TW201201829A - Novel peptides and methods for their preparation and use - Google Patents
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Description
201201829 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於糖尿病治療領域，且係關於對葡萄糖依賴 性促胰島素胜肽受體（GIP-R)及高血糖素樣胜肽_丨受體 (GLP-1-R)二者表現活性且對高血糖素受體（Gluc_R)具有選 擇性之胜肽。具體而言’本發明提供GIP類似物，其引入 胺基酸取代以調節對GIP-R及GLP-1-R二者之活性並維持 對Gluc-R之選擇性。 【先前技術】 GIP稱作抑胃胜肽或葡萄糖依賴性促騰島素胜肽其係 42個胺基酸之胃腸調節性胜肽，已顯示其可在葡萄糖存在 下刺激胰腺β細胞分泌胰島素，由此發揮在葡萄糖内穩態 中之生理作用。GLP-1係3 7個胺基酸之胜肽，其保護胰腺β 細胞並抑制高血糖素分泌 '胃排空及食物攝入，從而引起 體重降低。GIP及GLP-1稱作腸降血糖素。腸降血糖素受 體信號傳導發揮對葡萄糖内穩態至關重要之生理相關作 用。高血糖素係由胰腺產生之29個胺基酸之胜肽。此激素 向肝傳導信號以釋放葡萄糠，從而使血糖升高。因此，在 糖尿病背景中不期望刺激G1UC_R。 與在健康個體中所觀察到者不同，單獨之GIp在2型糖尿 病人類中具有極低降糖效應。然而，在達成一定程度之降 糖後’ GIP之功效增強且變得與在血糖正常個體中所觀察 到者接近。另一方面’ GLP-1可在健康個體及糖尿病個體 一者中有效降糖但引起噁心，因此，GLP-1可能不能發揮 154110.doc 201201829 全部功效。此外，遍在蛋白酶二肽基肽酶IV (DPP IV)可使 GIP及GLP-1二者快速失活，從而產生不能刺激胰島素分 泌且因此僅可用於短期代謝控制之胜肽。 某些GIP類似物已闡述於WO 2010/016940及WO 2010/016944中。WO 2010/011439中已闡述某些高血糖素 類似物可表現GIP及GLP-1二者之活性。 當前糖尿病治療包括胰島素促分泌劑，例如磺醯脲及格 列奈（glitinide)，其功效經常表現進行性降低且在2型糖尿 病患者中可引起低血糖症。因此，業内需要確定可以持續 葡萄糖依賴性方式加強胰島素分泌之新穎藥劑。亦期望確 定具有GLP-1之降糖效應且不引起噁心之新穎藥劑，及進 一步確定代謝穩定性增強之新穎藥劑。 【發明内容】 本發明提供新穎有力且有效之胜肽，其引入胺基酸取代 以調節GIP及GLP-1兩種活性同時維持對高血糖素之選擇 性。本發明達成GLP-1之降糖效應並利用GIP之葡萄糖刺 激性胰島素分泌效應。此外，某些本發明化合物提供有效 治療來降低體重。 【實施方式】 本發明提供包含以下序列之胜肽：
Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu- 5 10
Asp-Lys-lie-Ala-Gin-Arg-Ala-Xaa^Val-Gln-Trp-Leu-lie-Ala- 15 20 25
Aib-Lys-Gly-Lys-Lys-Gln-Glu-Trp-Lys-His-Gln-Ile-Thr-Gln-30 35 40 154110.doc -4-
S 201201829
Xaa2-Xaa3 (SEQ ID NO: I) 其中22位之Xaa1係Nal或Phe ; 43位之Xaa2係Cys或不存 在； 44位之xaa3係Cys或不存在；c末端胺基酸視需要經醯胺 化’且前提係倘若43位之Xaa2或44位之Xaa3係Cys，則其 一者或兩者視需要經聚乙二醇化。 本發明一實施例係關於胜肽，其中Xaai係Phe。本發明 一較佳實施例係關於胜肽，其中XaaiSNal。 本發明一實施例係關於胜肽，其中Xaa2及Xaa3不存在。 本發明一較佳實施例係關於胜肽，其中Xaa2及Xaa3各自係 Cys。在該實施例中，44位之CyS之羧基較佳經醯胺化。 本發明另一較佳實施例係關於胜肽，其中該胜肽在43及 44位之任一 Cys處經2〇 kDa pEG分子聚乙二醇化。在該實 施例中’ C末端Cys之叛基較佳經醯胺化。本發明另一較佳 貫施例係關於胜肽，其中該胜肽在43及44位之兩個Cys處 經20 kDa PEG分子聚乙二醇化。在該實施例中，c末端cys 之叛基較佳經酿胺化。 本發明一實施例係關於胜肽，其中Xaai係phe ;且Xaa2 及Xaa3不存在。在該實施例中，42位之〇末端Gln之羧基較 佳經醯胺化。本發明一較佳實施例係關於胜肽，其中Xaal 係Nal，且Xaa2及Xaa3不存在。在該實施例中，42位之C末 端Gin之羧基較佳經醯胺化。 本發明一更佳實施例係關於胜肽，其中Xaai係phe ; Xaa2及Xaa3二者皆係cys且二者皆視需要經聚乙二醇化且 154110.doc 201201829 44位之Cys之羧基視需要經醯胺化。本發明一尤佳實施例 係關於胜肽，其中Xaa1係Nal ; Xaa2及Xaa3係Cys且任一或 兩個Cys視需要經聚乙二醇化且44位之Cys之叛基視需要經 酿胺化。 本發明一尤佳實施例係
Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp-Lys-Ile-Ala-Gln-Arg-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-Aib-Lys-Gly-Lys-Lys-Gln-Glu-Trp-Lys-His-Gln-Ile-Thr-Gln-Cys(PEG20K)-Cys(PEG20K) (SEQ ID NO: 2) 且44位之Cys經醯胺化。此胜肽稱作Aib2、Aib13、 Aib29、Cys43(PEG20K)、Cys44 (PEG20K)-GIP。 本發明一最佳實施例係
Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp-Lys-Ile-Ala-Gln-Arg-Ala-Nal-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-Aib-Lys-Gly-Lys-Lys-Gln-Glu-Trp-Lys-His-Gln-Ile-Thr-Gln-Cys(PEG20K)-Cys(PEG20K) (SEQ ID NO： 3) 且44位之Cys經醢胺化。此胜肽稱作Aib2、Aib13、
Nal22、Aib29、Cys43(PEG20K)、Cys44 (PEG20K)-GIP。 本發明亦提供治療患者之糖尿病之方法，其包含向需要 該治療之患者投與有效量之本發明胜肽。本發明另外提供 治療患者之非胰島素依賴性糖尿病之方法，其包含向需要 該治療之患者投與有效量之本發明胜肽。本發明另外提供 治療患者之胰島素依賴性糖尿病之方法，其包含向需要該 治療之患者投與有效量之本發明胜肽。 154110.doc -6 ·
S 201201829 此外，本發明亦提供藉由向需要治療之患者投與有效量 之本發明胜肽來治療選自由以下組成之群之病況之方法. 肥胖症、代謝症候群、冠狀動脈疾病及動脈粥樣硬化。此 外’本發明提供藉由向需要治療之患者投與有效量之本發 明胜肽來誘導體重降低之方法。本發明亦提供藉由向需要 治療之患者投與有效量之本發明胜肽來治療脆弱症或提高 骨強度之方法。 此外’本發明提供用於治療之本發明胜肽。在一特定實 施例中，本發明提供本發明胜肽，其用於治療糖尿病。本 發明提供本發明胜肽，其用於治療非胰島素依賴性糖尿 病。本發明提供本發明胜肽，其用於治療胰島素依賴性糖 尿病。同樣，本發明提供本發明胜肽，其用於治療肥胖 症。另外，本發明提供本發明胜肽，其用於治療選自由以 下組成之群之病況：肥胖症、代謝症候群、冠狀動脈疾病 及動脈粥樣硬化。本發明另外提供本發明胜肽，其用於誘 導體重降低。本發明亦提供本發明胜肽，其用於治療脆弱 症或提高骨強度。 本發明亦提供本發明胜肽之用途，其用於製造治療糖尿 病之藥物。本發明亦提供本發明胜肽之用途，其用於製造 治療肥胖症之藥物。本發明另外提供上述胜肽之用途，其 用於製造治療選自由以下組成之群之病況之藥物：代謝症 候群、冠狀動脈疾病及動脈粥樣硬化。本發明另外提供本 發明胜肽之用途’其用於製造誘導體重降低之藥物。本發 明亦提供本發明胜肽之用途，其用於製造治療脆弱症或提 1541I0.doc 201201829 高骨強度之藥物。 奸另外纟發明提供醫藥調配物，其包含本發明胜狀及醫 樂上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。此外，本發明提供 適用於治療糖尿病之醫藥調配物。本發明提供適用於治療 非胰島素依賴性糖尿病之醫藥調配物。本發明提供適用於 治療騰島素依賴性糖尿病之t藥調配物。此外，本發明提 供適用於療肥胖症之醫藥調配物。本發明亦提供適用於 治療選自由以下組成之群之病況之醫藥調配物：代謝症候 群、冠狀動脈疾病及動脈粥樣硬化。本發明提供適用於誘 導體重降低之醫藥調g己物。纟發明另外提供適用於治療脆 弱症或提咼骨強度之醫藥調配物。在一特定實施例中，該 調配物另外包含一或多種其他治療藥劑。 本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明胜肽及一或多 種"J·藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在一特定實施 例中，該組合物另外包含一或多種其他治療藥劑。 本發明另外提供對DPPIV之快速代謝失活較不敏感之穩 定分子。 本發明序列含有用於二十種天然胺基酸之標準單字母或 三字母胺基酸密碼。所用其他胺基酸密碼定義如下： Aib=a·胺基異丁酸；Nal=l-萘基丙胺酸。 術語「C末端胺基酸」係指胜肽序列中含有游離羧基之 最後一個胺基酸。本發明C末端胺基酸可係42位之Gin、43 位之Cys或44位之Cys。 術語「聚乙二醇」或「PEG」係指聚伸烷基二醇化合物 154110.doc
S 201201829 或其衍生物，其具有或不具有偶聯劑，或經或未經偶聯或 活化部分衍生。PEG之典型形式係具有末端羥基之直鏈聚 合物且具有式 H0-CH2CH2-(CH2CH20)n-CH2CH2-0H，其中 η係約8至4000。mPEG係單曱氧基-聚乙二醇。由於PEG通 常係以PEG化合物之分子量在一定程度上變化之混合物形 式來生成及使用，熟習此項技術者一般藉由闡述生成特定 聚乙二醇化化合物之聚乙二醇化反應中所用PEG試劑之平 均分子量來闡述附接至化合物之PEG之分子量。業内存在 多種PEG衍生物。共價附接至本發明胜肽之PEG分子可為 10,000道爾頓、20,000道爾頓、30,000道_頓或40,000道爾 頓。PEG分子之平均值較佳係18,000至22,000道爾頓。更 佳地，平均值係19,000至2 1，000道爾頓。最佳地，平均值 係20,000至21,000道爾頓。PEG分子可係直鏈或具支鏈且 可單獨或串聯存在。本發明聚乙二醇化胜肽較佳具有附接 至胜肽C末端之串聯直鏈PEG分子。具體而言，PEG分子 較佳藉由mPEG-20 kDa馬來醯亞胺（mPEG MAL) (I)或 mPEG-20 kDa碘乙醯胺（II)附接至胜肽C末端之兩個半胱氨 酸殘基，其中η係10至2500。較佳地，η係350至600。更佳 地，η係425至475 °
本文所用術語「聚乙二醇化」意指一或多個上述PEG分 154110.doc 201201829 子共價附接至本發明胜肽。舉例而言，本發明胜肽在杓及 44位之Cys處經與各Cys之硫醇基共價連接之2〇 kDa pEG* 子聚乙二醇化。 在本文中使用以下縮寫：「t-Bu」係指第三丁基； 「fmoc」係指苟基曱氧基羰基；「Pbf」係指2,2,4,6,7_五曱 基二^氫苯并呋喃_5_磺醯基；r Trt」係指三苯甲基或三苯基 曱基，「OtBu」係指第三丁氧基；「b〇c」係指第三丁氧基 羰基；「PyBOP」係指六氟填酸（苯并三唑-丨_基氧基）三〇比 咯啶基鱗；「DIEA」係指二異丙基乙胺；r hEK」係指人 類胚腎；「Tris」係指2-胺基-2-羥甲基-丙烷q，％二醇； 「BSA」係指牛▲清白蛋白；「HEPES」係指2·[4_(2_經乙 基）六氫吡嗪-1-基]乙磺酸；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水； 「NSB」係指非特異性結合；「HBSS」係指漢克氏緩衝鹽 溶液（Hank's buffered salt solution) ;「IB MX」係指 1 _ 甲基 3-(2-甲基丙基）-7H-嘌呤-2,6-二酮；且「DMSO」係指二甲 亞礙。 胜肽合成 所有本發明胜肽皆係在Protein Technologies公司之 Symphony®自動化胜肽合成儀上藉由固相胜肽合成來生 成。合成係在具有約0.7 mmol/g取代之Fmoc-Rink醯胺聚苯 乙稀樹脂（Rapp Polymere Tubingen，Germany)上進行。該 合成係使用Fmoc/t-Bu固相胜肽合成來實施。所用胺基酸 側鏈衍生物係：Arg(Pbf)、Asp(OtBu)、Cys(Trt)、
Gln(Trt)、Glu(OtBu)、His(Trt)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、 154110.doc -l〇- 5 201201829
Thr(tBu)、Trp(Boc)及Tyr(tBu)。在室溫下用約6當量經二 異丙基碳二亞胺（DIC)及羥基苯并三唑（HOBt)活化之胺基 酸（莫爾比係1:1:1)在二甲基甲醯胺（DMF)中經90分鐘來進 行偶聯。使用以下條件在22位偶聯Fmoc-(l-Nal)-OH : Fmoc-(l-Nal)-OH(3 當量）、PyBOP(3 當量）及 DIEA(6 當 量），在DMF中，在室溫下，經3 h。使用以下條件在1 2位 偶聯 Fmoc-Ile-OH : Fmoc-Ile-OH(6 當量）、PyBOP(6 當量） 及DIE A( 12當量），在DMF中，在室溫下，經10 h。 伴隨之自樹脂裂解及側鏈保護基團之移除係在含有三氟 乙酸（TFA):三異丙基矽烷：1，2-乙二硫醇：曱醇：茴香硫醚 (90:4:2:2:2 (v/v))之溶液中在室溫下經2 h來進行。過濾溶 液並用冷二乙醚使胜肽沉澱，使其再溶解於30-40 mL存於 水中之10%乙腈中，並在C:18反相HPLC管柱（通常係Waters SymmetryPrepTM 7 μηι，19x300 mm)上以 18 mL/min之流速 純化。用0至18% B經5 min及之後18%至45% B經110分鐘 之二級線性AB梯度洗脫樣品，其中A=0.05°/〇 TFA/水且 8 = 0.05°/〇丁卩入/乙腈。一般在28-3 5%乙腈中洗脫出產物。在 Agilent 1100 Series LC-MS系統上用單一四極MS檢測器確 認胜肽純度及分子量。在Zorbax® Eclipse™ XDB-C8(5 μιη，4.6 mm内徑x 15 cm)管柱上用6%至60% B經15分鐘之 線性AB梯度實施分析型HPLC分離，其中A=0.05°/〇 TFA/H2O且Β = 0·05% TFA/乙腈，且流速為1 mL/min。所有 胜肽皆純化至純度> 95%且確認其分子量對應於在1 amu内 之計算值。 154110.doc -11 - 201201829 實例1
Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu- 5 10
Asp-Lys-Ile-Ala-Gln-Arg-Ala-Nal-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-15 20 25
Aib-Lys-Gly-Lys-Lys-Gln-Glu-Trp-Lys-His-Gln-Ile-Thr-Gln 30 35 40 (SEQ ID NO: 4) 實例2
Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu- 5 10
Asp-Lys-Ile-Ala-Gln-Arg-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-15 20 25
Aib-Lys-Gly-Lys-Lys-Gln-Glu-Trp-Lys-His-Gln-Ile-Thr-Gln 30 35 40 (SEQ ID NO: 5) 中間體1
Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu- 5 10
Asp-Lys - lie-Ala-Gin-Arg-Ala-Nal-Val-Gln-Trp-Leu-lie-Ala-15 20 25
Aib-Lys-Gly-Lys-Lys-Gln-Glu-Trp-Lys-His-Gln-Ile-Thr-Gln-Cys-30 35 40
Cys (SEQ ID NO: 6) 中間體2
Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu- 5 10
Asp-Lys-1le-Ala-Gin-Arg-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-lie-Ala-15 20 25
Aib-Lys-Gly-Lys-Lys-Gln-Glu-Trp-Lys-His-Gln-Ile-Thr-Gln-Cys-30 35 40
Cys 154110.doc -12· s 201201829 (SEQ ID NO: 7) mPEG-MAL-20 kDa對胜肽之聚乙二醇化 稱出凍乾胜肽（通常30-50 mg)。稱出2.1倍莫耳當量之 mPEG-20 kDa 馬來醯亞胺（CH30(CH2CH20)n-(CH2)3 NHCO(CH2)2-馬來醯亞胺）(NOF SUNBRIGHT ME-200MA) (mPEG MAL)並與胜肽合併。將反應物溶於50/50 (v/v)水/ 乙腈混合物中至胜肽濃度為約20 mg/mL。用100 mM乙酸 銨（10 mM EDTA，pH 7)將胜肽溶液稀釋兩倍。在室溫下攪 拌所得混合物。藉由分析型反相HPLC(在60°C下在Waters SymmetryShield™ C18(3.5 μπι，4.6 mm内徑 xlO cm)管柱上 以0至30% B經5分鐘及之後30%至90% B經30 min之二級線 性AB梯度實施分析型HPLC分離，其中A=0.05% TFA/H20 且Β = 0·05% TFA/乙腈且流速為1 mL/min)來監測反應混合 物，且通常在1-2 h反應時間後顯示胜肽峰幾乎完全消失。 因單及二-聚乙二醇化胜肽而出現兩個峰，且二-聚乙二醇 化胜肽通常佔總峰面積之90-95%。 通常隨後用酸化水（0.05% TFA/水）將樣品稀釋至約40 mL並藉由Ci8反相HPLC管柱（通常係Waters SymmetryPrep™ 7 μηι, 19x300 mm)以 10 mL/min之流速及 0至 25% B經 15 min之後25%至55% B經100 min之二級線性AB梯度加以純 化，其中A=0.05% TFA/水且B=0.05% TFA/乙腈。一般在 35-40%乙腈中洗脫出產物。在280 nm下使用基於胜肽序列 計算之莫耳消光係數藉由UV吸光度來量化所純化胜肽。 基於起始胜肽之量，純化後產率通常在70%範圍内。 154110.doc -13· 201201829 實例3
Aib2、Aib13、Aib29、Cys43(PEG20K)、Cys44 (PEG20K)· GIP 實例4
Aib2、Aib13、Nal22、Aib29、Cys43(PEG20K)、Cys44 (PEG20K)-GIP 實例3及實例4之胜肽已使用mPEG-MAL聚乙二醇化。 mPEG-碘乙醯胺-20 kDa對胜肽之聚乙二醇化 稱出凍乾胜肽（通常30-50 mg)。稱出2.1倍莫耳當量之 mPEG-20k Da 埃乙醯胺（CH30(CH2CH20)n-(CH2)3 NHCOCH2-I)(NOF SUNBRIGHT ME-200IA)並與胜肽合 併。將反應物溶於pH 8.5水性緩衝溶液（硼酸、氯化鉀、氫 氧化鈉緩衝液0.1 M+10 mM EDTA)+20%乙腈（v/v)中至胜 肽濃度為約10 mg/mL。然後在室溫下攪拌所得混合物。藉 由分析型反相 HPLC(在 60°C 下在 Waters SymmetryShield™ C18(3.5微米，4.6 mm内徑xlO cm)管柱上以0至30% B經5 分鐘及之後30%至90% B經30 min之二級線性AB梯度實施 分析型 HPLC 分離，其中 A=0.05% TFA/H20 且 B = 0.05% TFA/乙腈且流速為1 mL/min)來監測反應混合物，且通常 在18 h反應時間後顯示胜肽峰幾乎完全消失。因單-及二-聚乙二醇化胜肽而出現兩個峰，且二-聚乙二醇化胜肽通 常佔總峰面積之90-95%。 通常隨後用酸化水（0.05% TFA/水）將樣品稀釋至約50 mL並藉由C!8反相HPLC管柱（通常係Waters SymmetryPrep™ 154110.doc 14 201201829 7 μιη, 19x300 mm)以 10 mL/min之流速及 0至 25% Β經 15 min之後25°/。至55% Β經100 min之二級線性ΑΒ梯度加以純 化，其中A=0.05% TFA/水且B=0.05% TFA/乙腈》—般在 35-40%乙腈中洗脫出產物。在280 nm下使用基於胜肽序列 計算之莫耳消光係數藉由UV吸光度來量化所純化胜肽。 基於起始胜肽之量，純化後產率通常在70%範圍内。 或者，稱出凍乾胜肽（通常30-50 mg)。稱出2.1倍莫耳當 量之 mPEG-20k Da 碘乙醯胺（CH30(CH2CH20)n-(CH2)3 NHCOCH2-I)(NOF SUNBRIGHT ME-200IA)並與胜肽合 併。將反應物溶於pH 8.0水性緩衝溶液（0.1 Μ碳酸氫鹽緩 衝液+10 mM EDTA)+20%乙腈（ν/ν)中至胜肽濃度為約8 mg/mL。然後在室溫及暗環境下攪拌所得混合物。藉由分 析型反相 HPLC(在 60。(3 下在 Waters SymmetryShield™ C18 (3.5微米，4.6 mm内徑x 10 cm)管柱上以0至30% B經5分鐘 及之後30%至90% Β經30 min之二級線性ΑΒ梯度實施分析 型 HPLC分離，其中A=0.05% TFA/H20 且B = 0.05o/〇 TFA/乙 腈且流速為1 mL/min)來監測反應混合物，且通常在3 h反 應時間後顯示胜肽峰幾乎完全消失。因單-及二-聚乙二醇 化胜肽而出現兩個峰，且二-聚乙二醇化胜肽通常佔總峰 面積之90-95%。 通常隨後用酸化水（0.05°/。TFA/水）將樣品稀釋至約50 mL並如上文所述進行純化。基於起始胜肽之量，純化後 產率通常在70%範圍内。 實例 5 : SEQ ID: 3 154110.doc 201201829
Aib2、Aib13、Nal22、Aib29、Cys43(PEG20K)、Cys44 (PEG20K)-GIP 實例5之胜肽係使用mPEG-碘乙醯胺來聚乙二醇化。 分析 活體外 基本上如下文所述來測試本文所例示化合物且其所表現 與GIP-R及GLP-1-R之結合親和性（Ki)低於100 nM且相對於 Gluc-R之選擇性比率為至少1〇〇倍。此外，本文化合物在 結合分析中所表現對GIP-R及GLP-1-R之活性比率介於4:1 至1:2 (GIP-R:GLP-1-R)之間（4:1表明對GIP-R具有較高效 能；1:2表明對GLPd-R具有較高效能）。 葡萄糖依賴性促胰島素胜肽受體（GIP-R)結合分析 人類葡萄糖依賴性促胰島素多肽受體結合分析使用選殖 至 pcDNA3.1 (Promega)-NeoR 質粒中之 hGIP-R(Usdin，T.B.、 Gruber，C.、Modi，W.及 Bonner，T.I.，基因庫（GenBank): AAA84418.1)。將 hGIP-R-pcDNA3.1/Neo 質粒轉染至中國 倉鼠卵巢細胞CHO-S中以供懸浮培養，並在500 pg/mL遺 傳黴素（Invitrogen)存在下進行選擇。 使用來自懸浮培養之細胞製備粗質膜。在冰上於含有25 mM Tris HC1 (pH 7_5)、1 mM MgCl2、DNA酶 1 (20 μ/mL) 及Roche Complete™無EDTA抑制劑之低滲緩衝液中溶解細 胞。藉由杜恩斯玻璃勻聚器（glass dounce homogenizer)使 用Teflon®研棒使細胞懸浮液勻漿25個衝程。在4°C下將勻 漿物以1800 X g離心15分鐘。收集上清液並使沉澱再懸浮 154110.doc -16- 201201829 於低滲緩衝液中並再次勻漿化。以i 8〇〇 X g將混合物離心 15分鐘。合併第二上清液與第一上清液。將經合併上清液 以1800 X g再次離心15分鐘至澄清。將澄清上清液轉移至 高速管中並在4°C下以25000 X g離心30分鐘。使膜沉澱再 次懸浮於勻漿緩衝液中並以冷凍等份試樣儲存在_80ec冷 凍器中直至使用》 藉由 1-125-乳過氧化物酶程序（Markalonis，J.J., Biochem. J. 113:299 (1969))將 GIP放射性琪化並在 Perkin-Elmer/NEN (NEX-402)中藉由反相HPLC來純化。比活性為2200 Ci/mmol 〇藉由使用冷hGIP之同源競爭代替飽和結合來實 施KD測定。使用閃爍迫近分析（sPA)(Sun, S.、Almaden， J.、Carlson，T.J.、Barker, J.及 Gehring，M.R. Assay development and data analysis of receptor-ligand binding based on scintillation proximity assay. Metab Eng. 7:3 8-44 (2005))以預先經1%無脂肪酸BSA (Gibco，7.5% BSA)封阻 之麥胚凝集素（WGA)珠粒（GE Health Care)來實施受體結合 分析。結合緩衝液含有25 mM HEPES (pH 7.4)、2.5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、0.1% 無脂肪酸 BSA、0.003% Tween20及Roche CompleteTM&EDTA抑制劑。使hGIP及胜 肽類似物溶於PBS中並儲存在-80°C下。將胜肽類似物連續 稀釋至結合緩衝液中。隨後，將1 〇 pL經稀釋胜肽轉移至 含有40 μι分析結合緩衝液或冷GIP之Corning® 3632透明 底分析板中（NSB，在0.1 μΜ終濃度下）。隨後，添加90 pL 膜（4 pg/孔）、50 pL [125I] GIP(Perkin Elmer Life and 154110.doc 17 201201829
Analytical Sciences，反應終濃度為 0.15 nM)及50 μίν WGA 珠粒（150 pg/孔），密封，並翻轉混合。在室溫下沉降12小 時時間後用MicroBeta®閃爍計數器讀取板。 結果計算為在化合物存在下特異性I-125-GIP結合之百分 比》藉由I-125-GIP之特異性結合百分比對所添加化合物濃 度之非線性回歸來得出化合物之絕對IC50濃度。使用 Cheng-Prusoff方程將IC5G濃度轉換為Ki，其中KD之估計值 係 0.174 nM(Cheng，Y.、Prusoff，W. H. ’ Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108,（1973))。 表1
實例 Ki 1 0.044 nM 2 0.023 nM 3 9.79 nM 4 8.23 nM 5 9.22 nM 該等數據顯示，表1之胜肽與GIP-R結合且可活化該受 體，繼而觸發GIP依賴性生理反應。 高血糖素樣-胜肽1 (GLP-1-R)受體結合分析 GLP-1受體結合分析使用自293HEK膜分離之經選殖人類 高血糖素樣胜肽 1 受體（hGLP-1 -R)(Graziano MP、Hey P J、 Borkowski D、Chicchi GG、Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 196(1): 141-6，1993)。將 hGLP-l-R cDNA亞 選殖至表現質粒phD 中（Trans-activated expression of fully 154110.doc s 201201829 gamma-carboxylated recombinant human protein C， an antithrombotic factor. Grinnell，B.W.、Berg，D.T.、Walls， J.及 Yan，S.B. Bio/Techno:logy 5: 11 89-1192，1987)。將此 質粒DNA轉染至293HEK細胞中並用200 pg/mL潮黴素進行 選擇。 使用來自懸浮培養之細胞製備粗質膜。在冰上於含有25 mM Tris HC1 (pH 7.5)、1 mM MgCh、DNA酶 1 (20 μ/mL) 及Roche Complete™無EDTA抑制劑之低滲緩衝液中溶解細 胞。藉由杜恩斯玻璃勻漿器使用Teflon®研棒使細胞懸浮 液勻漿25個衝程。在4艽下將勻漿物以1800 X g離心15分 鐘。收集上清液並使沉澱再懸浮於低滲緩衝液中並再次勻 漿化。以1800 X g將混合物離心15分鐘。合併第二上清液 與第一上清液。將經合併上清液以1 800 X g再次離心15分 鐘至澄清。將澄清上清液轉移至高速管中並在4°C下以 25000 X g離心30分鐘。使膜沉澱再次懸浮於勻漿緩衝液中 並以冷凍等份試樣儲存在-80°C冷凍器中直至使用。 藉由1-125-乳過氧化物酶程序將高血糖素樣胜肽1 (GLP-1)放射性碘化並在Perkin-Elmer/NEN (NEX308)中藉由反相 1^1^來純化。比活性為 2200 (^/111111〇1。由於1-125 01^-1 材料中具有高丙醇含量，故藉由同源競爭代替飽和結合來 實施KD測定。KD之估計值係0.96 nM且使用其來計算所測 試所有化合物之Ki值。 使用閃爍迫近分析（SPA)以預先經1%無脂肪酸BSA (Gibco)封阻之麥胚凝集素（WGA)珠粒來實施受體結合分 154110.doc -19- 201201829 析。結合緩衝液含有25 mM HEPES (pH 7.4)、2·5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、0.1%無月旨肪酸BSA、0.003% Tween20及 Roche Complete™無EDTA抑制劑。將高血糖素樣胜肽1以1 mg/mL溶於PBS中並立即在-80°C下以30 μι等份試樣冷 凍。稀釋高血糖素樣胜肽1等份試樣並在1小時内用於結合 分析中。將胜肽類似物溶於PBS中並在結合緩衝液中連續 稀釋。隨後，將10 μί經稀釋化合物或PBS轉移至含有40 pL分析結合緩衝液或冷高血糖素之Corning® 3632透明底 分析板中（NSB，在1 μΜ終濃度下）。隨後，添加90 μί膜（1 pg/孔）、50 pL 1-125高血糖素樣胜肽1(0.15 ηΜ反應終濃 度）及5 0 pL WGA珠粒（150 pg/孔），密封並翻轉混合。在室 溫下沉降12小時時間後，用PerkinElmer Life and Analytical Sciences Trilux MicroBeta® 閃爍計數器讀取 板。 結果計算為在化合物存在下特異性1-125-高血糖素樣胜 肽1結合之百分比。藉由1-125-高血糖素樣胜肽1之特異性 結合百分比對所添加化合物之濃度之非線性回歸來得出化 合物之絕對IC5G濃度。使用Cheng-Prusoff方程將IC5G濃度 轉換為Ki。 表2
實例 Ki 1 0.096 nM 2 0.059 nM 3 9.00 nM 4 5.27 nM 5 6.20 nM 154110.doc -20- 201201829 該等數據顯示，表2之胜肽與GLP-1-R結合且由此可活化 該受體，繼而觸發GLP-1依賴性生理反應。 高血糖素受體（hGlucR)結合分析 高血糖素受體結合分析利用自293HEK膜分離之經選殖 人類高血糖素受體（Lok，S等人，Gene 140 (2)，203-209 (1994))。將hGlucR cDNA亞選殖至表現質粒phD t(Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, B.W. 等人，Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987))。將此質粒 DNA轉染至293HEK細胞中並用200 pg/mL潮黴素來選擇。 使用來自懸浮培養之細胞製備粗質膜。在冰上於含有25 mM Tris HC1 (pH 7.5)、1 mM MgCl2、DNA酶 1 (20 μ/mL) 及Roche Complete™無EDTA抑制劑之低滲緩衝液中溶解細 胞。藉由杜恩斯玻璃勻漿器使用Teflon®研棒使細胞懸浮 液勻漿25個衝程。在4°C下將勻漿物以1800 X g離心15分 鐘。收集上清液並使沉澱再懸浮於低滲緩衝液中並再次勻 漿化。以1800 X g將混合物離心15分鐘《合併第二上清液 與第一上清液。將經合併上清液以1800 X g再次離心15分 鐘至澄清。將澄清上清液轉移至高速管中並在4°C下以 25000 X g離心30分鐘。使膜沉澱再次懸浮於勻漿緩衝液中 並以冷凍等份試樣儲存在-80°C冷凍器中直至使用。 藉由1-125-乳過氧化物酶程序將高血糖素放射性碘化並 在Perkin-Elmer/NEN (NEX207)中藉由反相 HPLC來純化。 比活性為2200 Ci/mmol。由於1-125高血糖素材料中具有高 154110.doc •21 - 201201829 丙醇含量，故藉由同源競爭代替飽和結合來實施kd測定》 KD之估計值係2.62 nM且使用其來計算所測試所有化合物 之Ki值。 使用閃爍迫近分析（SPA)以預先經1%無脂肪酸牛血清白 蛋白（BSA) (Gibco，7.5% BSA)封阻之麥胚凝集素（WGA)珠 粒來實施受體結合分析》結合緩衝液含有25 mM 4-(2-羥乙 基）-1-六氫吡嗪乙磺酸（HEPES) (pH 7.4)、2.5 mM CaCl2、 1 mM MgCl2、0.1% 無脂肪酸 BSA、0.003% Tween20 及 Roche Complete™無EDTA抑制劑。將高血糖素以1 mg/mL 溶於0.01 N HC1中並立即在-80°C下以30 pL等份試樣冷 康。稀釋高血糖素等份試樣並在1小時内用於結合分析 中。將胜肽類似物溶於磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)中並在結合 緩衝液中連續稀釋。隨後，將10 pL經稀釋化合物或PBS轉 移至含有40 pL分析結合緩衝液或冷高血糖素之Corning® 3632透明底分析板中（非特異性結合（NSB)，在1 μΜ終濃度 下）。隨後’添加90μL膜（3μg/孔）、50μLI-125高血糖素 (0.15 nM反應終濃度）及50 μί WGA珠粒（150 pg/孔），密封 並翻轉混合。在室溫下沉降12小時時間後，用PerkinElmer
Life and Analytical Sciences Trilux MicroBeta® 閃爍計數器 讀取板。 結果計算為在化合物存在下特異性丨25-高血糖素結合 之百分比。藉由I -12 5 -高血糖素之特異性結合百分比對所 添加化合物之濃度之非線性回歸來得出化合物之絕對IC5〇 濃度。使用Cheng-Prusoff方程將IC50'劑量轉換-為一ΚΓ·。- ~ ' 154110.doc -22-
S 201201829
表3 實例 Ki 1 > 23,600 nM 2 > 23,600 nM 3 >7,890 nM 4 >7,490 nM 5 >7,490 nM 該等數據顯示，表3之胜肽對Gluc-R之選擇性較低且因 此並不引發Gluc-R介導之生理反應。
功能性活化hGIP-R細胞以生成細胞内cAMP cAMP功能分析使用上文所述經分離用於hGIP-R結合分 析之相同經選殖GIP-R細胞系。用胜肽刺激細胞並使用 CisBio cAMP Dynamic 2 HTRF® 分析套組（62AM4PEB)來 量化細胞内生成之cAMP。簡言之，藉由在細胞溶解緩衝 液存在下與cAMP-d2捕獲抗體結合來檢測在細胞内誘導之 cAMP。添加第二檢測抗體抗cAMP穴狀化合物（Cryptate) 以產生夾心化合物（sandwich)，隨後使用Perkin-Elmer Life Sciences Envision®儀器對其進行檢測。 自近匯合組織培養皿用無酶細胞解離溶液（特製培養基 5-004-B)收穫hGIP-R-CHO-S細胞。以低速使細胞沉澱並用 cAMP分析缓衝液[存於含有Mg及Ca之HBSS中之25 mM Hepes (GIBCO, 14025-092)，含有 0.1% 無脂肪酸 BSA (Gibco, 7.5% BSA)、500 μΜ IBMX]洗滌 3次，隨後將其稀 釋至終濃度為312,000細胞/mL。將hGIP及胜肽製備為5Χ原 154110.doc -23 - 201201829 液並連續稀釋至cAMP分析緩衝液中，且自儲存在-20°C下 之2,848 nM cAMP存於PBS中之冷凍原液製備cAMP標準曲 線。為開始分析，將40 μί細胞懸浮液轉移至未經組織培 養物處理之黑色半孔板（CoStar 3694)中，之後添加10 pL 5X胜肽稀釋液。使細胞在室溫下保持1 h。藉由添加25 pL 稀釋至CisBio溶解緩衝液中之cAMP-d2捕獲抗體（CisBio)來 終止反應，隨後在titer-tek振盪器中緩慢混合。在溶解15 分鐘後，添加25 μί檢測抗體抗cAMP穴狀化合物（CisBio) 並緩慢混合。在室溫下保持1 h後使用Perkin-Elmer Envision®來讀取溶解細胞與抗體之混合物。使用cAMP標 準曲線將Envision®單位轉換為nM cAMP/孔。將每孔中生 成之cAMP奈莫耳數轉換為用hGIP對照觀察到之最大反應 百分比。藉由使用最大反應百分比對所添加胜肽之濃度之 非線性回歸來得出相對EC50值。 表4
實例 EC50 1 0.005 nM 2 0.023 nM 3 0.244 nM 4 0.277 nM 5 0.207 nM 該等數據顯示，表4之胜肽結合並活化GIP-R且由此可引 發GIP-R介導之生理反應。
功能性活化hGLP-1-R細胞以生成細胞内cAMP 154110.doc •24-
201201829 cAMP功能分析使用自選殖至pcDNA3.1/Neo (Promega) 中（（Graziano MP、Hey PJ、Borkowski D、Chicchi GG、 Strader CD ’ Biochem Biophys Res Commun·，1993年 10月 15 曰；196(1):141-6))並轉染至 293HEK細胞中之 hGLR-l-R 之轉染物分離之表現hGL,P-1-R的細胞純系。用胜肽刺激 hGLP-1-R細胞並使用 CisBio cAMP Dynamic 2 HTRF®分析 套組（62AM4PEB)來量化細胞内生成之CAMP。簡言之，藉 由在細胞溶解緩衝液存在下與cAMP-d2捕獲抗體（CisBio) 結合來檢測在細胞内誘導之cAMP。添加第二檢測抗體抗 cAMP穴狀化合物（CisBio)以產生夾心化合物，隨後使用 Perkin-Elmer Envision®儀器對其進行檢測。 自近匯合組織培養皿用無酶細胞解離溶液（特製培養基 5-004-B)收穫hGLP-l-R-293HEK細胞。以低速使細胞沉澱 並用cAMP DMEM分析緩衝液[存於DMEM中之10 mM Hepes (Gibco-31053)，含有 0.5% FBS 及 2 mM 麩醯胺酸及 500 μΜ IBMX]洗滌3次，隨後稀釋至終濃度為50,000細胞/ mL。將hGLP-Ι及胜肽製備為5Χ原液並連續稀釋至cAMP DMEM分析緩衝液中，且自儲存在-20°C下之2,848 nM cAMP存於PBS中之冷凍原液製備cAMP標準曲線。為開始 分析，將40 pL細胞懸浮液轉移至未經組織培養物處理之 黑色半孔板（CoStar 3694)中，之後添加10 pL 5X胜肽稀釋 液。使細胞在室溫下保持1 h。藉由添加25 μι稀釋至 CisBio溶解緩衝液中之cAMP-d2捕獲抗體（CisBio)來終止反 應，隨後在titer-tek振盪器中缓慢混合。在溶解15分鐘 154110.doc •25- 201201829 後，添加25 μί檢測抗體抗cAMP穴狀化合物（CisBio)並緩 慢混合。在室溫下保持1小時後使用Perkin-Elmer Envision®來讀取溶解細胞與抗體之混合物。使用cAMP標 準曲線將Envision®單位轉換為nM cAMP/孔。將每孔中生 成之cAMP奈莫耳數轉換為用hGLP-Ι對照觀察到之最大反 應百分比。藉由使用最大反應百分比對所添加胜肽之濃度 之非線性回歸來得出相對EC50值。 表5
實例 ECs〇 1 0.036 nM 2 0.045 nM 3 1.11 nM 4 0.844 nM 5 0.959 nM 該等數據顯示’表5之胜肽結合並活化GLP-1-R且由此可 引發GLP-1-R介導之生理反應。 活體内 在膳食誘導肥胖（DIO)小鼠中對食物攝入、體重及身體組 成之效應 使用二至四個月齡雄性膳食誘導肥胖（DI〇)小鼠。將動 物單獨飼養在具有12小時光/暗循環（在㈨時開燈）之溫 度受控（24°C)設施中，且可自由獲得食物及水。在該設施 中勒丨化2週後’將小鼠隨機分配至各治療組（η=8·丨〇/組） 154110.doc -26· 201201829 中，從而使得每組具有相似之平均體重及脂肪量。在實驗 前，向小鼠皮下（SC)注射媒劑溶液並經7天稱重以使其適應 程序。 在2至4週内，每3天在暗循環開始前30-90分鐘時向隨意 進食之DIO小鼠藉由皮下注射來投與溶於媒劑中之媒劑或 胜肽類似物（劑量範圍係10-100 nmol/Kg)。在相同時間量 測體重及食物加上儲料漏斗之重量。藉由自前一天之食物 加儲料漏斗重量減去當前值來計算在過去24小時中消耗之 食物。藉由減去第一次注射前之動物體重來計算體重之絕 對變化。在第-1天及第14天，藉由核磁共振（NMR)使用 Echo Medical系統（Houston, TX)儀器來量測總脂肪量。藉 由自總體重減去脂肪量來計算非脂肪量。 表6a DIO小鼠在14天之治療階段中之重量變化（實例3及4) 實例(劑量） 總體體重降低 (14天中之體重 變化g數） 總食物攝入(14 天中之總g數:） 脂肪量降低(14 天中之脂肪重量 變化g數） 媒劑 +0.7 士 0.4 36.9 士 1.0 0.2±0.3 4 (10 nmol/Kg) -4.5 士 0.3** 28.4±1.8** -3.6 士 1.1** 4 (30 nmol/Kg) -6.0 土 0.4** 25.5±2.6** -4.7±0·4" 3 (30 nmol/Kg) -5.5±0.4** 26.5 土 1.5** -4.3±0·3** 3 (100 nmol/Kg) -7·0±0.3** 23.4±0.7** -5.6±0·2** 154110.doc -27 - 201201829 表6b DIO小鼠在14天之治療階段中之重量變化（實例4及5) 實例(劑量） 總體體重降低 (14天中之體重 變化g數） 總食物攝入(14 天中之總g數） 脂肪量降低(14天 中之脂肪重量變化 g數） 媒劑 +0.8±0_4 38.4 土 0.5 0.1±0.2 4 (10 nmol/Kg) -4.9±0.4* 26.9±1.5* -3.6 士 0.3** 5 (10 nmol/Kg) -3.2土0.3* 31.0±1.0* -2.4 士 0.3** 5 (30 nmol/Kg) -5.0±0.4* 26.7±0.7* -3.6 士 0_4** 表6a及6b之數據顯示，在14天之DIO小鼠研究中，實例 3、4及5與媒劑治療小鼠相比可降低累積食物攝入及體 重。體重主要係由於脂肪量減少而降低。相對於媒劑， *ρ<0·01，* *ρ<0·001 (郵奈特測試（Dunnett’s test)) 在2週之治療後，在口服葡萄糖耐受測試期間對DIO小鼠 血糖波動之效應 在上述DIO研究中最後一次注射化合物後56小時，對動 物實施口服葡萄糖耐受測試。簡言之，使小鼠禁食16小 時，之後開始葡萄糖耐受測試。在〇時刻，藉由經口管飼 給予動物2 g/kg右旋糖。藉由在葡萄糖激發後0、15、30、 60及120分鐘實施尾部採血來收集血液。藉由血糖儀來量 測葡萄糖濃度。
154110.doc -28 - S 201201829 表7a.在口服葡萄糖負荷後實例3及4對葡萄糖波動之效 應。數據表示為葡萄糖曲線下面積（平均值士 SEM) 實例(劑量） 葡萄糖AUC (mg*min/dL) 平均值 SEM 鄧奈特測試 媒劑 18232 624 4 (10 nmol/Kg) 11725 448 <0.01 4 (30 nmol/Kg) 10907 252 <0.01 3 (30 nmol/Kg) 10293 179 <0.01 3 (100 nmol/Kg) 10892 396 <0.01 表7b.在口服葡萄糖負荷後實例4及5對葡萄糖波動之效 應。數據表示為葡萄糖曲線下面積（平均值土 SEM) 實例(劑量） 葡萄糖AUC (mg*min/dL) 平均值 SEM 鄧奈特測試 媒劑 24412 1511 4(10 nmol/Kg) 13719 385 <0.01 5(10 nmol/Kg) 14332 413 <0.01 5 (30 nmol/Kg) 12474 369 <0.01 表7a及7b中之該等數據顯示，實例3、4及5在口服葡萄 糖負荷後顯著降低葡萄糖波動。藉由鄧奈特測試來評估統 計學顯著性。 在膳食誘導肥胖（DIO) Long Evans大鼠中對食物攝入、鱧 重及身鱧組成之效應 使用四至五個月齡雄性腊食誘導肥胖Long Evans大鼠。 154110.doc -29- 201201829 將動物單獨飼養在具有12小時光/暗循環（在22:00時開燈） 之溫度受控（24°C )設施中，且可自由獲得食物（膳食 TD95217)及水。使動物在該設施中馴化至少2週。在第〇 天，藉由QNMR來測定身體組成並基於體重、脂肪％及痩 肉量0/〇將大鼠隨機分配至各組（n=6/組）中。在第1、4、8、 11及15天藉由皮下注射來投與化合物。在第14天再次藉由 QNMR來測定身體組成且在第16天對動物進行稱重及尾部 採企以獲得樣品來測定血糖、脂質、腺島素、高血糖素及 PYY。在C〇2安樂死後，藉由心臟刺入法採集血液樣品以 供暴露測定分析。 經16天投與實例3及4，使DIO大鼠之體重及身體組成相 對於媒劑治療DIO大鼠發生變化，其中瘦肉量百分比提高 且脂肪量百分比降低。舉例而言，在經16天投與1 〇 nmol/Kg劑量之實例3後，瘦肉量提高0.6%且脂肪量降低 1.3%。類似地’在經16天投與30 nmol/Kg劑量之實例3 後，瘦肉量提高1.3%且脂肪量降低2.3%。此外，在經16天 投與30 nmol/Kg劑量之實例4後，瘦肉量提高0.4%且脂肪 量降低1.8%。類似地，在經16天投與100 nmol/Kg劑量之 實例4後，瘦肉量提高1.8%且脂肪量降低3.2%。 投與實例3及4使得相對於媒劑治療小鼠降低DIO大鼠之 血脂含量，包括甘油三酸酯及總膽固醇，且提高游離脂肪 酸含量。舉例而言，在投與10 nmol/Kg劑量之實例3後， 甘油三酸酯及總膽固醇分別自507.3 mg/dL及104 mg/dL(媒 劑）降低至262.1 mg/dL及91 mg/dL，且游離脂肪酸自0.69 154110.doc -30· 201201829 mEq/L提高至0.94 mEq/L。類似地，在投與30 nmol/Kg劑 量之實例3後，甘油三酸酯及總膽固醇分別自507.3 mg/dL 及 104 mg/dL(媒劑）降低至 233.5 mg/dL 及 94 mg/dL，且游 離脂肪酸自0.69 mEq/L提高至1.01 mEq/L。此外，在投與 1 0 nmol/Kg劑量之實例4後，甘油三酸酯及總膽固醇分別 自 808.1 mg/dL 及 127 mg/c[L(媒劑）降低至 488.7 mg/dL 及 110 mg/dL。類似地，在投與30 nmol/Kg劑量之實例4後，甘油 三酸酯及總膽固醇分別自808.1 mg/dL及127 mg/dL(媒劑） 降低至212.2 mg/dL及104 mg/dL，且游離脂肪酸自0.67 mEq/L提高至 0.82 mEq/L。 在靜脈内葡萄糖耐受測試期間對正常大鼠之血糖波動之效應 在研究中使用.正常雄性Wistar大鼠（225-250 g)。基於進 食體重及血糖將動物隨機分配至各組中。在開始測試前16 小時向動物注射媒劑或胜肽類似物（劑量為3-400 pg胜肽含 量/kg)。在注射時移除食物。在分析前，藉由腹膜内注射 65 mg/kg苯巴比妥（Phenobarbital)來使動物麻醉，並插入 兩個導管，一個插在頸靜脈中且另一個插在頸動脈中。在 0時刻，經由靜脈導管給予動物0.5 g葡萄糖/kg。在0時刻 (葡萄糖前）、在葡萄糖激發後2、4、6、10、20及30分鐘時 自頸動脈收集血液。藉由血糖儀來量測葡萄糖濃度。藉由 Mesoscale®來量測膜島素。將功效量測為總胰島素曲線下 面積（=自t+Ο至30 min之血漿胰島素積分值）以及葡萄糖曲 線下面積的增加，其係靜脈内葡萄糖激發後葡萄糖波動之 量度8 154110.doc •3Ϊ · 201201829 投與實例3及4相對於媒劑治療大鼠提高胰島素AUC且降 低葡萄糖AUC。舉例而言，在投與50 pg/Kg劑量之實例3 後，胰島素AUC自55 ng*min/mL(媒劑）提高至137 ng*min/mL且葡萄糖AUC自7830 mg*min/dL(媒劑）降低至 6780 mg*min/dL。類似地，在投與200 pg/Kg劑量之實例3 後，騰島素AUC自55 ng*min/mL(媒劑）提高至183 ng* min/mL且葡萄糖AUC自7830 mg*min/dL(媒劑）降低至7020 mg*min/dL。此外，在投與50 pg/Kg劑量之實例4後，胰島 素AUC自44 ng*min/mL(媒劑）提高至150 ng*min/mL且葡萄 糖 AUC 自 8010 mg*min/dL(媒劑）降低至 7730 mg*min/dL。 類似地，在投與200 Mg/Kg劑量之實例4後，胰島素AUC自 44 ng*min/mL(媒劑）提高至161 ng*min/mL且葡萄糖AUC自 8010 mg*min/dL(媒劑）降低至 7420 mg*min/dL。 在投與50 Mg/Kg劑量之實例5後，胰島素AUC自41 ng*min/mL(媒劑）提高至133 ng*min/mL且葡萄糖AUC自 7739 mg*min/dL(媒劑）降低至 7202 mg*min/dL。類似地， 在投與200 pg/Kg劑量之實例5後，胰島素AUC自41 ng*min/mL(媒劑）提高至124 ng*min/mL且葡萄糖AUC自 7739 mg*min/dL(媒劑）降低至 7351 mg*min/dL。 骨骼效應 在6個月齡切除卵巢（OvX ;參見Endocrinology 144: 2008-2015)之Sprague Dawley大鼠中評估實例4。在手術後 9天開始以每曰皮下注射形式給予大鼠0、2.9、9.7或29 nmol/kg之劑量。治療持續35天，且與經假手術OvX大鼠相
154110.doc -32- S 201201829 比，實例4使食物消耗及體重劑量反應性地降低最高8%。 體重係由於脂肪量降低而減少且在OvX大鼠中未觀察到瘦 肉量變化。實例4在OvX大鼠中降低非禁食血清葡萄糖及 甘油三酸i旨。該化合物在腰椎中以劑量依賴性方式防止 OvX誘導之骨礦物質含量降低及骨礦物質密度降低，但在 股骨中段皮質骨中無效應。在OvX大鼠之股骨及腰椎中， 實例4對骨礦物質密度或骨礦物質含量無不良影響。應注 意，體重降低（在此研究中為8%)可直接影響骨量。骨強度 具有負荷依賴性且體重降低會降低載重骨上之負荷，且因 此觀察到對載重骨（即股骨皮質骨）之骨骼參數之影響較 少。依次藉由單向ANOVA及鄧奈特測試來評估統計學顯 著性。 表8 :腰椎之骨礦物質密度（BMD)變化 實例(劑量） 骨礦物質密度(mg/cm3) 平均值 SEM 相對於OvX+Veh 之顯著性 假手術+媒劑 589 9.6 <0.05 OvX+媒劑 540 10.2 n/a OvX+2.9 nmol/kg實例 4 557 10.7 n.s. OvX+9.7 nmol/kg實例 4 558 10.9 n.s. OvX+29 nmol/kg 實例4 588 21.6 <0.05 154110.doc -33- 201201829 表9:腰椎骨礦物質含量（BMC)之變化 實例(劑量） 骨礦物質密度(mg) 平均值 SEM 相對於OvX+Veh 之顯著性 假手術+媒劑 9.61 0.17 n.s. OvX+媒劑 9.13 0.24 n/a OvX+2.9 nmol/kg實例 4 9.75 0.25 n.s. OvX+9.7 nmol/kg實例 4 9.98 0.18 <0.05 OvX+29 nmol/kg 實例4 10.49 0.55 <0.05 表8及9中之數據顯示，實例4改良OvX大鼠之BMC及 BMD。 本發明化合物較佳調配成可藉由多種途徑投與之醫藥組 合物。最佳地，該等化合物用於非經腸投與。該等醫藥組 合物及其製備方法為業内所熟知。例如，參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy(A. Gennaro等人編 輯，第 19版，Mack Publishing公司 1995)。 本發明化合物通常在較寬劑量範圍内有效。舉例而言， 每週劑量在1至24 mg胜肽偶聯物或0.014至0.343 mg/Kg體 重範圍内。在一些情形下，低於上述範圍下限之劑量量可 能過量，而在其他情形下可使用更大劑量而不會引起任何 有害副作用，且因此以上劑量範圍並非意欲以任何方式限 制本發明之範圍。應理解，化合物之實際投與量將由醫師 154110.doc •34- 201201829 根據包括以下之相關情況來確定：欲治療之病 與途徑、實際投與之化合物、個別患者之年齡 應及患者症狀之嚴重程度。 熟習此項技術者可瞭解本發明之其他修改而 明之範圍。 況、所選投 、體重及反 不背離本發 154110.doc -35· 201201829 序列表 <110>美國禮來大藥廠 <120>新穎胜肽及其製備方法及用途 <130〉X18982 <140> 100109463 <141> 2011-03-18 <150〉 61/317,850 <151> 2010-03-26 <160〉 7 < 170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> 人工序列 <220〉 <223>合成構造物 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> 2位之Xaa係α-胺基異丁酸 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223〉13位之Xaa係α-胺基異丁酸 154110-序列表.doc 201201829 <220> <221> MISC_FEATURE <222> 02).彳 22) <223> 22位之Xaa係1-萘基苯胺或Phe <220〉 <221〉MISC一FEATURE <222〉09)..(29) <223> 29位之Xaa係α-胺基異丁酸 <220〉 <221> MOD_RES <222> (42)..(42) <223〉在43位及44位之Xaa不存在時，42位之Gin可經醯胺化 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (43)..(43) <223> 43位之Xaa係Cys或不存在 <220> <221> MOD_RES <222> (43)..(43) <223〉在44位之Xaa不存在時，43位之Xaa可經醯胺化 <220〉 <221> MOD_RES <222〉（43)..(43) <223> 43位之Xaa在係Cys時可經聚乙二醇化 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉（44)..(44) <223> 44位之Xaa係Cys或不存在 <220〉 <221> MOD一RES <222> (44)..(44) <223> 44位之Xaa可經醯胺化 -2- 154110-序列表.doc 201201829 <220> <221〉MOD_RES <222〉（44)..(44) <223> 44位之Xaa在係Cys時可經聚乙二醇化 <400〉 1
Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 lie Ala Gin Arg Ala Xaa Val Gin Trp Leu lie Ala Xaa Lys Gly Lys 20 25 30
Lys Gin Glu Trp Lys His Gin lie Thr Gin Xaa Xaa 35 40 <210〉2 <211> 44 <212〉PRT <213>人工序列 <220> <223>合成構造物 <220>
<221> MSC—FEATURE <222〉（2)..(2) <223> 2位之Xaa係a-胺基異丁酸 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 13位之Xaa係a·胺基異丁酸 154110-序列表.doc 201201829 <220> <221> MISC_FEATURE <222> P9).彳 29) <223> 29位之Xaa係α-胺基異丁酸 <220> <221> MOD_RES <222> (43)..(43) <223> 43位之Cys經平均分子量為約20 kDa之PEG聚乙二醇化 <220> <221〉MOD一RES <222〉（44)..(44) <223> 44位之Cys經平均分子量為約20 kDa之PEG聚乙二醇化 <220> <221> MOD_RES <222> (44)..(44) <223> 44位之Cys經醯胺化 <400> 2
Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Xaa Leu Asp Lys 15 10 15 lie Ala Gin Arg Ala Phe Val Gin Trp Leu lie Ala Xaa Lys Gly Lys 20 25 30
Lys Gin Glu Trp Lys His Gin lie Thr Gin Cys Cys 35 40
<210> 3 <211> 44 <212> PRT 154110-序列表.doc -4- s 201201829 <213>人工序列 <220> <223>合成構造物 <220〉
<221> MISC_FEATURE <222〉ρ)··(2) <223> 2位之Xaa係α-胺基異丁酸 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 13位之Xaa係α-胺基異丁酸 <220〉 <221> MISC—FEATURE <222〉（22)..(22) <223> 22位之Xaa係1-萘基苯胺 <220> <221> MISC_FEATURE <222〉(29)..(29) <223〉29位之Xaa係α-胺基異丁酸 <220〉 <221〉MOD—RES <222〉（43)..(43) <223> 43位之Cys經平均分子量為約20 kDa之PEG聚乙二醇化 <220> <221> MOD_RES <222〉（44)..(44) <223> 44位之Cys經平均分子量為約20 kDa之PEG聚乙二醇化 <220〉 <221> MOD RES 154110-序列表.doc 201201829 <222> (44)..(44) <223> 44位之Cys經醯胺化 <400〉3
Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 lie Ala Gin Arg Ala Xaa Val Gin Trp Leu lie Ala Xaa Lys Gly Lys 20 25 30
Lys Gin Glu Trp Lys His Gin lie Thr Gin Cys Cys 35 40 <210> 4 <211> 42 <212> PRT <213> 人工序列 <220〉 <223>合成構造物 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> 2位之Xaa係a-胺基異丁酸 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 13位之Xaa係a-胺基異丁酸 <220〉
<221> MISC FEATURE -6- 154110-序列表.doc 201201829 <222〉（22)..(22) <223> 22位之Xaa係1-萘基苯胺 <220> <221> MISC_FEATURE <222〉（29)..(29) <223> 29位之Xaa係α-胺基異丁酸 <400〉 4
Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 lie Ala Gin Arg Ala Xaa Val Gin Trp Leu lie Ala Xaa Lys Gly Lys 20 25 30
Lys Gin Glu Trp Lys His Gin lie Thr Gin 35 40 <210> 5 <211> 42 <212〉PRT <213> 人工序列 <220> <223>合成構造物 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> 2位之Xaa係a-胺基異丁酸 <220> <221〉 MISC FEATURE 154110-序列表.doc 201201829 <222> (13)..(13) <223> 13位之Xaa係α-胺基異丁酸 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> 29位之Xaa係α-胺基異丁酸 <400> 5
Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 lie Ala Gin Arg Ala Phe Val Gin Trp Leu lie Ala Xaa Lys Gly Lys 20 25 30
Lys Gin Glu Trp Lys His Gin lie Thr Gin 35 40 <210〉 6 <211> 44 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>合成構造物 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉（2)..(2) <223> 2位之Xaa係a-胺基異丁酸 <220>
<221 > MISC FEATURE 154110-序列表.doc 201201829 <222> (13)..(13) <223> 13位之Xaa係α-胺基異丁酸 <220> <221〉MISC—FEATURE <222> (22)..(22) <223> 22位之Xaa係1-萘基苯胺 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉（29)..(29) <223> 29位之Xaa係α-胺基異丁酸 <400〉 6
Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Xaa Leu Asp Lys 15 10 15 lie Ala Gin Arg Ala Xaa Val Gin Trp Leu lie Ala Xaa Lys Gly Lys 20 25 30
Lys Gin Glu Trp Lys His Gin lie Thr Gin Cvs Cys 35 40 <210〉 7 <211> 44 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223>合成構造物 <220>
<221> MISC FEATURE 9- 154110-序列表.doc 201201829 <222> (2)..(2) <223> 2位之Xaa係α-胺基異丁酸 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> 13位之Xaa係α-胺基異丁酸 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉（29)..(29) <223> 29位之Xaa係α-胺基異丁酸 <400〉 7
Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser lie Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 lie Ala Gin Arg Ala Phe Val Gin Trp Leu lie Ala Xaa Lys Gly Lys 20 25 30
Lys Gin Glu Tip Lys His Gin lie Thr Gin Cys Cys 35 40 -10- 154110-序列表.doc
Claims (1)
- 201201829 七、申請專利範圍： 1. 一種胜肽，其包含以下序列： Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp-Lys-Ile-Ala-Gln-Arg-Ala-Xaa'-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-Aib-Lys-Gly-Lys-Lys-Gln-Glu-Trp-Lys-His-Gln-Ile-Thr-Gln-Xaa2-Xaa3 (SEQ ID NO:l) 其中22位之Xaai係Nal或Phe ; 43位之Xaa2係Cys或不存 在；44位之Xaa3係Cys或不存在；C末端胺基酸視需要經 醯胺化；且前提係倘若43位之Xaa2或44位之Xaa3係 Cys ’則其一者或兩者視需要經聚乙二醇化。 2. 如請求項1之胜肽，其中43位之Cys或44位之Cys或二者 經18至22 kDa之PEG分子聚乙二醇化。 3. 如請求項2之胜肽，其中該PEG分子係20 kDa。 4. 如請求項2之胜肽，其中每一 PEG皆係直鏈。 5 ·如請求項1之胜肽，其包含以下序列： Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp-Lys-Ile-Ala-Gln-Arg-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-Aib-Ly s-Gly-Lys-Lys-Gln-Glu-Trp-Lys-Hi s-Gln-Ile-Thr-Gln-Cys(PEG20K)-Cys(PEG20K) (SEQ ID NO: 2) 其中該44位之聚乙二醇化Cys之羧基經酿胺化。 6.如請求項1之胜肽，其包含以下序列： Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib- Leu-Asp-Lys-Ile-Ala-Gln-Arg-Ala-Nal-Val-Gln-Trp-Leu- Ile-Ala-Aib-Lys-Gly-Lys-Lys-Gln-Glu-Trp-Lys-His-Gln- 154110.doc 201201829 Ile-Thr-Gln-Cys(PEG20K)-Cys(PEG20K) (SEQ ID NO： 3) 其中該44位之聚乙二醇化Cys之羧基經醯胺化。 7. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至6中任一項之胜肽 及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。 8. 如請求項7之醫藥調配物，其包含—或多種其他治療藥 其用於製造 9. 一種如請求項1至6中任一項之胜肽之用途 治療糖尿病之藥物。 10. 一種如請求項1至6中任一 誘導體重降低之藥物。 項之胜肽之用途， 其用於製造 154110.doc 201201829 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 154110.doc
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