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WO2007126052A1 - 蛍光性化合物及びそれから成る標識剤 - Google Patents

蛍光性化合物及びそれから成る標識剤 Download PDF

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WO2007126052A1
WO2007126052A1 PCT/JP2007/059168 JP2007059168W WO2007126052A1 WO 2007126052 A1 WO2007126052 A1 WO 2007126052A1 JP 2007059168 W JP2007059168 W JP 2007059168W WO 2007126052 A1 WO2007126052 A1 WO 2007126052A1
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WO
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group
compound
fluorescence
fluorescent
independently
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2007/059168
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English (en)
French (fr)
Inventor
Koji Suzuki
Keitaro Umezawa
Hiroshi Makino
Daniel Citterio
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keio University
Original Assignee
Keio University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP07742603.9A priority patent/EP2022794B1/en
Priority to JP2008513292A priority patent/JP5177427B2/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescent compound and a labeling agent comprising the same.
  • Fluorescent dyes are used for the purpose of visualizing samples, and are widely used in labeling materials (labeled dyes) and staining dyes, recognition probes for biological substances, and photodynamic therapy (PDT) in the biological and biochemical fields. Used. Also, long wavelengths, especially in the near infrared region (specifically 650
  • Fluorescent dyes having absorption and fluorescence at 900 nm can be measured without receiving these optical interferences even in the presence of biological materials such as biological tissues, blood, lipids and water. Furthermore, low energy, high light permeability, and other advantages are expected to be applied to imaging of deep tissue.
  • long-wavelength fluorescent dyes are used not only in the biological and biochemical fields but also in chemical systems and other fields. For example, it is frequently used for red display materials, dye lasers, and optical recording materials. Thus, long-wavelength fluorescent dyes are required not only in the biological field but also in a wide range of fields.
  • the characteristics required for an excellent long-wavelength fluorescent dye for example, a fluorescent dye for the purpose of labeling biological materials, include the following items.
  • the boron dipyrromethene skeleton is an excellent dye with high, light durability, high !, fluorescence quantum yield, sharpness, and absorption spectrum, but the fluorescence wavelength of the basic skeleton is around 500 nm. Therefore, it does not have a sufficient function as a near-infrared fluorescent dye. Therefore, several studies have been conducted on increasing the wavelength of boron dipyrromethene. The methods include 1) the introduction of strong electron donating groups, 2) the strengthening of the skeleton, and 3) the expansion of the conjugated system.
  • Non-Patent Document 2 an electron-donating group introduced into R 1 and R 7 of boron dipyrromethene is made free of R 2 and R 6 and an appropriate methylene chain.
  • Patent Document 2 US Pat. No. 5,433,896
  • Patent Document 3 U.S. Pat.No. 6,005,113
  • Non-Patent Document 1 A. Burghart et. Al. J. Org. Chem. 1999, 64, 7813.
  • Non-Patent Document 2 J. Chen et. Al. J. Org. Chem. 2000, 65, 2900.
  • Non-Patent Document 3 Current Medicinal Chemistry 2005, 12, 795-895.
  • the object of the present invention is to provide a novel fluorescence having a high light durability, a high fluorescence quantum yield, a sharp absorption spectrum, a fluorescence in the long wavelength region, and a high molar extinction coefficient. It is to provide its use as a compound and labeling agent.
  • boron dipyrromethane is formed by forming a specific heterocycle with R 1 and R 2 and / or R 6 and R 7 in the above boron dipyrromethene skeleton.
  • Fluorescence dyes containing a methene skeleton have high fluorescence durability, high fluorescence quantum yield and f absorption spectrum, while maintaining excellent properties and longer fluorescence wavelength and molar extinction coefficient As a result, the present invention was completed.
  • R 1 and R 2 cooperate with each other to form a 5- or 6-membered heterocycle containing at least one heteroatom selected from the group consisting of io, oxygen, nitrogen and linker, or Hetero
  • R 6 and R 7 cooperate with each other to form a 5- or 6-membered heterocycle containing at least one heteroatom selected from the group consisting of io, oxygen, nitrogen and linker, or When not forming a heterocycle, each independently represents a hydrogen atom or any group that does not inhibit the fluorescence of the compound,
  • Q represents a carbon atom or a nitrogen atom
  • R 4 and R 5 represents any group which does not inhibit the fluorescence of hydrogen atom or a compound independently from each other (provided that when Q is a nitrogen atom R 4 is absent),
  • R 8 and R 9 each independently represent a halogen atom, an alkyl group, an alkyl group, an alkyl group, an alkoxy group, an aryl group or a heteroaryl group)
  • the fluorescent compound which has a structure shown by this is provided.
  • the present invention also provides a labeling agent comprising the fluorescent compound of the present invention. Furthermore, the present invention provides a method for measuring a labeled substance, which comprises subjecting a substance labeled with the labeling agent of the present invention to a reaction, and after the reaction, causing the labeling agent to emit light and measuring the substance.
  • the fluorescent dye having a boron dipyrromethene skeleton has a high wavelength, a high light durability, a high fluorescence quantum yield and a sharp, absorption spectrum, and a long wavelength while maintaining excellent characteristics.
  • New fluorescent compounds were provided that fluoresce and have a high molar extinction coefficient. Since the fluorescent compound of the present invention has a long fluorescence wavelength, when it is used as a labeling agent, it is subject to these optical interferences even in the presence of biological materials such as biological tissues, blood, lipids and water. It can measure without. Furthermore, because of the advantages of low energy and high light permeability, it can be applied to imaging of deep tissue in the living body.
  • the fluorescent compound of the present invention has a high fluorescence quantum yield and a molar extinction coefficient, it can be measured with high sensitivity by using it as a labeling agent.
  • FIG. 1 is a graph showing changes in absorbance over time of the fluorescent composite compound of the present invention and a commercially available fluorescent composite compound Cy7 (trade name).
  • the fluorescent compound of the present invention has a chemical structure represented by the above general formula [I].
  • R 1 and R 2 cooperate with each other to form a 5- or 6-membered hetero atom containing at least one hetero atom selected from the group consisting of io, oxygen, nitrogen and phosphorus.
  • it represents a hydrogen atom or any group that does not inhibit the fluorescence of the compound independently of each other, and R 6 and R 7 also cooperate with each other.
  • a 5- or 6-membered heterocycle containing at least one heteroatom selected from the group consisting of io, oxygen, nitrogen and linker, or not forming the heterocycle Each independently represents a hydrogen atom or any group that does not inhibit the fluorescence of the compound.
  • the heterocycle is preferably one having a chemical structure represented by any of the following formulae. When two hetero rings are formed, they are independent of each other.
  • X, Y and Z each independently represent X, oxygen, nitrogen or phosphorus atoms
  • R 1Q to R 17 each independently represent a hydrogen atom or the fluorescent compound of the present invention. Represents any group that does not inhibit fluorescence.
  • the two wavy lines on the left schematically represent a part of the compound of the present invention to which each heterocycle is bonded.
  • the heterocycle is most preferably a 5-membered ring.
  • the heterocycles represented by the above formulas those having a chemical structure represented by any of the following formulas are particularly preferred.
  • R 1Q to R 17 do not inhibit the hydrogen atom or the fluorescence of the fluorescent compound of the present invention independently of each other! Represent any group (inhibit the fluorescence of the fluorescent compound of the present invention) ⁇
  • the fluorescence wavelength is longer. This is preferable.
  • a group having a higher electron donating property is preferable because the wavelength of fluorescence becomes longer.
  • Examples of the electron donating group include an alkyl group, a fur group, a P-alkoxy fur group, a P-dialkylamino fur group, a 2-chael group, a 2-furyl group, Examples thereof include dialkoxyphenol groups (preferably 3,6-dialkoxyphenyl groups).
  • the carbon number of the alkyl part of the group containing an alkyl group or an alkyl part is not particularly limited, and is preferably about 1 to 10.
  • an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms or an alkoxyphenyl group having 1 to 10 carbon atoms in the alkyl moiety is particularly preferable.
  • Q represents a carbon atom or a nitrogen atom.
  • Q represents a carbon atom or a nitrogen atom.
  • the fluorescence becomes longer than when Q is a carbon atom.
  • an electron-withdrawing substituent for example, -tro group, cyano group, trifluoromethyl group, etc.
  • R 3 , R 4 and R 5 independently represent a hydrogen atom or an arbitrary group that does not inhibit the fluorescence of the fluorescent compound of the present invention. However, when Q is a nitrogen atom, R 4 does not exist.
  • R 3 to R 5 in the above general formula [I], R 1 and R 2 or R 6 and R 7 in the case where no heterocycle is formed, and the above Examples of the arbitrary group that does not inhibit the fluorescence of the fluorescent compound of the present invention represented by R 1Q to R 17 in the preferable heterocycle include the following.
  • “does not inhibit fluorescence” means that the wavelength of the fluorescence is not shortened, the molar absorption coefficient is decreased, or the fluorescence quantum coefficient is decreased or not (preferably, the substitution is not performed). Having 95% or more of the value of a compound having no group).
  • the fluorescence changes depending on the presence or absence of binding to the target. If there is not, at least, it means!
  • Halogen atom nitro group, cyano group, hydroxy group, amino group, thiol group, carboxyl group, aldehyde group, sulfonic acid group, isocyanate group, thioisocyanate group, alkyl group, alkyl group, alkyl group Group, alkoxy group, alkoxycarbonyl group, acyl group, halogenoacyl group, monoalkylamino group, dialkylamino group, alkylthio group, alkylcarbolamamide group, alkylamidocarboro group, monoalkylsilyl group, dialkyl A silyl group, a trialkylsilyl group, a monoalkoxysilyl group, a dialkoxysilyl group, a trialkoxysilyl group, an alkylsulfonyl group, a halogenosulfol group, an aryl group, and a heteroaryl group.
  • the "alkyl group” may be any of linear, branched and cyclic (that is, a cycloalkyl group) preferably having 1 to 20 carbon atoms.
  • all of the hydrogen atoms contained in the alkyl group are substituted !, one or more of them is a halogen atom, a nitro group, a cyano group, a hydroxy group, an amino group, a thiol group, a carboxy group.
  • It may be substituted with at least one selected from the group consisting of a group, an aldehyde group, a sulfonic acid group, an isocyanate group, a thioisocyanate group, an aryl group and a heteroaryl group.
  • a group an aldehyde group, a sulfonic acid group, an isocyanate group, a thioisocyanate group, an aryl group and a heteroaryl group.
  • an alkyl group in a group containing an alkyl group moiety such as an alkoxy group or an alkylthio group in the substituent. Note that the above-described substituent on the alkyl group is not particularly necessary.
  • the "alkenyl group” is any of linear, branched, and cyclic (ie, cycloalkenyl groups) that preferably have 2 to 20 carbon atoms. May be. In this case, all hydrogen atoms contained in the alkenyl group are not substituted or are not. At least one of them is a halogen atom, nitro group, cyano group, hydroxy group, amino group, thiol group, carboxyl group, aldehyde group, sulfonic acid group, isocyanate group, thioisocyanate group, aryl group and heteroaryl group force. It may be substituted with at least one selected from the group consisting of However, these substituents on the alkali group are not particularly necessary.
  • the "alkyl group” is any of linear, branched and cyclic (that is, a cycloalkyl group), preferably having 2 to 20 carbon atoms. May be. In this case, all hydrogen atoms contained in the alkynyl group are not substituted, or one or more of them are halogen atoms, nitro groups, cyan groups, hydroxy groups, amino groups, thiol groups, carboxyl groups, aldehydes. It may be substituted with at least one selected from the group consisting of a group, a sulfonic acid group, an isocyanate group, a thioisocyanate group, an aryl group and a heteroaryl group. However, these substituents on the alkyl group are not particularly necessary.
  • the aryl group is composed of 1 to 4 aromatic rings.
  • Aromatic rings or condensed polycycles are preferred, such as phenyl, 1- or 2_naphthyl, 1-, 2- or 9-anthranyl, 1-, 2- or 4-pyrenyl.
  • all the hydrogen atoms contained in the aromatic ring are substituted, or at least one of them is a halogen atom, a nitro group, a cyano group, a hydroxy group, an amino group, a thiol group, a carboxyl group, an aldehyde group.
  • Sulfonic acid group isocyanate group, thioisocyanate group, aryl group, heteroaryl group, alkyl group, alkyl group, alkyl group, alkoxy group, alkoxycarbonyl group, acyl group, halogenoacyl group, monoalkyl Amino group, dialkyl amino group, alkylthio group, alkylcarbolamamide group, alkylamidocarboro group, monoalkylsilyl group, dialkylsilyl group, trialkylsilyl group, monoalkoxysilyl group, dialkoxysilyl group, trialkoxysilyl group , Alkylsulfur groups and neurosulph It may be substituted with at least one selected from the group consisting of an onyl group. However, these substituents on the aryl group are not particularly necessary.
  • each of the above substituents substituted on the above-described alkyl group, alkenyl group, alkynyl group
  • Heteroaryl groups include aromatic rings containing 1 to 3 heteroatoms (5-membered or 6-membered rings) or heteroaromatic rings condensed with an aromatic ring force of 2 to 2. Those are preferred.
  • the heteroatom here is not limited to a combination of oxygen, nitrogen, or ion.
  • a drill base For example, a drill base.
  • all the hydrogen atoms contained in the heteroaromatic ring are not substituted, or at least one of them is a halogen atom, nitro group, cyano group, hydroxy group, amino group, thiol group, carboxyl group, aldehyde group, Sulfonic acid group, isocyanate group, thioisocyanate group, aryl group, heteroaryl group, alkyl group, alkenyl group, alkyl group, alkoxy group, alkoxycarbonyl group, acyl group, halogenoacyl group, monoalkyl Amino group, dialkylamino group, alkylthio group, alkyl force sulfonylamide group, alkylamidocarboro group, monoalkylsilyl group, dialkylsilyl group, trialkylsilyl group, monoalkoxysilyl group, dialkoxysilyl group, trialkoxysilyl group Groups, alkylsulfol groups and
  • R 8 and R 9 each independently represent a halogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alkoxy group, an aryl group or a heteroaryl group.
  • these groups represented by R 3 to R 5 and R 1Q to R 17 described above are used. All explanations apply as they are.
  • R 8 and R 9 are preferably independently a halogen atom, particularly preferably both are fluorine atoms.
  • the fluorescent compound of the present invention also includes the following functional groups (1) to (6) as optional groups that do not inhibit the fluorescence of the fluorescent compound of the present invention.
  • One or more may be provided. Na Do not inhibit the above-mentioned fluorescence!
  • an arbitrary substituent is an aryl group or a heteroaryl group
  • one or more of the following functional groups may be substituted on the aryl group or heteroaryl group. .
  • the fluorescent compound of the present invention preferably has at least one binding group.
  • the binding group means a group that can be used for binding to another compound. Fluorescent labeling agents are often bound to biologically related substances such as proteins, polypeptides, and sugars. Therefore, the binding groups include amino groups, hydroxyl groups, which are convenient for binding to these biologically related substances. Preferred examples include a group, a carboxyl group, a sulfonic acid group, a thiol group, a disulfide group, an isocyanate group, a thioisocyanate group, a succinimidyl ester group, a pentafluorophenyl ester group, and a maleimide group.
  • These groups may be used for bonding with other compounds, so at least of these groups! / Any group containing any of them (for example, an aminoalkyl group, etc.) can also be used as the binding group. It should be noted that one bonding group is sufficient, and it is usually preferable to have one bonding group for specifying one bonding site, but it may contain two or more bonding groups. It is also possible to combine the above-mentioned amino group, hydroxyl group, carboxyl group, sulfonic acid group and the like with a part of the bulky group described later, so that both the binding group and the bulky group can be used.
  • the fluorescent compound of the present invention preferably has at least one bulky group.
  • the boron dipyrromethene skeleton portion has high planarity, and the chemiluminescent group often has high planarity, so that the compound is often planar as a whole.
  • planar compounds are stacked and formed between ⁇ bonds of each aromatic ring, and each molecule is ⁇ - ⁇ bonded ( ⁇ - ⁇ stacking) to cause aggregation, resulting in a decrease in yield.
  • the bulky group is thicker than at least the linear alkyl group in the thickness direction (the direction perpendicular to the plane with the boron dipyrromethene skeleton as a plane).
  • a branched alkyl group having 10 or more carbon atoms, more preferably 10 to 20 carbon atoms, and a branched alkoxyl group are preferred.
  • At least one group that adjusts solubility may be contained.
  • the fluorescent labeling agent is often used in an aqueous system, when it is desired to improve the hydrophilicity of the fluorescent compound to improve the solubility in the aqueous system, at least one hydrophilic group is included. Also good. Examples of such hydrophilic groups include hydroxyl groups, amino groups, carbonyl groups, carboxyl groups, sulfonic acid groups, alkyl groups and alkoxyl groups containing one or more hydrophilic groups such as ether bonds (the number of carbon atoms is 1). -6 is preferred, and the like can be exemplified, but is not limited thereto.
  • hydrophilic group may be used in combination with the above-described bulky group and binding group.
  • an alkyl group having 10 or more carbon atoms more preferably an alkyl group having 10 to 20 carbon atoms, or a group containing both of them may be included.
  • the fluorescent compounds 2 to 2 of the present invention synthesized in the following examples have, as R 4 , a group having the following chemical structure as a group that increases fat solubility.
  • ether moiety is included in this group in order to facilitate the synthesis.
  • the two methyl groups on the benzene ring inhibit the rotational movement of the substituent, and prevent the decrease in the fluorescence quantum yield due to the rotational movement of the substituent.
  • the chemiluminescent group is a group having a structure that emits light by a chemical reaction.
  • fluorescent light is emitted by the light emitted from the chemiluminescent group.
  • the elementary part fluoresces and this fluorescence is measured. Therefore, the chemiluminescent group is not necessarily required to emit visible light, and any chemiluminescent group may be adopted as long as it emits light that can excite the fluorescent dye portion to emit fluorescence. it can.
  • any one can be used as long as it is used as a labeling agent in this field, and various ones are known or well known.
  • Preferred examples include phthalcarbazide derivatives, dioxetane derivatives, mouth fin derivatives, ataridin derivatives, indole derivatives, oxalic acid derivatives, diphenol derivatives or luciferin derivatives, all of which are well known in the art.
  • Each of these chemiluminescent groups is represented by the following general formula.
  • the fluorescent compound of the present invention preferably has at least one polymerization site.
  • the polymerization site indicates a site to be copolymerized with an organic polymer.
  • the introduction of dye into an organic polymer increases the fluorescence intensity and the molar extinction coefficient, thereby increasing the detection sensitivity.
  • the dye does not leak into the solvent by copolymerization (does not flow out), it is also suitable for continuous measurement using an organic polymer film.
  • the polymerization site may be any as long as it has a vinyl group. Specific examples include, but are not limited to, a bull alkyl group, a bull alkoxy group, a bull alkoxy carbo group, a bull reel group, a bull heteroaryl group, and the like.
  • Target ion or target compound recognition site group that selectively captures a specific ion substance such as crown ether
  • a fluorescent compound has a recognition site and a specific substance is measured, it is desirable that the optical response changes before and after recognition.
  • a specific substance can be measured by changing the fluorescence quantum yield before and after recognition, or by changing the absorption or fluorescence maximum wavelength.
  • the fluorescent compound of the present invention can be produced, for example, as follows. That is, azidoacetate is added to a heteroaryl ring having a formyl group at an arbitrary position to synthesize an azide compound, which is then heated to reflux in toluene, and pyrrole is condensed to the heteroaryl ring. After deprotecting the ⁇ -carboxylic acid ethyl ester of pyrrole, the ⁇ -carboxylic acid is decarboxylated by heating in the presence of a strong base. This pyrrole ring is condensed with an aromatic ring having a formyl group to synthesize a dipyrromethene compound.
  • the method for synthesizing the dipyrromethene compound is not limited to this.
  • the pyrrole rings may be reacted with each other in the presence of a trialkyl orthoformate and an acid catalyst, or may be reacted with a heteropyrrole ring having a formyl group in the presence of an acid. Can also be obtained.
  • a dipyrroazamethene compound having a nitrogen atom in the bridge portion can be synthesized by -trosolysis of the heteropyrrole ring with sodium nitrite.
  • the target compound can be obtained by reacting the obtained dipyrromethene compound and dipyrazomethene compound in the presence of triethylamine and boron trifluoride jetyl ether complex. If the heteroaryl ring has a halogen atom or boronic acid, it is possible to directly connect any aryl ring or heteroaryl ring by Suzuki coupling, and it is possible to provide dyes of various wavelengths. Become.
  • a fused ring of a heterocycle and a pyrrole ring formed by R 1 and R 2 and / or R 6 and R 7 is synthesized, and two fused rings are synthesized.
  • the ring is bonded with dichloromethane via one carbon atom, and BF is reacted to bond the BR 8 R 9 moiety.
  • the fluorescent compounds of the invention can be synthesized. If it has a substituent, further substitution Groups can be attached. However, when R 4 has a substituent, by reacting the above-mentioned substituent-containing compound simultaneously with the above-mentioned dichloromethane, the condensed ring is bonded with dichloromethane and simultaneously with the dichloromethane. The substituent can be bonded to a carbon atom.
  • Detailed synthesis methods of a plurality of the fluorescent compounds of the present invention are described in the following examples, and those skilled in the art can easily produce the fluorescent compound of the present invention by referring to them. it can.
  • the fluorescent compound of the present invention can be used as a fluorescent labeling agent. Fluorescent labeling agents themselves are well known, and the fluorescent compound of the present invention can be used in the same manner as conventional fluorescent labeling agents. That is, the labeling substance is labeled by binding the fluorescent compound of the present invention to the labeling substance to be labeled. When the fluorescent compound of the present invention has the above-described binding group, the fluorescent compound of the present invention is bound to the target substance via the binding group by a conventional method. When it does not have a binding group, an intermediate having a binding group introduced can be prepared by a conventional method, and this can be bound to a labeling substance.
  • the manner of use of the fluorescent labeling agent is exactly the same as in the prior art.
  • the labeled substance (referred to herein as "labeling substance") is subjected to the reaction, After performing a washing step or the like as necessary, the label is irradiated with excitation light to emit fluorescence, and the fluorescence is measured.
  • the reaction means, for example, an antigen-antibody reaction in the case of immunoassay and a hybridization between nucleic acids in the case of detection of nucleic acid, but is not limited thereto.
  • the labeling agent can be used as follows.
  • a primary antibody against the target antigen is bound to a solid phase, and this is reacted with the test sample, so that the target antigen in the test sample is immobilized on the solid phase. Bind to the primary antibody. After washing, a second antibody labeled with a fluorescent labeling agent is reacted. After washing, the fluorescent labeling agent of the second antibody bound to the target antigen is fluoresced with excitation light according to a conventional method, and the fluorescence is measured.
  • the optimal excitation light wavelength can be easily set by measuring the absorption maximum wavelength for each fluorescent compound, usually 570 ⁇ ! ⁇ About 680nm, preferably 66 ⁇ ! ⁇ About 680nm.
  • Measurement includes any of detection, quantification, and semi-quantification.
  • Fluorescent labeling agents are widely used not only in the sandwich method described above, but also in other immunoassay methods such as immune thread and weaving chemistry. Furthermore, it is widely practiced to detect nucleic acids having a specific base sequence by labeling a nucleic acid with a fluorescent labeling agent. For these uses, the fluorescent labeling agent of the present invention is used in the same manner as conventional fluorescent labeling agents. Can be used.
  • the fluorescent compound of the present invention can be used as a red fluorescent dye in various fields such as a red display material, a dye laser, and an optical recording material, in addition to a labeling agent. .
  • the fluorescent compound of the present invention has a fluorescence wavelength peak of 580 ⁇ ! It is in the long wavelength region from about 700nm to orange to near infrared.
  • this is used as a labeling agent, it can be measured without receiving these optical interferences even in the presence of biological materials such as biological tissues, blood, lipids and water.
  • biological materials such as biological tissues, blood, lipids and water.
  • a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a single chain antibody, a peptide chain, a sugar chain, or the like that specifically accumulates in a specific organ or tumor cell in the animal is labeled and injected into the animal, and then injected into the animal.
  • Labeling agent accumulates in organs and tumor cells. Therefore, it is possible to visualize specific organs and tumor cells by imaging animals with a CCD camera or the like.
  • examples of biological imaging are not limited to this. It can also be used for red display materials, dye lasers, optical recording materials, and photodynamic therapy (PDT).
  • the fluorescent compound of the present invention has a high fluorescence molecular yield and a molar extinction coefficient, it can be measured with high sensitivity by using it as a labeling agent.
  • the fluorescent compound 1 of the present invention was synthesized.
  • “on r” means room temperature.
  • DDQ 2,3-disiano-5,6-dichloro- p-benzoquinone (a kind of oxidizing agent).
  • the fluorescent compound 2 of the present invention was synthesized.
  • the fluorescent compound 4 of the present invention was synthesized.
  • the fluorescent compound of the present invention was synthesized according to the following reaction scheme.
  • 2-Furoboronic acid 20 (6.00 g, 53.5 mmol, 1 eq) in 5: 1 toluene / methanol solution (320 ml) was added to p-bromoasol (10.0 g, 53.5 mmol, 1 eq) and 2M aqueous sodium carbonate solution ( 53 ml) was added, degassed under reduced pressure, and completely replaced with Ar.
  • Tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0) (619 mg, 0.535 mmol, 0.01 eq) was added, and the mixture was stirred at 80 ° C. for 3 hours. After standing to cool, wash with saturated aqueous sodium bicarbonate and extract with ethyl acetate three times.
  • Phosphorus chloride (0.72 ml, 8.0 mmol, 2 eq) was added to a solution of 21 (700 mg, 4.0 mmol, 1 eq) in 1,2-dichloroethane (20 ml), and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes.
  • ⁇ , ⁇ -dimethylformamide (0.62 ml, 8.0 mmol, 2 eq) was added, and the mixture was stirred at 80 ° C for 30 minutes. After allowing to cool, 5N aqueous sodium hydroxide solution was added dropwise at 0 ° C. Water was added, extracted 5 times with methylene chloride, and washed once with saturated brine.
  • the absorption spectrum and fluorescence emission spectrum of the fluorescent compound 2 of the present invention synthesized in Examples 2, 3 and 5 were measured.
  • the absorption spectrum was measured using a commercially available spectrophotometer (U-2001, Hitachi, Ltd.) at a measurement wavelength of 300 to 750 nm and a measurement wavelength interval of 1 nm.
  • the fluorescence emission spectrum was measured using a commercially available fluorometer (F-4500, Hitachi, Ltd.) using excitation light having the maximum absorption wavelength under the following conditions.
  • the fluorescence quantum yield ⁇ is calculated by the following formula.
  • A is the absorbance
  • F is the wavenumber integral value of the fluorescence spectrum
  • n is the refractive index of the solvent
  • ref is the reference dye (reference)
  • the fluorescence of boron dipyrromethene was extended by extending the ⁇ - conjugated system by introducing a ring.
  • the fluorescent compound emits strong and sharp fluorescence at the maximum wavelength of 588 nm and 596 nm, and has a sharp spectral shape. Looking at the values in Table 1, it can be seen that the half-value width I hm is as small as about 20 nm and the spectrum is extremely sharp. These results indicate that the fluorescent compounds 2 and 3 are shifted in the long wavelength while having the same skeletal rigidity as the boron dipyrromethene skeleton. Fluorescent compound 2 showed a high fluorescence quantum yield even in high polarity MeOH and even in low polarity THF.
  • the fluorescent compound 2 has an extremely low environmental responsiveness inherent to boron dipyrromethene. More polar, aqueous solvent It is thought that it emits the same fluorescence in the field, and it has the characteristics that are indispensable for application to biomeasurement.
  • the maximum absorption wavelength of the fluorescent compound was 673 nm, a shift of about 170 nm compared to boron dipyrromethene (R ⁇ R ⁇ R ⁇ R ⁇ Me), and a longer wavelength shift of about 90 nm compared to the fluorescent compound.
  • R ⁇ R ⁇ R ⁇ R ⁇ Me boron dipyrromethene
  • the maximum absorption wavelength was achieved in the near infrared region.
  • the fluorescent compound emits strong and sharp fluorescence at the fluorescence maximum wavelength of 685 nm, and has a sharp spectral shape.
  • the half-value width I hm is as small as about 30 nm and the spectrum is extremely sharp. From these results, it is evident that the fluorescent compound has the same skeletal rigidity as the fluorescent compound 2 even though the P-methoxyphenyl group was introduced. The The fluorescent compound showed a high fluorescence quantum yield even in high polarity MeOH and even in low polarity THF. This indicates that the fluorescent compound is extremely low in nature and has an environmental responsiveness as boron dipyrromethene. Furthermore, even in highly polar and aqueous solvents !, it is thought that the same fluorescence is emitted, and it has the indispensable characteristics for bio-measurement using near infrared light. .
  • the fluorescent compound had a maximum absorption in the near infrared region, and V was strongly sharp even in that wavelength region.
  • the optical properties of fluorescent compounds are one of the most outstanding near-infrared fluorescent dyes.
  • Cy5 (trade name, 1- [3- (4-monomethoxytrithioxy) propyl] -1 '-[3-[(2-cyanoethyl)-( ⁇ , ⁇ ), a widely used commercially available fluorescent dye -Diisopropyl) phosphoamidityyl] propyl] -3,3,3 ', 3'-tetramethylindodicarboxy glycide was examined in the same manner as in Example 6. The results are shown in Table 2 below. Table 2 also shows the optical characteristics of the fluorescent compound of the present invention synthesized in Example 5 for comparison.
  • the fluorescent compound of the present invention has a molar extinction coefficient. Showed almost the same value, and the fluorescence quantum yield was much higher. Therefore, it was shown that fluorescent compounds ⁇ have the potential to be used universally for more sensitive biometrics instead of existing near-infrared fluorescent dyes.
  • Table 3 shows the optical properties of the fluorescent compound of the present invention synthesized in Example 5 for comparison.
  • the fluorescent compound of the present invention had a significantly higher molar extinction coefficient and a higher fluorescence quantum yield than the compounds of Comparative Examples 2-4.
  • the fluorescent compound of the present invention was synthesized according to the following reaction scheme.
  • the fluorescent compound Z of the present invention was synthesized.
  • the reagent used is an analytical grade reagent, and the reagent of the highest grade was used. All 1H-NMR vectors were measured at r.t. using tetramethylsilane as an internal standard. The equipment used was JOEL JNM-GSX300, JOEL JMM-LA300 FT-NMR.
  • ⁇ ⁇ X (A XFXn 2 ) / (AXF Xn 2 ) (However, A is the absorbance, F is the wavenumber integral value of the fluorescence spectrum, n is the refractive index of the solvent, and ref is the reference dye (reference))
  • the fluorescence quantum yield ⁇ of fluorescent compound S was prepared by preparing solutions with different concentrations, and creating a graph with the vertical axis representing the fluorescence intensity area integrated value F (excitation light: 690 horizontal axis representing absorbance A).
  • Fluorescent compound S has a maximum fluorescence wavelength of 737 nm in black mouth form. It was shifted by about 54 nm. From this, it can be seen that a further long wavelength shift can be achieved by introducing an electron withdrawing group at a specific site. In addition, the fluorescent compound S shows a sharp fluorescence spectrum with a very small half-value width of about 31 nm. From this, it can be seen that the long wavelength shift was performed while maintaining the rigidity of the skeleton similar to the boron dipyrromethene skeleton.
  • Fluorescent compound S and Cy7 (trade name, 1- [3- (4-monomethoxytrityroxy) propyl] -1 '-[3- [(2-cyanoethyl)-( ⁇ , ⁇ -diisopropyl) (Phosphoroamidyl] propyl] -3,3,3 ', 3'-tetramethylindotricarbocyanine) was tested to confirm the durability to light.
  • the concentration was adjusted to 1, and the sample was left under the same conditions (specifically, under daily light) without shading, and the absorbance was measured every day (or every other day).
  • the vertical axis shows the relative absorbance (absorbance before standing as 100%) and the horizontal axis shows the number of days.
  • Figure 1 shows the results.
  • the absorbance of fluorescent baboon compound S was maintained at 95% or more even after one week, while the absorbance of Cy7 (trade name) decreased to 10% or less. From this result, it was found that Cy7 (trade name) has extremely poor durability against light, but the fluorescent compound S has extremely high durability against light. From this result, it is considered that it can be applied as a long-time analytical reagent, a highly durable new display dye material, or an optical material, which was impossible with conventional dyes.
  • the fluorescent compound S has a chemically robust molecular structure, it is considered that the light durability has been dramatically improved. Therefore, the fluorescent compound has a flexible olefin structure. Significant advantages are also found in terms of light durability over dyes possessed, especially cyanine dyes such as Cy7. However, this phenomenon is not limited to fluorescent compounds, and is a characteristic common to all fluorescent compounds according to the present invention.

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Description

蛍光性化合物及びそれから成る標識剤
技術分野
[0001] 本発明は、蛍光性化合物及びそれから成る標識剤に関する。
背景技術
[0002] 蛍光色素は、試料を可視化する目的で用いられ、生物および生化学分野において は標識材料 (ラベル化色素)や染色色素、生体関連物質の認識プローブ、光線力学 療法 (PDT)などに広く用いられる。また、長波長とりわけ近赤外領域 (具体的には 650
900nm)に吸収および蛍光を有する蛍光色素は、生体組織や血液、脂質や水とい つた生体物質の存在下でもこれらの光学的妨害を受けることなく測定できる。さらに 低エネルギーかつ高 、光浸透性と 、つた利点から、生体深部組織のイメージングへ の応用が期待される。
[0003] また、長波長の蛍光色素は生物や生化学分野に限らず化学系およびその他の分 野でも用いられる。例えば赤色の表示材料や色素レーザー、光学記録材料などに頻 繁に用いられる。このように、長波長の蛍光色素は生物分野のみならず、幅広い分 野で求められている。
[0004] 優れた長波長蛍光色素、たとえば生体物質の標識材料を目的とした蛍光色素とし て求められる特性は、以下のような項目がある。
1) 長波長の蛍光
2) 高いモル吸光係数
3) 高い蛍光量子収率
4) 鋭い吸収スペクトル
5) 非環境応答性 (溶媒に対する応答が小さいこと）
6) 波長の多様性 (さまざまな波長の色素が合成できること）
[0005] 現在、上記の条件の一部を満たす分子として、下記構造式で示されるボロンジピロ メアン霄格 (4,4— difluoro— 4— bora— 3a,4a— diaza— s— indacenes)力ある。
[0006] [化 1]
Figure imgf000004_0001
[0007] ボロンジピロメテン骨格は、高 、光耐久性、高!、蛍光量子収率、鋭 、吸収スぺタト ルをもつ優れた色素であるが、基本骨格の蛍光波長はおおよそ 500 nm前後であるた め、近赤外蛍光色素としての十分な機能を持っていない。そこでボロンジピロメテン の長波長化に関する研究がいくつか行われてきた。その手法としては、 1)強い電子 供与基の導入、 2)骨格の堅牢化、 3)共役系の拡張などが挙げられる。
[0008] 1)に関しては、例えば特許文献 1や非特許文献 1に代表されるように、 R1と R7に強 い電子供与基を導入することで長波長化は達成できるが、 モル吸光係数の向上は 達成できていない。また導入する官能基の電子供与性が強くなるほど、光誘起電子 移動 (PET)が起こり易くなるため、蛍光量子収率の低下が起こるとともに、溶媒極性 に対する蛍光量子収率の依存性が強くなる。具体的には、水やメタノールなどの極 性溶媒中においては、これらの分子の蛍光量子収率は著しく低下するため、バイオ 分析などには適して ヽな ヽ。
[0009] 2)は、例えば非特許文献 2に代表されるように、ボロンジピロメテンの R1および R7に 導入された電子供与基を、 R2および R6と適切なメチレン鎖な 、しはへテロ原子で架橋 することで長波長化している報告例である力 モル吸光係数の向上は達成しておら ず、合成法も煩雑であるためノリエーシヨンは限定される。
[0010] 3)は、例えばシァニン系色素のようにォレフィンなどの共役二重結合を拡張するこ とにより長波長化するというものである力 これはシァニン系色素などでしばしば報告 されているようなォレフインの光異性化に由来する光安定性や蛍光量子収率の低下 が懸念されるため、有効は手法とはいえない。また、例えば特許文献 2および特許文 献 3に代表されるように、芳香環を R2, R3および R5, R6に縮合することで長波長化を達 成することができるが、モル吸光係数の向上は達成できていない。また、報告されて いる合成法では、縮合できる環も芳香環に限定され、色素のバリエーションも限られ る。 [0011] 特許文献 1 :米国特許第 5,248,782号
特許文献 2：米国特許第 5,433,896号
特許文献 3 :米国特許第 6,005,113号
非特許文献 1 :A. Burghart et. al. J. Org. Chem. 1999, 64, 7813.
非特許文献 2 : J. Chen et. al. J. Org. Chem. 2000, 65, 2900.
非特許文献 3 : Current Medicinal Chemistry 2005, 12, 795-895.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 従って、本発明の目的は、高い光耐久性、高い蛍光量子収率、鋭い吸収スぺタト ルを持ち、かつ、長波長領域の蛍光を発し、モル吸光係数が高い新規な蛍光性ィ匕 合物及び標識剤としてのその用途を提供することである。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明らは、鋭意研究の結果、上記したボロンジピロメテン骨格において、 R1と R2、 及び/又は、 R6と R7で特定のへテロ環を形成することにより、ボロンジピロメテン骨格 を含む蛍光色素が有する高!ヽ光耐久性、高!ヽ蛍光量子収率及び f ヽ吸収スぺタト ルと 、う優れた特性を維持したまま、蛍光の長波長化及びモル吸光係数の向上が達 成されることを見出し、本発明を完成した。
[0014] すなわち、本発明は、下記一般式 [I]
[0015] [化 2]
Figure imgf000005_0001
[ I ]
[0016] (ただし、式中、
R1と R2は互いに協働して、ィォゥ、酸素、窒素及びリンカも成る群より選ばれる少なく とも 1個のへテロ原子を含む 5員若しくは 6員のへテロ環を形成するか又は該ヘテロ 環を形成しない場合には互いに独立に水素原子若しくは前記化合物の蛍光を阻害 しない任意の基を表し、
R6と R7は互いに協働して、ィォゥ、酸素、窒素及びリンカも成る群より選ばれる少なく とも 1個のへテロ原子を含む 5員若しくは 6員のへテロ環を形成するか又は該ヘテロ 環を形成しない場合には互いに独立に水素原子若しくは前記化合物の蛍光を阻害 しない任意の基を表し、
(l)R1と R2、及び、（2)R6と R7、の少なくともいずれか一方は上記へテロ環を形成し、
Qは炭素原子又は窒素原子を表し、
R4及び R5は互いに独立に水素原子又は前記化合物の蛍光を阻害しない任意 の基を表し (ただし、 Qが窒素原子の場合には R4は存在しない）、
R8及び R9は互いに独立にハロゲン原子、アルキル基、ァルケ-ル基、アルキ-ル基 、アルコキシ基、ァリール基又はへテロアリール基を示す）
で示される構造を有する蛍光性化合物を提供する。
[0017] また、本発明は、上記本発明の蛍光性化合物から成る標識剤を提供する。さらに、 本発明は、上記本発明の標識剤で標識した物質を反応に供し、反応後、該標識剤 を発光させて該物質を測定することを含む標識物質の測定方法を提供する。
発明の効果
[0018] 本発明によれば、ボロンジピロメテン骨格を含む蛍光色素が有する高 、光耐久性、 高 ヽ蛍光量子収率及び鋭 、吸収スペクトルと ヽぅ優れた特性を維持したまま、長波 長の蛍光を発し、高いモル吸光係数を有する新規な蛍光性ィヒ合物が提供された。本 発明の蛍光性化合物は、蛍光波長が長いので、これを標識剤として用いた場合、生 体組織や血液、脂質や水と!ヽつた生体物質の存在下でもこれらの光学的妨害を受け ることなく測定できる。さらに低エネルギーかつ高い光浸透性といった利点から、生体 深部組織のイメージングへの応用が可能である。また、赤色の表示材料や色素レー ザ一、光学記録材料、光線力学治療 (PDT)などに用いることもできる。さらに、本発明 の蛍光性化合物は、蛍光量子収率及びモル吸光係数が高いので、これを標識剤と して用いることにより、高感度の測定が可能になる。
図面の簡単な説明 [0019] [図 1]本発明の蛍光性ィ匕合物旦と、市販の蛍光性ィ匕合物 Cy7 (商品名）の吸光度の経 時変化を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 上記の通り、本発明の蛍光性化合物は、上記一般式 [I]で表される化学構造を有す る。一般式 [I]中、 R1と R2は互いに協働して、ィォゥ、酸素、窒素及びリンから成る群よ り選ばれる少なくとも 1個のへテロ原子を含む 5員若しくは 6員のへテロ環を形成する か又は該ヘテロ環を形成しな 、場合には互いに独立に水素原子若しくは前記化合 物の蛍光を阻害しない任意の基を表し、同様に、 R6と R7も互いに協働して、ィォゥ、 酸素、窒素及びリンカ 成る群より選ばれる少なくとも 1個のへテロ原子を含む 5員若 しくは 6員のへテロ環を形成するか又は該ヘテロ環を形成しな 、場合には互いに独 立に水素原子若しくは前記化合物の蛍光を阻害しない任意の基を表わす。そして、 ( R1と R2、及び、（2)R6と R7、の少なくともいずれか一方は上記へテロ環を形成する。こ のへテロ環により、蛍光が長波長化される。
[0021] 上記へテロ環としては、下記式のいずれかで表される化学構造を有するものが好ま しい。上記へテロ環が 2個形成される場合には、互いに独立である。
[0022] [化 3]
Figure imgf000007_0001
ただし、これらの式中、 X、 Y及び Zは、互いに独立にィォゥ、酸素、窒素又はリン原子 を示し、 R1Qないし R17は互いに独立に水素原子又は本発明の蛍光性ィ匕合物の蛍光を 阻害しない任意の基を表す。なお、これらの式中、左側の 2本の波線は、各へテロ環 が結合している、本発明の化合物の一部分を模式的に表すものである。好ましいへ テロ環を示す上記各式から明らかなように、ヘテロ環は、最も好ましくは 5員環である 。また、ヘテロ原子として、酸素原子又はィォゥ原子を有するものが好ましい。上記各 式で表されるヘテロ環の中でも、特に下記式のいずれかで表される化学構造を有す るものが特に好ましい。
[0024] [化 4]
Figure imgf000008_0001
[0025] 上記各式中、 R1Qないし R17は互いに独立に水素原子又は本発明の蛍光性化合物 の蛍光を阻害しな!、任意の基を表す (本発明の蛍光性化合物の蛍光を阻害しな ヽ 任意の基については、 R3ないし R5の説明の項で併せて後述する）力 R1Qないし R17とし て、電子供与性基を有するものが、蛍光の波長がより長波長になるので好ましい。特 に、電子供与性が高い基ほど、蛍光の波長がより長波長になるので好ましい。 R1Qな いし R17が 1つのへテロ環上に 2個存在する場合には、少なくともいずれか一方が電子 供与性基を有するものが好まし 、。
[0026] 電子供与性基の例としては、アルキル基、フ 二ル基、 P-アルコキシフ 二ル基、 P- ジアルキルアミノフヱ-ル基、 2-チェ-ル基、 2-フリル基、ジアルコキシフヱ-ル基（ 好ましくは 3,6-ジアルコキシフエ-ル基）等を挙げることができる。これらのうち、アル キル基又はアルキル部分を含む基のアルキル部分の炭素数は、特に限定されな ヽ 力 1〜10程度が好ましい。これらの電子供与性基のうち、特に炭素数 1〜10のアル キル基又はアルキル部分の炭素数が 1〜10のアルコキシフエ-ル基が好ましい。
[0027] 上記一般式 [I]中、 Qは炭素原子又は窒素原子を表す。 Qが窒素原子の場合には、 Qが炭素原子の場合に比べて蛍光が長波長化される。なお、 Qが炭素原子の場合、 R4に電子吸引性の置換基 (例えば-トロ基、シァノ基、トリフルォロメチル基等）を導 入することにより Qが窒素原子の場合と同様、蛍光が長波長化される。
[0028] R3、R4及び R5は互いに独立に水素原子又は本発明の蛍光性ィ匕合物の蛍光を阻害 しない任意の基を表す。ただし、 Qが窒素原子の場合には R4は存在しない。
[0029] 上記一般式 [I]中の R3ないし R5、ヘテロ環を形成しない場合の R1と R2又は R6と R7や上 記した好ましいヘテロ環中の R1Qないし R17が表す、本発明の蛍光性化合物の蛍光を 阻害しない任意の基としては、次のものを挙げることができる。なお、ここで、「蛍光を 阻害しない」とは、蛍光の波長を短くしたり、モル吸光係数を低下させたり、蛍光量子 係数を低下させたりすることが全く又はほとんどない (好ましくは、その置換基を有さ ない化合物の値の 95%以上を有する）ことを意味する。なお、蛍光を阻害しない任 意の基が、後述する標的イオンや標的化合物の認識部位である場合には、標的との 結合の有無により蛍光が変化するが、標的と結合した場合及び結合していない場合 の少なくとも 、ずれかにお!/、て、蛍光を阻害しな!、ことを意味する。
[0030] ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、チオール基、カルボキシル 基、アルデヒド基、スルホン酸基、イソシァネート基、チォイソシァネート基、アルキル 基、ァルケ-ル基、アルキ-ル基、アルコキシ基、アルコキシカルボ-ル基、ァシル基 、ハロゲノアシル基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルキルチオ基、ァ ルキルカルボ-ルアミド基、アルキルアミドカルボ-ル基、モノアルキルシリル基、ジ アルキルシリル基、トリアルキルシリル基、モノアルコキシシリル基、ジアルコキシシリ ル基、トリアルコキシシリル基、アルキルスルフォ-ル基、ハロゲノスルフォ-ル基、ァ リール基及びへテロアリール基。
[0031] これらの置換基中、「アルキル基」は、炭素数 1〜20のものが好ましぐ直鎖状、分岐 状及び環状 (すなわち、シクロアルキル基）のいずれであってもよい。この場合、アル キル基に含まれる水素原子はすべて置換されて!、な 、か、ある 、はそのうち 1つ以上 力 ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、チオール基、カルボキ シル基、アルデヒド基、スルホン酸基、イソシァネート基、チォイソシァネート基、ァリ ール基及びへテロアリール基力 成る群より選ばれる少なくとも 1種で置換されていて もよい。また、上記置換基中のアルコキシ基、アルキルチオ基等の、アルキル基部分 を含む基中のアルキル基についても同様である。なお、アルキル基上の上記した置 換基は特に必要ではない。
[0032] また、上記各置換基中、「ァルケ-ル基」は、炭素数 2〜20のものが好ましぐ直鎖 状、分岐状及び環状 (すなわち、シクロアルケ-ル基）のいずれであってもよい。この 場合、ァルケ-ル基に含まれる水素原子はすべて置換されていないか、あるいはそ のうち 1つ以上が、ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、チォー ル基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホン酸基、イソシァネート基、チォイソシァ ネート基、ァリール基及びへテロアリール基力 成る群より選ばれる少なくとも 1種で 置換されていてもよい。もっとも、ァルケ-ル基上のこれらの置換基は特に必要では ない。
[0033] また、上記各置換基中、「アルキ-ル基」は、炭素数 2〜20のものが好ましぐ直鎖 状、分岐状及び環状 (すなわち、シクロアルキ-ル基）のいずれであってもよい。この 場合、アルキニル基に含まれる水素原子はすべて置換されていないか、あるいはそ のうち 1つ以上が、ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、チォー ル基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホン酸基、イソシァネート基、チォイソシァ ネート基、ァリール基及びへテロアリール基力 成る群より選ばれる少なくとも 1種で 置換されていてもよい。もっとも、アルキ-ル基上のこれらの置換基は特に必要では ない。
[0034] また、上記各置換基（上記したアルキル基、ァルケ-ル基、アルキニル基上に置換 しているものも包含する）中、ァリール基としては、芳香環数 1〜4で構成される芳香環 ないしは縮合多環が好ましぐ例えばフエニル基、 1-または 2_ナフチル基、 1-, 2-ま たは 9-アントラニル基、 1-, 2-または 4-ピレニル基などが好ましい。この場合、芳香環 に含まれる水素原子はすべて置換されて 、な 、か、あるいはそのうち 1つ以上がハロ ゲン原子、ニトロ基、シァノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、 アルデヒド基、スルホン酸基、イソシァネート基、チォイソシァネート基、ァリール基、 ヘテロァリール基、アルキル基、ァルケ-ル基、アルキ-ル基、アルコキシ基、アルコ キシカルボ-ル基、ァシル基、ハロゲノアシル基、モノアルキルアミノ基、ジアルキル アミノ基、アルキルチオ基、アルキルカルボ-ルアミド基、アルキルアミドカルボ-ル 基、モノアルキルシリル基、ジアルキルシリル基、トリアルキルシリル基、モノアルコキ シシリル基、ジアルコキシシリル基、トリアルコキシシリル基、アルキルスルフォ-ル基 及びノヽロゲノスルフォニル基カゝら成る群より選ばれる少なくとも 1種で置換されていて もよい。もっとも、ァリール基上のこれらの置換基は特に必要ではない。
[0035] また、上記各置換基（上記したアルキル基、ァルケ-ル基、アルキニル基上に置換 しているものも包含する）中、ヘテロァリール基としては、ヘテロ原子を 1〜3つ含む芳 香環 (5員環または 6員環)あるいは、ヘテロ芳香環に芳香環力 〜 2っ縮合されたもの が好ましい。ここでいうへテロ原子は、酸素、窒素又はィォゥが好ましぐこれらの組 み合わせは限定されない。たとえば 2-, 3-フリル基、 2-, 3-チェ-ル基、 Ν-, 2-, 3-ピ 口リル基、 2-, 3-ベンゾフラ-ル基、 2-, 3-ベンゾチェ-ル基、 N- , 2-, 3-インドリル基 、 N-, 1-, 2-イソインドリル基、 2-, 3-, 4-ピリジル基、 2-, 3-, 4-キノリル基、 1-, 3-, 4- イソキノリル基、 2-, 4-, 5-(1,3-ォキサゾリル)基、 2-ベンゾキサゾリル基、 2-, 4-, 5-(1, 3-チアゾリル)基、 2-ベンゾチアゾリル基、 N-, 2-, 4-イミダゾリル基、 N- , 2-ベンズイミ ダゾリル基、 1-, 2-ナフトフラ-ル基、 1-, 2-ナフトチェ-ル基、 Ν-, 2-, 3-ベンズイン ドリル基などである。この場合、ヘテロ芳香環に含まれる水素原子はすべて置換され ていないか、あるいはそのうち 1つ以上がハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、ヒドロキ シ基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホン酸基、イソシァ ネート基、チォイソシァネート基、ァリール基、ヘテロァリール基、アルキル基、ァルケ ニル基、アルキ-ル基、アルコキシ基、アルコキシカルボ-ル基、ァシル基、ハロゲノ ァシル基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルキルチオ基、アルキル力 ルボニルアミド基、アルキルアミドカルボ-ル基、モノアルキルシリル基、ジアルキル シリル基、トリアルキルシリル基、モノアルコキシシリル基、ジアルコキシシリル基、トリ アルコキシシリル基、アルキルスルフォ-ル基及びハロゲノスルフォ-ル基から成る群 より選ばれる少なくとも 1種で置換されていてもよい。もっとも、ヘテロァリール基上の これらの置換基は特に必要ではな!/、。
[0036] 上記一般式 [I]中、 R8及び R9は互いに独立にハロゲン原子、アルキル基、ァルケ- ル基、アルキニル基、アルコキシ基、ァリール基又はへテロアリール基を表す。ここで 、アルキル基、ァルケ-ル基、アルキ-ル基、アルコキシ基、ァリール基又はへテロア リール基については、上記した R3〜R5及び R1Q〜R17により表されるこれらの基につい ての説明がそのまま当てはまる。 R8及び R9は互いに独立にハロゲン原子であることが 好ましぐ特に両者ともフッ素原子であることが好ましい。
[0037] 本発明の蛍光性ィ匕合物はまた、上記した本発明の蛍光性ィ匕合物の蛍光を阻害し ない任意の基として、以下 (1)〜(6)の機能性基を 1個又は複数有していてもよい。な お、上記した蛍光を阻害しな!、任意の置換基がァリール基又はへテロアリール基の 場合に、該ァリール基又はへテロアリール基上に以下の 1個又は複数の機能性基を 置換してちょい。
[0038] (1) 結合性基
本発明の蛍光性ィ匕合物は、少なくとも 1つ、結合性基を有することが好ましい。ここ で、結合性基は、他の化合物に結合させるために利用できる基を意味する。蛍光標 識剤は、タンパク質、ポリペプチド、糖等の生体関連物質に結合されることが多いた め、結合性基としては、これらの生体関連物質との結合に好都合な、アミノ基、水酸 基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、ジスルフイド基、イソシァネート基、 チォイソシァネート基、スクシンィミジルエステル基、ペンタフルオロフェ-ルエステル 基、マレイミド基等を好ましい例としてあげることができる。なお、これらの基は、他の 化合物との結合のために用いることができればよ 、ので、これらの基の少なくとも！/、ず れかを含む任意の基 (例えば、アミノアルキル基等)も結合性基として利用することが できる。なお、結合性基は、 1つあれば足り、また、結合部位を 1つに特定するために も 1つであることが通常好ましいが、 2個以上の結合性基を含んでいてもよい。また、 後述する嵩高基の一部に上記したアミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基 等を結合させて結合性基と嵩高基を兼用することも可能である。
[0039] (2) 嵩高基
合成の収率を上げるために、本発明の蛍光性化合物は、少なくとも 1つ、嵩高基を 有していることが好ましい。本発明の化学発光性ィ匕合物は、ボロンジピロメテン骨格 部分の平面性が高ぐまた、化学発光基も平面性が高い場合が多いので、化合物が 全体として平面的になる場合が多い。このような場合、平面的な化合物が積層され、 それぞれの芳香環の π結合間で生じて各分子同士が π— π結合され（ π— πスタツ キング)て凝集が生じ、収率が低下することがある。このような事態を避け、合成収率 が低下しないように、 π— πスタッキングを防止する嵩高な基を一般式 [I]中の一般式 中の R〜R 、あるいはァリール基やへテロァリール基へ導入する置換基として、少な
1 17
くとも 1つ有していることが好ましい。ここで、嵩高基は、少なくとも直鎖状のアルキル 基よりも厚さ方向（ボロンジピロメテン骨格を平面として、該平面に垂直な方向）に厚 みのある基であり、好ましくは炭素数 10以上、さらには炭素数 10〜20の分枝アルキ ル基ゃ分枝アルコキシル基が好まし 、。
[0040] (3) 脂溶性又は水溶性調整基
さらに、必要に応じ、少なくとも 1つ、溶解性 (脂溶性又は水溶性)を調整する基を含 ませてもよい。蛍光標識剤は、水系で用いられることが多いので、蛍光性化合物の親 水性を高めて水系中での溶解性を向上させることが望まれる場合には、少なくとも 1 つ親水性基を含ませてもよい。このような親水性基としては、水酸基、アミノ基、カル ボニル基、カルボキシル基、スルホン酸基、エーテル結合等の親水性の基を 1個又 は複数含むアルキル基やアルコキシル基 (炭素数は 1〜6が好まし 、）等を例示する ことができるがこれらに限定されるものではない。また、このような親水性の基は上記 した嵩高基、結合性基と兼用させてもよい。また、脂溶性を増大させたい場合には、 好ましくは炭素数 10以上、さらには炭素数 10〜20のアルキル基ゃァリール基、又は これらの両者を含む基等を含ませてもよい。なお、下記実施例で合成した本発明の 蛍光性ィ匕合物 2〜 は、脂溶性を増大させる基として、下記の化学構造を有する基を R4として有している。
[0041] [化 5]
Figure imgf000013_0001
[0042] なお、この基にぉ 、て、エーテル部分は、合成を容易にするために含まれて 、る。
また、ベンゼン環上の 2つのメチル基は、この置換基の回転運動を阻害し、この置換 基の回転運動に起因する蛍光量子収率の低下を防止するものである。
[0043] (4) 化学発光基
化学発光基は、化学反応により発光する構造を有する基である。本発明の蛍光性 化合物に化学発光基を導入することにより、該化学発光基が発する光により蛍光色 素部分が蛍光を発し、この蛍光が測定される。したがって、化学発光基は、必ずしも 可視光を発光するものである必要はなぐ蛍光色素部分を励起して蛍光を発せさせ ることができる光を発するものであればいずれのものをも採用することができる。このよ うな化学発光基としては、この分野にぉ 、て標識剤として用いられて 、るものであれ ばいずれのものをも用いることができ、種々のものが公知ないしは周知である。好まし い例として、フタルカルバジド誘導体、ジォキセタン誘導体、口フィン誘導体、アタリジ ン誘導体、インドール誘導体、シユウ酸誘導体、ジフヱノィル誘導体又はルシフェリン 誘導体を挙げることができ、これらはいずれもこの分野において周知である。これらの 化学発光基は、それぞれ以下の一般式で示されるものである。
[0044] [化 6]
Figure imgf000014_0001
フタルヒドラジド誘 体
[0045] [化 7]
Figure imgf000014_0002
ジォキセタン誘導体
[0046] [化 8]
Figure imgf000014_0003
ロフィン ¾体
[0047] [化 9]
Figure imgf000014_0004
ァクリジン誘導体 [0048] [化 10]
〇 〇
R_〇 11 11 〇_R
ジォキセタン誘導体
[0049] [化 11]
Figure imgf000015_0001
ジフ Iノィル誘導体
(X = -0-, —0—0—)
[0050] [化 12]
Figure imgf000015_0002
ルシフ Iリン誘導体
[0051] (5) ポリマーへの重合部位 (末端に不飽和二重結合を有する分子）
本発明の蛍光性ィ匕合物は、少なくとも 1つ、重合部位を有することが好ましい。ここ で、重合部位は、有機高分子に共重合させる部位を示す。一般に、有機高分子に色 素を導入することで、蛍光強度やモル吸光係数が増加し、検出感度が上がることが 知られている。また、共重合させることで色素が溶媒にリークしない（流出しない）ので 、有機高分子膜による連続測定などにも適している。重合部位としては、ビニル基を 有するものであればかまわない。具体的には、ビュルアルキル基、ビュルアルコキシ 基、ビュルアルコキシカルボ-ル基、ビュルァリール基、ビュルへテロアリール基など であるが、これらに限定されない。
[0052] (6) 標的イオンや標的化合物の認識部位 (クラウンエーテルなどのように特定のィォ ンゃ物質を選択的に捕捉する基）
ベンゾクラウン、ァザクラウン、 N-ァリールァザクラウンなどのイオンや分子を認識す る基や、 P-ジメチルァミノフエ-ル基などの周囲の溶媒極性 (pHや溶媒極性）に応答 する基を導入することで、特定の物質や環境を認識し、光学情報へ変換する蛍光プ ローブとしての機能をもたせることもできる。この際、標的 (ターゲット)の認識前後で認 識部位の電子供与性が変化するため、色素の光学特性も変化する。最も好ましいの は上記した R4、 R1Q、 R12、 R15又は R16に認識部位を導入することであるが、これに限定さ れない。なお、ここで、認識部位とは、標的のイオンや標的化合物を捕捉する部位の ことを示す。一般に、蛍光化合物に認識部位を持たせ、特定の物質を測定する際に は、認識前後で光学応答が変化することが望ましい。例えば、認識前後で蛍光量子 収率が変化したり、吸収あるいは蛍光極大波長が変化したりすることで、特定の物質 の測定が可能となる。
[0053] 本発明の蛍光性ィ匕合物は、例えば次のようにして製造することができる。すなわち、 任意の位置にホルミル基を有するヘテロァリール環にアジド酢酸ェチルを加えてアジ ド化合物を合成後、トルエン中で加熱還流し、ヘテロァリール環にピロールを縮環す る。ピロールの α位のカルボン酸ェチルエステルを脱保護後、強塩基存在下で加熱 して α位のカルボン酸を脱炭酸する。このピロール環をホルミル基を有する芳香環と 縮合し、ジピロメテンィ匕合物を合成する。ジピロメテンィ匕合物を合成する方法はこれ に限らず、例えばピロール環同士をオルトギ酸トリアルキルおよび酸触媒存在下で反 応させることや、ホルミル基を有するヘテロピロール環と酸存在下で反応させることで も得られる。また、ヘテロピロール環を亜硝酸ナトリウムにて-トロソィ匕することで、架 橋部分に窒素原子を有するジピロァザメテン化合物を合成することができる。得られ たジピロメテンィ匕合物およびジピロァゾメテン化合物を、トリェチルァミンおよび三フッ 化ホウ素ジェチルエーテル錯体存在下で反応させれば、目的とする化合物が得られ る。また、ヘテロァリール環にハロゲン原子ないしはボロン酸を有するものであれば、 鈴木カップリングにより任意のァリール環やへテロァリール環を直結することが可能で あり、さまざまな波長の色素を提供することが可能となる。
[0054] すなわち、例えば、上記のようにして先に R1と R2、及び/又は R6と R7で形成されるへ テロ環とピロール環との縮合環を合成し、 2個の縮合環をジクロロメタンにより、 1個の 炭素原子を介して結合させ、 BF等を反応させて BR8R9部分を結合させることにより本
3
発明の蛍光性ィ匕合物を合成することができる。置換基を有する場合には、さらに置換 基を結合させることができる。ただし、 R4として置換基を有する場合には、上記したジ クロロメタンと同時に該置換基含有ィ匕合物を反応させることにより、前記縮合環がジク ロロメタンで結合されるのと同時に該ジクロロメタンの炭素原子に該置換基を結合さ せることができる。複数の本発明の蛍光性化合物の詳細な合成方法が下記実施例 に記載されているので、当業者であればそれらを参照して本発明の蛍光性ィ匕合物を 容易に製造することができる。
[0055] 本発明の蛍光性化合物は、蛍光標識剤として用いることができる。蛍光標識剤自 体は周知であり、本発明の蛍光性ィ匕合物も従来の蛍光標識剤と同様にして用いるこ とができる。すなわち、本発明の蛍光性化合物を、標識すべき被標識物質に結合さ せることにより被標識物質を標識する。本発明の蛍光性ィ匕合物が上記した結合性基 を有する場合には、常法により上記結合性基を介して本発明の蛍光性化合物を被標 識物質に結合する。結合性基を有さない場合には、常法により結合性基を導入した 中間体を調製し、これを被標識物質と結合することができる。
[0056] 蛍光標識剤の使用の態様は従来と全く同様であり、上記のように被標識物質を標 識した後、標識した物質 (本明細書において「標識物質」という）を反応に供し、必要 に応じて洗浄工程等を行なった後、標識に励起光を当て、蛍光を発光させ、該蛍光 を測定する。ここで、反応とは、例えば免疫測定の場合には抗原抗体反応、核酸の 検出の場合には、核酸同士のハイブリダィゼーシヨン等を意味するがこれらに限定さ れるものではない。例えば、蛍光標識剤が広く用いられている免疫測定の場合、次 のようにして標識剤を利用することができる。例えば、サンドイッチ法により被検試料 中の標的抗原を免疫測定する場合、標的抗原に対する一次抗体を固相に結合し、 これを被検試料と反応させて、被検試料中の標的抗原を固相化一次抗体に結合さ せる。洗浄後、蛍光標識剤で標識した第二抗体を反応させる。洗浄後、標的抗原に 結合した第二抗体の蛍光標識剤を、常法に従い励起光により蛍光発光させ、蛍光を 測定する。最適な励起光の波長は、各蛍光性化合物について吸収極大波長を測定 することにより容易に設定することができる、通常、 570ηπ！〜 680nm程度、好ましくは 66 Οηπ！〜 680nm程度である。なお、本明細書及び特許請求の範囲において「測定」には 検出、定量、半定量のいずれもが包含される。 [0057] また、蛍光標識剤は、上記したサンドイッチ法のみならず、免疫糸且織化学等の他の 免疫測定法においても広く用いられている。さらに、核酸を蛍光標識剤で標識し、特 定の塩基配列を有する核酸を検出することも広く行なわれており、これらの用途にも 本発明の蛍光標識剤を従来の蛍光標識剤と同様に用いることができる。
[0058] さらに、本発明の蛍光性化合物は、標識剤以外にも、赤色の蛍光色素として、赤色 の表示材料や色素レーザー、光学記録材料などの種々の分野にお!、て用いること ができる。
[0059] 本発明の蛍光性化合物は、蛍光波長のピークが 580ηπ！〜 700nm程度の橙〜近赤 外の長波長領域にある。これを標識剤として用いた場合、生体組織や血液、脂質や 水といった生体物質の存在下でもこれらの光学的妨害を受けることなく測定できる。 さらに低エネルギーかつ高 ヽ光浸透性と ヽつた利点から、生体深部組織のイメージ ングへの応用が可能である。例えば、動物内の特定の臓器や腫瘍細胞に特異的に 集積するようなポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ペプチド鎖、 糖鎖などに標識し、動物内に注入することで、特定の臓器や腫瘍細胞に標識剤が集 積する。したがって、動物を CCDカメラなどで撮像することにより、特定の臓器や腫瘍 細胞を可視化することが可能となる。もっとも、生体イメージングの例はこれに限定さ れるものではない。また、赤色の表示材料や色素レーザー、光学記録材料、光線力 学療法 (PDT)などに用いることもできる。さらに、本発明の蛍光性ィ匕合物は、蛍光量 子収率及びモル吸光係数が高いので、これを標識剤として用いることにより、高感度 の測定が可能になる。
[0060] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実 施例に限定されるものではない。
実施例 1
[0061] 本発明の蛍光性化合物丄の合成
下記の反応スキームに従い、本発明の蛍光性ィ匕合物 1を合成した。なお、反応スキ ーム中（後述の反応スキームにおいても同じ）、「r上」は室温を意味する。
[0062] [化 13] 、COOEt
Figure imgf000019_0001
0。C， 3 h rsflux
Figure imgf000019_0002
蛍光性化合物 _
[0063] [化 14]
COOEt
Figure imgf000019_0003
0°C, 3 h 2
[0064] Ar気流下、 0°Cにて 5-メチル -2-チォフェンカルバルデヒド 1 (3.67 g, 29.1 mmol, 1.0 eq.)とアジド酢酸ェチル（7.51 g, 58.2 mmol, 2.0 eq.)のエタノール溶液（100 mL) に、ナトリウムエトキシド 20%エタノール溶液 (19.9 g, 58.3 mmol, 2.0 eq.)をエタノー ル (50 mL)で希釈した溶液をゆっくり滴下した。 3時間撹拌後、飽和塩ィ匕アンモ-ゥム 水溶液を加え pHを中性にし、析出した黄色い沈殿をろ別し、沈殿を水で洗浄後、真 空乾燥した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル，へキサン：酢 酸ェチル = 9 : 1)により分離精製し、薄黄色液体 2 (3.61 g)を得た。
TLC (シリカ)： R = 0.8 (シリカゲル，へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)
f
[0065] [化 15]
Figure imgf000019_0004
2 reflux
3 [0066] 2のトルエン溶液 (60 ml)を 30分還流撹拌した。減圧濃縮後、得られた粗生成物を カラムクロマトグラフィー（シリカ，へキサン：酢酸ェチル = 9 : 1)により分離精製し、薄 肌色固体 3 (1.82 g, 25.0%)を得た。
TLC (シリカ)： Rf = 0.3 (へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)
[0067] [化 16]
Figure imgf000020_0001
[0068] 3 (1.82 g, 8.70 mmol, 1 eq.)のエタノール溶液 (100 ml)に水酸化ナトリウム (5.35 g , 134 mmol, 15.4 eq.)の水溶液（50 ml)を加え、 30分還流撹拌した。放冷後、 6N塩 酸水溶液を加えた。発生した沈殿をろ過後、ろ物を水で洗浄、真空乾燥し、白色固 体 4 (1.41 g, 89.5%)を得た。
TLC (シリカ)： Rf = 0.2 (へキサン：酢酸ェチル = 1 : 1)
[0069] [化 17]
Figure imgf000020_0002
140°C "
[0070] 4 (571 mg, 3.15 mmol, 1 eq.)のエチレングリコール溶液 (20 ml)に水酸化ナトリウ ム（1.34 g, 33.5 mmol, 10.6 eq.)を加え、 Ar気流下、 140°Cで 4時間撹拌した。放冷後 、酢酸ェチルをカ卩え、水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウム で乾燥後、減圧濃縮し、得られた茶色オイル状の粗生成物をカラムクロマトグラフィー
(シリカ，へキサン:酢酸ェチル =4： 1)により分離精製し、茶色液体 5 (303 mg, 70.1
%)を得た。
[0071] [化 18]
Figure imgf000021_0001
[0072] 5 (56.8 mg, 0.414 mmol, 2 eq.)の塩化メチレン溶液 (5 ml)にオルトギ酸トリェチル (1.00 mL, 6.21 mmol, 30 eq.)を加え、 Ar気流下、室温にて撹拌した。トリフルォロ酢 酸 1滴を加え、さらに室温にて 90分攪拌した。多量の水を加えて反応を終了させ、有 機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で 1回、水で 1回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄 した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、得られた粗生成物をカラムクロマト グラフィー（アルミナ，クロ口ホルム:酢酸ェチル =3： 1)により分離精製し、紫色固体 6 (57.5 mg)を得た。
[0073] [化 19]
Figure imgf000021_0002
蛍光性化合物丄
[0074] 6 (57.5 mg, 0.201 mmol, 1 eq.)をトルエン（10 ml)に溶解し、トリェチルァミン（0.3 m 1, 2.08 mmol, 10 eq.),三フッ化ホウ素ジェチルエーテル錯体（0.40 mL, 3.11 mmol, 15 eq.)を加え、 1時間加熱還流した。放冷後、不溶物をシリカゲルクロマトグラフィー にて分離し、溶出液を減圧濃縮した。得られた組成生物をカラムクロマトグラフィー（ シリカ，トルエン）により分離精製し、 光沢のある緑色固体の形態にある蛍光性化合 物 1 (5.8 mg, 8.46%, 2工程）を得た。
[0075] TLC (silica) R = 0.6 (toluene)
f
JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) σ 2.59 (s, 6H), 6.89 (s, 2H), 6.95 (s, 2H), 7.24 (s, 1H)
3
実施例 2
[0076] 蛍光性化合物 の合成
下記の反応スキームに従い、本発明の蛍光性ィ匕合物 を合成した。なお、反応スキ ーム中（後述の反応スキームにおいても同じ）、「DDQ」は 2,3-ジシァノ- 5,6-ジクロロ- p-ベンゾキノン (酸化剤の一種)を意味する。
[0077] [化 20]
Figure imgf000022_0001
[0079] Ar気流下、 0°Cにて 5-メチル -2-フルアルデヒド 7 (1.80 g, 16.3 mmol, 1 eq)とアジド 酢酸ェチル (2.80 g, 32.7 mmol, 2 eq)のエタノール溶液（90 ml)に、ナトリウムェトキ シド 20%エタノール溶液 (11.1 ml, 32.7 mmol, 2 eq)をエタノール (30 ml)で希釈した 溶液をゆっくり滴下した。 2時間撹拌後、飽和塩ィ匕アンモ-ゥム水溶液を加え pHを中 性にし、酢酸ェチルをカ卩え、水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナ トリウムで乾燥後、減圧濃縮し、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ ゲル，へキサン：酢酸ェチル = 9 : 1)により分離精製し、薄黄色液体 8 (1.26 g, 34.8 %)を得た。
TLC (シリカ)： R = 0.42 (シリカゲル，へキサン：酢酸ェチル = 9 : 1)
f
[0080] [化 22]
Figure imgf000023_0001
8 9
[0081] 8 (1.257 g, 5.68 mmol)のトルエン溶液 (30 ml)を 1時間還流撹拌した。減圧濃縮後 、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1 )により分離精製し、薄肌色固体 9 (979 mg, 89.3 %)を得た。
TLC (シリカ)： Rf = 0.13 (へキサン：酢酸ェチル = 9 : 1)
[0082] [化 23]
Figure imgf000023_0002
9 10
[0083] 9 (287 mg, 1.49 mmol, 1 eq)のエタノール溶液（10 ml)に水酸化ナトリウム（868 mg , 21.7 mmol, 15 eq)の水溶液 (5 ml)を加え、 1時間還流撹拌した。放冷後、 6N塩酸 水溶液を加えた。発生した沈殿をろ過後、ろ物を水で洗浄、真空乾燥し、灰色固体 1 0 (205 mg, 83.7%)を得た。
TLC (シリカ)： Rf = 0.14 (へキサン：酢酸ェチル = 1 : 1)
'H-NMRCCDCI ): δ = 2.37 (s, 3H), 6.14 (s, 1H), 6.63 (s, 1H)
[0084] [化 24]
Figure imgf000023_0003
[0085] 10 (200 mg, 1.21 mmol, 1 eq)のエチレングリコール溶液（5 ml)に水酸化ナトリウム
(484 mg, 12.1 mmol, 10 eq)を加え、 Ar気流下、 140°Cで 3時間撹拌した。放冷後、 酢酸ェチルを加え、水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウム で乾燥後、減圧濃縮し、得られた茶色オイル状の粗生成物をカラムクロマトグラフィー (シリカ， 9:1 hexane/ethylacetate)により分離精製し、茶色液体 11 (68.0 mg, 45.5 %) を得た。 TLC (シリカ)： R = 0.62 (へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)
f
1H-NMR(CDC1 ): δ = 2.39 (s, 3H), 6.07 (s, 1H), 6.12 (d, 1H, J = 2.9 Hz), 6.67 (t
3
1H, J = 2.9 Hz), 7.65 (bs, 1H)
[0086] [化 25]
Figure imgf000024_0001
[0087] 11 (60 mg, 0.5 mmol, 2 eq)の塩化メチレン溶液 (25 ml)に 4- (1-ブチルペンチロキ シ)- 2,6-ジメチルベンズアルデヒド（69 mg, 0.25 mmol, 1 eq)を加え、減圧脱気し、完 全に Ar置換した。トリフルォロ酢酸 3滴をカ卩え、室温で 24時間撹拌後、 P-クロラニル (6 2 mg, 0.25 mmol, 1 eq)を加えた。室温で 1時間撹拌後、減圧濃縮し、カラムクロマト グラフィー（アルミナ、クロ口ホルム)で不溶物を分離し、ろ液を濃縮して紫色固体 12を 得た。 12は精製せずそのまま次の反応に用いた。
[0088] [化 26]
Figure imgf000024_0002
蛍光性化合物
[0089] 12をトルエン（10 ml)、トリェチルァミン（0.2 ml)、三フッ化ホウ素ジェチルエーテル 錯体 (0.3 ml)を加えた。室温で 1時間撹拌後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え て洗浄し、トルエンで 3回抽出、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾 燥後、減圧濃縮し得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，へキサン：酢 酸ェチル = 4 : 1)により分離精製し、蛍光性化合物 2 (22.0 mg, 18.2 %、 11からの総 収率）を得た。
TLC (シリカ)： R = 0.50 (4:1 hexane/ethylacetate)
f
'H-NMRCCDCl ): δ = 0.85-0.96 (m, 6Η), 1.22-1.29 (m, 8H), 1.42—1.68 (m, 4H), 2
3
.15 (s, 6H), 2.44 (s, 6H), 4.25 (m, 1H), 5.97 (s, 2H), 6.34 (s, 2H), 6.63 (s, 2H) 実施例 3
[0090] 蛍光性化合物 2の合成
下記の反応スキームに従 ヽ、本発明の蛍光性化合物 2を合成した。
[0091] [化 27]
Figure imgf000025_0001
¾光性化合物
[0092] [化 28]
Figure imgf000026_0001
[0093] 5は実施例 2と同様にして合成した。 5 (150 mg, 1.09 mmol, 2 eq.)の塩化メチレン 溶液（50 ml)に 4- (1-ブチルペンチ口キシ) -2, 6-ジメチルベンズアルデヒド（151 mg, 0 .547 mmol, 1 eq.)を加え、減圧脱気し、完全に Ar置換した。トリフルォロ酢酸 1滴をカロ え、室温で 24時間撹拌後、 2,3-ジクロロ- 5,6-ジシァノベンゾキノン（151 mg, 0.547 m mol, 1 eq.)を加えた。室温で 30分撹拌後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 で 4回、飽和食塩水で 1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得ら れた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アルミナ， 9： 1へキサン：酢酸ェチル）に より分離精製し、赤色固体 13 (82.0 mg, 28.3%)を得た。
TLC (silica) R = 0.8 m— hexane： ethyl acetate = 90： 10)
f
[0094] [化 29]
Figure imgf000026_0002
蛍光性化合物
13 (82.0 mg)をトルエン（10 ml)溶液に溶かし、トリエチルァミン (0.2 ml)、三フッ化 ホウ素エーテル錯体 (0.3 ml)を加えた。室温で 1時間撹拌後、飽和炭酸水素ナトリウ ム水溶液を加えて洗浄し、トルエンで 3回抽出、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫 酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリ 力，へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)により分離精製し、 Compound 3 (22.0 mg, 18.2 % )を得た。
[0096] 1H-NMR (300 MHz, CDCl ) σ 0.94 (t, 6H, J = 7.1 Hz), 1.35—1.45 (m, 8H), 1.65—1.
3
72 (m, 4H), 2.15 (s, 6H), 2.58 (s, 6H), 4.25 (quant, 1H, J = 5.9 Hz), 6.57 (s, 2H), 6. 64 (s, 2H), 6.93 (s, 2H)
実施例 4
[0097] 蛍光性化合物 4の合成
下記の反応スキームに従 ヽ、本発明の蛍光性化合物 4を合成した。
[0098] [化 30]
Figure imgf000027_0001
s光性化合物 A
[0099] [化 31]
Figure imgf000027_0002
[0100] Ar気流下、 0°Cにてチォフェン- 3-カルバルデヒド 14 (550 mg, 4.90 mmol, 1.0 eq.) とアジド酢酸ェチル（1.40 g, 10.8 mmol, 2.2 eq.)のエタノール溶液（30 ml)に、ナトリ ゥムエトキシド 20%エタノール溶液 (3.33 g, 9.81 mmol, 2.0 eq.)をエタノール (20 ml) で希釈した溶液をゆっくり滴下した。 6時間撹拌後、飽和塩ィ匕アンモ-ゥム水溶液を カロえ pHを中性にし、酢酸ェチルをカ卩え、水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、薄黄色液体 15を得た。 15は精製せず、次 の反応に用いた。
TLC (シリカ)： R = 0.8 (シリカゲル，へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)
f
[0101] [化 32]
Figure imgf000028_0001
15 16
[0102] 15のトルエン溶液 (20 ml)を 30時間還流撹拌した。減圧濃縮後、得られた粗生成 物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，へキサン:酢酸ェチル = 3 : 1)により分離精製し 、薄肌色固体 16 (295 mg, 30.8%)を得た。
TLC (シリカ)： Rf = 0.5 (へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)
[0103] [化 33]
Figure imgf000028_0002
16 17
[0104] 16 (226 mg, 1.16 mmol, 1 eq.)のエタノール溶液（10 ml)に水酸化ナトリウム（740 mg, 18.5 mmol, 15.9 eq.)の水溶液（5 ml)を加え、 1時間還流撹拌した。放冷後、 6N 塩酸水溶液を加えた。反応系に酢酸ェチルを加え、水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1 回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、灰色固体 17 (190 mg, 97.7% )を得た。
TLC (シリカ)： Rf = 0.4 (へキサン：酢酸ェチル = 1 : 1)
[0105] [化 34]
Figure imgf000028_0003
17 [0106] 17 (190 mg, 1.14 mmol, 1 eq.)のエチレングリコール溶液（5 ml)に水酸化ナトリウ ム（340 mg, 8.49 mmol, 7.4 eq.)を加え、 Ar気流下、 140°Cで 2時間撹拌した。放冷後 、酢酸ェチルをカ卩え、水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウム で乾燥後、減圧濃縮し、得られた茶色オイル状の粗生成物をカラムクロマトグラフィー (シリカ， 9:1 hexane/ethylacetate)により分離精製し、茶色液体 18 (99.3 mg, 70.9 %) を得た。
TLC (シリカ)： Rf = 0.62 (へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)
[0107] [化 35]
Figure imgf000029_0001
19
[0108] 18 (93.0 mg, 0.755 mmol, 2 eq.)の塩化メチレン溶液 (50 ml)に 4- (1-ブチルペンチ 口キシ) -2, 6-ジメチルベンズアルデヒド（102 mg, 0.377 mmol, 1 eq.) を加え、減圧脱 気し、完全に Ar置換した。トリフルォロ酢酸 1滴を加え、室温で 24時間撹拌後、 P-クロ ラ-ル（120 mg, 0.488 mmol, 1.3 eq.)を加えた。室温で 30分撹拌後、有機層を飽和 炭酸水素ナトリウム水溶液で 4回、飽和食塩水で 1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾 燥後、減圧濃縮した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アルミナ，クロ口 ホルム）により分離精製し、赤色固体 19 (68.4 mg, 36.0%)を得た。
[0109] [化 36]
Figure imgf000030_0001
蛍光性化合物 Λ
[0110] 19 (38.4 mg, 0.0764 mmol, 1 eq.)をトルエン（5 ml)溶液に溶かし、トリェチルァミン
(0.20 mL, 1.38 mmol, 18 eq.),三フッ化ホウ素ジェチルエーテル錯体（0.30 mL, 2.3 0 mmol, 30 eq.)を加えた。室温で 1時間撹拌後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液をカロ えて洗浄し、トルエンで 3回抽出、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで 乾燥後、減圧濃縮し得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，へキサン： 酢酸ェチル = 4 : 1)およびゲル浸透クロマトグラフィー（クロ口ホルム）により分離精製 し、蛍光性ィ匕合物 4(7.4 mg, 17.7 %)を得た。
[0111] Tし C (silica) R = 0.6 (toluene)
f
JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) σ 0.94 (t, 6H, J = 7.1 Hz), 1.34—1.44 (m, 8H), 1.65—1.
3
72 (m, 4H), 2.16 (s, 6H), 2.58 (s, 6H), 4.27 (quant, 1H, J = 5.9 Hz), 6.65 (s, 2H), 6. 66 (s, 2H), 6.77 (d, 2H, J = 5.3 Hz), 6.97 (d, 2H, J = 5.3 Hz)
実施例 5
[0112] 蛍光性化合物 の合成
下記の反応スキームに従 ヽ、本発明の蛍光性化合物 を合成した。
[0113] [化 37]
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000031_0002
Figure imgf000031_0003
Figure imgf000031_0004
Figure imgf000031_0005
21
2-フランボロン酸 20 (6.00 g, 53.5 mmol, 1 eq)の 5:1トルエン/メタノール溶液（320 ml)に p-ブロモア-ソール（10.0 g, 53.5 mmol, 1 eq)および 2M炭酸ナトリウム水溶 液（53 ml)を加え、減圧脱気し、完全に Ar置換した。テトラキス (トリフエ-ルホスフィン )パラジウム (0) (619 mg, 0.535 mmol, 0.01 eq)を加え、 80°Cで 3時間撹拌した。放冷 後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液をカ卩えて洗浄し、酢酸ェチルで 3回抽出、飽和食 塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し得られた粗生成物を カラムクロマトグラフィー（シリカ， 2:1へキサン:塩化メチレン）により分離精製し、橙色 固体 21 (4.42 g, 78.2 %)を得た。
[0116] TLC (シリカ)： R = 0.66 (4:1 hexane/ethvlacetate)
f
'H-NMRCCDCl ): δ = 3.84 (s, 3Η), 6.45 (t, IH, J = 1.6 Hz ), 6.51 (d, IH, J = 3.4
3
Hz), 6.92 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.43 (d, IH, J = 1.2 Hz), 7.60 (d, IH, J = 8.8 Hz)
[0117] [化 39]
Figure imgf000032_0001
21 9?
[0118] 21 (700 mg, 4.0 mmol, 1 eq)の 1,2-ジクロロェタン溶液（20 ml)に塩化ホスホリス（0 .72 ml, 8.0 mmol, 2 eq)を加え、室温で 5分間撹拌した。 Ν,Ν-ジメチルホルムアミド（0 .62 ml, 8.0 mmol, 2 eq)を加え、 80°Cで 30分間撹拌した。放冷後、 0°Cで 5N水酸化 ナトリウム水溶液を滴下した。水を加え、塩化メチレンで 5回抽出し、飽和食塩水で 1 回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し得られた粗生成物をカラムク 口マトグラフィー（シリカ， 4:1 hexane/ethylacetate)により分離精製し、橙色液体 22 (6 67.3 mg, 82.9 %)を得た。
[0119] TLC (シリカ)： R = 0.40 (4:1 hexane/ethylacetate) NMR(CDC1 ): δ = 3.87 (s, 3Η f 3
), 6.72 (d, IH, J = 3.9 Hz), 6.97 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.31 (d, IH, J = 3.7 Hz), 7.77 ( d, 2H, J = 9.0 Hz), 9.60 (s, IH)
[0120] [化 40]
Figure imgf000032_0002
[0121] Ar気流下、 0°Cで、 22 (202 mg, 1.0 mmol, 1 eq)とアジド酢酸ェチル (516 mg, 4.0 mmol, 4 eq)のエタノール溶液（10 ml)に、ナトリウムエトキシド 20%エタノール溶液（1. 4 ml, 4 mmol, 4 eq)をエタノール (2 ml)で希釈した溶液をゆっくり滴下した。 2時間撹 拌後、飽和塩ィ匕アンモ-ゥム水溶液をカ卩ぇ pHを中性にし、酢酸ェチルを加え、水で 2 回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、得 られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ， 9: 1 hexane/ethylacetate)により分 離精製し、橙色固体 23 (273 mg, 87.5 %)を得た。
[0122] Tし C (シリカ): R = 0.39 (9:1 hexane/ethylacetate) NMR(CDC1 ): δ = 1.39 (t, 3Η
f 3
, J = 7.1 Hz), 3.87 (s, 3H), 4.35 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 6.67 (d, IH, J = 3.7 Hz), 6.92 ( s, IH), 6.93 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.18 (d, IH, J = 3.4 Hz), 7.65 (d, 2H, J = 8.3 Hz) [0123] [化 41]
Figure imgf000033_0001
[0124] 23 (273 mg, 0.875 mmol)のトルエン溶液（5 ml)を 5時間還流撹拌した。減圧濃縮 後、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ， chloroform)により分離精製 し、茶色固体 24 (117 mg, 46.9 %)を得た。
[0125] Tし C (シリカ): R = 0.35 (4:1 hexane/ethylacetate) NMR(CDC1 ): δ = 1.38 (t, 3Η
f 3
, J = 7.2 Hz), 3.84 (s, 3H), 4.35 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 6.57 (s, IH), 6.80 (s, IH), 6.94 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.66 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 8.78 (bs, IH)
[0126] [化 42]
Figure imgf000033_0002
[0127] 24 (71.0 mg, 0.25 mmol, 1 eq)のエタノール溶液（10 ml)に水酸化ナトリウム（150 mg, 3.75 mmol, 15 eq)の水溶液 (5 ml)を加え、 1時間還流撹拌した。放冷後、 6N塩 酸水溶液をカ卩えた。酢酸ェチルをカ卩ぇ水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無 水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮、真空乾燥し、緑色固体 25 (60.0 mg, 93.0%)を 得た。
TLC (シリカ)： R = 0.38 (ethvlacetate)
f
[0128] [化 43]
Figure imgf000034_0001
[0129] 25 (140 mg, 0.55 mmol, 1 eq)のエチレングリコール溶液（4 ml)に水酸化ナトリウム
(200 mg, 5 mmol, 9 eq)を加え、 Ar気流下、 160°Cで 2時間撹拌した。放冷後、酢酸 ェチルをカ卩え、水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾 燥後、減圧濃縮し、茶色液体 26 (138 mg)を得た。 26は精製せずにそのまま次の反 応に用いた。
TLC (シリカ)： R = 0.23 (4:1 hexane/ethylacetate)
f
[0130] [化 44]
Figure imgf000034_0002
[0131] 26 (67.0 mg, 0.31 mmol, 2 eq)の 1,2-ジクロロェタン溶液（30 ml)に 4- (1-ブチルぺ ンチロキシ) -2,6-ジメチルベンズアルデヒド (42 mg, 0.15 mmol, 1 eq)を加え、減圧脱 気し、完全に Ar置換した。トリフルォロ酢酸 1滴を加え、 2時間加熱還流した。放冷後、 溶媒を減圧濃縮し、青緑色の固体 27を得た。 27は分離精製せず、次の反応に用い た。
[0132] [化 45]
Figure imgf000034_0003
[0133] 27をトルエン（5 ml)溶液に溶かし、トリエチルァミン (0.20 mL)、三フッ化ホウ素ジェ チルエーテル錯体 (0.30 mL)を加えた。室温で 30分間撹拌後、飽和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液を加えて洗浄し、クロ口ホルムで 3回抽出、飽和食塩水で 1回洗浄した。無 水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー (シリカ， chloroform)により分離精製し、蛍光性化合物 (0.9 mg, 0.5 %, 2工程）を得 た。
[0134] TLC (シリカ)： R = 0.23 (1:1 toluene/chloroform) NMR(CDC1 ): δ = 0.85—0.97 ( f 3
m, 6H), 1.25-1.42 (m, 8H), 1.57—1.68 (m, 4H), 2.19 (s, 6H), 3.87 (s, 6H), 4.28 (m, 1H), 6.04 (s, 2H), 6.66 (s, 2H), 6.85 (s, 2H), 6.97 (d, 4H, J = 9.0 Hz), 7.75 (d, 4H, J = 9.0 Hz)
実施例 6
[0135] 光学特性
実施例 2、 3及び 5で合成した本発明の蛍光性ィ匕合物 2、 及び の吸収スペクトル 及び蛍光発光スペクトルを測定した。吸収スペクトルは、市販の分光光度計 (U-2001 、 日立製作所)を用い、測定波長 300〜750nm、測定波長間隔 lnmで測定した。蛍光 発光スペクトルは、市販の蛍光光度計 (F-4500、 日立製作所)を用い、最大吸収波長 の励起光を用いて以下の条件で測定した。
[0136] ·測定波長：蛍光性化合物 及び ; 550-700 nm
蛍光性化合物 ； 600-750 nm
ペリレン； 520-700 nm
•測定波長間隔: 0.2 nm
'スキャンスピード： 60 nm/min
'レスポンス： AUTO
•スリット幅：励起側 2.5 nm
受光側 2.5 nm
•フォトマルチプライヤー： 700 V
[0137] 測定されたスペクトルから、モル吸光係数 ε (M^cm"1),蛍光量子収率 Φ、半値幅 1 hm(full width at half maximum heightXnm)を算出しに。結果を下己表 1に す。 [0138] [表 1]
Figure imgf000036_0001
[0139] 蛍光量子収率 Φは、 Ν,Ν'-ビス（1-へキシルヘプチル) -3,4:9,10-ペリレンビス（ジカ ルボキシイミド）（Φ= 1.00、 CH C1中)をレファレンスとし、 A = A = 0.1、 Φ = 1.00、
2 2 ref ref n = 1.46 (CH CI )、 n = 1.484 (CHCl )、 1.407 (THF)ゝ 1.3284 (MeOH)を代入し、 Fに ref 2 2 3
は A = 0.1の波長で励起し検出された蛍光強度面積の積算値を代入して求めた。な お、蛍光量子収率 Φは、次の式で算出される。
Φ = Φ X (A X FX n2)/(A X F X n 2)
ref ref ref ref
(ただし、 Aは吸光度、 Fは蛍光スペクトルの波数積分値、 nは溶媒の屈折率を示し、 re fは参照色素（リファレンス）を示す)。
[0140] 蛍光性化合物 2、 _2の光学特性について
蛍光性化合物 2、 2の極大吸収波長は 581 nm, 586 nmとであり、ボロンジピロメテン (R = R = R = R = Me)に比べ約 80 nmほど長波長シフトした。分子設計どおり、縮
1 3 5 7
合環の導入による π共役系の拡張によりボロンジピロメテンの蛍光が長波長化した。 蛍光性化合物 、 は蛍光極大波長 588 nmと 596 nmに強く鋭い蛍光を発し、シヤー プなスペクトル形状をしている。表 1の数値を見ると、半値幅 I hmは約 20 nmと小さく、 スペクトルがきわめてシャープであることがわかる。これらの結果から，蛍光性化合物 2, 3はボロンジピロメテン骨格と同等の骨格の堅さを有したまま、長波長シフトしてい ることがわ力る。蛍光性化合物 2は高極性の MeOH中においても、低極性の THF中に ぉ 、ても高 、蛍光量子収率を示した。これは蛍光性ィ匕合物 2がボロンジピロメテン本 来のきわめて低 、環境応答性を有して 、ることを表す。さらに極性の高 、水系溶媒 においても同様の蛍光を発すると考えられ、バイオ計測への応用のために必要不可 欠な特性を有して 、ると 、える。
[0141] 蛍光性ィ匕合物 の光学特性について
蛍光性化合物 の極大吸収波長は 673 nmとボロンジピロメテン (R^R^R^R^Me)に 比べ約 170 nmほど、蛍光性化合物 に比べて約 90 nmほど長波長シフトした。分子設 計どおり、縮合環の導入と電子供与性置換基の導入によりボロンジピロメテン骨格に 比べて長波長化し、近赤外領域に極大吸収波長を持たせることに成功した。また、 蛍光性化合物 は蛍光極大波長 685 nmに強く鋭い蛍光を発し、シャープなスぺタト ル形状をしている。表 1の数値を見ると、半値幅 I hmは約 30 nmと小さく、スペクトルが きわめてシャープであることがわかる。これらの結果から、蛍光性ィ匕合物 は P-メトキ シフエ二ル基を導入したにもかかわらず、蛍光性ィ匕合物 2と同等の骨格の堅さを有し ていることがわ力る。 蛍光性化合物 は高極性の MeOH中においても、低極性の TH F中にぉ 、ても高 、蛍光量子収率を示した。これは蛍光性ィ匕合物 がボロンジピロメ テン本来のきわめて低 、環境応答性を有して 、ることを表す。さらに極性の高 、水系 溶媒にお!、ても同様の蛍光を発すると考えられ、近赤外光を用いたバイオ計測への 応用のために必要不可欠な特性を有して 、ると 、える。
[0142] 以上のことより、蛍光性化合物 ま近赤外領域に極大吸収を持ち、その波長域にお V、ても強く鋭 、蛍光を発することがわ力つた。蛍光性ィ匕合物≤の光学特性は既存の 近赤外蛍光色素の中でも最も優れたものの中の一つであると 、える。
[0143] 比較例 1
広く用いられている市販の蛍光色素である Cy5 (商品名、 1-[3-(4-モノメトキシトリチ 口キシ)プロピル] -1'-[3-[(2-シァノエチル) - (Ν,Ν-ジイソプロピル)フォスフォロアミジチ ル]プロピル] -3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシァニンク口リド)について、実施例 6と同様に光学特性を調べた。結果を下記表 2に示す。なお、表 2には、対比のため 、実施例 5で合成した本発明の蛍光性化合物 の光学特性も併せて示す。
[0144] [表 2] 蛍光性化 'し abs flu ΐ 半値幅 合物 溶媒 [nm] [nm] [M— — Φ [nm]
Me OH 664 679 200 , 000 0. 6 3 29
Cy5 Me OH 648 670 2 50, 000 0. 2 7a 29 a:Amersham Biosciences社から得た PBS中の値
[0145] 表 2に示すように、同程度の吸収'蛍光極大波長を持つ市販の近赤外蛍光色素 Cy 5 (商品名）と比べると、本発明の蛍光性ィ匕合物 はモル吸光係数ではほぼ同等の値 を示し、蛍光量子収率でははるかに高い値を示した。したがって、蛍光性化合物≤は 既存の近赤外蛍光色素に代わってより高感度なバイオ計測のために汎用的に利用 される可能性を持つことが示された。
[0146] 比較例 2〜4
特許文献 1に記載されて ヽる化合物（比較化合物 1)、特許文献 2に記載されて ヽる 化合物 (比較ィ匕合物 2)、及び上記一般式 [I]において、 R1と R2、 R6と R7がそれぞれ芳香 環を形成するが、芳香環中にヘテロ原子を含まない化合物 (比較ィ匕合物 3)を合成し 、実施例 6と同様にして光学特性を測定した。比較化合物 1〜3の構造を以下に示す
[0147] [化 46]
Figure imgf000038_0001
比較化合物 1
[0148] [化 47]
Figure imgf000039_0001
比較化合物 2
[0149] [化 48]
Figure imgf000039_0002
比較化合物 3
[0150] 結果を下記表 3に示す。なお、表 3には、対比のため、実施例 5で合成した本発明 の蛍光性化合物 の光学特性も併せて示す。
[0151] [表 3]
Figure imgf000039_0003
a:フルォレツセイン (Φ =0.92, 0.1M NaOH中）をレファレンスとして用いた。
b:ナイルブルー（Φ =0.25, MeOH中）をレファレンスとして用いた。
c:測定せず
[0152] 表 3に示されるように、本発明の蛍光性化合物は、比較例 2〜4の化合物と比較して モル吸光係数が顕著に高ぐまた、蛍光量子収率も高かった。
実施例 7 [0153] 本発明の蛍光性ィ匕合物旦の合成
下記の反応スキームに従い、本発明の蛍光性ィ匕合物 を合成した
[0154] [化 49]
Figure imgf000040_0001
48.6 %
CH(OEt)3
Figure imgf000040_0002
3.5 % (3 step)) 蛍光性化合物
[0155] ル)-フラン- 2-カルボアルデヒド (2)の合成
[0156]
Figure imgf000040_0003
80°C， 14h
(1 ) (2)
[0157] Ar気流下， 500mL三口フラスコに 4-メトキシフエ-ルボロン酸（1) (2.99 g , 19.7 mmo 1 , 1.0 eq)を入れ，トルエン (120 ml)に溶解し、 [1,1 '-ビス（ジフエ-ルホスフイノ)-フエ 口セン]パラジウム（II)ジクロリド ジクロロメタン複合体 (1：1)(100 mg)、エタノール (30 ml)、 5-ブロモ -2-フラルデヒド（3.46 g, 19.8 mmol, 1.0 eq)および 2M炭酸ナトリウム水 溶液 (20 ml)を加え、 80°Cで 14時間撹拌した。
[0158] 反応終了後、有機相を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥 後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた粗生成物をフラッシュシリカゲ ルクロマトグラフィー（溶離液；へキサン/酢酸ェチル = 19/1→4/1)で分離精製し、 目的化合物（2) (3.39 g, 84.8 %)を薄黄色液体として得た。
[0159] TLC (シリカ)： R = 0.31 (溶離液；へキサン/酢酸ェチル = 4/1)
f
'H-NMRCCDCl ): δ = 3.86 (s, 3H), 6.72 (d, 1H, J = 3.6 Hz ), 6.96 (d, 2H, J = 9.0
3
Hz), 7.30 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.77 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 9.60 (s, 1H)
[0160] 2-アジド -3-[5-(4-メトキシフエ-ル)-フラン- 2-ィル] -アクリル酸ェチルエステル (3)の 合成
[0161] [化 51]
Figure imgf000041_0001
(2) (3)
[0162] lOOOmL三口フラスコに Ar気流下， 5-(4-メトキシフエ-ル)-フラン- 2-カルボアルデヒ ド (2X3.39 g, 16.8 mmol, 1.0 eq)とアジド酢酸ェチル (8.65 g, 67.0 mmol, 4.0 eq)を エタノール (300 ml)に溶解し、次いで 20%ナトリウムエトキシドエタノール溶液（22.8 g, 67.0 mmol, 4.0 eq)を 0°C氷浴中でゆっくり滴下し， 2時間撹拌した。
[0163] 反応終了後、飽和塩ィ匕アンモ-ゥム水溶液をカロえ pHを弱酸性にし、水をカ卩えて吸 引ろ過を行い、得られたろ物を乾燥し、黄色固体 (3) (3.31 g)を得た。得られた化合物 (3)は精製せずにそのまま次の反応に用いた。
[0164] TLC (シリカ)： R = 0.38 (溶離液；へキサン/酢酸ェチル = 9/1)
f
[0165] 2-(4-メトキシフヱ-ル) -4H-フロ [3,2-b]ピロール- 5-カルボン酸ェチルエステル (4)の 合成
[0166] [化 52]
Figure imgf000042_0001
(3) (4)
[0167] 200mLナスフラスコに化合物 (3) (3.31 g,10.6 mmol.l eq)を入れ、トルエン（60 ml)に 溶解し、 1.5時間還流撹拌した。
[0168] 減圧濃縮後、得られた粗生成物を再結晶 (溶液；へキサン，酢酸ェチル)を行った 後に吸引ろ過し、得られたろ物を乾燥し、目的化合物 (4X2.32 g, 48.6% (2工程)）を茶 色結晶として得た。
[0169] TLC (シリカ)： R = 0.32 (溶離液；クロ口ホルム）
f
^-NMRCCDCl ): δ = 1.38 (t, 3H), 3.85 (s, 3H), 4.35 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 6.58 (s,
3
IH), 6.80 (s, IH), 6.94 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 7.67(d, 2H, J = 9.0 Hz), 8.72(s, IH)
[0170] 2- (4-メトキシフヱ-ル)- 4H-フロ [3,2- b]ピロール- 5-カルボン酸 (5)の合成
[0171] [化 53]
Figure imgf000042_0002
(4) (5)
[0172] 300mLフラスコに 2- (4-メトキシフエ-ル)- 4H-フロ [3,2- b]ピロール- 5-カルボン酸ェ チルエステル (4) (1.90 g, 6.66 mmol, 1 eq)を入れ、エタノール（60 ml)に溶解し、 sod ium hydroxide (3.90 g, 97.5 mmol, 14.6 eq)エタノール溶液（30 ml)を加え、 1時間還 流撹拌した。
[0173] 放冷後、 6N HC1水溶液を加え、溶液を酸性にし、水を加えて吸引ろ過を行い、得ら れたろ物を真空乾燥し、目的化合物（5) ( 1.56 g, 91.0 %)を薄緑灰色固体として得た
[0174] TLC (シリカ)： R = 0.40 (溶離液；酢酸ェチル）
f
'H-NMRCCDCl ): δ = 3.86 (s, 3H), 6.60 (s, IH ), 6.83 (s, IH ), 6.95(d, 2H, J = 9.0
3
Hz) ,7.28 (s , IH) , 7.68 (d, 2H, J = 9.0 Hz)
[0175] [化 54]
Figure imgf000043_0001
[0176] 30mL二口フラスコに 2-(4-メトキシフエ-ル) -4H-フロ [3,2-b]ピロール- 5-カルボン 酸 (5) (101 mg, 0.391 mmol, 2 eq) 、 TFA (1 ml)、 1,2—ジクロロェタン (2 ml)を人れ、 Ar 気流下、 30 °Cで 30分間撹拌した。次いで、 1,2-ジクロロエタン (6 ml)を加え、窒素で パブリングを行った後、オルトギ酸トリェチル (49.8 mg, 0.336 mmol, 1.7 eq) を加え、 室温で 1時間撹拌した。
[0177] 反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機相を洗浄した。有機相を 飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、得られた粗生成物をアルミナク 口マトグラフィー（溶離液；クロ口ホルム)でおおまかに分離し、黒色固体（6) (46.4 mg )を得た。化合物 (6)は精製せずにそのまま次の反応に用いた。
[0178] TLC (アルミナ)： R = 0.82 (溶離液；クロ口ホルム/酢酸ェチル = 10/1)
f
[0179] 蛍光性化合物 の合成
[0180] [化 55]
Figure imgf000043_0002
蛍光性化合物
[0181] 化合物（6) (19.9 mg)が入った lOOmLフラスコに、 1,2-ジクロロエタン (15 ml)、三フッ 化ホウ素ジェチルエーチル錯体 (0.1ml)、 TEA (0.8ml)をカ卩え、 60°Cで 40分間撹拌し た。
[0182] 反応終了後、酢酸ェチルと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機相を抽出、 洗浄した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、得られた粗 生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液；クロ口ホルム)でおおまかに分離し、 緑色固体を得た.これをメタノールおよびアセトンで洗浄し、得られた固体を真空乾 燥し、蛍光性ィ匕合物 (3.5 mg, 8.5%, 3工程）を緑色結晶として得た。
[0183] TLC (シリカ)： R = 0.24 (溶離液；クロ口ホルム） 実施例 8
[0184] 本発明の蛍光性化合物 Zの合成
下記の反応スキームに従い、本発明の蛍光性化合物 Zを合成した
[0185] [化 56]
Figure imgf000044_0001
82 %
1 ) N3CH2COOEt
Figure imgf000044_0002
60°C , 5min 0.2 % (3 step)
蛍光性化合物 2
[0186] 5-(2，5-ジメトキシフヱニル) -フラン- 2-カルボアルデヒド (9)の合成
[0187] [化 57]
Figure imgf000044_0003
S0°C， 3h
(8)
(9)
[0188] Ar気流下、 500mL三口フラスコに 2,5-ジメトキシフエ二ルボロン酸（8) (3.64 g， 20.0 mmol, 1.0 eq)を入れ、トルエン (120 ml)に溶解し、 [1，1，-ビス（ジフエニルホスフイノ)- フエ口セン]パラジウム (II)ジクロリド ジクロロメタン複合体 (1:1) (110 mg)、エタノーノレ（ 30 ml)、 5-ブロモ -2-フロアルデヒド（3.50 g, 20.0 mmol, 1.0 eq)および 2M炭酸ナトリ ゥム水溶液 (20 ml)を加え、 80°Cで 3時間撹拌した。
[0189] 反応終了後、有機相を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥 後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマト グラフィー（溶離液；トルエン/酢酸ェチル = 20/1)で分離精製し、目的化合物（9) (3 .82 g, 82.2 %)を薄黄色液体として得た。
[0190] TLC (シリカ)： R = 0.23 (溶離液；トルエン/酢酸ェチル = 20/1)
f
'H-NMRCCDCl ): δ = 3.85 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 6.93 (d, 2H, J = 1.7 Hz), 7.17(d, 1
3
H, J = 3.7 Hz) , 7.33 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 7.56 (t, 1H, J = 1.7 Hz), 9.65 (s, 1H)
[0191] 2-アジド -3-[5-(2, 5-ジメトキシフエ-ル)-フラン- 2-ィル] -アクリル酸ェチルエステル (1 0)の合成
[0192] [化 58]
Figure imgf000045_0001
(9) (10)
[0193] lOOOmL三口フラスコに Ar気流下、 5-(2,5-ジメトキシフエ-ル)-フラン -2-カルボア ルデヒド (9X3.82 g, 16.4 mmol, 1.0 eq)とアジド酢酸ェチル (8.50 g, 65.7 mmol, 4.0 e q)をエタノール (300 ml)に溶解し、次いで 20%ナトリウムエトキシドエタノール溶液（ 22 .8 g, 65.7 mmol, 4.0 eq)を 0°C氷浴中でゆっくり滴下し、 3時間撹拌した。
[0194] 反応終了後、飽和塩ィ匕アンモ-ゥム水溶液をカロえ pHを弱酸性にし、水をカ卩えて吸 引ろ過を行い、得られたろ物を乾燥し、黄色固体 (10X3.30 g)を得た。（10)は精製せず にそのまま次の反応に用 、た。
[0195] TLC (シリカ)： R = 0.61 (溶離液；へキサン/酢酸ェチル = 4/1)
f
[0196] 2-(2,5-ジメトキシフヱ-ル) -4H-フロ [3,2-b]ピロール- 5-カルボン酸ェチル (11)の合成 [0197] [化 59]
Figure imgf000045_0002
(10) (n) [0198] 200mLナスフラスコに化合物 (10) (3.30 g, 9.61mmol, 1 eq)を入れ、トルエン（60 ml) に溶解し、 1時間還流撹拌した。
[0199] 減圧濃縮後、得られた粗生成物を再結晶 (溶液；へキサン、酢酸ェチル)を行った 後に吸引ろ過し、得られたろ物を乾燥し、目的化合物 (11X2.70 g, 52.1%, 2工程）を 茶色結晶として得た。
[0200] TLC (シリカ)： R = 0.26 (溶離液；クロ口ホルム）
f
^-NMRCCDCl ): δ =1.39(t , 3H, J = 7.2 Hz) , 3.86 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 4.36(qua
3
nt. , 2H J = 7.2 Hz) , 6.80 - 6.84 (m, 2H), 6.90(d, 1H, J = 9.0 Hz) , 7.09 (s, 1H), 7. 52 (d, 1H, J = 3.3 Hz), 8.71(s, 1H)
[0201] 2-(2,5-ジメトキシフヱ-ル) -4H-フロ [3,2-b]ピロール- 5-カルボン酸 (12)の合成
[0202] [化 60]
Figure imgf000046_0001
(11) (12)
[0203] 500mLフラスコに 2-(2 ,5-ジメトキシフエ-ル) -4H-フロ [3 , 2-b]ピロール- 5-カルボン 酸ェチル (11) (2.67 g, 8.47 mmol, 1 eq)を入れ、エタノール（100 ml)に溶解し、水酸 化ナトリウム（5.08 g, 127mmol, 15 eq)水溶液 (50 ml)を加え、 1時間還流撹拌した。
[0204] 放冷後、 6N HC1水溶液を加え、溶液を酸性にして 30分間攪拌した後、水を加えて 吸引ろ過を行い、得られたろ物を真空乾燥し、目的化合物（12) ( 1.90 g, 78.1 %)を 緑灰色固体として得た。
[0205] TLC (シリカ)： R = 0.37 (溶離液；酢酸ェチル）
f
'H-NMR CDCl ): δ =3.86 (s， 3H)， 3.92 (s， 3H)， 6.84 (dd, 1H， J = 8.8 Hz, J = 2.9
3 1 2
Hz), 6.93— 6.89(m， 2H)， 7.11 (s， 1H)， 7.52 (d， 1H， J = 2.9 Hz), 8.88(s, 1H)
2
[0206] [化 61]
Figure imgf000046_0002
(12) (13) [0207] 30mL二口フラスコに 2-(2,5-ジメトキシフエ-ル) -4H-フロ [3,2-b]ピロール- 5-カルボ ン酸 (12) (97.0 mg, 0.338 mmol, 2 eq)、 TFA (1 ml)、 1,2—ジクロロェタン (2 ml)を人れ 、 Ar気流下、 40°Cで 35分間撹拌した。次いで、 オルソギ酸トリメチル (65.1 mg, 0.439 mmol, 2.6 eq) を加え、室温で 40分間撹拌した。
[0208] 反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機相を洗浄した。有機相を 飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、得られた粗生成物をアルミナク 口マトグラフィー（溶離液；へキサン/酢酸ェチル = 1/1)でおおまかに分離し、紫色 固体（13X20.0 mg)を得た。化合物（13)は精製せずにそのまま次の反応に用いた。
[0209] TLC (アルミナ)： R = 0.90 (溶離液；クロ口ホルム/酢酸ェチル = 10/1)
f
[0210] [化 62]
Figure imgf000047_0001
60°C . 5min
(13) 蛍光性化合物ェ
[0211] ィ匕合物 (13X20.0 mg)が入った 50mLフラスコに、 1,2-ジクロロエタン (15 ml)、三フッ化 ホウ素ジェチルエーテル複合体（約 0.1ml)、 TEA (約 0.8ml)をカ卩え、室温で 25分間攪 拌後、 60°Cで 5分間撹拌した。
[0212] 反応終了後、酢酸ェチルと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機相を抽出、 洗浄した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、得られた粗 生成物をシリカクロマトグラフィー（溶離液；クロ口ホルム)、ゲル浸透クロマトグラフィ 一 (溶離液；特級クロ口ホルム)および分取用薄層シリカゲルクロマトグラフィー（溶離 液；クロ口ホルム)で分離精製し、蛍光性化合物 Z(0.9 mg, 0.49 %(3 step))を緑色結 晶として得た。
[0213] TLC (シリカ)： R = 0.85 (溶離液；クロ口ホルム/酢酸ェチル = 10/1)
f
'H-NMRCCDCl ): δ =3.86 (s, 6H), 3.97 (s, 6H), 6.47 (s, 2H), 6.95 (d, 4H, J = 1.8
3
Hz) , 7.08 (s, 1H), 7.33(s, 2H), 7.51 (t, 2H, J = 1.8 Hz)
実施例 9
[0214] 本発明の蛍光性ィ匕合物 Sの合成 下記の反応スキームに従い、本発明の蛍光性化合物 Sを合成した
[0215] [化 63]
Figure imgf000048_0001
80°C， 14h
S4.S %
1 ) N3CH2COOEt
20% EtONa
EtOH, 0°C, 2h
2) toluene
reflux, 1.5 h
Figure imgf000048_0002
48.6 %
Figure imgf000048_0003
蛍光性化合物 _a
[0216] 30mL三口フラスコに 2- (4-メトキシフエ二ル)- 4H-フロ [3,2- b]ピロール- 5-カルボン 酸（5) (98.5 mg, 0.38 mmol, 2 eq)、 TFA (5 ml)を入れ、 Ar気流下、 50 °Cで 15分間撹 拌後、放冷し、氷浴中で 0°Cに冷やした。次いで、亜硝酸ナトリウム (14.2 mg, 0.206 m mol, 1.1 eq)を加え、 0 °Cで 10分間撹拌後、 TFAA(2 ml)をカ卩えて室温で 10分攪拌し、 ついで 60°Cで 1時間攪拌した。
[0217] 反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および氷をカ卩え、溶液を中和し、酢酸 ェチルをカ卩え、有機相を抽出した。有機相を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫 酸ナトリウムで乾燥後、得られた粗生成物をアルミナクロマトグラフィー（溶離液；クロ 口ホルム)でおおまかに分離し、青緑色固体（15X11.5 mg)を得た。化合物 (15)は精製 せずにそのまま次の反応に用いた。
[0218] TLC (アルミナ)： R = 0.63 (溶離液；クロ口ホルム）
f [0219] [化 64]
Figure imgf000049_0001
(15) 蛍光性化合物
[0220] 化合物（15) (11.5 mg)が入った 50 mLフラスコに、 1,2-ジクロロエタン (20 ml)、三フッ 化ホウ素ジェチルエーテル錯体 (0.1ml)、 TEA (0.08ml)をカ卩え、 40°Cで 30分間撹拌し た。
[0221] 反応終了後、塩化メチレンと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機相を抽出 、洗浄した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、得られた 粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液；クロ口ホルム)でおおまかに分離し 、減圧濃縮した後、アセトンを加えて吸引ろ過を行い、得られたろ物を真空乾燥し、 蛍光性化合物 (9.2 mg,4.4 %(3工程)）を緑色結晶として得た。
[0222] TLC (シリカ)： R = 0.50 (溶離液；クロ口ホルム）
f
^-NMRCCDCl ): δ = 3.90 (s, 6H), 6.73 (quant, 2H, J = 2.2 Hz), 6.82 (s, 2H), 7.00
3
(d, 4H, J = 8.8 Hz) , 7.80 (d, 4H, J = 9.0 Hz)
19F-NMR(CDC1 ): δ = -54.32 (s, 3F), 149.02(quant, 2F)
3
[0223] なお、上記実施例及び比較例にお!、て、試薬は分析級試薬ある!、は最上級品位 のものを用いた。また、すべての 1H-NMR ^ベクトルはテトラメチルシランを内部標準 物質とし、 r. t.で測定された。機器は、 JOEL JNM- GSX300、 JOEL JMM-LA300 FT- NMRを用いた。
[0224] また、上記実施例及び比較例において用いた略号は以下のとおりである。
Me: メチル基
Et: ェチノレ基
DDQ: 2, 3-ジクロロ- 5, 6-ジシァノ -p-ベンゾキノン
TEA:卜リエチノレアミン
TFA:トリフロロ酢酸
TFAA:トリフロロ無水酢酸 MeOH:メタノーノレ
r.t.:室温
mm:分
h:時間
実施例 10
[0225] 実施例 7〜9で合成した本発明の蛍光性ィ匕合物 、 Z及び Sの光学特性を実施例 6 と同様にして測定した。結果を下記表 4に示す。
[0226] [表 4] 蛍光性化 Aabs i ε a Φ a
半値幅 溶媒
合物 (nm) (nm) (M- W (nm)
6 CHC13 673 683 240, 000 0. 69 24
THF 665 674 n. d. 0. 63 24
MeOH 659 672 n. d. 0. 58 26
7 CHClj 678 688 n. d. 0. 51 24
MeOH 662 674 n. d. 0. 54 28
8 CHCI3 722 737 240, 000 0. 58 31
h /レエン 724 735 n. d. 0. 53 27
THF 721 735 n. d. 0. 42 32
MeCN 713 733 n. d. 0. 51 37
MeOH 712 732 n. d. 0. 40 35 a誤差 10%含む
b測定せず (not determined)
[0227] 蛍光性化合物 βおよひ の蛍光量子収率 Φは、 3,3'-ジェチル -ジチアジカルボシァ ニン（Φ =0.33、 MeOH中）をリファレンスとし、 A = A = 0.079, Φ = 0.33, η = 1 ref ref ref ref
.329(MeOH), n = 1.445 (CHCl), 1.407 (THF:テトラヒドロフラン)， 1.329 (Me〇H)を代
3
入し、 Fには 650應の励起光で励起し検出された蛍光強度面積の積算値を代入して 求めた。
Φ = Φ X(A XFXn2)/ (AXF Xn 2) (ただし、 Aは吸光度、 Fは蛍光スペクトルの波数積分値、 nは溶媒の屈折率を示し、 re fは参照色素（リファレンス）を示す）
[0228] 蛍光性化合物 Sの蛍光量子収率 Φは、異なる濃度の溶液を準備し、縦軸を蛍光強 度面積の積分値 F (励起光 : 690 横軸を吸光度 Aとしたグラフを作成し、その傾き Grad (=F/A)を算出し、さらに各溶媒の屈折 n = 1.496 (トルエン)， 1.445 (CHC1 ), 1.4
3
07 (THF), 1.344(MeCN), 1.329 (MeOH)を代入しそれぞれの値を次の式に代入する ことで求めた。このとき、参照化合物 1 (下記）（Φ = 0.36、 CHC1中）をリファレンスと ref 3
した。
Φ = Φ X (Grad X n2)/ (Grad X n 2)
ref ref ref
(ただし、 Gradは縦軸に蛍光スペクトルの波数積分値、横軸に吸光度としたグラフの 傾き、 nは溶媒の屈折率を示し、 refは参照色素（リファレンス）を示す）
[0229] 蛍光性化合物 、 Zの蛍光極大波長はクロ口ホルム中で 683 nm、 688 nmとなり、ボロ ンジピロメテン（R = R = R = R = Me)に比べて約 170 nmほど、蛍光性化合物 2に比
1 3 5 7 一 ベ約 90 nmシフトした。このことから、特定の部位に電子供与基を導入することで長波 長化することが確かめられた。また、蛍光性化合物 、 Zは、それぞれ半値幅が非常 に小さぐ鋭い蛍光スペクトルを示している。このこと力 、ボロンジピロメテン骨格と同 様の骨格の堅さを維持したまま長波長シフトしたことがわかる。さらに、蛍光性化合物 ぉよび Zを比較すると、導入した基の電子供与性が高 ヽほど蛍光が長波長化するこ とが確かめられた。
[0230] [化 65]
Figure imgf000051_0001
参照化合物 1
[0231] 蛍光性ィ匕合物 Sの蛍光極大波長はクロ口ホルム中で 737 nmとなり、蛍光性ィ匕合物 に比べ約 54 nmシフトした。このことから、特定の部位に電子吸引基を導入することで さらなる長波長シフトが達成できることがわかる。また、また、蛍光性ィ匕合物 Sは、半値 幅が 31 nm程度と非常に小さぐ鋭い蛍光スペクトルを示している。このこと力 、ボロ ンジピロメテン骨格と同様の骨格の堅さを維持したまま長波長シフトしたことがわかる 実施例 11
[0232] 蛍光性化合物 Sと、 Cy7 (商品名、 1-[3-(4-モノメトキシトリチロキシ)プロピル] -1'-[3- [(2-シァノエチル) - (Ν,Ν-ジイソプロピル)フォスフォロアミジチル]プロピル] -3,3,3',3'- テトラメチルインドトリカルボシァニンク口リド)の光に対する耐久性を確かめる実験を 行った。
[0233] 蛍光性ィ匕合物 Sと Cy7 (商品名）を、それぞれァセトニトリル中に溶解し、吸光度が 0.
1になる濃度に調整し、遮光せず同条件下 (具体的には日常生活光の下)で放置し、 1日（ないしは 2日おき）に吸光度を測定した。そして縦軸に相対吸光度 (放置前の吸 光度を 100%とする）を、横軸に日数をとり、経時変化をグラフに示した。
[0234] 結果を図 1に示す。蛍光性ィヒ合物 Sは、一週間後でも吸光度は 95%以上保持され ている一方、 Cy7 (商品名）は吸光度が 10%以下まで減少した。この結果より、 Cy7 ( 商品名）の光に対する耐久性は著しく乏しいが、蛍光性ィ匕合物 Sは光に対する耐久 性が極めて高いことがわ力つた。この結果より、従来の色素では不可能であった、長 時間の分析試薬、または高耐久性の新規表示色素材料、光学材料としての応用が 可能となると考えられる。
[0235] Cy7に代表されるシァニン系色素は、 0010段落でも述べたように、化学的に柔軟 な結合であるォレフィン (ポリメチン)鎖が長ぐこの部位が光異性ィ匕などを起こし、そ のため耐久性の低下を招いたと考えられる。また、この現象は Cy7のみならず、一般 的にォレフイン (ポリメチン)構造を有する色素にお 、ては起こりうることであり、ォレフ イン (ポリメチン)鎖が長くなるほど、耐久性が低下すると考えられる。もっとも、この現 象は非特許文献 3をはじめ、多くの文献で報告されている事実である。
[0236] 一方、蛍光性ィ匕合物 Sは、化学的に堅牢な分子構造であるため、飛躍的に光耐久 性が向上したと考えられる。したがって、蛍光性ィ匕合物 は、柔軟なォレフィン構造を 有する色素、特に Cy7に代表されるようなシァニン系色素に対して、光耐久性の面で も有意な利点を見出せる。もっとも、この事象は蛍光性ィ匕合物旦に限定されず、本発 明による蛍光性化合物全般に共通する特性である。

Claims

請求の範囲
下記一般式 [I]
Figure imgf000054_0001
[ I ]
(ただし、式中、
R1と R2は互いに協働して、ィォゥ、酸素、窒素及びリンカも成る群より選ばれる少なく とも 1個のへテロ原子を含む 5員若しくは 6員のへテロ環を形成するか又は該ヘテロ 環を形成しない場合には互いに独立に水素原子若しくは前記化合物の蛍光を阻害 しない任意の基を表し、
R6と R7は互いに協働して、ィォゥ、酸素、窒素及びリンカも成る群より選ばれる少なく とも 1個のへテロ原子を含む 5員若しくは 6員のへテロ環を形成するか又は該ヘテロ 環を形成しない場合には互いに独立に水素原子若しくは前記化合物の蛍光を阻害 しない任意の基を表し、
(l)R1と R2、及び、（2)R6と R7、の少なくともいずれか一方は上記へテロ環を形成し、
Qは炭素原子又は窒素原子を表し、
R4及び R5は互いに独立に水素原子又は前記化合物の蛍光を阻害しない任意 の基を表し (ただし、 Qが窒素原子の場合には R4は存在しない）、
R8及び R9は互いに独立にハロゲン原子、アルキル基、ァルケ-ル基、アルキ-ル基 、アルコキシ基、ァリール基又はへテロアリール基を示す）
で示される構造を有する蛍光性化合物。
[2] 前記 R1と R2、及び/又は R6と R7により形成される前記へテロ環が、互いに独立に、 下 3式
[化 2]
Figure imgf000055_0001
(ただし、これらの式中、 X、 Y及び Zは、互いに独立にィォゥ、酸素、窒素又はリン原 子を示し、 R1Qないし R17は互いに独立に水素原子又は前記化合物の蛍光を阻害しな い任意の基を表す）
で表されるいずれかの構造を有する請求項 1記載の化合物。
[3] 前記へテロ環が、
[化 3]
Figure imgf000055_0002
(ただし、これらの式中、 X、 Y及び Zは、互いに独立にィォゥ、酸素、窒素又はリン原 子を示し、 R1Qないし R13は互いに独立に水素原子又は前記化合物の蛍光を阻害しな い任意の基を表す）
で表されるいずれかの構造を有する請求項 2記載の化合物。
[4] 前記 R1Qないし R17が互いに独立に水素原子又は電子供与性基である請求項 2又は 3記載の化合物。
[5] 前記電子供与性基がアルキル基、フヱニル基、 P-アルコキシフヱニル基、 P-ジアル キルアミノフヱ-ル基、 2_チェ-ル基、 2_フリル基又はジアルコキシフ -ル基である 請求項 4記載の化合物。
[6] 前記電子供与性基が炭素数 1〜10のアルキル基、アルキル部分の炭素数が 1〜1 0のアルコキシフエ-ル基若しくはアルキル部分の炭素数がそれぞれ 1〜10のジァ ルコキシフエニル基である請求項 5記載の化合物。
[7] 前記一般式 [I]中、 R8及び R9が互いに独立にハロゲン原子である請求項 1ないし 6の いずれか 1項に記載の化合物。
[8] 前記一般式 [I]中、 R8及び R9がフッ素原子である請求項 7記載の化合物。
[9] 請求項 1な!、し 8の 、ずれか 1項に記載の化合物から成る標識剤。
[10] 請求項 9記載の標識剤で標識した物質を反応に供し、反応後、該標識剤を発光さ せて該物質を測定することを含む標識物質の測定方法。
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