MC1499A1

MC1499A1 - Interferon immun humain homogene et procede pour sa preparation

Info

Publication number: MC1499A1
Application number: MC831624A
Authority: MC
Inventors: Stanley Stein; Richard A Wolfe
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1982-03-01
Filing date: 1983-02-25
Publication date: 1983-11-17
Also published as: FI830557A0; PT76310B; NO830697L; GB8305506D0; GT198301619A; MW783A1; ZA83768B; MTP924B; ES8407499A1; ZW4683A1; GR77910B; GB2119383A; AU1181283A; EP0087686A3; DK104283A; KR840003422A; NZ203364A; PT76310A; IL67978A0; EP0087686A2

Description

La présente invention concerne de l'interféron immun humain sous la forme nouvelle d'une protéine homogène stable et un procédé pour sa préparation. Un tel interféron immun humain homogène est thérapeutiquement utile comme agent antiviral et anti-prolifératif et sert, en combinaison avec d'autres formes d'interféron comme l'interféron de leucocyte, à synergiser l'activité d'autres"interférons de ce genre.

Une purification partielle d'interféron immun humain est décrite par Georgiades et Johnson (Methods in Enzymology 78, 536 (1981)). Les étapes employées pour la purification comprennent le traitement avec l'absorbant Matrex Blue, on traite le surnageant avec du verre à porosi-~ --té contrôlée pour absorber l'interféron, on élue l'interféron avec du NaCl-éthylèneglycol et on rassemble et on. chromatographie les fractions d'interféron sur une colonne d'Ultrogel AcA-54 avec élution du pic d'interféron avec NaCl lM/éthylèneglycol à 18%. On élue la plus grande partie de l'activité d*interféron dans l'intervalle de poids moléculaire allant de 35 000 à 70 000. Il est dit que l'activité

6 30

spécifique de la fraction pic d'Ultrogel est de 10 '

Il est indiqué qu'il s'agit de la matière la plus pure obte-, nue à l'heure actuelle et représente une pureté inférieure à 10%.

Johnson et coll. (Methods in Enzymology, _78, 158 (1981)) mentionnent l'induction et la production à grande échelle d'interférons immuns humains. Ils indiquent que l'on obtient les rendements d'interféron les plus élevés à partir de lymphocytes périphériques humains obtenus à partir de donneurs normaux qui sont induits par 1^entérotoxine A staphylococcique mitogène de cellule T. Ce procédé fournit une concentration moyenne d'interféron de 1000 unités/ml, ou 2,5 x 10 unités pour 100 ml de sang. Les auteurs indiquent que l'interféron immun partiellement purifié obtenu

2

à partir du produit de départ mentionné ci-dessus convient pour la production d'anticorps et pour amorcer des essais cliniques chez l'homme, mais aucun détail n'est donné.

Mizrahl et O'Malley (Methods in Enzymology, 78, 5 209 (1981)) ont obtenu de l'interféron immun humain non glycosylé sous forme brute en employant de la tunicamycine. L'interféron immun non glycosylé présente une activité biologique mais perd son aptitude à se lier à une lectine immobilisée (ConA-sépharose).

10 O'Malley (Methods in Enzymology, _78, 540 (1981))

a décrit une chromatographie d'affinité de l'interféron immun humain. D'après l'examen des niveaux d'interféron immun de divers malades, on observe que l'interféron immun joue un ^-rôle dans les réponses défensives de l'hôte contre les infections virales et que les hôtes ayant subi une immuno-suppression sont handicapés dans leur aptitude à mettre sur pied une telle réponse. En outre, les résultats obtenus en utilisant divers inducteurs et un certain nombre de colonnes d'affinité différentes indiquent que l'interféron immun se compose d'une population hétérogène de composants d'interféron avec différents degrés d'hydrophobie. Il n'a pas été possible de procéder à une caractérisation plus poussée sans disposer de préparations d'.interféron purifiées à partir desquelles on ait enlevé les substances masquantes conta- -minantes.

Nathan et coll (Nature 292, 842 (27 août 1981)) signalent la production d'interféron immun humain par une lignée cellulaire de lymphocyte T humain. On purifie l'interféron en1utilisant des perles de verre de porosité con-" trôlée puis une chromatographie sur colonne avec Ultrogel AcA-44. L'activité spécifique de la fraction pic provenant de cette colonne est de 1,2 x 10^ (pure à moins de 5%) et le poids moléculaire apparent est d'environ 40 000.

15

20

25

L'induction de leucocytes humains par Con A et purification partielle par adsorption sur de l'acide sili-cique et élution avec de 1'éthylèneglycol contenant un tampon donne deux composants à action antivirale que l'on peut sépara: l'un de l'autre par filtration sur gel. Les composants (désignés par 45K et 22K) ont des poids moléculaires apparents d'environ 45 000 et 22 000. Le composant 45K est spécifique d'une espèce, relativement sensible à l'acide (pH 2) et faiblement neutralisé par les anticorps contre l'interféron de fibroblaste humain. Les auteurs concluent qu'en toute probabilité le composant 45K contient surtout des variantes moléculaires d'interféron immun humain. Cf Van Camme et coll. [Eur. J. Immunol., JQ, 937-942 (1981)].

Plus récemment, Yip et coll. [Science 215, 411 (22 janvier 1982)] ont décrit le traitement de préparations très concentrées et partiellement purifiées d'interféron immun humain avec du dodécylsulfate de sodium (DSS) à 0,1% à des températures comprises entre 20 et 25°C. Ils notent qu'un tel traitement ne détruit pas complètement l'activité biologique comme on l'avait observé antérieurement en utilisant des températures plus élevées. Ils recueillent deux pics ayant une activité biologique par analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec DSS (EGFA-DSS) avec des poids moléculaires apparents de 20 000 et 25 000 et on observe une activité trace dans la région correspondant à un poids moléculaire d'environ 50 000. Les auteurs supposent que dans les conditions de dénaturation employées dans le dosage, une forme à haut poids moléculaire de l'interféron immun se dissocie en les deux composants observés (Voir également Yip et coll., Proc. Nat. Acad. Sci. Etats-Unis 79, 1820 (mars 1982).

Enfin, Goeddel et coll. ont présenté une communication au Second Congrès International annuel de recherche sur l'interféron à San Francisco en Californie, les 21-23

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octobre 1981, décrivant le clonage d'un ADN complémentaire d'interféron immun humain et son expression dans 3 systèmes hôte-vecteur différents. D'après la séquence nucléotidique de ce gène cloné et en supposant un positionnement approprié de l'initiation de la séquence protéique exprimée, l'interféron immun humain putatif se compose de 146 acides aminés ayant un poids moléculaire total d'environ 17 000. Selon Gray et coll. [Nature 295, 503 (11 février 1982)3 la composition d'acides aminés dérivée de la séquence nucléotidique est la suivante:

Al a

8

Gin

10

Leu

10

"Ser

11

Arg

7

Glu

9

Lys

20

Thr

5

Asn

10

Gly

5

Met

4

Trp

1

Àsp

10

His

2

Phe

10

Tyr

5

Cys

2

Ile

7

Pro

2

Val

8

L'interféron immun humain brut utile dans la pratique de l'invention peut provenir de n'importe quelle source commode. Une source approprié d'interféron immun humain brut est constituée par les leucocytes normaux induits. On peut obtenir des rendements et des titres améliorés d'interféron immun humain en inoculant un milieu de culture cellulaire auquel on ajoute du sérum; comme le sérum de foetus de veau et un agent qui stimule la prolifération et la différentiation cellulaires et en permettant au mélange d'incuber pendant une période suffisante pour que les cellules connaissent au moins un doublement. Un milieu de culture cellulaire enrichi approprié pour ce procédé est le milieu RPMI-1640, article du commerce, contenant environ 2-10% de sérum de foetus de veau. Le milieu enrichi peut également contenir une addition de composants classiques utiles pour la culture cellulaire comme, par exemple, un tampon, p. ex. l'Hepes (acide N-2-hydroxyéthyl-pipérazine-N*-2-éthane-sulfonique) 12,5 à 25 mM. L'agent de stimulation

5

de la prolifération cellulaire utile dans la pratique de l'invention est une phytohémagglutinine (PHA) ajoutée en une quantité allant d'environ 0,1 à 10 jig/ml. La température d'incubation employée doit être de préférence d'environ 37°C. Généralement, les cellules connaissent un à deux doublements en environ 2 jours.

Lorsque la période d'incubation est terminée les cellules sont induites. Les agents inducteurs utiles que l'on peut employer sont bien connus des spécialistes et comprennent des antigènes spécifiques ou des mitogènes non spécifiques. Comme exemples de tels agents inducteurs on peut citer les phytohémagglutinines (PHA), la concanavaline A (Con A), le mitogène de phytolaccacées (PWM), un dérivé de protéine purifié (PPD), un toxoïde tétanique (TT), l'antigène du virus de la vaccine (VM), 1'entérotoxine staphylococcique A, les esters de phorbol comme le 13-acétate de 12-O-tétra-décanoylphorbol (TPA) , etc. On a généralement trouvé que les procédés d'induction utilisant des antigènes spécifiques que l'on ajoute habituellement aux cultures contenant des lymphocytes préalablement sensibilisés à l'antigène aboutissent à des rendements comparativement mauvais d'interféron immun. On préfère ainsi l'induction avec les mitogènes de cellule T. On préfère en particulier parmi les mitogènes les phytohémagglutinines, les plus appréciées étant la phytohémagglutinine L en conjonction avec le TPA comme il est dit par Yip et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. Etats-Unis 78, 1601 (1981).

La PHA est utilisée à une concentration allant d'environ 1 à 10 ug/rnl tandis que le TPA est utilisé à une concentration allant d'environ 5 à 20 ng/ml. On ajoute tout d'abord au milieu l'ester de phorbol, suivi au bout d'une période de 2 à 3 h, par la PHA. La période d'incubation peut aller de 48 à 120 h, de préférence environ 96 h. On transforme alors en boulettes par centrifugation et on

filtre pour retirer tout débris cellulaire éventuel, de préférence à travers un filtre dont la taille des pores est de 3 microns. En utilisant un tel procédé pour la prolifération et l'induction cellulaires, il est possible d'accroître de façon substantielle le rendement et le titre d'interféron immun humain que l'on peut produire par population cellulaire unitaire par comparaison avec les procédés connus jusqu'à présent des spécialistes. Ainsi, par exemple, la moyenne des titres de 45 préparations est d'environ 13 000 unités/ml.

Une autre source d'interféron immun humain brut provient de microorganismes recombinants qui ont été transformés avec un vecteur d'expression contenant le gène - d'interféron immun humain en état de fonctionnement en employant les techniques de 1'ADN recombinant maintenant bien connues des spécialistes. On peut faire fermenter les micro-organismes recombinant, les recueillir et extraire l'interféron immun des cellules par des procédés classiques comme, par exemple, par analogie avec les procédés décrits par Goeddel et coll.. Nature 28 7, 411 (1980);

Wetzel et coll.-Journal of Interferon Research _1, 381 (1981) et Gray et coll., Nature 295, 503 (1982). On peut alors traiter l'extrait acellulaire obtenu de la même manière qu'il est dit ci-dessous pour le milieu surnageant obtenu à partir de leuçocytes induits. Il faut cependant noter que l'interféron immun, contrairement à l'interféron de leucocyte est labile aux températures élevées et à pH acide ou basique et qu'il faut donc prendre garde en préparant les matières brutes d'éviter ces conditions extrêmes.

L'aspect procédé de l'invention fait intervenir un mode opératoire en trois étapes pour purifier l'interféron immun humain à partir du surnageant ou extrait acellulaire. Dans la première étape, l'interféron immun humain est sélectivement adsorbé sur une colonne d'affinité, les impuretés non adsorbées sont enlevées de la colonne par lavage,

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puis l'interféron immun humain est élué sous une forme plus purifiée. La purification par colonne d'affinité de l'interféron immun humain est déjà connue des spécialistes. Les matières spécifiques de la colonne et les conditions d'élution ne sont pas étroitement critiques pour la pratique de l'invention et on peut donc employer n'importe lequel des procédés de chromatographie d'affinité utilisé par les spécialistes, p. ex. l'emploi d'un verre à porosité contrôlée ou d'une colonne de lectine avec support.

Un procédé préféré de chromatographie d'affinité pour application dans le .procédé en 3 étapes de l'invention, en ce qui concerne l'interféron que l'on trouve dans la nature, utilise une colonne de concanavaline A-sépharose, qui est "un article du commerce, et qui de préférence a été préalablement lavé avec du sel physiologique tamponné au phosphate (STP) ou un milieu de culture, comme le milieu essentiel minimum. Après avoir chargé la colonne et l'avoir lavée avec au moins un volume de colonne de STP ou dudit milieu de culture, on peut éluer l'interféron immun humain avec une solution diluée d ' ot-méthyl-D-mannoside, ayant de préférence une concentration d'environ 0,2 M.

à partir de l'étape de chromatographie d'affinité à une nouvelle étape de chromatographie en phase liquide échangeu-se de cations faible à haute efficacité. Dans cette seconde étape on prépare une colonne de carboxyméthyl-silice (CM) en lavant avec une solution de sel comparativement concentrée, p. ex. 1 à 2 M, comme, par exemple, un halogénure, phosphate ou sulfate de métal alcalin, de préférence KC1. On ré-équili-bre alors la colonne avec un tampon aqueux, de préférence un tampon phosphaté, pH 7,5, ou avec de l'eau, et on charge avec les fractions actives réunies de l'étape de colonne d'activité diluées avec de l'eau. Après lavage avec de l'eau ou une solution à faible concentration de sel jusqu'à ce

On soumet alors les fractions actives rassemblées

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que la concentration de protéine observée dans l'effluent retourne aux niveaux de base, on élue la colonne avec un gradient croissant de concentration de sel. On détecte les fractions actives par biodosage et on les rassemble. La taille de la colonne, les débits employés et les tampons utilisés ne sont pas étroitement critiques pour appliquer l'invention avec succès. Il faut noter que la solution de sel choisie ne doit pas interférer avec le mode opératoire employé pour la détection de la protéine. Un système préféré utilise l'analyse par fluorescamine de la protéine et un gradient de sel compatible réalisé à. partir de chlorure de potassium 0 à 1 molaire dans une solution tampon, comme le phosphate de potassium dilué à pH 7,5.

On rassemble e.t on concentre les fractions actives provenant de la colonne de carboxyméthyl-silice. Un procédé préféré de concentration de la solution contenant l'interféron immun consiste à utiliser un cône de filtration, de préférence un cône de filtration CF 25 probablement lavé avec KC1 0,4 M, du phosphate de potassium 25 mM, pH 7,5 et î^O. On injecte alors la solution concentrée dans une colonne d'imprégnation sur gel de silice pré-équilibrée et on élue avec une solution salée tamponnée et diluée. Comme auparavant, le sel que l'on peut employer n'est pas étroitement critique et peut être choisi à partir de n'importe quel halogénure, phosphate ou sulfate de métal alcalin, de préférence le chlorure de potassium à une concentration allant de 0,01 à 1,0 M. Le tampon utilisé dans cette étape est un tampon au phosphate de métal alcalin dilué, de préférence au phosphate de potassium, pH 7,5. L'interféron immun humain purifié s'élue en un seul grand pic protéiqûe avec une bioactivité correspondant à ce pic protéique. Selon l'état de l'interféron immun brut utilisé comme produit de départ et l'efficacité des étapes de purification, il peut être posssible d'obtenir ui produit

homogène à ce point. Cependant, si la préparation n'est toujours pas complètement purifiée, il est possible de reconcentrer les fractions actives puis de répéter la chromatographie sur la colonne de TSK ou de CM pour obtenir l'homogénéité.

On dose les fractions provenant des colonnes d'imprégnation sur carboxyméthyl-silice et gel de silice dans un dosage d'inhibition de l'effet cytopathique (CPE), comme il est dit dans le brevet américain n° 4 241 174, publié le 23 décembre 1980, en utilisant comme cellules de dosage aussi bien des cellules Hep-2 (humaines) que des cellules MDBK (de boeuf). On observe une activité antivirale avec les fractions provenant des deux colonnes sur la lignée Hpe-2 humaine,

-mais non lorsqu'on teste les mêmes fractions contre les cellules MDBK de boeuf. Cette spécificité d'espèce indique la présence d'interféron immun humain et exclut la présence de quantités appréciables d'interférons de type leucocyte humain ou fibroblaste qui fournirait un dosage positif contre les cellules MDBK de boeuf.

L'interféron immun humain homogène obtenu par la pratique de l'aspect mode opératoire mentionné ci-dessus de l'invention présente une activité spécifique d'environ o

1 x 10 unités/mg de protéine. La valeur de l'activité spécifique n'est due qu'approximativement à la variabilité inhérente au dosage ainsi qu'au manque de disponibilité d'un standard de référence d'interféron immun humain. Le poids moléculaire apparent de la protéine homogène est d'environ 45 000 dalton, déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dans le dodécylsulfate de sodium. Ce poids moléculaire est également en accord avec sa migration sur la colonne de TSK.

Les interférons présentent une activité antivirale, antitumorale, d'inhibition de la croissance et d'immuno-suppression. Ces activités s'obtiennent même au niveau clinique en utilisant de 1 à 10 x 106 unités de dose

10

15

quotidiennement en utilisant des préparations relativement brutes, dont moins de 1% est constitué d'interféron humain. Plus récemment les interférons de leucocyte humain recombinant très purifiés A et D (IFLr-A et IFLr-D) ont commencé leurs essais cliniques. Des tests de dosage croissant avec IFLr-A ont montré que l'on peut tolérer des doses uniques allant jusqu'à 198 millions d'unités. On peut employer généralement des doses quotidiennes thérapeutiques allant d'environ 10 à 100 millions d'unités, de préférence environ 50 millions d'unités. Par analogie directe avec ce qui précède, l'interféron immun humain homogène peut être employé dans le même intervalle posologique. Il est également possible d'utiliser plus d'un type d'interféron humain dans "ïm traitement concurrent. Les spécialiste auront naturellement àl1 esprit les régimes posologiques appropriés à utiliser, par exemple l'interféron immun humain conjointement avec un interféron de leucocyte humain comme IFLr-A. L'emploi d'un tel traitement concurrent aboutit à un accroissement synergique de l'activité des interférons et réduit la quantité nécessaire pour obtenir l'effet thérapeutique désiré.

Le procédé et les aspects produit de l'invention sont précisés par référence aux exemples suivants.

11

Exemple 1

On recueille par leucophorèse du sang provenant de 7 à 10 donneurs humains normaux (environ 50 ml/donneur). Chaque ml de sang ayant subi une leucophorèse donne 15 x 10^ leucocytes. On sépare les leucocytes des hématies par sédimentation dans 11hydroxyéthylamidon à 2%. On aspire les leucocytes à partir de la phase supérieure et on les transforme en boulettes par centrifugation à 500 g.

On inocule alors les leucocytes à raison de 10^ cellules/ml dans 5 à 8 litres de milieu RPMI 1640 (Gibco) complété avec- du sérum de foetus de veau à 2-10% , de 11 Hepes 25 mM et 0,2-0,5jujg/ml de PHA-L.La PHA stimule la prolifération cellulaire. On fait incuber la culture pendant 2 jours à 37°C dans un ballon de 16 litres. Les cellules connaissent un à deux doublements au cours de cette incubation.

On induit la culture, après addition d'un volume égal de milieu frais avec TPA et PHA comme il a été dit. On ajoute l'ester de phorbol-TPA au récipient de culture à raison de 10 nq/ml pendant 3 h suivis par de la PHA à 2 pg/ml. L'induction se déroule pendant environ 96 h. On transforme alors les cellules en boulettes par centrifugation à 1000 g et on filtre (3 microns) le surnageant contenant l'interféron immun pour retirer les débris cellulaires. La solution filtrée est alors prête pour la purification.

Toutes les étapes suivantes sont conduites à froid à une température d'environ 4°C.

On filtre à nouveau de façon séquentielle le milieu conditionné obtenu comme il est dit ci-dessus à travers un filtre de 3 microns puis à travers un filtre (Nalgène) de 0,22 micron. On l'introduit alors dans une colonne de concanavaline A-sépharose (Con A) (Pharmacie FineChemicals ou Sigma Chemical Co.) préalablement lavée avec du sel phy-

12

siologique tamponné au phosphate (STP) de Dulbecco (Grand Island Biological Supply Co.) ou avec un milieu de culture F-ll (Grand Island Biological Supply Co.). On utilise typiquement un volume dé lit de 35 ml de Con A pour adsorber

5

l'interféron immun à partir d'1 litre de milieu conditionné. On lave alors la colonne avec au moins un volume de colonne de STP ou de milieu F-ll. On élue alors l'interféron avec de 1'a-méthyl-D-mannoside 0,2 M dans le STP et on rassemble les fractions actives. La stabilité de ces fractions actives 10 est montrée ci-dessous au Tableau 1.

Tableau 1

Stabilité de l'interféron immun purifié avec Con A à 4°C " Semaine Titre observé (unités/ml )

0

3,0

x

105

15 . '

1

3,1

x

105

2

1,5

X

105

3

7,7

X

104

5

4,1

X

104

8

4,1

X

105

20

11

2,0

X

105

12

6,1

X

105

Dosage

On titre tous les échantillons d'interféron immun en utilisant le dosage de réduction CPE tel que décrit dans 25 le. brevet américain n° 4 241 174 avec cette exception que l'on utilise des cellules Hep-2 (ATCC n° CCL 23) comme cellules de dosage. On provoque les dosages avec le virus de la stomatite vésiculaire après une "incubation de 6 h de l'échantillon d'interféron et des cellules de dosage. Tous 30 les titres d'interféron immun sont ajustés à des unités de référence en utilisant le standard d'interféron de leucocyte NIH (G-023-901-527).

L'étape de purification suivante utilise une colonne de chromatographie en phase liquide échangeuse de cations faible à haute efficacité. On tasse de la résine CM 200, 10 pm (Séparation Industries, Orange, N.J.) dans une colonne de 25 cm x 0,46 cm de diamètre interne et on la prépare pour utilisation en la nettoyant avec KC1 2 M et en ré-équilibrant avec un tampon phosphaté 25 rnM, pH 7,5, ou avec de l'eau désionisée distillée (on utilise cette qualité d'eau dans tout ce procédé). On dilue l'éluat rassemblé actif provenant de la colonne de Con A avec un volume égal d'eau et on pompe à raison de 1,5 ml/minute dans la colonne de CM. On lave alors la colonne avec du phosphate de potassium 25 mM, pH 7,5, jusqu'à ce que le niveau de protéine dans l'effluent de la colonne redescende aux niveaux de base, comme on le détermine par contrôle automatique de la colonne avec de la fluorescamine. On élue alors la colonne à raison de 0,5 ml/minute avec un gradient croissant dë KC1 (0 à 1 M) dans un tampon au phosphate de potassium 25 mM, pH 7,5. On détermine par biodosage l'interféron élué à partir de la colonne aux environs du milieu du gradient de sel et les fractions actives.

On rassemble les fractions actives provenant de la colonne de CM et on les concentre sur un cône de filtration CF 25 prélavé (Amicon Corp.). On injecte alors la solution concentrée (0,5 ml ou moins) dans une colonne d'imprégnation sur gel de silice TSK 250 (30 x 0,75 cm) (Bio-Rad Laboratories) préalablement équilibrée et éluée avec KC1 0,3 M, du phosphate de potassium 25 mM, pH 7,5 , à 24 ml/h, et on recueille les fractions à des intervalles d'1 minute. L'activité correspond à un pic de protéine. On peut obtenir un interféron immun homogène en une ou plusieurs fractions à ce stade selon le produit de départ et l'efficacité des étapes antérieures. Si nécessaire, on peut reconcentrer les fractions impures et les rechromatographier sur la colonne de TSK ou CM pour obtenir l'homogénéité.

14

On conduit l'analyse des acides aminés de l'interféron humain homogène préparé à partir de leucocytes humains induits comme il est dit ci-dessus en utilisant une détection post-colonne avec la fluorescamine. On sèche les échantillons sous vide et on les hydrolyse dans HC1 6 N contenant de l'acide thioglycolique à 4% pendant 24 h sous vide à 110°C. Pour l'analyse de l'acide cystéique, on traite les échantillons avec de l'acide performique pendant 2 h à 0°C, on sèche et on hydrolyse dans HC1 6N pendant 24 h sous vide à 110°C. L'analyse des acides aminés de 2 échantillons (un échantillon en double) est donnée ci-dessous au Tableau 2. Il faut noter que l'analyse n'est pas corrigée des pertes en certains acides aminés sensibles (comme le tryptophane, la thréonine et la.serine), ni de l'hydrolyse incomplète.

Tableau 2

Composition en acides aminés de l'interféron immun humain

Opération

A

B

C

Moyenne

Asp

49,7

32,9

32,1

38,2 +

7,6

Thr

28,4

21,2

22,5

24,0 +

2,9

Ser

26,0

19,4

19,1

22,5 +

3,3

Glu

51,0

37,9

41,9

43,6 +

5,1

Pro*

18,6

24,3

21,5 +

3,4

Gly

25,2

22,9

20,9 .

23,0 +

1,5

Al a

26,7

23,2

24,3

24,7 +

1,3

'Val

25,1

24, 3

24,2

24,5 +

1,7

Met

4,0

3,9

4,3

4,1 +

0,2

Ile

18 j 5

18,4

17, 9

18,3 +

0,3

Leu

39,4

40, 0

41,2

40,2 +

0,7

Tyr

10,0

10,8

10,3 +

0,4

Phe

17,8

18,5

18,0 +

0,3

His

5,3

5,2

6,4

5,6 +

0,5

Lys

23,8

32,3

25,0

27,0 +

3,5

Arg

20,0

22,2

22,0

21,4 +

0,7

Trp

1,8

2,7

2,2

2,2 +

0,3

Cys

5,9

4,0

5,0 +

1,0

15

*Les valeurs peuvent être trop élevées, ceci étant du à la présence d'un artéfact.

Comme on l'a souligné ci-dessus, l'activité spécifique observée pour l'interféron immun humain homogène

5 8

est d'environ 1 x 10 unités/mg et le poids moléculaire apparent de la protéine homogène est d'environ 45 000 dalton selon 1'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (gradient 10-20%) dans le DSS en utilisant une charge d'environ 100 ng et en employant une coloration à l'argent.

Exemple 2

Forme posologique parentérale avec de l'interféron immun humain homogène

L'interféron immun humain homogène injectable est une préparation lyophilisée dans des flacons stériles. Chaque flacon contient environ 15 pg d'interféron immun homogène. On reconstitue le tourteau lyophilisé avant l'emploi avec 1 ml d'eau-injectable stérile. Cette préparation convient pour injection intramusculaire et non pour l'utilisation intraveineuse. La formulation peut contenir les ingrédients suivants

20 Ingrédients Quantité par flacon Variation raisonnable ' par flacon "

Interféron immun humain homogène 15 y g 7-23 jig

Chlorure de sodium 9 mg 7-11 mg

Phénol* 3 mg 2- 4 mg

25 Sérum-albumine humaine 5 mg 3-7 mg

Eau injectable* 1 ml 1-2 ml

*Perdu pour la plus grande partie par volatilisation au cours de la lyophilisation.

Monaco

16

5

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Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé pour accroître la pureté de l'interféron immun humain, procédé dans lequel on fait passer une solution contenant de l'interféron immun humain partiellement purifié dans une colonne de chromatographie en phase liquide échangeuse de cations faibles à haute efficacité et on élue les fractions actives contenant l'interféron immun humain de pureté accrue à partir de la colonne par application d'un gradient de concentration croissante de sel.

2. Procédé de la revendication 1 où ladite colonne de chromatographie en phase liquide échangeuse de cations faibles est de carboxyméthyl-silice.

3. Procédé de la revendication 1 où ladite colonne est éluée avec un gradient 0-1 M de KCl dans un tampon au phosphate de potassium, pH 7,5.

4. Procédé pour accroître la pureté de l'interféron immun humain, procédé dans lequel on fait passer une solution contenant de l'interféron immun humain partiellement purifié dans une colonne d'imprégnation sur gel de silice et on élue les fractions actives contenant -l'interféron immun humain de pureté accrue à partir de la colonne en utilisant une solution tamponnée contenant une faible concentration de sel.

5. Procédé de la revendication 4 où ladite solution d'élu-tion est du KCl 0,3 M dans un tampon.au phosphate de potassium 25 mM, pH 7,5.

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6. Procédé pour préparer de l'interféron immun humain homogène, procédé comprenant la combinaison des étapes de traitement suivante:

a) On fait passer une solution d'interféron immun humain

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brut à travers une colonne d'affinité qui adsorbe ledit interféron, on lave les impuretés non adsorbées de ladite colonne et on élue les fractions actives contenant l'interféron immun humain à partir de ladite colonne;

b) On fait passer les fractions actives réunies provenant de l'étape a) dans une colonne de chromatographie en phase liqui de échangeuse de cations faibles à haute efficacité et on élue les fractions actives contenant l'interféron immun humain de pureté améliorée à partir de la colonne en utilisant un gradient de concentration accrue de sel;

c) On fait passer les fractions actives réunies provenant de l'étape b) sur une colonne d'imprégnation sur gel de silice et on élue les fractions actives contenant l'interféron humain de pureté accrue à partir de la colonne en utilisant une solution tamponnée contenant une faible concentration de sel et, si nécessaire d) On recycle les fractions actives réunies provenant de l'étape c) par l'étape b) ou l'étape c) pour fournir l'interféron humain homogène.

7. Procédé de la revendication 6 où ladite colonne d'affinité dans l'étape a) du procédé est de concanavaline A-séphairose, l'interféron immun humain brut est une matière que l'on trouve dans la nature et les fractions actives sont éluées avec une solution tamponnée d'a-méthyl-D-mannoside.

8. Procédé de la revendication 6 où ladite colonne de chromatographie en phase liquide échangeuse de cations faibles de l'étape b) est de carboxyméthyl-silice et ladite«colonne est éluée avec un gradient 0-1 M de KCl dans un tampon au phosphate de potassium, pH 7,5.

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9. Procédé de la revendication 6 où ladite colonne d'imprégnation sur gel de silice est éluée avec une solution qui est du KCl 0,3 M dans un tampon au phosphate de potassium

25 mM, pH 7,5.

10. Procédé cfe préparation d'une forme posologique parentérale, procédé dans lequel on mélange de l'interféron immun humain homogène avec un support approprié à l'application parentérale et des adjuvants thérapeutiquement compatibles et on amène le mélange obtenu sous une forme posologique appropriée comprenant, si on le désire, la lyophilisation d'une solution aqueuse.

11. Forme posologique parentérale comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un interféron immun humain homogène et un support parentéral pharmaceutiquement acceptable .

12. Interféron immun humain sous la forme d'une protéine homogène, qu'elle soit préparée selon un procédé revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou par un de ses équivalents chimiques évidents.

13. Interféron immun humain et procédés pour sa préparation tels que décrits ci-dessus, en particulier avec référence aux exemples.

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José CURAU

Conseil en Propriété Industrielle

26bis, Boul. princesse Charlotte