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WO2013073860A1 - 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 유용물질의 제조 방법 - Google Patents

이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 유용물질의 제조 방법 Download PDF

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WO2013073860A1
WO2013073860A1 PCT/KR2012/009655 KR2012009655W WO2013073860A1 WO 2013073860 A1 WO2013073860 A1 WO 2013073860A1 KR 2012009655 W KR2012009655 W KR 2012009655W WO 2013073860 A1 WO2013073860 A1 WO 2013073860A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
gene encoding
nucleotide sequence
acs
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2012/009655
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이상엽
장유신
임정애
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Original Assignee
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST filed Critical Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Publication of WO2013073860A1 publication Critical patent/WO2013073860A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant microorganism having a carbon dioxide fixing ability and a method for preparing a useful substance such as alcohol using the same, and more specifically, to express a gene encoding an ACS / CODH complex to prepare a recombinant microorganism having a carbon dioxide fixing ability.
  • Syngas is a mixture of carbon monoxide (CO) gas, carbon dioxide (CO 2 ) gas, hydrogen (H 2 ) gas, and other volatile gases (CH 4 , N 4 , NH 3 , H 25 ) and other trace gases.
  • CO carbon monoxide
  • CO 2 carbon dioxide
  • H 2 hydrogen
  • CH 4 , N 4 , NH 3 , H 25 volatile gases
  • Acetogenic Clostridia microorganisms grown in an atmosphere containing such syngas can absorb CO, CO 2 , and H 2 , which are components of syngas, and produce alcohol and aliphatic C 2 -C 6 organic acids. These syngas components activate the Wood-Ljungdahl metabolic pathway, leading to the formation of acetyl-coenzyme A, a major intermediate in the Wood-Ljungdahl pathway.
  • the Wood-Ljungdahl pathway is a biosynthesis pathway for acetyl-CoA and is an important means of generating energy for growth in some anaerobic microorganisms.
  • Enzymes that activate the Wood-Ljungdahl pathway are carbon monooxide dehydrogenase (CODH) and hydrogenase. These enzymes capture electrons from CO and H 2 in syngas and deliver them to ferredoxin, ie iron-sulfur (FeS) electron transport proteins. Due to the very low redox potential during syngas fermentation, perredoxin is a major electron carrier in the Wood-Ljungdahl pathway, mainly in anaerobic Clostridia.
  • CODH carbon monooxide dehydrogenase
  • FeS iron-sulfur
  • ferredoxin changes its electronic state from Fe3 + to Fe2 +.
  • Ferredoxin-binding electrons are then delivered to cofactors NAD + and NADP + via the activity of ferredoxin oxidoreductases (FORS).
  • FORS ferredoxin oxidoreductases
  • Reduced nucleotide cofactors (NAD + and NADP +) are used to produce intermediate compounds in the Wood-Ljungdahl pathway and form acetyl-CoA.
  • CO 2 or CO provides the substrate of that pathway.
  • Carbon derived from CO 2 is first reduced to formate by formate dehydrogenase (FDH) enzymes, which are then further reduced to methyl tetrahydrofolate intermediates and finally reduced to methyl groups.
  • FDH formate dehydrogenase
  • Carbon derived from CO is reduced to a carbonyl group by CODH.
  • the two carbon moieties are then incorporated into acetyl-CoA by acetyl CoA synthase (ACS), which is part of the CODH / ACS complex.
  • ACS acetyl CoA synthase
  • Acetyl-CoA is a key metabolite in the production of C 2 -C 6 alcohols and acids in acetogenic Clostridia.
  • acetogenic Clostridia produces, via the Wood-Ljungdahl route, a portion of a mixture of C 2 -C 6 alcohols and acids that are currently of commercial interest, such as ethanol, n-butanol, hexanol, acetic acid, and butyric acid. .
  • acids such as ethanol, n-butanol, hexanol, acetic acid, and butyric acid.
  • productivity is very low and there is a difficulty in metabolic operation.
  • the present inventors have tried to develop a microorganism with improved yield of a desired product based on the Wood-Ljungdahl pathway, and thus, encodes an ACS / CODH (acetyl-CoA synthases / carbon monoxide dehydrogenase complex) complex involved in the Wood-Ljungdahl pathway. Cloning the genes and then introducing them into heterologous host microorganisms for the first time to confirm the activity of the genes encoding the ACS / CODH complex and the enzymes of these products, and introducing such genes to produce a recombinant microorganism having a carbon dioxide fixation ability. It was confirmed that the recombinant microorganism is suitable for high yield production of useful substances such as the fixation of CO 2 and alcohol, and completed the present invention.
  • ACS / CODH acetyl-CoA synthases / carbon monoxide dehydrogenase complex
  • An object of the present invention is to provide a host microorganism comprising a gene encoding an acetyl-CoA synthase / carbon monooxide dehydrogenase (ACS / CODH) complex or a recombinant vector containing the gene.
  • the present invention provides a recombinant microorganism having a carbon dioxide fixing ability and a method for preparing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a method for fixing CO 2 using the recombinant microorganism and a method for preparing useful materials.
  • the present invention provides a gene encoding the acetyl-CoA synthase / carbon monooxide dehydrogenase (ACS / CODH) complex or the gene to a host microorganism.
  • ACS / CODH carbon monooxide dehydrogenase
  • a recombinant microorganism having a carbon dioxide fixation capability into which a recombinant vector containing is introduced.
  • the present invention also relates to a host microorganism comprising a gene encoding an acetyl-CoA synthase / carbon monooxide dehydrogenase (ACS / CODH) complex or a recombinant vector containing the gene.
  • ACS / CODH carbon monooxide dehydrogenase
  • a recombinant vector containing the gene Provided is a method for producing a recombinant microorganism, characterized in that the introduction.
  • the present invention also provides a method of fixing the CO 2 which comprises culturing a recombinant microorganism under the CO 2 present.
  • the present invention also provides a method for producing a useful material, characterized in that the recombinant microorganism is cultured in the presence of CO 2 to generate a useful material, and then recover the produced useful material.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism into which a gene encoding an ACS / CODH (acetyl-CoA synthases / carbon monoxide dehydrogenase complex) complex involved in the Wood-Ljungdahl pathway is introduced. It is useful in producing high concentrations and high yields of useful substances such as alcohols and organic acids from CO2.
  • ACS / CODH acetyl-CoA synthases / carbon monoxide dehydrogenase complex
  • 1 is a schematic diagram showing the Wood-Ljungdahl pathway, which is a pathway for synthesizing acetyl-CoA from syngas, and the production of various biocompounds and biofuels using the same.
  • 2 is a cleavage map of the recombinant vector pTHL20-ACS-CODH.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a gene encoding the Tetrahydrofolate cycle and ACS / CODH complex in Clostridium acetobutylicum.
  • the present invention in the host microorganism, contains a gene encoding the acetyl-CoA synthase / carbon monooxide dehydrogenase (ACS / CODH) complex or the gene
  • the present invention relates to a recombinant microorganism having a carbon dioxide fixing ability, into which a recombinant vector is introduced.
  • the gene encoding the ACS / CODH complex is dihydrolipoamide dehydrogenase (CD0723) (SEQ ID NO: 1), carbon monooxide dehydrogenase chaperone (carbon monooxide dehydrogenase chaperone) ( CD0724) (SEQ ID NO: 2), corrinoid iron-sulfur protein small subunit (CD0725) (SEQ ID NO: 3), corrinoid iron-sulfur protein large subunit ( CD0726) (SEQ ID NO: 4), methyltransferase subunit (CD0727) (SEQ ID NO: 5), acetyl-CoA synthase (ACS) or ACS / CODH subunit alpha (CD0728) (SEQ ID NO: 6) And one or more genes selected from the group consisting of glycine cleavage system H protein (CD0729) (SEQ ID NO: 7), but is not limited thereto.
  • CD0729 dihydrolipoamide dehydrogenas
  • genes encoding the ACS / CODH complexes such as SEQ ID NOS: 1 to 7, which are involved in the Wood-Ljungdahl pathway, can be obtained from various biological sources, in particular from acetogens or methanogens. It is more preferable to obtain.
  • meta nojeon is Methanobacterium bryantii, Methanobacterium formicum, Methanobrevibacter arboriphilicus, Methanobrevibacter gottschalkii, Methanobrevibacter ruminantium, Methanobrevibacter smithii, Methanocalculus chunghsingensis, Methanococcoides burtonii, Methanococcus aeolicus, Methanococcus deltae, Methanococcus jannaschii, Methanococcus maripaludis, Methanococcus vannielii, Methanocorpusculum labreanum, Methanoculleus strengensis (Methanogenium olentangyi & Methanogenium bourgense), Methanoculleus marisnigri, Methanofollis liminatans, Methanogenium cariaci, Methanogenium frigidum, Methanogenium organosaosa, Methanogenium
  • Clostridium glycolicum Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium scatologenes, Clostridium ultunense, Clostridium sp.
  • Eubacterium aggregans Eubacterium limosum, Holophaga foetida, Moorella glycerini, Moorella mulderi, Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Moorella sp.
  • Sporomusa acidovorans For example, Sporomusa acidovorans, Sporomusa aerivorans, Sporomusa malonica, Sporomusa ovata, Sporomusa paucivorans, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Sporomusa termitida, Sporomusa sp., Syntrophococcus sucromutans,
  • the genes encoding the ACS / CODH complex are genes that form the ACS / CODH complex involved in the step of biosynthesis of carbonyl group, methyl group and coenzyme A in Wood-Ljundahli pathway, Clostridium difficille cloned a gene of about 9 kb in length without a homology protein and then expressed it in Clostridium acetobutylicum, a heterologous host microorganism in which the gene was deleted, thereby expressing the ACS / CODH complex activity. It is proved through experiments that it is important gene in.
  • the gene of the present invention may be variously modified in the coding region within a range that does not change the amino acid sequence of the protein expressed from the coding region, and various modifications within the range that does not affect the expression of the gene even in parts other than the coding region. Modifications may be made and such modified genes are also within the scope of the present invention.
  • the present invention also encompasses polynucleotides having fragment sequences that are substantially identical to those of the genes.
  • substantially identical polynucleotide means a gene encoding an enzyme having the same function as used in the present invention, regardless of the homology of the sequence.
  • a fragment of the gene also refers to a gene encoding an enzyme having the same function as used in the present invention, regardless of the length of the fragment.
  • amino acid sequence of the protein which is the expression product of the gene of the present invention, can be secured from biological resources such as various microorganisms within a range that does not affect the titer and activity of the enzyme. It is included in the scope of the present invention.
  • the present invention also encompasses polypeptides and fragments of such polypeptides having amino acid sequences substantially identical to those proteins.
  • substantially identical polypeptide means a protein having the same function as used in the present invention, regardless of the homology of the amino acid sequence.
  • a fragment of the polypeptide also refers to a protein having the same function as used in the present invention, regardless of the length of the fragment.
  • vector refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing DNA in a suitable host.
  • Vectors can be plasmids, phage particles or simply potential genomic inserts. Once transformed into the appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are the most commonly used form of current vectors, "plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. For the purposes of the present invention, it is preferred to use plasmid vectors.
  • Typical plasmid vectors that can be used for this purpose include (a) a replication initiation point that allows for efficient replication, including several to hundreds of plasmid vectors per host cell, and (b) host cells transformed with plasmid vectors. It has a structure that includes an antibiotic resistance gene that allows it to be used and a restriction enzyme cleavage site (c) into which foreign DNA fragments can be inserted. Although no appropriate restriction enzyme cleavage site is present, the use of synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods facilitates ligation of the vector and foreign DNA. After ligation, the vector should be transformed into the appropriate host cell. Transformation can be readily accomplished using calcium chloride methods or electroporation (Neumann, et al., EMBO J. , 1: 841, 1982) and the like.
  • an expression vector known in the art may be used as the vector used for overexpression of the gene according to the present invention.
  • Sequences are "operably linked” when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences. This may be genes and regulatory sequence (s) linked in such a way as to enable gene expression when appropriate molecules (eg, transcriptional activating proteins) bind to regulatory sequence (s).
  • the DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to the DNA for the polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide;
  • a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • "operably linked” means that the linked DNA sequence is in contact, and in the case of a secretory leader, is in contact and present within the reading frame.
  • enhancers do not need to touch. Linking of these sequences is performed by ligation (linking) at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods are used.
  • the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the chosen expression host.
  • the expression control sequence and the corresponding gene will be included in one recombinant vector containing the bacterial selection marker and the replication origin. If the host cell is a eukaryotic cell, the recombinant vector must further comprise an expression marker useful in the eukaryotic expression host.
  • transformation means that DNA is introduced into a host such that the DNA is replicable as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.
  • the gene encoding the ACS / CODH complex may be characterized in that it is introduced into the genome of the host cell and present as a chromosome factor. It will be apparent to those skilled in the art that the present invention may have the same effect as when the recombinant vector is introduced into the host cell even when the gene is inserted into the genomic chromosome of the host cell.
  • the host microorganism may be used as the host microorganism without limitation as long as it is a microorganism, but it is preferable to use a microorganism of the genus Clostridium.
  • the microorganisms of the genus Clostridium include Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharobutylicum, Clostrit Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium difficile, Clostridium butyricum ), Clostridium butylicum, Clostridium kluyveri, Clostridium tyrobutylicum, Clostridium tyrobutyricum and the like can do.
  • the present inventors cloned a gene of about 9 kb in length from a Clostridium difficille without a homologous protein, and then expressed it in Clostridium acetobutylicum, a heterologous host microorganism in which the gene was deleted. Experiments proved that this gene is important for activity.
  • the host microorganism may be characterized by having some or all of the genes encoding enzymes involved in the Wood-Ljungdahl pathway.
  • the gene encoding the enzymes involved in the Wood-Ljungdahl pathway is a concept including a gene encoding the ACS / CODH complex, and the host microorganism may have some or all genes encoding the enzymes involved in the Wood-Ljungdahl pathway.
  • the inventors have demonstrated through experiments that genes encoding enzymes involved in the Wood-Ljungdahl pathway present in Clostridium acetobutylicum are important genes for ACS / CODH complex activity. Specifically, the genes present in Clostridium acetobutylicum were proved through experiments that they are important genes for ACS / CODH complex activity through knockout experiments.
  • the recombinant microorganism of the present invention has carbon dioxide fixation ability by using a gene encoding the enzymes involved in the Wood-Ljungdahl pathway originally possessed by the host microorganism and / or a gene encoding the ACS / CODH complex cloned by the present inventors.
  • the gene encoding the enzymes involved in the Wood-Ljungdahl pathway of the host microorganism is carbon monooxide dehydrogenase (carbon monooxide dehydrogenase) (CAC0116, also CAC2498) (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9) , Formyl-tetrahydrofolate synthase (CAC3201) (SEQ ID NO: 10), formomido-tetrahydrofolate cyclodeaminase (formimido-H4folate cyclodeaminase) (CAC2310, CAC2083) (SEQ ID NO: 11 (SEQ ID NO: 12), formyl-tetrahydrofolate cyclohydrolase / methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase (formyl-H4folate cyclohydrolase / methylene-H4folate dehydrogenase) (CAC2091) (
  • the present invention relates to a host microorganism comprising a gene encoding the acetyl-CoA synthase / carbon monooxide dehydrogenase (ACS / CODH) complex or containing the gene.
  • the present invention relates to a method for producing a recombinant microorganism, comprising introducing a recombinant vector.
  • the invention by culturing a recombinant microorganism according to the invention in the CO 2 present invention relates to a method of fixing the CO 2.
  • the recombinant microorganism according to the present invention can fix CO 2 using newly introduced genes and genes originally possessed.
  • the present invention relates to a method for producing a useful substance, characterized in that by culturing the recombinant microorganism according to the present invention, to generate a useful substance, and then to recover the produced useful substance.
  • the recombinant microorganism according to the present invention produces useful substances such as alcohol using CO 2 as a carbon source.
  • the useful substance may be an alcohol including butanol or ethanol, but is not limited thereto.
  • it will include all materials produced by recombinant microorganisms having a CO 2 fixing ability according to the present invention.
  • useful substances include alcohols, amino acids, organic acids, alkenes, polymer monomers, and the like, and the alcohols may be linear or branched alcohols having 2 to 10 carbon atoms, more specifically ethanol, isobutanol, propanol, hexanol, heptane Ol, octanol, nonanol, decanol, tert-butanol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 2-methyl-1-butanol, 3-methyl-1-butanol, 2-methyl- 2-butanol and the like may be further included.
  • Recombinant microorganism according to the present invention has a feature that can be produced in high concentration, high yield of the desired useful substances, such as alcohol, compared to the strains that naturally fix the carbon dioxide using Wood-Ljungdal pathway.
  • the present invention by introducing a metabolic circuit capable of fixing CO 2 to a mutant microorganism that has undergone metabolic engineering for the production of existing specific target compounds (amino acids, organic acids, alkenes, polymer monomers, etc.) There are features that can be produced from.
  • a clone of a gene encoding an ACS / CODH complex from Clostridium difficille is cloned, and the gene is introduced into a Clostridium acetobutylicum host microorganism having a portion of a gene encoding enzymes involved in the Wood-Ljungdahl pathway. Microorganisms were produced. Then, by culturing the produced recombinant microorganism, it was confirmed that the recombinant microorganism produces butanol and ethanol in high yield.
  • a shuttle vector for exogenous protein expression comprising a thiolase promoter and a ribosomal binding site (RBS) of Clostridium acetobutylicum was prepared as follows.
  • Thiolase is known to be able to express genes continuously and stably without being strongly influenced by the cell growth cycle (Tummala et al., Appl. Environ. Microbiol., 65: 3793-3799, 1999). Therefore, in this example, the promoter located on the top of the thiolase (NCBI GeneID: 1119056) was cloned and inserted into pIMP-H1del.
  • pIMP-H1del is a shuttle vector that uses pIMP1 as a template by removing one HindIII site in the 3408th base from the pIMP1 having two HindIII restriction sites and leaving only the restriction site located in the 743th base sequence.
  • the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and the total DNA of the Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) strain were subjected to PCR as a template to amplify the thiolase promoter. After amplified thiolase promoter fragments were purified and recovered, treated with HindIII and PstI restriction enzymes, and then conjugated with the same enzyme-treated pIMP-H1del shuttle vector to complete pTHL1 vector production.
  • pSOS95-Cm PCR of the primers pSOS95-Cm, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 to amplify the chloramphenicol resistance gene, purified and recovered amplified chloramphenicol resistance gene fragments, and then treated with HindIII restriction enzyme, the same
  • the pTHL2-Cm vector was constructed by adding an NcoI site to the MCS site by ligation with the enzyme-treated pTHL1 shuttle vector.
  • pSOS95-Cm can be produced by cloning the thioloase promoter of ATCC 824 strain to pSOS95 (Nair and Papoutsakis, J. Bacteriol., 176: 5843-5846, 1994) and cloning the chloramphenicol / thiamphenicol resistance gene in its downstream. .
  • PCR of the ATCC 824 gDNA as a template was carried out using primers of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 to amplify a part of the thiolase gene, and the amplified gene After purification and recovery of fragments, pTHL20 vector with XbaI-PstI-KpnI-SphI site was added to MCS site by treating with NcoI and SalI restriction enzyme and ligation with pTHL2-Cm shuttle vector treated with the same enzyme. Was completed.
  • PCR of the primers of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 and total DNA of C. difficile was performed to amplify the first fragment of the ACS / CODH gene complex, and the purified and recovered amplified gene fragments were then subjected to NcoI-PstI.
  • PTHL20-ACS-CODH1 production was completed by conjugation with a restriction enzyme and ligation with the same enzyme-treated pTHL20 shuttle vector.
  • PCR of the primers of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23, total DNA of C. difficile was performed to amplify the second fragment of the ACS / CODH gene complex, purified and recovered amplified gene fragments, and then PstI-AvaI.
  • PTHL20-ACS-CODH2 production was completed by treating with restriction enzyme and ligation with pTHL20-ACS-CODH1 treated with the same enzyme.
  • PCR of the primers of SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, and total DNA of C. difficile was performed to amplify the second fragment of the ACS / CODH gene complex, purified and recovered amplified gene fragments, and then PstI restriction enzyme.
  • PTHL20-ACS-CODH preparation was completed by ligation with the same enzyme-treated pTHL20-ACS-CODH2 (FIG. 2).
  • the recombinant vector pTHL20-ACS-CODH prepared in Example 2 was introduced into Clostridium acetobutylicum ATCC 824 strain using the electroporation method to prepare an ATCC 824-ACS / CODH strain.
  • E. coli TOP10 containing Bacillus subtilis Phage ⁇ 3T I methyltransferase expression vector, pAN1 (Mermelstein et al. , Appl. Environ. Microbiol., 59: 1077, 1993) Recombinant vectors prepared in Example 2 were introduced to induce methylation to be suitable for transformation to Clostridium.
  • the methylated vector was isolated and purified from E. coli, and the vector was introduced into Clostridium acetobutylicum mutant ATCC 824 to prepare a recombinant mutant microorganism.
  • ATCC 824 competent cells for transformation were prepared as follows. First inoculated M5 strain in 10 ml CGM (Table 1) and then incubated until OD 0.6. 10% inoculated in 60 ml of 2X YTG medium (16 g of Bacto Tryptone, 16 g of Yeast extract, 4 g of NaCl, 5 g of Glucose, per liter) and incubated for 4-5 hours. After washing twice with transformation buffer (EPB, 15 mL of 270 mM sucrose, 110 ⁇ L of 686 mM NaH 2 PO 4 , pH N.4), the microbial cells were suspended with 2.4 mL of the same buffer.
  • transformation buffer EMB, 15 mL of 270 mM sucrose, 110 ⁇ L of 686 mM NaH 2 PO 4 , pH N.4
  • the recombinant mutant microorganism ATCC 824-ACS / CODH was cultured to evaluate carbon dioxide fixation ability. After sterilizing a 100 ml serum bottle containing 10 ml of CGM medium, the mixture was removed at 80 ° C. or higher, cooled to room temperature in an anaerobic chamber, and then 40 ⁇ g / ml of erythromycin was added thereto, inoculated with the recombinant mutant microorganisms, and septum. After completely closed, the culture was carried out for 7 days under anaerobic conditions at 37 °C. Cultivation was performed in three replicate experiments.
  • the recombinant mutant microorganism ATCC 824-ACS / CODH was cultured in 13C-CO 2 to evaluate carbon dioxide fixation ability.
  • the culture was carried out under the same conditions as in Example 4, but 13C-sodium bicarbonate was additionally supplied from the outside as 13C-CO 2 .
  • metabolites were collected and analyzed by using a Gas Chromatograph / Mass Spectrometer (Clarus 600 series + TurboMatrix HSS Trap, PerkinElmer). Ionization of the mass spectrometer was performed using Electron Ionization (EI) method. As a result, there was no detection of isotopically labeled metabolites in the control group.
  • EI Electron Ionization
  • 13-C isotope compounds were observed in the metabolite analysis obtained from the culture medium of the recombinant mutant microorganism ATCC 824-ACS / CODH.
  • the mass spectrometry analyzed in the culture medium of the recombinant mutant microorganism ATCC 824-ACS / CODH was relatively higher than that of the control group.
  • / z showed a peak of 45. This is the result shown in CH 3 CO- ions as part of the labeling isotope (13 CH 3 13 CO-) m / z 45 to appear at the m / z 43.
  • the carbon dioxide fixation ability of the recombinant mutant microorganism ATCC 824-ACS / CODH was confirmed.
  • candidate genes were excavated (FIG. 3), and the genes encoding ACS / CODH complexes were confirmed by deleting these genes and confirming the disappearance of carbon dioxide fixation ability.
  • butanol, ethanol, acetone, organic acid production ability was tested because Clostridium acetobutylicum was used as a host.
  • Butanol and ethanol production ability for the mutant microorganism ATCC 824-ACS / CODH prepared in the above Example was confirmed.
  • Pre-cultivation was carried out under anaerobic conditions until the absorbance (600 nm) at 1.0 was 1.0.
  • the glucose in the medium was measured by a glucose analyzer (model 2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA), and the medium was collected by time, and the concentration of acetone produced therefrom was packed into a column (Supelco Carbopack TM B). It was measured by gas chromatography (Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA) equipped with AW / 6.6% PEG 20M, 2 m ⁇ 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA.
  • the mutant microorganism ATCC 824-ACS / CODH produced a final concentration of 13.8 g / l butanol and 2.6 g / l ethanol at 37 ° C. fermentation (Table 2). This is superior to 10.4 g / L butanol and 0.8 g / L ethanol produced by the control.
  • the yield for butanol showed 0.20 g / g higher than 0.16 g / g of the control and the butanol productivity showed 0.40 g / L / h according to 0.26 of the control.
  • the cell mass was also shown to be improved.
  • Clostridium carboxidivorans P7 strain which naturally has a Wood-Ljungdahl pathway, is only producing 2.2 mg / L of butanol.
  • the embodiment of the present invention is naturally better than the strains having the Wood-Ljungdahl pathway, showing the advantages that the introduction of the Wood-Ljungdahl pathway to other hosts through recombination.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism into which a gene encoding an ACS / CODH (acetyl-CoA synthases / carbon monoxide dehydrogenase complex) complex involved in the Wood-Ljungdahl pathway is introduced. It is useful in producing high concentrations and high yields of useful substances such as alcohols and organic acids from CO2.
  • ACS / CODH acetyl-CoA synthases / carbon monoxide dehydrogenase complex

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Abstract

본 발명은 Wood-Ljungdahl 경로에 관여하는 ACS/CODH(acetyl-CoA synthases/carbon monoxide dehydrogenase complex) 복합체를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 이산화탄소 고정능을 가지고 있어, CO2로부터 알코올, 유기산과 같은 유용물질을 고농도, 고수율로 생산하는데 유용하다.

Description

이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 유용물질의 제조 방법
이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 알코올과 같은 유용물질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자를 발현시켜 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물을 제조하는 방법 및 이러한 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 CO2의 고정방법 및 유용물질의 제조 방법에 관한 것이다.
합성가스는 일산화탄소(CO) 가스, 이산화탄소(CO2) 가스, 수소(H2) 가스, 및 다른 휘발성 가스(CH4, N4, NH3, H25) 및 기타 미량 가스의 혼합물로서, 바이오매스, 유기 폐기물, 석탄, 석유, 플라스틱 또는 다른 탄소 함유 물질 또는 개량된 천연 가스를 포함하는 다양한 유기 물질의 가스화에 의해 생산된다.
이러한 합성 가스를 포함하는 대기 중에서 성장시킨 acetogenic Clostridia 미생물은 합성가스의 구성성분인 CO, CO2, 및 H2를 흡수할 수 있고, 알코올 및 지방족 C2-C6 유기산을 생산할 수 있다. 이러한 합성가스 구성성분은 Wood-Ljungdahl 대사 경로(pathway)를 활성화시켜, Wood-Ljungdahl 경로에 있어서 주요한 중간물질인 acetyl-coenzyme A의 형성을 유도한다.
Wood-Ljungdahl pathway는 아세틸-CoA를 생합성하는 경로로서, 일부 혐기성 미생물에서 성장을 위한 에너지를 생성하는데 있어서 중요한 수단으로 이용된다.
Wood-Ljungdahl 경로를 활성화시키는 효소는 carbon monooxide dehydrogenase(CODH) 및 수소화효소(hydrogenase)이다. 이러한 효소는 합성가스 중 CO 및 H2로부터 전자를 포획하고 이를 페레독신, 즉, 철-황(FeS) 전자 수송 단백질에게 전달한다. 합성가스 발효 중에는 산화환원전위가 매우 낮기 때문에, 페레독신은 주로 혐기성 클로스트리디아 내에서 Wood-Ljungdahl 경로에 있어서 주요 전자 운반자이다.
전자 전달시, 페레독신은 Fe3+에서 Fe2+로 전자상태를 변화한다. 페레독신-결합 전자는 그 다음 ferredoxin oxidoreductases (FORS)의 활성을 통해 보조인자인 NAD+ 및 NADP+에게 전달된다. 환원된 뉴클레오티드 보조인자(NAD+ 및 NADP+)는 Wood-Ljungdahl 경로에서 중간 화합물의 생성에 이용되고, 아세틸-CoA를 형성시킨다.
Wood-Ljungdahl 경로를 통한 아세틸-CoA합성에 있어서, CO2 또는 CO는 상기 경로의 기질을 제공한다. CO2로부터 유래한 탄소는 우선 formate dehydrogenase(FDH) 효소에 의해 formate로 환원된 뒤, 추가적으로 methyl tetrahydrofolate 중간산물로 환원됨으로서, 최종적으로 메틸기로 환원된다. CO로부터 유래한 탄소는 CODH에 의해 카보닐기로 환원된다. 그 다음 상기 두 개의 탄소 moieties는 CODH/ACS 복합체의 일부인 아세틸 CoA 합성효소(ACS)에 의해 아세틸-CoA로 통합된다. 아세틸-CoA는 acetogenic Clostridia에서 C2-C6 알코올 및 산의 생성에 있어서 중심적인 대사산물이다.
이와 같이, acetogenic Clostridia는 Wood-Ljungdahl 경로를 통해서, 현재 상업적으로 주목받고 있는 C2-C6 알코올 및 산, 예컨대, 에탄올, n-부탄올, 헥산올, 아세트산, 및 부틸릭산의 혼합물을 일부 생산한다. 그러나, 그 생산성이 매우 낮은 문제점이 있고 대사조작의 어려움이 있다.
이에 본 발명자들은, Wood-Ljungdahl 경로를 토대로 목적하는 생산물의 수율이 향상된 미생물을 개발하기 위해 노력한 결과, Wood-Ljungdahl 경로에 관여하는 ACS/CODH(acetyl-CoA synthases/carbon monoxide dehydrogenase complex) 복합체를 코딩하는 유전자들을 클로닝한 뒤, 이종 숙주 미생물에 도입하여 최초로 발현시킴으로서 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자 및 이들 산물인 효소의 활성을 확인함과 아울러, 이러한 유전자를 도입하여 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물을 제작하고, 상기 재조합 미생물이 CO2의 고정 및 알코올 등 유용물질의 고수율 생산에 적합함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 숙주 미생물에, 아세틸-CoA 합성효소/카본 모노옥사이드 디히드로게나아제 (acetyl-CoA synthase/carbon monooxide dehydrogenase, ACS/CODH) 복합체를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 CO2의 고정 방법 및 유용물질의 제조 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 숙주 미생물에, 아세틸-CoA 합성효소/카본 모노옥사이드 디히드로게나아제 (acetyl-CoA synthase/carbon monooxide dehydrogenase, ACS/CODH) 복합체를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 숙주 미생물에, 아세틸-CoA 합성효소/카본 모노옥사이드 디히드로게나아제 (acetyl-CoA synthase/carbon monooxide dehydrogenase, ACS/CODH) 복합체를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 도입시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 미생물 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 CO2 존재하에 배양하는 것을 특징으로 하는 CO2의 고정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 CO2 존재하에 배양하여, 유용물질을 생성시킨 다음, 생산된 유용물질을 회수하는 것을 특징으로 하는, 유용물질 제조방법을 제공한다.
본 발명은 Wood-Ljungdahl 경로에 관여하는 ACS/CODH(acetyl-CoA synthases/carbon monoxide dehydrogenase complex) 복합체를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 이산화탄소 고정능을 가지고 있어, CO2로부터 알코올, 유기산과 같은 유용물질을 고농도, 고수율로 생산하는데 유용하다.
도 1은 합성가스로부터 아세틸-CoA를 생합성하는 경로인 Wood-Ljungdahl 경로 및 이를 이용한 다양한 바이오화합물 및 바이오연료 생산을 나타낸 도식도이다.
도 2는 재조합 벡터 pTHL20-ACS-CODH의 개열 지도이다.
도 3은 Clostridium acetobutylicum에서 Tetrahydrofolate cycle과 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자의 도식도이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명자는 Wood-Ljungdahl 경로에 관여하는 ACS/CODH(acetyl-CoA synthases/carbon monoxide dehydrogenase complex) 복합체를 코딩하는 유전자들을 클로닝하여 이종 숙주 미생물에서 최초로 발현시킴으로서 상기 유전자들의 기능을 실험적으로 규명하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 숙주 미생물에, 아세틸-CoA 합성효소/카본 모노옥사이드 디히드로게나아제 (acetyl-CoA synthase/carbon monooxide dehydrogenase, ACS/CODH) 복합체를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서, ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자는 디히드로리포아미드 디히드로게나아제(dihydrolipoamide dehydrogenase)(CD0723)(서열번호 1), 카본 모노옥사이드 디히드로게나아제 셰프론(carbon monooxide dehydrogenase chaperone)(CD0724)(서열번호 2), 코리노이드 철-황 단백질 소단위(corrinoid iron-sulfur protein small subunit)(CD0725)(서열번호 3), 코리노이드 철-황 단백질 대단위(corrinoid iron-sulfur protein large subunit)(CD0726)(서열번호 4), 메틸트랜스퍼라아제 서브유닛(methyltransferase subunit)(CD0727)(서열번호 5), 아세틸-CoA 합성효소(ACS) 또는 ACS/CODH 서브유닛 알파(CD0728)(서열번호 6) 및 글리신 절단 시스템 H 단백질(glycine cleavage system H protein)(CD0729)(서열번호 7)을 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, Wood-Ljungdahl pathway에 관여하는, 상기 서열번호 1 내지 7과 같은 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자의 수득은 다양한 생물자원으로부터 할 수 있으며, 특히 아세토전(acetogen)이나 메타노전(methanogen)으로부터 수득하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명에 있어서, 메타노전은 Methanobacterium bryantii, Methanobacterium formicum, Methanobrevibacter arboriphilicus, Methanobrevibacter gottschalkii, Methanobrevibacter ruminantium, Methanobrevibacter smithii, Methanocalculus chunghsingensis, Methanococcoides burtonii, Methanococcus aeolicus, Methanococcus deltae, Methanococcus jannaschii, Methanococcus maripaludis, Methanococcus vannielii, Methanocorpusculum labreanum, Methanoculleus bourgensis (Methanogenium olentangyi & Methanogenium bourgense), Methanoculleus marisnigri, Methanofollis liminatans, Methanogenium cariaci, Methanogenium frigidum, Methanogenium organophilum, Methanogenium wolfei, Methanomicrobium mobile, Methanopyrus kandleri, Methanoregula boonei, Methanosaeta concilii, Methanosaeta thermophila, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Methanosphaera stadtmanae, Methanospirillium hungatei, Methanothermobacter defluvii (Methanobacterium defluvii), Methanothermobacter thermautotrophicus (Methanobacterium thermoautotrophicum), Methanothermobacter thermoflexus (Methanobacterium thermoflexum), Methanothermobacter wolfei (Methanobacterium wolfei), Methanothrix sochngenii 등을 예시할 수 있으며, 아세토전은 Acetoanaerobium ruminis, Acetoanaerobium noterae, Acetoanaerobium romashkovii, Acetobacterium baloi, Acetobacterium carbinolicum, Acetobacterium dehalogenans, Acetobacterium fimetarium, Acetobacterium malicum, Acetobacterium paludosum, Acetobacterium psammolithicum, Acetobacterium tundrae, Acetobacterium wieringae, Acetobacterium woodii, Acetobacterium sp., Acetonema longum, Bryantella formatexigens, Butyribacterium methylotrophicum, Caloramator fervidus, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium coccoides, Clostridium difficile, Clostridium formicaceticum, Clostridium glycolicum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium mayombei, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium scatologenes, Clostridium ultunense, Clostridium sp., Eubacterium aggregans, Eubacterium limosum, Holophaga foetida, Moorella glycerini, Moorella mulderi, Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Moorella sp., Natroniella acengena, Natronincola histidinovorans, Oxobacter pfennigii, Ruminococcus hydrogenotrophicus, Ruminococcus productus, Ruminococcus schinkii, Ruminococcus sp., Sporomusa acidovorans, Sporomusa aerivorans, Sporomusa malonica, Sporomusa ovata, Sporomusa paucivorans, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Sporomusa termitida, Sporomusa sp., Syntrophococcus sucromutans, Thermoacetogenium phaeum, Thermoanaerobacter kivui 등을 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자는 Wood-Ljundahli pathway에서, 카보닐기와 메틸기 및 코엔자임 A가 생합성되는 단계에 관여하는 ACS/CODH 복합체(complex)를 형성하는 유전자들로서, 본 발명자는 Clostridium difficille로부터, 상동성(homology)을 가지는 단백질이 없는 약 9kb 길이의 유전자를 클로닝한 뒤, 이를 상기 유전자가 결실되어 있는 이종 숙주 미생물인 Clostridium acetobutylicum에서 발현시킴으로써, 상기 유전자들이 ACS/CODH 복합체 활성에 있어서 중요한 유전자임을 실험을 통해 증명하였다.
본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열의 상동성과는 무관하게, 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 효소를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 단편 또한 단편의 길이와는 무관하게, 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 효소를 코딩하는 유전자를 의미한다.
또한, 본 발명의 유전자의 발현산물인 단백질의 아미노산 서열이 해당 효소의 역가 및 활성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 미생물 등 생물자원들로부터 확보될 수 있으며, 그러한 다른 생물자원으로부터 확보한 단백질 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
따라서, 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 아미노산 서열의 상동성과는 무관하게, 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 폴리펩티드의 단편 또한 단편의 길이와는 무관하게, 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 단백질을 의미한다.
본원에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.
염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
아울러, ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자는 숙주세포의 게놈에 도입되어 염색체 상 인자로서 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.
본 발명에 있어서, 숙주 미생물은 미생물이라면 제한없이 숙주 미생물로 이용할 수 있으나, 클로스트리듐 속 미생물을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 클로스트리듐 속 미생물로는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(Clostridium saccharobutylicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butylicum), 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 타이로부틸리쿰(Clostridium tyrobutylicum), 클로스트리듐 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 등을 예시할 수 있다.
지금까지 ACS/CODH를 다양한 host에서 발현시키려는 노력은 있었으나, 이종 host에서 발현시켜 활성을 보인 경우는 없었다. 종래에는 genome sequencing에 기반한 단순한 computational annotation 정보만 있으므로 이를 실험적으로 증명하여 characterization이 되어 있지 않았기에 이종 host에서의 발현이 매우 어려웠다. 또한, 이들 균주들에 대한 분자생물학적 연구의 미비 및 이와 관련된 도구들의 부재로 인하여 이들 균주들이 가진 유전자에 대한 검증이 불가능한 형편이다. 또한, 단순한 computational annotation 정보에 따른 유전자의 기능분석과 유전자의 발현을 통한 단백질의 실제 활성은 별개의 일이다. 본 발명자는 Clostridium difficille로부터, 상동성을 가지는 단백질이 없는 약 9kb 길이의 유전자를 클로닝한 뒤, 이를 상기 유전자가 결실되어 있는 이종 숙주 미생물인 Clostridium acetobutylicum에서 발현시키는데 성공하였고, 상기 유전자들이 ACS/CODH 복합체 활성에 있어서 중요한 유전자임을 실험을 통해 증명하였다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 미생물은 Wood-Ljungdahl pathway에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자를 일부 또는 전부 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
Wood-Ljungdahl pathway에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자란 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자를 포함하는 개념이며, 숙주 미생물은 Wood-Ljungdahl pathway에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자를 일부 또는 전부 가질 수 있다. 본 발명자들은 Clostridium acetobutylicum 내에 존재하는 Wood-Ljungdahl pathway에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자들이 ACS/CODH 복합체 활성에 있어서 중요한 유전자임을 실험을 통해 증명하였다. 구체적으로, Clostridium acetobutylicum 내에 존재하는 유전자들에 대해서는 유전자결실(knockout) 실험을 통하여 ACS/CODH 복합체 활성에 있어서 중요한 유전자임을 실험을 통해 증명하였다.
본 발명의 재조합 미생물은 숙주 미생물이 본래 가지고 있던 Wood-Ljungdahl pathway에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자 및/또는 본 발명자가 클로닝한 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자를 이용하여 이산화탄소 고정능을 갖는다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 미생물의 Wood-Ljungdahl pathway에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자는 카본 모노옥사이드 디히드로게나아제(carbon monooxide dehydrogenase)(CAC0116, 또한, CAC2498)(서열번호 8, 서열번호 9), 포밀-테트라하이드로폴레이트신타제(formyl-H4folate synthase)(CAC3201)(서열번호 10), 포미미도-테트라하이드로폴레이트 사이클로디아미나제(formimido-H4folate cyclodeaminase)(CAC2310, CAC2083)(서열번호 11, 서열번호 12), 포밀-테트라하이드로폴레이트 사이클로하이들롤라제/메틸렌-테트라하이드로폴레이트 디하이드로게나제(formyl-H4folate cyclohydrolase/methylene-H4folate dehydrogenase)(CAC2091)(서열번호 13) 및 메틸렌-테트라하이드로폴레이트 리덕타제(methylene-H4folate reductase)(CAC2091)(서열번호 13)을 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 숙주 미생물에, 아세틸-CoA 합성효소/카본 모노옥사이드 디히드로게나아제 (acetyl-CoA synthase/carbon monooxide dehydrogenase, ACS/CODH) 복합체를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 도입시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 미생물 제조방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 미생물을 CO2 존재 하에 배양하여 CO2를 고정시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 새로 도입한 유전자와 본래 가지고 있는 유전자를 이용하여 CO2를 고정할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 미생물을 배양하여, 유용물질을 생성시킨 다음, 생산된 유용물질을 회수하는 것을 특징으로 하는, 유용물질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 CO2를 탄소원으로 이용하여 알코올과 같은 유용물질을 생산한다.
본 발명에 있어서, 상기 유용물질은 부탄올 또는 에탄올을 포함하는 알코올인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대, 본 발명에 따른 CO2 고정능을 가지는 재조합 미생물에 의해 생성되는 모든 물질을 포함한다 할 것이다.
유용물질의 한 예시로서 알코올, 아미노산, 유기산, 알켄, 고분자 단량체 등을 들 수 있으며, 상기 알코올은 탄소수 2~10의 직쇄 또는 측쇄 알코올, 더욱 상세하게는 에탄올, 이소부탄올, 프로판올, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, tert-부탄올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올 등을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 미생물은 자연적으로 Wood-Ljungdal pathway를 이용하여 이산화탄소를 고정하는 균주들에 비해 알코올 등과 같은 목적하는 유용물질을 고농도, 고수율로 생산할 수 있는 특징이 있다. 또한 본 발명을 이용하여, 기존의 특정 목적화합물(아미노산, 유기산, 알켄, 고분자 단량체 등) 생산을 위한 대사공학이 수행된 변이 미생물에 CO2를 고정할 수 있는 대사회로를 도입함으로써 목적화합물을 이산화탄소로부터 생산할 수 있는 특징이 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, Clostridium difficille로부터 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자를 클로닝하고, 상기 유전자를 Wood-Ljungdahl pathway에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자의 일부를 가지는 Clostridium acetobutylicum 숙주 미생물에 도입시켜 재조합 미생물을 제작하였다. 그리고, 제작된 재조합 미생물을 배양하여, 상기 재조합 미생물이 부탄올 및 에탄올을 고수율로 생산한다는 것을 확인하였다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 발현시키기 위하여 숙주균주로 특정 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 균주들만을 예시하였으나, 다른 클로스트리듐 속이나 다른 속의 미생물을 사용하더라도, 상동성이 있거나 동일한 유전자를 도입하고, 이를 이용하여 부탄올, 에탄올, 아미노산, 유기산, 알켄, 고분자 단량체 등의 목적화합물을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 부탄올 또는 에탄올의 생산만을 예시하였으나, 그 외 아미노산, 유기산, 알켄, 고분자 단량체 등의 목적화합물을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. pTHL20 벡터 제작
클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 싸이올레이즈(thiolase) 프로모터와 라이보좀 결합 부위(ribosome binding site, RBS)를 포함하는 외래 단백질 발현용 셔틀 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 싸이올레이즈는 세포 생장주기에 크게 영향받지 않고 계속적이고 안정적으로 유전자를 발현시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(Tummala et al., Appl. Environ. Microbiol., 65:3793~3799, 1999). 따라서 본 실시예에서는 싸이올레이즈(NCBI GeneID:1119056) 상단에 위치한 프로모터를 클로닝하여 pIMP-H1del에 삽입하였다. pIMP-H1del은 2개의 HindIII 제한효소 자리를 가지는 pIMP1으로부터 3408번째 염기서열에 존재하는 HindIII site 1개를 제거하고 743번째 염기열에 존재하는 제한효소 자리만 남겨둔 pIMP1을 주형으로 하는 셔틀 벡터이다. 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(ATCC 824) 균주의 total DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 싸이올레이즈 프로모터를 증폭하였다. 증폭된 싸이올레이즈 프로모터 단편들을 정제 및 회수 한 후, HindIII와 PstI 제한효소로 처리한 후, 동일 효소로 처리된 pIMP-H1del 셔틀 벡터와 접합(ligation)함으로써 pTHL1 벡터 제작을 완성하였다.
[서열번호 14]: 5'-GGCCCCAAGCTTAGAATGAAGTTTCTTATGCACAAG-3'
[서열번호 15]: 5'-AAACTGCAGTCTAACTAACCTCCTAAATTTTGATAC-3'
또한, 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머, pSOS95-Cm을 주형으로 PCR을 수행하여 클로람페니콜 저항성 유전자를 증폭하고, 증폭된 클로람페니콜 저항성 유전자 단편들을 정제 및 회수 한 후, HindIII 제한효소로 처리하고, 동일 효소로 처리된 pTHL1 셔틀 벡터와 접합(ligation)함으로써 MCS자리에 NcoI 자리가 추가된 pTHL2-Cm 벡터 제작을 완성하였다. pSOS95-Cm은 pSOS95 (Nair and Papoutsakis, J. Bacteriol., 176:5843-5846, 1994)에 ATCC 824균주의 thioloase promoter를 cloning하고, 그 down-stream에 chloramphenicol/thiamphenicol 내성 유전자를 cloning함으로써 제작 가능하다.
[서열번호 16]: 5'-CCAAGCTTCGACTTTTTAACAAAATATATTG-3'
[서열번호 17]: 5'-AAAACTGCAGCCATGGTCTAACTAACCTCCTAAATTTTGATAC-3'
NcoI과 SalI 자리 사이에 XbaI-PstI-KpnI-SphI 자리를 추가하기 위하여 하기 서열번호 18과 서열번호 19의 프라이머를 이용하여 ATCC 824 gDNA를 주형으로 PCR하여 thiolase 유전자의 일부를 증폭하고, 증폭된 유전자 단편들을 정제 및 회수 한 후, NcoI과 SalI 제한효소로 처리하고, 동일 효소로 처리된 pTHL2-Cm 셔틀 벡터와 접합(ligation)함으로써 MCS자리에 XbaI-PstI-KpnI-SphI 자리가 추가된 pTHL20 벡터 제작을 완성하였다.
[서열번호 18]: CATGCCATGGTCTAGACTGCAGTTACCACATGGGAATAACAGC
[서열번호 19]: TACGCGTCGACGCATGCGGTACCGTTGATCCAAATCTAGGGTGC
실시예 2. pTHL20-ACS-CODH 벡터의 제작
서열번호 20과 서열번호 21의 프라이머, C. difficile의 total DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 ACS/CODH 유전자 복합체의 첫 번째 단편을 증폭하고, 증폭된 유전자 단편들을 정제 및 회수 한 후, NcoI-PstI 제한효소로 처리하고, 동일 효소로 처리된 pTHL20 셔틀 벡터와 접합(ligation)함으로써 pTHL20-ACS-CODH1 제작을 완성하였다.
[서열번호 20]: CATGCCATGGATGAAGATAGTAGTAGTAGGTGGTGG
[서열번호 21]: GTTTGAACCACCTACTAAAACAC
서열번호 22와 서열번호 23의 프라이머, C. difficile의 total DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 ACS/CODH 유전자 복합체의 두 번째 단편을 증폭하고, 증폭된 유전자 단편들을 정제 및 회수 한 후, PstI-AvaI 제한효소로 처리하고, 동일 효소로 처리된 pTHL20-ACS-CODH1과 접합(ligation)함으로써 pTHL20-ACS-CODH2 제작을 완성하였다.
[서열번호 22]: CATTTGGACCATTAAGTGAATTAG
[서열번호 23]: CCCCCGGGGGCTATGAATATATCTGCATTTCTTGC
서열번호 24와 서열번호 25의 프라이머, C. difficile의 total DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 ACS/CODH 유전자 복합체의 두 번째 단편을 증폭하고, 증폭된 유전자 단편들을 정제 및 회수 한 후, PstI 제한효소로 처리하고, 동일 효소로 처리된 pTHL20-ACS-CODH2과 접합(ligation)함으로써 pTHL20-ACS-CODH 제작을 완성하였다 (도 2).
[서열번호 24]: CAGAAGAAAGAACTATAGCAATGG
[서열번호 25]: TGGGAATCCTAAAGCTATTGC
실시예 3. 재조합 미생물의 제작
실시예 2에서 제작된 재조합 벡터 pTHL20-ACS-CODH를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 균주에 도입하여 ATCC 824-ACS/CODH 균주를 제작하였다.
먼저, 바실러스 서브틸리스 파지 (Bacillus subtilis Phage) Φ3T I 메틸트랜스퍼라제(methyltransferase) 발현 벡터, pAN1 (Mermelstein et al., Appl. Environ. Microbiol., 59:1077, 1993)을 함유하는 대장균 TOP10에 실시예 2에서 제작된 재조합 벡터들을 도입하여, 상기 벡터들을 클로스트리듐으로의 형질전환에 적합하도록 메틸레이션을 유도하였다. 이렇게 메틸레이션된 벡터를 대장균으로부터 분리 및 정제하고, 이 벡터를클로스트리듐 아세토부틸리쿰 변이주 ATCC 824에 도입하여 재조합 변이 미생물을 제조하였다.
형질전환을 위한 ATCC 824 competent cell은 다음과 같이 준비하였다. 먼저 10 ml CGM (표 1)에 M5 균주를 접종한 후 OD 0.6이 될 때까지 배양하였다. 이를 이용하여 2X YTG배지 (Bacto Tryptone 16 g, Yeast extract 10 g, NaCl 4 g, Glucose 5 g, 1 리터 당) 60 ml에 10% 접종하여 4-5 시간 동안 배양하였다. 형질전환 버퍼 (EPB, 270 mM sucrose 15 ㎖, 686 mM NaH2PO4 110 ㎕, pH N.4)로 2번 washing한 후, 2.4 ㎖의 동일 버퍼로 미생물 세포를 현탁시켰다. 이렇게 만들어진 competent cell 600 ㎕와 재조합 플라스미드 DNA 25 ㎕를 섞어서 4 mm 전극을 가진 cuvette에 충진 후 2.5 kV, 25 uF의 조건으로 전기 충격을 가하였다. 즉시, 1 ml의 2X YTG 배지로 현탁하여 3시간 동안 37℃에서 배양한 후, 40 ㎍/ml의 에리스로마이신이 포함된 2X YTG 고체배지에 도말하여 형질전환체 ATCC 824-ACS/CODH를 선발하였다.
표 1 CGM 배지의 조성
성분 함량 (g/l)
Glucose 8.5 ~ 80
K2HPO4 3H2O 0.982
KH2PO4 0.75
MgSO4 0.348
MnSO4 H2O 0.01
FeSO4 7H2O 0.01
(NH4)2SO4 2
NaCl 1
Asparagine 2
p-Aminobenzoic acid 0.004
Yeast extract 5
실시예 4. 재조합 미생물을 이용한 CO2 고정
상기의 재조합 변이 미생물 ATCC 824-ACS/CODH를 배양하여 이산화탄소 고정능을 평가하였다. CGM 배지 10㎖을 함유한 100㎖ serum bottle을 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼내어 후 혐기 챔버에서 실온까지 식힌 후 에리트로마이신(erythromycin) 40 ㎍/㎖를 첨가하고, 상기 재조합 변이 미생물들을 접종하고, septum으로 완전히 밀폐 후, 37℃에서 혐기조건으로 7일 동안 배양을 수행하였다. 배양은 3반복 실험으로 수행하였다. 본 실시예에서는 외부로부터 이산화탄소 및 수소의 공급은 없었으나 (ATCC 824 균주의 경우 배양시, 이산화탄소 및 수소를 충분히 만듦), 이를 생산하지 않는 균주들에서는 두가지 gas를 외부에서 공급가능 하다. 배양 종료 후, 상등액을 회수하여 생산된 대사산물의 농도를 packed column(Supelco CarbopackTM B AW/6.6% PEG 20M, 2 m × 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography(Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하였다. 배양액으로부터 얻은 대사산물을 분석하여 total organic carbon을 조사해 본 결과, ATCC 824는 193 mmole이었으며, 재조합 변이 미생물 ATCC 824-ACS/CODH는 213 mmole의 결과를 보였다. 이는 재조합 변이 미생물 ATCC 824-ACS/CODH이 약 20 mmole의 탄소를 더 만들었음을 의미하며, 즉 20 mmole의 이산화탄소를 고정하였음을 보여준다.
실시예 5. 재조합 미생물을 이용한 13C-CO2 고정
상기의 재조합 변이 미생물 ATCC 824-ACS/CODH를 13C-CO2배양하여 이산화탄소 고정능을 평가하였다. 배양은 상기 실시예 4에서와 동일한 조건으로 하였으나, 13C-sodium bicarbonate를 13C-CO2로써 외부에서 추가로 공급하였다. 재조합 미생물 배양 중, 대사산물을 채취하여 기체크로마토그래프/질량분석기(Gas Chromatograph/Mass Spectrometer) (Clarus 600 series + TurboMatrix HSS Trap, PerkinElmer)를 이용하여 대사산물들을 분석하였다. 질량분석기의 이온화는 Electron Ionization(EI) 방법을 이용하였다. 그 결과, 대조군에서는 동위원소 표지된 대사산물의 검출이 전혀 없었다. 반면, 재조합 변이 미생물 ATCC 824-ACS/CODH를 배양한 배양액에서 채취한 대사산물 분석에서 13-C 동위원소 화합물들이 관찰 되었다. 예로써 아세트산의 경우를 보면, major 이온 peak인 m/z 43과 45에서, 재조합 변이 미생물 ATCC 824-ACS/CODH를 배양한 배양액에서 분석된 질량분석 스펙트럼은 대조군과 비교했을 때보다 상대적으로 높은 m/z 45의 peak을 보였다. 이는 m/z 43에 나타나야하는 CH3CO-이온 일부가 동위원소가 표지되면서(13CH3 13CO-) m/z 45에 나타난 결과이다.
실시예 6. Clostridium acetobutylicum 내에 존재하는 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자
상기 실시예들에서 확인한 바와 같이, 재조합 변이 미생물 ATCC 824-ACS/CODH의 이산화탄소 고정능이 확인되었다. 따라서, ATCC 824 균주 내에도 일부 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자들이 존재함을 알려준다. 이를 확인하기 위하여 후보 유전자들을 발굴하였으며 (도 3), 이들 유전자들을 결실시켜 이산화탄소 고정능이 사라짐을 확인함으로써 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자임을 확인하였다.
실시예 7. 재조합 미생물을 이용한 목적화합물의 제조
본 발명에서는 Clostridium acetobutylicum을 숙주로 이용한 관계로 부탄올, 에탄올, 아세톤, 유기산 생산능을 시험 할 수 있었다. 상기 실시예에서 제작한 변이 미생물 ATCC 824-ACS/CODH에 대한 부탄올 및 에탄올 생성능을 확인하였다. CGM 배지 10 ㎖을 함유한 30 ㎖ 시험관을 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼내어 질소가스를 채운 후 혐기 챔버에서 실온까지 식힌 후 에리트로마이신(erythromycin) 40 ㎍/㎖를 첨가하고, 상기 변이 미생물을 접종하여 37℃에서 흡광도(600 nm)가 1.0이 될 때까지 혐기조건에서 전배양을 수행하였다. 상기 동일성분으로 구성된 CGM배지를 200 ㎖을 함유한 500 ㎖ 플라스크를 멸균 후 동일한 처리를 한 후, 상기 전배양액 10 ㎖을 접종하여, 흡광도(600 nm)가 1.0이 될 때까지 37℃, 혐기조건에서 2차 전배양 하였다. 그 후 상기 성분으로 구성된 배지 1.8 l를 함유한 5.0 l 발효기(LiFlus GX, Biotron Inc., Kyunggi-Do, Korea)를 멸균 후 80℃ 이상에서부터 질소를 0.5 vvm으로 10시간 공급하면서 실온까지 온도를 낮춘 후 에리트로마이신(erythromycin) 40 ㎍/ml을 첨가하고 상기 2차 전배양액 200 ㎖을 접종하여, 37℃ 또는 32℃, 200 rpm에서 60시간 배양하였다. pH 보정은 암모니아수를 이용하였으며 automatic feeding에 의해 5.0 이상으로 유지하였고, 배양 중에는 질소를 0.2 vvm (air volume/working volume/minute)으로 공급하였다.
상기 배지중의 glucose를 glucose analyzer(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하였고, 시간별로 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 아세톤의 농도를 packed column(Supelco CarbopackTM B AW/6.6% PEG 20M, 2 m × 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography(Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하였다.
그 결과, 변이 미생물 ATCC 824-ACS/CODH는 37℃ 발효에서, 최종농도 13.8 g/l의 부탄올, 2.6 g/l의 에탄올을 생산하였다 (표 2). 이는 대조군이 생산한 10.4 g/L 부탄올, 0.8 g/L 에탄올보다 우수한 결과이다. 특히, 부탄올에 대한 수율은 대조군의 0.16 g/g보다 높은 0.20 g/g을 나타내었고, 부탄올 생산성은 대조군의 0.26 보다 따른 0.40 g/L/h를 나타내었다. 또한, cell mass도 향상되는 결과를 보여 주었다. 한편, 자연적으로 Wood-Ljungdahl 경로를 가지는 균주인 Clostridium carboxidivorans P7 균주는 2.2 mg/L의 부탄올 생산에 그치고 있다. 본 발명의 실시예는 자연적으로 Wood-Ljungdahl 경로를 가지는 균주들 보다 더욱 우수한 결과로써, Wood-Ljungdahl 경로를 재조합을 통하여 다른 숙주에 도입이 제공해 주는 장점을 단적으로 보여주는 결과이다.
표 2 변이 미생물 ATCC 824-ACS/CODH의 발효 결과
Glucose소비(g/L) & 소비속도(g/h) OD BuOH(g/L) EtOH(g/L) Acetone(g/L) Acetate(g/L) Butyrate(g/L) BuOH yield(g/g) BuOH productivity(g/L/h)
ATCC 824 64.02.5 11.9 10.4 0.8 3.7 4.1 2.5 0.16 0.26
ATCC 824-ACS/CODH 69.63.8 14.7 13.8 2.6 2.6 4.6 1.8 0.20 0.40
Clostridium carboxidivorans P7 - - <0.003 - - - - - -
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 Wood-Ljungdahl 경로에 관여하는 ACS/CODH(acetyl-CoA synthases/carbon monoxide dehydrogenase complex) 복합체를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 이산화탄소 고정능을 가지고 있어, CO2로부터 알코올, 유기산과 같은 유용물질을 고농도, 고수율로 생산하는데 유용하다.
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Claims (22)

  1. 숙주 미생물에, 아세틸-CoA 합성효소/카본 모노옥사이드 디히드로게나아제 (acetyl-CoA synthase/carbon monooxide dehydrogenase, ACS/CODH) 복합체를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자는 디히드로리포아미드 디히드로게나아제(dihydrolipoamide dehydrogenase), 카본 모노옥사이드 디히드로게나아제 셰프론(carbon monooxide dehydrogenase chaperone), 코리노이드 철-황 단백질 소단위(corrinoid iron-sulfur protein small subunit), 코리노이드 철-황 단백질 대단위(corrinoid iron-sulfur protein large subunit), 메틸트랜스퍼라아제 서브유닛(methyltransferase subunit), 아세틸-CoA 합성효소(ACS) 또는 ACS/CODH 서브유닛 알파 및 글리신 절단 시스템 H 단백질(glycine cleavage system H protein)을 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물.
  3. 제 2항에 있어서, 디히드로리포아미드 디히드로게나아제(dihydrolipoamide dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 카본 모노옥사이드 디히드로게나아제 셰프론(carbon monooxide dehydrogenase chaperone)을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자, 코리노이드 철-황 단백질 소단위(corrinoid iron-sulfur protein small subunit)를 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 코리노이드 철-황 단백질 대단위(corrinoid iron-sulfur protein large subunit)를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 메틸트랜스퍼라아제 서브유닛(methyltransferase subunit)을 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 아세틸-CoA 합성효소(ACS) 또는 ACS/CODH 서브유닛 알파를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 글리신 절단 시스템 H 단백질(glycine cleavage system H protein)을 코딩하는 유전자는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자인 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자는 아세토전(acetogen)또는 메타노전(methanogen)으로부터 수득된 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자를 수득한 미생물과 종이 다른 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 클로스트리듐 속 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 Wood-Ljungdahl pathway에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자를 가지는 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 Wood-Ljungdahl pathway에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자는 카본 모노옥사이드 디히드로게나아제(carbon monooxide dehydrogenase), 포밀-테트라하이드로폴레이트신타제(formyl-H4folate synthase), 포미미도-테트라하이드로폴레이트 사이클로디아미나제(formimido-H4folate cyclodeaminase), 포밀-테트라하이드로폴레이트 사이클로하이들롤라제/메틸렌-테트라하이드로폴레이트 디하이드로게나제(formyl-H4folate cyclohydrolase/methylene-H4folate dehydrogenase) 및 메틸렌-테트라하이드로폴레이트 리덕타제(methylene-H4folate reductase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물.
  9. 제 8항에 있어서, 카본 모노옥사이드 디히드로게나아제(carbon monooxide dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 8 또는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 포밀-테트라하이드로폴레이트신타제(formyl-H4folate synthase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 포미미도-테트라하이드로폴레이트 사이클로디아미나제(formimido-H4folate cyclodeaminase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 11 또는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 포밀-테트라하이드로폴레이트 사이클로하이들롤라제/메틸렌-테트라하이드로폴레이트 디하이드로게나제(formyl-H4folate cyclohydrolase/methylene-H4folate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 메틸렌-테트라하이드로폴레이트 리덕타제(methylene-H4folate reductase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자인 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물.
  10. 숙주 미생물에, 아세틸-CoA 합성효소/카본 모노옥사이드 디히드로게나아제 (acetyl-CoA synthase/carbon monooxide dehydrogenase, ACS/CODH) 복합체를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 도입시키는 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자는 디히드로리포아미드 디히드로게나아제(dihydrolipoamide dehydrogenase), 카본 모노옥사이드 디히드로게나아제 셰프론(carbon monooxide dehydrogenase chaperone), 코리노이드 철-황 단백질 소단위(corrinoid iron-sulfur protein small subunit), 코리노이드 철-황 단백질 대단위(corrinoid iron-sulfur protein large subunit), 메틸트랜스퍼라아제 서브유닛(methyltransferase subunit), 아세틸-CoA 합성효소(ACS) 또는 ACS/CODH 서브유닛 알파 및 글리신 절단 시스템 H 단백질(glycine cleavage system H protein)을 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 제조방법.
  12. 제 11항에 있어서, 디히드로리포아미드 디히드로게나아제(dihydrolipoamide dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 카본 모노옥사이드 디히드로게나아제 셰프론(carbon monooxide dehydrogenase chaperone)을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자, 코리노이드 철-황 단백질 소단위(corrinoid iron-sulfur protein small subunit)를 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 코리노이드 철-황 단백질 대단위(corrinoid iron-sulfur protein large subunit)를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 메틸트랜스퍼라아제 서브유닛(methyltransferase subunit)을 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 아세틸-CoA 합성효소(ACS) 또는 ACS/CODH 서브유닛 알파를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 글리신 절단 시스템 H 단백질(glycine cleavage system H protein)을 코딩하는 유전자는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자인 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 제조방법.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자는 아세토전(acetogen) 또는 메타노전(methanogen)으로부터 수득된 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 제조방법.
  14. 제 10항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 ACS/CODH 복합체를 코딩하는 유전자를 수득한 미생물과 종이 다른 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 제조방법.
  15. 제 10항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 클로스트리듐 속 유래인 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 제조방법.
  16. 제 10항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 Wood-Ljungdahl pathway에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자를 가지는 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 제조방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 Wood-Ljungdahl pathway에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자는 카본 모노옥사이드 디히드로게나아제(carbon monooxide dehydrogenase), 포밀-테트라하이드로폴레이트신타제(formyl-H4folate synthase), 포미미도-테트라하이드로폴레이트 사이클로디아미나제(formimido-H4folate cyclodeaminase), 포밀-테트라하이드로폴레이트 사이클로하이들롤라제/메틸렌-테트라하이드로폴레이트 디하이드로게나제(formyl-H4folate cyclohydrolase/methylene-H4folate dehydrogenase) 및 메틸렌-테트라하이드로폴레이트 리덕타제(methylene-H4folate reductase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 제조방법.
  18. 제 17항에 있어서, 카본 모노옥사이드 디히드로게나아제(carbon monooxide dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 8 또는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 포밀-테트라하이드로폴레이트신타제(formyl-H4folate synthase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 포미미도-테트라하이드로폴레이트 사이클로디아미나제(formimido-H4folate cyclodeaminase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 11 또는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 포밀-테트라하이드로폴레이트 사이클로하이들롤라제/메틸렌-테트라하이드로폴레이트 디하이드로게나제(formyl-H4folate cyclohydrolase/methylene-H4folate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자이고, 메틸렌-테트라하이드로폴레이트 리덕타제(methylene-H4folate reductase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자인 것을 특징으로 하는, 이산화탄소 고정능을 가지는 재조합 미생물 제조방법.
  19. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 CO2 존재하에 배양하는 것을 특징으로 하는, CO2 고정 방법.
  20. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 CO2를 탄소원으로 배양하여 유용물질을 생성시킨 다음, 생성된 유용물질을 회수하는 것을 특징으로 하는, 유용물질의 제조방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 유용물질은 알코올인 것을 특징으로 하는, 유용물질의 제조방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 알코올은 부탄올 또는 에탄올을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유용물질의 제조방법.
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