 99 % sur la base de .la quantité d'IFI.

20 Sur les dessins annexés :

La figure 1 représente la carte de clivage par un enzyme de restriction du plasmide pHIT3709 tel qu'il est obtenu dans l'exemple 1 (vii) ci-après, la portion hachurée à hachures montant de gauche a droite indiquant 25 la portion qui code pour le peptide supposé être le peptide signal et la portion hachurée à hachures descendant de gauche à droite indiquant la portion qui code pour le polypeptide IFI. La figure 2 illustre la structure primaire (séquence des bases) du plasmide pHIT3709 tel qu'obtenu 30 dans l'exemple 1 (vii). La figure 3 montre le schéma de construction pour l'exemple 2.

La figure 4 est une carte de restriction partielle d'un fragment Bgl II - Bam H 1 de 1200 paires de bases contenant un promoteur PL> La figure 5 illustre la construc-35 tion d'un vecteur d'expression pRC14 qui contient le promoteur PL de lambda sur une insertion de 350 paires de bases.

A)

12

La figure 6 illustre le schéma utilisé pour isoler le fragment de 82 paires de bases contenant la séquence de SD pour le gène int du bactériophage lambda servant à la construction du vecteur d'éxpression pRC15.

5 La figure 7 illustre la construction du vecteur d'expression pRC15. La figure 8 illustre la construction des vecteurs d'expression pRC21 et pRC22. La figure 9 illustre la construction du vecteur d'éxpression pRC23 avec un promoteur PL et un RBS synthétique. 10 La figure 10 illustre le schéma utilisé pour insérer le gène codant pour l'interféron immunitaire dans pRC22 et la séquence de la jonction promoteur-gène.

La figure 11 illustre l'insertion du gène de l'interféron immunitaire dans le vecteur d'expression pRC23 15 et la séquence de la jonction promoteur-gène et sa variante. Exemple 1

(i) Isolement de mARN codant pour IFI

On a fait incuber des lymphocytes préparés à partir de sang périphérique humain dans le milieu RPMI-164 0 20 (contenant 10 % de sérum de foetus de veau), additionné

de 15 ng/ml de 12-0-tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA) et de 40 p,g/ml de concanavaline A à 37°C en vue de l'induction d'IFI. Au bout de 24 heures d'incubation, les lympho-

1 0

cytes humains induits de la sorte (1x10 cellules) ont 25 été détruits et dénaturés dans une solution de thioguani-dine (thiocyanate de guanidine 5 M, 5 % de mercapto-éthanol, 50 mM de chlorhydrate de tris (pH 7,6), 10 mM d'EDTA) dans un appareil d'homogénéisation en "Teflon". On a ensuite ajouté du N-lauroylsarcosinate de sodium à 30 la concentration de 4 % et on a déposé sur le mélange,

après homogénéisation, une couche de 6 ml de solution de chlorure de césium 5,7 M (chlorure de césium 5,7 M, EDTA 0,1 M) et on a centrifugé à 15°C et à la vitesse de 24 000 tr/min pendant 30 heures en utilisant un rotor 35 Beckman "SW27" pour obtenir un précipité d'ARN.

Ce précipité d'ARN a été dissous dans du N-lauroylsarcosinate à 0,25 %, puis précipité à l'éthanol, ce qui a donné 8,3 mg d'ARN. On a laissé cet ARN se fixer par

13

adsorption, dans une solution de sel à forte concentration (NaCl 0,5 M, chlorhydrate de tris 10 mM (pH 7,6),

EDTA 1 mM, DSS 0,3 %) sur une colonne d'oligo(dT)-cellulose et on a élué le mARN contenant le poly-(A)

avec une solution de sel à faible concentration (chlorhydrate de tris 10 mM (pH 7,6), EDTA 1 mM, DSS 0,3 %). On a recueilli 700 ng de mARN.

Ce mARN a été de nouveau précipité à l'éthanol,

puis dissous dans 0,2 ml d'une solution de chlorhydrate de tris 10 mM (pH 7,6), EDTA 2 mM et DSS à 0f3 %), traité à 65QC pendant 2 minutes et fractionné en 22 portions par centrifugation selon un gradient de densité à 10-35 % de saccharose à 20 °C et à la vitesse de 25 000 tr/fain pendant 21 heures en utilisant un rotor BeckmaJi "SW27". Des portions aliquotes de chaque fraction ont été injectées à des ovocytes.de Xenopus. laevis et les protéines synthétisées ont été titrées en vue de déterminer l'activité en interférence 'est-à -dire que l'activité antivirale a été déterminée par exemple par le test d'inhibition de l'effet cyto-pathique du virus de la stomatite vésiculaire contre des cellules WISH dérivées d'amnios humain /~W. E. Stewart, The Interferon System 11-26,(Springer-Verlag, New York (1979)_7. Il a été révélé de cette manière que la fraction 12 (le coefficient de sédimentation étant de 12-14S) avait une activité de 195 unités (unités internationales d'IFN) par microgramme d'ARN. Le mARN dans la fraction 12 ainsi obtenue pesait environ 20 ixg.

(ii) Synthèse d'ADN monocaténaire

En utilisant le mARN ci-dessus et une transcriptase reverse, on a fait incuber 100 jil d'un mélange réactionnel (5 ug de mARN, 50 ng d'oligo (dT), 100 unités de trans-criptase-reverse, 1 mM de chacun des triphosphates dATP, dCTP, dGTP et dTTP, 8 mM de MgCl2, 50 mM de KC1, 10 mM de dithiothréitol et 50 mM de chlorhydrate de tris (pH 8,3) à 42°C pendant 1 heure, puis on a effectué la déprotéination avec du phénol et un traitement avec de l'hydroxyde de sodium décinormal à 70°C pendant 20 minutes pour effectuer la dégradation de l'ARN.

14

(iii) Synthèse de l'ADN bicaténaire

L'ADN complémentaire monocaténaire ainsi synthétisé a été soumis à une réaction dans 50 p.1 d'un mélange réactionnel (le même que celui qui a été mentionné ci-5 dessus, à la différence que le mARN et l'oligo (dT) étaient absents) à 42°C pendant 2 heures pour effectuer la synthèse de l'ADN bicaténaire.

(iv) Addition de queues dC

L'ADN bicaténaire ci-dessus a été traité avec 10 la nucléase S1 dans 50 |il d'un mélange réactionnel (ADN

bicaténaire, acétate de sodium 0,1 M (pH 4,5), NaCl 0,25 M, ZnSO^ 1,5 mM, 60 unités de nucléase S1) à la température ambiante pendant 30 minutes. Le mélange réactionnel a été débarrassé de la protéine avec du phénol, l'ADN a été 15 précipité avec de l'éthanol et il a été soumis à la réaction avec une transférase terminale dans un mélange d'ADN bicaténaire, de cacodylate de potassium 0,14 M, de 2 mM de dithiothréitol, de 1 mM de CoC^, de dCTP 0,15 mM,

i de 30 unités de transférase terminale dans le tris (base) 20 0,3 M (pH 7,6), à 37°C pendant 3 minutes pour l'addition à l'ADN bicaténaire d'environ 20 chaînes de désoxycyti-dine à chaque extrémité 3' de l'ADN.

Cette série de réactions a donné environ 300 ng d'un ADN bicaténaire contenant des chaînes de désoxycyti-25 dine.

(v) Clivage d'un plasmide d'Escherichia coli et addition de queues de dG

On a traité séparément 10 ng d'ADN de plasmide pBR322 d'Escherichia coli avec l'enzyme de restriction 30 PstI dans 50 p,l d'un mélange réactionnel contenant 10 \iq d'ADN de pBR322, 50 mM de NaCl, 6 mM de MgCl2, 6 mM de 2-mercapto-éthanol, 100 |ig/ml de sérum-albumine de boeuf et 20 unités de PstI dans du chlorhydrate de tris 6 mM (pH 7,4), à 37°C pendant 3 heures, pour effectuer le 35 clivage au niveau du site reconnaissant l'enzyme PstI

présenté par l'ADN de pBR322. Ensuite, le mélange réactionnel a été débarrassé de la protéine avec du phénol et l'ADN a encore été amené à réagir avec la transférase

15

terminale dans 50 ni d'un mélange réactionnel contenant 10 \ig d'ADN, 0,14 M de cacodylate de potassium, 2 mM de dithiothréitol, 1 mM de CoCl2, 0,15 mM de dGTP et 30 unités de transférase terminale dans du tris (base) 0,3 M (pH 7,6) à 37°C pendant 3 minutes pour l'addition d'environ 8 résidus de désoxyguanosine à chaque extrémité 3' de l'ADN de plasmide pBR322 ci-dessus.

(vi) Renforcement du cADN et transformation d'Escherichia coli

On a effectué le renforcement par chauffage de 0,1 |ig de 1*ADN bicaténaire synthétique à queues de dC ainsi obtenu et 0,5 (ig du plasmide pBR322 à queues de dG ci-dessuë dans une solution contenant 0,1 M de NaCl, 50 mM de chlorhydrate de tris (pH 7,6) et 1 mM d'EDTA à 65°C pendant 2 minutes, puis à 45°C pendant 2 heures, puis en refroidissant graduellement. La transformation d'Escherichia coli x1776 a été effectuée par le procédé d'Enea et collaborateurs /"~J. Mol. Biol., 96, 495 (1975)_7-

(vii) Isolement, du plasmide contenant le cADN

Environ 8500 colonies résistant à la tétracycline ont été isolées de la sorte et l'ADN de chaque colonie a été fixé à.un filtre nitrocellulosique /~M. Grunstein et D. S. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72 39 61 (1975)_7.

Séparément, sur la base de la séquence d'amino-acides d'IFI telle que rapportée par D. V. Goeddel et collaborateurs /""Nature, 295, 503 (1982)_7, deux séquences de bases 5' TCCTGGCAçTAçC 3' et 5' AC^TTCAT^TC^TC^T 3', correspondant vraisemblablement aux amino-acides N° 1-5 (Cys.Tyr.Cys.Gin.Asp) et aux amino-acides N° 77-82 (Lys.Gin.Asp.Meti'Asn.Val) de làdite séquence d'IFI, respectivement, ont été synthétisées chimiquement par la méthode du triester décrite par R. Créa et collaborateurs f~Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5765 (1978)_7. Ces oligo-nucléotides ont été traités avec la polynucléotide-kinase de T4 dans 50 ni d'un mélange réactionnel (0,2 |ig d'oligo-

nucléotide, 10 mM de MgCl,, 10 mM de mercapto-éthanol,

32

50 jiCi de y- P-ATP et 3 unités de polynucléotide-kinase

16

de T4 dans 50 mM de chlorhydrate de tris (pH 8,0)), à

37°C pendant 1 heure. Ces oligonucléotides ainsi marqués 32

au phosphore P à l'extrémité 5' ont été utilisés comme échantillons et renforcés avec l'ADN fixé au filtre de nitrocellulose mentionné ci-dessus, par la méthode de Lawn et collaborateurs /~Nucleic Acids Res., j), 6103 (1981)_7- Quatre colonies réactives vis-à-vis des deux échantillons d'oligonucléotides ci-dessus ont été isolées par autoradiographie.

Des ADN de plasmide ont été isolés des cellules bactériennes de chacune de ces colonies par le procédé de Birnboim et Doly /~Nucleic Acids Res. 1_, 1513 (1979)_7-Les insertions dans les ADN de plasmide ont été excisées avec l'enzyme de restriction PstI. Parmi les plasmides isolés, celui qui contient la plus longue insertion de cADN a été choisi et nommé "pHIT3709".

La carte des enzymes de restriction de ce plasmide est représentée sur la figure 1.

La structure primaire (séquence des bases) de la séquence de cADN insérée dans le plasmide pHIT3709 a ensuite été déterminée par la méthode de terminaison par des chaînes synthétiques de didésoxynucléotides et par la méthode de Maxam-Gilbert. Cette structure primaire était telle que représentée sur la figure 2.

La structure primaire en question concorde avec celle du cADN d'IFI, telle que rapportée par Gray et collaborateurs /""Nature, 295, 503-508 (1982)_7, à la différence que la première diffère de la seconde d'un seul codon ; en effet, le codon de la première pour l'amino-acide N° 140 est CGA, tandis que le codon de la seconde est CAA pour Gin. La protéine déterminée par cette séquence de bases consiste vraisemblablement en 166 amino-acides dont la synthèse est induite à partir du nucléotide N° 30, à savoir le codon ATG, qui est le signal de départ de la synthèse de la protéine. Les 20 premiers amino-acides constituent vraisemblablement un peptide signal. La séquence d'amino-acides diffère elle aussi de l'IFI rapporté par Gray et collaborateurs en ce qui concerne l'amino-

17

acide N° 140 (Arg au lieu de Gin).

D'après la structure primaire mentionnée ci-dessus, il est clair que ce plasmide comprend la région entière codant pour la protéine d'IFI. Cela permet de 5 faire produire à des hôtes tels qu'Escherichia coli un interféron immunitaire par transfert de la séquence d'ADN insérée dans ce plasmide à un autre plasmide d'expression. Exemple 2

L'insertion dans le plasmide pHIT3709, telle 10 qu'obtenue dans l'exemple 1, a été excisée de son nucléo-

tide N° 100 avec l'enzyme de restriction BstNI (voir figure 2 et figure 3) et, après réunion des deux extrémités cohésives avec le grand fragment d'ADN-polymérase I (également appelé ADN-polymérase I de Klenow), il a été 15 attaché par ligation, au moyen de l'ADN-ligase de T4,

avec 1'oligonucléotide d'adaptation :

CGATAATGTGTTACTGCC TATTACACAATGACGG qui a été synthétisé chimiquement par la méthode au tri-20 ester mentionnée ci-dessus et qui renferme le codon de départ ATG pour la synthèse de la protéine.

Un second plasmide (ptrp601) contenant pBR322 et la portion de promoteur de tryptophane d'Escherichia coli (c'est-à-dire le fragment d'ADN contenant le promo-25 teur et l'opérateur) comprenant 276 paires de bases a

été construit en tant que plasmide d'expression en utilisant la méthode de G. N. Bennett et collaborateurs /"J. Mol. Biol. 121, 113 (1978)J.

Ce plasmide ptrp601 a été ouvert avec l'enzyme 30 de restriction Clal et le gène d'IFI présentant l'adaptateur mentionné ci-dessus fixé par ligation a été inséré dans le vecteur de plasmide en aval du promoteur de tryptophane en utilisant l'ADN-ligase de T4. On a ainsi construit un plasmide pHIT.trp301 d'expression d'IFI (figure 35 3) .

Une souche bactérienne contenant ce plasmide pHIT.trp301 a été obtenue par transformation d'Escherichia coli 294 avec ce plasmide par le procédé de Cohen et colla

18

borateurs (voir ci-dessus).

Exemple 3

La souche bactérienne contenant le plasmide d'expression d'IFI,telle qu'obtenue dans l'exemple 2,est cultivée en milieu M9 contenant 0,5 % de glucose et 0,5 % de casamino-acides à 37°C pendant 6 heures. Les cellules sont ensuite recueillies et mises en suspension dans une solution de NaCl 0,15 M dans un tampon au phosphate 0,02 M (pH 6,8) et elles sont lysées par un traitement aux ultrasons. Une centrifugation donne la liqueur surnageante. L'activité en interféron de cette liqueur surnageante peut être mesurée par titrage sur les cellules WISH conformément à la méthode mentionnée dans l'exemple 1 (£) ci-dessus et décrite par W. E. Steward, (voir ci-dessus).

Exemple 4

La souche bactérienne contenant le plasmide pHIT.trp301 d'expression d'IFI, telle qu'obtenue dans l'exemple 2, a été cultivée en milieu M9 contenant 0,5 % de glucose et 0,5 % de casamino-acides à 37°C pendant 6 heures sous agitation par secousses.

De l'acide indole-acrylique a été ajouté, à une concentration finale de 20 et l'incubation a été

poursuivie à 37°C pendant 3 heures sous agitation par secousses.

On a prélevé un échantillon de 10 ml, on a recueil li les cellules par centrifugation et . on les a remises en suspension dans 0,1 ml de tris 50 mM (pH 7,4) contenant 10 %'de saccharose, et on a rapidement congelé la suspension dans un. bain de neige carbonique et d'éthanol. Ensuite les cellules ont été décongelées à 20°C et transférées dans un bain de glace. On a ajouté à la suspension cellulaire du chlorure de sodium,jusqu'à une concentration de 100 mM, de 1'EDTA jusqu'à une concentration de 10 mM, de la sper-midine jusqu'à une concentration de 20 mM et du lysozyme jusqu'à une concentration de 200 ng/ml. On a maintenu le mélange sur de la glace pendant 4 5 minutes, puis on l'a fait incuber à 37°C pendant 2 minutes. La lyse s'est manifestée par l'élévation de viscosité de la suspension. Les

19

débris cellulaires ont été enlevés par centrifugation et la liqueur surnageante a été titrée en vue de déterminer l'activité antivirale en IFI sur les cellules WISH. Cette expérience s'est soldée par un rendement de 1280 unités 5 d'activité en IFI par ml d'extrait cellulaire.

Des exemples représentatifs donnés ci-après illustrent l'expression de l'IFI au moyen du système promoteur PL de X conjointement avec le segment d'ADN codant pour l'IFI selon la présente invention.

10 Exemple 5

Pour isoler un fragment de 350 paires de bases (bp) contenant le promoteur PL de À, on a fait digérer 250 jj,g d'ADN cl857 Sam7 de X ' (Miles Laboratories) avec les endonucléases de restriction BamHl et Bgl II et on 15 a séparé les produits sur gel d'agarose par électrophorèse. Un fragment de 1200 paires de bases contenant le promoteur PL a été isolé du gel (voir figure 4).

Ce fragment de 1200 paires de bases a ensuite été exposé à une digestion totale avec Hpal et à une 20 digestion partielle avec Hinf I, et un fragment de 350

paires de bases a été isolé d'un gel à 5 % de polyacryl-amide. Une digestion avec Hpal a éliminé deux fragments partiels de HinfI d'environ 350 paires de bases, qui aurait autrement contaminé le fragment désiré. 25 Ce fragment de 350 paires de bases contient le promoteur PL et les sites de l'opérateur 0L (0L1, °L2 ' 0Lg) auxquels se lie le répresseur cl de X. Le site Hinfl, qui apparaît entre la séquence de Shine-Dalgarno (SD) du gène N de X et le codon d'initiation pour le gène N (voir 30 figure 4), prévoit la construction de sites hybrides de liaison du ribosome aux fins de l'expression de gènes étrangers dans E. coli. Ce site Hinfl peut aussi être converti en un site EcoRI.

Le fragment Bgl II - Hinfl de 350 paires de bases 35 a été cloné en plasmide pRC1 qui a été exposé à la digestion avec EcoRI et Bgl II. Le plasmide pRC1 est un dérivé de pBR322 qui contient un site Bgl II adjacent au site EcoRI (voir figure 5). La figure 5 illustre les séquences

20

du terminal de liaison et indique la manière dont l'extrémité EcoRI du vecteur peut s'unir à l'extrémité Hinfl du fragment, en reconstituant ainsi le site EcoRI. (Le cercle A de la figure 5 a été comblé in vivo). Le plasmide recom-5 binant résultant a été appelé plasmide pRC14.

En utilisant les mêmes techniques, on a également construit plusieurs, autres vecteurs d'expression en utilisant le promoteur (figures 6, 7,8 et 9). Le plasmide pRC15 contient, en plus du fragment Bgl II - Hinfl de 350 paires 10 de bases décrit ci-dessus, un fragment de 55 paires de bases (Hinf /~~-MboI_7) qui contient la séquence SD du gène int de X (voir figures 6 et 7). pRC21 et pRC22 sont analogues, respectivement, à pRC14 et pRC15. La principale différence existant entre ces plasmides est l'orien-15 tation du fragment inséré contenant PL, et,par conséquent, la direction de transcription (voir figure 8). Le plasmide pRC23 a été construit par ligation d'oligonucléotides synthétiques contenant un RBS de "consensus" (Scherer et collaborateurs, -Nucleic Acids Research, 8, 3895 (1980) à 20 un fragment Bgl II - Hae III de 250 paires de bases contenant le promoteur. PL et insertion du produit de ligation à pRC2 comme représenté sur la figure 9.

On a également construit des vecteurs d'expression de P^ contenant le gène de 1'interféron immunitaire 25 (IFI) issu du plasmide pHIT3709 de l'exemple 1 ci-dessus, comme indiqué dans les exemples suivants.

Exemple 6

On a isolé de pHIT3709 un fragment BstNl de 900 paires de bases qui contient 430 paires de bases de 30 la séquence codant pour IFI et 470 paires de bases de la région 3' non codante. Ce fragment ne porte pas les séquences pour la portion "signal" de l'IFI et les codons des trois premiers amino-acides de la protéine mûre présumée. Pour rétablir les trois codons manquants et pour 35 créer Un codon Met d'initiation, on a préparé des oligo-nucléotides synthétiques qui ont été fixés par ligation au fragment de 900 paires de bases (voir figure 10). Le fragment synthétique a converti les deux extrémités BstNl

1-

21

en extrémités EcoRI. Le fragment résultant a été cloné en vecteur pRC22 et ce dernier a été soumis à la restriction par EcoRI. L'orientation de l'insertion a été déterminée par analyse par restriction avec Bgl I qui effectue la coupure dans la région 3' non codante.

Le vecteur pRC22 contenant le gène d'IFI (appelé pRC22/IFI-900) a été séquencé suivant la jonction promoteur-gène pour assurer que toutes les opérations de ligation avaient lieu de la façon escomptée (voir figure 10).

Pour le test d'expression du gène d'IFI, la souche RRI (pRK248cIts, pRC22/IFI-900) a été cultivée en milieu M9 glucosé à 30°C jusqu'à 3-4 x 10® cellules/ml,

puis l'induction a été conduite à 42°C pendant 1 heure. Avant l'induction, on a ajouté davantage de glucose et de casamino-acides jusqu'à des concentrations respectives de 1,0 et 0,5 %. On a prélevé un échantillon de 10 ml, on a recueilli les cellules par centrifugation et on les a remises en suspension dans 0,1 ml de tris 50 mM (pH 7,4) à 10 % de saccharose et on a congelé rapidement la suspension dans un bain de neige carbonique et d'éthanol. On a décongelé les cellules à 20°C, puis on les a transférées dans un bain de glace. On a ajouté du chlorure de sodium à la concentration de 100 mM, de l'EDTA à la concentration de 10 mM, de la spermidine à la concentration de 20 mM et du lysozyme à la concentration de 200 (ig/ml. On a maintenu le mélange sur de la glace pendant 45 minutes, puis on l'a fait incuber à 37°C pendant 2 minutes. Les débris cellulaires ont été enlevés par centrifugation et la liqueur surnageante a été titrée pour déterminer l'activité antivirale en IFI sur des cellules WISH. Cet essai initial a montré un rendement de 128 0 unités d'activité en IFI par ml d'extrait cellulaire.

En vue de déterminer la cinétique de l'induction, on a répété le mode opératoire ci-dessus. On a maintenu un échantillon à 30°C comme témoin et on a prélevé d'autres échantillons après induction à 42°C pendant 30, 60, 90, 120 et 180 minutes. On a traité les échantillons de la manière décrite ci-dessus. Les résultats, reproduits sur

22

le tableau II., indiquent qu'à 30°C, aucune activité n'est produite et qu'après l'induction à 42°C, la quantité d'activité détectée atteint un maximum de l'ordre de 90 minutes, puis diminue progressivement.

5 TABLEAU II

Conditions d'induction

Souche Température (°C)-Temps Activité en IFI, unités/ml

RRI (pRK248cIts,

10 pRC22/IFI-900) 30° 0

42° - 30 min 120

42° - 60 min 120

42° - 90 min 320

42° - 120 min 160

15 " 42° - 180 min 40

Exemple 7

De l'ADN de pRC22/IFI-900 a encore été traité par restriction avec EcoRI et le fragment de 900 paires de bases contenant le gène d'IFI a été isolé et inséré dans 20 pRC23 qui avait été traité par restriction avec EcoRI

(voir figure 11). La construction résultante, pRC23/IFI-900, contenait un RBS nettement différent de celui qui se trouve dans pRC22/IFI (comparer les figures 10 et 11). Pour tester l'expression du gène d'IFI, on a cultivé la souche 25 RRI (pRK248cIts, pRC23/IFI-900) en milieu M9 glucosé à 30°C jsuqu'à une densité de 3-4 x 10 cellules/ml, puis on a procédé à l'induction à 42°C pendant 1 heure. Avant l'induction, on a encore ajouté du glucose et des casamino-acides en proportions respectives de 1,0 et 0,5 %. On a 30 prélevé un échantillon de 10 ml, on a recueilli les cellules par centrifugation et on les a remises en suspension dans 0,1 ml de tris 50 mM (pH 7,4) à 10 % de saccharose et on a rapidement congelé la suspension dans un bain de neige carbonique et d'éthanol. On a décongelé les cellules 35 à 20°C, puis on les a transférées dans un bain de glace. On a ajouté du chlorure de sodium à la concentration de 100 mM, de 1'EDTA à la concentration de 10 mM, de la sper-midine à la concentration de 20 mM et du lysozyme à la concentration de 1200 ng/ml. Le mélange a été maintenu sur

23

de la glace pendant 45 minutes, puis mis à incuber à 37°C pendant 2 minutes. Les débris cellulaires ont été enlevés par centrifugation et la liqueur surnageante a été titrée pour déterminer l'activité antivirale en IFI sur cellules 5 WISH. En utilisant pRC23/IFI pour transformer la souche RRI de E^ coli, on a obtenu environ quatre fois plus d'activité que pour pRC22/IFI, comme représenté sur le tableau III.

TABLEAU III

10 Souche Conditions Unités d'ac-

d1 induction tivité en IFI/ ml

RRI (pRK248cIts, pRC22/IFI-900) 42° - 90 min 320

RRI (pRK248cIts, pRC23/IFI-900) 42° - 90 min 1280

15 RRI (pRK248cIts, pRC231/IFI-900) 42° - 90 min 640

Exemple 8

On a encore procédé à la restriction de pRC23/IFI avec EcoRI dans des conditions qui ont entraîné la coupure d'un seul des deux sites. Les molécules résultantes ont 20 ensuite été traitées avec Pol I "Klenow" pour réunir les extrémités EcoRI. Les extrémités cohésives ont été réunies par ligation avec l'ADN-ligase de T4 et l'ADN a été utilisé pour transformer RRI (pRK248cIts). Des transformants ont été protégés de la perte du site EcoRI au début du gène 25 d'IFI et deux positifs ont été obtenus. L'un d'eux, appelé pRC231/IFI-900, a été utilisé pour transformer la souche RRI de E. coli pour exprimer IFI. Pour tester l'expression du gène d'IFI, cette souche RRI PpRK248cIts, pRC231/IFI-900) a été cultivée en milieu M9 glucosé à 30°C jusqu'à

O

30 une densité de 3-4 x 10 cellules/ml, puis l'induction a été effectuée à 42°C pendant 1 heure. Avant l'induction, du glucose et des casamino-acides avaient été ajoutés en proportions respectives de 1,0 et 0,5 %. Un échantillon de 10 ml a été prélevé, les cellules ont été recueillies 35 par centrifugation et remises en suspension dans 0,1 ml de tris 50 mM (pH 7,4) à 10 I de saccharose et la suspension a été rapidement congelée dans un bain de neige carbonique et d'éthanol. Les cellules ont été décongelées à 20°C, puis transférées dans un bain de glace. On a ajouté

24

du chlorure de sodium en proportion de 100 mM, de 11EDTA en proportion de 10 mM, de la spermidine en proportion de 20 mM et du lysozyme en proportion de 200 p,g/ml. Le mélange a été maintenu sur de la glace pendant 45 minutes, 5 puis incubé à 37°C pendant 2 minutes. Les débris cellulaires ont été enlevés par centrifugation et la liqueur surnageante a été titrée pour déterminer l'activité antivirale en IFI sur des cellules WISH. Les résultats sont reproduits sur le tableau III.

10 La modification de pRC23/IFI décrite a été conçue pour étendre la région de liaison de 6 à 10 paires de bases. Dans le cas de l'IFI, une distance de 6 paires de bases se révèle meilleure pour l'expression de l'IFI si elle est portée à 10 paires de bases.

15 Exemple 9

De l'interféron immunitaire humain obtenu conformément à la présente invention peut être purifié par un procédé tel que le suivant :

Toutes les étapes sont avantageusement conduites 20 à une basse température, de préférence au-dessous de la température ambiante, et notamment à environ 4°C. La matière contenant l'IFI, par exemple la liqueur surnageante de l'exemple 4, peut être filtrée successivement à travers un filtre "Nalgene" de 3 microns, puis de 0,22 micron. 25 L'étape de purification subséquente utilise une colonne de chromatographie en phase liquide par échange de cations faibles à haute performance. De la résine "CM 200" 10 m (Séparation Industries) est introduite dans une colonne de 25 cm x 0,46 cm de diamètre intérieur et préparée en 30 vue de son utilisation par épuration avec KC1 2 M et rééquilibrage avec un tampon au phosphate 24 mM à pH 7,5 ou avec de 1'eau distillée désionisée (qui doit être utilisée d'un bout à l'autre de ce mode opératoire), le filtrat du filtre de 0,22 micromètre est dilué avec un volume 35 égal d'eau et il est chargé par pompage à 1,5 ml/min sur la colonne CM. La colonne est ensuite lavée avec du phosphate de potassium 25 mM à pH 7,5 jusqu'à ce que la protéine contenue dans l'effluent de la colonne soit réduite

4

25

aux taux constituant le fond, comme déterminé par contrôle automatique de la colonne avec de la fluorescamine. La colonne est ensuite éluée à la vitesse de 0,5 ml/min avec un gradient de KC1 à concentration croissante (0 à 1 M) dans un tampon au phosphate de potassium 25 mM à pH 7,5.

Les fractions actives sortant de la colonne CM sont rassemblées et concentrées sur un cône filtrant CF 25 préalablement lavé (firme Amicon Corp.). La solution concentrée (0,5 ml ou moins) est ensuite injectée dans une colonne de chromatographie sur gel de silice "TSK 250" (30 x 0,75 cm) (Bio-Rad Laboratories), qui a été préalablement équilibrée, et qui est éluée avec une solution de KC1 0,3 M et de phosphate de potassium 25 mM à pH 7,5 à la vitesse de 24 ml/h. On recueille les fractions à des intervalles de 1 minute. L'activité en interféron correspond à un pic de protéine. L'interféron immunitaire homogène peut être obtenu en une ou plusieurs fractions à ce stade selon la matière de départ et le rendement des étapes précédentes. Le cas échéant, des fractions impures peuvent être reconcentrées et rechromatographiées sur la colonne TSK ou CM pour obtenir l'homogénéité.

La présente invention a permis de produire de l'interféron immunitaire humain ou son équivalent d'une manière économique. Cet interféron est utile comme agent antiviral ou antitumoral.

Claims

26

RESUME L'invention a pour objets :

I - Un ADN, caractérisé par les points suivants pris séparément ou en combinaisons : 5 1. Il contient une séquence de bases de formule

(5')

TGT

TAC

TGC

CAG

GAC

CCA

TAT

GTA

AAA

GAA

GCA

GAA

AAC

CTT

AAG

AAA

TAT

TTT

AAT

GCA

GGT

CAT

TCA

GAT

GTA

GCG

GAT

AAT

GGA

ACT

CTT

TTC

TTA

GGC

ATT

TTG

AAG

AAT

TGG

AAA

GAG

GAG

AGT

GAC

AGA

AAA

ATA

ATG

CAG

AGC

CAA

ATT

GTC

TCC

TTT

TAC

TTC

AAA

CTT

TTT

AAA

AAC

TTT

AAA

GAT

GAC

CAG

AGC

ATC

CAA

AAG

AGT

GTG

GAG

ACC

ATC

AAG

GAA

GAC

ATG

AAT

GTC

AAG

TTT

TTC

AAT

AGC

AAC

AAA

AAG

AAA

CGA

GAT

GAC

TTC

GAA

AAG

CTG

ACT

AAT

TAT

TCG

GTA

ACT

GAC

TTG

AAT

GTC

CAA

CGC

AAA

GCA

ATA

CAT

GAA

CTC

ATC

CAA

GTG

ATG

GCT

GAA

CTG

TCG

CCA

GCA

GCT

AAA

ACA

GGG

AAG

CGA

AAA

AGG

AGT

CAG

ATG

CTG

TTT

CGA

GGT

CGA

AGA

GCA

TCC

CAG

-X.

(3')

dans laquelle X représente TAA, TGA ou TAG.
2. Il a à son extrémité 5' la séquence 25 (5') ATG AAA TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT TTT CAG CTC TGC ATC GTT TTG GGT TCT CTT GGC (3').
3.11a ATG à son extrémité 5'.
4. Il code pour le polypeptide :

Cys

Tyr

Cys

Gin

Asp

Pro

Tyr

Val

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

Ala

Gly

His

Ser

Asp

Val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

Ile

Met

Gin

Ser

Gin

Ile

Val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

27

Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gin Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gin Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg ^ Lys Arg Ser Gin Met Lue Phe Arg Gly Arg Arg Ala

Ser Gin

5. Il code pour un polypeptide équivalant au 10 polypeptide de l'interféron immunitaire en ce qui concerne les activités immunologiques ou biologiques.

6. Il code pour le polypeptide :

Met Cys

Tyr

Cys

Gin

Asp

Pro

Tyr

Val

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

Ala

Gly

His

Ser

Asp Val Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

Ile

Met

Gin

Ser

Gin

Ile

Val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

Asn

Tyr

Ser

Val

Thr

Asp

Leu

Asn

Val

Gin

Arg

Lys

Ala

Ile

His

Glu

Leu

Ile

Gin

Val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin-

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Arg

Arg

Ala

Ser

Gin

7. Il code pour le polypeptide :

Met

Lys

Tyr

Thr

Ser

Tyr

Ile

Ala

Phe

Gin

Leu

Cys

30

Ile

Var

Leu

Gly

Ser

Leu

Gly

Cys

Tyr

Cys

Gin

Asp

Pro

Tyr

Val

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

Ala

Gly

His

Ser

Asp

Val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser Asp

Arg

Lys

Ile

Met

Gin

Ser

Gin

Ile

Val

35

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

28

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

Asn

Tyr

Ser

Val

Thr

Asp

Leu

Asn

Val

Gin

Arg

Lys

Ala

Ile

His

Glu

Leu

Ile

Gin

Val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Arg

Arg

Ala

Ser

Gin

8. Il forme une partie d'une molécule d'ADN recombinant.

9. Il est attaché au site en aval d'un promoteur. II - Un procédé de production d'ADN contenant une séquence de bases de formule :

(5')

TGT

TAC

TGC

CAG

GAC

CCA

TAT

GTA

AAA

GAA

GCA

GAA

AAC

CTT

AAG

AAA

TAT

TTT

AAT

GCA

GGT

CAT

TCA

GAT

GTA

GCG

GAT

AAT

GGA

ACT

CTT

TTC

TTA

GGC

ATT

TTG

AAG

AAT

TGG

AAA

GAG

GAG

AGT

GAC

AGA

AAA

ATA

ATG

CAG

AGC

CAA

ATT

GTC

TCC

TTT

TAC

TTC

AAA

CTT

TTT

AAA

AAC

TTT

AAA

GAT

GAC

CAG

AGC

ATC

CAA

AAG

AGT

GTG

GAG

ACC

ATC

AAG

GAA

GAC

ATG

AAT

GTC

AAG

TTT

TTC

AAT

AGC

AAC

AAA

AAG

AAA

CGA

GAT

GAC

TTC

GAA

AAG

CTG

ACT

AAT

TAT

TCG

GTA

ACT

GAC

TTG

AAT

GTC

CAA

CGC

AAA

GCA

ATA

CAT

GAA

CTC

ATC

CAA

GTG

ATG

GCT

GAA

CTG

TCG

CCA

GCA

GCT

AAA

ACA

GGG

AAG

CGA

AAA

AGG

AGT

CAG

ATG

CTG

TTT

CGA

GGT

CGA

AGA

GCA

TCC

CAG

-X.

(3')

où X représente TAA, TGA ou TAG,

comportant les caractéristiques suivantes prises séparément ou ensemble :

1. Il comprend :

(a) le développement de cellules sécrétant l'interféron immunitaire humain,

(b) l'isolement des cellules d'un ARN messager codant pour l'interféron immunitaire humain,

29

(c) la synthèse d'un ADN complémentaire monocaténaire avec l'utilisation dudit ARN messager et de transcriptase-reverse,

(d) la conversion dudit ADN complémentaire en 5 un ADN bicaténaire,

(e) l'insertion dudit ADN bicaténaire dans un plasmide,

(f) la transformation d'un hôte avec ledit plasmide recombinant,

10 (g) l'isolement d'un plasmide contenant l'ADN

désiré de la culture dudit hôte,

(h) le cas échéant, la séparation de l'ADN cloné du plasmide par excision, et

(i) le cas échéant, la liaison dudit ADN cloné

15 au niveau du site en aval d'un promoteur dans un véhicule.

2. L'ADN désiré code pour le polypeptide :

Cys

Tyr

Cys

Gin

Asp

Pro

Tyr

Val

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

Ala

Gly

His

Ser

Asp

20

Val

Ala

Asp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

Ile

Met

Gin

Ser

Gin

Ile

Val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

Phe

25

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

Asn

Tyr

Ser

Val

Thr

Asp

Leu

Asn

Val

Gin Arg

Lys

Ala

Ile

His

Glu

Leu

Ile

Gin

Val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Arg

Arg

Ala

30

Ser

Gin

3. L'ADN désiré code pour un polypeptide équivalant par ses activités immunologiques ou biologiques au

35 polypeptide de l'interféron immunitaire.

4. L'ADN désiré fait partie d'une molécule d'ADN recombinant.

30

III - Un hôte comportant les particularités suivantes prises conjointement ou individuellement :

1. Il est transformé avec un ADN contenant une séquence de bases de formule :

(5')

TGT

TAC

TGC

CAG

GAC

CCA

TAT

GTA

AAA

GAA

GCA

GAA

AAC

CTT

AAG

AAA

TAT

TTT

AAT

GCA

GGT

CAT

TCA

GAT

GTA

GCG

GAT

AAT

GGA

ACT

CTT

TTC

TTA

GGC

ATT

TTG

AAG

AAT

TGG

AAA

GAG

GAG

AGT

GAC

AGA

AAA

ATA

ATG

CAG

AGC

CAA

ATT

GTC

TCC

TTT

TAC

TTC

AAA

CTT

TTT

AAA

AAC

TTT

AAA

GAT

GAC

CAG

AGC

ATC

CAA

AAG

AGT

GTG

GAG

ACC

ATC

AAG

GAA

GAC

ATG

AAT

GTC

AAG

TTT

TTC

AAT

AGC

AAC

AAA

AAG

AAA

CGA

GAT

GAC

TTC

GAA

AAG

CTG

ACT

AAT

TAT

TCG

GTA

ACT

GAC

TTG

AAT

GTC

CAA

CGC

AAA

GCA

ATA

CAT

GAA

CTC

ATC

CAA

GTG

ATG

GCT

GAA

CTG

TCG

CCA

GCA

GCT

AAA

ACA

GGG

AAG

CGA

AAA

AGG

AGT

CAG

ATG

CTG

TTT

CGA

GGT

CGA

AGA

GCA

TCC

CAG

-X.

(3')

où X représente TAA, TGA ou TAG.

2. L'ADN contient ladite séquence de bases attachée au site en aval d'un promoteur.

3. L'hôte est Escherichia coli ou Bacillus subtilis. IV - Un composé caractérisé en ce qu'il répond à

la formule :

Y-Cys

Tyr

Cys

Gin

Asp

Pro

Tyr

Val

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

Ala

Gly

His

Ser

Asp

Val

Ala

£sp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

Ile

Met

Gin

Ser

Gin

Ile

Val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

Asn

Tyr

Ser

Val

Thr

Asp

Leu

Asn

Val

Gin

Arg

Lys

Ala

Ile

His

Glu

Leu

Ile

Gin

Val

Met

31

Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gin dans laquelle Y représente (a) l'hydrogène, (b) Met ou (c) Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Ala Phe Gin Leu Cys Ile Val Leu Gly Ser Leu Gly.

V - Un procédé de production d'un composé de formule :

Y-Cys

Tyr

Cys

Gin

Asp

Pro

Tyr

Val

Lys

Glu

Ala

Glu

Asn

Leu

Lys

Lys

Tyr

Phe

Asn

Ala

Gly

His

Ser

Asp

Val

Ala

Àsp

Asn

Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

Leu

Lys

Asn

Trp

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

Ile

Met

Gin

Ser

Gin

Ile

Val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Phe

Lys

Asn

Phe

Lys

Asp

Asp

Gin

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser

Val

Glu

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

Lys

Phe

Phe

Asn

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu

Lys

Leu

Thr

Asn

Tyr

Ser

Val

Thr

Asp

Leu

Asn

Val

Gin

Arg

Lys

Ala

Ile

His

Glu

Leu

Ile

Gin

Val

Met

Ala

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

Arg

Lys

Arg

Ser

Gin

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Arg

Arg

Ala

Ser

Gin

dans laquelle Y représente (a) l'hydrogène, (b) Met ou (c) Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Ala Phe Gin Leu Cys Ile Val Leu 30 Gly Ser Leu Gly, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un hôte transformé avec un ADN contenant une séquence de bases de formule :

32

(5*) TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA GAT GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC TTG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC ATC CAA GTG ATG

GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG AAG CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG -X (3')

dans laquelle X représente TAA, TGA ou TAG, à accumuler ledit composé dans le bouillon de culture, puis à le recueillir.

ORlGî^^t on pages contenant Renvois yx é.—.-moi r&yé> nu!

Conseil en Propriété Industrielle

2 6 bii( Boul. Princesse Charlotte MONTE-CARLO

j Par procuration çk> \ " J

4 ■