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WO2013127782A2 - Verwendung von micrornas oder genen als marker zur identifizierung, diagnose und therapie einzelner formen nicht-ischämischer kardiomyopathien oder speichererkrankungen des herzens - Google Patents

Verwendung von micrornas oder genen als marker zur identifizierung, diagnose und therapie einzelner formen nicht-ischämischer kardiomyopathien oder speichererkrankungen des herzens Download PDF

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WO2013127782A2
WO2013127782A2 PCT/EP2013/053800 EP2013053800W WO2013127782A2 WO 2013127782 A2 WO2013127782 A2 WO 2013127782A2 EP 2013053800 W EP2013053800 W EP 2013053800W WO 2013127782 A2 WO2013127782 A2 WO 2013127782A2
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
hsa
mir
cardiomyopathy
virus
Prior art date
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Ceased
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PCT/EP2013/053800
Other languages
English (en)
French (fr)
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WO2013127782A3 (de
Inventor
Uwe Kühl
Heinz-Peter Schultheiss
Dirk Lassner
Maria ROHDE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IKDT INSTITUT KARDIALE DIAGNOSTIK und THERAPIE GmbH
Charite Universitaetsmedizin Berlin
Original Assignee
IKDT INSTITUT KARDIALE DIAGNOSTIK und THERAPIE GmbH
Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IKDT INSTITUT KARDIALE DIAGNOSTIK und THERAPIE GmbH, Charite Universitaetsmedizin Berlin filed Critical IKDT INSTITUT KARDIALE DIAGNOSTIK und THERAPIE GmbH
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Priority to EP13712154.7A priority patent/EP2820131A2/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • microRNAs or genes as markers for the identification, diagnosis and therapy of individual forms of non-ischemic cardiomyopathies
  • the invention relates to the use of certain microRNAs and specific genes as markers for the identification of individual forms of non-ischemic cardiomyopathies or storage diseases of the heart according to the preamble of claim 1, a diagnostic system for identifying different forms of non-ischemic cardiomyopathies or storage diseases of the heart according to the preamble of Claim 4, a method for identifying and distinguishing individual forms of non-ischemic cardiomyopathies or storage diseases of the heart according to the preamble of claim 1 1 and a drug containing microRNAs, according to the preamble of claim 13.
  • the invention further relates to novel uses of the genotype in Referring to a deletion in the CCR5 gene as a biomarker according to the preambles of claims 14 and 15.
  • Cardiovascular diseases are by far the most common cause of death in western countries today. The incidence of heart failure in Europe and the US is 12 and 15 million, respectively. With approximately 4 million (30%) patients in Europe, dilated cardiomyopathy (DCM) is the most common form of non-ischemic cardiomyopathy. The 5-year survival rate for this viral inflammatory heart disease is 50% without specific treatment. Furthermore, severe cardiac injury developed in 45% of all transplant patients on the basis of an existing DCM. The high incidence of non-ischemic cardiomyopathy and the enormous health economic consequences of these diseases require an early and specific diagnosis of the individual subforms and a targeted therapy based thereon. This applies in the same way to memory diseases of the heart, such as amyloidosis-related cardiomyopathies.
  • Cardiomyopathy refers to diseases of the heart muscle itself, which are not primarily caused as a result of other diseases of the cardiovascular system. These diseases are therefore based neither on a mechanical overload (eg due to high blood pressure or a valve defect), nor to a lack of blood flow to the coronary arteries (coronary heart disease).
  • non-ischemic cardiomyopathy and heart disease In contrast to coronary heart disease with multiple diagnostic options, there are no specific, non-invasive diagnostic parameters for the various forms of non-ischemic cardiomyopathy and heart disease. Because of their multiple origins, non-ischemic cardiomyopathy and heart disease can only be diagnosed accurately with invasive methods (myocardial biopsy) with the aim of achieving further therapy-relevant differentiation of the individual clinical pictures.
  • cardiomyopathy diagnostics The gold standard for cardiomyopathy diagnostics is myocardial biopsy, which is only performed in individual cardiology centers and in a few countries and even there only in a very limited number of patients. In addition, for the most part, only a histological examination of the heart material is carried out without the necessary immunohistochemical inflammation differentiation and the molecular-biological investigations on viral infections.
  • microRNAs have been recognized as important regulators of genetic expression, including their importance in the development of heart muscle diseases.
  • MicroRNAs are single-stranded, short ribonucleic acid molecules (RNA molecules) of 17 to 24 bases in length, which directly interfere with gene regulation. In particular, the degradation of the target RNA or its translation are controlled. MicroRNAs form a new regulatory cycle of disease-related and tissue-specific gene expression. Increasingly, circulating microRNAs in human serum or in peripheral blood cells are being used as stable biomarkers for the diagnosis of various diseases and for the monitoring of applied therapies.
  • Voellenkle et al. have described in the publication "MicroRNA signatures in peripheral blood mononuclear cells of chronic heart failure patients", Physiol. Genomics 42 (2010), pages 420-426, various microRNAs by which healthy individuals from patients with ischemic cardiomyopathy (ICM) or with However, a distinction between patients with ischemic cardiomyopathy and patients with non-ischemic dilated cardiomyopathy was not possible on the basis of the identified microRNAs.
  • ICM ischemic cardiomyopathy
  • ICM ischemic cardiomyopathy
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • AS aortic stenosis
  • WO 2009/012468 A2 discloses various miRNAs as biomarkers which are used to generally diagnose heart failure.
  • the rough diagnosis described in this international patent application relates to a distinction between ischemic cardiomyopathy on the one hand and idiopathic dilated cardiomyopathy on the other hand.
  • ischemic cardiomyopathy on the one hand
  • idiopathic dilated cardiomyopathy on the other hand.
  • WO 2010/097471 proteins are described which play a role in the apoptosis of cardiomyocytes. These proteins are thereby identified via miRNAs, which are also to be used for the treatment of heart failure. However, a differential diagnosis with respect to different non-ischemic cardiomyopathies or cardiac memory diseases is not described.
  • microRNAs are used as markers for the identification of non-ischemic cardiomyopathies or memory diseases of the heart. In this way it is possible to distinguish the individual non-ischemic cardiomyopathies from one another or from storage diseases of the heart or the individual storage diseases of the heart from one another.
  • the microRNA is selected from the group consisting of the following microRNAs:
  • microRNA designations are clearly known to the person skilled in the art as unique designations of different microRNA sequences.
  • sequences standing behind these designations can be queried, for example, in the freely accessible database miRBase (accessible at the Internet address http://www.mirbase.org). They are also listed in the attached sequence listing. If individual of the abovementioned designations are used both for a stem-loop structure and for a mature microRNA sequence, the mature microRNA sequence, which is also known to the person skilled in the art under the English-language term "mature sequence", is the one behind each This is also evident from the appended sequence listing.
  • genes are used as markers to identify individual non-ischemic cardiomyopathies or memory diseases of the heart.
  • the genes are selected from the group consisting of the genes listed below, each specific portion of these genes are used, which are given in the attached sequence listing.
  • the sections used usually correspond to one or more exons of these genes.
  • the genes ATP6, CYB, ND1 and ND4 are mitochondrially encoded genes that do not have exons so that they are used in full length.
  • the TLR9 gene also uses the full-length gene.
  • the claimed invention is based on the concept of using microRNAs and / or genes as markers to identify the presence of a subtype (ie, a form) of non-ischemic cardiomyopathy or memory disease of the heart. In the present case, therefore, it is not a question of distinguishing healthy patients from sick patients or distinguishing any myocardial diseases from each other, but rather specific subgroups or forms of non-ischemic cardiomyopathies and subgroups or forms of memory diseases of the heart as well as subgroups or forms of infections of the heart Cardiac muscle, even without cardiomyopathic manifestations, to identify what clinically not possible.
  • microRNAs or genes are used in the context of a microRNA profile diagnostics or gene expression analysis, it is possible to identify patients with a non-ischemic cardiomyopathy, a memory disease of the heart or an infection of the heart muscle without cardiomyopathic manifestations in a specific subgroup and also to treat the respective clinical picture in a targeted manner at an early stage. It is possible to use the genes as complementary markers in microRNA profile diagnostics and vice versa.
  • the expression rates of the aforementioned microRNAs and genes are determined in a quantitative or semi-quantitative manner. From an increased expression of certain microRNAs and / or a reduced expression of other specific microRNAs can then diagnose a certain form of non-ischemic cardiomyopathy or a storage disease of the heart.
  • the abovementioned nucleic acids have proven to be particularly suitable for the specific diagnosis of individual non-ischemic cardiomyopathies and storage disorders of the heart. Some of the nucleic acids are so specific for certain diseases to be diagnosed that they can be used alone as specific markers. Other nucleic acids are not specific for a single disease to be diagnosed but, for example, for two diseases to be diagnosed.
  • nucleic acids are preferably not used alone, but in combination with other nucleic acids from the above list. But even with specific nucleic acids, it is advisable to refine the diagnosis of using these not individually, but in combination with other nucleic acids in the above list. In this way, the validity of diagnostic tests can be stabilized.
  • the microRNAs or genes it is also possible to use synthetic nucleic acid molecules which have an identical or complementary sequence to the abovementioned microRNAs or genes.
  • the microRNAs and / or genes of the above list are used in the form of diagnostically relevant profiles.
  • a profile may for example consist of at least or exactly 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200 , 250, 300, 400, 500, 600 or all microRNAs and / or genes in the above list.
  • microRNAs are used as single markers or in diagnostic profiles of different microRNAs.
  • diagnostic profiles of different microRNAs it is also possible to use a more complex diagnostic profile of different microRNAs for the diagnosis of the various diseases to be diagnosed. This has the advantage that with a single diagnostic profile a wide variety of diagnoses can be made, such a profile is thus universally applicable within the given question.
  • the detection of the abovementioned microRNAs and the determination of the respective gene expressions can each be carried out individually.
  • Complex diagnostic systems consist of detection components for both nucleic acid groups.
  • the non-ischemic cardiomyopathies or storage disorders of the heart are selected from the group comprising virus-free dilated cardiomyopathy, virus-induced or virus-free inflammation-induced cardiomyopathy, virally-induced cardiomyopathy, cardiomyopathy with limited left ventricular ejection fraction, inflammatory cardiomyopathy, adenovirus-induced cardiomyopathy, enterovirus-induced cardiomyopathy, Coxsackievirus-induced cardiomyopathy (which is a special form of enterovirus-induced cardiomyopathy), HHV6 virus-induced cardiomyopathy, chromosomally-integrated HHV6 (ciHHV6) virus-induced cardiomyopathy, erythroid-induced cardiomyopathy, myocarditis with high incidence of inflammatory cells, giant cell myocarditis, and amyloidosis.
  • virus-free dilated cardiomyopathy in a virus-free dilated cardiomyopathy without inflammation of the myocardium or in a virus-free dilated cardiomyopathy with inflammation of the myocardium is preferably possible.
  • enterovirus (coxsackievirus) -induced cardiomyopathy in enterovirus (coxsackievirus) -induced cardiomyopathy with spontaneous clearance of the virus by the patient's own immune system or in enterovirus (coxsackievirus) -induced cardiomyopathy without spontaneous elimination of the virus to differentiate the patient's own immune system.
  • myocarditis with a high incidence of inflammatory cells can also be distinguished into acute myocarditis or borderline myocarditis. Borderline myocarditis is characterized by many inflammatory cells in the heart muscle, with no myozytenunter réelle are detectable. The aforementioned breakdowns of individual diseases into finer subclasses can be combined with each other in any manner.
  • microRNAs and genes of the above list are to be understood throughout as human sequences.
  • a restricted ejection fraction is considered to be an ejection fraction that is less than 50% of the normal ejection fraction.
  • the microRNA to be used as a marker is selected from the group consisting of all those microRNAs which score 1 or 1 for the diagnosis of a specific non-ischemic cardiomyopathy or a specific memory disease of the heart in the examinations which are explained in the examples presented below 2 has been assigned. These are the following microRNAs, which are a selection from the microRNAs listed above:
  • the nucleic acids to be used as markers are selected from the group which does not directly include those microRNAs or genes which are responsible for the diagnosis a specific non-ischemic cardiomyopathy or a memory disease of the heart in the examinations, which are explained in the examples below, the score 3 or 4 was assigned. In this case, individual, several or all of these microRNAs or genes provided with the scores 3 or 4 can be excluded from the scope of protection.
  • the invention also relates to a diagnostic system for the identification of individual non-ischemic cardiomyopathies or memory diseases of the heart.
  • a diagnostic system for the identification of individual non-ischemic cardiomyopathies or memory diseases of the heart.
  • Such a system comprises at least one probe having a sequence corresponding to or complementary to the microRNAs or genes from the group as described above.
  • the diagnostic system has at least or exactly 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 or 600 such probes.
  • all the microRNAs / genes of the above list are contained in identical or complementary sequence in the diagnostic system as a probe.
  • the diagnostic system thus has a determinable number of diagnostically relevant microRNA sequences and / or gene sequences which represent a diagnostically relevant microRNA profile and / or gene profile in the system. MicroRNA sequences can be shared in any manner with gene sequences.
  • the diagnostic system has a means for detecting an additional prognostic marker.
  • this prognostic marker is a deletion in the CCR5 gene, in particular a 32 base pair deletion (CCR5 del-32 markers).
  • CCR5 del-32 markers are a positive prognostic marker for the occurrence of diabetes in patients with cardiomyopathy, a positive prognostic marker for myocardial infections with enterovirus infections and erythro virus HHV6 single and double infections (most common cardiotropic viruses) positive prognostic marker for the 7-year mortality of patients with cardiomyopathy.
  • the CCR5 del-32 marker is a positive prognostic marker (predictor) in cardiomyopathy patients for lower mortality, fewer myocardial infections, and fewer systemic diseases such as diabetes.
  • a diagnostic system for identifying the genotype related to a deletion in the CCR5 gene comprises at least one probe having a sequence which corresponds to or is complementary to a portion of the CCR5 gene.
  • the selected probe enables the determination of sequences of a gene segment within which the 32-base-pair deletion known per se occurs.
  • the diagnostic system is in the form of a kit for performing a polymerase chain reaction (PCR), wherein the probes are also provided as primers in solution.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the probes are also provided as primers in solution.
  • carrier plates with a large number of wells (for example, 384, or even 400-3000 wells)
  • such a system allows numerous PCRs to be performed simultaneously, making this system suitable for a large number of probes.
  • the diagnostic system is in the form of a nucleic acid chip. It can be provided in particular that at least 5 probes are applied for each nucleic acid to be detected on the chip. In this way, the expression of microRNAs or genes can preferably be measured semi-quantitatively.
  • a chip has the advantage that the presence of numerous different microRNAs in the examined sample can be detected simultaneously. The number of simultaneously detectable microRNAs is still much larger than in the case of a PCR. In particular with a larger number of probes (for example more than 25, but in particular more than 100 or more than 1000 probes), the use of a chip is particularly suitable for reasons of efficiency.
  • the claimed invention also relates to a method of identifying and distinguishing individual forms of non-ischemic cardiomyopathies or cardiac memory diseases comprising the following steps. First, a sample is obtained which has been obtained from a patient suspected of having a non-ischemic cardiomyopathy or memory disease of the heart. Subsequently, the sample is contacted directly or after previous biochemical modification with at least one probe, wherein the probe has a sequence which corresponds to the sequences of the microRNAs and / or the genes from the above lists or is complementary to these. This contacting occurs under conditions that involve hybridization between in the sample Allow microRNAs and / or genes on one side and at least one probe on the other side. It is then determined whether a hybridization between the microRNAs or the genes of the sample and the at least one probe has occurred. Subsequently, it is determined on the basis of this hybridization result which microRNA (s) or genes are present in the sample.
  • the sample is preferably a total RNA extract which originates from a tissue sample of the patient which has a proportion of microRNAs in addition to the mRNA.
  • genomic DNA is used as a sample.
  • the tissue sample may comprise a whole tissue of the patient, such as myocardial tissue or blood. Alternatively, the tissue sample may also comprise only a portion of a tissue, such as red or white blood cells or blood serum or blood plasma.
  • the tissue sample may also comprise other body fluid of the patient, which need not necessarily be a tissue. The tissue sample is thus a treated or untreated sample taken from the patient. From this sample, an RNA extract is then obtained before the start of the process, which is used as a sample in the presently claimed method.
  • the invention also relates to a medicament for the treatment of non-ischemic cardiomyopathies or storage disorders of the heart, which contains as pharmaceutically active substance at least one nucleic acid having a sequence which is identical or complementary to the sequence of one of the microRNAs according to the above explanations other type affects the formation of microRNAs as explained above.
  • a medicament can serve to increase the content of a particular microRNA in the blood or in the cells of a patient so as to enhance the positive properties of this microRNA with regard to a specific clinical picture. It can also be used to eliminate a particular microRNA whose content is increased in a particular clinical picture by hybridization or a comparable interaction in order to counteract the negative effect of this microRNA on the corresponding clinical picture.
  • the selected nucleic acid or group of nucleic acids is the sole pharmaceutically active ingredient of the subject medicament.
  • the medicament is preferably suitable not only for therapeutic purposes but also for diagnostic purposes.
  • the invention also relates to the therapeutic use of the illustrated microRNAs or nucleic acid sequences which are identical or complementary to these microRNAs, in particular for the treatment or therapy of non-ischemic cardiomyopathies or storage disorders of the heart.
  • the invention further relates to the use of the genotype with respect to a deletion in the CCR5 gene as a biomarker in order to provide a decision-making aid as to whether or not beta-interferon therapy is indicated in a patient.
  • the deletion is preferably the 32-base-pair deletion known per se in the CCR5 gene.
  • the genotype is determined in vitro on the basis of a patient sample, which was previously taken from a patient; So there is no diagnosis on the body of the patient.
  • the decision-making aid offered does not constitute a therapy or a therapeutic treatment. This takes place only when, taking into account the decision-making aid offered, an independent therapy decision has been made, and is not the subject of the present invention.
  • the invention further relates to the use of the genotype with respect to a deletion in the CCR5 gene as a prognostic marker indicative of increased 7-year mortality and / or virus spontaneous clearance in cardiomyopathy patients.
  • this prognostic marker relates to patients with enterovirus (coxsackievirus) -induced cardiomyopathy.
  • Preferred embodiments of the use of the microRNAs shown above and subsequently explained in connection with the examples can also be transferred to a corresponding therapeutic application in an analogous manner. In all of this, a sequence that is at least 90%, in particular at least 95%, and most especially at least 99% identical to the sequence of one of the mentioned microRNAs or genes, considered as "identical" within the meaning of the present invention.
  • Fig. 1 is a graphical representation of the quantitatively determined differential
  • 3 is a graphical representation of the prognostic relevance of the 32 base pair deletion of the CCR5 gene to a double infection with erythroid virus and HHV6 in cardiomyopathy patients,
  • 6A is a second graph showing the prognostic relevance of the 32 base pair deletion of the CCR5 gene on 7-year mortality in cardiomyopathy patients with myocardial enterovirus infection
  • Fig. 6B is a graphic representation of the relevance of the 32 base pair deletion of
  • Fig. 6C is a graph showing the relevance of spontaneous elimination of enterovirus (coxsackievirus) on 7-year mortality in cardiomyopathy patients with myocardial enterovirus infection.
  • Fig. 6D is a graphical representation of the relevance of the 32 base pair deletion of
  • 6E is a graph showing the relevance of the number of inflammatory cells to the survival rate of myocardial cardiomyopathy patients
  • Fig. 7 is a graphical representation of the quantitatively determined differential
  • Fig. 8 is a graphical representation of the quantitatively determined differential
  • FIG. 9 is a graphical representation of the quantified differential
  • FIG. 1 1 A is a schematic overview of the possibilities of diagnosis and treatment of cardiomyopathies according to the prior art (clinical diagnostics without myocardial biopsy) and Fig. 1 1 B is a schematic overview of the possibilities of diagnosis and treatment of cardiomyopathies, taking into account the present invention.
  • Figures 1 to 5 will be explained in connection with Example 26.
  • FIGS. 6 to 9 will be explained in connection with Example 27.
  • Example 1 Diagnosis of adenovirus-induced cardiomyopathies by means of a biopsy sample
  • RNA extract an extract of the total RNA of the respective biopsy
  • microRNA components This total RNA extract was then analyzed for the presence of specific microRNAs using two variants.
  • RNA chip The RNA of the total RNA extract was labeled with biotin, applied to an RNA chip and incubated for 16 hours. Such an RNA chip is sometimes referred to as a DNA chip because it contains DNA probes. However, these are intended for RNA detection, for which reason the term "RNA chip” is used here ..
  • RNA molecules were subsequently detected with the fluorescent dye streptavidin-phycoerythrin, which binds to biotin, and by determining the fluorescence intensity of the bound streptavidin-phycoerythrin, the amount of hybridized microRNA could be determined in a semiquantitative manner.
  • RNA chips For the individual process steps, standard buffers recommended by the respective manufacturer of the RNA chips were used. These are generally familiar to the person skilled in the art. For the detection of mRNA "whole genome chips" of the company Affymetrix were used and for the microRNA among other things microRNA chips of the company febit biomed.
  • Variant 2 (PCR gene map) The microRNA contained in the total RNA extract was used for the synthesis of cDNA. Depending on the amount of cDNA obtained, this was pre-amplified if necessary. Subsequently, the cDNA was applied to a card and a quantitative PCR was performed. In this way, a relative quantification of the individual cDNAs in real time on the relative fluorescence to mitampl en budget genes (ie to constitutively expressed microRNAs) take place.
  • microRNAs were identified whose expression was modified compared to samples derived from patients with other non-ischemic cardiomyopathies or memory disease of the heart.
  • Table 1 below lists the identified microRNAs whose expression is modified in adenovirus-induced cardiomyopathy. Furthermore, this table indicates the nature of this modification. For this purpose, a point value was calculated taking into account the results explained in the following examples and it was determined whether the expression of the respective microRNA was high or downregulated.
  • a score of 1 means that the observed expression modification is specific for one of the considered non-ischemic cardiomyopathies or memory diseases of the heart and only occurs significantly changed in this.
  • MicroRNAs with a score of 1 are therefore specific markers for adenovirus-induced cardiomyopathy. Their marker function can exert these microRNAs by an increased expression (upregulation) or a reduced expression (downregulation).
  • a score of 1 indicates microRNAs that allow for unambiguous identification of a disease, even if it is not known what the observed modification of expression is.
  • a score of 2 means that the observed expression modification is specific for two of the non-ischemic cardiomyopathies or memory diseases of the heart considered and occurs only in these two diseases. The expression is increased in the case of the first of these two diseases and lowered in the case of the second of these two diseases.
  • MicroRNAs that have a score of 2 are therefore specific markers for adenovirus-induced cardiomyopathy, if it is additionally known whether their expression is up-regulated or downregulated.
  • a score of 2 denotes microRNAs which allow a clear identification of a disease, if it is additionally known which species is the observed modification of the expression.
  • a score of 3 means that the observed expression modification is significant for several of the non-ischemic cardiomyopathies or memory diseases of the heart considered.
  • the expression in the case of two diseases is the same modified, ie either increased or decreased.
  • the expression is inversely modified, either decreased or increased.
  • MicroRNAs which are assigned a score of 3, are therefore in themselves nonspecific markers for adenovirus-induced cardiomyopathy, since they could also indicate a different clinical picture.
  • another microRNA marker which is either specific or also non-specific, a clear determination of an adenovirus-induced cardiomyopathy can already be made possible.
  • a score of 4 means that the observed expression modification is significant for exactly two of the non-ischemic cardiomyopathies or memory diseases of the heart considered.
  • the expression is in both cases the same way modified, so either increased or decreased.
  • MicroRNAs which are assigned a score of 4 are therefore in themselves nonspecific markers for adenovirus-induced cardiomyopathy, since they could also indicate a different clinical picture.
  • another microRNA marker which is either specific or also non-specific, a clear determination of an adenovirus-induced cardiomyopathy can already be made possible.
  • this applies only if its expression is modified in another disease other than that of the further disease in which the expression of the first non-specific marker is likewise modified.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 1 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of adenovirus-induced cardiomyopathy.
  • Example 2 Diagnosis of enterovirus-induced (coxsackievirus-induced)
  • Cardiomyopathies by means of a biopsy sample
  • Example 2 The procedure was analogous to Example 1, except that the biopsy specimens were taken from patients suffering from enterovirus-induced cardiomyopathy or coxsackievirus-induced cardiomyopathy as a special case of enterovirus-induced cardiomyopathy.
  • the identified microRNAs whose expression is modified in such enterovirus (coxsackievirus) induced cardiomyopathy are listed in Table 2 below. With regard to the scores, reference is made to the Explanatory Notes to Example 1.
  • Example 3 Diagnosis of enterovirus (coxsackievirus) -induced cardiomyopathies with spontaneous elimination of the virus by the patient's immune system using a biopsy sample
  • Example 2 The procedure was analogous to Example 1, except that the biopsy specimens were taken from patients suffering from enterovirus (coxsackievirus) -induced cardiomyopathy, but later a spontaneous elimination of the virus by the patient's own immune system took place. These patients do not require drug treatment of the viral infection.
  • enterovirus coxsackievirus
  • Table 3 The identified microRNAs whose expression is modified in such enterovirus (coxsackievirus) induced cardiomyopathy are listed in Table 3 below. With regard to the scores, reference is made to the Explanatory Notes to Example 1.
  • the invention relates to the use of microRNAs provided with a score of 1 and / or 2 in Tables 2 or 3 individually or in any combination with each other as markers for the identification of enterovirus (coxsackievirus) -induced cardiomyopathy, especially one Enterovirus (coxsackievirus) -induced cardiomyopathy with spontaneous elimination of the virus by the patient's own immune system.
  • enterovirus coxsackievirus
  • Example 4 Diagnosis of enterovirus (coxsackievirus) -induced cardiomyopathies without spontaneous elimination of the virus by the patient's immune system by means of a biopsy sample
  • Example 2 The procedure was analogous to Example 1, except that the biopsy specimens were taken from patients suffering from enterovirus (coxsackievirus) -induced cardiomyopathy, but in which later no spontaneous elimination of the virus by the patient's own immune system took place, so that a virus persistence in need of treatment developed.
  • enterovirus coxsackievirus
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided with a score of 1 and / or 2 in Table 4 individually or in any combination with one another as markers for the identification of enterovirus (coxsackievirus) -induced cardiomyopathy, in particular an enterovirus (Coxsackievirus-) induced cardiomyopathy without spontaneous elimination of the virus by the patient's own immune system.
  • Example 5 Diagnosis of amyloidosis of the heart by means of a biopsy sample
  • Example 2 The procedure was analogous to Example 1, except that the biopsy samples were taken from patients suffering from amyloidosis of the heart.
  • Amyloidosis is a typical memory disorder of the heart and is characterized by amyloid deposits in the heart muscle.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 5 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for identifying a storage disease of the heart, in particular an amyloidosis of the heart.
  • Example 6 Diagnosis of myocarditis with high incidence of inflammatory cells by means of a biopsy sample
  • Example 2 The procedure was analogous to Example 1, except that the biopsy samples were taken from patients who were suffering from an intramyocardial inflammation with a high incidence of inflammatory cells. An increased influx of inflammatory cells is present when there are more than 14 inflammatory cells per mm 2 of tissue in the inflamed tissue. This is called borderline myocarditis. If it is also possible to detect histopathologically myocyte deaths, this is called active / acute myocarditis. Active myocarditis is also present if histological evidence of an inflammatory cell-associated loss of cardiomyocytes is present without exceeding the above-mentioned cell number.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 6 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of a myocarditis with a high incidence of inflammatory cells.
  • Example 7 Diagnosis of giant cell myocarditis by means of a biopsy sample
  • Example 2 The procedure was analogous to Example 1, except that the biopsy samples were taken from patients suffering from giant cell myocarditis.
  • a giant cell myocarditis is characterized by the appearance of polynuclear giant cells accompanying acute myocarditis in the heart muscle. Since untreated giant cell myocarditis usually takes a fatal course, this form of acute myocarditis must be accurately determined, which is currently possible only by histological review of paraffin sections. However, the detection of multinucleated giant cells rarely succeeds. In suspected cases often 10 or more heart muscle biopsies must be cut open so that a histological evidence can be found, which almost no cardiology center performs worldwide. The identified microRNAs whose expression is modified in such giant cell myocarditis are listed in Table 7 below. With regard to the scores, reference is made to the Explanatory Notes to Example 1.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 7 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of a giant cell myocarditis.
  • Example 8 Diagnosis of a virus-free, dilated cardiomyopathy with or without inflammation of the myocardium by means of a biopsy sample
  • the procedure was analogous to Example 1, except that the biopsy specimens were taken from patients suffering from a virus-free, dilated cardiomyopathy with inflammation of the myocardium or from a virus-free dilated cardiomyopathy without inflammation of the myocardium.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 8 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of a virus-free dilated cardiomyopathy.
  • Example 2 The procedure was analogous to Example 1, except that the biopsy samples were taken from patients suffering from erythroid-induced cardiomyopathy.
  • the erythroid virus causing such cardiomyopathy occurs in two subtypes, genotype 1 being known as parvovirus B19 and erythroid virus B19, respectively.
  • genotype 1 being known as parvovirus B19 and erythroid virus B19, respectively.
  • the parvovirus plays only a minor role, so that in the present case no distinction should be made of the erythroid virus in its genotypes.
  • the identified microRNAs whose expression is modified in such erythroid-induced cardiomyopathies are listed in Table 9 below. With regard to the scores, reference is made to the Explanatory Notes to Example 1.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 9 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of an erythroid-induced cardiomyopathy.
  • Example 2 The procedure was analogous to Example 1, except that the biopsy specimens were taken from patients suffering from erythroid-induced cardiomyopathy without inflammation of the myocardium and with a normal ejection fraction.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 10 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with one another as markers for the identification of an erythroid-induced cardiomyopathy, in particular an erythroid-induced cardiomyopathy without inflammation of the myocardium and with normal ejection fraction.
  • Example 1 Diagnosis of erythroid-induced cardiomyopathy with inflammation of the myocardium and with restricted ejection fraction by means of a biopsy sample
  • Example 2 The procedure was analogous to Example 1, except that the biopsy specimens were taken from patients suffering from an erythroid-induced cardiomyopathy with inflammation of the myocardium and with a restricted ejection fraction.
  • the ejection fraction observed in the patients was less than 50% of a normal ejection fraction.
  • the identified microRNAs whose expression is modified in such erythroid-induced cardiomyopathies are listed in Table 1 below. With regard to the scores, reference is made to the Explanatory Notes to Example 1.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 11 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with one another as markers for the identification of an erythroid-induced cardiomyopathy, in particular of an erythroid-induced cardiomyopathy Inflammation of the myocardium and with limited ejection fraction.
  • Example 12 Diagnosis of inflammation-induced cardiomyopathy by means of a
  • biopsy sample The procedure was analogous to Example 1, except that the biopsy specimens were taken from patients suffering from inflammation-induced cardiomyopathy.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 12 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of an inflammation-induced cardiomyopathy.
  • Example 13 Diagnosis of Virally Induced Cardiomyopathy Using a Biopsy Sample The procedure was analogous to Example 1, except that the biopsy samples were taken from patients suffering from a viral-induced cardiomyopathy (caused by an erythroid virus or an enterovirus). The identified microRNAs whose expression is modified in such virally induced cardiomyopathies are listed in Table 13 below. With regard to the scores, reference is made to the Explanatory Notes to Example 1.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 13 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of a virally induced cardiomyopathy.
  • Example 14 Diagnosis of myocarditis with high incidence of inflammatory cells by means of a blood cell sample
  • the detection of specific gene expression or microRNAs for various forms of non-ischemic cardiomyopathy can also be done in blood cells.
  • the corresponding pattern of expressed nucleic acids in blood cells differs significantly from that in cardiac muscle biopsies.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 14 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of a myocarditis with a high incidence of inflammatory cells.
  • Example 15 Diagnosis of myocarditis with high incidence of inflammatory cells without myeloid (borderline myvocarditis) by means of a blood cell sample
  • Example 14 The procedure was analogous to Example 14, except that the blood cell samples were taken from patients who had increased inflammatory cells without histological detection of myocyte sinking (borderline myocarditis) in the myocardium.
  • the identified microRNAs whose expression is modified in such myocarditis with a high influx of inflammatory cells are listed in Table 15 below. With regard to the scores, reference is made to the Explanatory Notes to Example 1.
  • Example 16 Diagnosis of myocarditis with high incidence of inflammatory cells with detectable Mvozvtenunterqänqen (active / acute myocarditis) using a blood cell sample
  • Example 14 The procedure was analogous to Example 14, except that the blood cell samples were taken from patients who had an increased number of inflammatory cells with a histological detection of Myozytenunter réelle in heart muscle.
  • Example 17 Diagnosis of an inflammatory heart muscle by means of a blood cell sample
  • Example 14 The procedure was analogous to Example 14, except that the blood cell samples were taken from patients who had no increased incidence of inflammatory cells in the heart.
  • microRNAs whose expression is present in an inflammation-free myocardium are listed in Table 17 below. With regard to the scores, reference is made to the Explanatory Notes to Example 1.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 17 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of an inflammation-free myocardium.
  • Example 18 Diagnosis of cardiac amyloidosis by means of a blood cell sample
  • the procedure was analogous to Example 14, except that the blood cell samples were taken from patients who were suffering from amyloidosis of the heart.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 18 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with one another as markers for identifying a memory disorder of the heart, in particular an amyloidosis of the heart.
  • Example 19 Diagnosis of a virus-free dilated cardiomyopathy with or without inflammation of the myocardium by means of a blood cell sample
  • the procedure was analogous to Example 14, except that the blood cell samples were taken from patients who were suffering from a virus-free dilated cardiomyopathy with inflammation of the myocardium or a virus-free dilated cardiomyopathy without inflammation of the myocardium.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 19 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of a virus-free dilated cardiomyopathy.
  • Example 20 Diagnosis of a ciHHV6-Induced Cardiomyopathy by means of a
  • ciHHV6 denotes a special form of human herpesvirus 6. This virus has the property of being incorporated into the chromosomes of the host; This is called chromosomal integration of HHV6 (ciHHV6).
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 20 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with one another as markers for identifying an HHV6-induced cardiomyopathy, in particular a cardiomyopathy with ciHHV6 expression.
  • Example 21 Diagnosis of a virus-free dilated cardiomyopathy without inflammation of the myocardium by means of a blood serum sample
  • the detection of specific microRNAs for various forms of non-ischemic cardiomyopathy can also be done in serum.
  • the corresponding pattern of expressed nucleic acids in serum differs from that in cardiac muscle biopsies or in blood cells.
  • RNA extract was then obtained analogously to Example 1 and further processed and analyzed according to the methods described there.
  • Table 21 Expression modifications of microRNAs in dilated cardiomyopathy with or without inflammation of the myocardium.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 21 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of a virus-free dilated cardiomyopathy.
  • Example 22 Diagnosis of myocarditis with high incidence of inflammatory cells by means of a blood serum sample
  • Example 21 The procedure was analogous to Example 21, except that the blood serum samples were taken from patients suffering from myocarditis with a high incidence of inflammatory cells. Analogously, this includes the histological detection of inflammation-cell-associated death of cardiomyocytes without exceeding the above-mentioned number of cells.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 22 with a score of and / or 2 individually or in any combination with one another as a marker for the identification of myocarditis with a high incidence of inflammatory cells.
  • Example 23 Diagnosis of myocarditis with high incidence of inflammatory cells without myocyte subset by means of a blood serum sample The procedure was analogous to Example 21, except that the blood serum samples were taken from patients suffering from myocarditis with a high incidence of inflammatory cells.
  • the identified microRNAs whose expression is modified in such myocarditis with a high incidence of inflammatory cells are listed in Table 23 below. With regard to the scores, reference is made to the Explanatory Notes to Example 1.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 23 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of a myocarditis with a high incidence of inflammatory cells, but without myocyte declines.
  • Example 24 Diagnosis of myocarditis with high incidence of inflammatory cells and cell subsets in the heart muscle by means of a blood serum sample
  • the procedure was analogous to Example 21, except that the blood serum samples were taken from patients who had a myocarditis with histological evidence of inflammatory cell-associated death of cardiomyocytes, even without exceeding the above-mentioned cell number.
  • the invention relates to the use of microRNAs provided in Table 24 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of myocarditis with a high incidence of inflammatory cells and simultaneous cell deaths in the myocardium.
  • EXAMPLE 25 Diagnosis of an Inflammatory Heart Muscle Using a Blood Serum Sample The procedure was analogous to Example 21, except that the blood serum samples were taken from patients who had no increased influx of inflammatory cells of the heart.
  • the invention relates to the use of microRNAs provided in Table 25 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of myocarditis without increased influx of inflammatory cells.
  • Example 26 CCR5 del 32 as an independent prognostic marker in patients with cardiomyopathies
  • cardiomyopathies are also developed by viral infections of the heart or inflammation-associated processes in the affected myocardium.
  • a known polymorphism in the CC chemokine receptor 5 (CCR5) gene which involves a deletion of 32 base pairs in this gene, results in a functionally impaired macrophage coreceptor. This provides protection against viral infections. Furthermore, the inflammatory response in systemic diseases is thereby modulated.
  • This 32 base pair deletion of the CCR5 gene is described, for example, by Prahalad: "Negative association between the chemokine receptor CCR5-A32 polymorphism and rheumatoid arthritis: A meta-analysis", Genes Immun. 2006, 7 (3): 264-268 and the literature cited therein.
  • FIG. 1 shows a graphic representation of the quantitatively determined differential gene expression of various genes in cardiomyopathy patients. The names of the examined genes are indicated on the x-axis. Gene expression of the genes under consideration in patients whose CCR5 gene was wild-type (no deletion was present in both alleles of the gene) was set to 100%.
  • FIG. 2 shows a graphic representation of the prognostic relevance of the 32 base pair deletion of the CCR5 gene to diabetes in cardiomyopathy patients. Of 427 patients examined, 46 were diabetics. 41 of these diabetics showed the wild type in the CCR gene.
  • FIG. 3 shows a graphical representation of the prognostic relevance of the 32 base pair deletion of the CCR5 gene to a double infection with erythroid virus and HHV6 (the two most frequently detected myocardium viruses) in patients with clinically manifest dilated cardiomyopathy (DCM).
  • DCM clinically manifest dilated cardiomyopathy
  • FIG. 4 shows a graphic representation of the prognostic relevance of the 32 base pair deletion of the CCR5 gene to enterovirus infection in cardiomyopathy patients.
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • Figure 5 shows a graphical representation of the prognostic relevance of the 32 base pair deletion of the CCR5 gene on the 7-year mortality in cardiomyopathy patients. Mortality data were available in 268 patients. 195 wild-type patients also lived within 7 years, while 19 wild-type patients died during this period. In a total of 50 patients heterozygous for the 32 base pair deletion of the CCR5 gene and a total of 4 patients homozygous for the 32 base pair deletion of the CCR5 gene, no deaths occurred within 7 years.
  • Example 26A CCR5 del 32 as a prognostic marker in patients with enterovirus-induced cardiomyopathy The procedure was analogous to Examples 3, 4 and 26. That is, biopsy specimens suffering from enterovirus (coxsackievirus) -induced cardiomyopathy were taken from such patients. On the one hand, those patients were selected in whom a spontaneous elimination of the virus by the patient's own immune system took place later.
  • FIG. 6A shows a graphical representation of the prognostic relevance of the 32 base pair deletion of the CCR5 gene on the 7-year mortality in cardiomyopathy patients. As can be seen from these data, no patient with the 32 base pair deletion of the CCR5 gene dies. Genes (genotype hetero or mutation) in the 7-year period. In contrast, approximately 24% of patients with wild-type genotypes die.
  • Figure 6B shows a graphic representation of the relevance of the 32 base pair deletion of the CCR5 gene on a spontaneous elimination of Enterovirus (coxsackievirus) in cardiomyopathy patients with myocardial enterovirus infection.
  • Enterovirus coxsackievirus
  • FIG. 6C shows a graphic representation of the relevance of spontaneous elimination of enterovirus (coxsackievirus) on 7-year mortality in cardiomyopathy patients myocardial enterovirus infection.
  • enterovirus coxsackievirus
  • CCR5 genotype in a proven myocardial enterovirus infection allows the decision on the necessity of interferon therapy and thus a prognosis for mortality in untreated patients in the sense of personalized medicine or as a companion diagnostic for the pharmaceutical beta.
  • Interferon Example 26B CCR5 del 32 as Prognostic Marker in Patients with Respiratory Virus (Parvorius B19) Induced Cardiomyopathy
  • the procedure was analogous to Examples 3, 4 and 26. That is, biopsy specimens suffering from erythroid virus (Parvorius B19) -induced cardiomyopathy were taken from such patients. Furthermore, the 5-year mortality was determined for these patients. In these patients, the CCR5 genotype (wild type - without altering the gene sequence, hetero or mutation - a 32 base pair deletion in this gene on at least one chromosome) was determined.
  • Figure 6D shows a graphic representation of the relevance of the 32 base pair deletion of the CCR5 gene on the survival of cardiomyopathy patients with myocardial erythroid infection.
  • FIG. 6E shows a graphic representation of the relevance of the number of inflammatory cells on the survival rate of cardiomyopathy patients with myocardial erythroid infection.
  • Patients with wild-type genotype and inflammatory infiltrates less than or equal to 10 cells per mm 2 of myocardial surface die significantly less frequently than patients with the same CCR5 genotype but high numbers of inflammatory cells in the myocardium.
  • the significance of myocardial erythroid virus infection is based on a frequency of 50% virus-positive myocardial biopsies. On average, up to 90% of all patients have the wild-type CCR5 genotype. Of 4 million DCM patients in Europe, approximately 1 .8 million have the wild-type CCR5 genotype.
  • the "CCR5 genotype” biomarker is a prognostic marker in predictive myocardial erythroid infection to predict the survival of cardiomyopathy patients, and the number of inflammatory cells can be used as a prognostic marker to predict the survival of cardiomyopathy patients
  • the present invention relates to the use of these prognostic markers in order to predict the survival rate of corresponding patients.
  • Example 27 Differential regulation of genes in biopsy specimens in active myocarditis, giant cell myocarditis and qranulomatous giant cell myocarditis
  • a giant cell myocarditis is characterized by the appearance of polynuclear giant cells accompanying acute myocarditis in the heart muscle. Since untreated giant cell myocarditis usually takes a fatal course, this form of acute myocarditis must be accurately determined, which is currently possible only by histological review of paraffin sections. However, the detection of multinucleated giant cells rarely succeeds. In suspected cases, 10 and more heart muscle biopsies would have to be cut open in order to find a histological record, which is almost impossible to do anywhere in the cardiology center.
  • FIG. 7 shows a graphic representation of the differential gene expression of various genes in cardiomyopathy patients which has been quantitatively determined during an initial examination.
  • TLR genes are downregulated compared to the control group Vneg.
  • some genes can be seen, whose expression is increased in the granulomatous giant cell myocarditis, in the giant cell myocarditis without granuloma but not. These genes are also useful for distinguishing between the two diseases.
  • the threshold from which an increase in gene expression is to be taken into account can be largely determined as far as statistically significant results can still be obtained by applying this threshold.
  • FIG. 8 shows a graphic representation of the differential gene expression of various genes in cardiomyopathy patients which is quantitatively determined during a follow-up examination.
  • the follow-up examination took place between 1 month and 2 years after the initial examination.
  • the abbreviations used correspond to the designations used in FIG.
  • the threshold should preferably be set at less than 800% of the usual gene expression.
  • the genes CCL20, IL17D, IL23R, TLR8, TNF, ND4, CPT1 and CYB are suitable for a corresponding distinction.
  • FIG. 9 shows a graphic representation of the quantitatively determined differential gene expression of various genes in cardiomyopathy patients with giant cells with granuloma in a first examination and a follow-up examination.
  • the follow-up examination took place between 1 month and 2 years after the initial examination.
  • the procedure was analogous to the procedure explained with reference to FIG. It showed that, among other things, the genes CCR5, F0XP3, IFNB1, IL23R, TLR5, TLR7, ND4, ATP6, CYB and ND1 were significantly more or less expressed in the follow-up examination than was the case at the initial examination of the patients. Therefore, these genes are also suitable individually or in combination with each other for the diagnosis and monitoring of giant cell myocarditis with granuloma.
  • FIG. 10 shows a further graphical representation of the quantitatively determined differential gene expression of various genes in cardiomyopathy patients with giant cells without granuloma in a first examination and a follow-up examination.
  • the follow-up examination took place between 1 month and 2 years after the initial examination.
  • the procedure was analogous to the procedure explained with reference to FIG.
  • genes CCL20, CCR5, CCR6, FOXP3, IFNB1, IL10, IL17D, IL23R, IL6, IL6R, TGFB1, TLR3, TLR7, TLR8, TNF, ND4, ATP6, CPT1, TLR9, IL1 B, ND1 and UQCR were significantly more or less expressed in the follow-up study than was the case with the initial examination of the patients. Therefore, these genes are also suitable individually or in combination with each other for the diagnosis and monitoring of giant cell myocarditis without granuloma.
  • Tables 26 and 27 below show a list of the quantitatively determined differential gene expression of various genes in cardiomyopathy patients (analogous to the results shown in FIGS. 7, 8 and 9).
  • Patients with acute / active myocarditis (MCA) patients with giant cell myocarditis (RZ) without granuloma and patients with giant cell myocarditis with granuloma (granulomatous giant cell myocarditis) were studied.
  • the list refers to genes that can be used for differential primary diagnosis of myocarditis (Table 26) and for subsequent follow-up diagnoses for monitoring acute / active myocarditis in giant cell myocarditis with and without granuloma (Table 27).
  • the examination was carried out on RNA obtained from myocardial biopsies. In one variant, only those genes are used individually or in any combination as a marker to which a score of 1 and / or 2 was assigned in Table 26 and / or Table 27.
  • Example 28 Diagnosis of veterinary virus-induced cardiomyopathies by means of a biopsy sample
  • Example 2 The procedure was analogous to Example 1, except that the biopsy samples were taken from patients suffering from virus replication of erythroid-induced cardiomyopathy. Virus replication can be detected by virus RNA in patient tissue.
  • the invention relates to the use of the microRNAs provided in Table 28 with a score of 1 and / or 2 individually or in any combination with each other as markers for the identification of an erythroid virus-induced cardiomyopathy with virus replication.
  • FIG. 11A shows a schematic overview of the possibilities currently existing in the prior art for the diagnosis and treatment of the various forms of non-ischemic cardiomyopathies.
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • FIG. 11b shows a schematic overview of the possibilities which exist for the diagnosis and treatment of different cardiomyopathies when the present invention is taken into account in the diagnosis. Because then it is no longer non-specifically differentiated into "healthy heart” and "sick heart", rather there is a fine diagnosis with regard to the different types of cardiomyopathy. This will be explained in more detail below with reference to FIG. 11B.
  • a cardiomyopathy that occurs in a patient can have different causes. For example, a virus infection, an inflammation or a storage disorder or an autoimmune disease can be the cause. By an initial diagnosis of cardiomyopathy as to whether there is inflammation or no inflammation, an initial differential diagnosis can already be made with regard to the cardiomyopathy that has occurred in the patient. Cardiomyopathies in which there are no signs of inflammation can be virus-associated or virus-free. In the case of virus-negative cardiomyopathies one can distinguish between cardiomyopathies with a low myocardial damage and those with a severe myocardial damage.
  • a virus-negative cardiomyopathy with a low myocardial damage can also be termed a healed myocarditis, which requires no further treatment.
  • the patient can be protected from the use of a nonspecific conventional heart failure therapy by appropriate diagnosis.
  • a virus-negative cardiomyopathy without inflammation with a pronounced myocardial damage is a dilated cardiomyopathy, which can then be treated by conventional heart failure therapy.
  • a patient has been diagnosed with cardiomyopathy in which no inflammation has been detected, but the presence of viruses has been diagnosed, this indicates a viral myocardial disease which, in addition to conventional heart failure therapy, may or may not be treated with antiviral therapy.
  • a virus-positive and a virus-negative course In a virus-positive course there is again a chronic viral heart muscle disease, so that in turn offers an antiviral therapy in addition to a conventional heart failure therapy.
  • a virus-negative course of an inflammatory Cardiomyopathy can be differentiated into cardiomyopathy with severe myocardial damage and cardiomyopathy with low myocardial damage.
  • Such cardiomyopathy with a severe myocardial damage is an inflammatory cardiomyopathy in which in addition to a conventional heart failure therapy and an immunosuppressive therapy should be performed.
  • a myocarditis which differs in the phenotype of a dilated cardiomyopathy of unclear genesis. Likewise, however, it will be treated by conventional heart failure therapy. Additional immunosuppressive therapy is also possible.
  • FIGS. 11A and 11B it is clear what advantages a fine diagnosis of different cardiomyopathies or storage disorders of the heart entails. Because only by means of such a fine diagnosis, it is possible to offer each patient a targeted therapy that offers the best possible chance of recovery. In addition, an appropriate and ineffective therapy of certain cardiomyopathies can be avoided by means of an appropriate fine diagnosis, which both relieves the patient's body and also ensures lower expenditure in the health system.
  • Table 29 below shows an overview of the different cardiomyopathies which can be distinguished from one another in the context of the present invention.
  • most of these diseases can also be diagnosed by biopsy diagnostics using classical histology, possibly supplemented by a polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • this is far more complicated than a miRNA diagnosis.
  • no coxsackievirus-induced cardiomyopathy with spontaneous elimination and no coxsackievirus-induced cardiomyopathy with virus persistence can be diagnosed by the classical methods. This is only possible by means of the miRNA diagnosis presented here.
  • the Therapy Option column identifies various options for treating the particular cardiomyopathy, with the treatment options listed in non-highlighted fields being real options, ie therapies that can be made, whereas the therapy options shaded as "indications" represent such therapies that need to be done so as not to endanger the patient's life.
  • the therapy options shaded as "indications” represent such therapies that need to be done so as not to endanger the patient's life.

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Description

Verwendung von microRNAs oder Genen als Marker zur Identifizierung, Diagnose und Therapie einzelner Formen nicht-ischämischer Kardiomyopathien
oder Speichererkrankungen des Herzens
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Verwendung bestimmter microRNAs und spezifischer Gene als Marker zur Identifizierung einzelner Formen nicht-ischämischer Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 , ein diagnostisches System zur Identifizierung unterschiedlicher Formen nicht-ischämischer Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 4, ein Verfahren zur Identifizierung und Unterscheidung einzelner Formen nicht- ischämischer Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 1 und ein Medikament, welches microRNAs enthält, gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 13. Die Erfindung betrifft ferner neuartige Verwendungen des Genotyps in Bezug auf eine Deletion im CCR5-Gen als Biomarker gemäß den Oberbegriffen der Ansprüche 14 und 15.
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind heute in den westlichen Ländern die mit Abstand häufigste Todesursache. Die Inzidenz für Herzinsuffizienzen in Europa und den USA liegt bei 12 bzw. 15 Mio. Erkrankten. Mit ca. 4 Mio. (30%) erkrankten Patienten in Europa ist die dilatative Kardiomyopathie (DCM) die häufigste Ausprägung der nicht-ischämischen Kardiomyopathie. Die 5-Jahres-Überlebensrate bei dieser viral-entzündlich-induzierten Herzerkrankung liegt ohne spezifische Behandlung bei 50 %. Weiterhin entwickelte sich die schwere Herzschädigung bei 45% aller transplantationspflichtigen Patienten auf der Grundlage einer vorliegenden DCM. Die hohe Inzidenz der nicht-ischämischen Kardiomyopathie und die enormen gesundheitsökonomischen Folgen dieser Erkrankungen erfordern eine frühzeitige und spezifische Diagnostik der einzelnen Unterformen und eine darauf basierende zielführende Therapie. Dies gilt in gleicher Weise für Speichererkrankungen des Herzens, wie etwa durch Amyloidose bedingte Kardiomyopathien.
Unter einer Kardiomyopathie versteht man Erkrankungen der Herzmuskulatur selbst, die primär nicht als Folge von anderen Erkrankungen des kardiovaskulären Systems entstanden sind. Diese Erkrankungen beruhen also weder auf einer mechanischen Überlastung (z.B. durch zu hohen Blutdruck oder einem Klappenfehler), noch auf einer Mangeldurchblutung der Herzkranzgefäße (koronare Herzerkrankung).
Im Gegensatz zu den koronaren Herzerkrankungen mit vielfältigen Diagnosemöglichkeiten gibt es für die verschiedenen Formen der nicht-ischämischen Kardiomyopathien und Speichererkrankungen des Herzens bisher keine spezifischen, nicht-invasiven Diagnoseparameter. Aufgrund ihrer vielfältigen Entstehungsursachen können nichtischämische Kardiomyopathien und Speichererkrankungen des Herzens bisher nur mit invasiven Methoden (Myokardbiopsie) exakt diagnostiziert werden, mit dem Ziel, eine weitere Therapie-relevante Differenzierung der einzelnen Krankheitsbilder zu erreichen.
Derzeit geht man davon aus, dass neben den rein genetisch bedingten Formen Herzmuskelerkrankungen häufig durch eine Virusinfektion und/oder eine damit verbundene Entzündungsreaktion bedingt sind, wobei genetische Veranlagungen für den Verlauf der Erkrankung bedeutsam sein können. Diese sich überlappenden Krankheitsbilder sind bis heute pathogenetisch unzureichend aufgeklärt. Aus diesem Grund ist es wichtig, eine diagnostische Methodik zu entwickeln, die frühzeitig die unterschiedlichen Formen der klinisch nicht zu unterscheidenden Gruppen nicht-ischämischer Kardiomyopathien und Speichererkrankungen des Herzens diagnostizieren kann, um so frühestmöglich eine dem Patienten adäquate Therapie einleiten zu können.
Der Goldstandard für die Kardiomyopathie-Diagnostik ist die Herzmuskelbiopsie, welche aber nur in einzelnen kardiologischen Zentren und in wenigen Ländern und auch dort nur bei einer stark begrenzten Anzahl von Patienten durchgeführt wird. Zusätzlich erfolgt großteils nur eine histologische Begutachtung des Herzmaterials, ohne die notwendigen immunhistochemische Entzündungsdifferenzierung und die molekularbiologischen Untersuchungen auf virale Infektionen.
Bei der Häufigkeit der nicht-ischämischen Kardiomyopathien und Speichererkrankungen des Herzens und den enormen gesundheitsökonomischen Folgen wäre es aber wünschenswert, durch weniger invasive Untersuchungsmethoden frühzeitig gute von schlechter Prognose für die entsprechenden Patienten zu differenzieren und sie bei Bedarf dann einer spezifischen Therapie zuführen und irreversible Myokardschäden vermeiden zu können. Weiterhin ist es wichtig zu wissen, welcher Patient auf welche Therapie anspricht. Erste Untersuchungen weisen darauf hin, dass das Vorliegen individueller Genexpressionsmuster möglicherweise mit einer genetischen Prädisposition assoziiert ist, welche die individuell erforderliche und wirksame Behandlung des Patienten beeinflussen kann.
Inzwischen sind microRNAs (miRNAs) als wichtige Regulatoren der genetischen Expression, auch in ihrer Bedeutung bei der Entstehung von Herzmuskelerkrankungen, erkannt worden. MicroRNAs sind einzelsträngige, kurze Ribonukleinsäure-Moleküle (RNA-Moleküle) mit 17 bis 24 Basen Länge, welche direkt in die Genregulation eingreifen. Hierbei werden insbesondere der Abbau der Ziel-RNA oder deren Translation gesteuert. MicroRNAs bilden einen neuen Regelkreislauf krankheitsbedingter und gewebespezifischer Genexpression. In zunehmendem Maße werden zirkulierende microRNAs im menschlichen Serum oder in peripheren Blutzellen als stabile Biomarker für die Diagnostik verschiedener Krankheiten und für das Monitoring angewandter Therapien verwendet.
Voellenkle et al. haben in der Publikation „MicroRNA signatures in peripheral blood mononuclear cells of chronic heart failure patients", Physiol. Genomics 42 (2010), Seiten 420-426, verschiedene microRNAs beschrieben, mittels derer gesunde Individuen von Patienten mit ischämischer Kardiomyopathie (ICM) oder mit nicht-ischämischer dilatativer Kardiomyopathie (NIDCM) unterschieden werden konnten. Eine Unterscheidung zwischen Patienten mit ischämischer Kardiomyopathie und Patienten mit nicht-ischämischer dilatativer Kardiomyopathie war auf der Basis der identifizierten microRNAs jedoch nicht möglich.
Ikeda et al. haben in der Publikation„Altered microRNA expression in human heart disease", Physiol. Genomics 31 (2007), Seiten 367-373, ebenfalls verschiedene microRNAs beschrieben, mittels derer zwischen unterschiedlichen Herzerkrankungen, nämlich der ischämischen Kardiomyopathie (ICM), der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) und der Aortenstenose (AS; diese Erkrankung zählt als Klappenfehler nicht zu den Kardiomyopathien) differenziert werden konnte.
Prasad et al. haben in der Publikation„Unique microRNA profile in end-stage heart failure indicates alterations in specific cardiovascular signaling networks", J. Biol. Chem. 284 (2009), Seiten 27487-27499, acht microRNAs identifiziert, deren Konzentration im Gewebe im Falle eines Herzversagens verändert ist. Dabei wurden jedoch nur Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie im Endstadium untersucht. Eine Unterscheidung verschiedener Herzmuskelerkrankungen untereinander war nicht Ziel dieser Publikation und wird entsprechend nicht beschrieben.
Aus der WO 2008/042231 A2 sind verschiedene Verfahren bekannt, die unter anderem die Beurteilung des Risikos einer Herzerkrankung, die Diagnose einer Herzerkrankung, die Beurteilung der Effizienz der Behandlung einer Herzerkrankung und die Bestimmung des Typs einer Herzerkrankung betreffen. Dabei werden auch spezifische miRNAs zur Durchführung dieser Methoden herangezogen. Aus dieser internationalen Patentanmeldung ist es jedoch nicht bekannt, einzelne nicht-ischämische Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens zu identifizieren bzw. voneinander zu unterscheiden. Vielmehr wird auf eine gröbere Unterscheidung, unter anderem zwischen ischämischer Kardiomyopathie und dilatativer Kardiomyopathie abgezielt.
Aus der WO 2009/012468 A2 sind verschiedene miRNAs als Biomarker bekannt, die dazu eingesetzt werden, um allgemein ein Herzversagen zu diagnostizieren. Die in dieser internationalen Patentanmeldung beschriebene grobe Diagnostik betrifft eine Unterscheidung zwischen ischämischer Kardiomyopathie auf der einen Seite und idiopathischer dilatativer Kardiomyopathie auf der anderen Seite. Es wird jedoch nicht beschrieben, unterschiedliche Formen der nicht-ischämischen Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens zu identifizieren bzw. voneinander zu unterscheiden.
In der WO 2010/097471 sind Proteine beschrieben, die bei der Apoptose von Kardiomyozyten eine Rolle spielen. Diese Proteine werden dabei über miRNAs identifiziert, welche auch zur Behandlung von Herzversagen eingesetzt werden sollen. Eine Differentialdiagnose in Bezug auf unterschiedliche nicht-ischämische Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens wird indes nicht beschrieben.
Häufig treten auch Infektionen des Herzmuskels auf, die zunächst noch nicht zu einer klinisch diagnostizierbaren Kardiomyopathie führen. Im klinischen Befund zeigt sich also ein normal großes und normal leistungsfähiges Herz, das beispielsweise durch ein Virus infiziert ist. Diese Infektion kann nachfolgend zu einer Kardiomyopathie führen; sie stellt folglich eine Vorform der Kardiomyopathie dar. Frühzeitig erkannt und behandelt, lässt sich der Ausbruch einer Kardiomyopathie jedoch vermeiden. Bislang ist es noch nicht gelungen, miRNA-basierte Diagnosen zu erstellen, mittels derer unterschiedliche Typen nicht-ischämischer Kardiomyopathien, Speichererkrankungen des Herzens und Infektionen des Herzmuskels ohne kardiomyopathische Ausprägungen identifiziert und voneinander unterschieden werden können. Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, geeignete microRNAs und Gene für eine entsprechende Identifizierung und Unterscheidung nicht-ischämischer Kardiomyopathien, Speichererkrankungen des Herzens oder Infektionen des Herzmuskels ohne kardiomyopathische Ausprägungen anzugeben sowie ein darauf basierendes, entsprechendes Diagnostiksystem bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird mit einer Verwendung bestimmter microRNAs gemäß dem Anspruch 1 gelöst. Demzufolge werden eine oder mehrere definierte microRNAs als Marker zur Identifizierung von nicht-ischämischen Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens eingesetzt. Auf diese Weise ist eine Unterscheidung der einzelnen nichtischämischen Kardiomyopathien voneinander oder von Speichererkrankungen des Herzens oder der einzelnen Speichererkrankungen des Herzens voneinander möglich. Dabei ist die microRNA ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden microRNAs:
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Die vorgenannten microRNA-Bezeichnungen sind dem Fachmann allgemein bekannte eindeutige Bezeichnungen unterschiedlicher microRNA-Sequenzen. Die jeweils hinter diesen Bezeichnungen stehenden Sequenzen können beispielsweise in der frei zugänglichen Datenbank miRBase (unter der Internet- Adresse http://www.mirbase.org erreichbar) abgefragt werden. Sie sind zudem im beigefügten Sequenzprotokoll aufgelistet. Sofern einzelne der vorgenannten Bezeichnungen sowohl für eine Stamm-Schlaufen- Struktur als auch für eine reife microRNA-Sequenz verwendet werden, ist jeweils die reife microRNA-Sequenz, die dem Fachmann auch unter der englischsprachigen Bezeichnung „mature sequence" bekannt ist, als die hinter der jeweiligen Abkürzung stehende Sequenz zu verstehen. Dies ergibt sich auch aus dem beigefügten Sequenzprotokoll.
Die Aufgabe wird mit einer Verwendung bestimmter menschlicher Gene als Marker gemäß dem Anspruch 1 gleichermaßen gelöst. Wiederum werden ein oder mehrere definierte Gene als Marker zur Identifizierung einzelner nicht-ischämischer Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens eingesetzt. Dabei sind die Gene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den nachfolgend aufgelisteten Genen, wobei jeweils spezifische Abschnitte dieser Gene verwendet werden, die in dem beigefügten Sequenzprotokoll angegeben sind. Die verwendeten Abschnitte entsprechen in der Regel einem oder mehreren Exons dieser Gene. Die Gene ATP6, CYB, ND1 und ND4 sind mitochondrial kodierte Gene, bei denen keine Exons gibt, so dass sie in vollständiger Länge verwendet werden. Beim Gen TLR9 wird ebenfalls das Gen in vollständiger Länge verwendet.
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Diese Gene sind in der Literatur bereits hinlänglich beschrieben. Ihre jeweilige Struktur und Funktion kann beispielsweise der frei zugänglichen Datenbank„Gene" des„National Center for Biotechnology Information" (NCBI) entnommen werden, die unter der Internetadresse http://www.ncbi.nlm.nih.qov/qene erreicht werden kann. Bislang nicht bekannt war jedoch die vorliegend beanspruchte neuartige Verwendung dieser Gene (bzw. Abschnitte dieser Gene) zur Identifizierung von nicht-ischämischen Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens.
Die beanspruchte Erfindung beruht auf dem Konzept, microRNAs und/oder Gene als Marker zu verwenden, um das Vorhandensein eines Subtyps (also einer Form) einer nichtischämischen Kardiomyopathie oder einer Speichererkrankungen des Herzens zu identifizieren. Es geht vorliegend also nicht darum, gesunde Patienten von kranken Patienten zu unterscheiden oder beliebige Herzmuskelerkrankungen voneinander zu unterscheiden, sondern darum, spezifische Untergruppen bzw. Formen nicht-ischämischer Kardiomyopathien und Untergruppen bzw. Formen von Speichererkrankungen des Herzens sowie Untergruppen bzw. Formen von Infektionen des Herzmuskels, auch ohne kardiomyopathische Ausprägungen, zu identifizieren, was klinisch nicht möglich ist.
Werden die vorgenannten microRNAs oder Gene im Rahmen einer microRNA-Profil- Diagnostik oder Genexpressionsanalyse eingesetzt, ist es möglich, Patienten mit einer nichtischämischen Kardiomyopathie, einer Speichererkrankung des Herzens oder einer Infektion des Herzmuskels ohne kardiomyopathische Ausprägungen frühzeitig zu identifizieren, in eine bestimmte Subgruppe zu klassifizieren und ebenfalls frühzeitig dem jeweiligen Krankheitsbild entsprechend gezielt zu behandeln. Dabei ist es möglich, die Gene als ergänzende Marker bei der microRNA-Profil-Diagnostik einzusetzen und umgekehrt.
Dazu werden vorzugsweise die Expressionsraten der vorgenannten microRNAs und Gene in quantitativer oder semi-quantitativer Weise bestimmt. Aus einer erhöhten Expression bestimmter microRNAs und/oder einer verminderten Expression anderer bestimmter microRNAs lässt sich dann eine bestimmte Form der nicht-ischämischen Kardiomyopathie oder eine Speichererkrankung des Herzens diagnostizieren. Die vorgenannten Nukleinsäuren (microRNAs oder Gene) haben sich dabei als besonders gut geeignet für die spezifische Diagnostik einzelner nicht-ischämischer Kardiomyopathien und Speichererkrankungen des Herzens herausgestellt. Einige der Nukleinsäuren sind für bestimmte zu diagnostizierende Erkrankungen derart spezifisch, dass sie bereits allein als spezifischer Marker eingesetzt werden können. Andere Nukleinsäuren sind nicht für eine einzelne zu diagnostizierende Erkrankung spezifisch, sondern beispielsweise für zwei zu diagnostizierende Erkrankungen. Daher werden solche Nukleinsäuren vorzugsweise nicht alleine, sondern in Kombination mit anderen Nukleinsäuren aus der obigen Liste eingesetzt. Aber auch bei spezifischen Nukleinsäuren bietet es sich zur Verfeinerung der Diagnostik an, diese nicht einzeln, sondern in Kombination mit anderen Nukleinsäuren der obigen Liste einzusetzen. Auf diese Weise lässt sich die Aussagekraft diagnostischer Tests stabilisieren. Statt den microRNAs oder Genen können auch synthetische Nukleinsäuremoleküle eingesetzt werden, die eine identische oder komplementäre Sequenz zu den vorgenannten microRNAs oder Genen aufweisen.
Vorzugsweise werden die microRNAs und/oder Gene der obigen Liste in Form diagnostisch relevanter Profile eingesetzt. Ein solches Profil kann beispielsweise aus mindestens oder genau 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600 oder aber allen microRNAs und/oder Genen der obigen Liste bestehen.
Dabei ist es möglich, je nach zu diagnostizierender Erkrankung, unterschiedliche microRNAs als Einzel-Marker bzw. in diagnostischen Profilen verschiedener microRNAs einzusetzen. Es ist aber auch möglich, ein komplexeres diagnostisches Profil unterschiedlicher microRNAs für die Diagnose der verschiedenen zu diagnostizierenden Erkrankungen einzusetzen. Dies hat den Vorteil, dass mit einem einzigen diagnostischen Profil unterschiedlichste Diagnosen erstellt werden können, ein derartiges Profil also universell innerhalb der gegebenen Fragestellung einsetzbar ist.
Gleiches gilt analog auch für den Nachweis spezifischer Genexpression und den Einsatz entsprechender Gene. Der Nachweis der obengenannten microRNAs und die Bestimmung der jeweiligen Genexpressionen können jeweils individuell erfolgen. Komplexe Diagnosesysteme bestehen aus Nachweiskomponenten für beide Nukleinsäuregruppen.
In einer Variante sind die nicht-ischämischen Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens ausgewählt aus der Gruppe umfassend virusfreie dilatative Kardiomyopathie, virusbedingte oder virusfreie entzündungsinduzierte Kardiomyopathie, viralinduzierte Kardiomyopathie, Kardiomyopathie mit eingeschränkter linksventrikulärer Ejektionsfraktion, entzündungsfreie Kardiomyopathie, Adenovirus-induzierte Kardiomyopathie, Enterovirus- induzierte Kardiomyopathie, Coxsackievirus-induzierte Kardiomyopathie (diese stellt eine Sonderform der Enterovirus-induzierte Kardiomyopathie dar), HHV6-Virus-induzierte Kardiomyopathie, chromosomal-integriertes HHV6 (ciHHV6) Virus-induzierte Kardiomyopathie, Erythrovirus-induzierte Kardiomyopathie, Myokarditis mit hohem Aufkommen von Entzündungszellen, Riesenzellmyokarditis und Amyloidose. In einer weiteren Variante lassen sich einige der vorgenannten Erkrankungen noch feiner unterteilen und entsprechend genauer diagnostizieren. So ist vorzugsweise eine Unterscheidung der virusfreien dilatativen Kardiomyopathie in eine virusfreie dilatative Kardiomyopathie ohne Entzündung des Myokards oder in eine virusfreie dilatative Kardiomyopathie mit Entzündung des Myokards möglich. Ferner ist es vorzugsweise möglich, die Enterovirus-(Coxsackievirus-) induzierte Kardiomyopathie in eine Enterovirus- (Coxsackievirus-)induzierte Kardiomyopathie mit Spontanelimination des Virus durch das patienteneigene Immunsystem oder in eine Enterovirus-(Coxsackievirus-) induzierte Kardiomyopathie ohne Spontanelimination des Virus durch das patienteneigene Immunsystem zu unterscheiden. Außerdem ist es vorzugsweise möglich, die Erythrovirus- induzierte Kardiomyopathie in eine Erythrovirus-induzierte Kardiomyopathie ohne Entzündung des Myokards und mit normaler Ejektionsfraktion oder in eine Erythrovirus- induzierte Kardiomyopathie mit Entzündung des Myokards und einer eingeschränkten Ejektionsfraktion möglich. Vorzugsweise kann ferner die Myokarditis mit hohem Aufkommen von Entzündungszellen in eine akute Myokarditis oder in eine Borderline-Myokarditis unterschieden werden. Eine Borderline-Myokarditis zeichnet sich durch viele Entzündungszellen im Herzmuskel aus, wobei keine Myozytenuntergänge nachweisbar sind. Die vorgenannten Aufgliederungen einzelner Erkrankungen in feinere Subklassen können in beliebiger Weise miteinander kombiniert werden.
Vorzugsweise werden nur Erkrankungen des Menschen berücksichtigt. So sind auch die microRNAs und Gene der obigen Liste durchweg als humane Sequenzen zu verstehen.
Vorzugsweise wird als eingeschränkte Ejektionsfraktion eine Ejektionsfraktion betrachtet, die weniger als 50 % der normalen Ejektionsfraktion beträgt.
In einer Variante ist die als Marker einzusetzende microRNA ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus all denjenigen microRNAs, denen für die Diagnose einer spezifischen nichtischämischer Kardiomyopathie oder einer spezifischen Speichererkrankung des Herzens in den Untersuchungen, die in den unten dargestellten Beispielen erläutert werden, die Punktzahl 1 oder 2 zugeordnet wurde. Hierbei handelt es sich um die folgenden microRNAs, die eine Auswahl aus den oben aufgelisteten microRNAs darstellen:
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In einer Variante nd die als Marker einzusetzenden Nukleinsäuren ausgewählt aus der Gruppe, die gerad nicht diejenigen microRNAs oder Gene umfasst, denen für die Diagnose einer spezifischen nicht-ischämischen Kardiomyopathie oder einer Speichererkrankung des Herzens in den Untersuchungen, die in den unten dargestellten Beispielen erläutert werden, die Punktzahl 3 oder 4 zugeordnet wurde. Dabei können sowohl einzelne, mehrere oder alle dieser mit den Punktzahlen 3 oder 4 versehenen microRNAs oder Gene vom Schutzbereich ausgeschlossen sein.
Die Erfindung betrifft auch ein diagnostisches System zur Identifizierung einzelner nichtischämischer Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens. Ein solches System weist mindestens 1 Sonde auf, die eine Sequenz aufweist, welche den microRNAs oder Genen aus der Gruppe gemäß den obigen Erläuterungen entspricht oder zu diesen komplementär ist.
Vorzugsweise weist das diagnostische System mindestens oder genau 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 oder 600 derartige Sonden auf. Ferner ist es möglich, dass sämtliche microRNAs/Gene der obigen Liste in identischer oder komplementärer Sequenz im diagnostischen System als Sonde enthalten sind. Das diagnostische System weist also eine bestimmbare Anzahl diagnostisch relevanter microRNA-Sequenzen und/oder Gensequenzen auf, die im System ein diagnostisch relevantes microRNA-Profil und/oder Genprofil darstellen. MicroRNA-Sequenzen können in beliebiger Weise mit Gensequenzen gemeinsam verwendet werden.
In einer weiteren Variante weist das diagnostische System ein Mittel zur Detektion eines zusätzlichen prognostischen Markers auf. Dadurch ist es nicht nur möglich, Aussagen über eine bei einem Patienten vorhandene Krankheit zu treffen, sondern auch Aussagen zum erwarteten Krankheitsverlauf zu treffen.
Vorzugsweise handelt es sich bei diesem prognostischen Marker um eine Deletion im CCR5- Gen, insbesondere um eine 32-Basenpaar-Deletion (CCR5-del-32-Marker). So konnten die Erfinder zeigen, dass eine solche Deletion ein positiver prognostischer Marker für das Auftreten von Diabetes bei Patienten mit Kardiomyopathie, ein positiver prognostischer Marker für Infektionen des Myokards mit Enterovirusinfektionen und Erythrovirus-HHV6- Einzel- und Doppelinfektionen (häufigste kardiotrope Viren) und ein positiver prognostischer Marker für die 7-Jahres-Mortalität von Patienten mit Kardiomyopathie ist. Das heißt, der CCR5-del-32-Marker ist ein positiver prognostischer Marker (Prädiktor) in Kardiomyopathie- Patienten für eine geringere Mortalität, für weniger Infektionen des Myokards und für weniger systemische Erkrankungen wie etwa Diabetes. In einem weiteren Erfindungsaspekt wird ein diagnostisches System zur Identifizierung des Genotyps in Bezug auf eine Deletion im CCR5-Gen bereitgestellt. Dieses diagnostische System umfasst mindestens eine Sonde, die eine Sequenz aufweist, welche einem Abschnitt des CCR5-Gens entspricht oder zu dieser komplementär ist. Die ausgewählte Sonde ermöglicht dabei insbesondere die Bestimmung von Sequenzen eines Genabschnitts, innerhalb dessen die an sich bekannte 32-Basenpaar-Deletion auftritt.
Vorzugsweise liegt das diagnostische System in Form eines Kits zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vor, wobei die Sonden auch als Primer in Lösung bereitgestellt werden. Auf diese Weise ist es besonders einfach möglich, in quantitativer Weise zu arbeiten, da mit Hilfe des Kits eine quantitative PCR durchgeführt werden kann. Durch den Einsatz von Trägerplatten mit einer großen Anzahl an Vertiefungen (beispielsweise 384, oder sogar 400-3000 Vertiefungen) können mit einem derartigen System zahlreiche PCRs gleichzeitig durchgeführt werden, so dass sich dieses System auch für eine große Anzahl an Sonden eignet.
In einer alternativen bevorzugten Ausgestaltung liegt das diagnostische System in Form eines Nukleinsäure-Chips vor. Dabei kann insbesondere vorgesehen sein, dass mindestens 5 Sonden für jede nachzuweisende Nukleinsäure auf den Chip aufgetragen sind. Auf diese Weise lässt sich die Expression von microRNAs oder Genen bevorzugt semi-quantitativ messen. Ein Chip weist den Vorteil auf, dass das Vorhandensein zahlreicher verschiedener microRNAs in der untersuchten Probe gleichzeitig detektiert werden kann. Dabei ist die Anzahl gleichzeitig detektierbarer microRNAs noch weitaus größer als im Falle einer PCR. Insbesondere bei einer größeren Anzahl an Sonden (beispielsweise mehr als 25, insbesondere aber mehr als 100 oder mehr als 1000 Sonden), bietet sich die Verwendung eines Chips aus Effizienzgründen besonders an.
Die beanspruchte Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung und Unterscheidung einzelner Formen nicht-ischämischer Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens, das die folgenden Schritte umfasst. Zunächst wird eine Probe bereitgestellt, die von einem Patienten, bei dem ein Verdacht auf das Vorliegen einer nicht-ischämischen Kardiomyopathie oder einer Speichererkrankung des Herzens vorliegt, gewonnen wurde. Anschließend wird die Probe direkt oder nach vorangegangener biochemischer Modifikation mit mindestens einer Sonde in Kontakt gebracht, wobei die Sonde eine Sequenz aufweist, welche den Sequenzen der microRNAs und/oder der Gene aus den obigen Listen entspricht oder zu diesen komplementär ist. Dieses Inkontaktbringen erfolgt unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen in der Probe enthaltenen microRNAs und/oder Genen auf der einen Seite und der mindestens einen Sonde auf der anderen Seite erlauben. Danach wird ermittelt, ob eine Hybridisierung zwischen den microRNAs bzw. den Genen der Probe und der mindestens einen Sonde erfolgt ist. Anschließend wird anhand dieses Hybridisierungsergebnisses bestimmt, welche microRNA(s) bzw. Gene in der Probe vorhanden ist/sind.
Vorzugsweise geschieht die Ermittlung einer erfolgten Hybridisierung in semi-quantitativer oder in quantitativer Weise. Bei der Probe handelt es sich vorzugsweise um einen Total-RNA-Extrakt, der aus einer Gewebeprobe des Patienten stammt, welche neben der mRNA einen Anteil an microRNAs aufweist. Für den Nachweis der oben diskutierten Deletion im CCR5-Gen (CCR5-del-32) wird vorzugsweise genomische DNA als Probe verwendet. Die Gewebeprobe kann ein vollständiges Gewebe des Patienten wie etwa Herzmuskelgewebe oder Blut umfassen. Alternativ kann die Gewebeprobe auch nur einen Teil eines Gewebes, wie etwa rote oder weiße Blutkörperchen oder Blutserum oder Blutplasma, umfassen. Die Gewebeprobe kann aber auch eine andere Körperflüssigkeit des Patienten umfassen, die nicht notwendigerweise ein Gewebe zu sein braucht. Bei der Gewebeprobe handelt es sich also um eine behandelte oder unbehandelte dem Patienten entnommene Probe. Aus dieser Probe wird dann vor Beginn des Verfahrens ein RNA-Extrakt gewonnen, der als Probe im vorliegend beanspruchten Verfahren verwendet wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Medikament zur Behandlung von nicht-ischämischen Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens, das als pharmazeutisch aktive Substanz mindestens eine Nukleinsäure enthält, die eine Sequenz aufweist, die identisch oder komplementär zu der Sequenz einer der microRNAs gemäß den obigen Erläuterungen ist oder auf andere Art die Bildung der microRNAs gemäß den obigen Erläuterungen beeinflusst. Ein solches Medikament kann dazu dienen, den Gehalt einer bestimmten microRNA im Blut bzw. in den Zellen eines Patienten zu erhöhen, um so die positiven Eigenschaften dieser microRNA in Bezug auf ein spezifisches Krankheitsbild zu verstärken. Es kann auch dazu dienen, eine bestimmte microRNA, deren Gehalt bei einem bestimmten Krankheitsbild erhöht ist, durch Hybridisierung oder eine vergleichbare Interaktion zu eliminieren, um dem negativen Effekt dieser microRNA auf das entsprechende Krankheitsbild entgegenzuwirken. Vorzugsweise stellt die ausgewählte Nukleinsäure oder Gruppe von Nukleinsäuren den einzigen pharmazeutisch aktiven Bestandteil des entsprechenden Medikaments dar.
Das Medikament eignet sich vorzugsweise nicht nur zu therapeutischen Zwecken, sondern auch zu diagnostischen Zwecken.
Bevorzugte Ausgestaltungen der oben dargestellten und nachfolgend in Zusammenhang mit den Beispielen erläuterten Verwendung der microRNAs sind in analoger Weise auch auf das beanspruchte Medikament übertragbar. Dies betrifft insbesondere die Auswahl entsprechender Nukleinsäure-Sequenzen oder Untergruppen von Sequenzen anhand der microRNAs, die als bevorzugt einzusetzen dargestellt sind.
Die Erfindung betrifft auch die therapeutische Nutzung der dargestellten microRNAs oder Nukleinsäure-Sequenzen, die zu diesen microRNAs identisch oder komplementär sind, insbesondere zu Behandlung bzw. Therapie von nicht-ischämischen Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Genotyps in Bezug auf eine Deletion im CCR5-Gen als Biomarker, um eine Entscheidungshilfe geben zu können, ob bei einem Patienten eine Beta-Interferon-Therapie angezeigt ist oder nicht. Bei der Deletion handelt es sich vorzugsweise um die an sich bekannte 32-Basenpaar-Deletion im CCR5-Gen. Dabei wird der Genotyp in vitro anhand einer Patientenprobe bestimmt, die einem Patienten zuvor entnommen wurde; es erfolgt also keine Diagnose am Körper des Patienten. Die angebotene Entscheidungshilfe stellt auch insbesondere keine Therapie und keine therapeutische Behandlung dar. Diese erfolgt erst, wenn unter Berücksichtigung der angebotenen Entscheidungshilfe eine unabhängige Therapieentscheidung getroffen wurde, und ist nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Genotyps in Bezug auf eine Deletion im CCR5-Gen als prognostischer Marker, der indikativ für eine erhöhte 7-Jahresmortalität und/oder eine Virusspontanelimination bei Kardiomyopathie-Patienten ist. Dabei bezieht sich dieser prognostische Marker insbesondere auf Patienten mit einer Enterovirus- (Coxsackievirus-) induzierten Kardiomyopathie. Bevorzugte Ausgestaltungen der oben dargestellten und nachfolgend in Zusammenhang mit den Beispielen erläuterten Verwendung der microRNAs sind in analoger Weise auch auf eine entsprechende therapeutische Anwendung übertragbar. Bei alledem wird eine Sequenz, die zu mindestens 90 %, insbesondere zu mindestens 95 % und ganz besonders zu mindestens 99 % identisch ist zu der Sequenz einer der genannten microRNAs oder Gene, als„identisch" im Sinne der vorliegenden Erfindung angesehen.
Die vorliegende Erfindung soll anhand von Figuren und Beispielen näher erläutert werden. Es zeigen:
Fig. 1 eine graphische Darstellung der quantitativ bestimmten differentiellen
Genexpression verschiedener Gene bei Kardiomyopathiepatienten mit unterschiedlichem CCR5-Genotyp,
Fig. 2 eine graphische Darstellung der prognostischen Relevanz der 32-Basenpaar- Deletion des CCR5-Gens auf Diabetes bei Kardiomyopathiepatienten,
Fig. 3 eine graphische Darstellung der prognostischen Relevanz der 32-Basenpaar- Deletion des CCR5-Gens auf eine Doppelinfektion mit Erythrovirus und HHV6 bei Kardiomyopathiepatienten,
Fig. 4 eine graphische Darstellung der prognostischen Relevanz der 32-Basenpaar- Deletion des CCR5-Gens auf eine Enterovirusinfektion bei Kardiomyopathiepatienten,
Fig. 5 eine graphische Darstellung der prognostischen Relevanz der 32-Basenpaar- Deletion des CCR5-Gens auf die 7-Jahres-Mortalität bei Kardiomyopathiepatienten (allgemein),
Fig. 6A eine zweite graphische Darstellung der prognostischen Relevanz der 32- Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens auf die 7-Jahres-Mortalität bei Kardiomyopathiepatienten mit myokardialer Enterovirusinfektion,
Fig. 6B eine graphische Darstellung der Relevanz der 32-Basenpaar-Deletion des
CCR5-Gens auf eine Spontanelimination des Enterovirus (Coxsackievirus) bei Kardiomyopathiepatienten mit myokardialer Enterovirusinfektion, Fig. 6C eine graphische Darstellung der Relevanz einer Spontanelimination des Enterovirus (Coxsackievirus) auf die 7-Jahres-Mortalität bei Kardiomyopathiepatienten mit myokardialer Enterovirusinfektion, Fig. 6D eine graphische Darstellung der Relevanz der 32-Basenpaar-Deletion des
CCR5-Gens auf die Überlebensrate von Kardiomyopathiepatienten mit myokardialer Erythrovirusinfektion,
Fig. 6E eine graphische Darstellung der Relevanz der Anzahl der Entzündungszellen auf die Überlebensrate von Kardiomyopathiepatienten mit myokardialer
Erythrovirusinfektion,
Fig. 7 eine graphische Darstellung der quantitativ bestimmten differentiellen
Genexpression verschiedener Gene bei Kardiomyopathie-Patienten mit akuter Myokarditis, Riesenzellmyokarditis ohne Granulome und Riesenzellmyokarditis mit Granulomen im Vergleich zu entzündugsfreien Patienten in einer Erstuntersuchung,
Fig. 8 eine graphische Darstellung der quantitativ bestimmten differentiellen
Genexpression verschiedener Gene bei Kardiomyopathie-Patienten mit akuter
Myokarditis, Riesenzellmyokarditis ohne Granulome und Riesenzellmyokarditis mit Granulomen im Vergleich zu entzündugsfreien Patienten in einer Nachfolgeuntersuchung, Fig. 9 eine graphische Darstellung der quantitativ bestimmten differentiellen
Genexpression verschiedener Gene bei Riesenzellenmyokarditis-Patienten mit Granulom in einer Erstuntersuchung und einer Nachfolgeuntersuchung,
Fig. 10 eine graphische Darstellung der quantitativ bestimmten differentiellen
Genexpression verschiedener Gene bei granulomfreien
Riesenzellenmyokarditis-Patienten in einer Erstuntersuchung und einer Nachfolgeuntersuchung,
Fig. 1 1 A eine schematische Übersichtsdarstellung über die Möglichkeiten einer Diagnose und Behandlung von Kardiomyopathien nach dem Stand der Technik (klinische Diagnostik ohne Myokardbiopsie) und Fig. 1 1 B eine schematische Übersichtsdarstellung über die Möglichkeiten einer Diagnose und Behandlung von Kardiomyopathien unter Berücksichtigung der vorliegenden Erfindung. Die Figuren 1 bis 5 werden im Zusammenhang mit Beispiel 26 erläutert. Die Figuren 6 bis 9 werden im Zusammenhang mit Beispiel 27 erläutert.
Beispiel 1 : Diagnose von Adenovirus-induzierten Kardiomyopathien mittels einer Biopsieprobe
Mehreren an einer Adenovirus-induzierten Kardiomyopathie erkrankten menschlichen Patienten wurden Herzmuskelbiopsien entnommen. Aus den einzelnen Biopsieproben wurde mittels dem Fachmann allgemein bekannter Standardverfahren jeweils ein Total-RNA- Extrakt (also ein Extrakt der gesamten RNA der jeweiligen Biopsie) gewonnen, der auch microRNA-Bestandteile enthielt. Dieser Total-RNA-Extrakt wurde anschließend mittels zweier Varianten auf das Vorhandensein bestimmter microRNAs untersucht.
Variante 1 (RNA-Chip) Die RNA des Total-RNA-Extrakts wurde mit Biotin markiert, auf einen RNA-Chip aufgebracht und 16 Stunden inkubiert. Ein solcher RNA-Chip wird mitunter auch als DNA-Chip bezeichnet, da er DNA-Sonden enthält. Diese sind jedoch zum RNA-Nachweis vorgesehen, weshalb vorliegend die Bezeichnung„RNA-Chip" verwendet wird. Während der Inkubation erfolgte eine Hybridisierung der in dem Total-RNA-Extrakt enthaltenen microRNA mit komplementären DNA-Sonden auf dem RNA-Chip. Hybridisierte micro-RNA-Moleküle wurden anschließend mit dem Fluoreszenzfarbstoff Streptavidin-Phycoerythrin, welcher an Biotin bindet, detektiert. Durch Bestimmung der Fluoreszenzintensität des gebundenen Streptavidin-Phycoerythrins konnte die Menge der hybridisierten microRNA in semiquantitativer Weise bestimmt werden.
Für die einzelnen Verfahrensschritte wurden vom jeweiligen Hersteller der RNA-Chips empfohlene Standardpuffer verwendet. Diese sind dem Fachmann allgemein geläufig. Für den mRNA-Nachweis wurden „Whole Genome Chips" der Fa. Affymetrix und für die microRNA unter anderem microRNA-Chips der Firma febit biomed verwendet.
Variante 2 (PCR-Genkarte) Die im Total-RNA-Extrakt enthaltene microRNA wurde zur Synthese von cDNA verwendet. Je nach Menge der erhaltenen cDNA wurde diese bei Bedarf präamplifiziert. Anschließend wurde die cDNA auf eine Karte aufgetragen und eine quantitative PCR durchgeführt. Auf diese Weise konnte eine relative Quantifizierung der einzelnen cDNAs in Echtzeit über die relative Fluoreszenz zu mitamplifizierten Haushaltsgenen (also zu konstitutiv exprimierten microRNAs) erfolgen.
Für die einzelnen Verfahrensschritte wurden vom jeweiligen Anbieter der Genkarten empfohlene Standardpuffer verwendet. Diese sind dem Fachmann allgemein geläufig. Unter anderem wurden Genkarten der Firma Applied Biosystems verwendet.
Durch eine ergänzende Anwendung der Verfahren nach Variante 1 und Variante 2 wurden zahlreiche microRNAs identifiziert, deren Expression im Vergleich zu Proben, die von Patienten mit anderen nicht-ischämischen Kardiomyopathien oder einer Speichererkrankung des Herzens stammten, modifiziert war.
In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer Adenovirus-induzierten Kardiomyopathie modifiziert ist, aufgelistet. Ferner ist in dieser Tabelle angegeben, welcher Art diese Modifikation ist. Dazu wurde unter Berücksichtigung der in den nachfolgenden Beispielen erläuterten Ergebnissen ein Punktwert berechnet und ermittelt, ob die Expression der jeweiligen microRNA hoch oder herunter reguliert war.
Ein Punktwert von 1 bedeutet, dass die beobachtete Expressionsmodifikation spezifisch für eine der betrachteten nicht-ischämischen Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens ist und nur bei dieser deutlich verändert auftritt. MicroRNAs, denen ein Punktwert von 1 zugeordnet ist, sind daher spezifische Marker für eine Adenovirus-induzierte Kardiomyopathie. Ihre Markerfunktion können diese microRNAs durch eine erhöhte Expression (Hochregulation) oder eine verminderte Expression (Herunterregulation) ausüben. Ein Punktwert von 1 bezeichnet mit anderen Worten microRNAs, die eine eindeutige Identifizierung eines Krankheitsbildes ermöglichen, selbst wenn nicht bekannt ist, welcher Art die beobachtete Modifikation der Expression ist.
Ein Punktwert von 2 bedeutet, dass die beobachtete Expressionsmodifikation spezifisch für zwei der betrachteten nicht-ischämischen Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens ist und nur bei diesen beiden Erkrankungen auftritt. Dabei ist die Expression im Falle der ersten dieser beiden Erkrankungen erhöht und im Falle der zweiten dieser beiden Erkrankungen erniedrigt. MicroRNAs, denen ein Punktwert von 2 zugeordnet ist, sind daher spezifische Marker für eine Adenovirus-induzierte Kardiomyopathie, sofern zusätzlich bekannt ist, ob ihre Expression hochreguliert oder aber herunterreguliert ist. Ein Punktwert von 2 bezeichnet mit anderen Worten microRNAs, die eine eindeutige Identifizierung eines Krankheitsbildes ermöglichen, sofern zusätzlich bekannt ist, welcher Art die beobachtete Modifikation der Expression ist.
Ein Punktwert von 3 bedeutet, dass die beobachtete Expressionsmodifikation signifikant für mehrere der betrachteten nicht-ischämischen Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens ist. Dabei ist die Expression im Falle zweier Erkrankungen gleichläufig modifiziert, also entweder erhöht oder erniedrigt. Bei allen anderen Erkrankungen, bei denen die Expressionsmodifikation ebenfalls signifikant ist, ist die Expression gegenläufig modifiziert, also entweder erniedrigt oder erhöht. MicroRNAs, denen ein Punktwert von 3 zugeordnet ist, sind daher für sich allein genommen unspezifische Marker für eine Adenovirus-induzierte Kardiomyopathie, da sie auch ein anderes Krankheitsbild anzeigen könnten. Zusammen mit einem weiteren microRNA-Marker, der entweder spezifisch oder aber ebenfalls unspezifisch ist, lässt sich jedoch bereits eine eindeutige Bestimmung einer Adenovirus-induzierten Kardiomyopathie ermöglichen. Dies gilt im Falle eines weiteren unspezifischen Markers jedoch nur, sofern dessen Expression bei anderen weiteren Erkrankungen modifiziert ist als denjenigen weiteren Erkrankungen, bei denen die Expression des ersten unspezifischen Markers modifiziert ist.
Ein Punktwert von 4 bedeutet, dass die beobachtete Expressionsmodifikation signifikant für genau zwei der betrachteten nicht-ischämischen Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens ist. Dabei ist die Expression in beiden Fällen gleichläufig modifiziert, also entweder erhöht oder erniedrigt. MicroRNAs, denen ein Punktwert von 4 zugeordnet ist, sind daher für sich allein genommen unspezifische Marker für eine Adenovirus-induzierte Kardiomyopathie, da sie auch ein anderes Krankheitsbild anzeigen könnten. Zusammen mit einem weiteren microRNA-Marker, der entweder spezifisch oder aber ebenfalls unspezifisch ist, lässt sich jedoch bereits eine eindeutige Bestimmung einer Adenovirus-induzierten Kardiomyopathie ermöglichen. Dies gilt im Falle eines weiteren unspezifischen Markers jedoch nur, sofern dessen Expression bei einer anderen weiteren Erkrankung modifiziert ist als derjenigen weiteren Erkrankung, bei der die Expression des ersten unspezifischen Markers gleichermaßen modifiziert ist.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 1 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Adenovirus-induzierten Kardiomyopathie. Beispiel 2: Diagnose von Enterovirus-induzierten (Coxsackievirus-induzierten)
Kardiomyopathien mittels einer Biopsieprobe
Es wurde analog zu Beispiel 1 vorgegangen, nur dass die Biopsieproben Patienten entnommen wurden, die an einer Enterovirus-induzierten Kardiomyopathie bzw. einer Coxsackievirus-induzierten Kardiomyopathie als Spezialfall der Enterovirus-induzierten Kardiomyopathie erkrankt waren. Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer solchen Enterovirus-(Coxsackievirus-)induzierten Kardiomyopathie modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 2 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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Beispiel 3: Diagnose von Enterovirus-(Coxsackievirus-)induzierten Kardiomyopathien mit Spontanelimination des Virus durch das patienteneiqene Immunsystem mittels einer Biopsieprobe
Es wurde analog zu Beispiel 1 vorgegangen, nur dass die Biopsieproben Patienten entnommen wurden, die an einer Enterovirus-(Coxsackievirus-)induzierten Kardiomyopathie erkrankt waren, später aber eine Spontanelimination des Virus durch das patienteneigene Immunsystem erfolgte. Diese Patienten bedürfen keiner medikamentösen Behandlung der Virusinfektion. Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer solchen Enterovirus-(Coxsackievirus-)induzierten Kardiomyopathie modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabellen 2 oder 3 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Enterovirus- (Coxsackievirus-)induzierten Kardiomyopathie, insbesondere einer Enterovirus- (Coxsackievirus-)induzierten Kardiomyopathie mit Spontanelimination des Virus durch das patienteneigene Immunsystem. Beispiel 4: Diagnose von Enterovirus-(Coxsackievirus-) induzierten Kardiomyopathien ohne Spontanelimination des Virus durch das patienteneiqene Immunsvstem mittels einer Biopsieprobe
Es wurde analog zu Beispiel 1 vorgegangen, nur dass die Biopsieproben Patienten entnommen wurden, die an einer Enterovirus-(Coxsackievirus-)induzierten Kardiomyopathie erkrankt waren, bei denen aber später keine Spontanelimination des Virus durch das patienteneigene Immunsystem erfolgte, so dass sich eine behandlungsbedürftige Viruspersistenz entwickelte.
Eine Unterscheidung zwischen Enterovirus-(Coxsackievirus-)induzierten Kardiomyopathie mit Spontanelimination des Virus durch das patienteneigene Immunsystem und solchen ohne Spontanelimination des Virus ist aus wirtschaftlichen Gründen besonders interessant. Denn bei derartigen Erkrankungen ohne Spontanelimination des Virus ist eine Beta- Interferon-Therapie zur Viruselimination erforderlich. Eine solche Therapie kostet rund 20.000 Euro pro Jahr. Wenn also frühzeitig auf einfachem Wege festgestellt werden kann, dass eine Spontanelimination des Enterovirus-(Coxsackievirus-) durch das patienteneigene Immunsystem erfolgt, können diese Kosten einer dann unnötigen Beta-Interferon-Therapie eingespart werden.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer solchen Enterovirus- (Coxsackievirus-)induzierten Kardiomyopathie modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 4 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 4 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Enterovirus- (Coxsackievirus-)induzierten Kardiomyopathie, insbesondere einer Enterovirus- (Coxsackievirus-)induzierten Kardiomyopathie ohne Spontanelimination des Virus durch das patienteneigene Immunsystem.
Beispiel 5: Diagnose einer Amyloidose des Herzens mittels einer Biopsieprobe
Es wurde analog zu Beispiel 1 vorgegangen, nur dass die Biopsieproben Patienten entnommen wurden, die an einer Amyloidose des Herzens erkrankt waren.
Eine Amyloidose ist eine typische Speichererkrankung des Herzens und ist durch Amyloidablagerungen im Herzmuskel gekennzeichnet.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer solchen Amyloidose modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 5 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 5 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Speichererkrankung des Herzens, insbesondere einer Amyloidose des Herzens.
Beispiel 6: Diagnose einer Myokarditis mit hohem Aufkommen von Entzündunqszellen mittels einer Biopsieprobe
Es wurde analog zu Beispiel 1 vorgegangen, nur dass die Biopsieproben Patienten entnommen wurden, die an einer intramyokardialen Entzündung mit einem hohen Aufkommen an Entzündungszellen erkrankt waren. Ein erhöhtes Aufkommen von Entzündungszellen liegt dann vor, wenn im entzündeten Gewebe mehr als 14 Entzündungszellen pro mm2 Gewebe vorhanden sind. Man spricht hierbei von einer Borderline-Myokarditis. Lassen sich zusätzlich noch histologisch Myozytenuntergänge nachweisen, spricht man von einer aktiven/akuten Myokarditis. Eine aktive Myokarditis liegt auch dann vor, wenn der histologische Nachweis eines Entzündungszellen-assoziierten Untergangs von Kardiomyozyten ohne Überschreiten der oben genannten Zellanzahl vorliegt.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer solchen Myokarditis mit einem hohen Aufkommen an Entzündungszellen modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 6 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 6 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Myokarditis mit einem hohen Aufkommen an Entzündungszellen.
Beispiel 7: Diagnose einer Riesenzellmyokarditis mittels einer Biopsieprobe
Es wurde analog zu Beispiel 1 vorgegangen, nur dass die Biopsieproben Patienten entnommen wurden, die an einer Riesenzellmyokarditis erkrankt waren.
Eine Riesenzellmyokarditis ist durch das Auftreten von mehrkernigen Riesenzellen begleitend zu einer akuten Myokarditis im Herzmuskel gekennzeichnet. Da unbehandelte Riesenzellmyokarditiden meist einen fatalen Verlauf nehmen, muss diese Form der akuten Myokarditiden genau bestimmt werden, was bisher nur durch histologische Begutachtung von Paraffinschnitten möglich ist. Allerdings gelingt der Nachweis der mehrkernigen Riesenzellen nur selten. In Verdachtsfällen müssen oft 10 und mehr Herzmuskelbiopsien aufgeschnitten werden, damit ein histologischer Beleg gefunden werden kann, was fast kein kardiologisches Zentrum weltweit durchführt. Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer solchen Riesenzellmyokarditis modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 7 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 7 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Riesenzellmyokarditis. Beispiel 8: Diagnose einer virusfreien, dilatativen Kardiomyopathie mit oder ohne Entzündung des Myokards mittels einer Biopsieprobe
Es wurde analog zu Beispiel 1 vorgegangen, nur dass die Biopsieproben Patienten entnommen wurden, die an einer virusfreien, dilatativen Kardiomyopathie mit Entzündung des Myokards oder an einer virusfreien dilatativen Kardiomyopathie ohne Entzündung des Myokards erkrankt waren.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei solchen dilatativen Kardiomyopathien modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 8 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 8 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer virusfreien dilatativen Kardiomyopathie.
Beispiel 9: Diagnose einer Ervthrovirus-induzierten Kardiomyopathie mittels einer Biopsieprobe
Es wurde analog zu Beispiel 1 vorgegangen, nur dass die Biopsieproben Patienten entnommen wurden, die an einer Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathie erkrankt waren.
Das Erythrovirus, das eine derartige Kardiomyopathie verursacht, tritt in zwei Subtypen auf, wobei der Genotyp 1 als Parvovirus B19 bzw. Erythrovirus B19 bekannt ist. Bei Myokardinfektionen spielt das Parvovirus jedoch nur eine untergeordnete Rolle, so dass vorliegend keine Unterscheidung des Erythrovirus in seine Genotypen erfolgen soll. Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei solchen Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathien modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 9 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 9 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathie.
Beispiel 10: Diagnose einer Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathie ohne Entzündung des
Myokards und mit normaler Ejektionsfraktion mittels einer Biopsieprobe
Es wurde analog zu Beispiel 1 vorgegangen, nur dass die Biopsieproben Patienten entnommen wurden, die an einer Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathie ohne Entzündung des Myokards und mit normaler Ejektionsfraktion erkrankt waren.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei solchen Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathien modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 10 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 10 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathie, insbesondere einer Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathie ohne Entzündung des Myokards und mit normaler Ejektionsfraktion.
Beispiel 1 1 : Diagnose einer Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathie mit Entzündung des Myokards und mit eingeschränkter Ejektionsfraktion mittels einer Biopsieprobe
Es wurde analog zu Beispiel 1 vorgegangen, nur dass die Biopsieproben Patienten entnommen wurden, die an einer Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathie mit Entzündung des Myokards und mit eingeschränkter Ejektionsfraktion erkrankt waren.
Die bei den Patienten beobachtete Ejektionsfraktion betrug weniger als 50 % einer normalen Ejektionsfraktion. Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei solchen Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathien modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 1 1 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 1 1 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathie, insbesondere einer Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathie mit Entzündung des Myokards und mit eingeschränkter Ejektionsfraktion.
Beispiel 12: Diagnose einer entzündunqsinduzierten Kardiomyopathie mittels einer
Biopsieprobe Es wurde analog zu Beispiel 1 vorgegangen, nur dass die Biopsieproben Patienten entnommen wurden, die an einer entzündungsinduzierten Kardiomyopathie erkrankt waren.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei solchen entzündungsinduzierten Kardiomyopathien modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 12 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 12 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer entzündungsinduzierten Kardiomyopathie.
Beispiel 13: Diagnose einer viralinduzierten Kardiomyopathie mittels einer Biopsieprobe Es wurde analog zu Beispiel 1 vorgegangen, nur dass die Biopsieproben Patienten entnommen wurden, die an einer viralinduzierten Kardiomyopathie (hervorgerufen durch ein Erythrovirus oder ein Enterovirus) erkrankt waren. Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei solchen viralinduzierten Kardiomyopathien modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 13 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 13 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer viralinduzierten Kardiomyopathie. Beispiel 14: Diagnose einer Myokarditis mit hohem Aufkommen von Entzündunqszellen mittels einer Blutzellenprobe
Der Nachweis spezifischer Genexpression oder microRNAs für verschiedene Formen der nicht-ischämischen Kardiomyopathie kann auch in Blutzellen erfolgen. Das entsprechende Muster der exprimierten Nukleinsäuren in Blutzellen unterscheidet sich deutlich von dem in Herzmuskelbiopsien.
Patienten, die an einer Myokarditis mit histologischem Nachweis von Myozytenuntergängen neben einem entzündlichen Infiltrat oder einem hohen Aufkommen an Entzündungszellen erkrankt waren, wurde eine Blutprobe entnommen. Das Blut wird in speziellen Röhrchen abgenommen (PAXgene). Dabei erfolgt schon die Lyse der Erythrozyten, und die restlichen zellulären Bestandteile werden RNA-schonend stabilisiert. Anschließend werden die zellulären Bestandteile abzentrifugiert und gewaschen. Danach wird die RNA aus diesen zellulären Bestandteilen nach Protokoll isoliert, so dass ein Total-RNA-Extrakt analog zu Beispiel 1 gewonnen und nach den dort erläuterten Verfahren weiterverarbeitet und analysiert wird. Diese Verfahrensschritte wurden wiederum nach Standardmethoden durchgeführt, die dem Fachmann allgemein bekannt sind.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer solchen Myokarditis mit einem hohen Aufkommen an Entzündungszellen modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 14 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 14 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Myokarditis mit einem hohen Aufkommen an Entzündungszellen.
Beispiel 15: Diagnose einer Myokarditis mit hohem Aufkommen von Entzündunqszellen ohne Mvozvtenunterqänqe (Borderline-Mvokarditis) mittels einer Blutzellenprobe
Es wurde analog zu Beispiel 14 vorgegangen, nur dass die Blutzellenproben Patienten entnommen wurden, die erhöhte Entzündungszellen ohne einen histologischen Nachweis von Myozytenuntergängen (Borderline-Myokarditis) im Herzmuskel aufwiesen. Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer solchen Myokarditis mit einem hohen Aufkommen an Entzündungszellen modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 15 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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Beispiel 16: Diagnose einer Myokarditis mit hohem Aufkommen von Entzündunqszellen mit nachweisbaren Mvozvtenunterqänqen (aktive/akute Myokarditis) mittels einer Blutzellenprobe
Es wurde analog zu Beispiel 14 vorgegangen, nur dass die Blutzellenproben Patienten entnommen wurden, die eine erhöhte Anzahl von Entzündungszellen mit einen histologischen Nachweis von Myozytenuntergängen im Herzmuskel aufwiesen.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer solchen Myokarditis mit einem hohen Aufkommen an Entzündungszellen modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 16 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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Beispiel 17: Diagnose eines entzündunqsfreien Herzmuskels mittels einer Blutzellenprobe
Es wurde analog zu Beispiel 14 vorgegangen, nur dass die Blutzellenproben Patienten entnommen wurden, die kein erhöhtes Aufkommen von Entzündungszellen im Herzen aufwiesen.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einem entzündungsfreien Herzmuskel vorliegen, sind in der nachfolgenden Tabelle 17 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 17 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung eines entzündungsfreien Herzmuskels.
Beispiel 18: Diagnose einer Amyloidose des Herzens mittels einer Blutzellenprobe
Es wurde analog zu Beispiel 14 vorgegangen, nur dass die Blutzellenproben Patienten entnommen wurden, die an einer Amyloidose des Herzens erkrankt waren.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer solchen Amyloidose modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 18 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 18 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Speichererkrankung des Herzens, insbesondere einer Amyloidose des Herzens.
Beispiel 19: Diagnose einer virusfreien dilatativen Kardiomyopathie mit oder ohne Entzündung des Myokards mittels einer Blutzellenprobe
Es wurde analog zu Beispiel 14 vorgegangen, nur dass die Blutzellenproben Patienten entnommen wurden, die an einer virusfreien dilatativen Kardiomyopathie mit Entzündung des Myokards oder an einer virusfreien dilatativen Kardiomyopathie ohne Entzündung des Myokards erkrankt waren.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei solchen dilatativen Kardiomyopathien modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 19 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 19 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer virusfreien dilatativen Kardiomyopathie. Beispiel 20: Diagnose einer ciHHV6-induzierten Kardiomyopathie mittels einer
Blutzellenprobe
Es wurde analog zu Beispiel 14 vorgegangen, nur dass die Blutzellenproben Patienten entnommen wurden, die an einer ciHHV6-induzierten Kardiomyopathie erkrankt waren. ciHHV6 bezeichnet eine Sonderform des humanen Herpesvirus 6. Dieses Virus hat die Eigenschaft, sich in die Chromosomen des Wirts einzulagern; man spricht hier von chromosomaler Integration des HHV6 (ciHHV6).
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei solchen ciHHV6-induzierten Kardiomyopathien modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 20 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 20 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer HHV6-induzierten Kardiomyopathie, insbesondere einer Kardiomyopathie mit ciHHV6-Ausprägung.
Beispiel 21 : Diagnose einer virusfreien dilatativen Kardiomyopathie ohne Entzündung des Myokards mittels einer Blutserumprobe
Der Nachweis spezifischer microRNAs für verschiedene Formen der nicht-ischämischen Kardiomyopathie kann auch in Serum erfolgen. Das entsprechende Muster der exprimierten Nukleinsäuren im Serum unterscheidet sich von dem in Herzmuskelbiopsien oder in Blutzellen.
Patienten, die an einer virusfreien dilatativen Kardiomyopathie ohne Entzündung des Myokards erkrankt waren, wurde eine Blutprobe entnommen. Diese Blutprobe wurde zur Gerinnung gebracht und durch eine Zentrifugation in Blutserum und zelluläre Bestandteile aufgetrennt. Diese Verfahrensschritte wurden wiederum nach Standardmethoden durchgeführt, die dem Fachmann allgemein bekannt sind.
Aus dem Blutserum wurde dann ein Total-RNA-Extrakt analog zu Beispiel 1 gewonnen und nach den dort erläuterten Verfahren weiterverarbeitet und analysiert.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei solchen dilatativen Kardiomyopathien modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 21 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
Tabelle 21 : Expressionsmodifikationen von microRNAs bei einer dilatativen Kardiomyopathie mit oder ohne Entzündung des Myokards.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 21 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer virusfreien dilatativen Kardiomyopathie.
Beispiel 22: Diagnose einer Myokarditis mit hohem Aufkommen von Entzündunqszellen mittels einer Blutserumprobe
Es wurde analog zu Beispiel 21 vorgegangen, nur dass die Blutserumproben Patienten entnommen wurden, die an einer Myokarditis mit hohem Aufkommen von Entzündungszellen erkrankt waren. Analog zählt hierzu der histologische Nachweis von entzündungszell- assoziiertem Untergang von Kardiomyozyten ohne Überschreiten der oben genannten Zellanzahl.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer solchen Myokarditis mit einem hohen Aufkommen an Entzündungszellen modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 22 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieh sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 22 mit einem Punktwert von und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinande als Marker zur Identifizierung einer Myokarditis mit einem hohen Aufkommen an Entzündungszellen.
Beispiel 23: Diagnose einer Myokarditis mit hohem Aufkommen von Entzündunqszellen ohne Myozytenunterqänqe mittels einer Blutserumprobe Es wurde analog zu Beispiel 21 vorgegangen, nur dass die Blutserumproben Patienten entnommen wurden, die an einer Myokarditis mit hohem Aufkommen von Entzündungszellen erkrankt waren. Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer solchen Myokarditis mit einem hohen Aufkommen an Entzündungszellen modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 23 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 23 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Myokarditis mit einem hohen Aufkommen an Entzündungszellen, jedoch ohne Myozytenuntergänge. Beispiel 24: Diagnose einer Myokarditis mit hohem Aufkommen von Entzündunqszellen und Zellunterqänqen im Herzmuskel mittels einer Blutserumprobe
Es wurde analog zu Beispiel 21 vorgegangen, nur dass die Blutserumproben Patienten entnommen wurden, die an einer Myokarditis mit histologischem Nachweis von entzündungszell-assoziiertem Untergang von Kardiomyozyten, auch ohne Überschreiten der oben genannten Zellanzahl erkrankt waren.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer solchen Myokarditis mit einem hohen Aufkommen an Entzündungszellen modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 24 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 24 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Myokarditis mit einem hohen Aufkommen an Entzündungszellen und gleichzeitigen Zelluntergängen im Herzmuskel.
Beispiel 25: Diagnose eines entzündunqsfreien Herzmuskels mittels einer Blutserumprobe Es wurde analog zu Beispiel 21 vorgegangen, nur dass die Blutserumproben Patienten entnommen wurden, die kein erhöhtes Aufkommen an Entzündungszellen des Herzens aufwiesen.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei entzündungsfreiem Herzmuskel vorliegen, sind in der nachfolgenden Tabelle 25 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 25 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Myokarditis ohne erhöhtes Aufkommen an Entzündungszellen.
Beispiel 26: CCR5 del 32 als unabhängiger prognostischer Marker bei Patienten mit Kardiomyopathien
Neben einer genetischen Mitverursachung von Kardiomyopathien werden Kardiomyopathien auch durch virale Infektionen des Herzens oder Entzündungs-assoziierte Prozesse im betroffenen Myokard entwickelt. Ein bekannter Polymorphismus im Gen des CC-Chemokin- Rezeptors 5 (CCR5), der eine Deletion von 32 Basenpaaren Länge in diesem Gen betrifft, führt zu einem in seiner Funktion beeinträchtigten Korezeptor für Makrophagen. Dadurch ergibt sich ein Schutz gegen virale Infektionen. Ferner wird die Entzündungsantwort bei systemischen Erkrankungen dadurch moduliert. Diese 32-Basenpaar-Deletion des CCR5- Gens ist beispielsweise von Prahalad: „Negative association between the chemokine receptor CCR5-A32 polymorphism and rheumatoid arthritis: A meta-analysis", Genes Immun. 2006, 7(3): 264-268 und der darin genannten Literatur beschrieben.
Zum Nachweis der 32-Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens wurde ein Primerpaar verwendet, dessen Sequenzen im beigefügten Sequenzprotokoll aufgelistet sind. Mittels Primer 1 (SEQ ID NO: 566) und Primer 2 (SEQ ID NO: 567) war es möglich, ein PCR- Produkt (SEQ ID NO: 568) zum Nachweis der 32-Basenpaar-Deletion herzustellen. Die Figur 1 zeigt eine graphische Darstellung der quantitativ bestimmten differentiellen Genexpression verschiedener Gene bei Kardiomyopathie-Patienten. Die Namen der untersuchten Gene sind auf der x-Achse angegeben. Die Genexpression der betrachteten Gene bei Patienten, deren CCR5-Gen dem Wildtyp entsprach (in beiden Allelen des Gens lag keine Deletion vor), wurde auf 100 % gesetzt. Zahlreiche der vorliegend betrachteten Gene wurden bei Patienten, die heterozygot für die 32-Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens waren, stärker als bei Wildtyp-Patienten exprimiert. Einige Gene wurden bei den heterozygoten Patienten aber auch schwächer als bei Wildtyp-Patienten exprimiert. Es ist davon auszugehen, dass die in der Figur 1 angegebenen Gene, deren Expression bei den heterozygoten Patienten modifiziert ist, einen Einfluss auf den Krankheitsverlauf bei Kardiomyopathiepatienten haben. Sie eignen sich daher als prognostische Marker zur Bestimmung des Krankheitsverlaufs. Die Figur 2 zeigt eine graphische Darstellung der prognostischen Relevanz der 32- Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens auf Diabetes bei Kardiomyopathiepatienten. Von 427 untersuchten Patienten waren 46 Diabetiker. 41 dieser Diabetiker zeigten den Wildtyp im CCR-Gen. 5 Diabetiker waren heterozygot für die 32-Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens. Kein Diabetiker war homozygot für die 32-Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens. Demgegenüber standen 296 Wildtyp-Patienten ohne Diabetes, 80 für die 32-Basenpaar- Deletion des CCR5-Gens heterozygote Patienten ohne Diabetes und 5 für die 32- Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens homozygote Patienten ohne Diabetes.
Damit waren 12,2 % der Wildtyppatienten Diabetiker, aber nur 5,9 % der heterozygoten Patienten. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Kardiomyopathiepatient zusätzlich an Diabetes erkrankt ist, ist also im Falle heterozygoter Patienten signifikant niedriger.
Die Figur 3 zeigt eine graphische Darstellung der prognostischen Relevanz der 32- Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens auf eine Doppelinfektion mit Erythrovirus und HHV6 (den beiden am häufigsten im Myokard nachgewiesenen Viren) bei Patienten mit einer klinisch manifesten dilatativen Kardiomyopathie (DCM). Bei 84 Patienten wurde eine Doppelinfektion des Myokards nachgewiesen. 52 Wildtyp-Patienten zeigten keine Doppelinfektion, während 16 Wildtyppatienten eine Doppelinfektion aufwiesen. Von 16 für die 32-Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens heterozygote Patienten wies keiner eine Doppelinfektion auf. Damit waren 23,5 % der Wildtyppatienten zusätzlich von einer Doppelinfektion betroffen, während keine heterozygoten Patienten Doppelinfektionen aufwiesen. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Kardiomyopathiepatient zusätzlich an einer Doppelinfektion erkrankt ist, ist also im Falle heterozygoter Patienten signifikant niedriger.
Die Figur 4 zeigt eine graphische Darstellung der prognostischen Relevanz der 32- Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens auf eine Enterovirusinfektion bei Kardiomyopathiepatienten. Bei 84 Patienten mit einer klinisch manifesten dilatativen Kardiomyopathie (DCM) wurde eine Untersuchung auf eine Enterovirusinfektion im Myokard vorgenommen. 60 Wildtyp-Patienten zeigten keine Enterovirusinfektion, während 7 Wildtyppatienten eine Enterovirusinfektion aufwiesen. Von 16 für die 32-Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens heterozygote Patienten wies keiner eine Enterovirusinfektion auf. 1 für die 32-Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens homozygoter Patient wies eine Enterovirusinfektion auf.
Damit waren 10,4 % der Wildtyppatienten zusätzlich von einer Enterovirusinfektion betroffen, während keine heterozygoten Patienten Enterovirusinfektionen aufwiesen. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Kardiomyopathiepatient zusätzlich an einer Enterovirusinfektion erkrankt ist, ist also im Falle heterozygoter Patienten signifikant niedriger.
Die Figur 5 zeigt eine graphische Darstellung der prognostischen Relevanz der 32- Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens auf die 7-Jahres-Mortalität bei Kardiomyopathiepatienten. Bei 268 Patienten lagen Mortalitätsdaten vor. 195 Wildtyp- Patienten lebten auch noch innerhalb von 7 Jahren, während 19 Wildtyppatienten während dieses Zeitraums starben. Bei insgesamt 50 für die 32-Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens heterozygoten Patienten und insgesamt 4 für die 32-Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens homozygoten Patienten traten überhaupt keine Todesfälle innerhalb von 7 Jahren auf.
Damit verstarben 8,9 % der Wildtyppatienten innerhalb von 7 Jahren, während keine heterozygoten Patienten und keine homozygoten Patienten verstarben. Die Wahrscheinlichkeit, eine Kardiomyopathie zumindest während eines Zeitraums von 7 Jahren zu überleben, ist also im Falle heterozygoter oder homozygoter Patienten signifikant größer als bei Wildtyppatienten. Beispiel 26A: CCR5 del 32 als prognostischer Marker bei Patienten mit Enterovirus- induzierter Kardiomyopathie Es wurde analog zu den Beispielen 3, 4 und 26 vorgegangen. Das heißt, es wurden solchen Patienten Biopsieproben entnommen, die an einer Enterovirus-(Coxsackievirus-) induzierten Kardiomyopathie erkrankt waren. Dabei wurden einerseits solche Patienten ausgewählt, bei denen später eine Spontanelimination des Virus durch das patienteneigene Immunsystem erfolgte. Ferner wurden Patienten ausgewählte, bei denen eine Viruspersistenz über einen längeren Zeitraum bestand, so dass eine Beta-Interfron-Therapie indiziert war. Weiterhin wurde die 7-Jahres-Mortalität für diese Patienten bestimmt. Bei diesen Patienten wurde der CCR5-Genotyp bestimmt (Wildtyp - ohne Veränderung der Gensequenz; Hetero oder Mutation - eine Deletion von 32 Basenpaaren Länge in diesem Gen auf mindestens einem Chromosom).
Eine Unterscheidung zwischen Enterovirus-(Coxsackievirus-)induzierten Kardiomyopathie mit Spontanelimination des Virus durch das patienteneigene Immunsystem und solchen ohne Spontanelimination des Virus ist aus wirtschaftlichen Gründen besonders interessant. Denn bei derartigen Erkrankungen ohne Spontanelimination des Virus ist eine Beta- Interferon-Therapie zur Viruselimination erforderlich. Eine solche Therapie kostet rund 20.000 Euro pro Jahr. Wenn also frühzeitig auf einfachem Wege festgestellt werden kann, dass eine Spontanelimination des Enterovirus (Coxsackievirus) durch das patienteneigene Immunsystem erfolgt, können diese Kosten einer dann unnötigen Beta-Interferon-Therapie eingespart werden.
Die Figur 6A zeigt eine graphische Darstellung der prognostischen Relevanz der 32- Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens auf die 7-Jahres-Mortalität bei Kardiomyopathiepatienten, Wie sich aus diesen Daten ergibt, verstirbt kein Patient mit der 32-Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens (Genotyp Hetero oder Mutation) in der 7-Jahres- Frist. Bei den Patienten mit Wildtyp-Genotyp versterben hingegen ca. 24%.
Die Figur 6B zeigt eine graphische Darstellung der Relevanz der 32-Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens auf eine Spontanelimination des Enterovirus (Coxsackievirus) bei Kardiomyopathiepatienten mit myokardialer Enterovirusinfektion. Wie sich aus diesen Daten ergibt, eliminieren alle Patienten mit dem Genotyp Hetero oder Mutation das Enterovirus spontan. Bei den Patienten mit dem Wildtyp-Genotyp kommt es hingegen nur bei ca. 25% der Patienten zu einer Spontanelimination. Die restlichen Patienten sind therapiepflichtig (Therapie mit Beta-Interferon).
Die Figur 6C zeigt eine graphische Darstellung der Relevanz einer Spontanelimination des Enterovirus (Coxsackievirus) auf die 7-Jahres-Mortalität bei Kardiomyopathiepatienten mit myokardialer Enterovirusinfektion. Von Patienten mit einer Enteroinfektion und Spontanelimination des Virus versterben nur ca. 6% (alles nur Wildtyp-Patienten). Von den Patienten mit Viruspersistenz versterben hingegen ca. 35%. Eine Persistenz des Enterovirus resultiert also in einer deutlich höheren Mortalität der Patienten. Wenn der Patient das Virus nicht selber eliminieren kann, muss eine Behandlung mit Beta- Interferon für eine Virusentfernung eingeleitet werden. Patienten nach Behandlung mit Beta-Interferon zeigen eine signifikant bessere Überlebensrate als Patienten mit Viruspersistenz.
Die Bestimmung des Biomarkers„CCR5-Genotyp" bei einer nachgewiesenen myokardialen Enterovirus-Infektion erlaubt die Entscheidung über die Notwendigkeit einer Interferon- Therapie und somit eine Prognose zur Mortalität bei unbehandelten Patienten im Sinne der personalisierten Medizin oder als Companion-Diagnostikum für das Pharmazeutikum Beta- Interferon. Beispiel 26B: CCR5 del 32 als prognostischer Marker bei Patienten mit Ervthrovirus- (Parvorius B19-) induzierter Kardiomyopathie
Es wurde analog zu den Beispielen 3, 4 und 26 vorgegangen. Das heißt, es wurden solchen Patienten Biopsieproben entnommen, die an einer Erythrovirus-(Parvorius B19-) induzierten Kardiomyopathie erkrankt waren. Weiterhin wurde die 5-Jahres-Mortalität für diese Patienten bestimmt. Bei diesen Patienten wurde der CCR5-Genotyp (Wildtyp - ohne Veränderung der Gensequenz; Hetero oder Mutation - eine Deletion von 32 Basenpaaren Länge in diesem Gen auf mindestens einem Chromosom) bestimmt. Die Figur 6D zeigt eine graphische Darstellung der Relevanz der 32-Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens auf die Überlebensrate von Kardiomyopathiepatienten mit myokardialer Erythrovirusinfektion. Von den Patienten mit Erythrovirus-(Parvorius B19-) induzierter Kardiomyopathie verstirbt kein Patient mit der 32-Basenpaar-Deletion des CCR5-Gens, während bei den Wildtyp-Patienten über 6 % innerhalb von 5 Jahren versterben. Diese Mortalität hängt mit einer gleichzeitig vorliegenden erhöhten Anzahl von Entzündungszellen zusammen.
Die Figur 6E zeigt eine graphische Darstellung der Relevanz der Anzahl der Entzündungszellen auf die Überlebensrate von Kardiomyopathiepatienten mit myokardialer Erythrovirusinfektion. Patienten mit Wildtyp-Genotyp und mit entzündlichen Infiltraten kleiner gleich 10 Zellen pro mm2 Myokardfläche versterben deutlich seltener als Patienten mit dem gleichen CCR5-Genotyp, aber hohen Zahlen an Entzündungszellen im Myokard. Die Bedeutung der myokardialen Erythrovirus-Infektion basiert auf einer Häufigkeit von 50 % viruspositiven Herzmuskelbiopsien. Durchschnittlich weisen bis zu 90 % aller Patienten den CCR5-Genotyp Wildtyp auf. Von 4 Mio. DCM-Patienten in Europa weisen ca. 1 .8 Mio. den CCR5-Genotyp Wildtyp auf. Statistisch versterben von dieser Gruppe ca. 100.000 Patienten innerhalb von 5 Jahren. Eine bessere Voraussage der Überlebenschancen entsprechender Kardiomyopathiepatienten würde also zahlreiche Patienten betreffen und damit einen hohen Nutzen haben. Damit eignet sich der Biomarker„CCR5-Genotyp" bei einer nachgewiesenen myokardialen Erythrovirus-Infektion als prognostischer Marker, um die Überlebensrate entsprechender Kardiomyopathiepatienten voraussagen zu können. Ferner eignet sich die Bestimmung der Anzahl an Entzündungszellen ebenso als prognostischer Marker, um die Überlebensrate entsprechender Kardiomyopathiepatienten voraussagen zu können. In einer Variante betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser prognostischen Marker, um die Überlebensrate entsprechender Patienten voraussagen zu können.
Beispiel 27: Differentielle Regulation von Genen in Biopsien bei aktiver Myokarditis, Riesenzellmyokarditis und qranulomatöser Riesenzellmyokarditis
Eine Riesenzellmyokarditis ist durch das Auftreten von mehrkernigen Riesenzellen begleitend zu einer akuten Myokarditis im Herzmuskel gekennzeichnet. Da unbehandelte Riesenzellmyokarditiden meist einen fatalen Verlauf nehmen, muss diese Form der akuten Myokarditiden genau bestimmt werden, was bisher nur durch histologische Begutachtung von Paraffinschnitten möglich ist. Allerdings gelingt der Nachweis der mehrkernigen Riesenzellen nur selten. In Verdachtsfällen müssten 10 und mehr Herzmuskelbiopsien aufgeschnitten werden, damit ein histologischer Beleg gefunden werden kann, was fast kein kardiologisches Zentrum weltweit durchführt. Die Figur 7 zeigt eine graphische Darstellung der im Rahmen einer Erstuntersuchung quantitativ bestimmten differentiellen Genexpression verschiedener Gene bei Kardiomyopathie-Patienten. Dabei wurden Patienten mit einer akuten Myokarditis (MCA), Patienten mit einer Riesenzellmyokarditis ohne Granulom (RZ ohne Granulom), Patienten mit einer Riesenzellmyokarditis mit Granulom (granulomatöse Riesenzellmyokarditis) und Patienten, die weder an einer akuten Myokarditis noch an einer Riesenzellmyokarditis noch an einer granulomatösen Riesenzellmyokarditis erkrankt waren und zudem virusnegativ waren (Vneg), untersucht. Die Untersuchung erfolgte an aus Myokardbiopsien gewonnener RNA. In der Figur 7 sind unter der Bezeichnung RZ zudem die Gruppen der Patienten mit einer Riesenzellmyokarditis ohne Granulom sowie der Patienten mit einer Riesenzellmyokarditis mit Granulom zusammengefasst. Es zeigte sich, dass auf der Basis unterschiedlicher Gene eine Unterscheidung zwischen der einfachen Riesenzellmyokarditis und der granulomatösen Riesenzellmyokarditis getroffen werden konnte. Setzt man beispielsweise einen Grenzwert bei ca. 800 % der gewöhnlichen Genexpression, ist nur bei der Riesenzellmyokarditis ohne Granulom eine höhere Expression der Gene CCR5, CCR6, FOXP3, IFNB1 , IL10, IL23R und IL6 zu beobachten, nicht jedoch bei der granulomatösen Riesenzellmyokarditis. Die vorgenannten Gene können daher einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander zur Diagnose der einfachen Riesenzellmyokarditis und/oder zur Unterscheidung zwischen der einfachen und der granulomatösen Riesenzellmyokarditis eingesetzt werden. Auffallend ist ferner, dass die Expression einiger TLR-Gene gegenüber der Kontrollgruppe Vneg herunterreguliert ist. Ferner sind aus der Figur 7 einige Gene ersichtlich, deren Expression bei der granulomatösen Riesenzellmyokarditis erhöht ist, bei der Riesenzellmyokarditis ohne Granulom jedoch nicht. Auch diese Gene eignen sich zur Unterscheidung beider Erkrankungen. Dabei kann die Schwelle, ab der eine Erhöhung der Genexpression berücksichtigt werden soll, weitgehend beliebig festgelegt werden, sofern sich bei Anwendung dieser Schwelle noch statistisch signifikante Ergebnisse erhalten lassen.
Die Figur 8 zeigt eine graphische Darstellung der im Rahmen einer Nachfolgeuntersuchung quantitativ bestimmten differentiellen Genexpression verschiedener Gene bei Kardiomyopathie-Patienten. Die Nachfolgeuntersuchung erfolgte zwischen 1 Monat und 2 Jahren nach der Erstuntersuchung. Die verwendeten Abkürzungen entsprechen den in der Figur 7 verwendeten Bezeichnungen. Um im Rahmen einer Nachfolgeuntersuchung Unterscheidungen zwischen einer gewöhnlichen Riesenzellmyokarditis und einer granulomatösen Riesenzellmyokarditis treffen zu können, sollte die Schwelle vorzugsweise auf weniger als 800 % der gewöhnlichen Genexpression festgesetzt werden. Dann eignen sich für eine entsprechende Unterscheidung beispielsweise die Gene CCL20, IL17D, IL23R, TLR8, TNF, ND4, CPT1 und CYB.
Die Figur 9 zeigt eine graphische Darstellung der quantitativ bestimmten differentiellen Genexpression verschiedener Gene bei Kardiomyopathie-Patienten mit Riesenzellen mit Granulom in einer Erstuntersuchung und einer Nachfolgeuntersuchung. Die Nachfolgeuntersuchung erfolgte zwischen 1 Monat und 2 Jahren nach der Erstuntersuchung. Das Vorgehen erfolgte analog zu dem in Bezug auf die Figur 7 erläuterten Vorgehen. Es zeigte sich, dass unter anderem die Gene CCR5, F0XP3, IFNB1 , IL23R, TLR5, TLR7, ND4, ATP6, CYB und ND1 bei der Nachfolgeuntersuchung signifikant stärker oder schwächer exprimiert wurden als dies noch bei der Erstuntersuchung der Patienten der Fall war. Daher eignen sich auch diese Gene einzeln oder in Kombination miteinander zur Diagnose und Überwachung von Riesenzellenmyokarditiden mit Granulom.
Die Figur 10 zeigt eine weitere graphische Darstellung der quantitativ bestimmten differentiellen Genexpression verschiedener Gene bei Kardiomyopathie-Patienten mit Riesenzellen ohne Granulom in einer Erstuntersuchung und einer Nachfolgeuntersuchung. Die Nachfolgeuntersuchung erfolgte zwischen 1 Monat und 2 Jahren nach der Erstuntersuchung. Das Vorgehen erfolgte analog zu dem in Bezug auf die Figur 7 erläuterten Vorgehen. Es zeigte sich, dass unter anderem die Gene CCL20, CCR5, CCR6, FOXP3, IFNB1 , IL10, IL17D, IL23 R, IL6, IL6 R, TGFB1 , TLR3, TLR7, TLR8, TNF, ND4, ATP6, CPT1 , TLR9, IL1 B, ND1 und UQCR bei der Nachfolgeuntersuchung signifikant stärker oder schwächer exprimiert wurden als dies noch bei der Erstuntersuchung der Patienten der Fall war. Daher eignen sich auch diese Gene einzeln oder in Kombination miteinander zur Diagnose und Überwachung von Riesenzellenmyokarditiden ohne Granulom.
Die nachfolgenden Tabellen 26 und 27 zeigen eine Auflistung der quantitativ bestimmten differentiellen Genexpression verschiedener Gene bei Kardiomyopathie-Patienten (analog zu den in den Figuren 7, 8 und 9 dargestellten Ergebnissen). Dabei wurden Patienten mit einer akuten/aktiven Myokarditis (MCA), Patienten mit einer Riesenzellmyokarditis (RZ) ohne Granulom und Patienten mit einer Riesenzellmyokarditis mit Granulom (granulomatöse Riesenzellmyokarditis) untersucht. Die Auflistung betrifft Gene, welche zur differentiellen Primärdiagnose der Myokarditiden (Tabelle 26) und für die anschließenden Nachfolgediagnosen zum Monitoring von akuten/aktiven Myokarditiden, bei Riesenzellmyokarditen mit und ohne Granulom (Tabelle 27) genutzt werden können. Die Untersuchung erfolgte an aus Myokardbiopsien gewonnener RNA. In einer Variante werden nur solche Gene einzeln oder in beliebiger Kombination als Marker verwendet, denen in der Tabelle 26 und/oder der Tabelle 27 eine Punktzahl von 1 und/oder 2 zugeordnet wurde.
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Beispiel 28: Diagnose von Ervthrovirus-induzierten) Kardiomyopathien mittels einer Biopsieprobe
Es wurde analog zu Beispiel 1 vorgegangen, nur dass die Biopsieproben Patienten entnommen wurden, die an einer Erythrovirus-induzierte Kardiomyopathie mit Virusreplikation erkrankt waren. Die Virusreplikation lässt sich anhand von Virus-RNA im Patientengewebe nachweisen.
Die identifizierten microRNAs, deren Expression bei einer solchen Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathie modifiziert sind, sind in der nachfolgenden Tabelle 28 aufgelistet. Hinsichtlich der Punktwerte wird auf die Erläuterungen zu Beispiel 1 verwiesen. Für die Erythrovirus-induzierte Kardiomyopathie mit Virusreplikation gibt es heutzutage die Therapieoption der Behandlung mit dem Replikationshemmer Telbivudine, welcher zur Verhinderung der Virusvermehrung und dadurch zu einer Verbesserung der klinischen Symptome innerhalb sehr kurzer Behandlungzeiträume führt.
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In einer Variante bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der in der Tabelle 28 mit einem Punktwert von 1 und/oder 2 versehenen microRNAs einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander als Marker zur Identifizierung einer Erythrovirus-induzierten Kardiomyopathie mit Virusreplikation.
Zusammenfassende Erläuterung der Vorteile der vorliegenden Erfindung
Die Figur 1 1 A zeigt eine schematische Übersichtsdarstellung über die Möglichkeiten, die gemäß dem Stand der Technik derzeit für eine Diagnose und Behandlung der verschiedenen Formen nicht-ischämischer Kardiomyopathien existieren. So kann bei den unterschiedlichsten Kardiomyopathien in der Klinik lediglich ein gemeinsamer klinischer Phänotyp einer dilatativen Kardiomyopathie (DCM) unklarer Genese erkannt werden. Aufgrund einer allgemeinen unspezifischen Diagnose der entsprechenden Kardiomyopathie existiert auch keine spezifische Therapieoption. In der Folge werden die unterschiedlichsten Kardiomyopathien mittels einer konventionellen Herzinsuffizienztherapie behandelt. Anhand des unspezifischen Phänotyps kann nicht entschieden werden, ob eine zusätzliche antivirale Therapie oder eine zusätzliche immunsuppressive Therapie von Nutzen wäre. Damit besteht für die unterschiedlichen Kardiomyopathien keine an den jeweiligen Krankheitsverlauf angepasste Therapieoption, weshalb der Therapieerfolg insgesamt verhältnismäßig schlecht ist.
Die Figur 1 1 B zeigt eine schematische Übersichtsdarstellung über die Möglichkeiten, die zur Diagnose und Behandlung unterschiedlicher Kardiomyopathien existieren, wenn die vorliegende Erfindung bei der Diagnose berücksichtigt wird. Denn dann wird nicht mehr unspezifisch in „gesundes Herz" und „krankes Herz" unterschieden, vielmehr erfolgt eine Feindiagnostik im Hinblick auf die unterschiedlichen Typen von Kardiomyopathien. Dies wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figur 1 1 B noch näher erläutert.
Eine bei einem Patienten auftretende Kardiomyopathie kann unterschiedliche Ursachen haben. Beispielsweise kann eine Virusinfektion, eine Entzündung oder eine Speichererkrankung bzw. eine Autoimmunerkrankung ursächlich sein. Durch eine Feindiagnostik der Kardiomyopathie dahingehend, ob eine Entzündung vorliegt oder keine Entzündung vorliegt, kann bereits eine erste Differenzialdiagnose in Bezug auf die bei dem Patienten aufgetretene Kardiomyopathie erreicht werden. Kardiomyopathien, bei denen es keine Anzeichen für eine Entzündung gibt, können virusassoziiert oder virusfrei verlaufen. Bei virusnegativen Kardiomyopathien kann man in Kardiomyopathien mit einem geringen Myokardschaden und solche mit einem schweren Myokardschaden unterscheiden.
Eine virusnegative Kardiomyopathie mit einem geringen Myokardschaden kann auch als eine ausgeheilte Myokarditis, die keiner weiteren Behandlung bedarf, bezeichnet werden. Durch eine entsprechende Feindiagnostik kann der Patient vor der Anwendung einer nur unspezifischen konventionellen Herzinsuffizienztherapie bewahrt werden. Bei einer virusnegativen Kardiomyopathie ohne Entzündung mit einem ausgeprägten Myokardschaden liegt eine dilatative Kardiomyopathie vor, die dann mittels konventioneller Herzinsuffizienztherapie behandelt werden kann. Ist hingegen bei einem Patienten eine Kardiomyopathie festgestellt worden, bei der keine Entzündung festgestellt werden konnte, aber das Vorhandensein von Viren diagnostiziert wurde, zeigt dies eine virale Herzmuskelerkrankung an, die neben einer konventionellen Herzinsuffizienztherapie zusätzlich mit einer antiviralen Therapie behandelt werden kann oder muss.
Wird bei einer Kardiomyopathie eine Entzündung festgestellt, kann wiederum in einen viruspositiven und einen virus-negativen Verlauf unterschieden werden. Bei einem virus-positiven Verlauf liegt abermals eine chronisch-virale Herzmuskelerkrankung vor, so dass sich wiederum eine antivirale Therapie in Ergänzung einer konventionellen Herzinsuffizienztherapie anbietet. Bei einem virusnegativen Verlauf einer entzündlichen Kardiomyopathie kann in eine Kardiomyopathie mit einem schweren Myokardschaden und in eine Kardiomyopathie mit einem geringen Myokardschaden differenziert werden. Eine derartige Kardiomyopathie mit einem schweren Myokardschaden ist eine entzündliche Kardiomyopathie, bei der neben einer konventionellen Herzinsuffizienztherapie auch eine immunsuppressive Therapie durchgeführt werden sollte.
Bei einer virusnegativen Kardiomyopathie mit Entzündung und geringem Myokardschaden handelt es sich um eine Myokarditis, die sich im Phänotyp von einer dilatativen Kardiomyopathie unklarer Genese unterscheidet. Gleichfalls wird sie jedoch mittels einer konventionellen Herzinsuffizienztherapie behandelt werden. Eine zusätzliche immunsuppressive Therapie ist ebenfalls möglich.
Bei einem Vergleich der Figuren 1 1 A und 1 1 B wird deutlich, welche Vorteile eine Feindiagnostik unterschiedlicher Kardiomyopathien bzw. Speichererkrankungen des Herzens mit sich bringt. Denn nur mittels einer derartigen Feindiagnostik ist es möglich, jedem Patienten eine zielgerichtete Therapie anbieten zu können, die die bestmögliche Aussicht auf Heilung bietet. Zudem kann mittels einer entsprechenden Feindiagnostik eine unnötige und unwirksame Therapie bestimmter Kardiomyopathien vermieden werden, was sowohl den Körper der Patienten entlastet als auch für geringere Ausgaben im Gesundheitssystem sorgt.
In der nachfolgenden Tabelle 29 ist eine Übersicht der unterschiedlichen Kardiomyopathien dargestellt, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung voneinander unterschieden werden können. Die meisten dieser Erkrankungen können zwar grundsätzlich auch durch eine Biopsiediagnostik mittels klassischer Histologie - gegebenenfalls ergänzt durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) - diagnostiziert werden. Dies ist allerdings weitaus aufwendiger als eine miRNA-Diagnose. Zudem kann mittels der klassischen Methoden keine Coxsackievirus-induzierte Kardiomyopathie mit Spontanelimination und keine Coxsackievirus-induzierte Kardiomyopathie mit Viruspersistenz diagnostiziert werden. Dies ist nur mittels der vorliegend dargestellten miRNA-Diagnostik möglich.
Eine derartige Feindiagnostik dieser beiden Coxsackievirus-induzierten Kardiomyopathien ist jedoch von entscheidender Bedeutung. Denn während bei der Coxsackievirus-induzierten Kardiomyopathie mit Spontanelimination eine gute Prognose bezüglich des weiteren Krankheitsverlaufs vorliegt, ist die Prognose über den weiteren Krankheitsverlauf bei einer Coxsackievirus-induzierten Kardiomyopathie mit Viruspersistenz schlecht. Bei Viruspersistenz ist zudem eine antivirale Therapie dringend geboten, während bei einer Spontanelimination des Virus eine antivirale Therapie nicht erforderlich ist. Hier hängt also von einer hinreichend feinen Diagnostik ab, ob der betreffende Patient mit der für ihn geeigneten und sinnvollen Therapie behandelt werden kann oder nicht.
Wie aus der Tabelle 29 ebenfalls ersichtlich ist, ist es für keine der unterschiedlichen Kardiomyopathien möglich, aufgrund eines klinischen Befundes eine Therapieentscheidung zu treffen. Dies ist vielmehr nur nach einer hinreichend feinen miRNA-Diagnostik möglich.
In der Spalte „Therapieoption" sind verschiedene Möglichkeiten zur Therapie der betreffenden Kardiomyopathie angegeben. Dabei stellen die in nicht hinterlegten Feldern angegebenen Therapieoptionen echte Optionen dar, also Therapien, die gemacht werden können. Demgegenüber stellen die als „Indikationen" schraffiert hinterlegten Therapieroptionen solche Therapien dar, die gemacht werden müssen, um das Leben des Patienten nicht zu gefährden. Da eine entsprechende Therapie jedoch nur vorgenommen werden kann, wenn zuvor eine entsprechend feine Diagnose erstellt wurde, zeigt dies abermals, wie wichtig eine Feindiagnostik unterschiedlicher Kardiomyopathien und Speichererkrankungen des Herzens mittels Myokardbiopsie und microRNA-Diagnostik ist.
In den letzten vier Spalten der Tabelle 29 ist angegeben, welche Beispiele der vorliegenden Patentanmeldung welche spezifische Kardiomyopathie betreffen. Aufgrund dieser Korrelation ist leicht ersichtlich, wie wirkungsvoll und leistungsstark eine miRNA-basierte Diagnostik unterschiedlicher Kardiomyopathien ist.
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Claims

Patentansprüche
1 . Nukleinsäure zur Verwendung als Marker zur Identifizierung einzelner Formen nicht- ischämischer Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens, wobei die
Nukleinsäure eine Sequenz aufweist, die identisch oder komplementär ist zu der Sequenz a) einer microRNA, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus hsa-miR-105-5p (SEQ ID NO: 1 ), hsa-miR-105-3p (SEQ ID NO: 2), hsa-miR-107 (SEQ ID NO: 3), hsa-miR-1 178 (SEQ ID NO: 4), hsa-miR-1 179 (SEQ ID NO: 5), hsa-miR-1 180 (SEQ ID NO: 6), hsa-miR-1 181 (SEQ ID NO: 7), hsa-miR-1 182 (SEQ ID NO: 8), hsa-miR- 1 183 (SEQ ID NO: 9), hsa-miR-1200 (SEQ ID NO: 10), hsa-miR-1202 (SEQ ID NO: 1 1 ), hsa-miR-1207-3p (SEQ ID NO: 12), hsa-miR-122-5p (SEQ ID NO: 13), hsa-miR- 1224-3p (SEQ ID NO: 14), hsa-miR-1224-5p (SEQ ID NO: 15), hsa-miR-1225-3p
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3. Nukleinsäure zur Verwendung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die virusfreie dilatative Kardiomyopathie eine virusfreie dilatative Kardiomyopathie ohne Entzündung des Myokards oder eine virusfreie dilatative Kardiomyopathie mit Entzündung des Myokards ist, dass die Enterovirus-(Coxsackievirus-)induzierte Kardiomyopathie eine Enterovirus-(Coxsackievirus-)induzierte Kardiomyopathie mit
Spontanelimination des Virus durch das patienteneigene Immunsystem oder eine Enterovirus-(Coxsackievirus-)induzierte Kardiomyopathie ohne Spontanelimination des Virus durch das patienteneigene Immunsystem ist, dass die Erythrovirus-induzierte Kardiomyopathie eine Erythrovirus-induzierte Kardiomyopathie ohne Entzündung des Myokards und mit normaler Ejektionsfraktion oder eine Erythrovirus-induzierte
Kardiomyopathie mit Entzündung des Myokards und einer eingeschränkten Ejektionsfraktion ist und/oder dass die Myokarditis mit hohem Aufkommen von Entzündungszellen eine akute/aktive Myokarditis oder eine Borderline-Myokarditis ist.
4. Diagnostisches System zur Identifizierung einzelner Formen nicht-ischämischer Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens, mit mindestens einer Sonde, die eine Sequenz aufweist, welche einer Sequenz der microRNAs oder den Genen aus der Gruppe gemäß Anspruch 1 entspricht oder zu dieser komplementär ist.
5. Diagnostisches System gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Mittel zur Detektion eines zusätzlichen prognostischen Markers aufweist.
6. Diagnostisches System gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der prognostische Marker eine Deletion im CCR5-Gen ist.
7. Diagnostisches System gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass der prognostische Marker indikativ für eine erhöhte 7-Jahresmortalität, das Auftreten von Diabetes und/oder das Auftreten von Einzel- oder Doppelinfektionen des Herzmuskels mit Enteroviren, Erythroviren und/oder HHV6 bei Kardiomyopathie-Patienten ist.
8. Diagnostisches System zur Identifizierung des Genotyps in Bezug auf eine Deletion im CCR5-Gen, mit mindestens einer Sonde, die eine Sequenz aufweist, welche einem Abschnitt des CCR5-Gens entspricht oder zu dieser komplementär ist.
9. Diagnostisches System gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das System ein Kit zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion ist und die Sonden als Primer in Lösung vorliegen.
10. Diagnostisches System gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das System einen microRNA-Chip aufweist, auf den die Sonden aufgetragen sind.
1 1. Verfahren zur Identifizierung und Unterscheidung einzelner Formen nicht-ischämischer Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens, umfassend die folgenden Schritte:
Bereitstellung einer Probe, die von einem Patienten, bei dem ein Verdacht auf das Vorliegen einer nicht-ischämischen Kardiomyopathie oder einer Speichererkrankung des Herzens vorliegt, gewonnen wurde,
Inkontaktbringen der Probe mit mindestens einer Sonde, die eine Sequenz aufweist, welche den Sequenzen der microRNAs oder Genen aus der Gruppe gemäß Anspruch 1 entspricht oder zu diesen komplementär ist, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen in der Probe enthaltenen microRNAs und/oder Genen und der mindestens einen Sonde erlauben,
Ermittlung einer erfolgten Hybridisierung zwischen microRNAs und/oder Genen der Probe und der mindestens einen Sonde und
Bestimmung des Vorhandenseins einer microRNA und/oder eines Gens in der Probe anhand des Hybridisierungsergebnisses des vorherigen Schritts.
12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Ermittlung einer erfolgten Hybridisierung semi-quantitativ oder quantitativ erfolgt.
13. Medikament zur Behandlung von nicht-ischämischen Kardiomyopathien oder Speichererkrankungen des Herzens, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure, die eine
Sequenz aufweist, die identisch oder komplementär zu der Sequenz einer der microRNAs gemäß Anspruch 1 ist.
14. Verwendung des Genotyps in Bezug auf eine Deletion im CCR5-Gen als Biomarker, um eine Entscheidungshilfe geben zu können, ob bei einem Patienten eine Beta-Interferon- Therapie angezeigt ist oder nicht.
15. Verwendung des Genotyps in Bezug auf eine Deletion im CCR5-Gen als prognostischer Marker, der indikativ für eine erhöhte 7-Jahresmortalität und/oder eine Virusspontanelimination bei Kardiomyopathie-Patienten ist.
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