TWI763065B - 重組融合蛋白及免疫原組合物 - Google Patents
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Abstract
重組融合蛋白包括受體相關蛋白1（RAP1）、分化簇28（CD28）-假單胞菌外毒素A轉位結構域（PEt）融合多胜肽，天冬氨酸內肽酶以及標靶胜肽。RAP1位於重組融合蛋白的N端。分化簇28-假單胞菌外毒素A轉位結構域（CD28-PEt）融合多胜肽位於RAP1的C端。天冬氨酸內肽酶位於分化簇28-假單胞菌外毒素A轉位結構域（CD28-PEt）融合多胜肽的C端。標靶胜肽位於天冬氨酸內肽酶蛋白的C末端。在本揭露的另一個實施例中，提供了免疫原組合物。包括重組融合蛋白和佐劑的免疫原組合物用於在罹癌的受試者中誘導特異性免疫反應，由此可以成功地降低受試者的癌症轉移和復發的風險。
Description
[相關申請的交叉引用]
此申請要求申請日為2019年10月4日的美國臨時申請第62/910,474號的優先權和權益。上述專利申請的全部內容藉由引用併入本文，並成為本說明書的一部分。
本發明是有關於一種重組融合蛋白及免疫原組合物，且特別是有關於一種包括重組融合蛋白的免疫原組合物，所述重組融合蛋白可以在罹癌的受試者中有效地誘導特異性免疫反應。
天冬氨酸內肽酶（legumain）在多種腫瘤中會過度表達（overexpression），且在腫瘤晚期和轉移（metastasis）時更為顯著。因此，天冬氨酸內肽酶的過度表達（overexpression）被認為與術後的轉移和復發（recurrence）的風險相關。例如，在患有乳腺腫瘤（breast tumor）的狗中，天冬氨酸內肽酶過度表達，主要治療方法是手術切除。然而在臨床上已經發現，在外科切除乳房腫瘤後的轉移和復發率非常高。
據此，本揭露提供一種包括重組融合蛋白的免疫原組合物，所述重組融合蛋白可用於在罹癌的受試者中有效地誘導特異性免疫反應，並可降低受試者的癌症轉移和復發的風險。
根據本揭露的一些實施例，一種重組融合蛋白被提供。該重組融合蛋白包括受體相關蛋白1（receptor associated protein 1，RAP1）、分化簇28（cluster of differentiation 28，CD28）-假單胞菌外毒素A轉位結構域（Pseudomonas exotoxin A translocation domain，PEt）融合多胜肽、天冬氨酸內肽酶（legumain）蛋白以及標靶胜肽（target peptide）。受體相關蛋白1（RAP1）位在重組融合蛋白的N-端。分化簇28-假單胞菌外毒素A轉位結構域（CD28-PEt）融合多胜肽位在受體相關蛋白1的C端。天冬氨酸內肽酶蛋白位在分化簇28-假單胞菌外毒素A轉位結構域（CD28-PEt）融合多胜肽的C端。標靶胜肽位在天冬氨酸內肽酶蛋白的C端。
在本發明的一實施例中，上述的重組融合蛋白包括SEQ ID NO：1的胺基酸序列。
在本發明的一實施例中，上述的重組融合蛋白包括由SEQ ID NO：2的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。
在本發明的一實施例中，上述的天冬氨酸內肽酶蛋白為人類重組蛋白。
在本發明的一實施例中，上述的標靶胜肽為內質網保留序列。
本發明的免疫原組合物，用於在罹癌的受試者中誘導特異性免疫反應，免疫原組合物包括上述的重組融合蛋白以及佐劑。
在本發明的一實施例中，上述的佐劑包括CpG寡聚去氧核苷酸（CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODN）或基於皂苷佐劑（saponin-based adjuvant）。
在本發明的一實施例中，上述的CpG寡聚去氧核苷酸（CpG ODN）的濃度為0.2毫克/毫升。
在本發明的一實施例中，上述的基於皂苷佐劑的濃度為0.2毫克/毫升。
在本發明的一實施例中，上述的重組融合蛋白與佐劑的重量比為1：1至12.5：1。
在本發明的一實施例中，上述的受試者包括人類和非人類動物。
在本發明的一實施例中，上述的癌症包括天冬氨酸內肽酶過度表達癌。
在本發明的一實施例中，上述的天冬氨酸內肽酶過度表達癌包括乳腺癌、乳腺腫瘤、前列腺癌、胃癌、大腸直腸癌、卵巢癌或黑色素瘤。
基於上述，本發明提供了重組融合蛋白和包括該重組融合蛋白的免疫原組合物。重組融合蛋白包括位於重組融合蛋白的N端的受體相關蛋白1（RAP1）、位於受體相關蛋白1（RAP1）的C端的分化簇28-假單胞菌外毒素A轉位結構域（CD28-Pet）融合多胜肽、位於分化簇28-假單胞菌外毒素A轉位結構域（CD28-Pet）融合多胜肽的C端的天冬氨酸內肽酶（legumain）蛋白，以及位在天冬氨酸內肽酶蛋白的C端的標靶胜肽。藉由在用於疫苗接種的免疫原組合物中添加本發明的重組融合蛋白，可以在患有癌症的受試者中成功地有效誘導特異性免疫反應，因此可降低該受試者的癌症轉移和復發的風險。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
當前，天冬氨酸內肽酶（Legumain）被發現在多種腫瘤中過度表達(overexpressed)，並且在腫瘤的晚期和轉移（metastasis）時更為顯著。此外，天冬氨酸內肽酶過度表達被認為與術後的轉移和復發（recurrence）的風險相關。例如，在患有乳腺腫瘤（mammary tumor）的狗中，天冬氨酸內肽酶會過度表達，且在臨床上已經發現，外科切除乳腺腫瘤後的轉移和復發率非常高。
本揭露涉及一種重組融合蛋白（recombinant fusion protein）以及免疫原組合物（immunogenic composition），重組融合蛋白包括SEQ ID NO：1的胺基酸序列，免疫原組合物包括所述重組融合蛋白與佐劑，以在患有癌症的受試者中有效地誘導特異性免疫反應。在一些示例性實施例中，重組融合蛋白可至少包括受體相關蛋白1（receptor associated protein 1，RAP1）、分化簇28（cluster of differentiation 28，CD28）-假單胞菌外毒素A轉位結構域（Pseudomonas exotoxin A translocation domain，PEt）融合多胜肽、天冬氨酸內肽酶（legumain）蛋白以及標靶胜肽（target peptide）。受體相關蛋白1（RAP1）位在重組融合蛋白的N-端。分化簇28-假單胞菌外毒素A轉位結構域（CD28-PEt）融合多胜肽位在受體相關蛋白1（RAP1）的C端。天冬氨酸內肽酶（legumain）蛋白位在分化簇28-假單胞菌外毒素A轉位結構域（CD28-PEt）融合多胜肽的C端。標靶胜肽位在天冬氨酸內肽酶（legumain）蛋白的C端。
在一個示例性的實施例中，重組融合蛋白可包括由SEQ ID NO：2的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。然而，本揭露不限於此。
受體相關蛋白1（RAP1）的分子量為39 kDa，是內質網保留蛋白（Endoplasmic Reticulum resident protein，ERRP）。受體相關蛋白1（RAP1）也是與低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor）家族成員緊密結合的拮抗劑（antagonist）和分子伴護子（molecular chaperones），例如，低密度脂蛋白受體相關蛋白1（low density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1），也被知道為分化簇91（cluster of differentiation 91，CD91）。
假單胞菌外毒素A（PE）蛋白是該細菌最具毒性的致病因子（virulence factor）。假單胞菌外毒素A（PE）蛋白可分為Ia結構域（胺基酸序列1-252）、II結構域（胺基酸序列253-364）、Ib結構域（胺基酸序列365-404）和III結構域（胺基酸序列405-613）。在一些實施例中，具有假單胞菌外毒素A轉位結構域（PEt）的假單胞菌外毒素A（PE）蛋白的胺基酸序列268-313可用以作為重組融合蛋白的一部分。然而，本揭露不限於此。在其他實施例中，具有假單胞菌外毒素A轉位結構域（PEt）的假單胞菌外毒素A（PE）蛋白的胺基酸序列也可用以作為重組融合蛋白的一部分。
分化簇28-假單胞菌外毒素A轉位結構域（CD28-PEt）融合多胜肽可以包括分化簇28（CD28）保守區（conserved region）和假單胞菌外毒素A轉位結構域（PEt），並且假單胞菌外毒素A轉位結構域（PEt）可以位於分化簇28（CD28）保守區的C端。分化簇28（CD28）保守區是用以作為誘導CD28促控抗體（agonist antibody）的抗原表位（epitope）。以分化簇28-假單胞菌外毒素A轉位結構域（CD28-PEt）融合多胜肽作為免疫刺激劑（immunostimulator），可能會提高CD28（CD28激動劑抗體（CD28 agonist antibody））特異性的IgG效價，然後使CD4+和CD8+ T細胞敏化（sensitize）。
天冬氨酸內肽酶（Legumain）蛋白是一種半胱氨酸內肽酶（cysteine endopeptidase），屬於肽酶家族C13（peptidase family C13）。天冬氨酸內肽酶蛋白是腫瘤中非常重要的臨床指標，並且在多種腫瘤中過度表達，包括人類的乳腺癌（breast cancer）、乳腺腫瘤（mammary tumor）、前列腺癌（prostate cancer）、胃癌（stomach cancer）、大腸直腸癌（colorectal cancer）、卵巢癌（ovarian cancer）和黑色素瘤（melanoma）。天冬氨酸內肽酶蛋白也於非人類（例如狗，但不限於此）的肛門囊癌（anal sac carcinoma）、淋巴瘤（lymphoma）、乳腺腫瘤（mammary gland tumor）、肥大細胞腫瘤（mast cell tumor）、口腔惡性黑色素瘤（oral malignant melanoma）、骨肉瘤（osteosarcoma）、軟組織肉瘤（soft tissue sarcoma）（纖維肉瘤（fibrosarcoma）、周圍神經鞘瘤（peripheral nerve sheath tumor）或其他）和脾血管肉瘤（splenic hemangiosarcoma）中過度表達。此外，天冬氨酸內肽酶蛋白在III-IV期癌症中的表達程度（expression level）高於I-II期癌症，因此，天冬氨酸內肽酶蛋白的過度表達可能與癌症臨床分期有關。具體而言，過度表達的天冬氨酸內肽酶可能嚴重影響抗原呈現（antigen presentation）過程，從而影響MHC II的活化，但不限於此。過量表達的天冬氨酸內肽酶也可能影響位於細胞表面上的其他蛋白酶的活化（activation）。例如，腫瘤相關的巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）（例如，M2 TAM）可以透過過度表達的天冬氨酸內肽酶蛋白且藉由上述機制，以建立適合腫瘤生長的微環境。
在一個示例性實施例中，天冬氨酸內肽酶蛋白可以是人類（智人（Homo sapiens
））的重組天冬氨酸內肽酶蛋白。然而，本揭露不限於此。在其他示例性實施例中，可以使用具有其他胺基酸序列的其他物種的天冬氨酸內肽酶蛋白。
在一個示例性的實施例中，靶標胜肽（target peptide）可包括內質網（ER）保留序列，其幫助抗原從內吞區室（endocytic compartment）轉移到內質網（ER）中並保留在內腔（lumen）中。內質網（ER）保留序列可以包括KDEL或RDEL的胺基酸序列。例如，內質網（ER）保留序列可以包括KDELKDELKDEL的胺基酸序列。然而，本揭露不限於此。
在一個示例性實施例中，受試者可以包括人類和非人類動物。例如，受試者可以是小鼠、貓或狗。然而，本揭露不限於此。
在一個示例性實施例中，所述癌症可以包括天冬氨酸內肽酶過度表達的癌症。在其他示例性實施例中，天冬氨酸內肽酶過度表達可包括人類的乳腺癌、乳腺腫瘤、前列腺癌、胃癌、大腸直腸癌、卵巢癌和黑色素瘤。然而，本揭露不限於此。在其他示例性實施例中，天冬氨酸內肽酶過度表達的癌症可包括非人類（例如狗，但不限於此）的肛門囊癌、淋巴瘤、乳腺腫瘤、肥大細胞腫瘤、口腔惡性黑色素瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤（纖維肉瘤、周圍神經鞘瘤或其他）和脾血管肉瘤。
在一個示例性實施例中，佐劑可包括CpG寡聚去氧核苷酸（CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODN）或基於皂苷的佐劑（saponin-based adjuvant）。例如，基於皂苷的佐劑可以是基於皂苷動物用疫苗佐劑（saponin-based veterinary vaccine adjuvant，VET-SAP）。然而，本揭露不限於此。
在一個示例性實施例的免疫原組合物中，CpG寡聚去氧核苷酸（CpG ODN）的濃度為約0.2毫克/毫升（mg/mL）。在一些實施例的免疫原組合物中，基於皂苷佐劑的濃度為約0.2毫克/毫升（mg/mL）。
在一個示例性實施例中，重組融合蛋白與佐劑的重量比為2.5：1。在一些實施例中，重組融合蛋白與佐劑的重量比為12.5：1。在一些實施方案中，重組融合蛋白與佐劑的比例為1：1重量。通過將重組融合蛋白與佐劑的比例調整在該範圍內，可以誘導有效的特異性免疫反應。
通過設計重組融合蛋白，使其至少包括受體相關蛋白1（RAP1）、分化簇28（CD28）-假單胞菌外毒素A轉位結構域（PEt）融合多胜肽、天冬氨酸內肽酶蛋白以及靶標胜肽，並透過包括上述重組融合蛋白的免疫原組合物，可以在罹癌的受試者中成功地誘導有效地特異性免疫反應，因此降低了受試者的癌症轉移和復發的風險。
實施例
進行以下實驗實施例以證明本揭露包括重組融合蛋白的免疫原組合物，可以在罹癌的受試者中成功地誘導特異性免疫反應，從而可以降低受試者的癌症轉移和復發的風險。
實施例 1
：重組融合蛋白和包括重組融合蛋白的免疫原組合物的製備
在該實施例中，無菌操作台（sterile hood）內，製備500毫升的培養基（125微升的卡那黴素（kanamycin）（100毫克/毫升），50毫升的20％葡萄糖溶液，450毫升的TSB培養基）於2升的燒瓶（flask）中。接著，將細菌原種（bacterial stock）接種到含有500毫升培養基的2升燒瓶中，於30℃的培養箱中搖晃（150 rpm）培養14〜18小時。應當注意，上述細菌可以表達包括SEQ ID NO：1的胺基酸序列的重組融合蛋白。在另一個實例中，上述細菌具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列，其可以編碼重組融合蛋白的胺基酸序列。
在發酵罐（fermenter）中製備培養液：在發酵罐中加入48克的胰蛋白（tryptone）、96克的酵母提取物（yeast extract）、8.8克的磷酸二氫鉀（KH2
PO4
）、37.6克的磷酸氫二鉀（K2
HPO4
）、1克的氯化鈉（NaCl）及1毫升消泡劑（defoamer）後，加水至4升並在121°C滅菌20分鐘。滅菌並降低溫度至37°C後，將100毫升的碳源溶液（包括16克的葡萄糖和64克的甘油）和1毫升的卡那黴素（100毫克/毫升）添加到發酵罐中。
將在2L燒瓶中過夜培養的細菌培養基添加到發酵罐中，並在以下培養條件下培養：溫度為37°C，轉速為400至1000 rpm，pH為7.0，溶解氧（DO）值為20％，通風量為3 ccm。發酵罐中培養液在600 nm波長處的初始光學密度（OD600波長）在0.01〜0.04之間。
溫育6小時後，將4毫升的異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）（1莫耳濃度（M））加入發酵罐中進行誘導。異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導8小時以上且pH值大於7.5後，可以收集發酵產物。
[重組融合蛋白的收集]
將發酵產物在8,000 rpm和4℃下離心10分鐘。移除上清液，並以TNE緩衝液（50 mM的Tris緩衝液，50 mM的氯化鈉（NaCl），1 mM的EDTA，pH 8.0）將沉澱物重新均勻懸浮。
將冷水系統（cold water system）安裝在高壓細胞破碎機（high-pressure cell crusher）中後，將懸浮液倒入高壓細胞破碎機中。在4℃和1300巴的條件下，通過高壓細胞破碎機使懸浮液中的細菌細胞破裂以獲得細胞裂解物，再重複此步驟。
將沉澱物用TNE-T緩衝液洗滌兩次，並以7,000 rpm離心20分鐘，然後除去上清液。
將沉澱物用2 M的Urea-T緩衝液（2 M的尿素（Urea），50 mM的Tris緩衝液，50 mM的氯化鈉（NaCl），1mM的乙二胺四乙酸（EDTA），5 %的Triton X-100，pH 8.0）洗滌3次，並以7,000 rpm離心15分鐘 ，然後除去上清液。
將沉澱物用TNE緩衝液洗滌並以7,000 rpm離心30分鐘，然後去除上清液以獲得包涵體（inclusion body）。將含有重組融合蛋白的包涵體保存在-20℃下。
[重組融合蛋白的純化]
以150毫升結合緩衝液（binging buffer）（8 M尿素（Urea），10 mM磷酸鉀（K. Phosphate），pH 6.0）將3克包涵體均勻懸浮。
加入3毫升的0.5 M DTT後，將懸浮的包涵體倒入高壓細胞破碎機中，然後在1300巴的壓力下進行高壓均質。應該注意的是，懸浮的包涵體在倒入高壓細胞破碎機之前必須完全均質化。高壓均質後，將裂解物溶液（lysate solution）在150 rpm和37°C的振盪器上放置16-24小時。
之後，將裂解物溶液在7,000 rpm和4°C下離心10分鐘。
收集上清液並用0.45微米/0.22微米的過濾器（filter）過濾，並收集含有重組融合蛋白的過濾半產物。
在以5倍色譜柱體積的結合緩衝液（binding buffer）（8 M的尿素，10 mM的磷酸鉀（K.）磷酸鹽，pH 6.0）平衡10毫升Q Sepharose色譜柱（5毫升/分鐘的流速）後，將50毫升的過濾半產物添加到Q Sepharose色譜柱中。
加入3倍色譜柱體積的15 %洗脫緩衝液（Elution buffer）以5毫升/分鐘的流速洗滌色譜柱，然後收集洗滌的樣品。洗脫緩衝液包括pH值為6.0的8 M尿素、10 mM磷酸鉀（K. Phosphate）和500 mM氯化鈉（NaCl）。
加入3倍色譜柱體積的20 %洗脫緩衝液，以5毫升/分鐘的流速洗滌色譜柱，然後收集洗滌的樣品。
加入3倍色譜柱體積的100 %洗脫緩衝液以5毫升/分鐘的流速洗滌色譜柱，然後收集含有重組融合蛋白的純化半產物。
[重組融合蛋白的重新折疊（refolding）]
將10毫克的純化半成品添加到透析袋（30kD cut-off）後，向透析袋中添加8 M尿素緩衝液（8 M尿素，10 mM 磷酸鉀，pH 6.0）至10 毫升。
將透析袋放置在裝有5升的6 M尿素緩衝液（6 M尿素，10 mM磷酸鉀，pH 6.0）的容器中進行透析16小時。
取出透析袋，將其置於裝有5升的4 M尿素緩衝液（4 M尿素，10 mM磷酸鉀，pH 6.0）的容器中透析4小時。
取出透析袋，並將其置於裝有5升的2 M尿素緩衝液（2 M尿素，10 mM磷酸鉀，pH 6.0）的容器中透析4小時。
取出透析袋並將其置於裝有5升的1M尿素緩衝液（1M尿素，10mM磷酸鉀，pH 6.0）的容器中進行透析16小時。
取出透析袋，並將其置於裝有5升的1X PBS緩衝液（pH 7.4）的容器中進行透析4小時。
取出透析袋，並將其置於裝有5升的1X PBS緩衝液（pH 7.4）的容器中進行透析4小時。
取出重新折疊的半產物，並用0.22微米的過濾器（filter）過濾後，獲得重組融合蛋白。
[免疫原組合物的製備]
將10微升的新黴素（Neomycin）和100微升的CpG寡聚去氧核苷酸（CpG）/ 基於皂苷動物用疫苗佐劑（VET-SAP）（20毫克/毫升）加入10毫升的重組融合蛋白中以形成混合物後，將混合物以無菌過濾至具有0.2微米過濾器的混合罐中，並以150 rpm攪拌5分鐘，以得到免疫原組合物。在該實驗實施例中，將重組融合蛋白與CpG / VET-SAP均勻混合，例如比例為2.5：1。然而，本揭露不限於此。在其他實驗實施例中，重組融合蛋白與CpG / VET-SAP也可以以1：1或12.5：1的比例均勻混合。在一些實驗實施例中，CpG ODN的濃度為約0.2毫克/毫升。在其他實驗實施例中，基於皂苷佐劑的濃度為約0.2毫克/毫升。
實施例 2
：免疫原組合物對乳腺腫瘤動物模型的影響
在該實驗例中，將雌性BALB/c小鼠（7週齡）用作試驗動物，並通過皮下注射向其注射安慰劑或免疫原組合物。如表1所示，將Balb/c小鼠分為3組，每組3-10隻小鼠。首先，通過尾靜脈注射（tail vein injection）向A至C組注射小鼠乳腺腫瘤細胞（例如1.4×104
4T1-luc細胞）。在注射小鼠乳腺腫瘤細胞後第3、10和17天，向A組注射緩衝液（作為安慰劑），向B組注射包括重組融合蛋白和CpG寡聚去氧核苷酸（CpG）的免疫原組合物，以及向C組注射包括重組融合蛋白和基於皂苷動物用疫苗佐劑（VET-SAP）的免疫原組合物。應注意的是，4T1小鼠乳腺腫瘤細胞具有高度致瘤性（tumorigenic）和侵襲性（invasive），可以自發地從原發腫瘤轉移到多個遠處，包括淋巴結、血液、肝、肺、腦及骨。
在注射安慰劑/免疫原組合物之前與在第一次、第二次和第三次安慰劑/免疫原組合物注射之後，通過頜下血液(submandibular blood)收集來收集血液樣品。血液樣品中的血清用於天冬氨酸內肽酶（legumain）之IgG抗體的酵素免疫分析法（ELISA）分析。小鼠中的小鼠乳腺腫瘤細胞是透過體內成像系統（IVIS）來檢測。
表1
| 組 | 免疫原組合物 | 注射體積(微升) | 小鼠的數量 |
| A | 安慰劑 | 100 | 8 |
| B | 重組融合蛋白 + CpG | 100 | 10 |
| C | 重組融合蛋白+ VET-SAP | 100 | 3 |
[天冬氨酸內肽酶之IgG抗體的ELISA分析]
天冬氨酸內肽酶之IgG抗體的ELISA分析的實驗步驟：將3-10隻小鼠的血清（每隻小鼠10 μL）混合到同一管中。將每組血清稀釋1000倍後，將100微升血清稀釋液添加到Biocheck legumain ELISA試劑盒的抗原盤的一個孔洞中（塗覆1 微克/孔洞的天冬氨酸內肽酶)，並在37°C反應30分鐘。用1X的PBST洗滌4次後，加入100微升的anti-mouse-IgG-HRP（1：10000），並在37°C反應30分鐘。用1X的PBST洗滌4次後，加入100微升的3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB），並在室溫反應15分鐘。在加入100微升1N的H2
SO4
之後，用酵素免疫分析儀（ELISA reader）測量於450 nm波長下的訊號。
圖1A是以酵素免疫分析法來檢測實施例2的不同測試組的小鼠中的天冬氨酸內肽酶的抗體的結果。橫軸表示注射安慰劑/免疫原組合物前（B0）、在第一次安慰劑/免疫原組合物注射之後（A1）、在第二次安慰劑/免疫原組合物注射之後（A2）以及第三次安慰劑/免疫原組合物注射之後（A3）的每組小鼠的血清。縱軸表示在450 nm波長下的光學密度(optical density，OD)的讀值，其可以代表血清中天冬氨酸內肽酶的抗體的相對量。根據圖1A的結果，相較於A組與B組在B0時的天冬氨酸內肽酶的抗體量，A組和B組在A1、A2、A3時的天冬氨酸內肽酶的抗體量沒有顯著變化。然而，在A2及A3時，來自C組（注射了包括重組融合蛋白和VET-SAP的免疫原組合物）的天冬氨酸內肽酶的抗體量顯著高於A組（僅注射了安慰劑）的天冬氨酸內肽酶的抗體量。
因此可以看出，包括重組融合蛋白和VET-SAP的免疫原組合物，可以在具有小鼠乳腺腫瘤細胞的小鼠中成功地誘導特異性免疫反應，例如抗體免疫反應。
[通過體內成像系統（IVIS）檢測腫瘤細胞]
圖1B至圖1D是以體內成像系統來檢測實施例2的不同測試組的小鼠中的4T1/luc小鼠乳腺腫瘤細胞的結果。注射小鼠乳腺腫瘤細胞後32天，使用體內成像系統檢測A至C組小鼠中的4T1/luc小鼠乳腺腫瘤細胞的信號。根據圖1B的結果，A組中有4/8隻（約50 %）小鼠在體內（不含尾巴）具有腫瘤細胞。在圖1C中，B組中有2/10（約20 %）隻小鼠（不包括尾巴）在體內具有腫瘤細胞。在圖1D中，C組有有1/3隻（約33 %）小鼠在體內（不包括尾巴）具有腫瘤細胞。
因此可以看出，包括重組融合蛋白和CpG/VET-SAP的免疫原組合物，可以成功地降低具有小鼠乳腺腫瘤細胞的小鼠發生癌症轉移的風險。此外，在C組中，包括重組融合蛋白和VET-SAP的免疫原組合物可以至少通過產生天冬氨酸內肽酶的抗體來降低癌症轉移的風險。在B組中，儘管未檢測到天冬氨酸內肽酶的抗體，但它被相信，包括重組融合蛋白和CpG的免疫原組合物可能觸發對天冬氨酸內肽酶的細胞免疫反應，從而降低了癌症轉移的風險。
實施例 3
：免疫原組合物對患有乳腺腫瘤的狗的影響
在該實驗例中，將具有乳腺腫瘤的狗分為兩組，每組有1隻狗，如表2所示。在手術切除腫瘤之前，通過皮下注射向α組和β組注射包括重組融合蛋白和VET-SAP的免疫原組合物。免疫原組合物注射3次。在測量腫瘤體積之後，在第0天分別在α組和β組中注射第一劑免疫原組合物。接下來，在第10天和第16天分別將第二劑和第三劑的免疫原組合物注射到α組中。在第10天和第16天分別將第二劑和第三劑的免疫原組合物注射到β組中。在第32天，以手術切除了α組的乳腺腫瘤。
在第0、10、16、24和32天收集來自α組和β組的血液樣品。血液樣品中的血清用於天冬氨酸內肽酶之IgG抗體的ELISA分析。在第0、10、16、24和32天測量β組的乳腺腫瘤的體積。
表2
| 組 | 免疫原組合物 | 注射體積(微升) | 狗的數量 |
| α | 重組融合蛋白 + VET-SAP | 1000 | 1 |
| β | 重組融合蛋白 + VET-SAP | 1000 | 1 |
[天冬氨酸內肽酶之IgG抗體的ELISA分析]
天冬氨酸內肽酶之IgG抗體的ELISA分析的實驗步驟：在每組血清稀釋1000倍後，將100微升血清稀釋液添加到Biocheck legumain ELISA試劑盒的抗原盤的一個孔洞中（塗覆1 微克/孔洞的天冬氨酸內肽酶)，並在37°C反應30分鐘。用1X的PBST洗滌4次後，加入100微升的anti-mouse-IgG-HRP（1：10000），並在37°C反應30分鐘。用1X的PBST洗滌4次後，加入100微升的3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB），並在室溫反應15分鐘。在加入100微升1N的H2
SO4
之後，用酵素免疫分析儀（ELISA reader）測量於450 nm波長下的光學密度。
圖2A是以酵素免疫分析法來檢測實施例3的不同測試組的狗中的天冬氨酸內肽酶的抗體的結果。橫軸表示在第0、10、16和24天時每組的狗的血清。縱軸表示在450 nm波長下的光學密度(optical density，OD)的讀值，其可以代表血清中天冬氨酸內肽酶的抗體的相對量。根據圖2A的結果，α組和β組在第10、16和24天的天冬氨酸內肽酶的抗體量顯著高於α組和β組在第0天的天冬氨酸內肽酶的抗體量。因此，可以看出，包括重組融合蛋白和VET-SAP的免疫原組合物，可以在患有乳腺腫瘤的狗中成功地誘導特異性免疫反應，例如抗體免疫反應。
[α組中的乳腺腫瘤的體積的測量]
圖2B是檢測實施例3的狗的乳腺腫瘤的體積的結果。在注射第一劑免疫原組合物之前，在第0天測量α組中的乳腺腫瘤的大小。測量後，如圖2B所示，α組中的乳腺腫瘤的尺寸為約85×95×100mm，α組中的乳腺腫瘤的體積為約403,750 mm3
（85×95×100×1/2）。接下來，還在第10、16、24和32天測量α組的乳腺腫瘤體積。根據圖2B的結果，在第二劑注射（第10天）後，腫瘤體積明顯變小。此外，獸醫還觀察到腫瘤開始軟化。接下來，在第32天以手術切除腫瘤，且在手術切除腫瘤後，未觀察到復發。因此可以看出，包含重組融合蛋白和VET-SAP的免疫原組合物可以成功地地降低患有乳腺腫瘤的狗發生癌症轉移的風險。
根據以上的實施例，重組融合蛋白包括位於重組融合蛋白的N端的受體相關蛋白1（RAP1）、位於受體相關蛋白1（RAP1） 的C端的分化簇28-假單胞菌外毒素A轉位結構域（CD28-Pet）融合多胜肽、位於分化簇28-假單胞菌外毒素A轉位結構域（CD28-Pet）融合多胜肽的C端的天冬氨酸內肽酶（legumain）蛋白，以及位於天冬氨酸內肽酶（legumain）蛋白的C端的標靶胜肽（target peptide）。此外，本揭露的包括重組融合蛋白的免疫原組合物用於在罹癌的受試者中有效地誘導特異性免疫反應，因此降低了該受試者的癌症轉移和復發的風險。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
無
包括附圖以便進一步理解本發明，且附圖併入本說明書中並構成本說明書的一部分。附圖說明本揭露的實施例，並與描述一起用於解釋本發明的原理。
圖1A是以酵素免疫分析法來檢測實施例2的不同測試組的小鼠中的天冬氨酸內肽酶的抗體的結果。
圖1B至圖1D是以體內成像系統來檢測實施例2的不同測試組的小鼠中的4T1/luc小鼠乳腺腫瘤細胞的結果。
圖2A是以酵素免疫分析法來檢測實施例3的不同測試組的狗中的天冬氨酸內肽酶的抗體的結果。
圖2B是檢測實施例3的狗的乳腺腫瘤的體積的結果。
Claims (11)
- 一種重組融合蛋白，包括：受體相關蛋白1，位在所述重組融合蛋白的N-端；分化簇28-假單胞菌外毒素A轉位結構域融合多胜肽，位在所述受體相關蛋白1的C端；天冬氨酸內肽酶蛋白，位在所述分化簇28-假單胞菌外毒素A轉位結構域融合多胜肽的C端；以及標靶胜肽，位在所述天冬氨酸內肽酶蛋白的C端。
- 如請求項1所述的重組融合蛋白，其中所述重組融合蛋白包括SEQ ID NO：1的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的重組融合蛋白，其中所述重組融合蛋白包括由SEQ ID NO：2的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的重組融合蛋白，其中所述天冬氨酸內肽酶蛋白為人類重組蛋白。
- 如請求項1所述的重組融合蛋白，其中所述標靶胜肽為內質網保留序列。
- 一種免疫原組合物，用於在罹癌的受試者中誘導特異性免疫反應，所述免疫原組合物包括：如請求項1所述的重組融合蛋白；以及佐劑，其中所述癌為天冬氨酸內肽酶過度表達癌，所述受試者包括人類和非人類的哺乳類動物。
- 如請求項6所述的免疫原組合物，其中所述佐劑包括CpG寡聚去氧核苷酸或基於皂苷佐劑。
- 如請求項7所述的免疫原組合物，其中所述CpG寡聚去氧核苷酸的濃度為0.2毫克/毫升。
- 如請求項7所述的免疫原組合物，其中所述基於皂苷佐劑的濃度為0.2毫克/毫升。
- 如請求項6所述的免疫原組合物，其中所述重組融合蛋白與所述佐劑的重量比為1：1至12.5：1。
- 如請求項6所述的免疫原組合物，其中所述天冬氨酸內肽酶過度表達癌包括乳腺癌、乳腺腫瘤、前列腺癌、胃癌、大腸直腸癌、卵巢癌或黑色素瘤。
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