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WO2007002973A2 - Verwendung von stilbenderivaten zur herstellung von arzneimitteln für die behandlung solider tumore - Google Patents

Verwendung von stilbenderivaten zur herstellung von arzneimitteln für die behandlung solider tumore Download PDF

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WO2007002973A2
WO2007002973A2 PCT/AT2006/000283 AT2006000283W WO2007002973A2 WO 2007002973 A2 WO2007002973 A2 WO 2007002973A2 AT 2006000283 W AT2006000283 W AT 2006000283W WO 2007002973 A2 WO2007002973 A2 WO 2007002973A2
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WO
WIPO (PCT)
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use according
stilbene derivative
general formula
treatment
melanoma
Prior art date
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Volker Wacheck
Thomas Szekeres
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Medizinische Universitaet Wien
Original Assignee
Medizinische Universitaet Wien
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Publication of WO2007002973A3 publication Critical patent/WO2007002973A3/de
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the invention relates to the use of stilbene derivatives for the preparation of medicaments for the treatment of solid tumors.
  • Resveratrol a stilbene-3, 4 ', 5 triol, is the most extensively studied compound in the group
  • resveratrol appears suitable for use as an antitumor substance.
  • 3 ', 4', 4 ', 5', 5'-hexahydroxystilbene (M8) exhibited more than 3-fold higher cytotoxicity in HL-60 cells than resveratrol (reference 5)
  • hexahydroxystilbene was found to have the lowest IC 50 values in the lower micromolar range, and the dose-dependent induction of apoptosis was induced by morphogenesis after peak propidium iodide staining.
  • Malignant melanoma is one of the most aggressive and malignant tumors and the leading cause of death among skin cancer patients. Presumably due to increased UV irradiation, a dramatic increase in melanoma frequency has been observed during the past decades (reference 6). In the past relatively rare (1935: 1 in 100 000), malignant melanoma is now one of the most common tumors of the fair-skinned population (15 in 100 000 in most parts of the USA and Europe). The increase in the incidence rate of melanoma is significantly higher than in other tumors (reference 7).
  • COX-2 cyclooxygenase 2
  • isoenzyme of cyclooxygenase is expressed in malignant melanomas and may play a role in the regulation of the invasiveness of melanoma (References 10; ll).
  • COX-2 cyclooxygenase 2
  • inhibition of COX-2 also improves macrophage function in melanoma and enhances the antitumor effect of gamma-interferon (reference 12). According to these results, the inhibition of COX-2 may be a promising molecular approach for the treatment of malignant melanoma.
  • the enzyme ribonucleotide reductase is overexpressed in melanomas; Antisense oligonucleotides which are resistant to the R2
  • Subunit of the enzyme could be directed in one
  • Mouse model not only inhibit the growth of malignant melanoma, but also suppress the formation of lung metastasis
  • NF-kappa B could be identified as an important molecular target for melanoma progression (reference 14). By inhibition of NF-kappa B could be identified as an important molecular target for melanoma progression (reference 14). By inhibition of NF-kappa B could be identified as an important molecular target for melanoma progression (reference 14). By inhibition of NF-kappa B could be identified as an important molecular target for melanoma progression (reference 14).
  • Tyrosinase The enzyme is responsible for the rate-limiting step of melanin synthesis and plays an important role in the distribution of the melanin pigment.
  • the object of the present invention is now to carry out further investigations in the direction of antitumor action of already synthesized stilbene derivatives.
  • R 1 to R 6 which are identical or different, are hydrogen, OH, -OD or -OR 7 , wherein R 7 is a C 1 to C 3 alkyl group or a C 1 to C 4 acyl group, with the proviso that at least four (4) of the substituents R 1 to R 6 have a meaning other than hydrogen.
  • Human melanoma cell line 518A2 was incubated in DMEM medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS) (GIBCO, Grand Island Biological Co., Grand Island, NY, USA) and 1% penicillin-streptomycin mix one moistened Atmosphere cultured at 5% CO 2 .
  • FCS heat-inactivated fetal calf serum
  • Human gastric carcinoma cell lines N87, MKN45 and MKN28 were spiked into RPMI medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS) (GIBCO, Grand Island Biological Co., Grand Island, NY, USA) and 1% penicillin-streptomycin mix was cultured in a humidified atmosphere at 5% CO 2 .
  • FCS heat-inactivated fetal calf serum
  • Logarithmically growing melanoma or gastric carcinoma cells were seeded in 24 well plates at a concentration of 5 x 10 3 cells / ml and incubated with various concentrations of resveratrol or M8, respectively. The substances were dissolved in 0.25% DMSO. Subsequently, the cell number was determined by means of a cell counter Coulter ZI Counter (Coulter, Luton, Beds., UK). Cell death and cell cycle analyzes: The analyzes for the determination of apoptotic cell death and the distribution of treated cells within the cell cycle were carried out by means of propidium iodide staining and FACS analysis.
  • the cells were first washed in PBS and then fixed by addition of 2 ml of ice-cold ethanol-PBS mix (70:30). After 30 min on ice, the fixed cells were centrifuged for 5 min at room temperature and then the supernatant was discarded. The cells were washed again with PBS and incubated in 0.1% DNase-free RNase A and 100 ug / ml propidium iodide-containing PBS for 30 min at 37 ° C. A minimum of IxIO 4 events were then measured by a FACScalibur Flow Cytometer with an argon laser (488nm) and evaluated using the CellQuest software (Becton Dickinson, New Jersey, USA).
  • Western Blot Analsyen Western Blot analyzes were performed for NF-kB, Bcl-2, and actin. For this cell extracts of cells from cell cultures or tumor extracts using 0.14M NaCl, 0.2M triethanolamine, 0.2% Na-deoxycholate, and 0.5% Nonident P-40 were supplemented with protease inhibitors (all Sigma, St. Louis, MO, USA) won , A total of 15 ⁇ g of absolute protein was separated on SDS-PAGE and blotted onto a PVDF membrane (Tropix, Bedford, MA, USA).
  • the membranes were saturated for 60 min in PBS with 0.2% I-block (Tropix) and then incubated with monoclonal antibodies directed against Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) and NF-kB (Santa Cruz). Secondary antibodies were obtained with alkaline phosphatase conjugated goat anti-mouse and goat anti-rabbit (Tropix) were used and reactive bands detected with the chemoluminescence substrate CSPD (CSPD substrates, Tropix). An anti-actin antibody (Sigma, St. Louis, MO, USA) was used as internal charge control. The expression levels of NF-kB, BcI-2 and actin were measured by densitometry (TotalLab, version 1.1, UK).
  • NTP Pool Measurement To examine the effect of M8 on nucleoside triphosphate concentrations, 518A2 cells were treated with various concentrations of hexahydroxystilbene (compound M8) for 24 hours. Thereafter, the cells were extracted and after neutralization the cell extracts were analyzed by HPLC as described by Garrett and Santi (reference 20).
  • SCID mice Pathogen-free, 6-8 week old C.B-17 (SCID) mouse worms were purchased from Harlan-Winkelmann (Borchen, Germany). SCID mice were maintained under pathogen-free conditions in special filter cages (e.g., Micro-Isolator TM cages) because of their immune deficiency. Cages with litter, drinking water and feed were autoclaved.
  • filter cages e.g., Micro-Isolator TM cages
  • mice (6 mice per group) were injected subcutaneously in the area of the lower left flank with 5x10 6 518A2 human 518A2 melanoma cells dissolved in 200 ⁇ l of PBS. After palpable tumors developed, the animals were randomized to the different treatment groups. The SCID mice were treated daily by intraperitoneal (ip) administration with compound M8 at the indicated dosages. For the combination treatment with dacarbazine (DTIC) - DTIC was in a Dosage of 80 mg / kg ip administered on days 4 and 6 after the start of M8 treatment. At the end of the treatment, the mice were anesthetized and euthanized by cervical dislocation. Tumor tissue, organs and serum were collected and stored accordingly for further investigation. TUNEL staining of tumors:
  • the tumor tissue of the animals was fixed in formalin after removal (7.5% formalin in 0.08 M sodium phosphate, pH 7.4).
  • TUNEL TdT-mediated dUTPnick end labeling
  • Resveratrol is known in the literature as an apoptosis-inducing substance. Therefore, the apoptosis induction of M8 was investigated in comparison to resveratrol. As shown in Figure 2, M8 resulted in a dose-dependent induction of apoptosis, whereas resveratrol did not induce apoptosis up to a concentration of 50 ⁇ M led to significant apoptosis induction. The DMSO control showed no significant effects on cell growth or apoptosis induction.
  • DMSO DMSO was used as a solvent and had a slight effect on cell growth only at the highest concentrations used alone.
  • M8 cell cycle analyzes were performed. Depending on the cell system studied, resveratrol may cause a Gj-S phase or a G 2 / M phase arrest, according to the literature. In the 518A2 melanoma cells, M8 doubled the number of cells in the G 2 / M phase from M8 concentrations of 6.25 ⁇ M, while resveratrol caused G 1 arrest in 518A2 melanoma cells (see Figure 3). These results indicate that M8 has, at least in part, a different mechanism of action than resveratrol.
  • M8 dose-dependently inhibits the growth of the three gastric carcinoma cell lines N87, MKN45 and MKN28, see Figure 5, with IC50 concentrations between ⁇ 15-25 ⁇ M.
  • N87 and MKN45 treatment with M8 showed above all an increase in the fraction of cells in the S phase, see FIGS. 7a and 7b.
  • Measurement of N87 and MKN45 gastric carcinoma cell lines was assessed by FACS for cell death (PI positive Cells) 48 hours after treatment with M8 in concentrations of
  • NTP nucleoside triphosphates
  • FIG. 9 shows the effect of M8 on incorporation of radiolabelled cytidine into 318A2 human melanoma cells (in situ ribonucleotide reductase assay). As shown in Figure 9, incorporation could be significantly inhibited by pretreatment with M8. Since cytidine can only be incorporated into the DNA via the pathway via ribonucleotide reductase, pretreatment with M8 has caused the inhibition of the activity of this metabolic pathway in intact melanoma cells.
  • Figure 10 shows the in vivo activity of M8 as a single substance.
  • Treatment period (day 21) is indicated (mean ⁇
  • M8 As a result of the antitumor activity of M8 as a single substance and the published modulation of chemoresistance-influencing proteins by stilbenes, the potential of M8 as a chemosensitizer for standard therapy with DTIC was investigated in a next step.
  • the SCID mice After establishing a palpable tumor xenograft, the SCID mice were treated daily with 2.5 mg / kg of compound M8 ip for 14 days. In addition, 80 mg / kg DTIC was administered ip on days 4 and 6 after the start of M8 treatment.
  • liver and spleen weights were examined as markers for immunomodulatory or toxic side effects in the different treatment groups. There were no significant differences in liver or spleen weight.
  • Figure 14a shows mean spleen weight and Figure 14b shows mean liver weight.
  • a dosage regimen for human administration can be determined as follows:
  • Typical dosage rates of hexahydroxystilbene, for example compound M8, range from 0.5 mg to 10 mg per day and kg body weight when administered parenterally, with a dose range between 1 and 5 mg per day and kg body weight based on previous results seems particularly promising.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Stilbenderivaten der allgemeinen Formel (I) zum Herstellen von Arzneimitteln für die Behandlung solider Tumore, wie Melanome oder Magenkarzinome. Neben der Antitumoraktivität als Einzelsubstanz konnten weiters zufriedenstellende Ergebnisse dann erzielt werden, wenn Stilbenderivate der allgemeinen Formel (I) in Kombination mit einer DNA-interkalierenden Substanz, insbesondere Dacarbazin verabreicht wurden.

Description

Verwendung von Stilbenderivaten zur Herstellung von Arzneimitteln für die Behandlung solider Tumore
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Stilbenderivaten zum Herstellen von Arzneimitteln für die Behandlung solider Tumore .
Es ist bekannt, dass verschiedene natürlich vorkommende Substanzen, wie Flavonoide oder phenolische Substanzen vor unterschiedlichen Krankheiten schützen und in der Behandlung von Krankheiten, wie Tumorerkrankungen oder Blutgefäßerkrankungen hilfreich sein können. Diese Wirkstoffe kommen auch in Pflanzen, Beeren, Trauben, Nüssen, Wein oder Kräutermischungen, wie sie in der indischen und chinesischen Medizin verwendet werden, vor.
Resveratrol, ein Stilben-3, 4' , 5 triol, ist die am ausführlichsten untersuchte Substanz aus der Gruppe der
Polyphenole. Sie wird von Weintrauben gebildet und ist ein
Inhaltsstoff von Wein. Resveratrol hemmt das Wachstum von
Tumorzellen und wird für das sogenannte französische Paradoxon verantwortlich gemacht; das ist die Tatsache, dass in Frankreich die Häufigkeit von koronaren Herzerkrankungen um 40 % niedriger ist, als im restlichen Europa.
Verschiedene zelluläre Effekte, wie Hemmung von Cyclooxygenasen (Literaturzitat 1) , des Enzyms Ribonukleotid Reduktase (Literaturzitat 2) oder die Induktion des Transkriptionsfaktors NFkappaB (Literaturzitat 3) wurden beschrieben. All diese biochemischen Wirkungen führen zur Hemmung von Tumorzellwachstum. Deshalb erscheint Resveratrol geeignet für die Verwendung als Antitumorsubstanz .
Weiters konnte gezeigt werden, dass eine Kombination von Resveratrol mit dem Chemotherapeutikum Ara-C in vitro die Proliferation von Leukämiezellen synergistisch hemmen kann.
Um die Antitumorwirkung von Stilbenen weiter zu verbessern, wurden eine Reihe mehrfach hydroxylierter Analoga synthetisiert und deren Wirkung in der Gewebekultur untersucht (Literaturzitat 4) .
Figure imgf000003_0001
Resveratrol Hexahydroxystilben (M8)
"Unter diesen Analoga zeigte 3, 3' , 4 , 4' , 5, 5' -Hexahydroxystilben (M8) in HL-60 Zellen eine mehr als 3-fach höhere Zytotoxizität als Resveratrol (Literaturzitat 5) . Darüber hinaus wurden die Wirkungen verschiedener Analoga in humanen HT-29 Kolontumorzellen sowie in Prostatatumorzelllinien untersucht. In allen Fällen konnten mit Hexahydroxystilben die niedrigsten IC50 Werte im unteren mikromolaren Bereich festgestellt werden. Darüber hinaus induziert die Substanz dosisabhängig Apoptose, wie morphologisch nach Höchst Propidium Jodid Färbung festgestellt wurde.
Das maligne Melanom ist einer der aggressivsten und bösartigsten Tumore und die häufigste Todesursache von Patienten mit Hautkrebs. Vermutlich aufgrund verstärkter UV-Bestrahlung wurde während der vergangenen Jahrzehnte ein dramatischer Anstieg der Melanomhäufigkeit beobachtet (Literaturzitat 6) . Früher relativ selten (1935: 1 in 100 000) ist das maligne Melanom nunmehr eine der häufigsten Tumorerkrankungen der hellhäutigen Population (15 in 100000 in den meisten Teilen der USA und Europas). Der Anstieg der Inzidenzrate des Melanoms ist wesentlich höher als bei anderen Tumoren (Literaturzitat 7) .
Während das umschriebene, lokalisierte Melanom nach entsprechender chirurgischer Entfernung eine sehr gute Prognose hat, ist die Prognose für Patienten, die an einem metastasierten Melanom leiden (20% aller Fälle) sehr schlecht. Dies gilt insbesondere für Fernmetastasen, bei welchen trotz einer Reihe von therapeutischen Ansätzen die Behandlungserfolge wenig zufrieden stellend sind (Literaturzitat 8). Die einzige bis dato von der FDA zugelassene Therapie für Patienten in fortgeschrittenem Stadium, ist Dacarbazin (DTIC) . Trotzdem ist die Wirkung auf DTIC nicht ausreichend, sodass in klinischen Studien kein Überlebensvorteil für nicht DTIC behandelte Patienten mit fortgeschrittenem Melanom gesehen werden konnte (Literaturzitat 9) . Deshalb besteht weiterhin ein dringender Bedarf für neuartige Therapieoptionen zur Behandlung des malignen Melanoms.
Sämtliche für Resveratrol beschriebene molekulare Zielstrukturen spielen auch eine wesentliche Rolle für die Progression und Resistenz von malignen Melanomen.
Es konnte gezeigt werden, dass das Enzym Cyclooxygenase 2 (COX-2), ein Isoenzym der Cyclooxygenase, in malignen Melanomen exprimiert wird und eine Rolle bei der Regulation der Invasivität des Melanoms spielen dürfte (Literaturzitate 10;ll). Während gesunde Haut und Melanozyten COX-2 negativ sind, zeigen Melanom- Metastasen eine hohe Expression von COX-2, die bei Krankheitsprogression weiter ansteigt (Literaturzitat 11) . Nach den Resultaten von Duff und Mitarbeitern verbessert die Hemmung von COX-2 auch die Makrophagenfunktion in Melanomen und verstärkt die Antitumorwirkung von gamma-Interferon (Literaturzitat 12) . Nach diesen Resultaten dürfte die Hemmung von COX-2 einen viel versprechenden molekularen Ansatz für die Behandlung des malignen Melanoms darstellen.
Das Enzym Ribonukleotid Reduktase ist in Melanomen überexprimiert; Antisense Oligonukleotide, die gegen die R2-
Untereinheit des Enzymes gerichtet sind, konnten in einem
Mausmodell nicht nur das Wachstum von malignen Melanomen hemmen, sondern auch die Bildung von Lungenmetastasen unterdrücken
(Literaturzitat 13) . Weiters konnte NF-kappa B als eine wichtige molekulare Zielstruktur für die Melanomprogression identifiziert werden (Literaturzitat 14). Durch Hemmung von NF-kappa B konnten
Melanomzellen gegenüber Strahlentherapie oder Temozolamid, dem aktiven Metaboliten von DTIC, sensibilisiert werden
(Literaturzitate 14;15). Ein weiteres „Target" von Stilbenen stellt das Enzym
Tyrosinase dar. Das Enzym ist verantwortlich für den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Melaninsynthese und spielt eine wichtige Rolle für die Verteilung des Melaninpigments.
Ohguchi und Mitarbeiter (Literaturzitat 16), sowie Kim et al . (Literaturzitat 17) konnten zeigen, dass Gnetol ebenso wie andere Stilbene wirksame Inhibitoren der Tyrosinase-Aktivität sind. Die Tyrosinase-Aktivität ist deshalb von besonderer Bedeutung, da das Ausmaß der Pigmentierung die Empfindlichkeit von Zellen gegenüber einer Strahlentherapie bestimmt (Literaturzitat 18) . Eine Hemmung der Tyrosinase-Aktivität unterstützt daher wirkungsvoll die konventionelle Behandlung des malignen Melanoms. Darüber hinaus haben Fuggetta et al . kürzlich vorgeschlagen, Resveratrol zur Therapie von Temozolamid empfindlichen und resistenten Melanomzellen zu verwenden (Literaturzitat 19) .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, weitere Untersuchungen in Richtung Antitumorwirkung von bereits synthetisierten Stilbenderivaten durchzuführen.
Erfindungsgemäß wird die Verwendung eines Stilbenderivates der allgemeinen Formel I
Figure imgf000005_0001
zum Herstellen von Arzneimitteln für die Behandlung solider Tumore angegeben, worin R1 bis R6, die gleich oder verschieden sind, Wasserstoff, OH-, -OD oder -OR7 bedeuten, worin R7 eine C1 bis C3- Alkylgruppe oder eine C1 bis C4-Acylgruppe ist, mit der Maßgabe, dass wenigstens vier (4) der Substituenten R1 bis R6 eine andere Bedeutung als Wasserstoff haben.
Erfindungsgemäß wird ebenso die Verwendung der vorgenannten Stilbenderivate mit der allgemeinen Formel I zum Herstellen von Arzneimitteln für die Behandlung von Melanomen sowie Magenkarzinomen, welche der Gruppe der soliden Tumore zuzuordnen sind, beschrieben.
Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind gemäß Unteransprüche offenbart.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen sowie diese erläuternde Abbildungen, welche jedoch insgesamt nicht einschränkend auszulegen sind, näher beschrieben.
Dazu werden vorerst das verwendete Material bzw. die eingesetzten Messmethoden diskutiert. Zellkultur:
Die humane Melanom-Zelllinie 518A2 wurde in DMEM Medium, welches mit 10% Hitze inaktiviertem fetalem Kälberserum (FCS) (GIBCO, Grand Island Biological Co., Grand Island, NY, USA) und mit 1% Penicillin-Streptomycin Mix versetzt war, in einer befeuchteten Atmosphäre bei 5% CO2 kultiviert. Die humanen Magenkarzinom Zellinien N87, MKN45 und MKN28 wurden in RPMI Medium, welches mit 10% Hitze inaktiviertem fetalem Kälberserum (FCS) (GIBCO, Grand Island Biological Co., Grand Island, NY, USA) und mit 1% Penicillin-Streptomycin Mix versetzt war, in einer befeuchteten Atmosphäre bei 5% CO2 kultiviert. Wachstumshemmungstests :
Logarithmisch wachsende Melanom- oder Magenkarzinomzellen wurden in 24 Well Platten in einer Konzentration von 5 xlO3 Zellen/ml ausgesät und mit verschiedenen Konzentrationen von Resveratrol bzw. M8 inkubiert. Die Substanzen waren in 0,25% DMSO gelöst. Anschließend wurde die Zellzahl mittels eines Zellcounters Coulter Zl Counter (Coulter, Luton, Beds., UK) bestimmt. Zelltod und Zellzyklus Analysen: Die Analysen zur Bestimmung des apoptotischen Zelltods und der Verteilung behandelter Zellen innerhalb des Zellzyklus erfolgten mittels Propidium Jodid Färbung und FACS Analyse. Die Zellen wurden zunächst in PBS gewaschen und dann durch Zugabe von 2ml eiskaltem Ethanol-PBS mix (70:30) fixiert. Nach 30min auf Eis, wurden die fixierten Zellen für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und anschließend der Überstand verworfen. Die Zellen wurden erneut mit PBS gewaschen und in 0.1% DNase-free RNase A und 100 μg/ml Propidium Jodid enthaltendem PBS für 30 min bei 37°C inkubiert. Ein Minimum von IxIO4 Ereignissen wurde anschließend mittels eines FACScalibur Flow Zytometer mit einem Argon Laser (488nm) gemessen und mit der CellQuest Software (Becton Dickinson, New Jersey, USA) ausgewertet. Western blot Analsyen: Western blot Analysen wurden für NF-kB, Bcl-2, und Aktin durchgeführt. Dazu wurden Zellextrakte von Zellen aus Zellkulturen oder von Tumorextrakten mittels 0.14M NaCl, 0.2M Triethanolamin, 0.2% Na-deoxycholate, und 0.5% Nonident P-40, supplementiert mit Protease Inhibitoren (all Sigma, St. Louis, MO, USA) gewonnen. Insgesamt 15 μg absolute Proteinmenge wurden auf einer SDS-PAGE separiert und auf eine PVDF Membran (Tropix, Bedford, MA, USA) geblottet. Die Membranen wurden für 60min in PBS mit 0.2% I-block (Tropix) abgesättigt und dann mit monoklonalen Antikörpern gerichtet gegen Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) und NF-kB (Santa Cruz) inkubiert. Als Zweitantikörper wurden mit Alkalischer Phosphatase konjugierte Ziege-anti-Maus und Ziege-anti-Kaninchen (Tropix) verwendet und reaktive Banden mit dem Chemoluminiszenz Substrat CSPD (CSPD Substrate, Tropix) detektiert. Ein anti-Aktin Antikörper (Sigma, St. Louis, MO, USA) wurde als interne Ladungskontrolle verwendet. Die Expressionsstärke von NF-kB, BcI- 2 und Aktin wurden mittels Densitometrie vermessen (TotalLab, version 1.1, UK). Die Signalstärke von NF-kB und Bcl-2 wurde auf die von Aktin normalisiert. NTP Pool Messung: Um die Wirkung von M8 auf Nukleosidtriphosphat- Konzentrationen zu untersuchen, wurden 518A2 Zellen 24 Stunden lang mit verschiedenen Konzentrationen an Hexahydroxystilben (Verbindung M8) behandelt. Danach wurden die Zellen extrahiert und nach Neutralisation wurden die Zellextrakte mittels HPLC analysiert wie von Garrett und Santi beschrieben (Literaturzitat 20) .
In situ Messung der Ribonukleotid Reduktase-Aktivität : Es wurden 0.1 x 105 518A2 Zellen mit verschiedenen Konzentrationen der Verbindung M8 für 24 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellen gezählt und 30 Minuten lange mit 14C-Cytidin
(0,3125 μCi, 5mM) markiert. Danach wurde die DNA der Zellen nach
Standardvorschriften isoliert; der Einbau des Cytidin in die DNA wurde mittels eines Scintillationscounters gemessen und auf die photometrisch bestimmte DNA-Konzentration bezogen. SCID Maus Experimente:
Pathogenfreie, 6-8 Wochen alte C.B-17 seid/seid (SCID) Mäuseweibchen wurden von Harlan-Winkelmann (Borchen, Germany) erworben. SCID-Mäuse wurden aufgrund ihrer Immunschwäche unter pathogenfreien Bedingungen in speziellen Filterkäfigen (z.B. Micro-Isolator™ cages) gehalten. Käfige mit Streu, Trinkwasser und Futter wurden autoklaviert .
Den SCID-Mäusen (6 Mäuse pro Gruppe) wurden subkutan im Bereich der linken unteren Flanke 5xlO6 518A2 humane 518A2 Melanomzellen gelöst in 200μl PBS injiziert. Nachdem sich tastbare Tumore entwickelt hatten, wurden die Tiere nach dem Zufallsprinzip auf die verschiedenen Behandlungsgruppen aufgeteilt. Die SCID-Mäuse wurden täglich mittels intraperitonealer (ip) Applikation mit der Verbindung M8 in den angegebenen Dosierungen behandelt. Für die Kombinationsbehandlung mit Dacarbazin (DTIC) - wurde DTIC in einer Dosierung von 80 mg/kg ip an den Tagen 4 und 6 nach dem Beginn der M8-Behandlung verabreicht. Am Ende der Behandlung wurden die Mäuse anästhesiert und mittels cervicaler Dislokation euthanasiert . Tumorgewebe, Organe und Serum wurden gewonnen und für weitere Untersuchungen entsprechend gelagert. TUNEL Färbungen der Tumore :
Das Tumorgewebe der Tiere wurde nach Entnahme in Formalin fixiert (7.5% formalin in 0.08 M Natriumphosphat , pH 7.4).
Anschließend wurde das Gewebe in Formalin eingebettet und anschließend 4 μm dicke Schnitte angefertigt. Eine TUNEL (TdT- mediated dUTPnick end labeling) Immunhistochemie wurde entsprechend dem Protokoll des Herstellers (Roche Diagnostics,
Mannheim, Gerrαany) durchgeführt . Multiple Tumorschnitte der äußeren Schicht des Tumors ohne Anzeichen von Nekrose wurden mit einem Fluoreszenz Mikroskop auf das Vorhandensein von apoptotischen Zellen hin untersucht.
Statistische Analysen:
Statistisch signifikante Unterschiede wurden mittels Man-
Whitney-U Test für nicht parametrische Verteilungen und anschließender Bonferroni-Holm Korrektur für multiples Testen
(SPSS 10.0.7, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) bestimmt. P-Werte kleiner als 0,05 wurden als statistisch signifikant gewertet.
Im folgenden wird die in vitro Wirkung von Hexahydroxystilben (Verbindung M8) im Vergleich zu Resveratrol auf das Wachstum und die Apoptose von 518A2 Zellen untersucht.
Humane 518A2 Melanomzellen wurden mit steigenden
Konzentrationen an Resveratrol oder M8 behandelt. Eine dosisabhängige Reduktion der Zellzahl konnte beobachtet werden.
Diese war deutlich stärker ausgeprägt als die der Muttersubstanz Resveratrol (siehe Abbildung 1) . Nach 24 Stunden Behandlung zeigte sich mit M8 eine IC50 von unter 20μM, während Resveratrol eine mehr als doppelt so hohe IC50 von etwa 50μM zeigte. Nach 96
Stunden konnte für Resveratrol eine IC50 von 3,125 μM beobachtet werden, während hingegen M8 unter denselben Bedingungen eine IC50 von unter 1,56 μM zeigte.
Resveratrol ist in der Literatur als eine Apoptose induzierende Substanz bekannt. Daher wurde die Apoptose Induktion von M8 im Vergleich zu Resveratrol untersucht. Wie in Abbildung 2 gezeigt, führte M8 zu einer dosisabhängigen Induktion von Apoptose, während Resveratrol bis zu einer Konzentration von 50μM zu keiner signifikanten Apoptoseinduktion führte. Die DMSO Kontrolle zeigte keine signifikanten Effekte auf das Zellwachstum oder die Apoptoseinduktion .
DMSO wurde als Lösungsmittel eingesetzt und hatte alleine nur bei den höchsten eingesetzten Konzentrationen einen leichten Effekt auf das Zellwachstum.
Zur weiteren Abklärung des Mechanismus der antiproliferativen Effekte von M8 wurden Zellzyklusanalysen durchgeführt. In Abhängigkeit des untersuchten Zellsystems kann Resveratrol laut Literatur eine Gj-S-Phase oder eine G2/M Phasen Arretierung bewirken. In den 518A2 Melanomzellen bewirkte M8 eine Verdopplung der Zellen eine Verdopplung der Zellen in der G2/M Phase ab M8 Konzentrationen von 6.25μM, während Resveratrol eine G1 Arretierung in 518A2 Melanomzellen bewirkte (siehe Abb 3) . Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass M8 zumindest teilweise einen unterschiedlichen Wirkmechanismus besitzt als Resveratrol.
Aufgrund der beeindruckenden Apoptose induzierenden Potenz von M8 bei niedrigen mikromolaren Konzentrationen wurde die Expression von Schlüsselproteinen für die Regulation der Apoptose untersucht. Wie in Abbildung 4 gezeigt, zeigte sich nach Behandlung mit M8 eine Herabregulierung von NF-kB und Bcl-2 um mehr als 50% bei M8 Konzentrationen von 25 und 50μM.
Die Wirkung von M8 konnte in vitro auch gegen weiteren solide Tumorentitäten gezeigt werden. M8 hemmt dosisabhängig das Wachstum der drei Magenkarzinomzellinien N87, MKN45 und MKN28, siehe Abb. 5, mit IC50 Konzentrationen zwischen ~15-25μM.
Diese antiproliferative Wirkung von M8 korrelierte mit der Induktion von Zelltod. Nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen zeigte sich eine dosisabhängige Steigerung des Zelltods (PI positive Zellen), siehe Abb. 6a und 6b. Die Messung an N87 und MKN45 Magenkarzinomzellinien wurde mittels FACS auf Zelltod (PI-positive Zellen) 48 Stunden nach Behandlung mit M8 in Konzentrationen von 6,25 bis 50 μM vorgenommen. Entsprechend der höheren IC50 war die Induktion von Zelltod durch M8 in MKN45 weniger ausgeprägt als bei N87 Zellen.
In Bezug auf die Beeinflussung des Zellzyklus zeigte sich in den beiden Magenkarzinomzellinien N87 und MKN45 durch die Behandlung mit M8 vor allem eine Erhöhung der Fraktion der Zellen in der S-Phase, siehe Abb. 7a und 7b. Die Messung an N87 und MKN45 Magenkarzinomzellinien wurde mittels FACS auf Zelltod (PI-positive Zellen) 48 Stunden nach Behandlung mit M8 in Konzentrationen von
6,25 bis 50 μM vorgenommen.
Weiters wurde die Wirkung von M8 auf die Nukleosidtriphosphate (NTP) von Melanomzellen untersucht. Wie oben beschrieben wurden die Zellen 24 Stunden lang mit 6,25 bis 25 μM Verbindung M8 behandelt. Anschließend wurden die NTP-Pools mittels HPLC bestimmt. In Abb. 8 wird die Wirkung von M8 auf intrazelluläre NTP-Konzentrationen in 518A2 humanen Melanom- Zellen gezeigt. Wie aus Abbildung 8 ersichtlich, verursachten 25μM der Verbindung M8 einen signifikanten Abfall aller gemessenen NTP- Spiegel, mit Ausnahme der UTP-Konzentrationen, welche signifikant konzentrationsabhängig anstiegen. Alle anderen Konzentrationen von M8 bewirkten keine signifikante Veränderung der NTP-Pools im Vergleich zur Kontrolle. Ebenso wurde die Wirkung von M8 auf die in situ Aktivität des Enzyms Ribonukleotid Reduktase untersucht.
Es wurden Zellen, wie oben beschrieben mit 25 bis 200 μM der Verbindung M8 24 Stunden lang behandelt und dann mit radioaktivem Cytidin markiert. Danach wurde die Aufnahme der Radioaktivität in die DNA bestimmt. In Abbildung 9 wird die Wirkung von M8 auf den Einbau von radioaktiv markiertem Cytidin in 318A2 humanen Melanomzellen (in-situ-Ribonukleotid Reduktase-Assay) gezeigt. Wie aus Abbildung 9 ersichtlich, konnte der Einbau durch Vorbehandlung mit M8 signifikant gehemmt werden. Da Cytidin nur über den Stoffwechselweg via Ribonukleotid Reduktase in die DNA eingebaut werden kann, hat die Vorbehandlung mit M8 die Hemmung der Aktivität dieses Stoffwechselweges in intakten Melanomzellen bewirkt.
Weiters wurde die in vivo Antitmorwirkung von Hexahydroxystilben (Verbindung M8) als Monotherapie untersucht.
Aufgrund der vielversprechenden in vitro Resultate, wurde die Aktivität von Hexahydroxystilben (M8) als Monotherapie in einem 518A2 humanem Melanom-SCID-Maus-Modell evaluiert. Im Rahmen eines Pilot-Versuches (n=3 SCID Mäuse) wurden täglich 2,5 und 5 mg/kg der Verbindung M8 durch ip Injektion verabreicht. Diese Dosis wurde von den Tieren sehr gut vertragen.
Eine tägliche ip Behandlung mit 2,5 bzw. 5 mg/kg der Verbindung M8 für die Dauer von 21 Tagen, welche nach dem Erreichen eines tastbaren Tumors begann, wurde ohne Zeichen einer Toxizität gut vertragen. Am Ende der Behandlungszeit war zwischen den Gruppen kein signifikanter Unterschied in Bezug auf das
Körpergewicht der SCID-Mäuse festzustellen, siehe Abb. 10. In
Abbildung 10 wird die In-vivo-Aktivität von M8 als Einzelsubstanz gezeigt. SCID Mäuse (n=6) mit 518A2 humanen Melanom Xenografts wurden 21 Tage lang mit den angegebenen Dosen ip-behandelt
(mg=mg/kg/d) . Das durchschnittliche Körpergewicht am Ende der
Behandlungsperiode (Tag 21) ist angegeben (Mittelwerte ±
Standardabweichung) . Die Analyse von gepoolten Serumproben der
Tiere, welche am Ende der Therapieperiode gewonnen wurden, zeigte in den therapierten Tieren im Vergleich zu unbehandelten Tieren keine signifikante Veränderung bezüglich des roten bzw. weißen Blutbildes oder der Serumchemie.
Bezüglich der Antitumoraktivität konnte für beide Dosierungen eine signifikante Antitumoraktivität mit einer vergleichbaren Reduktion des Tumorgewichts um 40% relativ zur DMSO/Kochsalzkontrolle beobachtet werden, siehe Abb. 115. In Abbildung 11 wurde die Aktivität von M8 in vivo als Einzelsubstanz gezeigt. SCID Mäuse (n=6) mit 518A2 humanen Melanom-Xenografts wurden 21 Tage lange mit den angegebenen Dosen ip-behandelt (mg=mg/kg/d) . Das durchschnittliche Tumorgewicht am Ende der Behandlungsperiode (Tag 21) ist angegeben (Mittelwerte + Standardabweichung) . Die Reduktion im Tumorgewicht war für beide Dosierungen im Vergleich zu den mit DMSO/Kochsalz behandelten Kontrolltieren signifikant unterschiedlich (p< 0.018). Da zwischen den Dosen von M8 kein signifikanter Unterschied in der Wirkung gesehen wurde, wurde eine Dosis von 2,5 mg/kg als geringste wirksame Dosis definiert (minimale effektive Dosis = MED) und für die weiteren Kombinationsstudien eingesetzt.
Aufgrund der Antitumoraktivität von M8 als Einzelsubstanz und der publizierten Modulation von Chemoresistenz beeinflussenden Proteinen durch Stilbene, wurde in einem nächsten Schritt das Potential von M8 als Chemosensitizer für eine Standardtherapie mit DTIC untersucht. Nach Etablierung eines palpablen Tumorxenograft wurden die SCID Mäuse 14 Tage lang täglich mit 2,5 mg/kg an Verbindung M8 ip behandelt. Zusätzlich wurde an den Tagen 4 und 6 nach Beginn der M8 Behandlung 80 mg/kg DTIC ip verabreicht.
Diese Kombinationstherapie wurde von den Tieren gut vertragen. Es wurden keine Anzeichen einer akuten oder subakuten Toxizität beobachtet. Entsprechend ergaben sich am Ende der Behandlungsperiode keine signifikanten Unterschiede im Körpergewicht der Tiere zwischen den verschiedenen Gruppen, siehe Abb. 12. In Abbildung 12 wird das durchschnittliche Körpergewicht von SCID Mäusen (n=6/Gruppe) mit 518A2 Xenograften nach Behandlung mit M8, DTIC oder einer Kombination aus beiden (Mittelwerte ± Standardabweichung) gezeigt.
Ähnlich wie in dem zuvor dargestellten Experiment zeigte M8 auch in diesem Experiment eine Antitumoraktivität als Einzelsubstanz im Bereich von 40% Wachstumsreduktion des Tumors im Vergleich zur DMSO/Kochsalzkontrolle (p<0.036) In Abbildung 13 wird gezeigt, dass M8 maligne Melanome gegenüber DTIC in vivo chemosensitiviert . Durchschnittliches Tumorgewicht von SCID Mäusen (n=6/Gruppe) mit 518A2 Xenograften nach Behandlung mit M8, DTIC oder einer Kombination aus beiden (Mittelwerte ± Standardabweichung) wurden dargestellt.
Weit bemerkenswerter noch als die Monoaktivität war der chemosensitivierende Effekt bei der Kombinationsbehandlung mit M8 und DTIC. Nach 14 Tagen Behandlung mit dieser Kombination waren 3 der 5 SCID-Mäuse tumorfrei, wobei die übrigen 3 Tiere nur noch minimale Resttumore hatten. Dieser Antitumoreffekt für die Kombination von M8 und DTIC Behandlung war statistisch signifikant unterschiedlich (p<0.012) im Vergleich zu den Effekten in den anderen Gruppen (M8 alleine oder DTIC alleine) . Die 96%-ige Reduktion des Tumorvolumens durch die Kombinationstherapie M8/DTIC relativ zur DMSO/Kochsalzkontrolle war gegenüber den Effekten der Einzelsubstanzen klar überadditiv. Die Behandlung mit DTIC alleine, welche die Standardtherapie des malignen Melanoms darstellt, zeigte ebenfalls eine signifikante Antitumorwirkung relativ zur DMSO/Kochsalzkontrolle. Im Gegensatz zu der Kombinationsbehandlung (M8 + DTIC) hatte die Monotherapie mit DTIC allerdings in keinem der Versuchstiere Tumorfreiheit am Ende der Versuchsperiode bewirkt.
Weiters wurden Leber- und Milzgewichte als Marker für immunmodulierende oder toxische Nebenwirkungen in den verschiedenen Behandlungsgruppen untersucht. Dabei wurden keine signifikanten Unterschiede bezüglich Leber- oder Milzgewicht festgestellt. Abbildung 14a zeigt das mittlere Milzgewicht und Abbildung 14b das mittlere Lebergewicht.
Weiters wurden die asservierten 518A2 humanen Melanomtumoren aus den SCID Mäusen auf die Induktion von apoptotischen Zelltod hin untersucht. Wie in Abbildung 15 ersichtlich, führte die Behandlung mit M8 zu einer Erhöhung der apoptotischen Zellen im Vergleich zur Kontrollbehandlung.
Anhand der hier vorgenommenen Untersuchungen an Mäusen kann ein Dosierungsrahmen für die Verabreichung am Menschen wie folgt festgelegt werden:
Typische Dosierungsraten von Hexahydroxystilben beispielsweise der Verbindung M8, liegen in einem Bereich von 0,5 mg bis 10 mg pro Tag und kg Körpergewicht bei parenteraler Applikation, wobei ein Dosisbereich zwischen 1 und 5 mg pro Tag und kg Körpergewicht, basierend auf den bisherigen Ergebnissen als besonders vielversprechend erscheint.
Bei enteraler Applikation könnte sich dieser Dosierungsrahmen in Abhängigkeit der verwendeten Galenik und der damit verbundenen enteralen Resorption um ein Vielfaches erhöhen. Als Darreichungsform finden folgende Formulierungen Anwendung
- eine Lösung zur parenteralen Verabreichung, enthaltend 0,1 bis 30 mg Hexahydroxystilben als Wirkstoff pro ml,
Tabletten und Kapseln, enthaltend 10 bis 500 mg Hexahydroxystilben als Wirkstoff, sowie
- flüssige Formulierungen zur oralen Verabreichung mit einer Konzentration von 0,1 bis 30 mg Hexahydroxystilben als Wirkstoff pro ml .
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die hier untersuchten Stilbenderivate eine äußerst zufriedenstellende
Antitumorwirkung, unter anderem bei Melanom- sowie Magenkarzinom- zelllinien zeigen, welche an Hand entsprechender in vitro- bzw. an
Tiermodellen untersucht wurden. Neben der Antitumoraktivität als
Einzelsubstanz konnten weiters zufriedenstellende Ergebnisse dann erzielt werden, wenn ein Stilbenderivat der allgemeinen Formel I in Kombination mit einer DNA-interkalierenden Substanz, insbesondere Dacarbazin (DTIC) eingesetzt wird. Da DNA- interkalierende Substanzen Reparaturen der DNA auslösen, werden diese durch die verwendeten Stilbenderivate, welche das Enzym Ribonukleotid Reduktase hemmen, erschwert. Dies deshalb, da keine bzw. weniger DNA-Bausteine (dNTPs) für eine adäquate Reparatur zur
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Claims

Ansprüche :
1. Verwendung eines Stilbenderivates der allgemeinen Formel I
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worin R1 bis R6, die gleich oder verschieden sind, Wasserstoff,
OH-, -OD oder -OR7 bedeuten, worin R7 eine C1 bis C3-Alkylgruppe oder eine C1 bis C4-Acylgruppe ist, mit der Maßgabe, dass wenigstens vier (4) der Substituenten R1 bis R5 eine andere Bedeutung als Wasserstoff haben, zum Herstellen von Arzneimitteln für die Behandlung solider Tumore.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der solide Tumor ein Melanom ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der solide Tumor ein Magenkarzinom ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Stilbenderivat der allgemeinen Formel I mit einer DNA-interkalierenden Substanz kombiniert wird.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der verwendeten DNA-interkalierenden Substanz um Dacarbazin (DTIC) handelt.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem verwendeten Stilbenderivat der allgemeinen Formel I um 3, 3' , 4, 4' , 5, 5' -Hexahydroxystilben handelt .
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem verwendeten Stilbenderivat der allgemeinen Formel I um 3, 3' , 4, 4' , 5, 5' -Hexamethoxystilben handelt .
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem verwendeten Stilbenderivat um
3, 3' 5, 5' -Tetrahydroxystüben handelt .
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem verwendeten Stilbenderivat um 3 , 3' , 4 ' , 5-Tetrahydroxystilben handelt .
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem verwendeten Stilbenderivat um 3, 3' 4, 4' 5-Pentahydroxystilben handelt.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem verwendeten Stilbenderivat um
3, 3' 4, 5, 5' -Pentahydroxystilben handelt.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem verwendeten Stilbenderivat um 3, 4, 4' 5, 5' -Pentahydroxystilben handelt .
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem verwendeten Stilbenderivat um 3, 3' , 4' ,5, 5' -Pentahydroxystilben handelt.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein Arzneimittel in Form einer Lösung zur parenteralen Verabreichung hergestellt wird, in welchem ein Stilbenderivat der allgemeinen Formel I mit einer Wirkstoffkonzentration von 0,1 bis 30 mg/ml vorliegt.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung des Arzneimittels als Wirkstoff ein Stilbenderivat der allgemeinen Formel I mit einem pharmazeutischen Träger kombiniert und zu Tabletten und Kapseln verpresst wird.
16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Wirkstoff in einer Menge von 10 bis 500 mg vorliegt.
17. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel als flüssige Formulierung zur oralen Verabreichung hergestellt wird, und dass als Wirkstoff ein Stilbenderivat der allgemeinen Formel I in einer Konzentration von 0,1 bis 30 mg/ml eingesetzt wird.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein Wirkstoff der allgemeinen Formel I mit einer DNA-interkalierenden Substanz, vorzugsweise Dacarbazin, kombiniert wird.
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