TWI392731B

TWI392731B - 含有ｃｔｇｆ編碼之ｄｎａ構築體的ｄｎａ疫苗及其應用

Info

Publication number: TWI392731B
Application number: TW97136292A
Authority: TW
Inventors: Wen Fang Cheng; Chi An Chen
Original assignee: Univ Nat Taiwan
Priority date: 2008-09-22
Filing date: 2008-09-22
Publication date: 2013-04-11
Also published as: TW201012924A

Description

含有CTGF編碼之DNA構築體的DNA疫苗及其應用

本發明係關於一種含有DNA構築體之DNA疫苗。本發明亦關於前述DNA疫苗之醫藥組成物及其生產方法。

子宮頸癌是女性的主要死亡原因之一，目前已知高風險型人類乳突病毒(Human Papillomavirus，HPV)如HPV亞型16(HPV-16)的持續性感染與子宮頸癌的發展與進程是直接相關的。雖然現有的HPV疫苗可被用於預防子宮頸癌，但還不知道它們是否能夠用於治療HPV相關之子宮頸癌或減輕既有的HPV感染或HPV相關病變。因此，發展出一種安全有效的治療性疫苗來治療HPV相關之子宮頸癌、HPV相關之其他生殖道癌症(如陰道、外陰、陰莖)和其他位於頭頸部和胃腸系統之HPV相關病變、及治療相同部位的癌前病變是很有用的。

近年來，已在多種疾病模型中開發並評估了DNA疫苗，它被視為一種前瞻性治療劑，可用以治療多種疾病，包括在某些癌症當中作為免疫療法來使用。治療性DNA疫苗係被引入接受者之免疫系統的抗原呈獻細胞(APC)中，以表現蛋白抗原，該蛋白抗原係由第I類及第II類的主要組織相容抗原(MHC)分子來處理並呈獻，以誘導免疫反應，如輔助型T細胞反應、毒殺型T細胞反應及體液性 (抗體)反應，而這會直接導致有表現前述抗原之腫瘤細胞被免疫系統所清除。

與「傳統」(蛋白抗原)疫苗相較之下，DNA疫苗有多種優點，如高特異性、安全性、穩定性、成本效用(cost-effectiveness)，以及誘導數種類型免疫反應的能力。與「活菌」及「減毒」疫苗相較之下，DNA疫苗不具任何感染風險，因為它的製程中只有用到病原體DNA中的某些序列。另外，DNA疫苗在實際使用上不需要具有毒性的佐劑。而DNA疫苗在製備上也比「次單位」疫苗(subunit vaccine)來得簡單，因為它在注射到病人身上之前不需要進行蛋白抗原的表現及純化。

然而，APC細胞的壽命有限，所以DNA疫苗的效度也會因為APC細胞無法無限期地處理與呈獻抗原而受到限制。因此，已有數種策略被用來增加DNA疫苗的效度，如：藉由融合分子來導向抗原，以增強抗原處理(Cheng et al.,2001；Chen et al.,2000)；以快速胞內降解(rapid intracellular degradation)的抗原作為導向目標(Rodriguez et al.,1997)；將之與一APC受體之配位體(Boyle et al.,1998)或與一病原體序列(如破傷風毒素之片段C)(King et al.,1998)融合，來使抗原移往APC細胞；將之與細胞激素共同注射(Weiss et al.,1998)、以及將之與CpG寡核苷酸共同給予病人(Klinman et al.,1997)。

目前已有一些用來增強DNA疫苗效果的合併策略被引入癌症疫苗和免疫療法的開發，而過度表現抗細胞凋亡分子是一種可能能夠克服APC細胞壽命過短的策略。舉例來說，給予一包含具有抗原及樹突細胞(DC)凋亡抑制物之編碼片段的DNA疫苗，可以延長DC細胞的存活時間，從而增強DNA疫苗的效度(Kim et al.,2003)。其他研究顯示，併用腫瘤抗原與細胞凋亡抑制物(如Bcl-X1、Bcl-2、XIAP、負顯性胱冬肽酶-9(dominant negative caspase-9)或負顯性胱冬肽酶-8)可以增強抗原特異性免疫及抗腫瘤效應(Kim et al.,2003；Kim et al.,2004；Kim et al.,2005)。因此，可以透過在活體內抑制細胞凋亡並延長有表現抗原之DC細胞存活時間這樣的策略來增強以DC細胞為主的免疫。然而，已知有某些細胞凋亡抑制物(如Bcl-2家族蛋白)會在某些癌症中有過度表現的情形，這顯示它們與細胞不朽化作用(cellular immortalization)有關，必須注意這方面的安全問題。

有鑑於習知DNA疫苗的缺失，本發明之一目的係開發一種效度有所改善的DNA疫苗，其包含一得自結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)基因之序列及一得自人類乳突病毒E6及/或E7基因之序列。CTGF和選自E6及/或E7之HPV序列的組合會增強接受者的免疫反應，並得到更有效的抗腫瘤效果。

本發明之另一目的係提供一種醫藥組成物，其包含前述DNA疫苗及一選擇性醫藥可接受載劑。本發明之又一目的係提供一種生產前述DNA疫苗之方法。

為了達到上述目的，本發明提供一種DNA構築體，其包含：一表現載體，其可在真核細胞中表現；以及一核苷酸片段，其包含一CTGF編碼序列及一HPV序列，其中前述HPV序列係選自E6編碼序列、E7編碼序列、或其組合。

前述E6編碼序列及E7編碼序列係可得自HPV之所有亞型，特別是得自HPV-16者。

在較佳實施態樣中，前述表現載體係可在人類細胞中表現；更佳者，前述表現載體係選自pcDNA3、pSG5或pCMV；最佳者，前述表現載體為pcDNA3。

在較佳實施態樣中，前述CTGF編碼序列為SEQ ID NO：3，前述E6編碼序列為SEQ ID NO：6，且前述E7編碼序列為SEQ ID NO：9。

本發明亦提供一種DNA疫苗，其包含：上述DNA構築體；以及一顆粒，其係以前述DNA構築體加以包覆。

在較佳實施態樣中，前述顆粒為金質顆粒；更佳者，前述金質顆粒之直徑為1.6 μm。

在較佳實施態樣中，前述表現載體係可在人類細胞中表現；更佳者，前述表現載體係選自 pcDNA3、pSG5或pCMV；最佳者，前述表現載體為pcDNA3。

本發明另提供一種醫藥組成物，其包含上述DNA疫苗。

在較佳實施態樣中，前述醫藥組成物進一步包含一醫藥可接受載劑；更佳者，前述醫藥可接受載劑為ddH₂O或PBS(磷酸鹽緩衝溶液)。

在較佳實施態樣中，前述醫藥組成物係用於治療HPV所引起的疾病；更佳者，係用於治療生殖道癌症(如子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、陰莖癌)或癌前病變(如子宮頸、外陰或陰道之癌前病變)、頭頸部癌症(如口咽部鱗狀細胞癌(oropharyngeal squamous cell carcinoma))或胃腸道癌症(如食道癌或大腸直腸癌)；最佳者，係用於治療子宮頸癌。

本發明又提供一種生產上述DNA疫苗之方法，其包含：(1)提供一DNA構築體，其中前述DNA構築體包含：一表現載體，其可在真核細胞中表現；以及一核苷酸片段，其包含一CTGF編碼序列及一HPV序列，其中前述HPV序列係選自E6編碼序列、E7編碼序列、或其組合；以及(2)將前述DNA構築體包覆在顆粒表面。

在較佳實施態樣中，前述表現載體為pcDNA3；前述CTGF編碼序列為SEQ ID NO：3，前述E6編碼序列為SEQ ID NO：6，且前述E7編碼序列為SEQ ID NO：9；更佳者，前述顆粒為金質顆粒；最佳者，前述金質顆粒之直徑為1.6 μm。

本發明進一步提供預防或治療HPV所引起的疾病之方法，其包含：對已罹患前述HPV所引起的疾病或有發展出該疾病之風險的病患給予有效量之上述DNA疫苗或有效量之上述醫藥組成物。

在較佳實施態樣中，前述HPV所引起的疾病為生殖道癌症或癌前病變、頭頸部癌症或胃腸道癌症；更佳者，前述生殖道癌症包含子宮頸癌、陰道癌、外陰癌及陰莖癌；前述生殖道癌前病變包含子宮頸、外陰及陰道之癌前病變；前述頭頸部癌症包含口咽部鱗狀細胞瘤；且前述胃腸道癌症包含食道癌、大腸直腸癌及肛門癌，以及其癌前病變；最佳者，前述HPV所引起的疾病為子宮頸癌。

綜上所述，本發明提供一種DNA疫苗，其包含一DNA構築體，且該DNA構築體包含：一可在真核細胞中表現之表現載體、以及一包含CTGF編碼序列及HPV序列的核苷酸片段，其中前述HPV序列係選自E6編碼序列及/或E7編碼序列；該疫苗具有優異的效用，可被用於治療HPV所引起的疾病。此外，本發明亦提供前述DNA疫苗之醫藥組成物及其生產方法。

因為HPV之早期基因(early gene)在HPV的整個生命週期都會表現，所以這些早期基因可用作治療性HPV疫苗之目標抗原。我們特別想要將HPV早期基因E6和E7(由於它們具有使宿主細胞轉型的能力，也被稱為致癌基因)用於DNA疫苗，來治療HPV所引起的疾病，包括生殖道、頭頸部及胃腸道的癌症及相關癌前病變。然而，有許多DNA疫苗沒有足夠的免疫原性(immunogenicity)，所以不能說它們是有用的疫苗，這是因為這些包含疫苗在內的DNA無法在活體內放大或散播，而在有用的治療性DNA疫苗之製造過程中，抗原的處理與呈獻扮演了一個很重要的角色。

結締組織生長因子(CTGF)是一種富含半胱胺酸(cysteine)的蛋白，最早是在人類臍靜脈內皮細胞的條件培養基(conditioned medium)當中找到的。近年來，已顯示CTGF會抑制雞胚胎纖維母細胞及人類橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)細胞的細胞凋亡，也會提高內皮細胞的存活率。CTGF也會讓細胞得到抗細胞凋亡之表型(apoptosis-resistant phenotype)，這一點和IGF-II在骨骼肌母細胞(skeletal myoblast)中的作用是類似的。

下列實施例係用於進一步描述本發明的重要性，而非意圖限制本發明之申請專利範圍。尤其重要的是，在本發明中所提及的「E6」及「E7」係指人類乳突病毒之任一亞型的E6及E7基因。

實施例

DNA構築及製備

CTGF係使用聚合酶連鎖反應(PCR)加以放大，其係以人類胎盤互補DNA(complementary DNA)作為模板，並使用下列引子對：5’-CCGGTCTAGACAACCATGACCGCCGCCAGT-3’(SEQ ID NO：1)及5’-CCGGAAT TCGTTCAAGTTCCAGTCTAATG-3’(SEQ ID NO：2)。之後將放大的CTGF核苷酸序列(SEQ ID NO：3)選殖到pcDNA3載體(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)之XbaI/EcoRI位置，來生產pcDNA3-CTGF。

E6係使用PCR加以放大，其係以CaSki細胞株(一種含有經嵌入之HPV 16基因體的細胞株，得自ATCC)之DNA作為模板，並使用下列引子對：5’-GGGGAATTCATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGT-3’(SEQ ID NO：4)及5’-CCCAAGCTTTTACAGCTGGGTTTCTCTACGTGTTCT-3’(SEQ ID NO：5)。之後將放大的E6核苷酸序列(SEQ ID NO：6)分別選殖到pcDNA3和pcDNA3-CTGF之EcoRI/HindIII位置內，來生產pcDNA3-E6和pcDNA3-CTGF/E6。另外，E7係使用PCR加以放大，其係以CaSki細胞株之DNA作為模板，並使用下列引子對：5’-CCGGAAGCTTATGCATGGAGATACACCTAC-3’(SEQ ID NO：7)及5’-CCCAAGCTTTTGAGAACAGA TGG-3’(SEQ ID NO：8)。之後將放大的E7核苷酸序列(SEQ ID NO：9)分別選殖到pcDNA3和pcDNA3-CTGF之HindIII位置內，來生產pcDNA3-E7和pcDNA3-CTGF/E7。

將放大的E7核苷酸序列(SEQ ID NO：9)選殖到pcDNA3-CTGF/E6之HindIII位置內，以生產pcDNA3-CTGF/E6/E7。

前述pcDNA3-CTGF/E6所含有的CTGF和E6核苷酸序列會合成一連續的開放讀碼區(open reading frame)，故此構築體會表現出包含CTGF和E6之融合蛋白。同樣地，pcDNA3-CTGF/E7會表現出包含CTGF和E7之融合蛋白，而pcDNA3-CTGF/E6/E7會表現出包含CTGF、E6和E7之融合蛋白。

其後，以HindIII來消化pcDNA3-CTGF/E7，再以由質體pcDNA3-E7/GFP(得自Johns Hopkins Medical Institutes的吳子丑博士)經EcoRI/NotI消化作用得出的GFP片段補上，連接，來生產pcDNA3-CTGF/E7/GFP。所有DNA構築體均以DNA定序加以確認，而DNA構築體之示意圖係顯示於第一圖。

小鼠

下文所描述的研究係使用六至八週大的雌性 C57BL/6J小鼠以五隻一組的方式來進行。所有的動物實驗均依據已核可的程序並依照實驗動物之適當使用及照護方面的建議在國立臺灣大學醫學院動物中心進行。

DNA免疫作用

製備經DNA包覆之金質顆粒，並使用氦氣基因槍來進行由顆粒所中介的DNA免疫作用，其係以低壓加速式基因槍(生物鎵科技股份有限公司，台灣台北)來進行。將金質顆粒(Bio-Rad 1652263)稱重並懸浮於70%乙醇中。此懸浮液經劇烈震盪後，離心並收集顆粒。在以蒸餾水清洗三次後，將0.025 μg收集到的金質顆粒置入Eppendorf管中，並與100 μL之0.05 M亞精胺(spermidine)震盪混合，並對混合物進行超音波處理10至20秒。接下來，加入溶於25 μL ddH₂O之25 μg DNA，並將混合物加以震盪。加入100 μL的1 M CaCl₂，並將最終混合物加以震盪，在冰上培養10分鐘，透過亞精胺將DNA包覆在金質顆粒上。最後，經包覆之顆粒以100%乙醇清洗三次，並且再懸浮於200至250μL之100%乙醇中。這些經DNA包覆之金質顆粒懸浮液係作為基因槍的子彈。溶於ddH₂O或PBS中的裸DNA(naked DNA)也可作為子彈使用。使用氦氣排氣壓力為50 psi之低壓加速式基因槍將經DNA包覆之金質顆粒從已剃毛的腹部送入小鼠體內。

細胞內之細胞激素染色及流式細胞分析

首先，各組小鼠係以下列DNA疫苗當中的一種來進行免疫：pcDNA3(無插入序列)、pcDNA3-E7、pcDNA3-CTGF、pcDNA3-E7+pcDNA3-CTGF、以及pcDNA3-CTGF/E7(2 μg DNA構築體/2 μg金質顆粒/小鼠)；所有小鼠在一週後接受補強(boost)免疫。其中小鼠未進行免疫的DNA原態(naïve)組係作為陰性對照組。補強一週後，犧牲小鼠，收取牠們的脾臟細胞，將之與1 μg/ml之短E7胜肽RAHYNIVTF(aa 49-57，SEQ ID NO：10)或10 μg/ml之長E7胜肽DSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRL(aa 30-67，SEQ ID NO：11)共同培養。一般來說，短E7胜肽可以直接呈獻；而長E7胜肽則需要先被APC細胞攝入，之後才進行處理與呈獻。將細胞與前述之短或長E7胜肽混合16至20小時。其後，加入1 μL/mL Golgistop(PharMigen,San Diego,CA)，來預防細胞激素(如IFN-γ或IL-4)分泌。六小時後，收取細胞，移到管子裡，之後在1,200-1,600 rpm於4℃離心5分鐘。其後，以500 μL FACScan緩衝液(溶於PBS之0.5% BSA)清洗細胞，於4℃再離心5分鐘。細胞再懸浮於以50 μL FACScan緩衝液加以稀釋之1 μL(0.5 μg)與PE共軛結合之抗CD4或抗CD8抗體(PharMingen)，並將細胞避光培養30分鐘。之後細胞以FACScan緩衝液清洗兩次並離心。這些細胞再懸浮於500 μL固定緩衝液，在冰上避光20分鐘；接下來，將細胞再次離心，並以500 μL Perm Wash緩衝液(BioLegend Biotech)清洗。將1 μL(0.5 μg)與FITC共軛結合之抗IFN-γ抗體(PharMingen)或抗IL-4抗體(Biolegend,San Diego,CA)稀釋到50 μL Perm Wash緩衝液中，將之加入前述細胞，並在冰上避光培養30分鐘。將細胞離心並以500 μL Perm Wash緩衝液清洗兩次。之後將細胞再懸浮於300至500 μL FACScan緩衝液，並以流式細胞法加以分析。所有經雙重染色的細胞均以配備CELLQuest software(Becton Dickinson Immuno-cytometry System,Mountain View,Calif.,USA)的FACScan或FACSCalibur以標準程序進行分析。結果顯示於第二圖。

第二圖a顯示了各免疫組中E7特異性之IFN-γ分泌性CD8⁺ T淋巴球的流式細胞分析，而第二圖b及第二圖c的柱狀圖則分別描繪出每3.5×10⁵個脾臟細胞中E7特異性之IFN-γ分泌性CD8⁺ T淋巴球和E7特異性之IFN-γ分泌性CD4⁺ T淋巴球的數目。此外，第二圖d的柱狀圖則描繪出每3.5×10⁵個脾臟細胞中E7特異性之IL-4分泌性CD4⁺ T淋巴球的數目。這些數據顯示，以CTGF/E7進行免疫這一組的小鼠會比其他組生產出更多的E7特異性之IFN-γ分泌性CD8⁺ T淋巴球和E7特異性之IL-4分泌性CD4⁺ T淋巴球。易言之，CTGF/E7可活化毒殺型T淋巴球(第二圖b)和Th2路徑(第二圖d)，但不會活化Th1路徑(第二圖c)。

同樣地，另外五組小鼠亦以上述步驟進行免疫並犧牲，但使用下列DNA疫苗：pcDNA3-CTGF/E7、pcDNA3-CTGF/E6、pcDNA3-CTGF/E6/E7、及pcDNA3-CTGF/E6+pcDNA3-CTGF/E7。之後將這些小鼠的脾臟細胞與1 μg/ml之短E7胜肽(即SEQ ID NO：10)或1 μg/ml 之短E6胜肽LCIVYRDG(aa 50-57，SEQ ID NO：12)共同培養16至20小時，並進行上述處理，定出每3.5×10⁵個脾臟細胞中E6及/或E7特異性之IFN-γ分泌性CD8⁺ T淋巴球的數目。第三圖a及第三圖b分別顯示了上述免疫組中E7特異性之IFN-γ分泌性CD8⁺ T淋巴球及E6特異性之IFN-γ分泌性CD8⁺ T淋巴球的流式細胞分析。在第三圖c中，pcDNA3-CTGF/E7、pcDNA3-CTGF/E6/E7及pcDNA3-CTGF/E6+pcDNA3-CTGF/E7組的E7特異性之IFN-γ分泌性CD8⁺ T淋巴球有增加，而pcDNA3-CTGF/E6、pcDNA3-CTGF/E6/E7及pcDNA3-CTGF/E6+pcDNA3-CTGF/E7組的E6特異性之IFN-γ分泌性CD8⁺ T淋巴球有增加。這些數據顯示，CTGF與E6或E7之間的物理性連結對於增強E6或E7特異性之IFN-γ分泌性CD8⁺ T淋巴球活性來說是必要的。也就是說，CTGF/E6/E7也可以活化毒殺性T淋巴球。同樣地，它會活化Th2路徑，但不會活化Th1路徑(數據未顯示)。

抗E7抗體之酶標記免疫吸附測定法(ELISA)

在最後一次免疫後14天時，抽取所有小鼠的血清，並藉由下述直接酶標記免疫吸附測定法將之用於偵測HPV-16之E7特異性抗體。

將100 μL得自細菌的HPV-16 E7蛋白(0.5 μg/ml)塗覆在一96-微孔盤上，並於4℃培養隔夜。之後這些孔洞以含有20%胎牛血清之PBS於37℃封阻(block)2小時，之後加入100 μL在PBS中以1：100、1：500或1：1,000比率稀釋的血清，再將孔盤於37℃培養2小時。之後這些孔洞以含有0.05% Tween 20之PBS加以清洗，再以與過氧化酶共軛結合之兔子的抗小鼠IgG抗體(Zymed,San Francisco,CA)1：2,000稀釋液於室溫培養1小時。清洗孔盤，以1-Step Turbo TMB-ELISA(Pierce,Rockford,IL)來顯色，之後以1M H₂SO₄中止反應，並以標準ELISA分析儀在450 nm讀取ELISA盤。

第二圖e顯示了在以各種DNA疫苗進行免疫之小鼠身上的E7特異性抗體。以CTGF/E7 DNA疫苗進行免疫之小鼠的效價會比其他組要來得高。

活體內腫瘤保護實驗

為了測定我們觀察到E7特異性T細胞免疫性增強的情形是否能夠轉化為明顯的E7特異性之保護性抗腫瘤效應，進行下列活體內腫瘤保護實驗。各組小鼠係以pcDNA3(無插入序列)、pcDNA3-E7、pcDNA3-CTGF、pcDNA3-E7+pcDNA3-CTGF、或pcDNA3-CTGF/E7進行免疫(2 μg/小鼠)，且所有小鼠在一週後接受補強。在補強一週後，對小鼠皮下注射5×10⁴個TC-1細胞/小鼠，進行攻毒(challenge)。這些小鼠會受到監測，直到TC-1攻毒後60天為止。小鼠未進行免疫的原態組係作為陰性對照組。

TC-1細胞係在補充有10%(vol/vol)胎牛血清、50單位/mL之青黴素/鏈黴素、2 mM L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉、2 mM非必須胺基酸(Gibco company) 及0.4 mg/mL G418之RPMI-1640中於37℃及5% CO₂下生長。在腫瘤攻毒日時，利用胰蛋白酶消化作用將TC-1細胞收取下來，以1×PBS清洗兩次，最後再懸浮於TC-1攻毒用的1×Hanks緩衝鹽溶液。

在以TC-1腫瘤細胞進行攻毒後，100%接受CTGF/E7 DNA疫苗的小鼠在第60天時都保持在無腫瘤狀態，而其他組別的所有小鼠(包括E7組)都在TC-1攻毒後14天內發展出腫瘤。結果顯示於第四圖a。

同樣地，如第四圖b所示，另外五組小鼠亦以上述步驟進行免疫及攻毒，但使用下列DNA疫苗：pcDNA3-E7、pcDNA3-CTGF/E6、pcDNA3-CTGF/E7、pcDNA3-CTGF/E6/E7、及pcDNA3-CTGF/E6+pcDNA3-CTGF/E7。100%接受CTGF/E6、CTGF/E7、CTGF/E6/E7或CTGF/E6+CTGF/E7疫苗的小鼠在第60天時都保持在無腫瘤狀態。這些結果顯示，CTGF與抗原E6及/或E7的融合對於有表現E6及/或E7之TC-1腫瘤細胞的抗腫瘤活性來說是必要的。

活體內抗體耗盡(antibody depletion)實驗

為了決定淋巴球亞群(CD4⁺ T淋巴球、CD8⁺ T淋巴球及NK淋巴球)是否在抗腫瘤效應中扮演重要角色，我們進行了一項活體內抗體耗盡實驗。小鼠係以CTGF/E7 DNA疫苗進行免疫，一週後補強，之後接受淋巴球亞群的耗盡處理，其中單株抗體 GK1.5係用於CD4耗盡(Berkeley Antibody Company)，單株抗體2.43係用於CD8耗盡(Berkeley Antibody Company)，而單株抗體PK136係用於自然殺手細胞(Natural Killer)1.1⁺耗盡(Berkeley Antibody Company)。

將這些單株抗體以腹腔注射方式送入小鼠體內。耗盡一週後，所有組別的小鼠均以5×10⁴個TC-1細胞/小鼠進行攻毒。流式細胞分析顯示這些特定淋巴球亞群有99%已耗盡，但其他亞群則維持在正常數量(數據未顯示)。所有小鼠都在進行腫瘤攻毒後第40天終止實驗。

所有原態組的小鼠和所有CD8⁺ T細胞耗盡的小鼠都在TC-1攻毒後14天內長出腫瘤。相反地，如第五圖所示，所有未進行耗盡處理的小鼠、以及所有CD4⁺ T細胞耗盡或自然殺手細胞1.1⁺細胞耗盡的經免疫小鼠在TC-1腫瘤攻毒後60天時都保持在無腫瘤狀態。這些結果顯示，這項結果表示，CD8⁺ T細胞對CTGF/E7 DNA疫苗所產生的抗腫瘤免疫性來說是很重要的。

活體內腫瘤治療實驗

由於肺臟血行性散播(lung hematogenous spread)的模型與癌症轉移相似，所以藉由這個模型來評估CTGF/E7嵌合型DNA疫苗(chimeric CTGF/E7 DNA vaccine)的治療效力(參見Cheng et al.,2005a)。在本實驗中，係將5×10⁴個TC-1細胞由尾部靜脈注射到小鼠身上。兩天後，各組小鼠係以pcDNA3(無插入序列)、pcDNA3-E7、pcDNA3-CTGF或pcDNA3-CTGF/E7進行免疫(16 μg/小鼠)，之後每7天進行一次補強免疫。TC-1攻毒28天後，犧牲小鼠，並將其肺臟摘除。由不知道樣本組別的實驗者來估算並計算各組小鼠之肺部腫瘤結節。小鼠未進行免疫的原態組係作為陰性對照組。

各組經免疫之小鼠的代表性肺部腫瘤結節係顯示於第六圖a，而各組經免疫之小鼠的肺部腫瘤結節數目顯示於第六圖b。與其他組別的小鼠相較之下，以CTGF/E7進行免疫之小鼠的肺部腫瘤結節明顯較少。

由經免疫之小鼠的腹股溝淋巴結製備CD11c ⁺ 樹突細胞

用基因槍在小鼠腹部進行pcDNA3-GFP、pcDNA3-E7/GFP或pcDNA3-CTGF/E7/GFP的皮內注射。在進行免疫1天或5天後，收取所有小鼠的腹股溝淋巴結。再使用CD11c(N418)微顆粒(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)從淋巴結中富集(enrich)細胞表面有CD11c⁺表現的樹突細胞。使用膜聯蛋白V-PE之細胞凋亡偵測套組(annexin V-PE apoptosis detection kit，BD Bioscience,San Diego,CA)來偵測GFP⁺ CD11c⁺細胞中的凋亡細胞，而以流式細胞法來計算凋亡細胞之百分比。小鼠未進行免疫的原態組係作為陰性對照組。此外，將2×10⁴個上述經富集之CD11c⁺樹突細胞與2×10⁶ 個E7特異性之CD8⁺ T細胞株共同培養(參見Kim et al.,2003)。之後將這些細胞做表面CD8及細胞內IFN-γ兩種染色，再如上述以流式細胞法加以分析。

細胞凋亡偵測套組的結果係顯示於第七圖a-c。如第七圖a所示，在進行免疫後第1天時，各組腹股溝淋巴結中的GFP⁺ CD11c⁺細胞數目並無明顯差異。然而在第5天時，我們發現，與以E7/GFP和僅以GFP進行免疫的組別相較之下，從以CTGF/E7/GFP進行免疫之小鼠收取下來的淋巴結中的GFP⁺ CD11c⁺細胞百分比會比較高。

我們進一步測定從各組小鼠之腹股溝淋巴結中取得之GFP⁺ CD11c⁺細胞的細胞凋亡情形。與以GFP或E7/GFP進行免疫之小鼠相較之下，以帶有CTGF/E7/GFP之DNA進行免疫之小鼠的凋亡細胞百分比明顯較低，如第七圖b所示。易言之，樹突細胞之細胞凋亡會被CTGF/E7免疫作用所抑制。

我們並估算了這些經富集之CD11c⁺樹突細胞在刺激IFN-γ分泌方面的能力。如第七圖c所示，我們比較了在以基因槍進行免疫後1天和5天時的經富集之CD11c⁺樹突細胞。與以GFP和E7/GFP進行免疫之小鼠相較之下，從以CTGF/E7/GFP進行免疫之小鼠分離出來的CD11c⁺樹突細胞在活化E7特異性之CD8⁺ T細胞株分泌IFN-γ方面是比較有效的。

由於E6和E7蛋白顯示為HPV治療性疫苗開發的理想目標，會導向E6和E7兩種蛋白之DNA疫苗能夠得到比單獨導向E6或E7之疫苗更好的免疫反應及抗腫瘤效應。我們先前的研究也顯示，與單用E6 DNA或E7 DNA的情況相較之下，帶有E6及E7這兩種DNA疫苗對抗有表現HPV E6及E7之腫瘤的治療性抗腫瘤效應明顯較佳。這些結果顯示，在對抗有表現E6/E7之腫瘤時，同時以E6及E7作為導向目標會得到較佳的治療效果。

統計分析

以平均值±SEM表示的所有數據都代表至少兩次不同的實驗。利用流式細胞分析得出的細胞內細胞激素染色數據和腫瘤治療實驗數據係以變異數分析(ANOVA)來加以估算。

第一圖為DNA構築體之示意圖。

第二圖顯示了經免疫之小鼠的E7特異性免疫狀態(immunological profile)。(a)由各組中E7特異性之IFN-γ分泌性CD4⁺ T淋巴球得出的流式細胞分析代表圖。(b)該柱狀圖描繪了每3.5×10⁵個脾臟細胞中E7特異性之IFN-γ分泌性CD8⁺ T淋巴球的數目(平均值±SEM，P<0.01，單因子變異數分析(one-way ANOVA))。(c)該柱狀圖描繪了每3.5×10⁵個脾臟細胞中E7特異性之IFN-γ分泌性CD4⁺ T淋巴球的數目(平均值±SEM，P>0.05，單因子變異數分析)。(d)該柱狀圖描繪了每3.5×10⁵個脾臟細胞中E7特異性之IL-4分泌性CD4⁺ T淋巴球的數目(平均值±SEM，P<0.01，單因子變異數分析)。(e)該柱狀圖顯示了以各種DNA疫苗進行免疫之小鼠身上的抗E7抗體效價(平均值±SEM，P<0.01，單因子變異數分析)。

第三圖顯示了經下列各種DNA疫苗進行免疫之小鼠的E7特異性免疫狀態：CTGF/E7、CTGF/E6、CTGF/E6/E7、CTGF/E6+CTGF/E7。(a)由各組中E6特異性之IFN-γ分泌性CD8⁺ T淋巴球得出的流式細胞分析代表圖。(b)由各組中E7特異性之IFN-γ分泌性CD8⁺ T淋巴球得出的流式細胞分析代表圖。(c)該柱狀圖描繪了每3.5×10⁵個脾臟細胞中E6特異性及/或E7特異性之IFN-γ分泌性CD8⁺ T淋巴球的數目(平均值±SEM，P<0.01，單因子變異數分析)。

第四圖顯示小鼠之活體內腫瘤保護實驗的結果。(a)以下列各種DNA疫苗進行免疫之小鼠的活體內腫瘤保護實驗：原態(naïve)、無插入序列、E7、CTGF、E7+CTGF、CTGF/E7。(b)以下列各種DNA疫苗進行免疫之小鼠的活體內腫瘤保護實驗：原態、E7、CTGF/E6、CTGF/E7、CTGF/E6/E7、CTGF/E6+CTGF/E7。

第五圖顯示小鼠之活體內抗體耗盡實驗的結果。

第六圖顯示了在小鼠身上使用高治療劑量的活體內腫瘤治療結果。(a)各組經免疫之小鼠的代表性肺部腫瘤結節。1：原態(naïve)，2：無插入序列，3：E7，4：CTGF，5：CTGF/E7。(b)各組經免疫之小鼠的肺部腫瘤結節數目(平均值±SEM，P<0.001，單因子變異數分析)。

第七圖顯示了經免疫之小鼠的腹股溝淋巴結中經DNA轉染之樹突細胞的流式細胞分析，以及從經免疫之小鼠的腹股溝淋巴結分離出來的E7特異性之CD8⁺ T細胞活化情形。(a)該柱狀圖描繪了在單核球群體中CD11c⁺ GFP⁺單核球的百分比(平均值±SEM，P<0.001，單因子變異數分析)。(b)該柱狀圖描繪了在CD11c⁺ GFP⁺細胞中凋亡細胞的百分比(平均值±SEM，P<0.001，單因子變異數分析)。(c)該柱狀圖描繪了每1×10⁵個細胞中E7特異性之IFN-γ分泌性CD8⁺ T細胞的百分比(平均值±SEM，P<0.001，單因子變異數分析)。

<110> 國立台灣大學

<120> 含有CTGF編碼之DNA構築體的DNA疫苗及其應用

<130> 08P0344

<160> 12

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 1

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 2

<210> 3

<211> 1100

<212> DNA

<213> 人類

<400> 3

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 4

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 5

<210> 6

<211> 477

<212> DNA

<213> 人類乳突病毒16

<400> 6

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 7

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 8

<210> 9

<211> 288

<212> DNA

<213> 人類乳突病毒16

<400> 9

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人類乳突病毒16

<400> 10

<210> 11

<211> 38

<212> PRT

<213> 人類乳突病毒16

<400> 11

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人類乳突病毒16

<400> 12

Claims

一種DNA構築體，其係由可在真核細胞中表現之表現載體、一結締組織生長因子(CTGF)編碼序列、及一人類乳突病毒(HPV)序列所組成；其中前述CTGF編碼序列為SEQ ID NO：3，前述HPV序列係為選自E6編碼序列及E7編碼序列之其中之一，所述E7編碼序列為SEQ ID NO：9，所述E6編碼序列為SEQ ID NO：6。
如申請專利範圍第1項所述之DNA構築體，其中前述表現載體係可在人類細胞中表現。
如申請專利範圍第2項所述之DNA構築體，其中前述表現載體係選自pcDNA3、pSG5或pCMV。
一種DNA疫苗，其包含：如申請專利範圍第1項所述之DNA構築體；以及一顆粒，其係以前述DNA構築體加以包覆。
如申請專利範圍第4項所述之DNA疫苗，其中前述顆粒為金質顆粒。
如申請專利範圍第5項所述之DNA疫苗，前述金質顆粒之直徑為1.6 μm。
如申請專利範圍第4項所述之DNA疫苗，其中前述表現載體係可在人類細胞中表現。
如申請專利範圍第5項所述之DNA疫苗，其中前述表現載體係選自pcDNA3、pSG5或pCMV。
如申請專利範圍第8項所述之DNA疫苗，其中前述表現載體為pcDNA3。
一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第4項所述之DNA疫苗。
如申請專利範圍第10項所述之醫藥組成物，其進一步包含一醫藥可接受載劑。
如申請專利範圍第10項所述之醫藥組成物，其係用於治療HPV所引起的疾病。
如申請專利範圍第12項所述之醫藥組成物，其係用於治療子宮頸癌、肺癌、口咽癌、陰道癌、外陰癌或陰莖癌。
如申請專利範圍第13項所述之醫藥組成物，其係用於治療子宮頸癌。
如申請專利範圍第12項所述之醫藥組成物，其係用於治療子宮頸、外陰或陰道之癌前病變。
一種生產如申請專利範圍第4項所述之DNA疫苗的方法，其包含：(1)提供一DNA構築體，其中前述DNA構築體係由一表現載體，其可在真核細胞中表現之一表現載體、一結締組織生長因子(CTGF)編碼序列、及一人類乳突病毒(HPV)序列所組成，其中前述CTGF編碼序列為SEQ ID NO：3，前述HPV序列係為E6編碼序列以及E7編碼序列之其中之一，所述E7編碼序列為SEQ ID NO：9，所述E6編碼序列為SEQ ID NO：6；以及(2)將前述DNA構築體包覆在前述顆粒表面。
如申請專利範圍第16項所述之方法，其中前述表現載體為pcDNA3。
如申請專利範圍第16項所述之方法，其中前述顆粒為金質顆粒。
如申請專利範圍第18項所述之方法，前述金質顆粒之直徑為1.6 μm。