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TW201116297A - Antibodies that specifically bind to the EphA2 receptor - Google Patents

Antibodies that specifically bind to the EphA2 receptor Download PDF

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TW201116297A
TW201116297A TW099133107A TW99133107A TW201116297A TW 201116297 A TW201116297 A TW 201116297A TW 099133107 A TW099133107 A TW 099133107A TW 99133107 A TW99133107 A TW 99133107A TW 201116297 A TW201116297 A TW 201116297A
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TW
Taiwan
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antibody
ser
doc
group
cancer
Prior art date
Application number
TW099133107A
Other languages
English (en)
Inventor
Herve Bouchard
Alain Commercon
Claudia Fromond
Vincent Mikol
Fabienne Parker
Ingrid Sassoon
Daniel Tavares
Original Assignee
Sanofi Aventis
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Application filed by Sanofi Aventis filed Critical Sanofi Aventis
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Description

201116297 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於專一性結合至EphA2受體之抗體或其抗原 決定基結合片段。 本發明進一步係關於包含細胞毒性劑共價結合至該抗體 之結合物及製備該結合物之方法。 【先前技術】 癌症為一種以異常信號轉導所導致之不受控制之增殖為 特徵的疾病。最危險之癌症形式為能夠擴散之惡性細胞， 擴散藉由通過侵襲直接生長至相鄰組織中或藉由通過轉移 植入遠處部位而進行。轉移性細胞已能夠脫離原發性腫 瘤，經由血流或淋巴系統移位至遠處部位，並移植於遠處 及外來微環境中。 現已清楚Eph分子涉及於諸如癌症之疾病狀態中。Eph受 體為一個獨特的受體酪胺酸激酶（RTK)家族，其為基因組 中之最大家族，由14種受體組成，分為A及B兩組，可與8 種膜結合型蝶素配位體（ephrin ligand)相互作用（Pasquale， Ε· B.等人，2005，TVaiWT-e ZieWews Mo/· Cell Biol., 6: 462-475)。Eph受體結合至其配位體誘導受體叢集、激酶活性 活化及隨後酪胺酸殘基上之細胞質域反磷酸化，從而為許 多信號傳導蛋白質產生對接位點（docking site)(Kullander, Κ·及 Klein, R·，2002，Mo/. Ce// 3: 475-486 ; Noren, Ν· K.及 Pasquale, Ε· B·，2004, Cell 16: 655-666) o 150936.doc 201116297 已在卵巢癌、乳癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌、食管 癌、腎細胞癌、子宮頸癌及黑素瘤中報導EphA2受體過度 表現。表明EphA2為惡性細胞細胞生長及存活之正調控物 (Landen，C. N.等人，2005，五jcperi. TVier· rargeis，9 (6): 1179-1187) »亦已描述EphA2在癌症中之作用，因為 單獨EphA2過度表現足以使乳腺上皮細胞轉型為惡性表型 (Zelinski等人，2001，61: 2301-2306)，並增 加向遠處部位自發轉移（Landen，C. Ν.等人，2005，£x;?eri· 77ζβ"· Jbrgeii，9 (6): 1179-1 187)。此外，愈來愈多的 證據表明，EphA2涉及於腫瘤血管生成中（Ogawa等人， 2000， Oncogene, 19: 6043-6052 ； Cheng^ A > 2002, Mol. Λμ.，1: 2-11 ; Cheng等人，2003，JVeop/aha，5 (5): 445-456 ; Dobrzanski 等人，2004, Cancer Res., 64: 910-919)。 已顯示EphA2之磷酸化與其豐度有關聯。酪胺酸磷酸化 之EphA2快速内在化並最終降解，而未磷酸化之EphA2顯 示轉換減少，並因此在細胞表面積聚。目前認為，此種模 型可能在癌症中造成高頻率EphA2過度表現（Landen，C. N. 等人，2005，77zer. Γα/^ei·?，9 (6): 1179· 1187) »然而，實際情況可能更複.雜，因為近期資料似乎 表明EphA2激酶依賴性功能及非EphA2激酶依賴性功能在 腫瘤進展中起作用（Fang W. B·, 2005, Owcogewe，24: 7859-7868) ° 已開發激動性抗體，其促進EphA2酪胺酸磷酸化及内在 150936.doc 201116297 化，最終致使抑制腫瘤細胞生長（Dodge-Zantek等人， 1999, Cell Growth & Differ., 10： 629-638 ； WO 01/12172 ' WO 03/094859、WO 2004/014292、WO 2004/101764、WO 2006/023403 ' WO 2006/047637 ' WO 2007/030642) ° 申請案WO 2006/084226揭示既不增加EphA2激酶活性又 不降低EphA2激酶活性但能夠阻礙腫瘤細胞增殖的抗體。 然而，其中並未指示此等抗體防止ephrinA 1結合至受體並 抑制ephrinAl誘導之EphA2磷酸化。WO 2004/092343中已 提議使用拮抗性抗體，但其中並未揭示明確抗體。WO 2008/010101中已描述作為真正拮抗劑之識別EphA2之抗體 以及其人類化變異體及結合物。此等抗體及其衍生物抑制 EphA2激酶依賴性腫瘤細胞生長。 儘管如此，仍然需要可用於癌症療法中的新穎而有效之 藥物。 【發明内容】 本發明之一目標為提供專一性結合至諸如EphA2之A類 Eph受體家族成員並藉由拮抗該受體而抑制該受體之細胞 活性的新穎藥劑《因而，本發明包括識別EphA2受體（較佳 人類EphA2受體）且用作該受體之拮抗劑的抗體或其片段。 此等抗體缺乏任何激動劑活性。 在一項實施例中，本發明之抗體或其抗原決定基結合片 段包含至少一個重鏈及至少一個輕鏈，該重鍵包含3個具 有由SEQ ID NO: 1、2及3表示之胺基酸序列的連續互補決 定區’且該輕鏈包含3個具有由SEQ ID NO: 4、5及6表示 150936.doc 201116297 之胺基酸序列的連續互補決定區。在一較佳實施例中該 抗體或其抗原決定基結合片段經人類化或表面重塑。在一 更佳實施例中，該抗體或其抗原決定基結合片段之重鏈包 含由SEQ ID NO: 12組成之胺基酸序列，且該抗體或其抗 原決定基結合片段之輕鏈包含由SEQ ID NO: 14組成之胺 基酸序列。 在另一實施例中，該抗體之重鏈具有胺基酸序列SEq ID NO: 18 ’且該抗體之輕鏈具有胺基酸序列sEQ id NO: 16 ° 在另一實施例中’該抗體或其抗原決定基結合片段結合 至細胞毒性劑。因此’本發明之一態樣提供本發明抗體或 其抗原決定基結合片段之結合物，其中該結合物包含選自 以下之結合細胞毒性劑： 式（XIII)之化合物：
式（XIV)之化合物： 150936.doc (XIII); V201116297
20
150936.doc 201116297 式（XXVI)之化合物：
式（XXVII)之化合物：
(XXVII)。 在一較佳實施例中，該結合物包含式（XIII)化合物作為 細胞毒性劑。在另一較佳實施例中，該結合物中每個抗體 分子所結合之類美登醇（maytansinoid)分子數目（DAR)包含 4至7個類美登醇分子/抗體分子，該DAR係藉由以分光光 150936.doc 201116297 度法量測在252 nm及280 nm下之吸光度之比來測定。 在另一態樣中’提供一種製備結合物之方法’該方法包 含以下步驟： ⑴使視情況經緩衝之細胞結合劑水溶液與細胞毒性化合 物溶液接觸； (Π)接著視情況分離⑴中所形成之結合物與未反應之試 劑及溶液中可能存在之任何聚集物； 其中’該細胞結合劑為如請求項1至3之抗體，且細胞毒 性劑選自以下： 式（XVII)之化合物：
(XVII) 其中Y為N-丁二醯亞胺基氧基、N_績基丁二醯亞胺基氧 基、N-鄰苯二曱醯亞胺基氧基、…磺基鄰苯二曱醯亞胺基 氧基、2-硝基苯基氧基、4-硝基笨基氧基、2,4_二硝基笨 基氧基、3-磺醯基-4-硝基苯基氧基、3_羧基_4_硝基苯基氧 基、咪°坐基或鹵素原子；及 式（XVIII)之化合物·· 150936.doc 201116297
其中Y為N-丁二醯亞胺基氧基、N-磺基丁二醯亞胺基氧 基、N-鄰苯二甲醯亞胺基氧基、N-磺基鄰笨二甲醞亞胺基 氧基、2-硝基苯基氧基、4-硝基苯基氧基、2,4-二硝基苯 基氧基、3-磺醯基-4-硝基苯基氧基、3-羧基-4-硝基苯基氧 基、味n坐基或鹵素原子。 可由該方法獲得之結合物包含在本發明範疇内。詳& 之，該結合物具有選自以下之結構’式（XV)之結構.
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佳實施例中’ n包含4至7。在另一較佳實施例中，本發明 之結合物具有式（XV)之結構。 本發明抗體或其抗原決定基結合片段對抗原之親和力不 觉結合製程影響；另一方面，先前技術中細胞毒性劑與抗 體之結合導致對EPhA2之親和力降低。與先前技術之結合 物相比，本發明之該抗體或其抗原決定基結合片段在結合 至細胞毒性劑時展示更高效能，且在殺死表現£151^2之腫 瘤、、’田胞方面更具選擇性。另夕卜，本發明之結合物顯示比先 别技術之結合物適宜的藥物動力學性質，諸如清除率更 慢 '暴露更佳及結合物之活體内穩定性增加。該等性質以 '高細胞毒性效能及選擇性將尤其適用於研發安全而有效 的藥物。 本發明涵蓋 種醫樂組合物，其含有本發明之相 :、抗原決定基結合片#，或其結合物，及醫藥學上可 栽劑或賦形劑。本發明之抗體或其抗原衫基結合 又或其結合物可用作藥物。詳言之，其可用於製造治療 150936.doc 201116297 癌症之藥物。在一 ^ 牧佳貫細•例中，該癌症係選自癌瘤，包 晚;癌导ί癌、結腸癌、賢癌、肝癌、肺癌、卻氣癌、 腺癌β癌、子宮頸癌、甲狀腺癌及皮膚癌；包括鱗狀 n # m血性腫瘤’包括白血病、急性淋巴球性 病急丨生淋巴母細胞白血病、b細胞淋巴瘤、T細胞淋 巴瘤伯基特氏淋巴瘤（Burkitt，s lymphoma);骨髓系造血 I"生腫瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病及前髓細胞白血 病’起源於間葉細胞之腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤 及骨肉瘤；其他腫瘤，包括黑素瘤、精原細胞瘤、畸胎 癌、甲狀腺濾泡癌、著色性乾皮病、角化棘皮瘤；中樞及 周邊神經系統腫瘤，包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神 經膠質瘤及神經鞘瘤。 【實施方式】 除非本文另有定義，否則關於本發明使用之科學及技術 術語應具有一般熟習此項技術者通常所理解之含義。此 外’除非上下文另有所需’否則單數術語應包括複數且複 數術語應包括單數。一般而言，關於本文所述之細胞及組 織培養物、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋 白質及核酸化學及雜交使用之命名法及其技術為此項技術 中熟知且常用者。除非另外指出，否則採用分子生物學 (包括重組技術）、微生物學、細胞生物學、生物化學及免 疫學之習知技術來實施本發明，該等技術在此項技術範圍 内。該等技術已於文獻中詳盡解釋，諸如Molecular
Cloning: A Laboratory Manual，第 2 版（Sambrook 等人， 150936.doc 12 201116297 1989) ; Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait編，1984)； Animal Cell Culture(R. I. Freshney編，1987) ; Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.) ! Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel等人編，1987，及定期更 新）；PCR: The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人編， 1994) ； A Practical Guide to Molecular Cloning(Perbal Bernard V., 1988) ； Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas等人’ 2001)。根據製造商之說明書如此項技術中 通常所實現或如本文中所述來執行酶促反應及純化技術。 關於本文所述之分析化學、合成有機化學及醫藥化學所使 用之命名法及其實驗室程序及技術為此項技術中熟知且常 用者。使用標準技術進行化學合成、化學分析、醫藥製 備、調配及傳遞，及治療患者。 本文中提供能夠專一性結合EphA2受體並拮抗該受體之 新抗體及其片段。特定言之’本發明之新穎抗體或片段專 一性結合細胞表面上之Eph受體，但較佳缺乏任何激動劑 活性。另一方面，即使在其配位體存在下，其亦能夠抑制 該受體之細胞功能。 如本文所使用，術語「EphA2受體」係指屬於Eph受體 家族（於 Pasquale，Ε· B.等人，2005，施/.
Ce// 6，46；2_475中論述）且包含例如如基因庫寄存編 號 NM_00443 1(人類 EphA2)、NM_010139(鼠類 EphA2)或 NXM 一345596(大鼠EphA2)中之胺基序列的酪胺酸激酶。人 類EphA2為較佳EphA2受體。如本文所使用，術狂 150936.doc 201116297 「EphA2配位體」係指結合並視情況激活EphA2受體（例如 刺激EphA2受體之自體磷酸化）的蛋白質。本文中之較佳 EphA2配位體為「ephrinA 1」，其結合至EphA2受體且包含 例如如基因庫寄存編號NM_004428(人類ephrinAl)中之胺 基序列。 如本文所使用，術語「拮抗劑」係指能夠抑制諸如 EphA2受體之靶分子之一或多種生物活性的分子。拮抗劑 可藉由干擾受體結合至配位體及配位體結合至受體、藉由 減少可能由配位體誘導之EphA2構酸化，及/或藉由抑制由 結合該配位體所誘導之細胞内路徑，及/或藉由抑制EphA 受體之同源/異源寡聚而起作用。拮抗劑可完全阻斷受體-配位體相互作用或可實質上減少該等相互作用。出於本發 明之目的，拮抗劑之所有該等介入點應視作等效的。因 而，本發明範疇内包括結合至EphA2受體、EphA2配位體 或EphA2受體與EphA2配位體之複合物的拮抗劑（例如中和 抗體）；拮抗EphA2受體與EphA2配位體間之相互作用的 EphA2受體或EphA2配位體之胺基酸序歹ij變異體或衍生 物；可溶性EphA2受體或可溶性EphA2配位體，視情況融 合至諸如免疫球蛋白區（例如免疫黏附素）之異源分子；包 含EphA2受體締合EphA2配位體之複合物；結合至EphA2 受體或EphA2配位體之合成或天然序列肽。在一較佳實施 例中，拮抗劑為抗體。 如本文所使用，術語「激動劑」係指能夠激活把分子之 一或多種生物活性的任何化合物，包括蛋白質、多肽、 150936.doc -14- 201116297 狀、抗體、抗體片段、結合物、大分子、小分子。EphA2 激動劑係藉由刺激蛋白質磷酸化，藉此觸發該蛋白質降解 而起作用。 因而’在一較佳實施例中，本發明提供抗EphA2單株抗 體、抗EphA2人類化抗體及抗EphA2抗體之片段以及其他 特徵。本發明之各抗體及抗體片段經設計專一性識別並結 合EphA2受體，並用作EphA2受體拮抗劑，抑制由EphA2 配位體所誘導之磷酸化。
EphA2受體屬於在配位體結合後增加細胞質尾鱗酸化以 便與各種銜接子及信號傳導蛋白相互作用，從而激活不同 下游細胞信號傳導路徑的受體家族（Kullander，K.及Klein， R., 2002, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 3: 475-486 ； Noren，N. K.及 Pasquale, E. B·，2004, Ce// h公《α/., 16: 655-666)。如本文所使用，術語「EphA2介導之信號傳導」係 指回應EphA2結合配位體而發生之所有細胞事件《儘管先 前技術中所揭示之抗體可激動EphA2受體，且特定言之增 加EphA2蛋白質之酪胺酸磷酸化，但本發明之抗體及抗體 片段較佳缺乏任何該等激動性質。特定言之，其自身不能 刺激EphA2磷酸化。如同WO 2008/010101中所描述之抗 體，本發明之拮抗性抗體及抗體片段缺乏任何激動劑活 性。在一特定實施例中，不同於先前技術中所描述之其他 抗體（Dodge-Zantek等人，1999，Ce// GrowA 10: 629-638 ; WO 01/12172、WO 03/094859、WO 2004/ 014292、WO 2004/101764、WO 2006/023403、WO 2006/ 150936.doc 15 201116297 047637、WO 2007/030642)，其不能促進EphA2之酪胺酸 填酸化。 本發明提供明確拮抗性抗EphA2抗體。即使存在該 EphA2受體之配位體（例如ephrinAl)，本發明之抗體及抗 體片段亦能夠抑制EphA2受體之細胞功能。在一項實施例 中’本發明之抗體及抗體片段可抑制配位體結合至EphA2 受體。在一較佳實施例中，藉由本發明所提供之抗體及其 片段防止ephrinAl結合至EphA2。特別是在另一實施例 中，即使存在ephrinAl，本發明之抗體及抗體>}段亦能夠 抑制Eph A2受體之酪胺酸磷酸化。 抗體 術語「抗體」在本文中以最廣義使用，且特別涵蓋諸如 IgG、IgM、IgA、IgD及IgE之任何同型之單株抗體（包括全 長單株抗體）、多株抗體、多專一性抗體、嵌合抗體及抗 體片段。與特定抗原具反應性之抗體可藉由重組法產生， 諸如在噬菌體或類似載體中選擇重組抗體庫，或藉由用抗 原或編碼抗原之核酸使動物免疫。 典型抗體包含藉由二硫鍵接合之2個相同重鏈及2個相同 輕鏈。各重键及輕键含有恒定區及可變區。如本文所使 用’「VH」或「VH」係指抗體免疫球蛋白重鍵之可變區， 包括 Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’或 F(ab’)2 片段之重鍵。提 及「VL」或「VL」係指抗體免疫球蛋白輕鍵之可變區， 包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab')2片段之輕鏈。各 可變區含有3個區段，稱為「互補決定區」（r cdr」）或 150936.doc •16- 201116297 同變區」’主要負責結合抗原之抗原決定基。其通常稱 為CDR1、CDR2及CDR3 ’自N末端依序編號。可變區之更 高度保守部分稱作「構架區」（「FR」）。天然重鏈及輕鍵 之可變域各包含4個FR區，主要採用β摺疊構型，由3個 CDR連接，該等CDR形成環連接且在一些情況下形成β指 疊結構之一部分。各鏈中之CDR經由FR區緊接地固持在一 起，且與另一鏈之CDR—起幫助形成抗體之抗原結合位點 、參看 从專 k，Sequences of Proteins of Immun〇l〇gicai /«ieresi，第 5 版，National Institute of Health, Bethesda, MD (1991))。 恆定域不直接涉及抗體結合至抗原，但展現各種效應功 能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性（ADCC)、經由結 合至Fey受體產生之吞噬作用、經由新生兒fc受體（FcRn) 產生之半衰期清除率，及經由補體級聯之C1q組分產生之 補體依賴性細胞毒性（CDC)。 來自任何脊椎動物物種之抗體（免疫球蛋白）之r輕鏈」 可基於其恆定域之胺基酸序列而歸屬於稱為κ及λ兩個明顯 不同類型之一。 視重鏈恆定域之胺基酸序列而定，抗體（免疫球蛋白）可 歸屬於不同類別。有5種主要類別之免疫球蛋白：IgA、 IgD、IgE、IgG及IgM ’且其中幾類可進一步分成子類（同 型），例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA2。對應 於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ 及μ。在輕鏈及重鏈内，可變區及恆定區經由具有約1 2個 150936.doc -17- 201116297 或12個以上胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括具有 約10個以上胺基酸之「D」區（參看例如 /wwwtio/o幻；C/z. 7，Paul，W.編’第 2版，Raven Press，Ν· Y., 1989)。不同類別免疫球蛋白之次單元結構及三維構型為 熟知的且一般描述於例如Abbas等人（Ce//w/ar and从〇厂 /www«o/o幻；，第 4版 ’ W. B. Saunders，Co., 2000)中。抗體 可能為較大融合分子之一部分’該較大融合分子由該抗體 與一或多種其他蛋白質或肽共價或非共價締合所形成。 「多株抗體」為在一或多種其他不相同抗體中或在一或 多種其他不相同抗體存在下產生之抗體。一般而言，多株 抗體係由B淋巴細胞在數種可產生不相同抗體之其他b淋 巴細胞存在下產生。多株抗體通常直接獲自免疫動物。 如本文所使用’「單株抗體」為獲自實質上同源抗體群 體的抗體’亦即除可能少量存在之可能天然產生之突變 外’形成此群體之抗體基本上相同。此等抗體針對單一抗 原決定基，且因此具高度專一性。 出於本文之目的’「裸抗體」為未結合至細胞毒性部分 或放射性標記的抗體。 「抗原決定基」為抗原上結合抗體之位點。其可能由鄰 近殘基形成，或藉由非鄰近殘基藉由摺疊抗原蛋白質而緊 接來形成。由鄰近胺基酸所形成之抗原決定基通常在暴露 於變性溶劑時保留，而由非鄰近胺基酸所形成之抗原決定 基通常在該暴露下損失。 如本文所使用，術語「KD」係指特定抗體/抗原相互作 150936.doc -18- 201116297 Z之解離吊數。「結合親和力」一般係指分子（例如抗體）之 單合位點與其結合搭配物（例如抗原）間之非共價相互 作用之總強度。除非另有指#，否則如本文所使用，「結 〇親和力」係指反映結合對成員（例如抗體與抗原）間之1:1 相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物Υ之親和 力般可由KD表示。可由此項技術中已知之常用方法，包 括本文所述之方法測量親和力。低親和力抗體一般緩慢結 合抗原且傾向於輕易解離，而高親和力抗體一般較快結合 抗原且j貝向於保持結合較長時間。此項技術中已知多種測 量結合親和力之方法，任一者可用於本發明之目的。 本發明由鼠類抗EphA2抗體’本文中mu2Hl 1R35R74進 行°玄抗體關於以下方面詳盡表徵：輕鏈及重鏈之胺基酸 序列、CDRs之識別、表面胺基酸之識別、及其重組形式 表現方式。 本發明之鼠類抗體可以例如由抗體53 2H1丨之定點誘變 獲得。53.2H11抗體係由根據布達佩斯條約⑺“邛如 Treaty)於6月16日以寄存編號PTA_7662寄存於美國菌種保 存中心（American Type Culture Collection)的融合瘤產生， 且描述於PCT申請案WO 2008/010101中。因而，53 2HU 之輕鏈及重鏈之胺基酸序列、CDRs之識別、表面胺基酸 之識別，以及編碼該輕鏈及重鏈之聚核苷酸序列均揭示於 WO 2008/010101 中。 本文中揭示抗體mu2Hl 1R35R74輕鏈及重鏈及其人類化 型式之主要胺基酸及DNA序列。在一項實施例中，本發明 150936.doc -19· 201116297 提供抗體或其抗原決定基結合片段，其包含一或多個具有 選自由SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6組成之群之胺基酸 序列的CDR。 在一個較佳實施例中，本發明抗體包含至少一個重鏈及 至少一個輕鏈，該重鏈包含3個具有選自由SEq ID N〇: 1、2、3組成之群之胺基酸序列的連續CDRs，該輕鏈包含 3個具有選自由SEQ ID NO: 4、5、6組成之群之胺基酸序 列的連續CDRs » 在一個較佳實施例中’該等單株抗體或其抗原決定基結 合片段之互補位在輕鍵中包含：環以之Arg35 ; L2之 Tyr54、Arg58及 Asp60。 在一較佳實施例中’該等單株抗體或其抗原決定基結合 片段之互補位在重鏈中包含：環出之Thr3〇、Aia31、
Tyr32及 Tyr33 ; H2之 Asn52、Tyr54、Asn55及 Phe57 ;及 H3 之 Glu99、PhelOO、TyrlOl、Glyl02、Tyrl03及 Tyrl05。 該等抗體或其抗原決定基結合片段可包含以下突變： 在以下位置：Thr H28 ; 在輕鏈上之以下數個位置中之一者處：35、26至31、34 至37 、 55 、 56 、 57 、 59及94至102 ;及/或 在重鍵上之以下數個位置中之一者處：28、54及57。 在另一實施例中’本發明之抗體專一性結合至人類 EphA2受體之抗原決定基，包含EphA2受體細胞外域之 LBD 的殘基 Gly49、Lys50、Gly51、Asp53、Cys70、 Asn71、Val72、Met73、Ser74、Gly75、Gln77、Phel08、 150936.doc •20· 201116297
Prol09、Glyl 10、Gly 111、Seri 13 及 Seri 14，或其保守取 代之形式。 在另一實施例中，本發明之抗體包含具有由SEQ ID NO 8組成之胺基酸序列的VH。在另一較佳實施例中，本發明 之抗體包含具有由SEQ ID NO 10組成之胺基酸序列的。 經人類化或表面重塑之2H11R35R74抗體 如本文所使用，術語「人類化抗體」係指含有來源於非 人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。如本文所使用， 「嵌合抗體j為恆定區或其一部分經改變、置換或交換從 而使可變區連接至不同物種之怪定區或屬於另一抗體類別 或子類的抗體。「嵌合抗體」亦係指可變區或其一部分經 改變、置換或交換從而使恆定區連接至不同物種之可變區 或屬於另一抗體類別或子類的抗體。 人類化之目標在於降低異種抗體（諸如鼠類抗體）之免疫 原性以便引入人類中，同時維持該抗體之完全抗原結合親 和力及專一性。可使用數種技術產生人類化抗體或經調適 以便不被其他哺乳動物排斥之抗體，諸如表面重塑及cDR 移植。如本文所使用，表面重塑技術使用分子模型化、統 計分析及突變誘發之組合來改變抗體可變區之非cdr表面 以使其類似於乾宿主之已知抗體之表面。 於抗體表面重塑之策略及方法以及用&降低抗體在不 主内之免疫原性的其他方法於美國專利5,㈣，⑷中揭 示丄該專利係以全文引用的方式併入本文中。簡而言之， 較佳方法中，（1)產生抗體重鏈及輕鏈可變區集合之位 I50936.doc 201116297 置比對以獲得一組重鏈及輕鏈可變區構架表面暴露之位 致；（2)確定 置，其中所有可變區之位置比對至少約98% — 齧齒動物抗體（或其片段）之一組重鍵及輕鍵可變區構架表 面暴露之胺基酸殘基；（3)識別一組與該組齧齒動物表面暴 露之胺基酸殘基最接近一致的重鏈及輕鏈可變區構架表面 暴露之胺基酸殘基，（4)除在該齧齒動物抗體互補決定區之 任何殘基之任何原子5 A以内之彼等胺基酸殘基以外，步 驟（2)中所確定之該組重鏈及輕鏈可變區構架表面暴露之胺 基酸殘基經步驟（3)中所識別之該組重鍵及輕鍵可變區構架 表面暴露之胺基酸殘基取代；及（5)產生具有結合專一性之 人類化齧齒動物抗體。 在PCT申請案WO 2009/032661中已描述基於識別可撓性 殘基而使抗體人類化之另一較佳方法。該方法包含以下步 驟·（ 1)構建親本mAb之同源模型並進行分子動力學模擬； (2)分析可撓性殘基並識別非人類抗體分子之最具可撓性之 殘基，以及識別可能為異質性或降解反應之來源的殘基或 基元，（3)識別呈現與親本抗體最相似之識別區域全體的人 類抗體；（4)確定欲突變之可撓性殘基，可能為異質性及降 解來源的殘基或基元亦進行突變；及（5)檢查已知τ細胞或 Β細胞抗原決定基之存在。可使用分子動力學計算，使用 内隱溶劑模型（implicit solvent model)發現可撓性殘基，該 模型解釋水溶劑與蛋白質原子在模擬時段内的相互作用。 抗體可使用各種其他技術進行人類化，包括Cdr移植 (EP 0 239 400 ; WO 91/09967 ;美國專利第 5,530，101 號及 150936.doc -22- 201116297 第 5,5 85,089號）、鑲飾或表面重塑（Ep 〇 592 1〇6 ; Ep 〇 5i9 Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28(4/5)： 489-498 ； Studnicka G. M.# A * 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814 ; R〇guska Μ·Α.等人，1994，户"^ aw. m 91:969·973)，及鏈改組（美國專利第 5,565,332號）。 在某些實施例中’抗體或其抗原結合片段、變異體或衍 生物之可變區及恆定區為完全人類的。完全人類抗體可使 用此項技術中已知之技術製造。舉例而言，針對專一抗原 之完全人類抗體可藉由將該抗原投與轉殖基因動物來製 備，該轉殖基因動物已經改質以便回應抗原攻擊（antigenic challenge)產生該等抗體，但其内源基因座已喪失功能。 可用於製造該等抗體之例示性技術描述於以下美國專利 中.6,150,584’ 6,458,592; 6，420,140。其他技術為此項 技術中已知。完全人類抗體同樣可藉由各種呈現技術產 生’例如喔菌體呈現或其他病毒呈現系統。亦參看美國專 利第 4,444,887 號、第 4,716，111 號、第 5,545,806 號及第 5,814,3 18號；及國際專利申請公開案第w〇 98/46645號、 第 WO 98/50433 號、第 WO 98/24893號、第 WO 98/16654 號、第 WO 96/34096 號、第 WO 96/33735 號、及第 w〇 91/10741號（該等參考文獻係以全文引用的方式併入本文 中）。 本發明提供人類化抗體或其片段，其識別EphA2受體並 充當拮抗劑。在一較佳實施例中，該等人類化抗體或其抗 150936.doc -23- 201116297 原決定基結合片段另外能夠抑制表現EphA2受體之癌細胞 生長°在另一實施例中’該等人類化抗體或其抗原決定基 結合片段另外能夠抑制表現EphA2受體之轉移性癌細胞遷 移。 該人類化抗體之一較佳實施例為人類化2H11r35r74抗 體或其抗原決定基結合片段。 在另一較佳實施例中，本發明之人類化抗體係藉由編碼 hu53-2Hl l(WO 2008/010101)(本文中稱為 hu2Hl 1)之聚核苷 酸序列的定點突變誘發而獲得。 在更佳實施例中’提供2H11R35R74抗體之表面重塑或 人類化型式’其中該抗體或其片段之表面暴露之殘基在輕 鏈及重鏈中經置換以更接近類似於已知人類抗體表面。本 發明之人類化2H11R35R74抗體或其抗原決定基結合片段 具有改良之性質。舉例而言，人類化2miR35R74抗體或 其抗原決定基結合片段專一性識別EphA2受體。更佳地， 人類化2H11R35R74抗體或其抗原決定基結合片段另外能 夠抑制表現EphA2受體之細胞生長。 2H11R35R74抗體之人類化型式在本文中亦關於以下方 面詳盡表徵：其輕鏈及重鏈可變區之各別胺基酸序列、輕 鏈及重鏈可變區基因之DNA序列、CDR之識別、其表面胺 基Ssc之識別及揭示其重組形式表現方式。然而，本發明之 範疇不限於包含此等序列之抗體及片段。而是所有專一性 結合至EphA2受體之抗體及片段均包括在本發明中。專一 性結合至EphA2受體之抗體及片段較佳拮抗受體之生物活 I50936.doc • 24· 201116297 性。更佳地，該等抗體進一步實質上缺乏激動劑活性。因 而，本發明之抗體及抗原決定基結合抗體片段可能在其骨 架、CDR及/或輕鏈及重鏈之胺基酸序列方面不同於 2H11R35R74抗體或其人類化衍生物，而仍在本發明範疇 内。 已藉由對2H11R35R74之Fab片段與EphA2受體之細胞外 域的複合物晶體結構進行解析來測定2H11R35R74抗體之 CDR。已識別2H11R35R74中與EphA2之細胞外域相互作用 的殘基。因此’提供藉由例如本發明抗體之親和力成熟而 產生之具有改良性質之抗體及片段。 已識別可能產生53.2H11之小鼠輕鏈igVK及Jk生殖系基 因以及重鏈IgVh及Jh生殖系基因，並揭示於w〇 2008/ 01 0 1 0 1中。該等生殖系序列寄存編號分別為MMU23 11 96 及AF 3 0 3 8 3 3。該等生殖系基因序列適用於識別抗體中包括 CDR中之體細胞突變。 2H11R3 5R74抗體之重鍵及輕鏈可變區序列及其cdr序 列先前未知且在本申請案中加以闡述。該資訊可用於產生 2H11R35R74抗體之人類化型式。亦可能藉由hu2ml之定 點突變誘發獲得本發明之人類化2H11R35R74抗體。此等 人類化抗EphA2抗體或其衍生物亦可用作本發明結合物之 細胞結合劑。 因而，在一項實施例中，本發明提供人類化抗體或其抗 原決定基結合片段，其包含一或多個具有選自由SEQ m NO. 1、2、3、4、5、6組成之群之胺基酸序列的CDR。在 150936.doc -25- 201116297 一較佳實施例中，本發明之人類化抗體包含至少一個重鏈 及至少一個輕鏈，其中該重鏈包含3個具有由SEQ ID NO: 1、2及3表示之胺基酸序列的連續CDR，且其中該輕鏈包 含3個具有由SEq NO: 4、5及6表示之胺基酸序列的連 續 CDR。 在一項實施例中，本發明提供人類化2H11R35R74抗體 或其片段，其包含具有由SEQ ID NO. 12組成之胺基酸序 列的VH。在另一實施例中，本發明提供人類化 2H11R35R74抗體或其片段，其包含具有由SEQ ID NO 14 組成之胺基酸序列的Vl。 在一較佳實施例中，提供人類化2H11R35R74抗體，其 包含至少一個重鏈及至少一個輕鏈，其中該重鏈包含3個 具有由SEQ ID NO: 1、2及3表示之胺基酸序列的連續 CDR ’其中該輕鏈包含3個具有由SEQ ID NO: 4、5及6表 示之胺基酸序列的連續CDR，其中該重鏈具有由SEq ID NO. 12組成之胺基酸序列’且其中該輕鏈具有由SEq id NO. 14組成之胺基酸序列。 聚核苷酸、載體及宿主細胞。 提供編碼本發明抗EphA2抗體之核酸。在一項實施例 中，該核酸分子編碼抗EphA2免疫球蛋白之重鏈及/或輕 鏈。在一較佳實施例中，單一核酸編碼抗£沖八2免疫球蛋 白之重鏈且另一核酸分子編碼抗EphA2免疫球蛋白之輕 鏈。 在本發明之另一態樣中，提供具有選自SEQ ID Ν〇: ι、 150936.doc -26- 201116297 m 5' 6' 8' 1()' 12、14' 16及18之群的胺基酸序 列之編碼多肽的聚核苷酸。在一較佳實施例中本發明之 聚核苷酸係選自由SEQ ID NO: 7、9、11、13、15及17組 成之群。本發明不限於該聚核苷酸本身，而是亦包括所有 與該％•聚核苦酸呈現至少80% —致性的聚核皆酸。 如本文所提及之術語「聚核苷酸」意謂長度為至少丨〇個 驗基之核苷酸（核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類型 核苷酸之修飾形式）之聚合形式。該術語包括DNA之單股 及雙股形式。 如本文所使用，術語「經分離聚核苷酸」應意謂基因 組、cDNA或合成起源或其某種組合之聚核苷酸，該「經 分離聚核苷酸」就其起源而言（1)不與在自然界中發現與該 「經分離聚核苷酸」締合的聚核苷酸之整體或一部分締 合；（2)可操作地連接至在自然界中不與其連接之聚核苷 酸，或（3)在自然界中不以較大序列之一部分形式出現。 本發明提供包含本發明聚核苷酸之載體。在一項實施例 中，該載體含有編碼抗EphA2免疫球蛋白之重鏈的聚核普 酸。在另一實施例中，該聚核苦酸編碼抗EphA2免疫球蛋 白之輕鏈。本發明亦提供包含編碼融合蛋白、經修飾抗 體、抗體片段及其探針之聚核苷酸分子的載體。 為表現本發明抗EphA2抗體之重鏈及/或輕鏈，將編碼該 等重鏈及/或輕鏈之聚核苷酸插入表現載體中以使該等基 因可操作地連接至轉錄及轉譯序列。 「可操作地連接」之序列包括與相關基因鄰近之表現控 150936.doc -27· 201116297 制序列以及以反式作用或遠端作用控制相關基因的表現控 制序列。如本文所使用，術語「表現控制序列」係指實現 其所接合之編喝序列之表現及加工所必需的聚核苦酸序 列。表現控制序列包括適當轉錄起始序列、終止序列、啟 動子序列及強化子序列；有效RNA加工信號，諸如拼接及 聚腺苷酸化信號；使細胞質mRNA穩定之序列；提高轉譯 效率之序列（亦即Kozak共同序列）；增強蛋白質穩定性之 序列；及必要時增強蛋白質分泌之序列。該等控制序列之 性質視宿主生物體而不同；在原核生物中，該等控制序列 一般包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列；在真 核生物中，該等控制序列一般包括啟動子及轉錄終止序 列。術語「控制序列」意欲至少包括對於表現及處理而言 必須存在之所有組分，且亦可包括宜存在之其他組分例 如前導序列及融合搭配物序列。 如本文所使用，術語「載體」意欲指能夠轉運其所連接 之另一核酸的核酸分子。一種類型載體為「質體」，其係 指可接合其他DNA區段之環狀雙股0?^厶環。另一類型載體 為病毒載體，其中其他DNA區段可接合至該病毒基因組 中。某些載體能夠在引入該等載體之宿主細胞中自主複製 (例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載 體）。其他載體（例如非游離型哺乳動物載體）可在引入宿主 細胞中後整合至宿主細胞基因組中，藉此與宿主基因組一 起複製。 某些載體能夠引導與其可操作地連接之基因的表現。該 150936.doc •28· 201116297 等載體在本文中稱為「重組表現載體」（或簡稱為「表現 載體」）。一般而言’適用於重組dna技術中之表現載體 呈質體形式。「質體」與「載體」在本說明書中可互換使 用’因為質體為最常用之载體形式'然而，本發明意欲包 括表現載體之該等形式，諸如細菌質體、YAC、黏^體、 反轉錄病毒、EBV衍生之游離基因體，及熟習此項技術者 應已知之適宜於確保本發明抗體重鏈及/或輕鏈之表現的 所有其他載體。熟習此項技術者應認識到編碼重鏈及輕鏈 之聚核苷酸可選殖於不同載體或相同載體中。在一較佳實 施例中’該聚核苷酸在相同載體中進行選殖。 本發明之聚核苷酸及包含此等分子之載體可用於轉型適 合哺乳動物宿主細胞或熟習此項技術者已知之任何其他類 型宿主細胞。如本文所使用，術語「重組宿主細胞」（或 簡稱為「佰主細胞」）意欲指其中已引入重組表現載體的 細胞。應瞭解該等術語不僅意指特定個體細胞，而且亦指 該細胞之子代。由於可能因突變或環境影響而在繼代中出 現某些修飾，因此該子代實際上可能與親本細胞不一致， 但仍包括在如本文所使用之術語「宿主細胞」之範疇内。 了精由用於向侣主細胞中引入聚核苦酸之任何已知方法 進行轉型。該等方法為熟習此項技術者所熟知，且包括聚 葡萄糖介導之轉型、磷酸鈣沈澱、凝聚胺介導之轉染、原 生質體融合、電穿孔、聚核苷酸封裝於脂質體中，基因搶 注射及向細胞核中直接顯微注射DNA。 抗體片段 150936.doc -29- 201116297 本發明之抗體包括上文所論述之全長抗體以及抗原決定 基結合片段。如本文所使用，「抗體片段」包括保留結合 至該全長抗體所識別之抗原決定基之能力的抗體任何部 分，一般稱為「抗原決定基結合片段」。抗體片段之實例 包括但不限於Fab、Fab，及F(ab，）2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單 鍵抗體、二硫化物連接之Fv(dsFv)及包含^或^區之片 •k。抗原決定基結合片段，包括單鏈抗體，可包含單獨之 可變區或可變區與以下全部或一部分之組合：鉸鏈區、 CH1、CH2及 CH3域。 該等片段可含有Fab片段或F(ab，）2片段中之一或兩者。 抗體片段較佳含有完整抗體之所有6個CDR ’但含有少於 所有該等區域，諸如含有3、4或5個CDR之片段亦具功能 性。此外，片段可能為或可能組合以下任一免疫球蛋白類 別中之成員.IgG ' IgM、IgA、IgD或IgE，及其子類。
Fab及F(ab’）2片段可能使用諸如木瓜蛋白酶（Fab片段）或 胃蛋白酶（F(ab，)2片段）之酶藉由蛋白質水解裂解來產生。 「單鏈FV」（「scFv」）片段為含有抗體重鏈可變區（vh) 之至少一個片段連接至抗體輕鏈可變區（VL)之至少一個片 段的抗原決定基結合片段。連接子可能為可撓性短肽，其 經選擇以確保（VL)與（VH)區在連接後進行適當三維摺疊以 便維持產生單鍵抗體片段之完整抗體的乾分子結合專一 性。（VL)或（VH)序列之羧基末端可藉由連接子共價連接至 互補（VL)或（VH)序列之胺基酸末端。 本發明之單鏈抗體片段含有具有本說明書中所述完整抗 J50936.doc •30· 201116297 體之至少-個可變區或互補衫區（CDR)的胺基酸序列， 但缺乏彼等抗體之某些或所有恆定域。此等恆定域並非抗 原結合所必需，但構成完整抗體結構之主要部分。因此， 單鏈抗體片段可能克服-些與使用含部分或所有恆定域之 抗體相關的問題。舉例而言’單鏈抗體片段傾向於不含生 物分子與重鏈怪定區之間的不良相互作用，或其他不需要 之生物活性。另外’單鏈抗體片段顯著小於完整抗體，並 且可能因此具有高於完整抗體之毛細管滲透性使得單鏈 抗體片段可更有效地定位並結合至靶抗原結合位點。又， 可在原核生物細胞中以相對大規模產生抗體m而促 進其產生。此外’單鏈抗體片段之尺寸相對較小使其在接 受者中引起免疫反應的可能性小於完整抗體。 單鏈抗體片段可藉由分子選殖、抗體嗔菌體呈現文庫或 熟習此項技術者熟知之類似技術來產生。此等蛋白質可在 例如真核細胞或原核細胞，包括細菌中產生。本發明之抗 原決定基結合片&亦可使用&項技術中已知之各種嗔菌體 呈現法來產生。在噬菌體呈現法中，功能抗體域呈現於噬 菌體粒子之表面上，該等噬菌體粒子攜帶編碼該等功能抗 體域之聚核苷酸序列。特定言之，可利用該噬菌體呈現由 谱系或組合抗體庫（例如人類或鼠類）表現之抗原決定基結 合域。可用抗原，例如使用結合至或捕捉於固體表面或珠 粒之經標記抗原來選擇或識別表現結合相關抗原之抗原決 疋基結合域的噬菌體。此等方法中所使用之噬菌體通常為 絲狀噬菌體，其包括由具有Fab、Fv或二硫化物穩定之Fv 150936.doc -31 - 201116297 抗體結構域重組融合至噬菌體基因ΠΙ或基因VIII蛋白質之 噬菌體表現的fd及Ml 3結合域。 可用於製造本發明之抗原決定基結合片段的噬菌體呈現 法之實例包括以下文獻中所揭示之彼等方法：Brinkman等 人，1995, J. Immunol. Methods, 182: 41-50 ; Ames等人， 1995, J. Immunol. Methods, 184: 177-186 ； Kettleborough 等人，1994，Eur. J. Immunol., 24:952-958 ; Persic 等人， 1997, Gene 187: 9-18 ； Burton 等人，1994, Advances in Immunology, 57: 1 9 1-280 ; PCT公開案第 PCT/GB91/01134 號；PCT 公開案 WO 90/02809 ; WO 91/10737 ; WO 92/01047 ； WO 92/18619 ； WO 93/11236 ； WO 95/15982 ； WO 95/20401 ;及美國專利第 5,698,426號；第 5,223,409 號；第 5,403,484號；第 5,580,717號；第 5,427,908號；第 5,750,753 號；第 5,821,047 號；第 5,571，698 號；第 5,427,908 號；第 5,516,637 號；第 5,780,225 號；第 5,658,727號；第5,733,743號及第5,969，108號；各文獻係 以全文引用的方式併入本文中。 噬菌體選擇後，可分離編碼該等片段之噬菌體區域並用 於例如如下文所詳細描述經由使用重組DNA技術表現於包 括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母及細菌之所 選宿主中來產生抗原決定基結合片段。舉例而言，亦可採 用重組產生Fab、Fab·及F(ab')2片段之技術，使用諸如以下 文獻中所揭示之方法：PCT公開案WO 92/22324 ; Mullinax 等人，1992，12(6): 864-869 ; Sawai等人， 150936.doc -32- 201116297 1995, AJRI, 34: 26-34 ；及 Better 等人，1988, Science, 240: 1041-1043 ;該等參考文獻係以全文引用的方式併入本文 中。可用於產生單鏈Fv及抗體之技術之實例包括以下文獻 中所述之彼等技術：美國專利第4,946,778號及第5,258,498 號；Huston 等人，1991, Methods in Enzymology 203: 46-88 ； Shu等人，1993，Proc. Jcizi 5W. m, 90: 7995-7999 ; Skerra等人，1988, 240: 1038-1040 ° 功能相等物 本發明範疇内亦包括抗EphA抗體及人類化抗EphA2受體 抗體之功能相等物。術語「功能相等物」包括例如具有同 源序列之抗體、嵌合抗體、人工抗體及經修飾之抗體，其 中各功能相等物係由其結合至EphA2受體之能力確定。熟 習此項技術者應瞭解，在稱為「抗體片段」之分子群及稱 為「功能相等物」之群中存在重疊。產生功能相等物之方 法為熟習此項技術者已知，且揭示於例如以下文獻中： PCT申請案WO 93/21319、歐洲專利第EP 0239400號、PCT 申請案WO 89/09622、歐洲專利第EP 03 3 8745號及歐洲專 利申請案EP 0332424，各案係以全文引用的方式各別併入 本文中。 具有同源序列之抗體為胺基酸序列與本發明抗EphA抗 體及人類化抗EphA抗體之胺基酸序列具有序列同源性的 彼等抗體。同源性較佳係關於本發明之抗EphA抗體及人 類化抗EphA抗體之可變區的胺基酸序列。當用於本文之 胺基酸序列時，「序列同源性」定義為一個序列與另一胺 150936.doc •33· 201116297 基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%或94%序列同 源性，且更佳具有至少約95%、96%、97%、98%或99%序 列同源性，如藉由例如FASTA搜尋法根據Pearson及 Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 2444-2448 所測定。 嵌合抗體為抗體之不同部分來源於不同動物物種的抗 體。舉例而言，抗體具有與人類免疫球蛋白恆定區配對之 來源於鼠類單株抗體之可變區。用於產生嵌合抗體之方法 在此項技術中為.已知的。例如參看Morrison，1985, SWewce, 229:1202 ; Oi等人，1986，4:214 ; Gillies等人，1989，·/. TVnmwno/· Mei/ϊθί/ί，125:191-202 ;美 國專利第5,807,715號；第4,816,567號及第4,816,397號， 該等文獻係以全文引用的方式併入本文中。 嵌合抗體之人類化形式係藉由將例如小鼠抗體之互補決 定區取代成人類構架域來製造，例如參看PCT公開案第 WO 92/22653號。人類化嵌合抗體較佳具有除實質上或僅 來源於相應人類抗體區之互補決定區（CDR)及實質上或僅 來源於除人類以外之哺乳動物之CDR以外的恆定區及可變 區0 人工抗體包括scFv片段、微型雙功能抗體、微型三功能 抗體、微型四功能抗體及mru(參看Winter, G.及Milstein， C.，1991, Nature, 349: 293-299 ； Hudson, P.J., 1999,
Cwrrewi Opim’ow 灯，11: 548-557之論述），各抗 體均能夠結合抗原。在單鏈Fv片段（scFv)中，抗體之VH及 I50936.doc •34- 201116297 VL域係藉由可撓性肽連接。此連接子肽通常長度為約1 5個 胺基酸殘基。若連接子更小，例如5個胺基酸，則形成微 型雙功能抗體，該微型雙功能抗體為二價scFv二聚物。若 連接子減少為少於3個胺基酸殘基，則形成稱為微型三功 能抗體及微型四功能抗體之三聚體及四聚體結構^抗體之 最小結合單兀為CDR，通常為重鏈之CDR2，其具有足夠 專一性識別及結合使得其可獨立使用。該片段稱為分子識 別單元或mru。數個該種爪⑺可與短連接子肽連接在一起， 因此形成比單一 mru親和性高的人工結合蛋白。 本申請案之功能相等物亦包括經修飾之抗體，例如藉由 任何類型分子共價連接至抗體而經修飾之抗體。舉例而 言，經修飾之抗體包括已藉由例如糖基化、乙醯化、聚乙 二醇化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護基/阻隔基之衍 生化、蛋白質水解裂解、鍵聯至細胞配位體或其他蛋白質 等而經修飾的抗體。共價連接不會阻止抗體產生抗個體基 因型反應。此等修飾可藉由已知技術進行，包括但不限於 特定化學裂解、乙醯化、曱醯化、衣黴素（tunicamycin)之 代謝合成等。另外，經修飾之抗體可含有一或多種非經典 胺基酸。 功能相等物可藉由交換不同構架内之不同鏈上的不同 CDR來產生。因而，例如不同類別抗體可能藉由不同重鏈 之取代而具有既定CDR組，藉此可產生例如Ig(}1_4、 IgM、IgAl-2、IgD、IgE抗體類型及同型。類似地，本發 明範疇内之人工抗體可藉由將既定CDR組嵌入完全合成之 150936.doc •35· 201116297 構架内來產生。 功能相等物可使用此項技術中已知之多種方法，藉由在 側接特定CDR組之可變區及/或恆定區序列内進行突變、 刪除及/或插入而輕易地產生。 本發明之抗體片段及功能相等物涵蓋當與2H11R35R74 抗體相比時，以可偵測程度結合至EphA2之彼等分子。可 偵測結合程度包括鼠類2H11R35R74抗體對EphA2之結合能 力之至少10%至100%範圍内的所有值，較佳至少50%、 60% 或 70%，更佳至少 75%、80%、85%、90%、95% 或 99%。 改良型抗體 CDR對於抗原決定基識別及抗體結合至關重要。然而， 可改變包含CDR之殘基而不干擾抗體識別並結合其同源抗 原決定基的能力。舉例而言，可進行不影響抗原決定基識 別卻能增加抗體對抗原決定基之結合親和力的變化。 因而，本發明範疇中亦包括鼠類抗體及人類化抗體之改 良型式，其較佳亦以較高親和力專一性識別並結合 EphA2。 數項研究已調查基於對一次抗體序列之認識在抗體序列 中之不同位置處引入一或多個胺基酸變化對其性質（諸如 結合及表現程度）的影響（Yang，W. P.等人，1995，《/.从〇/· 5/〇/·, 254: 392-403 ; Rader，C.等人，1998，Proc. Λ^ί/· Acad. Sci. t/H , 95 : 891 0-891 5 ; Vaughan, T. J.等人， 1998, TVa/wre 16: 535-539) ° 150936.doc -36- 201116297 在此等研究中，已藉由使用諸如募核苷酸介導之定點突 變誘發、盒式突變誘變、易出錯PCR、DNA改組或大腸桿 菌（E. coli)增變株之方法改變CDR1、CDR2、CDR3或構架 區中之重鏈及輕鏈基因序列來產生一次抗體相等物 (Vaughan, T. J.等人，1998，7\^仏"6价〇紿<:/2«〇/〇尽少，16:535-539 ; Adey，Ν· B.等人，1996，第 16 章，第 277-291 頁， 「Phage Display of Peptides and Proteins」，Kay, B.又.專 人編，Academic Press)。改變一次抗體序列之此等方法已 使二次抗體之親和力改良（Gram，H.等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 3576-3580 » Boder, E. T. ^ » 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97: 10701-10705 ； Davies, J. JL Riechmann, L., 1996, Immunotechnolgy, 2: 169- 179 ; Thompson, J.等人，1996，·/. Mo/. 5io/·，256: 77-88 ; Short，Μ. K.等人，2002，J. 5^/.C/zem.,277:16365-16370 ; Furukawa, K.等人，2001, J.仏〇/. C7?ew., 276: 27622-27628)。 藉由改變抗體之一或多個胺基酸殘基之類似引導策略， 本發明中所述之抗體序列可用於開發具有改良功能，包括 對EphA2之改良親和力之抗EphA2抗體。 較佳胺基酸取代為如下取代：（1)降低對蛋白質水解之 敏感度；（2)降低對氧化之敏感度；（3)改變結合親和力形 成蛋白質複合物；及（4)賦予或改進該等類似物之其他物理 化學性質或功能性質。類似物可包括除天然存在之肽序列 以外之序列的各種突變蛋白。舉例而言，可在天然存在之 150936.doc •37- 201116297 序列（較佳在形成分子間接觸之結構域以外之多肽部分中） 中進行單個或多個胺基酸取代（較佳為保守胺基酸取代）。 保守胺基酸取代實質上不應改變親本序列之結構特徵（例 如置換胺基酸不應傾向於阻斷親本序列中所存在之螺旋或 破壞表徵親本序列之其他類型二級結構）。此項技術公認 之多肽二級及三級結構之實例描述於尸roieiwi, «SirwciMrei Mo/ecw/iir Priwcip/eWCreighton編，W. H. Freeman and Company, New York (1984)) ' Introduction to Protein Structure{C. Branden 及 J. Tooze 編，Garland Publishing, New York，N.Y. (1991));及 Thornton等人，1991，iVaiwre， 3 54:105中，其各自以引用的方式併入本文中。 改良型抗體亦包括藉由動物免疫、融合瘤形成及選擇具 有特定特徵之抗體之標準技術製備的具有改良特徵之彼等 抗體。 咸信抗體恆定區與各種Fc受體（FcYR)之間的相互作用介 導抗體之效應功能，包括抗體依賴性細胞毒性（ADCC)、 補體固定、吞噬作用及抗體之半衰期/清除率。可視所要 性質對本發明抗體之恆定區進行多種修飾。舉例而言，恆 定區中之特定突變致使在其他情況下溶解之抗體不溶於EP 0629 240B1及EP 0307 434B2中描述，或可將救助受體結 合抗原決定基併入抗體中以增加血清半衰期（參看US 5,739,277)。當前存在5種公認人類Fey受體，即FcyR(I)、 FcyRIIa、FcyRIIb、FcyRIIIa及新生兒 FcRn。Shields 等人 27: 65 91-6604, 2001)證明一組常見 IgGI殘基 150936.doc .38 - 201116297 涉及結合所有FcyR，而FcyRII及FcyRIII利用此常見組以外 之不同位點。一組IgGI殘基在變成丙胺酸時降低與所有 FcyR之結合：Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297 及 Pro-239。所有殘基均位於IgG CH2域中且叢集在接合CHI 及CH2之鉸鏈附近。雖然FcyRI僅利用常見IgGI殘基組來結 合，但FcyRII及FcyRIII與除該常見組以外之不同殘基相互 作用。 一些殘基之改變僅降低與FcyRII(例如Arg-292)或 FcyRIII(例如Glu-293)之結合。一些變異體顯示與FcyRII或 FcyRIII之結合改良，但不影響與其他受體之結合（例如 Ser-267Ala改良與FcgRII之結合，但與FcyRIII之結合不受 影響）。其他變異體展現與FcyRII或FcyRIII之結合改良， 而與其他受體之結合減少（例如Ser-298Ala改良與FcyRIII之 結合，與FcyRII之結合減少）。對於FcyRIIIa，最佳結合 IgGI之變異體在Ser-298、Glu-333及Lys-334組合丙胺酸取 代。咸信新生兒FcRn受體涉及抗體清除及穿過組織之穿胞 運輸（transcytosis)(參看 Junghans R.P，1997，/mmwwo/· 16: 29-57 ;及 Ghetie等人，2000, Rev. Immunol. 18: 739-766)。確定與人類FcRn直接相互作用之人類IgGI殘基 包括 Ne253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434 及His43 5。此章節中所述之任何此等位置之轉變可能使本 發明抗體之血清半衰期增加及/或效應性質改變。 其他修飾包括本發明抗體之醣基化變異體。已知抗體在 恆定區中之保守位置糖基化對抗體功能，尤其效應功能， 150936.doc -39- 201116297 諸如上述’具有深遠影響，參看例如B〇yd等人（M〇/. 32: 1311-1318, 1996)。涵蓋一或多個碳水化合 物部分添加、取代、刪除或修飾之本發明抗體或其抗原結 合片段之糖基化變異體。引入天冬醯胺酸_χ_絲胺酸或天 冬醯胺酸-X-蘇胺酸基元產生一個可供酶連接碳水化合物 部分之潛在位點，且因此可用以操作抗體之醣基化。在
Raju等人⑻0以娜⑹π 40: 8868-8876, 2001)中，經由一種 使用β-1，4-半乳糖苷基轉移酶及/或α，2,3唾液酸轉移酶之再 半乳糖苷基化及/或再唾液酸化方法增加TNFR_IgG免疫黏 附素之末端唾液酸化。咸信增加末端唾液酸化會增加免疫 球蛋白之半衰期。與大多數醣蛋白相同，抗體通常以糖型 (glycoforms)之混合物產生。當在真核細胞、尤其哺乳動 物細胞中產生抗體時，此混合物尤其顯而易見。已開發各 種方法來製造所定義之糖型（參看Zhang等人2〇〇4, 303. 371，Sears等人，2001，Sde/ice 291: 2344 ; Wacker等 人，2002，Sc㈣ce 298: 1790 ; Davis等人 2002，C/ζ亂及ev. 102· 579，Hang等人 ’ 2001，jcc· CTzew.細.34: 727)。因 而，本發明涵蓋多種如本文中所述之（單株）抗體（其可能為
IgG同型，例如IgGI)，包含一定數目（例如7或7以下，例如 5或5以下，諸如兩個或單個）該等抗體或其抗原結合片段 之糖型。 因此，本發明之改良型抗體尤其包括具有增強之功能性 質的抗體《特別關注介導諸如ADCC之細胞毒性效應功能 之能力增強的彼等抗體。該等抗體可藉由在抗體之恆定構 150936.doc -40· 201116297 架中進行單次或多次取代來獲得，從而改變其與Fc受體之 相互作用。用於設計該等突變體之方法可見於例如Lazar 等人（2006，iVoc. Λ^ί/. jcai ί/,51·儿 103(1 1): 4005- 4010)及 Okazaki 等人（2004, X Mo/· Β/ο/· 336(5): 1239-49) 中。亦參看 WO 03/074679、WO 2004/029207、WO 2004/ 099249、WO 2006/047350、WO 2006/019447、WO 2006/ 105338、WO 2007/041635。亦可能使用經專一性工程化之 細胞株來產生改良型抗體。詳言之，此等細胞株已改變對 糠基化路徑之調控，例如產生不良海藻糖基化或甚至完全 去海藻糖基化的抗體。該等細胞株及其工程改造方法於以 下文獻中揭示，例如Shinkawa等人（2003，.价〇/· C/zew· 278(5): 3466-3473)、Ferrara 等人（2006，爪〇/. CTzew· 281(8): 5032-5036; 2006, Biotechnol. Bioeng. 93(5): 85 1-61)、EP 1 272 527 B1、EP 1 331 266、EP 1 498 490、EP 1 498 491、EP 1 676 910、EP 1 792 987及 WO 99/54342。 本發明之其他實施例包括與諸如聚乙二醇（PEG)、聚丙 二醇或聚環氧烷之非蛋白質聚合物偶合的本發明抗體或其 抗原結合片段。蛋白質結合至PEG為已確立的用於增加蛋 白質半衰期以及降低蛋白質之抗原性及免疫原性的技術。 已用完整抗體以及Fab·片段研究使用不同分子量及類型（線 性或分支）之聚乙二醇化（Koumenis I. L.等人，2000，/«丨.1/· 尸/iarwacew?· 198: 83-95)。 本發明亦包括細胞毒性結合物，或抗體藥物結合物，或 結合物。如本文所使用，所有此等術語具有相同含義且可 150936.doc -41 - 201116297 互換。 細胞結合劑及 此等細胞毒性結合物包含兩個主要組分， 細胞毒性劑。 如本文所使s ’術語「細胞結合劑」係指專—性識別並 結合細胞表面上之EphA2受體的藥劑。在__項實施例中， 細胞結合劑專-性識別EphA2受體，以使結合物以靶向方 式起作用，幾乎不具有非專—性結合所產生之副作用。 在另-實施例中，本發明之細胞結合劑亦專—性識別 EphA2受體，以便結合物與靶細胞接觸足夠時段以允許結 合物之細胞毒性藥物部分對細胞起作用及/或允許細胞= 結合物内在化。 在一較佳實施財，細胞毒性結合物包含抗EphA2抗體 作為細胞結合劑，更佳為鼠類2HUR35R74單株抗體。在 一更佳實施例中，細胞毒性結合物包含人類化 2H11R35R74抗體或其抗原決定基結合片段。2H11R35R74 抗體能夠專一性識別EphA受體，諸如EphA2，並以靶向方 式將細胞毒性劑引導至異常細胞或組織，諸如癌細胞。 本發明細胞毒性結合物之第二組分為細胞毒性劑。如本 文所使用，術語「細胞毒性劑」係指降低或阻斷細胞之功 能或生長及/或造成細胞破壞的物質。 在較佳實施例中，細胞毒性劑為類紫杉醇（tax〇id)、諸 如DM1或DM4之類美登醇、小藥物、托馬黴素 (t〇maymycin)衍生物、前藥、CC-1065 或 CC-1065類似物。 在較佳實施例中，本發明之細胞結合劑直接或經由可裂解 150936.doc •42- 201116297 或不可裂解之連接子共價連接至細胞毒性劑。如本文所使 用，「連接子」意謂包含將抗體共價連接至藥物部分之共 價鍵或原子鏈的化學部分。 因而，本發明涵蓋使用（1)鑑別並結合EphA2受體之細胞 結合劑與（2)細胞毒性劑之間的結合物。在細胞毒性結合物 中，細胞結合劑對EphA2受體具有高親和力，而細胞毒性 劑對表現EphA2受體之細胞具有高度細胞毒性，使得本發 明之細胞毒性結合物形成有效殺死劑。 先前已描述拮抗性EphA2抗體之結合物。舉例而言， WO 2008/010101揭示人類化37.3D7及人類化53.2H11抗體 使用SPDB(4-[2-吡啶基二硫基]丁酸N-羥基丁二醯亞胺酯） 連接子結合至L-DM4，N2’脫乙醯基-N2’（4-曱基-4-巯基-1-側氧基戊基）-美登素（參看WO 2008/010101之實例10 ; hu3 7_3D7-SPDB-DM4及 hu2Hll-SPDB-DM4)。 當結合至細胞毒性劑時，本發明抗體展示許多優於先前 技術抗體之適宜性質。特定言之，結合不影響本發明抗體 對EphA2受體之親和力，而細胞毒性劑連接至該53.2H11抗 體上將對53.2H11結合至EphA2產生負面影響。 在下文中更詳細論述細胞結合劑、細胞毒性劑及連接 子。 細胞結合劑 本發明化合物作為治療劑之有效性視對適當細胞結合劑 之謹慎選擇而定。細胞結合劑可為目前已知或變得已知之 任何種類，且包括肽及非肽。細胞結合劑可能為可以專一 150936.doc -43 - 201116297 或非專一方式結合細胞的任何化合物。一般而言，此等结 合劑可能為抗體（尤其單株抗體）、淋巴介質、激素、生長 因子、維生素、營養素轉運分子（諸如轉鐵蛋白）或任何其 他細胞結合分子或物質。 可使用之細胞結合劑之更特定實例包括： 多株抗體； 單株抗體； 抗體片段，諸如 Fab、Fab·及 F(ab，）2、Fv(Parham，1983,
J- W㈣《σ/·， 131:2895-2902 ; Spring 等人，1974 J /wmwno/·，113: 470-478 ; Nisonoff 等人，196〇， Sioc/zem. 89: 230-244)。 人類化抗EphA2抗體較佳用作本發明之細胞結合劑。人 類化抗EphA2抗體更佳為人類化2H11R35R74抗體。 細胞毒性劑 在另一實施例中，人類化抗體或其抗原決定基結合片段 可結合至藥物，諸如類美登醇、托馬黴素衍生物或多卡米 辛（duocarmycin)衍生物，形成藉由使藥物靶向EphA2受體 而對抗原表現細胞具有專一細胞毒性的前藥。包含該等抗 體及高毒性小藥物（例如類美登醇、托馬黴素衍生物及cC_ 1065及CC-1065類似物）之細胞毒性結合物可用作治療腫 瘤’諸如乳房腫瘤及卵巢腫瘤之治療劑。 用於本發明之細胞毒性結合物中之細胞毒性劑可能為導 致細胞死亡或誘導細胞死亡或以某種方式降低細胞生存力 的任何化合物。較佳細胞毒性劑包括例如下文定義之類美 150936.doc -44 - 201116297 登醇及類美登醇類似物、托馬黴素衍生物及CCM065及 CC 1065類似物。此等細胞毒性劑結合至如本文中所揭示 之抗體抗體片’又、功能相等物、改良型抗體及其類似 物。 广胞毒性結合物可藉由活體外方法製備。為使藥物或前 藥連接至虹體，使用連接基團。適合連接基團在此項技術 中為熟知的且包括二硫基、硫醚基、酸不穩定基團光不 穩定基團、肽酶不穩定基團及酯酶不穩定基團。 例示〖生連接基團為二硫基及硫醚基。舉例而言，可使用 二硫化物交換反應或藉由在抗體與藥物或前藥之間形成硫 醚鍵來建構結合物。帶有該等連接基團之連接子之實例包 括吼°定基二硫丙酸N· 丁二醯亞胺酯（SPDP)及吡啶基二硫丁 酸N- 丁二醯亞胺酯（SPDB)，其二硫吡啶基反應基（參看
Bourdon M.A.等人，5/oc/zewi. «/.，173: 723-737, 1978 ; US 5208020)與諸如之細胞毒性化學反應基反應形成新鍵_ S-S- °接著丁二醯亞胺基氧基基團優先與抗體上存在之 胺基反應以形成醯胺鍵。 在另一較佳實施例中，細胞毒性劑使用聚乙二醇（PEG) 連接基團連接至細胞結合劑，如US 6,716,821中所述。例 示性PEG連接基團包括在一端經由官能基硫氫基或二硫基 結合至細胞毒性劑且在另一端經由活性酯結合至細胞結合 劑的異雙官能PEG連接子（US 6,716,821)。亦可能使用不經 由官能基硫氫基或二硫基結合至細胞毒性劑的PEG連接 子。 150936.doc -45- 201116297 特另】涵蓋式（i)之帶有具有末端活性酯之聚乙二醇 連接基團的細胞毒性劑： (I)， 其中Z為該細胞毒性劑，該細胞毒性劑係選自類美登醇及 類美登醇類似物、托馬黴素衍生物及CC-1065及CC-1065 類似物之群；且 其中Y為N-丁二醯亞胺基氧基、N_磺基丁二醯亞胺基氧 基、N_鄰苯二曱醯亞胺基氧基、N-磺基鄰苯二甲醯亞胺基 氧基、2-硝基苯基氧基、4_硝基苯基氧基、2，‘二硝基苯 基氧基、3-磺醯基硝基苯基氧基、3_羧基_4-硝基苯基氧 基、咪唑基或鹵素原子。 在另一較佳實施例中，提供一種細胞毒性劑，該細胞毒 性劑帶有具有末端活性酯之聚乙二醇（PEG)連接基團，並 且具有式（II):
(Π) 其中Z為該細胞毒性劑’該細胞毒性劑係選自類美登醇及 類美登醇類似物、托馬黴素衍生物及CC-1065及CC-1065 150936.doc 201116297 類似物之群；且 其中Y為N-丁二醯亞胺基氧基、N_磺基丁二醯亞胺基氧 基N_鄰笨二曱醯亞胺基氧基、N-績基鄰笨二甲醯亞胺基 氧基、2-硝基苯基氧基、4_硝基苯基氧基、2,4二硝基苯 基氧基' 3-磺醯基_4_硝基苯基氧基、3_羧基_心硝基苯基氧 基、咪唑基或齒素原子。 製備結合物 一般而言，可藉由包含以下步驟之方法獲得結合物： (i)使視情況經緩衝之細胞結合劑水溶液與細胞毒性化合 物溶液接觸； (Π)接著視情況分離（i)中所形成之結合物與未反應之試 劑及溶液中可能存在之任何聚集物。 在一態樣中，細胞結合劑為抗體；更特定言之，細胞結 合劑為mu2HllR3 5R74抗體或其人類化型式。在另一態樣 中’細胞毒性劑為式（I)或（II)之化合物，其中Z為類美登 醇；特定言之，Z為DM4。 應瞭解，可由此方法獲得之結合物包含在本發明範脅 内。 細胞結合劑之水溶液可用諸如磷酸鉀或N-2-羥基乙基派 。秦-Ν'-2-乙烧續酸（Hepes緩衝液）之緩衝液進行緩衝。緩衝 液視細胞結合劑之性質而定。細胞毒性化合物呈於例如二 曱亞砜（DMSO)或二曱基乙醯胺（DMA)之有機極性溶劑中 之溶液形式。 反應溫度通常包含20°C至40°C。反應時間可自1小時至 150936.doc •47- 201116297 24小時變化。細胞結合劑與細胞毒性劑之間的反應可藉由 尺寸排外層析法（SEC)用折射及/或UV偵測器監測。若結合 物產率過低’則可延長反應時間。 熟習此項技術者可使用許多不同層析法以便執行分離步 驟（ii).可藉由例如SEC、吸附層析（諸如離子交換層析， IEC)、疏水性相互作用層析（HIC)、親和層析、諸如羥基 磷灰石層析之混合支撐物層析，或高效液相層析（HpLC)來 純化結合物。亦可使用藉由透析或透濾之純化。 可使用之方法實例於實例I.b. 1中描述。 如本文所使用，術語「聚集物」意謂可能在兩種或兩種 以上細胞結合劑之間形成的締合物，該等藥劑可藉由結合 而經修飾或未經修飾。可能在大量參數之影響下形成聚集 物，諸如細胞結合劑於溶液中之高濃度、溶液之pH值、高 剪切力、結合二聚物之數目及其疏水性特徵、溫度（參看
Wang & Gosh, 2008，*/. 5W.，318: 311-316，及其 中所引用之參考文獻）；注意一些此等參數之相對影響尚 未明確確立。在蛋白質及抗體情況下，熟習此項技術者應 參考 Cromwell 等人（2006，8(3): E572-E579) 〇 聚集物中之内含物可用熟習此項技術者所熟知之技術測 定’諸如 SEC(參看 Walter等人 ’ 1993，隱， 212(2)·· 469-480)。 在步驟（i)或（ii)之後，含有結合物之溶液可進行額外超 遽及/或透滤步驟（iii)。 在此等步驟結束時回收水溶液中之結合物。 150936.doc •48· 201116297 類美登醇 本發月中τ用以成細胞毒性結合物之細胞毒性劑包括 類美登醇及類美登醇類似物。適合類美登醇之實例包括美 登木醇（maytansinol)及美登木醇類似物。類美登醇為抑制 微官形成且對喷乳動物細胞具有高毒性的藥物。 適合美登木醇類似物之實例包括具有經修飾之芳族環的 類似物及在其他位置具有修飾的類似物。該等適合類美登 醇於美國專利第4,424,219號；第（以⑽號；第4 294,乃7 號，第 4,307,016號；第 4,313,946 號；第 4,315,929 號；第 4’331’598 號·’第 4,361，65〇 & ;第 4,362,663 號；第 4,364,866 5虎’第 4,450,254 號；第 4,322,348 號；第 4,371，533 號；第 6,333,41〇 號；第 5,475,〇92 號；第 5,585,499號；及第5,846,545號中揭示。 具有經修飾之芳族環的美登木醇之適合類似物之特定實 例包括： (1) C-19-去氣（美國專利第4,256,746號）（藉由[αη還原安 絲菌素（ansamytocin)P2而製備）； (2) C-20-羥基（或c_2〇_去曱基）+/_c_19_去氯（美國專利第 4,361，650號及第4,3〇7,〇16號）（藉由使用鏈黴菌 (Sirepiowyces)或放線菌之去曱基化或使用 LAH之去氣作用而製備）；及 (3) C-20-去甲氧基、c_2〇_醯氧基（_〇c〇R)+/_去氣（美國 專利第4,294,757號）（藉由使用醯基氣化物之醯化來製備）。 在其他位置具有修飾之美登木醇之適合類似物的特定實 150936.doc • 49· 201116297 例包括： (1) C-9-SH(美國專利第4,424,219號）（藉由美登木醇與出s 或P2Ss之反應來製備）； (2) C-14-烷氧基曱基（去甲氧基/CH2〇R)(美國專利第 4,331，598號）； (3) C-14-羥基甲基或醯氧基曱基（CH2〇H4CH2〇Ac)(美國 專利第4,450,254號）（由土壤絲菌心匀製備）； (4) C-15-經基/醯氧基（美國專利第4,364,866號）（藉由鏈黴 菌轉化美登木醇來製備）； (5) C-15-曱氧基（美國專利第4,313,946號及第4,315,929 號）（分離自滑桃木«w<i(/7ora)); (6) C-18-N-脫曱基（美國專利第4,362,663號及第4,322,348 號）（藉由鏈黴菌脫除美登木醇之甲基來製備）；及 (7) 4,5-去氧（美國專利第4,371,533號）（藉由三氣化鈦 /LAH還原美登木醇來製備）。 在一較佳實施例中，本發明之細胞毒性結合物利用含有 硫醇之類美登醇（DM1)，正式稱為#2'-脫乙醯基-#2·-(3-巯 基-1-側氧基丙基）-美登素作為細胞毒性劑。DM1由以下結 才冓式（ΠΙ)表示： 50· 150936.doc 201116297
有硫醇之類美登醇DM4，正式稱為脫乙醯基省-2，（4-甲 基-4-魏基-1-側氧基戊基美登素作為細胞毒性劑。DM4由 以下結構式（IV)表示：
在本發明之其他實施例中，可使用其他美登素，包括在 帶有硫原子之碳原子上帶有單或二烷基取代的含硫醇及二 硫化物之類美登醇。此等美登素包括在c_3、c_i4羥基甲 土 -15羥基或C-20去甲基處具有醯基化胺基酸側鏈的類 美丑醇，該醯基化胺基酸側鏈具有帶有位阻硫氫基之醯 、/、中該▼有;^醇官能基之醯基之碳原子具有一或兩個 戈基°玄等取代基為CH3、C2H5 '具有1至10個碳原子之 150936.doc •51 - 201116297 直鏈或分支鏈烷基或烯基、具有3至10個碳原子之環狀烷 基或稀基、笨基、經取代之苯基，或雜環芳族基團或雜^ 烧^且另外其中一個取代基可能為H ’且其中醯基在幾 基官能基與硫原子之間具有至少3個碳原子之直鏈長度。 該等其他美登素包括由式（ν)表示之化合物：
其中： Υ'表示 (CR7R8)1(CR9=CR10)p(CsC)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C^ C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ > 其中：
Ri及R_2各自獨立為eh、、具有！至個碳原子之直 鍵烧基或烯基、具有3至1G個碳原子之分支鍵或環狀烧基 或烯基、苯基、經取代之苯基或雜環芳族基團或雜環烷 基’且此外R2可能為Η ; A、Β、D為具有3至1〇個碳原子之環烷基或環烯基，簡 單或經取代之芳基或雜環芳族基團或雜環烷基； 150936.doc -52- 201116297 R3 R4、R5、R6、R?、r8、r9、、R"及心各自獨立 地為H CH3、C2H5、具有}至10個碳原子之直鏈烷基或烯 基具有3至1〇個碳原子之分支鍵或環狀烧基或稀基、苯 基、經取代之笨基或雜環芳族基團或雜環烷基，· m、η ο 數 中 Ρ、q、r、各自獨立地為〇或 ’其限制條件為在任何時刻卜m、η、ο、ρ、qr、s及 至少一者不為0;且 Z為H、SR或-COR，其中R為具有個碳原子之直鍵 院基或稀基、具有3至10個碳原子之分支鏈或環狀烧基或 烤基，或簡單或經取代之芳基或雜環芳族基團或雜環烧 式（V)之較佳實施例包括式（V)之化合物，其中： R1為甲基；R2為Η且Z為Η。
Ri及R2為甲基，且Ζ為Η。
Ri為甲基，R2為Η，且Ζ為-SCH3。
Ri及R2為曱基，且Z為-SCH3。 該等其他美登素亦包括由式（VI-L)、（VI_D)或（vi_d,l) 表示之化合物： 150936.doc
(VI-L) (VI-D) -53 201116297
(VI-D,L) 其中： Y表示， 其中：
Ri及R2各自獨立地為CH3、QH5、具有丨至10個碳原子之 直鏈烷基或烯基、具有3至10個碳原子之分支鏈或環狀烷 基或烯基、苯基、經取代之苯基，或雜環芳族基團或雜環 烧基’且此外R2可能為Η ; R3、R4、R5、r6、R7及R8各自獨立地為Η、、 C2li5、具有1至丨〇個碳原子之直鏈烷基或烯基、具有3至1〇 個碳原子之分支鏈或環狀烷基或烯基、苯基、經取代之苯 基’或雜環芳族基團或雜環烷基； 1、m及η各自獨立地為1至5之整數，且此外η可能為〇 ; Ζ為Η、SR或-COR，其中R為具有1至1〇個碳原子之直鏈 或分支鏈烷基或烯基、具有3至10個碳原子之環狀烷基或 稀基，或簡單或經取代之芳基或雜環芳族基團或雜環烷 基，且
May表示類美登醇，其在c-3、C-14羥基甲基、C-15經 基或C-20去曱基處帶有側鏈。 式（VI-L)、（VI-D)及（VI-D，L)之較佳實施例包括式（VI-L)、（VI-D)及（VI-D,L)之化合物，其申： 150936.doc •54· 201116297 心為甲基，R^H，R5、R6、R7&R8各自為Η， 自為1 ’ n為〇，且z為H。 1^及112為甲基，r5、r6、r7、r8各自為Η，為1，η 為0，且Ζ為Η。 R!為曱基’ R^H ’ R5、R6、R7AR8各自為Η，1及爪各 自為1 ’ η為〇，且ζ為-SCH3。 1^及尺2為甲基，r5、r6、r7、r8各自為Η , 1及111為i，η 為0，且Z為-SCH3。 細胞毒性劑較佳由式（VI-L)表示。 該等其他美登素亦包括由式（VII)表示之化合物：
(VII) 其中： Y表示（CUMCRsDn^CI^DnCHSZ， 其中： 直鍵院基或稀基、
Ri及R2各自獨立地為CH3、C2HS、具有丨至10個碳原子之 鏈烷基或烯基 '具有3至10個碳原子之分支鏈或環狀烷 150936.doc -55· 201116297 基或烯基、笨基、、經取代之苯基或雜環芳族基團或雜環烧 基’且此外R2可能為！1; R3、R4、R5、R6、R7 及 R8 各自獨立地為 H、、 C2%、具有1至10個碳原子之直鏈烷基或烯基、具有3至 個碳原子之分支鏈或環狀烷基或烯基、苯基、經取代之苯 基’或雜環芳族基團或雜環烷基； 1、m及n各自獨立地為丨至5之整數，且此外n可能為 〇 ;且 ζ為H、SR或-COR，其中R為具有丨至…個碳原子之直鏈 炫基或縣、具有3至1()個碳原+之分支鏈或環狀烧基或 烯基，或簡單或經取代之芳基或雜?裒芳族&團或雜環烷 基。 式（VII)之較佳實施例包括式（νπ)之化合物其中： 1為曱基，112為11，R5、R6、心及以各自為H ; 1及爪各 自為1 ; η為0 ;且ζ為Η。 1^及112為甲基；R5、r6、r7、Rs各自為Η，為i ; η 為〇 ;且Ζ為Η。
Ri為甲基，R2為Η，R5、R6、r7&r8各自為Η，各 自為1，n為0，且Z為-SCH3 »
RjR2為甲基’ R5、R6、R7、r8各自為Η，认爪為1，„ 為〇，且Z為-SCH3。 該等其他美登素進一步包括由式（VIIII_L)、（vni_D)或 (VIII-D,L)表示之化合物： •56· 150936.doc 201116297
(VIII-D) (VIII-L)
May〆
y2 (VIII-D，L) 其中： Y2表示（CR7R8)1(CR5R6；)m(CR3R4)nCRiR2SZ2 其中： R丨及R2各自獨立地為eh、、具有1至i〇個碳原子之 直鏈烷基或烯基、具有3至1〇個碳原子之分支鏈或環狀烷 基或烯基笨基、經取代之笨基或雜環芳族基團或雜環烷 基’且此外R2可能為Η ; 3 R4 R5 R6、R7及R8各自獨立地為Η、CH3、 CzH5、具有1至10個碳原子之直鏈環狀烷基或烯基、具有3 至10個碳原子之分支鍵或環狀燒基或烯基、苯基、經取代 之本基或雜技芳族基團或雜環烧基； 卜m及η各自獨立地為丨至5之整數，且此外n可能為〇丨 22線或C0R’其中R為具有個碳原子之直鏈烷基 或稀基、具有3至1()個碳原子之分支鏈或環狀烧基或二 基，或簡單或經取代之芳基或雜環芳族基團或雜環燒 150936.doc •57· 201116297
May為類美登醇。 該等其他美登素亦包括由式（IX)表示之化合物：
其中： Y2,表示
(CR7R8)1(CR9=CR10)p(CsC)qAr(CR5R6)inDu(CR11 = CR12)r(CH C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2 > 其中： R!及各自獨立地為eh、c^5、具有1至10個碳原子之 直鏈或分支鏈烷基或烯基、具有3至1〇個碳原子之環狀烷 基或稀基、苯基、絲狀苯基或料㈣基團或雜環烧 基’且此外R2可能為Η ; A、Β及D各自獨立地為具有3至1〇個碳原子之環烷基或 環烯基’簡早或經取代之芳基，或雜環芳族基團或雜環炫 基； R4 R5 ^、^、^、^^^及心各自獨立 為 3 C2Hs、具有1至ίο個碳原子之直鏈烷基或烯 150936.doc -58· 201116297 基、具有3至1G個碳原子之分支鏈或環狀烧基或稀基苯 基、經取代之苯基或雜環芳族基團或雜環烷基； η 0 ?、9、1'、8及1各自獨立地為〇或1至5之整 數，其限制條件為在任何時刻卜m、η、〇、p、q m 中至少一者不為〇;且 Z、2為SR或-COR，其中R為具有i至1〇個碳原子之直鏈烷 基或烯基、具有3至10個碳原子之分支鏈或環狀烷基或烯 基’或簡單或經取代以基或雜環芳縣目或雜環烧基。 式（IX)之較佳實施例包括式（ΙΧ)之化合物，其中：心為 曱基’ R2為Η。 上述類美登醇可結合至抗EphA抗體2H11R35R74或其同 源物或片段’其中該抗體使用在類美登醇之c_3、〇14羥 土甲基C 15經基或C-20去曱基處發現之酿基化胺基酸側 鍵之酿基上所存在之硫醇或二硫化才勿官能基連帛至類美登 醇且其中5亥醯基化胺基酸側鏈之醯基在位於具有一或兩 個取代基之碳原子處具有其硫醇或二硫化物官能基，該等 取代基為CH3、QH5、具有丨至⑺個碳原子之直鏈烷基或烯 基具有3至1〇個碳原子之分支鏈或環狀烷基或烯基、苯 基、經取代之苯基或雜環芳族基團或雜環烷基，且此外一 個取代基可能為11，且其中醯基在羰基官能基與硫原子之 間具有至少3個碳原子之直鏈長度。 本發明之較佳結合物為包含抗EphA抗體2hi 1R35R74或 其同源物或片段結合至式（χ)之類美登醇或可藉由與式（χ) 之類美登醇結合而獲得之結合物： 150936.doc -59- 201116297 η
其中： 表示 (CR7R8)1(CR9=CR1〇)p(c=C)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(c = C)sBt(CR3R4)„CR]R2S. » 其中： A、B及D各自獨立地為具有3至1〇個碳原子之環烷基或 %稀基’簡單或經取代之芳基，或雜環芳族基團或雜環院 基； R3、R4、R5、R6、R?、R8、r9、R。、R"及 R]2各自獨立 地為H CH3、C2H5、具有1至1G個碳原子之直鏈烧基或烯 基具有3至1〇個碳原子之分支鍵或環狀院基或稀基、苯 基.、里取代之苯基或雜環芳族基團或雜環烧基；且 數 中 n 0、？、9、卜8及1各自獨立地為〇或1至5之壁 ，其限制條件為在任何時刻卜m、η、〇、p、q、卜认 至少一者不為〇。 較佳RI為甲基，RAH，机及心為甲基。 150936.doc 201116297 本發明之更佳結合物為包含抗邱^抗體2H11R35R74* 其同源物或片段結合至式（XI L)、（χι D)或（XI D L)之類 美登醇之結合物：
(XI-D，L) 其中：
Yl 表示， 其中：
Ri及R2各自獨立地為CH3、C^5、具有}至1〇個碳原子之 直鏈烷基或烯基、具有3至10個碳原子之分支鏈或環狀烷 基或烯基、笨基、經取代之苯基，雜環芳族基團或雜環烷 基’且此外R2可能為Η ; I、R4、R5、r6、r7及&各自獨立地為η ' cH3、 hH5、具有工至⑺個碳原子之直鏈烷基或烯基、具有3至⑺ 個唉原子之分支鏈或環狀烷基或烯基、苯基 '經取代之苯 基或雜環芳族基團或雜環烷基； !、m及n各自獨立地為1至5之整數，且此外〇可能為 150936.doc • 61 · 201116297 ο ;且
May表示美登木醇，其在C-3、C-14羥基曱基、C-15經 基或C-20去甲基處帶有側鏈。 式（XI-L)、（XI-D)及（XI-D，L)之較佳實施例包括式（XI· L)、（XI-D)及（XI-D，L)之化合物，其中： 1^為曱基，R2為Η，或1^及112為曱基；
Rl為曱基’ R_2為Η，R5、、Κ·7及Κ·8各自為Η，1及IYJ各 自為1 ; η為0 ;
Ri及R2為甲基；R5、R6、117及118各自為Η ; 1及m為1 ; η 為0。 細胞毒性劑較佳由式（XI-L)表示。 本發明之另一較佳結合物為包含抗EphA抗體 2H11R35R74或其同源物或片段結合至式（XII)之類美登醇 的結合物： 150936.doc Π
其中該等取代基如關於以上式（XI)所定義。 • 62 - 201116297 尤佳為任何上述化合物，其中&為Η，&為甲基，I、 R6 '尺7及118各自為Η，1及m各自為i，且〇為〇。
此外尤佳為任何上述化合物，其中心及心為甲基，R5、 Κ·6、R7、Κ·8各自為Η，1及m為 1，an&〇D 此外’ 胺基醯基立體異構體較佳。 2004年5月20曰申請之申請中美國專利申請案第 10/849,136號中所教示之各類美登醇亦可用於本發明之細 胞毒性結合物中。美國專利申請案第1〇/849，136號之全部 揭示内谷係以引用的方式併入本文中。 含二硫化物之連接基團 為將類美登醇連接至細胞結合劑，諸如2η 11R3 5R74抗 體，類美登醇包含連接部分。連接部分含有允許在特定位 點釋放具有充分活性之類美登醇的化學鍵。適合化學鍵在 此項技術中為熟知的’且包括二硫鍵、酸不穩定鍵、光不 穩定鍵、肽酶不穩定鍵及酯酶不穩定鍵。 連接部分亦包含反應性化學基團。在一較佳實施例中， 反應性化學基團係用於經由二硫鍵連接部分共價結合至類 美登醇。 尤佳反應性化學基團為，丁二醯亞胺基酯及，績基丁二 酿亞胺基醋。 包含含有反應性化學基團之連接部分的尤佳類美登醇為 美登木醇之C-3酯及其類似物’其中該連接部分含有二硫 鍵且該化學反應基包含7V-丁二醯亞胺基或，績基丁二醯亞 胺基酯。 150936.doc -63- 201116297
佳。 當關於含二硫鍵之連接部分描it具有連接部分之美登木 醇酯合成時，熟習此項技術者應瞭解， (如上文所述）之連接部分亦可用於本發明 ’具有其他化學鍵 明’同樣可使用其 他類美登醇。其他化學鍵之特定實例包括酸不穩定鍵、光 不穩定鍵、肽酶不穩定鍵及酯酶不穩定鍵。併入本文中之 美國專利第5’208,020號之揭示内容教示製造帶有該等鍵之 類美登醇。 具有帶有反應基之二硫化物部分之類美登醇及類美登醇 何生物之合成於美國專利第號及第6,333,41〇號以 及美國申明案第10/161，65 1號中描述，各案係以引用的方 式併入本文中。 含PEG之連接基團 類美登醇亦可使用PEG連接基團連接至細胞結合劑，如 美國專利第6,716,821號中所述。此等PEG連接基團可溶解 於水及非水性溶劑中，且可用於將一或多種細胞毒性劑接 合至細胞結合劑。例示性pEG連接基團包括在連接子之相 對末端在一端經由官能基硫氫基或二硫基結合至細胞毒性 劑且在另一端經由活性酯結合至細胞結合劑的異雙官能 PEG連接子。 150936.doc • 64 * 201116297 關於使用PEG連接基團合成細胞毒性結合物之一般實 例，特定細節再參考美國專利第6,716,821號。合成開始時 使一或多種帶有反應性PEG部分之細胞毒性劑與細胞結合 劑反應，致使各反應性PEG部分之末端活性酯由細胞結合 劑（諸如2H11R35R74抗體）之胺基酸殘基置換，產生包含一 或多種細胞毒性劑經由PEG連接基團共價結合至細胞結合 劑的細胞毒性結合物。亦可能使用不經由官能性硫氫基或 二硫基結合至細胞毒性劑的PEG連接基團。 因而，本發明範疇内包含式（XIII)之類美登醇，本文中 稱為 PEG4-NHAC-DM4 :
(XIII) 本發明含義内亦包含式（XIV)之類美登醇，本文中稱為 PEG4-Mal-DM4 ： 150936.doc -65- 201116297
r^V 本發明含義内亦包含式（XXIV)之類美登醇，本文中稱為 SPDB-DM4 ：
本發明含義内亦包含式（XXV)之類美登醇，本文中稱為 PEG4-NMeAc-DM4 ：
150936.doc -66· 201116297 本發明含義内亦包含式（XXVI)之類美登醇，本文中稱為 PEG8-NHAC-DM4 ：
本發明含義内亦包含式（XXVII)之類美登醇，本文中稱 為PEG4-烯丙基-DM4 :
含反應基之類美登醇（諸如DM4)與抗體（諸如 2H11R35R74抗體）反應產生細胞毒性結合物，其中細胞毒 性劑共價連接至抗體。此等結合物可藉由HPLC或藉由凝 膠過滤純化。 本發明之一較佳實施例為2H11R35R74抗體或其人類化 型式之結合物，該結合物包含細胞毒性劑共價連接至該 2H11R35R74抗體，該細胞毒性劑係選自式（XIII)之類美登 醇及式（XIV)之類美登醇。在一更佳實施例中，式（XIII)之 類美登醇結合至本發明之2H11R35R74抗體將產生 150936.doc -67- 201116297 2H11R35R74-PEG4-NHAC-DM4結合物。在另一更佳實施 例中，式（XIV)之類美登醇結合至本發明之2H11R35R74抗 體，產生2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4結合物。 因而，較佳實施例為具有由式（XV)之結構組成之結構的 抗體-藥物結合物：
(xv) 其中Ab為本發明之抗體，且η為包含1至15之整數。η較 佳包含1至10。η更佳包含5至7。在另一更佳實施例中，本 發明之抗體為2H11R35R74抗體或其人類化型式，且結合 物為 2H11R35R74-PEG4-NHAC-DM4結合物。 因而，另一較佳實施例為具有由式（XVI)之結構組成之 結構的抗體-藥物結合物： 150936.doc • 68 - 201116297
佳包含1至10。η更佳包含5至7。在另一更佳實施例中，本 發明抗體為2H11R35R74抗體或其人類化型式，且結合物 為 2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4結合物。 在美國專利第6,333,410號及美國申請案第〇9/867,598 號、第10/161,651號及第10/024,290號中提供數種製造該等 抗體-類美登醇結合物之極佳流程，各案之全文併入本文 中。 如上文所解釋，一般而言’可藉由包含以下步驟之方法 獲得結合物： (1)使視情沉經緩衝之抗體水溶液與類美登醇溶液接觸； (π)接著視情況分離⑴中所形成之結合物與未反應之試 劑及溶液中可能存在之任何聚集物。 更特定言之’可用1莫耳過量之具有帶有反應基之二硫 化物部分之類美登醇培育抗體於水性緩衝液中之溶液。可 藉由添加過量胺（諸如乙醇胺、胺基乙磺酸等）淬滅反應混 150936.doc •69- 201116297 合物。接著可藉由凝膠過濾來純化類美登醇-抗體結合 物。 在該方法之一態樣中，抗體為mu2HliR35R74抗體或其 人類化型式。在該方法之另一態樣中，細胞毒性劑為選自 以下之細胞毒性劑： 式（XVII)之化合物：
基、N-鄰苯二甲醯亞胺基氧基、N-磺基鄰笨二甲醢亞胺基 氧基' 2-硝基苯基氧基、4-硝基苯基氧基、2,4-二硝基笨 基氧基、3-續酿基-4-¾肖基苯基氧基、3-叛基-4-确基苯基氧 基、咪唑基或鹵素原子；及 式（XVIII)之化合物： 150936.doc -70· 201116297
(XVIII) 其中Y為N-丁二醯亞胺基氧基、N-磺基丁二醯亞胺基氧 基、N-鄰苯二曱醯亞胺基氧基、N-磺基鄰苯二曱醯亞胺基 氧基、2-硝基苯基氧基、4-硝基苯基氧基、2,4-二硝基苯 基氧基、3-磺醯基-4-硝基苯基氧基、3-羧基-4-硝基苯基氧 基、咪唑基或鹵素原子。 在實例I中提供可用於抗體及式（XVII)或式（XVIII)之化 合物之方法的實例。 每個抗體分子所結合之類美登醇分子數目（「藥物-抗體 比率」或「DAR」）可以分光光度法藉由量測實質上經純 化之結合物溶液在252 nm及280 nm下之吸光度比率來測定 (在步驟（ii)後進行）。詳言之，該DAR可用分光光度法使用 分別在280 nm及252 nm下所量測之抗體消光係數測定： Sa28〇=224,000 Μ 1 cm 1 且εΑ252=82,880 M icm 1 ;假定抗體之 平均分子量為160,000，且對於類美登醇，ε028〇=5,180 M'm·1 且 ε〇252=26,1 59 M·1 cm·1。計算方法係得自 Antony S. Dimitrov(編），LLC， 2009，Therapeutic Antibodies and 150936.doc -71 - 201116297
Protocols ’ 第 525 卷，445，Springer Science，且在下文中 更詳細描述： 根據SEC分析之單體峰值（允許計算「DAR(SEC)」參數） 或使用經典分光光度計裝置（允許計算「DAR(UV)」參數） 來量測結合物在252 nm下（A252)及在280 nm下（A28Q)之吸光 度。吸光度可表達如下： A252 = (cDXeD252) + (cAX8A252) A2 8 0 = (cDX8D28〇) + (cAX£A28〇) 其中： CD及CA分別為溶液中類美登醇及抗體之濃度； ε〇252及sD28G分別為類美登醇在252 nm及280 nm下之莫耳 消光係數； SA252及εΑ28〇分別為抗體在252 nm及280 nm下之莫耳消光 係數。 解出此兩個方程式之兩個未知數，得到以下方程式： 0〇-[(εΑ28〇ΧΑ252)-(εΑ252χΑ28〇)]/[(ε〇252><εΑ28〇)-(εΑ252><ε〇28〇)] Ca_[A280_(CdxSd280)]/Sa280 接著由藥物濃度相對於抗體濃度之比率計算平均Dar : DAR=cd/ca。 以UV分光光度計量測之平均DAR(DAR(UV))更特定言之 超過4’更特定言之為4至10’更特定言之為4至7，更特定 言之為5.5至8’且更特定言之為5.9至7.5。 在又一較佳實施例中，本發明包含2H11R35R74抗體或 其人類化型式與式（XVII)或式（XVIII)化合物之結合物，其 150936.doc -72- 201116297 中該DAR包含4至7個類美登醇分子/抗體分子，該dar係 藉由分光光度法量測實質上經純化之結合物溶液在252 nm 及280 nm下之吸光度比率來測定。 可由上述方法獲得之結合物包含在本發明範疇内。在一 特定態樣中，該等結合物具有選自式（χν)及式（χνΐ)之結 構’其中Ab為本發明抗體’且其中η包含4至1〇。在一較佳 實施例中，η包含4至7。在另一較佳實施例中，該等結合 物具有式（XV)之結構。 可評估抗體與類美登醇藥物之結合物在活體外抑制各種 不需要之細胞株增殖的能力。舉例而言，使用細胞株，諸 如人類表皮樣癌細胞株Α-43 1、人類小細胞肺癌細胞株 SW2、人類乳房腫瘤細胞株SKBR3及伯基特氏淋巴瘤細胞 株Namalwa之細胞株可輕易地評估此等化合物之細胞毒 性。欲評估之細胞可暴露於化合物24小時，並藉由已知方 法以直接檢定量測細胞之存活分數。接著可由檢定結果計 算IC5。值。 托馬黴素衍生物 本發明之細胞毒性劑亦可為托馬黴素衍生物。托馬黴素 衍生物為咐咯幷[1，4]苯并二氮呼（PBD)，一種藉由共價結 合至DNA小溝中之鳥嘌呤之N2來發揮其生物性質的已知化 合物類別。PBD包括許多小溝黏合劑，諸如安麯黴素 (anthramycin)、新菌黴素（ne〇thramycin)及 dc_81。 保留高細胞毒性且可有效連接至細胞結合劑之新穎托馬 黴素衍生物於國際申請案第PCT/IB2〇〇7/〇〇〇142號中描 150936.doc •73· 201116297 述，該申請案之内容係以引用的方式併入本文中。細胞結 合劑-托馬黴素衍生物複合物使得托馬黴素衍生物以靶向 方式僅針對不需要之細胞施加完全細胞毒性作用，因此避 免由於損害非靶向健康細胞而致之副作用。 本發明之細胞毒性劑包含一或多種托馬黴素衍生物經由 連接基團連接至諸如2H11R35R74抗體之細胞結合劑。連 接基團為藉由習知方法共價結合至托馬黴素衍生物之化學 部分的一部分。在一較佳實施例中，該化學部分可經由二 硫鍵共價結合至托馬黴素衍生物。 適用於本發明之托馬黴素衍生物具有以下所示之式 (XX):
(XX) > 其中 ----表示視情況存在之單鍵； 一表示單鍵或雙鍵； 其限制條件為當——表示單鍵時，相同或不同之^^及U， 獨立地表示Η ’且相同或不同之w及W·係、獨立地選自由以 下組成之群：0Η、諸如_〇R之崎、諸如_〇c〇r之醋（例如 夂酉曰）諸如-0<：00尺之碳酸酯、諸如_〇C〇NRRi之胺基 曱酸S曰、使仵N1〇及C11成為環之一部分的環狀胺基甲酸 150936.doc 201116297 酯、諸如-NRCONRR1之脲、諸如-OCSNHR之硫代胺基曱 酸酯、使得N10及Cl 1成為環之一部分的環狀硫代胺基甲 酸酯、-SH、諸如-SR之硫化物、諸如-SOR之亞砜、諸如 -SOOR之砜、諸如-S03-之磺酸酯、諸如-NRSOOR之磺醯 胺、諸如-NRR'之胺、使得N10及C11成為環之一部分的視 情況存在之環胺、諸如-NROR'之羥胺衍生物、諸如-NRCOR 之醯胺、諸如-N3之疊氮基、氰基、鹵基、三烷基或三芳 基鱗、胺基酸衍生基團；W及W'較佳相同或不同且為 OH、OMe、OEt、NHCONH2、SMe ; 且當11二表示雙鍵時，U及U，不存在且w及W'表示Η ;
Rl、R2、Rl'、R21相同或不同且獨立地選自視情況經 一或多個 Hal、CN、NRR,、CF3、OR、芳基、Het、S(0)qR 取代之鹵化物或烷基，或R1與R2及Rl，與R2,一起分別形成 含有雙鍵之基團=B及=B'。 較佳地R1與R2及R1’與R2,一起分別形成含有雙鍵之基團 B與B'相同或不同且獨立地選自視情況經一或多個
Ha卜 CN、NRR,、CF3、OR、芳基、Het、S(0)qR取代之烯 基，或B及π表示氧原子。 較佳Β=Β·。 更佳 B=B，==CH2 或=CH-CH3 ; X、X'相同或不同且獨立地選自-Q_、_NR_、_(C = 〇)_、 -S(0)q -中之一或多者。 較佳x=x'。 150936.doc -75- 201116297 更佳 x=x’=o。 A、A'相同或不同且獨立地選自視情況含有氧、氮或 硫原子之烷基或烯基，各基團視情況經一或多個Hal、 CN、NRR|、CF3、OR、S(0)qR、芳基、Het、烷基、烯基 取代。 較佳A=A'。 更佳A=A'=直鏈未經取代之烷基。 _ Y、Y·相同或不同且獨立地選自H、OR; 較佳Υ=Υ·。 更佳Υ=Υ'=0烷基，更佳〇甲基。 Τ為-NR- ; -Ο- ; -S(〇)q-;或4至1〇員芳基、環烷基、 雜環或雜芳基’各基團視情況經一或多個Hai、CN、 NKK’、CF3、R、〇R、8(〇)小及/或連接子取代；或分支鏈 烧基，視情況經一或多個Hal、CN、NRR，、CF3、OR、 S(〇)qR及/或連接子取代；或直鏈烷基，經一或多個Hal、 CN、NRR’、CF3、〇R、8(〇)小及/或連接子取代。 T較佳為4至10員芳基或雜芳基，更佳為苯基或他啶基， 視情況經一或多個連接子取代。 該連接子包含連接基團。適合連接基團在此項技術中為 熟知的且包括硫醇、硫化物、二硫基、硫_基、酸不穩定 基團*不穩疋基團、肽酶不穩定基團及酯酶不穩定基 團。較佳為一硫基及硫峻基。 田連接基團為含有硫醇、硫化物（或所謂硫喊冬）或二硫 物（S )之基團時，帶有硫醇、硫化物基團或二硫基之 150936.doc -76· 201116297 側鏈可能為直鏈或分支鏈、芳族或雜環。一般熟習此項技 術者可輕易地確定適合側鏈。 該連接子較佳具有下式： -G-D-(Z)p-S-Z， 其中 G為單鍵或雙鍵、-Ο-、-S-或-NR-; D 為單鍵或-E-、-E-NR-、-E-NR-F-、-E-Ο-、-E-0-F-、 -E-NR-CO-、-E-NR-CO-F-、-E-CO-、-CO-E-、-E-CO-F、 -E-S-、-E-S-F-、-E-NR-C-S-、-E-NR-CS-F-， 其中E與F相同或不同且獨立地選自直鏈或分支鏈 -(OCH2CH2)i烷基（OCH2CH2)j-、-烷基（OCH2CH2)i-烷基-、 -(OCH2CH2)i- 、 -(OCH2CH2)i 環烧基（OCH2CH2)j-、 -(OCH2CH2)i 雜環（OCH2CH2)j- 、 -(〇CH2CH2)i 芳基 (OCH2CH2)j-、-(OCH2CH2)i雜芳基（〇CH2CH2)j-、-烧基-(OCH2CH2)i 烧基（OCH2CH2)j-、-烧基-(〇CH2CH2)i-、-烧 基-(〇CH2CH2)i 環烷基（〇CH2CH2)j-、-烷基（〇CH2CH2)i 雜 環（OCH2CH2)j-、·烷基-(〇CH2CH2)i芳基（〇CH2CH2)j- ' -烷 基（OCH2CH2)i雜芳基（〇CH2CH2)j-、-環烷基-烷基-、-烷 基-環烷基-、-雜環-烷基- ' -烷基-雜環-、-烷基-芳基—、—芳 基-烧基-、-烧基-雜芳基-、-雜芳基-燒基 其中i與j為相同或不同之整數且獨立地選自〇、1至 2000 ； Z為直鏈或分支鏈-烷基-; p為0或1 ; 150936.doc •77· 201116297 Z'表示Η、硫醇保護基，諸如c〇R、R2〇或SR20，其中 R20表示Η、甲基、烷基，視情況經取代之環烷基、芳 基、雜芳基或雜環，其限制條件為當ζ，為Η時，該化合物 與藉由在一個PBD部分之亞胺鍵_ΝΗ=上添加硫醇基_SH分 子造成之内環化作用所形成之相應化合物平衡。 η、η·相等或不同，為〇或1。 q為 0、1 或 2 » R、R'相等或不同且獨立地選自Η、烷基、芳基，各自 視情況經 Hal、CN、NRR'、CF3、R、OR、S(0)qR、芳 基、Het取代； 或其醫藥學上可接受之鹽、水合物或水合鹽，或此等化 合物或其光學異構體、外消旋體、非對映異構體或對映異 構體之多晶型結晶結構。 具有幾何異構物及立體異構物之通式（χχ)之化合物亦為 本發明之一部分。 已知式（XX)之托馬黴素衍生物之Ν·10、^丨雙鍵可在 水、醇、硫醇、一級或二級胺、脲及其他親核體存在下以 可逆方式輕易地轉化成相應亞胺加合物。此過程為可逆 的，且可在脫水劑存在下於非質子性有機溶劑中在真空中 或高溫下輕易地使相應托馬黴素衍生物再生（z T〇zuka 1983, J. Antibiotics, 36: 276) ° 因而，通式（XXI)之托馬黴素衍生物之可逆衍生物亦可 用於本發明： I50936.doc •78· 201116297
(XXI) 其中 A、X、Y、η、T、A'、X’、Y’、η1、R1、R2、 Rl'、R2'如式（XX)中所定義，且W，W相同或不同且選自 由以下組成之群：OH ;諸如-OR之醚；諸如-OCOR、-COOR 之S旨（例如乙酸醋）；諸如-OCOOR之碳酸自旨；諸如-OCONRR' 之胺基曱酸酯；使得N10及C11成為環之一部分的環狀胺 基甲酸酯；諸如-NRCONRR'之脲；諸如-OCSNHR之硫代 胺基曱酸酯；使得N10及C11成為環之一部分的環狀硫代 胺基曱酸酯；-SH ;諸如-SR之硫化物；諸如-SOR之亞 砜；諸如-SOOR之颯；諸如-S03-之磺酸酯；諸如-NRSOOR 之磺醯胺；諸如-NRW之胺；使得N10及C11成為環之一部 分的視情況存在之環胺；諸如-NROR/之羥胺衍生物；諸 如-NRCOR、-NRCONRR'之醯胺；諸如-N3之疊氮基、氰 基、i基、三烷基或三芳基鱗、胺基酸衍生基團。較佳W 與 W·相同或不同且為 OH、Ome、Oet、NHCONH2、SMe。 因而，式（XXI)之化合物可視為溶劑合物，當溶劑為水 時包括水；此等溶劑合物可尤其適用。 較佳化合物為式（XXII)或式（XXIII)之化合物： 150936.doc -79- 201116297
(XXII)
(XXIII) 其中X、Χ·、A、A'、Y、Υ·、T、η、η'如上文所定義。 式（XX)之化合物可以熟習此項技術者所熟知之許多方式 來製備。如熟習此項技術者所瞭解，化合物可例如藉由應 用或調適下文所述之方法或其變化形式來合成。適當改進 及替代為熟習此項技術者顯而易見，並為熟習此項技術者 所熟知或可自科學文獻輕易地獲得。詳言之，該等方法可 A.^R-C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, Wiley-VCH 出版，1999 中。 合成可用於本發明之托馬黴素衍生物的方法於國際申請 案第PCT/IB2007/000142號中描述。本發明化合物可藉由 各種合成路徑製備。試劑及起始物質可購得，或藉由一般 熟習此項技術者所熟知之技術輕易地合成（參看例如WO 00/12508、WO 00/12507、WO 2005/040170、W0 2005/ 085260 、 FR1516743 、 M. Mori 等人，1986， Tetrahedron, 42: 3793-3806)。 150936.doc -80 · 201116297 本發明之結合物分子可使用任何技術形成。本發明之托 馬徽素衍生物可經由酸不穩定連接子或光不穩定連接子連 接至抗體或其他細胞結合劑^衍生物可與具有適合序列之 肽縮合，且隨後連接至細胞結合劑，產生肽酶不穩定連接 子。可製備含有伯羥基之結合物，其可經醯基化，接著連 接至細胞結合劑以產生結合物，該結合物可由細胞内酯酶 裂解以釋放游離衍生物。較佳合成含有游離硫醇基或經保 屢硫醇基的衍生物，接著一或多種含二硫化物或硫醇之衍 生物各自經由二硫鍵或硫醚連接物而共價連接至細胞結合 劑。 在USP 5,416,064及USP 5,475,〇92中教示許多結合方 法。托馬黴素衍生物可經改進以產生游離胺基，接著經由 酸不穩定連接子或光不敎連接子連接至抗體或其他細胞 結合劑。具有游離胺基或羧基之托馬黴素衍生物可與肽縮 合，且隨後連接至細胞結合劑，產生肽酶不穩定連接子。 在連接子上具有游離羥基之托馬黴素衍生物可經醯基化， 接著連接至細胞結合劑產生結合物，該結合物可由細胞内 醋酶裂解以釋放游離藥物。最佳，托馬黴素衍生物經處理 以產生游離或經㈣之料基，接著含三硫化物或硫醇之 托馬黴素二聚體經由二硫鍵連接至細胞結合劑。 單株抗體或細胞結合劑托馬黴素衍生物結合物較佳為 絰由一硫鍵接合之結合物，如上文所論述，該等結合物能 夠傳遞托馬黴素衍生物。該等細胞結合結合物係藉由已知 方法製備’諸如藉由用吡啶基_二 150936.doc •81· 201116297 (SPDP)修飾單株抗體（Carlsson等人，1978, 人 173: 723-737)。接著，藉由用含硫醇之托馬黴素衍生物處 理來置換所得硫吡啶基，產生二硫化物連接之結合物。或 者’在芳基二硫-托馬黴素衍生物情況下，藉由用先前引 入抗體分子中之硫氫基直接置換托馬黴素衍生物之芳基硫 醇來形成細胞結合結合物。含有1至丨〇種托馬黴素衍生物 藥物經由雙硫橋連接之結合物可藉由任何方法輕易地製 備。 更特疋s之’二硫-硝基β比咬基修飾之抗體於〇,〇5 Μ鱗 酸卸緩衝液（pH 7.5 ’含2 mM EDTA)中2.5 mg/ml濃度之溶 液用含硫醇之托馬黴素衍生物處理（1_3莫耳當量/二硫吡啶 基）。在325 nm下以分光光度法監測硝基„比咬硫酮自經修 飾之抗體釋放且在約16小時内完成。藉由通過Sephadex G-25或Sephacryl S3 00管柱凝膠過濾純化抗體_托馬黴素衍 生物結合物’且清除未反應之藥物及其他低分子量物質。 每個抗體分子所結合之托馬黴素衍生物部分之數目可藉由 量測在230 nm及275 nm下之吸光度比率來確定。藉由此方 法可經由二硫鍵連接平均1至I 〇個托馬黴素衍生物分子/抗 體分子。 結合對於針對抗原表現細胞之結合親和力的作用可使用 先前由 Liu 等人 ’ 1996，Proc· #加/. 93: 8618-8623所述之方法來確定。托馬黴素衍生物及其抗體 結合物對細胞株之細胞毒性可藉由反向外推細胞增殖曲線 來量測，如 Goldmacher等人，1985，乂 ⑽/，135: 150936.doc -82· 201116297 3648-365 1中所述。此等化合物對黏附細胞株之細胞毒性 可藉由細胞群落檢定來測定，如Goldmacher等人，1986， ·/. Ce//价 〇/.，102: 1312-1319 中所述。 CC-1065類似物 用於本發明之細胞毒性結合物中之細胞毒性劑亦可為 CC-1065或其衍生物。 CC-1065為自鏈徽菌（iSTrepiowyca ze/ewib)之培養液中 分離之有效抗腫瘤抗生素。CC-1 065在活體外比諸如小紅 莓（doxorubicin)、曱胺喋呤（methotrexate)及長春新驗 (vincristine)之常用抗癌藥物有效約1〇〇〇倍（b.K. Bhuyan等 人，1982, 42, 35 32_3 537)。CC-1065及其類似 物於美國專利第6,372,738號、第6,340,701號、第 5,846,545號及第5,585,499號中揭示。 CC-1065之細胞毒性效能與其烷基化活性及其dNA結合 活性或DN A嵌入/¾性相關。此兩種活性存在於分子之獨立 4刀中。因而，烧基化活性含於環丙0比D各幷η引〇朵（CPI)次 單元中，而DNA結合活性存在於兩個吡咯幷吲哚次單元 中0 雖然CC-1065作為細胞毒性劑具有某些有吸引力的特 徵’但其治療用途具有侷限性。投與小鼠CC-i〇65引起延 遲之肝毒性’在單次靜脈内給予125 _後第5〇天導致 死亡（V. L· Reynoids等人’ 1986, 乂心如如，χχιχ: 3ΐ9· 334)。此結果激勵努力研發不會 物 w个I引起延遲之中毒之類々 ，且已描述模仿CC-1065之較伟留相Y κ 平乂間早類似物的合成（Μ7 150936.doc -83- 201116297
Warpehoski等人，1988, 乂 c/^w，31: 59〇·6〇3)。 在另一系列類似物中’用環丙幷[c]苯并[e]吲哚（〇趴）部 分置換CPI部分（D.L. B0ger等人，1990, j cw，55: 5823-5833 ; D.L. B〇ger等人，1991，仏〇〇rg c/?緣 kH·，1: 115-120)。此等化合物在小鼠中維持親本藥物之 高活體外效能，而不會引起延遲中毒。如同cc_1〇65，此 等化合物為以共價方式結合至DNA之小溝引起細胞死亡的 烷基化劑。然而，對最有前景之類似物阿多來新 (Adozelesin)及卡折來新（Carzelesin)進行之臨床評估已產 生令人失望的結果（B.F_ Foster等人，1996, 2>吵，13: 321_326 ; j w〇lff 等人，1996， C⑽ar Λα” 2: 1717-1723)。此等藥物由於其高全身性毒 性而顯示不良治療作用。 藉由經由靶向傳遞至腫瘤部位而改變活體内分佈，從而 對非靶向組織產生較低毒性，且因而引起較低全身性毒 性，可大大改良CC-1065類似物之治療功效。為了達成此 目標’已描述CC-1065之類似物及衍生物與專一性靶向腫 瘤細胞之細胞結合劑的結合物（美國專利5,475,〇92 ; 5,585’499 ; 5,846,545)。此等結合物通常在活體外呈現高 標靶專一性細胞毒性且小鼠之人類腫瘤異種移植模型中呈 現優越的抗腫瘤活性（R.V. j. Chari等人，1995， Λα.，55: 4079-4084)。 近來’已描述在水性介質中溶解度較高之cC_1065類似 物之前藥（歐洲專利申請案第06290379.4號）^在此等前藥 150936.doc -84· 201116297 中’用官能基保護分子之烷基化部分之酚基，該官能基可 使藥物在儲存於酸性水溶液中後穩定並賦予藥物相較於未 經保護之類似物增加之水溶度。保護基在活體内於生理pH 值下輕易裂解，獲得相應活性藥物。在EP 06290379.4中所 述之前藥中’酚取代基以含有胺基甲酸苯酯之磺酸形式經 保護’該形式在生理pH值下具有電荷，且因而具有較高水 溶度。為了進一步增強水溶度，可向吲哚基次單元與諸如 二硫基之可裂解鍵聯之間的連接子中引入視情況存在之聚 乙二醇間隔基。引入此間隔基不改變藥物之效能。 可用於本發明之細胞毒性結合物中之CC-1065類似物的 合成方法以及使該等類似物結合至諸如抗體之細胞結合劑 的方法於EP 06290379.4(其内容係以引用的方式併入本文 中）及美國專利第5,475,092號、第5,846,545號、第 5,5 85,499號、第6,5 34,660號及第6,5 86,618號以及美國申 请案第10/116,053號及第1〇/265,452號中詳細描述。 其他藥物 諸如曱胺喋呤、道諾黴素（daunorubicin)、小紅莓、長春 新鹼、長春鹼（vinblastine)、美法侖（meiphalan)、來普黴 素（leptomycin)衍生物、絲裂黴素C(mitoinycin 〇、笨丁酸 氮芥、卡奇黴素（calicheamicin)、土布黴素（tubulysin)及土 布滅素類似物、多卡米辛（duocarmycin)及多卡米辛類似 物、海兔毒素（dolastatin)及諸如阿瑞他汀（auristatin)之海 兔毒素類似物之藥物亦適用於製備本發明之結合物。藥物 分子亦可經由諸如血清白蛋白之中間載劑分子連接至抗體 150936.doc -85- 201116297 分子。例如如美國專利第6,63〇,579號中所述之小紅莓及道 諾黴素化合物亦可為適用之細胞毒性劑。 治療組合物 本發明亦係關於一種用於治療哺乳動物之過度增殖病症 的治療組合物’其包含治療有效量之本發明化合物及醫藥 學上可接受之載劑。在一項實施例中，該醫藥組合物係用 於治療癌症，包括（但不限於）以下：癌瘤，包括膀胱癌、 乳癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃 癌、子宮頸癌、甲狀腺癌及皮膚癌；包括鱗狀細胞癌；淋 巴系造血性腫瘤，包括白血病、急性淋巴球性白血病、急 性淋巴母細胞白血病、B細胞淋巴瘤、τ細胞淋巴瘤、伯基 特氏淋巴瘤；骨髓系造血性腫瘤，包括急性及慢性骨髓性 白血病及前髓細胞白血病；起源於間葉細胞之腫瘤，包括 纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤；其他腫瘤，包括黑素瘤、精原細 胞瘤、畸胎癌、神經母細胞瘤及神經膠質瘤；中樞及周邊 神經系統腫瘤，包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠 質瘤及神經鞘瘤；起源於間葉細胞之腫瘤，包括纖維肉 瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；及其他腫瘤，包括黑素瘤、著 色性乾皮病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤 '曱狀腺濾泡癌及 畸胎癌，及EphA2表現佔優勢之尚有待確定之其他癌症。 在一較佳實施例中，本發明之醫藥組合物係用於治療肺 癌、乳癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌、胰腺癌、印巢癌、 子宮頸癌及淋巴器官癌、骨肉瘤、滑液癌瘤、肉瘤、頭頸 癌、神經膠質瘤、胃癌、肝癌、或表現EphA22其他癌 -86 - 150936.doc 201116297 瘤。特定言之，癌症為轉移性癌症。在另一實施例中，該 醫藥組合物係關於其他病症，諸如自體免疫疾病，諸如全 身性狼瘡、類風濕性關節炎及多發性硬化；移植排斥，諸 如腎移植排斥、肝移植排斥、肺移植排斥、心臟移植排斥 及骨髓移植排斥；移植物抗宿主疾病；病毒感染，諸如 mV感染、HIV感染、AIDS等；及寄生蟲感染，諸如梨形 鞭毛蟲症（giardiasis)、阿米巴病（am〇ebiasis)、血吸蟲病 (schistosomiasis);及一般熟習此項技術者確定之其他病 症。 本發明提供包含以下之醫藥組合物： 有效量之本發明抗體'抗體片段或抗體結合物；及 醫藥學上可接受之載劑，其可能為惰性的或生理學上活 性的。 如本文所使用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學 上相容之任何及全部溶劑、分散介質、塗覆劑、抗細菌劑 及抗真菌劑，及其類似物。適合載劑、稀釋劑及/或賦形 劑之實例包括一或多種如下物質：水、生理食鹽水、磷酸 鹽緩衝生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物以及 其組合。在許多情況下，較佳在組合物中包括等張劑（諸 如糖）、多元醇或氣化鈉。詳言之，適合載劑之相關實例 包括.（1)杜爾貝科氏（Dulbecco's)石粦酸鹽緩衝生理食睡 水’ pH〜7.4 ’含有或不含約i 11^/1111至25 類血清 白蛋白；（2)0.9¼生理食鹽水（0·9% w/v氣化鈉（NaC1));及 (3)5% (w/v)右旋糖；且亦可含有諸如色胺之抗氧化劑及諸 150936.doc -87- 201116297 如Tween 20之穩定劑。 當治療特定病症需要時，本文中之組合物亦可含有另一 治療劑。本發明之抗體、抗體片段或抗體結合物及補充活 性化合物較佳將具有彼此無不利影響之互補活性。在一較 佳實施例中’另一治療劑為纖維母細胞生長因子（FGF)、 肝細胞生長因子（HGF)、組織因子（TF)、蛋白質c、蛋白質 S、血小板衍生生長因子（PDGF)或HER2受體之拮抗劑。 本發明之組合物可呈多種形式。此等形式包括例如液 體、半固體及固體劑型，但較佳形式視預定投藥模式及治 療應用而定。典型較佳組合物呈可注射或可輸注溶液形 式較佳技藥模式為非經腸（例如靜脈内、肌肉内、腹膜 内、皮下）。在一較佳實施例中，本發明之組合物係以推 庄形式或藉由連續輸注歷時—^時段而靜脈内投與。在另 較佳實施例中’其係藉由肌肉内、皮下、關節内、滑臈 内腫瘤内、腫瘤周圍（peritum〇ral)、病變内或病變周圍 途徑注射以發揮局部以及全身性治療作用。其亦可藉由喷 霧投與。 用於非腸技藥之無菌組合物可藉由將本發明之抗體 机體片奴或抗體結合物以所需量併入適當溶劑中，隨後 由微過遽滅菌來製備。可伯 了使用水、生理食鹽水、磷酸鹽 衝生理食鹽水、右旌嫵 & 疋糖、甘油、乙醇及其類似物以及其 合作為溶劑或媒劑。在 J在许多情況下，較佳在組合物中包」 等張劑（諸如糖）、多元醢赤备 夕疋酵或氯化鈉。此等組合物亦可含 佐劑’詳言之濕潤劑、 專張劑、钆化劑、分散劑及穩 150936.doc -88. 201116297 劑。用於非經腸投藥之無菌組合物亦可製備成無菌固體組 合物形式，纟可在使用時溶解於無菌纟或任何其他可注射 無菌介質中。 劑s視所要作用、治療持續時間及所用投藥途徑而定； 對於成人而言，劑量一般為每天5 mg至1〇〇〇 mg，單位劑 量在1 mg至250 mg活性物質範圍内。 一般而言，醫生將視欲治療個體之特定年齡、體重及任 何其他因素來決定適當劑量。 治療性使用方法 在另一實施例中，本發明提供抑制EphA2受體活性的方 法，其藉由投與有需要之患者拮抗EphA2受體之抗體。本 發月之任何類型抗體、抗體片段或細胞毒性結合物均可以 治療方式使用。因而本發明包括拮抗性抗EphA2抗體、其 片段或其細胞毒性結合物用作藥物之用途。在一較佳實施 例中，拮抗性抗EphA2抗體為2H11R3 5R74抗體或其人類化 變異體。 在一較佳實施例中，本發明之抗體、抗體片段或細胞毒 性結合物係用於治療哺乳動物之過度增殖病症。在一更佳 實施例中，一種上文中揭示且含有本發明之抗體、抗體片 段或細胞毒性結合物的醫藥組合物係用於治療哺乳動物之 過度增殖病症。本發明之一實施例亦為本發明之抗體、抗 體片段及細胞毒性結合物亦可用於製造治療哺乳動物之該 過度增殖病症的藥物。在一項實施例中，該病症為癌症。 詳言之，癌症為轉移性癌症。本發明之抗體、抗體片段及 150936.doc •89· 201116297 細胞毒性結合物亦可用於治療該癌症腫瘤之新企管生成。 因此，本發明之醫藥組合物適用於治療或預防各種癌 症，包括（但不限於）以下：癌瘤，包括膀胱癌、乳癌、結 腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宮 頸癌、甲狀腺癌及皮膚癌；包括鱗狀細胞癌；淋巴系造血 性腫瘤，包括白血病、急性淋巴球性白血病、急性淋巴母 細胞白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴 瘤；骨髓系造血性腫瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病及 前聽細胞白血病，起源於間葉細胞之腫瘤，包括纖維肉瘤 及橫紋肌肉瘤；其他腫瘤，包括黑素瘤、精原細胞瘤、畸 胎癌、神經母細胞瘤及神經膠質瘤；中樞及周邊神經系統 腫瘤’包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及神 經鞘瘤；起源於間葉細胞之腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌 肉瘤及骨肉瘤；及其他腫瘤，包括黑素瘤、著色性乾皮 病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、曱狀腺濾泡癌及畸胎癌， 及EphΑ表現佔優勢之尚有待確定之其他癌症。在一較佳 實施例中，癌症為肺癌、乳癌、結腸癌、前列腺癌、腎 癌、胰腺癌、子宮癌、卵巢癌、子宮頸癌及淋巴器官癌、 骨肉瘤、滑液癌瘤、肉瘤、頭頸癌、神經膠質瘤、胃癌、 肝癌、或表現EphA之其他癌瘤。在另一實施例中，該醫 藥組合物係關於其他病症，諸如自體免疫疾病，諸如全身 性狼瘡、類風濕性關節炎及多發性硬化；移植排斥，諸如 腎移植排斥、肝移植排斥、肺移植排斥、心臟移植排斥及 骨髓移植排斥，移植物抗宿主疾病；病毒感染，諸如mv 150936.doc •90- 201116297 感染HIV感染、AIDS等；及寄生蟲感染，諸如梨形鞭毛 蟲症、阿米巴病、血吸蟲病；及一般熟習此項技術者所確 定之其他病症。 類似地，本發明提供抑制所選細胞群體生長之方法該 方法包含用有效量之本發明抗體、抗體片段或抗體結合 物，或者抗體、抗體片段或包含細胞毒性結合物之治療劑 單獨或與其他細胞毒性劑或治療劑組合接觸靶細胞或含有 乾細胞之組織。 抑制所選細胞群體生長之方法可能在活體外、活體内或 離體實施。如本文所使用，「抑制生長」意謂在短時段内 或長時段内延緩細胞生長、降低細胞生存力、引起細胞死 亡、溶解細胞及誘導細胞死亡。 活體外用途之實例包括在自體骨髓移植至同一患者體内 别對其進行處理以殺死患病細胞或惡性細胞；在骨趫移植 前對其進行處理以殺死勝任T細胞並預防移植物對抗宿主 疾病（GVHD);處理細胞培養物以殺死除不表現把抗原之 所要變異體以外的所有細胞；或殺死表現不合需要之抗原 的變異體。 非臨床活體外使用條件由一般熟習此項技術者輕易地確 定。 臨床離體用途之實例為在癌症治療或自體免疫疾病治療 中在自體移植前自骨髓移除腫瘤細胞或淋巴細胞，或在移 植前自自體或同種異體骨髓或組織移除T細胞及其他淋巴 細胞以預防移植物抗宿主疾病（GVHD)。可如下進行處 150936.doc -91- 201116297 理°自患者或其他個體收集骨髓，接著在添加本發明之細 胞毒性劑的含有血清之培養基中培育。濃度範圍為約1 〇 μΜ至1 PM，在約37。(：下歷時約3〇分鐘至約48小時。確切 濃度條件及培育時間，亦即劑量由一般熟習此項技術者輕 易地確定。培育後用含有血清之培養基洗滌骨髓細胞，並 根據已知方法靜脈内輸注回患者體内。在患者於骨髓收集 時間與再輸注經處理之細胞之間接受諸如根除式化學療法 或全身照射療程之其他治療的情況下，經處理之骨髓細胞 係使用標準醫療設備冷凍儲存於液氮中。 對於臨床活體内使用’本發明之抗體、抗原決定基結合 抗體片段或細胞毒性結合物將以已測試無菌性及内毒素含 量之溶液形式供應。細胞毒性結合物之適合投藥方案之實 例如下。每週給予結合物一次，歷經4週，各週以靜脈内 推注形式投藥。推注劑量以可添加5至10 ml人類血清白蛋 白之50至100 ml生理食鹽水形式給予。每次靜脈内投藥劑 量將為10 pg至100 mg(範圍為每天1〇〇 ng至1 mg/kg)。劑量 更佳在50 pg至30 mg範圍内。劑量最佳在1 mg至20 mg範 圍内。治療4週後，患者可繼續每週一次接受治療。關於 投藥途徑、賦形劑、稀釋劑、劑量、時間等之特定臨床方 案可由一般熟習此項技術者依臨床情形之證據來確定。 診斷 本發明之抗體或抗體片段亦可用於在活體外或活體内债 測生物樣品中之EphA2。在一項實施例中，本發明之抗 EphA2抗體係用於測定組織或來源於組織之細胞中的 150936.doc -92- 201116297
EphA2含量。在一較佳實施例中，組織為患病組織。在該 方法之一較佳實施例中，組織為腫瘤或其活組織檢查切 片。在該方法之一較佳實施例中，首先自患者切除組織或 其活組織檢查切片’接著可在免疫檢定中用本發明抗體或 抗體片段測定該組織或活組織檢查切片中之EphA2含量。 該組織或其活組織檢查切片可經冷凍或固定。可使用同一 方法測定EphA2蛋白質之其他性質，諸如其酪胺酸磷酸化 量、細胞表面量或細胞定位。 可使用上述方法來診斷已知或疑似患有癌症之個體之癌 症’其中將在s玄患者中所量測之EphA2含量與正常參考個 體中之含量或標準值進行比較。接著可使用該方法確定腫 瘤是否表現EphA2，其可表明腫瘤將對用本發明抗體、抗 體片段或抗體結合物進行之治療產生良好反應。腫瘤較佳 為肺癌、乳癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌、胰腺癌、子宮 癌、卵巢癌、子宮頸癌及淋巴器官癌、骨肉瘤、滑液癌 瘤、肉瘤、神經膠質瘤、胃癌、肝癌、頭頸癌或表現 EphA2之其他癌瘤，及EphA2表現佔優勢之尚有待確定之 其他癌症。 本發明進一步提供經進一步標記用於研究或診斷應用之 單株抗體、人類化抗體及其抗原決定基結合片段。在較佳 實施例中，標記為放射性標記、螢光團、發色團、成像劑 或金屬離子。 亦提供一種診斷方法，其中該等經標記之抗體或其抗原 決定基結合片段投與疑似患有癌症之個體，並量測或監測 93· 150936.doc 201116297 該標記在該個體體内之分佈。 套組 亦l括套組，例如包含所述細胞毒性結合物及使 日=。L毒1±合物殺死特定細胞類型的說明書。該等說 曰可〇括在活體外、活體内或離體使用細胞毒性結合物 之指導。 套組通常將具有含有細胞毒性結合物之隔室。細胞毒性 結合物可呈綠形式、液體形式或可改良以包括在套組中 之/、他形式。套組亦可含有實踐套組中說明書上所述之方 法所需之其他70件’諸如用於復原;東乾粉末之滅菌溶液、 用於在杈與患者前與細胞毒性結合物組合之其他藥劑，及 幫助向患者投與結合物之工具。 本發明亦係關於一種製品，其包含： • a)包裝材料； -b)抗體或其抗原決定基結合片段或結合物；及 c)含於該包裝材料内的標籤或包裝插頁，指示該抗體或 其抗原決定基結合片段對治療癌症有效。 實例 實例1 製備結合物 2H11R35R74結合至 DM4 一般合成流程 實例 la : hu2HUR35R74-PEG4-NHAc-DM4 150936.doc •94· 201116297 ----- CA(PEG)4 〇 1) BrCH2CONHSCH2CI2
2) DIC
抗體 緩衝液，DMA o
f。 NH NH Ab 實例 lb: hu2HllR35R74-PEG4-Mal-DM4 95- 150936.doc 201116297
方法A:高壓液相層析-質譜（LCMS) 已在Waters UPLC-SQD系統上以正及/或負電喷霧模式 (ES+/-)獲得光譜。色譜條件如下：管柱：ACQUITY BEH C18，1.7 μπι-2.1χ30 mm ;溶劑：A : H20(0.10/〇 曱酸）B : CH3CN(0.1%曱酸）；管柱溫度：45°C ;流動速率：0.6 ml/min ;梯度（2 min):在 1 min 内，自 5% 至 50% B ; 1.3 min : 100% B ; 1.45 min : 100% B ; 1.75 min : 5% B。 方法B:高壓液相層析-質譜（LCMS) 已在Waters ZQ系統上以正及/或負電喷霧模式（ES+/-)獲 得光譜。色譜條件如下：管柱：XBridge C18 2.5 μιη 3x50 150936.doc -96- 201116297 mm ;溶劑：A : Η2Ο(0·1% 曱酸）B : CH3CN(0.1% 曱酸）；管 柱溫度：70°C ;流動速率：0.9 ml/min ;梯度（7 min):在 5.3 min内，自 5%至 100% ; 5.5 min : 100% B ; 6.3 min : 5% B。 方法C:免疫結合物之去糖基化及高解析度質譜 (HRMS) 去糖基化為藉助於糖苷酶之酶促消化技術。由500 μΐ結 合物+100 μΐ Tris 缓衝液 HC1 50 mM+ΙΟ μΐ 聚糖酶-F 酶（100 單位經冷凍乾燥之酶/100微升水）進行去糖基化。渦旋培養 基並在37°C下維持一夜。接著去糖基化樣品即可進行 HRMS分析。在Waters Q-Tof-2系統上以電喷霧正模式 (ES + )獲得質譜。色譜條件如下：管柱：4 μιη BioSuite 250 URH SEC 4.6x300 mm(Waters);溶劑：A :曱酸銨 25 mM+1%甲酸；B : CH3CN ;管柱溫度：30°C ;流動速率： 0·4 ml/min ;等度溶離 70°/。A+30% B( 1 5 min)。 方法D:分析型尺寸排外層析（SEC) > 管柱：TSKgel G3000 SWXL 5 μπι管柱，7.8 mmx30 cm，TOSOH BIOSCIENCE，LLC部件號 08541 > 移動相：KC1(0.2 M)、KH2P〇4(0.052 M)、K2HP〇4(0.107 M)、iPrOH(20%，以體積計） > 分析條件：以0.5 ml/min等度溶離30分鐘 方法E :質譜（MS) 已藉由化學電離（反應氣體：氨）在WATERS GCT系統（無 LC下直接引入）上獲得光譜。 150936.doc -97- 201116297 方法F:高壓液相層析-質譜（LCMS) 已在Waters UPLC-SQD系統上以正及/或負電噴霧模式 (ES + Λ)獲得光譜。色譜條件如下：管柱：ACQUITY BEH C18 1.7 μιη-2.1χ50 mm ;溶劑：A : H2O(0.1% 甲酸）B : CH3CN(0.1°/。曱酸）；管柱溫度：50°c ;流動速率：1 ml/min ;梯度（2 min) : 0.8 min 内，自 5% 至 50% B ; 1.2 min : 100% B ; 1.85 min : 100% B ; 1.95 min : 5% B。 縮寫：
AcOEt :乙酸乙酯；ALK : (CVCu)伸烧基，尤其（CVC6) 伸烷基；DAR :藥物抗體比率；DBU : 1，8-二氮雙環 [5.4.0]十一 -7-烯；DCC : N，N'-二環己基碳化二亞胺； DCM :二氯曱烷；DEAD :偶氮二羧酸二乙酯；DIC : Ν,Ν'-二異丙基碳化二亞胺；DIPEA : Ν,Ν-二異丙基乙胺； DMA :二甲基乙醯胺；DMAP : 4-二甲基胺基吡啶； DME :二曱氧基乙烷；DMF :二甲基曱醯胺；DMS0 :二 甲亞砜；ε :莫耳消光係數；EEDQ : 2-乙氧基-1-乙氧基羰 基-1,2-二氫喹啉；EDC1 : Ν-(3-二甲基胺基丙基）-NL乙基 碳化二亞胺；EDTA :乙二胺四乙酸；Fmoc :苐基曱氧基 羰基；Hal :鹵原子；HOBt : 1-羥基苯并三唑；HEPES : 4-(2-羥基乙基）-1-哌嗪-乙烷磺酸；NHS : N-羥基丁二醯亞 胺；iPrOH :異丙醇；NMP : N-曱基吡咯啶酮；Rf :滞留 因子；RP :減壓；RT :室溫；SEC :尺寸排外層析； TBDMS :第三丁基二曱基矽烷基；TEA :三乙胺；TFA : 三氟乙酸；TFAA :三氟乙酸酐；TFF :切向流式過濾； 150936.doc -98- 201116297 THF :四氫呋喃；TIPS :三異丙基矽烷基；TLC :薄層層 析；tR :滯留時間。 緩衝液内含物： > 缓衝液 A(pH 6.5) : NaCl(50 mM)、KPi(50 mM)、 EDTA(2 mM) >缓衝液HGS(pH 5·5):組胺酸（10 mM)、甘胺酸（130 mM)、蔑糖5% (w/v)、HC1(8 mM) 用於Ab及L-DM4濃度計算之參數（參考計算方法： Therapeutic Antibodies and Protocols 5 第 525卷，445)： > hu2HllR35R74之莫耳消光係數（在280 nM下為 224000;在25 2 11^1下為828 80)及[-〇]^4之莫耳消光 係數（在280 nM下為5180 ;在252 nM下為2615 9)，假 定抗體之平均分子量為160000。 實例la : la.l.製備與PEG4-乙酿胺基連接之結合物： hu2HHR35R74-PEG4-NHAc-DM4
Un 在磁力攪拌下，在室溫下添加9 ml hu2HllR35R74 150936.doc -99- 201116297 (14.36 mg/ml，於緩衝液A中），接著添加16.85 ml緩衝液 A、3.23 ml HEPES 1 Μ、1.59 ml DMA，接著添加 1.64 ml L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化酯之 10 mM DMA溶液。i 小時30分鐘後，在室溫下添加額外0.085 ml L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化酯之10 mM DMA溶液。1小時45分鐘 後，在室溫下用60 ml HGS緩衝液稀釋粗結合介質，並在 Pellicon 3卡匣上藉由TFF進行純化。將樣品相對約10個樣 品體積之HGS缓衝液進行透濾，接著收集。用額外1〇 ml HGS緩衝液洗滌TFF儲槽及細胞株。將兩種溶液混合，通 過0.22 μιη PVDF過濾滅菌，在Amicon 15上濃縮，並通過 0.22 μιη PVDF過濾滅菌。因而獲得 17 ml hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4免疫結合物（c=5.76 mg/ml)。接著分析免 疫結合物之最終載藥量及單體純度。 SEC 分析（方法 D) : DAR(SEC)=5.4 ; RT=16.757 ;單體純 度=99.5% HRMS資料（方法C):參看圖2 la.2.製備 L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化酯：
150936.doc •100- 201116297 在磁力攪拌下’在室溫下將154.3 mg L-DM4引入玻璃小 瓶中。接著添加90 mg 3-[2-(2-{2-[2-(2·溴·乙醯胺基）-乙氧 基]-乙氧基}-乙氧基）-乙氧基]-丙酸_2,5-二側氧基 -°比0各咬-1-基醋於0.94 ml DMA中之溶液，隨後添加36 μΐ DIEA。23 小時後’在室溫下用5 ml AcOEt稀釋反應介質並用7 ml水 洗蘇。用5 ml AcOEt萃取水相。所合併之有機相經硫酸鎂 乾燥’在減壓下濃縮至乾燥。獲得228 „^淺黃色黏性油狀 物’該產物用最低量之DMA稀釋並在30 g C18接枝矽膠上 藉由急驟層析純化（溶離梯度水：乙腈95:5至5:95，以體積 計）°在減壓下濃縮溶離份2及3後，獲得無色黏性油狀 物’該產物用最低量之DMA稀釋並在30 g C18接枝矽膠上 藉由急驟層析純化（溶離梯度水：乙腈95:5至5:95，以體積 計）。在減壓下濃縮溶離份33至35後，獲得41 mg呈白色蛋 白穌皮樣產物形式的L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化S旨， 其特徵如下：
質譜：方法B 滯留時間（min)=4.06 [M+H-H20J + : m/z 1164 ； [M+H] + : m/z 1182 ； [M-H+HC02H]-: m/z 1226 NMR分析 1H (500 MHz，δ (ppm)，三氣甲烷-d): 0.80 (S， 3 H); 1.21 (S, 3 H); 1.22 (s, 3 H); 1.25 (m, 1 H); 1.29 (d, ^=6.7 Hz, 6 H); 1.46 (m, 1 H); 1.57 (d, 7=13.4 Hz, 1 H); 164 (s，3 H ); 1.76至 1.83 (m，1 H); 1.88至 1.96 (m，1 H); 2.18 (dd，J=2.5及 14.3 Hz，1 H); 2.36 (m，1 H); 2.53 (m, 1 150936.doc -101 - 201116297 H); 2.61(dd, 7=12.5^14.3 Hz, 1 H); 2.825.2.92 (m, 10 H); 2.98 (d, 7=16.7 Hz, 1 H)； 3.03 (d, 7=9,6 Hz, 1 H); 3.15 (d, J=12.9 Hz，1 H); 3.22 (s，3 h); 3.32 (大單峰，l H); 3.36 (s， 3 H); 3.42 (m, 2 H); 3.50 (d, /=9.1 Hz, 1 H); 3.53 (t, 7=5.2 3.99 (s，3 H); 4.27 (m，1 h); 4.77 (dd，·7=2.9及 11.9 Hz，1 H); 5.42 (q，《/=6.7 Hz，1 h); 5.66 (dd，/=9.1 及 15.4 Hz，1 H ); 6.23 (s,l H); 6.43 (dd, J=11.3A 15.4 Hz, 1 H); 6.64 (d, hn' «7=1.1 Hz，1 H); 6.74 (d, HZ，1 H); 6.85 (d，/=1.1 Hz， 1 H); 7.08 (t，/=5.2 Hz，1 h)。 la.3.製備3-[2-(2-{2-[2-(2_溴_乙醯胺基）_乙氧基】_乙氧 基}_乙氧基）-乙氧基】-丙酸2,5·二側氧基_咕咯啶4 —基
在磁力攪拌下，在室溫下將671 4 mg 3_(2_{2_[2 (2胺 基-乙氧基）-乙氧基]-乙氧基卜乙氧基卜丙酸（CA(pEG)4, Pierce)引入玻璃小瓶中。接著添加597 4 mg溴乙酸2,5•二 側氧基-吡咯啶-1-基酯於14 ml二氣曱烷中之溶液。15分鐘 後，在室溫下添加0.396 ml DIC(N，N，-二異丙基碳化二亞 胺）。1小時30分鐘後’在燒結玻璃上過濾粗反應介質，且 在100 g CN接枝矽膠上藉由急驟層析純化濾液（溶離梯度 正庚烷/iPrOH/AcOEt，iPrOH部分逐漸增加）。在減壓下濃 縮溶離份30至45後，獲得761 mg呈無色油狀物形式的3_[2_ ο
150936.doc •102· 201116297 (2-{2-[2-(2-溴-乙醯胺基）-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基）-乙氧 基]-丙酸2，5 -二側氧基-π比洛咬-1 -基自旨’其特徵如下. 質譜：方法A 滞留時間（min) = 0_74 [M+H] + : m/z 483/485 [M-H+HC02H]-: m/z 527/529 可按照公開方案（Biochemistry, 1974, 481)製備溴-乙酸 2,5-二側氧基比咯啶-1-基酯。 實例lb : lb.l·製備與PEG4-Ma丨連接之結合物： hu2HllR35R74-PEG4-Mal-DM4
在磁力攪拌下，在室溫下添加4 ml hu2HllR35R74 (14.36 mg/ml ’於緩衝液A中），接著添加7.5 ml緩衝液A、 1.45 ml HEPES 1 Μ、1.15 ml DMA，接著添加 0.3 05 ml L-DM4-Mal-PEG4-CONHS活化酯之 10 mM DMA溶液。7小時 後，在室溫下用70 ml HGS緩衝液稀釋粗結合介質，並在 Pellicon 3卡匣上藉由TFF進行純化。將樣品相對於約10個 樣品體積之HGS緩衝液進行透濾，接著收集。用額外10ml 150936.doc -103 - 201116297 HGS緩衝液洗滌TFF儲槽及細胞株。將兩種溶液混合，在 Amicon 15上濃縮並通過0.22 μιη PVDF過濾滅菌。因而獲 得 8.0 ml hu2HllR35R74-PEG4-Mal-DM4 免疫結合物 (c=5.09 mg/ml)。接著分析免疫結合物之最終載藥量及單 體純度。 SEC 分析（方法 D) : DAR(SEC)=5.3 ; RT=16_680 ;單體純 度=99.5% HRMS資料（方法C):參看圖3 lb.2.製備L DM4-MaNPEG4-CONHS活化酯：
在磁力攪拌下，在室溫下依序添加50 mg L-DM4、17.2 mg 經支撐之 DIEA(3.72 mmol/g)及36.2 11^3-{2-[2-(2-{2-[3 - ( 2，5 -二側氧基-2，5 -二氮-。比11各-1 -基）-丙酿胺基]-乙氧基}_ 乙氧基）-乙氧基]-乙氧基}·-丙酸2,5 -二側氧基-D比洛π定-1-基 酯（可購得，SM(PEG)4，Pierce)於360 μΐ DMA中之溶液。 1小時30分鐘後，在室溫下過濾反應介質，用AcOEt洗滌固 體，且在14 g CN接枝矽膠上藉由急驟層析直接純化所合 併之濾液（溶離梯度庚烷：AcOEt:iPrOH，iPrOH之比重逐 漸增加）。在減壓下濃縮含有預期產物之溶離份後，獲得 29.8 mg呈無色玻璃形式的L-DM4-Mal-PEG4-CONHS活化 150936.doc -104- 201116297 酯，其特徵如下：
質譜：方法A 滯留時間（min)=l.24/1.25(2種非對映異構體） [M+H] + : m/z 1293 [M-H+HC02H]-: m/z 1337 實例lc:製備與SPDB連接之結合物： hu2HllR3 5R74-SPDB-DM4
使用與先前於WO 200801 0101A9中關於其他hu2H 11抗體 所描述之方案相同的方案，使用SPDB(4-[2-吡啶基二硫基] 丁酸N-羥基丁二醯亞胺酯）連接子使人類化2H11R35R74抗 體結合至L-DM4 N21脫乙醯基-N2’（4-曱基-4-酼基-1-側氧基 戊基）-美登素。簡而言之，8 mg/ml hu2Hll及hu37.3D7抗 體分別經5.5或6·5倍莫耳過量之SPDB修飾。反應在室溫下 於含 EtOH(5% v/v)之緩衝液 A(50 mM KPi/50 mM NaCl/2 mM EDTA，pH 6·5，95% v/v)中進行90分鐘。接著，藉由 含緩衝液A之SephadexG25去鹽管柱純化經修飾之抗體。 接著，經修飾之抗體與相對於SPDB連接子1.7倍莫耳過量 150936.doc •105· 201116297 之DM4反應。2.5 mg/mL抗體在室溫下於緩衝液A(97% v/v) 及DMA(二甲基乙醯胺，3% v/v)中進行反應20小時。藉由 含10 mM組胺酸、130 mM甘胺酸、5%蔗糖之SephadexG25 去鹽管柱化115.5)純化結合物。111137.307-8?06-01^4之藥 物抗體比率為4.0，且hu2Hl 1-SPDB-DM4之藥物抗體比率 為 3.1。 實例 Id :製備結合物 hu2HllR35R74-PEG4-NMeAc-DM4
ld.l 製備結合物 hu2HllR35R74-PEG4-NMeAc-DM4 在磁力攪拌下，在室溫下添加4 ml hu2HllR35R74 (14.36 mg/ml，於緩衝液A中），接著添加7.5 ml緩衝液A、 1.45 ml HEPES 1 Μ、1.05 ml DMA，接著添加 0.39 ml L-
DM4-AcNMe-PEG4-CONHS活化酯之 10 mM DMA溶液。在 室溫下30分鐘後，添加額外0.19 ml L-DM4-AcNMe-PEG4-CONHS活化酯之10 mM DMA溶液。在室溫下3小時後，用 65 ml HGS緩衝液稀釋粗結合介質，並在Pellicon 3卡匣上 藉由TFF進行純化。將樣品相對於約10個樣品體積之HGS 150936.doc •106· 201116297 緩衝液進行透濾，接著收集。用額外1〇 ml HGS緩衝液洗 務TFF儲槽及細胞株。將兩種溶液混合’在Amic〇rl 15上濃 縮’並通過0.22 μιη PVDF過濾滅菌。因而獲得8.5 ml hu2HllR35R74-PEG4-NMeAc-DM4 結合物（c=6.01 mg/ml)。 接著分析結合物之最終載藥量及單體純度。SEC分析 (D) : DAR(SEC)=5.5 ; RT=16.7 min ;單體純度=99.4% ; HRMS資料：參看圖14。 ld.2 製備 L-DM4-AcNMe-PEG4-CONHS活化酯 在磁力攪拌下’在室溫下將133.4 mg L-DM4引入玻璃小 瓶中。接著添加85 mg 3-{2-[2-(2-{2-[(2-溴-乙醯基）-曱基-胺基]-乙氧基}-乙氧基）-乙氧基]-乙氧基}_丙酸2,5·二側氧 基-吡咯啶-1-基酯於0.2 ml DMA中之溶液，隨後添加32.9 μΐ DIEA。在室溫下1小時後，於30 g C18接枝矽膠上藉由 急驟層析（溶離梯度水：乙腈95:5至5:95，以體積計）純化反 應介質。在減壓下濃縮含有所要產物之溶離份後，獲得 71_3 mg呈無色玻璃樣產物形式的L-DM4-AcNMe-PEG4-CONHS活化酯。質譜（D) : RT=0,98 min ; [Μ+Η-Η20] + : m/z 1178(主信號）；[M+Na] + ·· m/z 1218; [M-H+HC02H]-: m/z 1240 ; 1H NMR (500 MHz, δ (ppm)，三氣甲烧-d): 0.81 (s，3 H) ; 1.20至 1.33 (m，13 H) ; 1.42至 1.52 (m，1 H); 1.56至 1.61 (m，1 H) ; 1.65 (s，3 H) ; 1.73 至 1.83 (m，1 H); 1.96至 2.04 (m，1 H) ; 2.19 (dd，J=2.8及 14.4 Hz, 1 H) ; 2.29 至 2.41 (m，1 H) ; 2.55 至 2.66 (m，2 H) ; 2.83 至 2.93 (m，12 H) ; 3.04 (d, 7=9,8 Hz, 1 H) ; 3.12 (d, 7=12.7 Hz, 1 H); 150936.doc •107- 201116297 3.18至 3.25 (m，5 η) ; 3.37 (s，3 Η) ; 3.47至 3.54 (m，3 Η); 3.57至 3.68 (m，15 Η) ; 3 85 (t，J=6 6 Ηζ，2 Η) ; 3 99 (s，3 印；4.29(〇1，111);4.79(0£1，>/=2.8及12.2沿，1印；5.41 (q，·7=6.7 Ηζ，1 η) ; 5.68 (dd，·7=9.3及 15.2 Ηζ，1 Η) ; 6.23 (s，1 Η) ; 6.43 (dd，·7=11.0及 15.2 Ηζ，1 Η) ; 6.66 (s，1 Η); 6.74 (d，/=11.0 Ηζ，】Η) ; 6 83 (s，j Η)。 ld.3製備3_{2_丨2_(2_{2_【(2_溴-乙醯基）甲基胺基】乙氧 基卜乙氧基乙氧基】-己氧基}-丙酸2,5-二側氧基·》比咯啶_ 1-基醋
在磁力攪拌下，在室溫下依序向圓底燒瓶中引入U51 mg 3_(2·{2-[2-(2·甲基胺基·乙氧基）_乙氧基]_乙氧基}乙氧 基）-丙酸、1.5 ml DCM、97.3 mg溴-乙酸2,5_二側氧基_吡 咯啶-1-基酯。2小時後，添加72 μι DIEA ,且在室溫下再j 小時後，添加70.2 μΐ DIC。粗反應介質在室溫下保持4小 時，在-20 C下保持16小時，接著在3〇 g矽膠上藉由急驟層 析進行純化（溶離梯度DCM:甲醇自〇:1 〇〇至3:97，以體積 汁）°在減壓下濃縮含有所要產物之溶離份後，獲得85 8 «^呈白色固體形式的3_{2_[2_(2{2_[(2_溴乙醯基）_曱基_ 胺基]-乙氧基}-乙氧基）·乙氧基乙氧基卜丙酸2,5_二側氧 基比略唆-1-基 _。質譜（A) : RT=〇 84 min ; [m+h] + : m/z 497/499 〇 ld.4製備3-(2-{2-【2-(2-甲基胺基_乙氧基）_乙氧基】-乙氧 150936.doc •108- 201116297 基}-乙氧基）-丙酸 在氬氣惰性氛圍下，在磁力攪拌下向圓底燒瓶中依序引 入 120.1 mg 3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-三氟-乙醯胺基）-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基）-乙氧基]-丙酸甲酯、lml無水THF及59.8 μΐ CH3I。在約〇°c下用冰/水浴冷卻反應介質，且以小份緩 慢添加16.1 mg NaH(50%純，於油中）。在〇°C下歷時1 5分 鐘’且在室溫下歷時1小時後，在減壓下將粗反應介質濃 縮至乾燥，並用0.5 ml THF及0.8 ml水稀釋。接著在室溫 下向反應介質中添加30.6 mg LiOH。粗反應介質在室溫下 保持2小時，在-20t：下保持16小時，接著在30 g C18接枝 矽膠上藉由急驟層析進行純化（溶離梯度水：乙腈自95:5至 5 :9 5 ’以體積計）。在減壓下濃縮含有所要產物之溶離份 後，獲得115.3 1^呈黃色油狀物形式的3_(2-{2-[2-(2-曱基 胺基-乙氧基）-乙氧基]-乙氧基}_乙氧基）_丙酸。 ld.5製備3-[2-(2-{2-[2_(2,2,2-三氟-乙醯胺基）乙氧基】_ 乙氧基}-乙氧基）-乙氧基卜丙酸甲酯
在氬氣惰性氛圍下，在磁力攪拌下向圓底燒瓶中依序引 入230 mg 3-(2-{2-[2-(2-胺基.乙氡基）_乙氧基]_乙氧基卜乙 氧基）-丙酸（CA(PEG)4，Pieree)、2 在室溫下，向反應介質中緩慢添加 ml DCM及1 ml曱醇。 ml三甲基矽烷基重氮 150936.doc •109- 201116297 甲烷（於己烷中2 Μ溶液）。在室溫下2小時後，添加乙酸來 中和過量之三甲基矽烷基重氮曱烷。接著，在減壓下蒸發 粗反應介質至乾燥。用2 ml DCM稀釋所獲得之殘餘物， 用水冰浴冷卻至0°C，接著依序添加363 μΐ TEA及3 00 μΐ TFAA。在室溫下歷時2小時30分鐘，且在-20°C下歷時19小 時後，依序添加363 μΐ TEA及300 μΐ TFAA。在室溫下4小 時30分鐘後，粗介質儲存在-20°C下，接著在30 g C18接枝 石夕膠上藉由急驟層析進行純化（溶離梯度水：乙腈自9 5:5至 5:95，以體積計）。在減壓下濃縮含有所要產物之溶離份 後，獲得123 mg呈淺黃色油狀物形式的3-[2-(2-{2-[2-(2,2,2-二氟-乙酿胺基）_乙氧基]_乙氧基乙氧基）_乙氧基]_ 丙酸甲酯。質譜（A) : RT=0.90 min ; [M+H] + : m/z 376 ; [M-H]- : m/z 374。 實例 le:製備結合物 hu2HllR35R74-PEG8_NHAe_DM4
le.l 製備結合物 hu2H11R35R74_pEG8 NHAc DM4 在磁力攪拌下，在室溫下添加4 ml hu2HUR35R74 (M.36 mg/m卜於緩衝液A中），接著添加7 5 μ緩衝液A、 L45 ml HEPES ! Μ、ml DMA，接著添加 〇.4〇5 mi l_ -no- 】50936.doc 201116297 DM4-AcNMe-PEG8-CONHS活化酯之 10 mM DMA溶液。在 室溫下30分鐘後，添加額外0.1 ml L-DM4-AcNMe-PEG8-CONHS活化酯之10 mM DMA溶液。在室溫下1小時45分鐘 後，用60 ml HGS緩衝液稀釋粗結合介質，並在Pellicon 3 卡匣上藉由TFF進行純化。將樣品相對於約10個樣品體積 之HGS緩衝液進行透濾，接著收集。用額外10 ml HGS緩 衝液洗務TFF儲槽及細胞株。將兩種溶液混合，在Amicon 15上濃縮，並通過0.22 μηι PVDF過濾滅菌。因而獲得7.0 ml hu2HllR35R74-PEG8-AcNMe-DM4 結合物（c = 6.95 mg/ml)。接著分析結合物之最終載藥量及單體純度。SEC 分析（D) : DAR (SEC)=5.0 ; RT=16.593 min ;單體純度 = 99.5% ; HRMS資料：參看圖15。 le.f 製備 L-DM4-AcNH-PEG8-CONHS活化酯 在磁力攪拌下，在室溫下向玻璃小瓶中引入6511^3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(3-溴-丙醯胺基）-乙氧基]-乙氧基}-乙 氧基）-乙氧基]-乙氧基}-乙氡基）-乙氧基]-乙氧基}-丙酸 2,5-二側氧基-吡咯啶-1-基酯，接著引入67.7 11^[-01^4於 0.85 ml DMA及16.5 μΐ DIEA中之溶液。在室溫下歷時48小 時後，在10 g矽膠上藉由急驟層析純化反應介質（溶離梯度 DCM:MeOH 100:0至90:10，以體積計）。在減壓下濃縮溶 離份18至26後，獲得17 mg呈無色玻璃形式的L-DM4-AcNH-PEG8-CONHS活化酯。質譜（B) : RT=4.08 min ; [M+H-H20] + : m/z 1340(主信號）；[M+Na] + : m/z 1380; [M-H+HC02H]-: m/z 1402 ； 1H NMR (400 MHz, δ (ppm), 150936.doc -Ill - 201116297 三氣甲烷-d) : 0·81 (s，3 Η) ; 1·22 (s，3 Η) ; 1.23 (s，3 Η); 1.26 (m，1 Η) ; 1·30 (d，*7=6.8 Ηζ，6 Η) ; 1.41 至 1·52 (m，1 Η) ; 1.65 (s，3 Η) ; 1.80 (m，1 Η) ; 1.89至 1.99 (m，1 Η); 2.19(111，111);2.37(111，111);2.47至2.67(111，2 11);2.81至 2.93 (m, 10 Η) ; 2.99 (d, y=16.6 Hz, 1 H) ; 3.04 (d, J=9,8
Hz，1 H) ; 3.16 (寬雙峰，《7=13.7 Hz，1 H) ; 3.23 (s，3 H); 3.32 (寬單峰，1 H) ; 3.37 (s，3 H) ; 3.44 (m, 2 H) ; 3.51 (d， /=9,11^，111);3.54(1，>/=5.4 1^，2 11);3.59至3.73(111，29 H) ; 3.86 (t，/=6.6 Hz，2 H) ; 4.00 (s，3 Η) ; 4·22至 4.33 (m， 1 Η) ; 4·78 (dd，*7=2.9及 12.2 Hz，1 H) ; 5.43 (q，·7=6·8 Hz，1 H) ; 5.67 (dd，·7=9,〇及 15.2 Hz，1 H) ; 6.23 (s，1 H) ; 6.44 (dd，J=11.2及 15.2 Hz，1 H) ; 6.65 (d，《7=1.5 Hz，1 H) ; 6.75 (d，Jr=11.2Hz，lH);6.86(d，t/=1.5Hz,lH);7.02S7.13 (m，1 H)。 le.g 製備 3-{2-[2·(2-{2-[2-(2-{2-[2-(3-溴丙醯胺基）-乙 氧基】-乙氧基}-乙氧基）-乙氧基]-乙氧基}·乙氧基）·乙氧基]_ 乙氧基}•丙酸2,5-二側氧基-吡咯啶_ι_基酯：
在磁力攪拌下，在室溫下依序向玻璃小瓶中引入10〇 mg 3-(2-{2-[2-(2-胺基-乙氧基）-乙氧基]_乙氧基卜乙氧基）_丙 酸（CA(PEG)4，Pierce)、2 ml DCM及 53.5 mg溴-乙酸 2,5- 二側氧基比"各咬-1-基酯。在室溫下1小時後，添加35.1 μΐ DIC。1小時後，在燒結玻璃上過滤粗反應介質，在減壓下 150936.doc •112- 201116297 、農縮至乾燥’用i〇 mi 稀釋’在燒結玻璃上過;慮並 在減壓下濃縮至乾燥。獲得76.5 mg呈無色油狀物形式的3-{2-1；2_(；2-丨2-[2-(2-{2-[2-(3-溴-丙醯胺基）-乙氧基]-乙氧基}_ 乙氧基）_2>氧基]-乙氧基}-乙氧基）-乙氧基]-乙氧基}-丙酸 2 5 -二側氣基_ °比17各咬-1 ·基醋。質譜（A) : RT=〇. 8 0 miη ; [Μ+Η] + : m/z 659/661 ; [M-H+HC02H]-: m/z 703/ 705。 實例If:製備結合物hu2HllR35R74-PEG4-稀丙基- DM4
lf.l 製備結合物 hu2HllR35R74-PEG4-烯丙基-DM4
在磁力攪拌下’在室溫下添加4 ml hu2HllR35R74 (14.3 6 111§/1111，於緩衝液八中），接著添加7.5 1111緩衝液八、 1.45 ml HEPES 1 Μ、1_14 ml DMA，接著添加 0.3 ml L-DM4-烯丙基-PEG4-CONHS活化酯之10 mM DMA溶液。在 室溫下歷時30分鐘後，添加額外0.125 ml L-DM4-烤丙基-PEG4-CONHS活化酯之10 mM DMA溶液。在室溫下1小時 25分鐘後，用65 ml HGS緩衝液稀釋粗結合介質，並在 Pemcon 3卡匣上藉由TFF進行純化。將樣品相對於約10倍 樣品體積之HGS緩衝液進行透濾，接著收集。用額外丨〇 mI 150936.doc -113- 201116297 HGS緩衝液洗滌TFF儲槽及細胞株。將兩種溶液混合，在 Amicon 15上濃縮，並通過0.22 μηι PVDF過濾滅菌。因而 獲得 8.0 ml hu2HllR35R74-PEG4-烯丙基-DM4 結合物 (c=5.22 mg/ml)。接著分析結合物之最終載藥量及單體純 度。SEC分析（H) : DAR (SEC)=5.3 ; RT=16.767 min ;單 體純度=99.4% ; HRMS資料：參看圖16。 lf.2製備L-DM4-烯丙基-PEG4-CONHS活化酯 在磁力攪拌下，在室溫下依序向玻璃小瓶中引入70 mg L-DM4'45 mg 3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2-烯基氧基）-乙氧基]· 乙氧基}-乙氧基）-丙酸2,5-二側氧基-η比洛唆-1-基酯（溴-稀 丙基-PEG4-CONHS)、0.5 ml DMA及 23.5 μΐ DIEA。在室溫 下歷時2小時且在-20°C下歷時17小時後，添加50 μΐ DIEA。在室溫下歷時24小時後，於30 g C-1 8接枝石夕膠上 藉由急驟層析純化反應介質（溶離梯度水：乙腈95:5至 5:95，以體積計）。在減壓下濃縮含有預期產物之溶離份 後’獲得47·1 mg呈白色固體形式的L-DM4-稀丙基-PEG4-CONHS活化酯。質譜（D) : RT=1.06 min ; [M+Na] + : m/z 1173 ; 1H NMR (500 MHz, δ (ppm)，三氣甲烷_句：〇 81 (s，3 Η) ; 1.18至 1.39 (m，13 Η) ; 1.42至 1.52 (m，！ Η) ; ! 58 (υ=13.4ΗΖ，1Η);1.65(3,3Η);1.7ΐ182(ιη，1Η); 1.86至 1.95 (m，1 Η) ; 2.19 (d，·7=14·3 Ηζ，1 η) ; 2.40 (m，1 Η) ; 2.51 至 2·65 (m，2 Η) ; 2.82至 2.95 (m, 9 Η) . 2 98至 3.07 (m，2 Η) ; 3.12 (d，7=12.6 Ηζ，1 Η) ; 3.18至 3.27 (m，1 Η) ; 3.23 (s, 3 Η) ;3.36 (s, 3 Η) ; 3.51 (d, J=9jl Hz, 1 Η); 150936.doc -114- 201116297 3.54至3.82(111，13 11);3.86(1，1/=6.4 1^，2 11);3.91至3.95 (m，2 Η) ; 3.99 (s，3 Η) ; 4.28 (t, «7=11.0 Hz，1 Η) ; 4.78 (£1£1，>/=2.6及11,9沿，1印；5.44((1，>/=6.7 112，1^1);5.49 至 5.63 (m，2 Η) ; 5.68 (dd，《7=9.1 及 15.0 Ηζ，1 Η) ; 6.24 (s 1 Η) ; 6.43 (dd，/=11.1 及 15.0 Ηζ，1 Η) ; 6.66 (s, 1 Η) ; 6·77 (d, J=ll.l Ηζ,Ι Η) ; 6.83 (s, 1 Η) 〇 製備3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2-烯基氧基）-乙氧基】·乙氧 基}_乙氧基）-丙酸2,5-二側氧基-吼洛啶-1-基酯
在室溫下依序向玻璃小瓶中引入2〇〇 mg 3-(2-{2-[2n 溴-丁-2-烯基氧基）_乙氧基]-乙氧基丨_乙氧基）_丙酸、4叫 DCM及23 2.3 mg經支撐之DCC(2當量）。在室溫下歷時1小 時後’添加64_ 8 mg NHS。在室溫下歷時5小時後，在燒結 玻璃上過濾粗反應介質，用DCM洗滌固體，並在減壓下濃 縮所合併之濾液至乾燥。在15 g矽膠上藉由急驟層析進行 純化（溶離梯度1^01^0€]^0:1〇0至10:90，以體積計），並 在減壓下漢縮含有預期產物之溶離份，獲得46 mg呈淺黃 色油狀物形式的3-(2-{2-[2-(4-溴-丁 -2-烯基氧基）-乙氧基]_ 乙氧基}-乙氧基）-丙酸2,5-二側氧基-»比〇各啶-1 _基酯（溴-烯 丙基-PEG4-CONHS)。質譜（a) : RT=1.02 min ; [Μ+Η] + : m/z 454/456 ； [M+Na] + : m/z 476/478 ； [M-H+HC02H]-: m/z 498/500 ° 150936.doc -115 - 201116297 lf.4製備3-(2-{2-[2-(4-溴·丁-2-稀基氧基）·乙氧基卜乙氧 基}-乙氧基）-丙酸
八vS^〇H 在室溫下，將1 g 3-(2-{2-[2-(4-溴-丁-2·烯基氧基）·乙氧 基]-乙氧基}-乙氧基）-丙酸第三丁酯（可購得）、6 ml TFA及 3 ml DCM之溶液攪拌3小時，接著在減壓下濃縮至乾燥。 用甲苯稀釋油性殘餘物，並在減壓下濃縮至乾燥，獲得 853 mg呈棕色油狀物形式的3-(2-{2-[2-(4·溴-丁 _2_烯基氧 基）-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基）-丙酸。 實例 lg:製備結合物 hu2Hll-PEG4-NHAc-DM4 結合物hu2Hl l-PEG4-NHAc-DM4可以類似於實例1之方 式製備.在授摔下’在室溫下添加1 ml hu2Hl 1(8.5 2 mg/ml，於緩衝液A中），接著添加0.7 ml緩衝液A、0.213 ml HEPES 1 Μ、0.7 ml DMA，隨後添加 0.085 ml L-DM4-AcNH-PEG4-CONHS活化醋之 10 mM DMA溶液，用 0.128 ml DMA稀釋。在室溫下歷時2小時後，在Amicon 4上於 7000 G下濃縮粗介質，於Nap-10管柱上與HGS緩衝液進行 緩衝液交換，且最後在5 ml Zeba管柱上純化。因而獲得 1.15 ml hu2Hll-PEG4-NHAc-DM4 結合物（c=3.78 mg/ml)。 接著分析結合物之最終載藥量及單體純度。SEC分析（方法 D) : DAR (UV)=6.6 ; DAR(SEC)=5.6 ; RT=15.387 min ;單 體純度=99.7% ; HRMS資料：參看圖17。 實例2 150936.doc • 116- 201116297 藉由hu2HllR35R74抑制EphA2自體磷酸化活性 材料及方法 細胞株及抗體 乳腺癌細胞株MDA-MB-231係獲自ECAAC(參考號 92020424)。非小細胞肺癌細胞株NCI-H1299係獲自 ATCC(參考號CRL-5803)。兩種細胞株均維持在補充有10% 熱失活胎牛血清及2 mM L-Gln之杜爾貝科氏改良伊格爾培 養基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM)中。重 組小鼠Ephrin-Al細胞外域/Fc嵌合體（EphrinAl/Fc)係獲自 Sigma(參考號 E 9902)或 R&D Systems(參考號 602-A1)。抗 Eck/EphA2純系D7抗體（Ab)及抗磷酸酪胺酸Ab 4G10係獲 自Millipore(參考號分別為05-480及05-321)。chKTI同型對 照Ab係由Immunogen Inc.生產。其對應於抗Kunitz大豆胰 蛋白酶抑制劑Ab之嵌合型式（KTI，ATCC參考號 HB 9515)，其中Ig重鏈及輕鍵恨定區由人類κ輕鏈及人類γΐ 重鏈置換。在11111111111〇〇611((：111^1批號 2539-91)，自針對重 鏈及輕鏈經表現質體短暫轉染之ΗΕΚ293Τ細胞的培養物上 清液純化重組Ab。人類化抗EphA2 Ab hu2Hll(批號 LP08191)及 hu2HllR35R74(批號 LP09077)係在 Sanofi-Aventis由經穩定轉染之Lonza中國倉鼠卵巢（CHO)/GS細胞 株產生。藉由在蛋白質A-瓊脂糖凝膠上進行親和層析，隨 後根據標準程序進行陰離子交換層析自培養物上清液中純 化兩種Ab。在陶瓷羥基磷灰石上執行額外層析步驟。所有 製劑在4°C下儲存於1 xPBS中，並使用動力學LAL法測試低 150936.doc -117- 201116297 内毒素含量。抗肌動蛋白抗體純系C4來自於Millipore(參 考號ΜΑΒ15〇1)。過氧化酶（P〇)結合山羊抗小‘IgG Ab來 自於 Jackson Immunoresearch(參考號 115-035-003)。 誘導磷酸化 將MDA-MB-231細胞以每板3χ1〇6細胞接種於P100皮氏 培養皿中之完全培養基中（每種樣品5個板），並在37°C下於 C〇2培育箱中培育48小時。使細胞血清饑餓18小時，隨後 在 37°C 下用 10 pg/mL hu2Hll 或 hu2Hll-R35/R74或者用 2 pg/mL EphrinAl/Fc處理10分鐘至2小時。 抑制磷酸化 在 37°C 下用 chKTI、hu2Hll 或 hu2HllR35R74(10 pg/mL) 培育血清饑餓之MDA-MB-231或NCI-H1299細胞1小時。接 著，添加1 pg/mL EphrinAl/Fc並在37。(：下再培育細胞10至 30分鐘。 製備細胞提取物 在冰上藉由刮剝收集細胞樣品，轉移至1 5 mL錐形管中 並在13 00 rpm下離心5分鐘。用1 X磷酸鹽緩衝生理食鹽水 (PBS ; Invitrogen編號14190)洗滌一次後，將細胞再懸浮 於300 μί臨時補充有1 mM苯基甲基磺醯基氟化物 (PMSF)、lx蛋白酶抑制劑混合液（sigma參考號P2714)及 lxHalt破酸酶抑制劑（Pierce參考號78420)之溶解緩衝液 (Biosource參考號FNN0011)中。細胞提取物保持在冰上45 分鐘’偶爾渦旋，在15000 rpm下離心10分鐘並保持在 •8 0°C下直至進一步使用。藉由二喧琳甲酸（BCA)法使用來 150936.doc -118· 201116297 自Pierce之套組（參考號23227)測定蛋白質濃度。 免疫沈澱法 藉由添加先前在溶解緩衝液中平衡之蛋白質G瓊脂糖凝 膠 4快速流（GE Healthcare Life Sciences，參考號 17-0618· 01)來執行細胞提取物（每個樣品0.3-0.5 mg)之預清潔步驟 (在4°C下’於旋轉器上1小時）。在4°C下於旋轉器上培育3〇 分鐘。在1 500 rpm下離心樣品2分鐘，收集上清液並在旋 轉器上用抗EphA2 Ab純系D7(每個樣品4 μί)培育隔夜。在 4°C下於旋轉器上用蛋白質G瓊脂糖凝膠執行免疫沈澱法4 小時。在4°C下以1 500 rpm離心樣品2分鐘，並用1 〇〇 溶 解緩衝液洗滌3次歷時5分鐘。使免疫沈澱珠粒再懸浮於5〇 gL補充有NuPAGE還原劑（Invitrogen參考號NP0009)之 4><NuPAGE LDS 樣品緩衝液（Invitrogen 參考號 NP0007)中， 在95°C下加熱5分鐘，以1500 rpm離心5分鐘，並保持在 -20C下或進行電泳。 免疫墨點法 將免疫沈澱物或細胞提取物裝載於4%至12%具有參考分 子量標記物（GE healthcare Life Sciences參考號 RPN800)之 Bis-Tris Midi 凝膠（Invitrogen 編號 NP0322BOX)上，並在 150 V下於MOPS-SDS緩衝液 1 x(Invitrogen 參考號 ΝΡ0001) 中執行電泳3小時。在PVDF膜（Invitrogen參考號LC2007)上 用i-blotTM裝置（Invitrogen)使用程式3執行電墨點法 (Electroblotting)。在補充有5%牛血清白蛋白之TBST 1 χ(亦即’ Tris緩衝生理食鹽水，Sigma參考號τ 5912， 150936.doc -119- 201116297 0.1% Tween 20，Sigma參考號PI 379)中阻斷膜。在下於 同一緩衝液中用抗EphA2 Ab純系D7或抗磷酸酪胺酸4Gi〇
Ab標記隔仗。在室溫下用抗肌動蛋白Ab純系C4標^己1】 時。隨後用1 xtbst洗滌膜後，使用p〇結合山羊抗小鼠 1〇4〇〇1Ea)使
及來自Perkin Elmer之ECL套組（參考號NEL 免疫墨點顯影。在Fuji4000裝置上讀取發光度。 結果 在MDA-MB23 1細胞中使用重組EphrinAl/Fc作為陽,丨生董子 照研究由 hu2Hll 或 hu2HllR35R74 Ab誘導之 EphA2i|| 的 化。結果呈現於圖4中。自10分鐘至2小時使用兩種Ab中之 任一者均未偵測到誘導填酸化，而在10分鐘@ i # EphrinAl/Fc誘導強EphA2受體破酸化，信號在1小時時門 始減弱，且在2小時時受體降解開始可見。 在NCI-H1299及MDA-MB-231細胞中研究^ _ EphrinAl/Fc誘導後抑制EphA2峨酸化。結果於圖5a 圖 5B中呈現。在兩種情況下，用兩種Ab中之任一者對、細月~ 進行預培育藉由EphrinAl/Fc抑制EphA2受體磷酸化。 可推斷hu2Hll及hu2HllR35R74對EphA2受體具有相似 抑制活性。 實例3 結合之抗EphA2抗體hu2HllR35R74及hu2Hll的結合特 徵。 \ 使用 BIAcore 3000儀器（GE healthcare，Nv°pH321)藉由表 面電漿子共振偵測來監測裸或藉由PEG4-NHAC連接子結合 150936.doc -120- 201116297 至DM4之抗EphA2抗體hu2Hll及hu2HllR3 5R74與經固定 之EphA2-Fc的相互作用。使用標準胺偶合方案以EDC(N-乙基-Ν’-[二曱基-胺基丙基]碳化二亞胺）/NHS(N-羥基丁二 醯亞胺）以10 μΐ/min將EphA2-Fc(10 pg/ml;乙酸鹽緩衝液 ρΗ=4·5)偶合至C1感測器晶片基質（GE healthcare BR-1005-
40)。在動力學結合實驗中，密度控制在約1 〇〇個反應單位 (RU)之較高反應水準。將igG在含有0.15 M NaCn、3 mM £〇丁入及0.005%?20之0.01厘以？68(?117.4)中稀釋。所有 隨後稀釋均在相同緩衝液中進行。所有結合實驗均在2 5。〇 下執行’ IgG濃度通常在50至0.2 nM範圍内，流動速率為 50 μΐ/min。 收集資料歷時約12分鐘（2分鐘締合時間及10分鐘解離時 間）且以30 μΐ/min之1 M NaCl施加1分鐘脈衝，使用5〇 mM NaOH再生表面。IgG亦流過未經塗佈之細胞，並且自用 EphA2-Fc偶合晶片獲得之感測器圖譜減去空操作之感測器 圖谱。將資料擬合至具有漂移基線之1:1朗谬爾結合模 型。此算法計算kon及k。" ’據此以兩個速率常數之比率 (koff/U推導表觀平衡解離常數Kd。所獲得之值於表〗中指 示。 首先用裸hWHll及hu2HllR35R74量測親和力常數。分 析hu2Hll對EphA2-Fc之結合資料，得到〖〇為〇 3〇 nM ;此 值類似於hu2HllR35R74之KD(0.22 nM)。然而，當檢定中 使用結合抗體時，結果顯著不同：結合之hu2Hu具有諸如 7·5之較高藥物抗體比率，當與裸抗體相比時顯示〖ο增加 I50936.doc • 121 · 201116297 5.4倍（1.62 nM相對於0.30 nM)。另一方面，以7.4之藥物抗 體比率結合之hu2HllR35R74的KD與裸抗體之KD(0.27 nM 相對於0.22 nM)相同。此外，對於5.6至8.4範圍中之藥物 抗體比率，KD無顯著不同。 吾人推斷即使在高藥物抗體比率下，2H11R35R74抗體 之親和力亦不受結合影響。 實例4 藉由人類化21111113 51174-?£04-；\^1-〇]^4抑制表現丑？11八2 之腫瘤細胞生長 抑制Lovo腫瘤細胞 將Lovo腫瘤細胞（每孔2000)接種於96孔組織培養板中之 含血清完全培養基中。連續稀釋結合物並以在ι〇-7至ι〇-12 Μ範圍内之濃度一式三份添加至各孔中。在37°C/5% C02 下，在抗體-細胞毒性化合物結合物存在下培養細胞5天， 此段時間後根據製造商說明書（Dojindo細胞計數套組-8， 目錄號CK04)執行4小時WST8檢定來評估細胞存活率及生 長。自測試孔讀數減去不含細胞之試劑空白值，且將資料 以存活分數繪圖，該等存活分數藉由經結合物處理之細胞 的讀數除以經媒劑處理之細胞之對照孔讀數之平均值而獲 得。 可將兩批hu2HllR35R74-PEG4-Mal-DM4在高美登素/抗 體比率（6.70 D/A及7.00 D/A)下之細胞毒性效能與具有類 似美登素/抗體比率（6.99 D/A)之野生型hu2Hl 1-PEG4-Mal-DM4結合物之細胞毒性效能相比較。如圖7中可見，兩種 150936.doc -122- 201116297 hu2Hl 1R35R74-PEG4-Mal-DM4結合物展示針對 EphA2 陽性 Lοvo細胞株之效能比野生型hu2Hl 1之相應結合物高（表 II)。 實例5 藉由人類化2H11R35R74-PEG4-NHAC-DM4抑制表現 EphA2之腫瘤細胞生長 抑制 MDA-MB231 及 SKMEL28 生長 用胰蛋白酶處理處於指數生長期之細胞，並將其再懸浮 於其各別培養基中（對於MDA-MB231細胞為DMEM/F12 (Gibco編號21331)、10%SVF(Gibco編號 10500-05 6)、2nM 麩醯胺酸（Gibco編號25030);對於SKMEL-28細胞為 DMEM(Gibco 編號 11960)、10% SVF(Gibco 編號 1 0500-056)、2 nM麩醯胺酸（Gibco編號25030))。以5000細胞/孔 (MDA-MB231，SKMEL-28)之密度將細胞懸浮液分配在96 孔 Cytostar 培養板（GE Healthcare Europe，編號RPNQ0163) 中之含血清完全培養基中。塗覆4小時後，將結合物之連 續稀釋液以在1〇·7至ΙΟ·12 Μ範圍内之濃度一式三份添加至 各孔中。細胞在抗體-細胞毒性化合物結合物存在下在 3 7°C/5% C〇2下培養3天。在第4天，向各孔中添加10 μΐ 14C胸苷溶液（0.1 pCi/孔，Perkin Elmer編號NEC56825000)。 在實驗開始後96小時用MicroBeta放射性計數器（Perkin Elmer)量測14C胸苷之攝取。自測試孔讀數減去不含細胞 之試劑空白值，且將資料以存活分數繪圖，該等存活分數 藉由經結合物處理之細胞之讀數除以經媒劑處理之細胞之 150936.doc -123- 201116297 對照孔讀數之平均值而獲得。在一些實驗中，在開始實驗 時將裸抗體（2H11或2H11R3 5R74)以1 μΜ之濃度添加至各 孔中，並根據先前描述量測對增殖之抑制。 結果 報導於表III中之結果表明’就對MDA-MB23 1細胞之活 體外增殖抑制及針對抗原陰性細胞（antigen minus cell)(SKMEL-28)之活體外選擇性而言，2H11R35R74-PEG4-NHAC-DM4 以及 2H11R35R74-PEG4-Mal-DM4結合物 比先前結合物更佳。 實例6 藥物動力學研究 設計本研究以在CD-1小鼠中評估hu2HllR35R74-PEG4-NHAC-DM4結合物（DAR=5.5)相較於 hu2Hll-SPDB-DM4結 合物（DAR=3.9)之藥物動力學特性。動物經由靜脈内途徑 接受20 mg/kg各結合物，並且在注射後0、8、24、48、 72、120、168、240、336、504、672小時收集血液。在標 準條件下量測抗體藥物結合物之血漿含量以確定單一劑量 基本藥物動力學參數。藉由專一性ELISA技術量測結合物 及其抗體組分（總抗體，即結合抗體與任何脫除結合抗體 之總和）之血漿漢度。 計算hu2Hl 1-SPDB-DM4之抗體組分（總）之清除率相關之 藥物動力學參數：C1(清除率）為0.00043 L/h/kg ; Tl/2(終 末半衰期）為160 h ; AUC Ο-inf(自零時間至無限大之濃度 時間曲線下面積）為47,000,000 ng.h/mL ; Vdss(穩態分佈體 150936.doc -124- 201116297 積）為 0.095 L/kg ;且 C0(0時間之濃度）為 270,000 ng/mL。 計算hu2Hll-SPDB-DM4結合物之藥物動力學參數：C1 為 0.00070 L/h/kg ; T1/2 為 87 h ； AUC Ο-inf 為 28,000,000 ng.h/mL ; Vdss為 0.080 L/kg ;且 C0為 360,000 ng/mL。 hu2HllR3 5R74-PEG4-NHAc-DM4之抗體組分（總）之 PK 參數為：C1 為 0.00027 L/h/kg ; T1/2為 190 h ; AUC Ο-inf為 73,000,000 ng.h/mL ; Vdss 為 0.068 L/kg ；且 C0 為 530,000 ng/mL 0 最後，hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4結合物展示如 下值：清除率為 0.00036 L/h/kg ; T1/2為 150 h ; AUC 0-inf 為 56,000,000 ng.h/mL ; Vdss 為 0.069 L/kg ;且 CO 為 600,000 ng/mL。 總之，hu2Hll-SPDB-DM4 結合物比 hu2Hl 1R35R74-PEG4-NHAc-DM4清除得快。此外，與hu2Hll-SPDB-DM4 相比，hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4 展示更佳暴露 (A U C 0 - i n f)且總結合抗體與總抗體曲線之間的間隔較窄 (比較圖7與圖8)。 實例7 hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4 及 hu2Hll-PEG4-NHAc-DM4結合物針對植入雌性SCID小鼠中之原發性結腸腫瘤 CR-LRB-004P的抗腫瘤作用 材料及方法 為了評估結合物之抗腫瘤活性，每日對動物進行稱重且 每週藉由測徑規量測腫瘤2次。使用下式計算腫瘤重量： 150936.doc •125· 201116297 質量（mg)=[長度（mm)x寬度（mm)2]/2。以最高無毒性劑量 (HNTD)進行抗腫瘤活性評估。 產生20%最底點體重減輕（bwl)(組平均值）或者1 0%或 10%以上藥物死亡的劑量視為過度毒性劑量。動物體重包 括腫瘤重量。主要功效終點為ATMC、中值消退百分比、 部分及完全消退（PR及CR)及無腫瘤存活（TFS)。 藉由自指定觀察日之腫瘤體積減去第一次治療當日（開 始曰（staging day))之腫瘤體積來計算各腫瘤之各治療組（T) 及對照組（C)之腫瘤體積變化。計算治療組之中值ΔΤ並計 算對照組之中值△(：。接著，計算比率ATMC並以百分比表 不 · %AT/AC = 中值（77-ΓΟ) 中值（CV-C0)
xlOO 當ΔΤ/Δ(：低於40%時，劑量視為具有治療活性；且當 △ T/AC低於10%時視為極具活性。若ΔΤ/Δί：低於0，則劑量 視為具有高活性並記錄消退百分比之日期（參考1): 腫瘤消退。/<» :定義為相較於第一次治療第一天之腫瘤體 積，在指定觀察日治療組中之腫瘤體積降低百分比。 計算特定時間點及對各動物之消退百分比。接著計算該 組之中值消退百分比。 %消退（在ί時刻）=辟(。二㈣X100 體積,。 部分消退（PR):若腫瘤體積降低至開始治療時腫瘤體積 的50%，則定義為部分消退。 150936.doc -126- 201116297 完全消退（CR):當腫瘤體積=0 mm3時達成完全消退（當 無法記錄腫瘤體積時，視為CR)。 TFS :無腫瘤定義為在研究結束時（末次治療後>100天） 動物不具有可偵測之腫瘤。 結果 評估2劑量濃度之hu2Hll-PEG4-NHAc-DM4結合物及 hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4針對經皮下植入雌性 SCID小鼠中之較強表現標靶之可量測原發性結腸腫瘤CR-LRB-004P之抗腫瘤作用。對照組未經處理。劑量表示為 毫克蛋白質/公斤。在第15天藉由靜脈内（IV)推注投與40 mg/kg及 10 mg/kg之 hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4。為 了給予等劑量DM4，投與44 mg/kg及11 mg/kg之hu2Hl 1 -PEG4-NHAC-DM4。 如表V所示，在CR-LRB-004P腫瘤中使用單一投藥時 程，40 mg/kg 及 10 mg/kg 之 hu2Hl 1R35R74-PEG4-NHAC-DM4具有活性，AT/AC分別為28°/。及39。/。；而僅44 mg/kg 之hu2Hll-PEG4-NHAc-DM4具有活性，ΔΤ/Δί：為26%。10 mg/kg之hu2Hll-PEG4-NHAc-DM4在此模型中不具活性。 由此等結果可見，相較於hu2Hll-PEG4-NHAc-DM4結合 物，hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4結合物在較低劑量 下展現較佳活性。 實例8 DAR對 hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4在 SCID雌性小 鼠中針對前列腺癌PC-3之抗腫瘤活性的影響 150936.doc -127- 201116297 關於經皮下植入雌性SCID中之前列腺PC-3腫瘤在6個不 同藥物抗體比率（DAR)下比較兩個低效劑量來評估DAR對 抗體藥物結合物hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4之抗腫 瘤活性的影響。對照組未經處理8劑量表示為毫克蛋白 質/公斤。藉由UV法測定DAR。在第16天，藉由靜脈内 (IV)推注投與 10 mg/kg 及5 mg/kg 之 hu2HllR35R74-PEG4-1^11入〇〇]\44,0入11分另|】為3.4、4.4、5.9、6.2、7.4及8.4。 材料及方法 為了評估結合物之抗腫瘤活性，每日對動物進行稱重且 每週藉由測徑規量測腫瘤2次。使用下式計算腫瘤重量： 質量（mg)=[長度（mm)x寬度（mm)2]/2。以最高無毒性劑量 (HNTD)進行抗腫瘤活性評估。 產生20%最底點體重減輕（bwl)(組平均值）或者10%或 1 0°/。以上藥物死亡的劑量視為過度毒性劑量。動物體重包 括腫瘤重量。主要功效終點為ΔΤ/ΔΟ：、中度消退百分比、 部分及完全消退（PR及CR)及無腫瘤存活者（TFS)。 藉由自指定觀察日之腫瘤體積減去第一次治療當曰（開 始曰）之腫瘤體積來計算各腫瘤各治療組（Τ)及對照組（C)之 腫瘤體積變化。計算治療組之中值ΔΤ並計算對照組之中值 △ C。接著，計算比率ΔΤ/AC並表示為百分比： %AT/AC = 土偉（Γ’-Γ〇) X100 中值（a-co) 當ATMC低於40%時，劑量視為具有治療活性；且當 △ TMC低於10%時視為極具活性。若ΔΤ/Δ(：低於0，則劑量 150936.doc -128· 201116297 視為異有高活性並記錄該消退百分比之曰期（參考1): 腫痼消退％:定義為相較於第一次治療第一天之腫瘤體 積，在指定觀察曰治療組中之腫瘤體積降低百分比。 計算特定時間點及各動物之消退百分比。接著計算該組 之中值消退百分比。 %消退（在塒刻）=積，-X100 體積/〇 部分消退（PR):若腫瘤體積降低至開始治療時之腫瘤體 積的5〇°/。’則定義為部分消退。 完全消退（CR):當腫瘤體積=〇 mm3時達成完全消退（當 無法記錄腫瘤體積時，視為CR)。 TFS :無腫瘤定義為在研究結束時（末次治療後> 1 〇〇天） 動物不具有可偵測之腫瘤。 結果 如表VI中所說明，使用單一投藥時程，10 mg/kg之 hu2HllR3 5R74-PEG4-NHAc-DM4在 4.4之 DAR至 8·4 之較高 DAR展示活性。 5 mg/kg之 hu2Hl 1R3 5R74-PEG4-NHAC-DM4在 5.9 之 DAR 至8.4之較高DAR展示活性。 總之，DAR 對 hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4 之腫瘤 活性具有影響，且可自此等結果推斷，hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4之最佳DAR至少等於5.9。 實例9 DAR對 hu2HllR35R74，PEG4 NHAc-DM4之 PK參數的影 150936.doc -129- 201116297 響。 單次靜脈内投與20 mg/kg結合物後，在雄性CD-I小鼠中 評估hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4在不同藥物抗體比 率（DAR)下之藥物動力學性質。在標準條件下量測結合物 之血漿含量以確定單一劑量基本藥物動力學參數。BPK參 數與裸親本抗體之PK參數相比較。藉由專一性ELISA技術 量測結合物及其抗體組分（總抗體，即結合抗體與任何脫 除結合抗體之總和）之血漿濃度。 結果（參看圖9A及9B)顯示DAR值與總抗體組分暴露之間 存在反向相關性，對於0、3.4、4.3、5.9、6.6及7.4之 DAR，AUC Ο-inf 值分別為 83,000,000、61，000,000、 48.000. 000、46,000,000、41，000,000及27,000,000 ng · h/mL。 類似地，DAR值與結合物暴露之間存在反向相關性，對 於3.4、4.3、5.9、6.6及7.4之〇八11，八1；(：0_丨1^值分別為 39.000. 000、30,000,000、27,000,000、29,000,000及 20,000,000 ng · h/mL。 DAR值與抗體組分消除之間存在完全相關性，對於〇、 3.4、4.3、5.9、6.6 及 7.4 之 DAR，C1值分別為 0.00024、 0.00033 、 0.00042 、 0.00043 、 0.00049及0.00074 L/h/kg 。 類似地，DAR值與結合物消除之間存在幾乎完全之相關 性，對於3.4、4.3、5.9、6.6及7.4之0八11，（：1值分別為 0.00051 、 0.00066 、 0.00075 、 0.00069 、 0.00099 L/h/kg ° 總之，DAR對PK參數具有影響，當DAR增加時，暴露降 低且消除增加。 150936.doc •130- 201116297 根據效能及PK評估之結果，最佳DAR將包括5.9至7.4。 實例10 在 SCID 雌性小鼠中評估 hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4針對前列腺癌PC-3 評估8劑量濃度之抗體藥物結合物hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4針對經皮下植入雌性SCID小鼠中 之較強 表現標 靶之可量測前列腺PC-3腫瘤的抗腫瘤作用。對照組未經處 理。劑量表示為毫克蛋白質/公斤。 在第 17 天靜脈内（IV)推注 160、120 ' 80、40、20、10、 5及2.5 mg/kg該等結合物。 材料及方法 為了評估結合物之抗腫瘤活性，每日對動物進行稱重且 每週藉由測徑規量測腫瘤2次。使用下式計算腫瘤重量： 質量（mg) =[長度（mm)x寬度（mm)2]/2。以最高無毒性劑量 (HNTD)進行抗腫瘤活性評估。 產生20%最底點體重減輕（bwl)(組平均值）或者10%或 1 0%以上藥物死亡的劑量視為過度毒性劑量。動物體重包 括腫瘤重量。主要功效終點為ΔΤ/Δ(：、中度消退百分比、 部分及完全消退（PR及CR)及無腫瘤存活者（TFS)。 藉由自指定觀察日之腫瘤體積減去第一次治療當日（開 始曰）之腫瘤體積來計算各腫瘤之各治療組（Τ)及對照組（C) 之腫瘤體積變化。計算治療組之中值ΔΤ並計算對照組之中 值AC。接著，計算比率ΔΤ/Δ(：並表示為百分比： 150936.doc -131 - 201116297 %AT/AC = 中值（7>-；Γ0) 中值（C7 — CO) 當ATMC低於40%時，劑量視為具有治療活性；且當 △ T/AC低於10%時視為極具活性。若ΔΤ/Δ(：低於0，則劑量 視為具有高活性並記錄該消退百分比之曰期（參考1): 腫瘤消退％ :定義為相較於第一次治療第一天時之腫瘤 體積，在指定觀察日治療組中之腫瘤體積降低百分比。 計算特定時間點及各動物之消退百分比。接著計算該組 之中值消退百分比。 %消退（在ί時刻）=體ϋ-生X100 體積,〇 部分消退（PR):若腫瘤體積降低至開始治療時腫瘤體積 的50%，則定義為部分消退。 完全消退（CR):當腫瘤體積=0 mm3時達成完全消退（當 無法記錄腫瘤體積時，視為CR)。 TFS :無腫瘤定義為在研究結束時（末次治療後>100天） 動物不具有可偵測之腫瘤。 結果 使用單一投藥時程，發現測試結合物之最高劑量（160 mg/kg)有毒，導致體重減輕及與藥物相關之死亡。 如表VIII所說明，在HNTD(120 mg/kg)及其他最低劑量 下，化合物具有高活性。除2.5 mg/kg以外，所有劑量之 hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4誘導部分消退，且120、 80及20 mg/kg誘導完全消退。另外，腫瘤模型為惡病質， 150936.doc •132- 201116297 且相較於對照組，投與該化合物可減少最底點體重減輕。 總之，hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4 對前歹ij 腺 PC-3 腫瘤模型展示高活性及良好劑量效應。 實例11 藉由在2.1A解析度下對EphA2受體細胞外域與hu2Hll-R35-R74之Fab片段的複合物之晶體結構進行結構測定來 定位抗原決定基並識別互補位。 材料及方法 對EphA2受體-Fc之糖基化細胞外域與hu2Hl 1R35-74之 F ab的複合物進行初始結晶試驗。僅在胰蛋白酶存在下獲 得晶體。分析此等晶體，且肽圖顯示其含有Fab、EphA2 細胞外域之N末端結構域的某一部分及Fc的某一部分。製 造另一批複合物，此次使用具有末端His標記物之EphA2受 體非糖基化細胞外域與來自hu2HllR34-R74-His之重組Fab 片段複合。兩種EphA2受體之構築體在EphA2受體與 hu2HllR34-R75之間提供相同複合物結構。
EphA2受體之細胞外區由4個結構域組成，且其顯示極 高可撓性：LBD(配位體結合域）、CRD(半胱胺酸富集 域），以及兩個纖維結合蛋白重複單元nFN3及cFN3。使用 單獨或組合之不同結構域作為分子替代計算之搜尋模型； 亦製造並使用Fab之可變域及恆定域模型以及Fc(pdb碼 1IGT)之模型以解析晶體結構。 測試各種結晶條件，並使用在ESRF下收集之2.1A資料 集解析複合物之結構。此使得能夠分析EphA2受體之細胞 150936.doc -133- 201116297 外域與hu2HllR34-R74之間的介面。 即使最初存在全長EphA2細胞外區（25-534)，但晶體僅 含有蛋白質之LBD及CRD結構域（殘基25-325或327，視晶 體而定，此處使用順序編號法）。 結果 抗原決定基定位 圖10 :說明針對hu2HllR34-R75之EphA2受體抗原決定 基之細胞外域定位（抗原決定基殘基定義為含有位於 hu2HllR34-R74 Fab片段之CDR殘基之任何原子4A以内之 原子的殘基）。 當結合至hu2HllR34-R74之Fab片段時，EphA2受體細胞 外域之抗原決定基為包括LBD域之殘基Gly49、Lys50、 Gly51、Asp53、Cys70、Asn71、Val72 ' Met73、Ser74、 Gly75 、 Gln77 、 Phel08 、 Prol09 、 GlyllO 、 Glylll 、 Serll3及Serll4的構形抗原決定基。 圖11:展示作為抗原決定基之一部分的EphA2受體細胞 外域之殘基（表示為深灰色）；呈淺灰色之殘基在晶體結構 中不可見。 圖12A:表示複合物之整體結構，且圖11B為在位置35 及位置74引入兩個突變之部分的放大圖。 hu2Hll之結合發生於表面離胺酸殘基上。此等殘基中有 兩個突變成精胺酸。此兩個殘基重鏈R74及輕鏈R35示於 圖12B中： R74位於鄰近介面處，背對向EphA2受體之細胞外域且 150936.doc -134- 201116297 距最近細胞外域約1 ο A。 R35為一個互補位殘基，且其與來自EphA2受體細胞外 域之Asp53形成Η鍵。離胺酸殘基將極可能與抗原進行相 同相互作用，且其結合顯然將對抗體結合有害。 互補位分析
EphA2受體細胞外域與hu2HllR35-R74之間的介面不涉 及所有CDR環。如自圖12可見，主要是重鏈CI)R涉及結 合。此現象表明可在hu2Hll之CDR中，尤其在輕鏈中（但 不排除其他情況）引入變化，而不會對結合至EphA2受體造 成不利影響。輕鏈之環L3完全不涉及介面，同時僅有—個 位於L1末端之殘基（Arg35)與EphA2之細胞外域相互作用。 此現象暗示環L3中之變化應不影響結合至EphA2，且環l 1 應耐受胺基酸殘基之突變/插入，只要該等殘基不會使 Arg35殘基之構形及定向變得不穩定即可。 針對EphA2受體之hu2Hll-R35-R74之互補位包括輕鏈之 以下殘基：環 L1 之 Arg35 ; L2之 Tyr54、Arg58及 Asp60。其 在重鏈中包括以下殘基：環H1之Thr30、Ala31、Tyr32及 Tyr33 ; H2 之 Asn52、Tyr54、Asn55 及 Phe57 ;及 H3 之 Glu99、PhelOO、TyrlOl、Glyl02、Tyrl03 及 Tyrl05。對輕 鏈及重鏈使用順序編號流程。 可能使用結構資料且例如藉由Clark等人（Protein Science (2006)，15:949-960)或 Lippow等人（Nature Biotech (2007)， 10:1171-76)所描述之方法改良hu2Hll-R35-R74抗體對 EphA2受體之親和力。 150936.doc -135- 201116297 環HI :可能產生其他相互作用，例如藉由Thr H28之慎 重突變（judicious mutation)與 Asp76相互作用。 輕鏈與Epha2受體之間的相互作用不涉及許多殘基。然 而，產生新的相互作用可能會需要在環L1或L3中進行大量 插入0 此等環與EphA2受體之間的相互作用經由相當大或長的 殘基發生：此環境中之任何變化均可能造成結合親和力損 失。 此X射線結構突出顯示可能經突變之CDR殘基’該等殘 基應不影響結合至EphA2。 在下文描述中，來自互補位之殘基不應經修飾’除非如 此規定以便保持結合至EphA2受體。亦應瞭解，CDR中之 突變不應影響來自互補位之殘基的構形及定向以便保持結 合至EphA2受體。殘基編號為順序編號，且不遵循Kabbat 慣例，如 Al-Lazikani((1997) J. Mol. Biol. 273，927-948)中 所使用。「X」表示「任何殘基」，而「-」指示不應在此位 置進行修飾。 在CDR L1(SEQ ID 4)中，除D33及R35以外，對序列無 限制，只要保留環之長度且其採用如J. Mol. Biol. (1992) 227: 799-817、J. Mol. Biol. (1992) 227: 776-798 及 Al-Lazikani等人（同上文所引用）中所述之典型結構l1-k4即 可。此意謂肽鍵之扭轉角在Al-Lazikani等人（同上文所引 用）之圖5中所定義之接受範圍内。
Arg3 5已進行突變以防止在此殘基上結合。然而Lys將與 150936.doc -136· 201116297
EphA2進行相同相互作用，且因此預期親本hu2Hl 1抗體將 與EphA2受體進行相同相互作用並接合EphA2受體之相同 抗原決定基。
Asp為位置3 3處之較佳殘基。
編號 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 初始序列 S Q S L I Η S D G R Τ Υ 建議突變 X X X X X X X D X R/K X X 在CDR L2(SEQ ID N 5)中，兩個Leu均可藉由保守取代 諸如lie置換。Val可由lie置換（較不適宜）。該環之第一個 Ser可由任何殘基置換，而第二個可由另一親水性/帶電殘 基置換。不應改變Tyr殘基（54)。
編號 54 55 56 57 58 59 60 61 初始序列 Υ L V S R L D S 建議突變 - L/I V/i X - L/I _ S/T/D/N/E/Q 在CDR L3(SEQ ID N 6)中，對序列及環長度均無限制， 只要其採用如Al-Lazikani等人（同上文所引用）中所定義之 典型結構L3-K1即可。
編號 94 95 96 97 98 99 100 101 102 初始序列 W Q G S Η F Ρ R Τ 建議突變 X X X X X X X X X 在 CDR H1(SEQ ID N 1)GYTFTAYY)周圍，環中第一個 Thr(Thr 28)為潛在親和力成熟位置。 編號 26 27 28 29 30 31 32 33 初始序列 G Υ Τ F Τ A Y Y 建議突變 - - 特定 - - - - - 150936.doc -137- 201116297 在CDR H2(SEQ ID N 2)中，Phe及Tyr可由任何芳族殘基 (F/Y/W)置換。
編號 52 53 54 55 56 57 初始序列 N P Y N G F 建議突變 - Y/F/W - - F/Y/W 關於CDR H3(EFYGYRYFDV)，不應對此環進行任何改 變。 編號 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 初始序列 E F Y G Y R Y F D V 建議突變
Ephrin結合位點 hu2Hl 1抗體展示以下功能活性：其抑制ephrin A1結合 及ephrin A1誘導之EphA2磷酸化。已公開EphA2受體之 LBD及CRD結構域與ephrinAl之複合物的結構（PDB碼 3MBW)。當此結構疊加在EphA2與hu2HllR3 5R74之Fab片 段之複合物結構上時，顯而易見2H11R35R74之Fab片段之 輕鍵與EphA2上之ephrin A1結合區域重疊，並因此證實 hUHll抗體具競爭性。 實例12 藉由人類化2H11R35R74-DM4結合物抑制表現EphA2之 腫瘤細胞生長 用胰蛋白酶處理處於指數生長期之MDA-MB23 1細胞， 並將其再懸浮於培養基（DMEM/F12，Gibco編號21331 ; 10% SVF，Gibco編號 10500-056 ; 2 nM麩醯胺酸，Gibco編 號）中。以5000細胞/孔之密度將細胞懸浮液分配在96孔 150936.doc •138- 201116297
Cytostar培養板（GE Healthcare Europe，編號 RPNQO163)中 之含血清完全培養基中。塗覆4小時後，將結合物之連續 稀釋液以在10_7至1〇_12 Μ範圍内之濃度一式三份添加至各 孔。細胞在抗體-細胞毒性化合物結合物存在下在37°C/50/〇 C〇2下培養3天。在第4天’向各孔中添加1〇 μΐ 14C胸芽溶 液（0.1 μ(：ί/孔，Perkin Elmer，編號NEC56825000)。在實 驗開始後96小時用MicroBeta放射性計數器（perkin Elmer) 里測14 C胸音之攝取。測§式孔讀數減去不含細胞之試劑空 白值’且將資料以存活分數繪圖，該等存活分數藉由經結 合物處理之細胞之讀數除以經媒劑處理之細胞之對照孔讀 數平均值而獲得。在一些實驗中，在開始實驗時將裸抗體 (2H11或2H11R35R74)以1 μΜ之濃度添加至各孔中，並根 據先前描述量測對增殖之抑制。 結果 報導於表IX中之結果表明，在抑制MDA_MB23丨細胞生 長方面，所有經測試之2HUR35R74 DM4結合物與 hu2HllR35R74-Peg4-AcNH-DM4同樣有效。 實例13 在SCID雌性小鼠中評估不同連接子對211111)肘4結合物 針對結腸腺癌Lovo之抗腫瘤活性的影響 材料及方法 為了評估結合物之抗腫瘤活性，每日對動物進行稱重且 每週藉由測徑規量測腫瘤2次。使用下式計算腫瘤重量： 質量（mgH長度卜)χ寬度（mm)2]/2。以最高無毒性劑量 150936.doc -139- 201116297 (HNTD)進行抗腫瘤活性評估。 產生20%最底點體重減輕（bwl)(組平均值）或者10%或 10%以上藥物死亡的劑量視為過度毒性劑量。動物體重包 括腫瘤重量。主要功效終點為ΔΤ/Δ(：、中度消退百分比、 部分及完全消退（PR及CR)及無腫瘤存活者（TFS)。 藉由自指定觀察日之腫瘤體積減去第一次治療當日（開 始曰）之腫瘤體積來計算各腫瘤之各治療組（Τ)及對照組（C) 之腫瘤體積變化。計算治療組之中值AT並計算對照組之中 值AC。接著，計算比率ΔΤ/Δ(：並表示為百分比： %AT/AC =中值（^一710/ X100 中值（CY-C0) 當ΔΤ/Δ(：低於40%時，劑量視為具有治療活性；且當 △ TMC低於10%時視為極具活性。若ΔΤ/Δ。低於0，貝丨J劑量 視為具有高活性並記錄該消退百分比之日期（參考1): 腫瘤消退％ :定義為相較於第一次治療第一天時之腫瘤 體積，在指定觀察日治療組中之腫瘤體積降低百分比。 計算特定時間點及各動物之消退百分比。接著計算該組 之中值消退百分比。 %消退（在ί時刻）=麟,0_體後X100 體積 部分消退（PR):若腫瘤體積降低至開始治療時腫瘤體積 的50%，則定義為部分消退。 完全消退（CR):當腫瘤體積=0 mm3時達成完全消退（當 無法記錄腫瘤體積時，視為CR)。 150936.doc -140· 201116297 TFS :無腫瘤定義為在研究結束時（末次治療後>100天） 動物不具有可偵測之腫瘤。 結果 關於經皮下植入雌性SCID中之結腸Lovo腫瘤比較600 pg DM4/kg之相同劑量來評估具有不同不可裂解連接子之抗 體藥物 2M1-DM4 結合物11112：»11-1135尺74-?£04-八。>^11-DM4 ' hu2Hll-R35R74-PEG8-AcNH-DM4 ' hu2Hl 1-R35R74-PEG4-AcNMe-DM4、hu2Hll-R35R74-PEG4-烯丙基-DM4 及hu2Hll-R35R74-乙醯基-DM4之抗腫瘤活性。對照組未 經處理。劑量表示為微克DM4/公斤。在第14天經由靜脈 内（IV)推注投與結合物。 如表X中所說明，使用單一投藥時程，所有5種結合物關 於Lovo腫瘤模型展示相同高活性（ΔΤ/Δ(：<0)且對體重減輕 之影響相同（對照組-13.3 %相對於治療組-9.5%至11.2%)。 hu2Hll-R35R74-PEG4-AcNH-DM4展現最佳效能，其腫瘤 消退為 82% 及 1CR ;相比之下 hu2Hll-R35R74-PEG4-AcNMe-DM4 、 hu2Hll-R35R74- 乙醯基 -DM4 、 hu2Hll-R35R74-PEG4-烯丙基-DM4 及 hi^Hll-R^im-PEGS-AcNH-DMA之腫 瘤消退 分別為 72% 、 69% 、 41%及 33% ， 無 CR。 150936.doc -141 - 201116297 表格 表I : hu2HllR35R74及其結合物結合至EphA2之Biacore分 析 結合至huEphA2-m! c(13 3RU)/Biacor( i動力學資料 huEphA2 抗趙 D/A Ka(K〇„) Kd(K〇ff) (s-丨） Ka(M·') Kd(M) STDEV 比率 hu2Hll 0 3.71E+06 1.10E-03 3.39E+09 2.98E-10 3.61E-11 1.0 hu2HllR35R74 0 5.25E+06 1.15E-03 4.59E+09 2.18E-10 1.13E-11 0.7 hu2HllR35R74- PEG4-NHAC-DM4 5.6 4.35E+06 1.15E-03 3.80E+09 2.63E-10 0.9 hu2HllR35R74- PEG4-NHAc-DM4 6.3 4.21E+06 1.19E-03 3.55E+09 2.82E-10 *** 0.9 hu2HHR35R74- PEG4-NHAc-DM4 7.4 4.47E+06 1.23E-03 3.64E+09 2.75E-10 0.9 hu2HHR35R74- PEG4-NHAC-DM4 8.4 4.15E+06 1.11E-03 3.76E+09 2.66E-10 0.9 hu2HllR35R74- PEG4-NHAc-DM4 9.3 3.08E+06 1.29E-03 2.38E+09 4.21E-10 1.4 hu2Hll-PEG4- NHAC-DM4 7.5 1.49E+06 2.42E-03 6.16E+08 1.62E-09 5.4 表II : hu2HllR35R74-PEG4-Mal-DM4 對 Lovo 細胞之細胞毒 性活性 結合物 DAR IC5〇(M) hu2Hll-PEG4-Mal-DM4 6.99 1.22 E-10 hu2Hl 1R35R74-PEG4-Mal-DM4 6.70 7.96 E-ll hu2Hl 1R35R74-PEG4-Mal-DM4 7.00 1.16 E-ll 150936.doc 142· 201116297 表III : hu2HllR35R74及其結合物對MDA MB231細胞及 SKMEL-28細胞之細胞毒性 2H11 ADC MDA-MB231 IC50(nM) 1^0八-1\^231+裸21111 IC50(nM) IC50 比率 SKMEL28 IC50(nM) hu2Hll-SPDB-DM4 DAR:3.93 1.1 8.1 7 8.4 hu2Hl 1R35R74-SPDB-DM4 DAR:3.97 1.2 11.5 9 13.1 hu2Hl lRJSRT^PEG^Mal-DIv/M DAR:6.1 0.1 25.1 228 51 hu2H 11 -PEG4-NHAc-DM4 DAR=5.3 0.2 27.4 114 26 hu2HllR35R74-PEG4- NHAc-DM4 DAR=5.5 0.06 80.8 1346 104.4 150936.doc -143 - 201116297 。^茛^蜒鉍肩踅牛书举埏蛛馋。碱蛉琳-^«荽濂》龚^贺^^^鍊8911》寸1^01-3<»>1 403αΗ4ΑΉιηεΉΙΙΗίΝη!ί^々Να-3ααΗ8-ΙΙΗ(Νπιι<«>&ο>ι/6ιοαΙ 0<N“ 七 I-<13铼^^衅-2:笺漆：>1< 150936.doc 靜脈内投藥 VdSS [L/kgl 0.068 0.069 0.095 0.080 G1 0.00027 0.00036 0.00043 0.00070 Tl/2 [hour] § 外推值 [%] 寸 in co (N r〇 0.29 AUC(O-inf) [ng.h/mL] 73,000,000 56,000,000 47,000,000 28,000,000 T持頑時M [小時] 672 672 672 672 AUC(0-672h) [ng.h/mL] 69,000,000 54,000,000 45,000,000 28,000,000 1 δ ! 530,000 600,000 〇 o o <N 〇 〇 m 偵測 總共 結合物 總共 結合物 化合物 (DAR) 4 S g 5 ° ^ S hu2Hll-SPDB-DM4 DAR=3.9 • 144· 201116297 403αΗ4ΑΉιηεΉΙΙΗ3ηΗ^#^^々ΙΑΙα-3νΉζ403<ί-ΙΙΗ<ΝηΗ^^-Β-^+±1'#αΙ3ϋο^:Λ^ 註釋 ._ 活性 活性 活性 不具 活性 生物統 計 pAa 第21天 0.011 0.0174 0.0008 m 第30 天之 無腫 瘤存 活者 VO Ο o v〇 o vo o 00 o 消退 _1 οί U Ο o 〇 o 00 o Pd Oh Ο o o VO o 00 o -B- Ο $ w g| S < ^ 00 (Ν Os m \D <N 1 ^ S -m /^~N JlQ 塒V塒 /—Ν ιη CN, 卜 — ^-Η 1 -18.2 (25) /—N cs 1 -15.8(25) /^~N 卜 1 藥物死 亡(死亡 之天數） Ο VO o VO 〇 VO o oo o ®w 桃,_、 ^ ^ E 茶响Q 过身DO Y总且 #旦 'w/ ο 10(0.4) G" V_^ 11 (0.4) 1 時程 (天） 1 途徑/每次 注射劑量 (mL/kg) IV 16 mL/kg IV 16 mL/kg 1 濰 寸 4 S 艺9 ^ ύ <； 2 5 a ^ yr\ 5 δ ^ g § < Λ Oh Q i i ^ Q ^ ^ , to Γ1 〇 11 K < oi 9 a < λ 2 Q 對照 -145 - 150936.doc 201116297 a?-l、))5^s^w^,f'titalusε-ud 墚诺 ί-κκ柘骤 Ύ 琛叙 i.evaIis:^婵荽Φ皱寸 ΙΑΙαύνΗΜ-寸 03d-寸 ΑΉςΓηΉΙ IffiCN口 q 寒敖：ΙΛ< 150936.doc 註釋 活性 不具活性 高活性 不具活性 高活性 極具活性 高活性 極具活性 高活性 高活性 高活性 極具活性 生物統 計 卩值3 X/1 0.0020 oo <0.0001 0.0013 <0.0001 0.0043 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0014 第34 天之 TFS 00 〇 00 〇 oo 00 o 00 o 00 Ο oo o 00 Ο 00 ο 00 ο οο ΟΟ ο 0/10 消退 CR 00 〇 00 〇 oo 00 o 00 o 00 00 o 00 Ο 00 ο 00 ο οο CN οο ο 0/10 g 00 〇 00 〇 oo 00 o oo ίο 00 in oo (N 00 ?3 00 νδ 00 οο 00 ?3 0/10 -Β- 咕 CS yr\ oo v〇^ o" o oo o' 艺 r-H ο G4 <0(35.5) (〇 ο" 00 ο ίΓ 碱 牛：Γ Μ JJJ /—N JHJ 6¾ s〇 塒^塒 /—N m rn -11.9(30) ^•S 寸 -4.5(25) /^s cn" -9.3(34) S—✓ <n -8.0(34) ιη -6.3(17) ν〇 -15.6(34) /^s Os r-^ t 藥物死亡 (死亡之 天數） 00 〇 00 Ο oo 00 o oo 00 o oo 00 Ο 00 ο 00 Ο οο ΟΟ 0/10 每次注射劑 量(mg/kg) (總劑量） 〇 m o o o m ο ο 時程 (天） \〇 \〇 \〇 途徑/每次注 射劑量 (mL/kg) IV 16mL/kg IV 16mL/kg IV 16mL/kg IV 16mL/kg IV 16 mL/kg IV 16 mL/kg 藥劑 (批次） 4 1 ^ 9 > 2 g " -^ ^ K 4 〇 g 〇 S 寸 O w*： K 4 q ϋ Λ w CL, .2 ? | ^ ώ 5 s5§ IS CLh _ 2 2 1 V S 5 ^ g o 另w a. _ 2 >η ο /1. 2 ί V -is ffi 4 ^ go Β ω CLh 4 2 g|| s 5 ^ IS Ρη 對照 •146- 201116297 ,f、tlfalus ε-ud 墚琏 f&feMI Ύ«?# 智寂袭伞贺寸 ΙΛΙαύνϋΝ-寸o3d-寸 sssulHgq^t: ιιιλ 150936.doc 註釋 毒性 HNTD 高 活性 高活性 高活性 高活性 活性 極具活性 1- 極具活性 1 D31 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 赛a D26 0.0002 <0.0001 1 <0.0001 第49 天之 TFS 1 iT) o VO o 〇 o 〇 o OO o 消退 _ CR 1 in CN 安 o VO o v〇 〇 o 00 o £ 1 in jn v〇 v〇 o 00 中值 ΔΤ/ΔΟ(°/〇) (天） 1 <0 (31) <0 (31) /·<—s rn, 〇 /—s o (〇 Os (〇 m ζ〇 o 贫亨柘 ^ -L〇 /-~S JL^ Β*Ρς ^ B*Pi 蝴s蚴 N VO 〇 (N -14.4 (24) cs m 〇 1 Os s： 卜 rn /**~N m CTs o 1 /*—N m ro oo (N /-~s m m cK /—N m Os (N 藥物死亡(死亡 之天數） 1/5(24) 〇 o VO 〇 V〇 o 〇 〇 VO o 00 o 每次注射劑 量(mg/kg) (總劑量） 160.0 120.0 80.0 40.0 20.0 10.0 o iri (N 1 時程 (天） 卜 卜 1 途徑/每次 注射劑量 (mL/kg) IV 25 mL/kg > ε 1 藥劑 (分批） 5 ύ < 〇s 2 i s 1 s s ^ 3 Oh 對照 •147· 201116297 犁肆驾-1》驾田二rnCNas ναΙΑΙ^#^雄寸 wa 寸 ^寸 ζ^ςεΉΙ1Η(ΝηΜ : XI< 202 On 00 VD gs ο. m U +裸 hu2HllR35R74 29731 24955 7820 36400 19514 單獨ADC 〇 寸 217 00 DAR On 〇\ 寸· 寸 <n VO 結合物 hu2H 11-R3 5R74-PEG4-AcNH-DM4 hu2Hl 1 -R35R74-PEG8-AcNH-DM4 hu2Hl 1-R35R74-PEG4-烯丙基-DM4 hu2H 11-R3 5R74-PEG4-AcNMe-DM4 hu2H 11-R3 5R74-乙醯基-DM4 •148 150936.doc 201116297 D^^^«^w^,f、tifQIuso>ol 墚琏樂驶黩弋踩？B 寂-ff 荽命贺寸 1ΛΙα42ςε^-ΙΙκΓΝ1ηΜ w 屮球？F 竣孩^K-fgJK-^^^^:x< 註釋 高活性 高活性 ifj活性 yfj活性 高活性 消退 Ρύ U VO 〇 o 〇 o 1 οί PL, CN v〇 v〇 cs VO *〇 1 第26天之 消退％ (中值） <N 00 m m (N 〇\ VO 1 务U sr o O 〇 o o 1 <ίϊ>减絲 Ϊ ¥ ^ i： ί 1 ϊ| -9.5 (23) _i -11.2 (32) -8.5 (23) -10.6 (23) -10.8 (25) m rn 1 藥物死亡(死 亡之天數） o o o o o 0/10 時程 (天） 寸 寸 寸 寸 寸 1 每次注射劑量 (pgDM4/kg) 600 , _i 600 600 600 600 1 每次注射劑量 (mL/kg) 16 ml/kg 16 ml/kg 16 ml/kg 16 ml/kg 16 ml/kg 1 m m 1 寸 pd, 9 ^ < K t cn 〇 3 w Λ cu 1 寸 oi 9 ίΤ) ΗηΗ m S —<ί x 2 |S Λ CLh ? ώ ^ 1 2 1 i =：4 Q S S ^ 4 lit* m f 寸 ¥装s ^40 K 〇 ^ S 45 g ^ m ϋ 兰i ffi ^ CN tO Λ 對照 150936.doc •149- 201116297 【圖式簡單說明】 圖 1 : mu2HllR35R74 之 CDR、VH 及 VL 序列，及 hu2HllR35R74 之 VH及 VL序列； 圖 2 :使用方法 c 獲得之 hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4之 HRMS譜（實例 la.l); 圖3 :使用方法C獲得之 hu2HllR35R74-PEG4-Mal-DM4 之HRMS譜（實例lb.1); 圖4 : MDA-MB-231細胞中之EphA2磷酸化之動力學分 析。WT :野生型未經處理之細胞；MW :分子量標記物； P-EphA2 :經填酸化之Epha2 ; 圖5A及圓5B :藉由EphrinAl/Fc分別對NCI-H1299細胞 (5A)及MDA-MB-231細胞（5B)進行誘導後對EphA2磷酸化 之抑制；WT :野生型未經處理之細胞；MW :分子量標記 物；P-EphA2 :經磷酸化之EphA2 ; 圖 6 : hu2HllR35R74-PEG4-Mal-DM4 相較於 hu2Hll-PEG4-Mal-DM4之細胞毒性活性（小實心圓圈：DAR=6_7 ; 大實心圓圈：DAR=7.0); 圖7 :向雄性CD-I小鼠單劑量靜脈内投與20 mg/kg含免 疫結合物之HGS後，hu2Hll-SPDB-DM4之平均血漿濃度之 時間曲線表示圖（半對數尺度）(n=2)。展示人類IgG(實心菱 形）及結合物部分（空心方形）之總濃度； 圖8:向雄性CD-1小鼠單劑量靜脈内投與20 mg/kg含免 疫結合物之HGS後，hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4之平 均血漿濃度之時間曲線表示圖（半對數尺度）(n=2)。展示人 150936.doc -150· 201116297 類IgG(實心菱形）及結合物部分（空心方形）之總濃度；
圖9A及圖9B :向雄性CD-1小鼠單劑量靜脈内投與20 mg/kg 含免疫結合物之 HGS 後，hu2HllR35R74-PEG4-NHAc-DM4在不同DAR下之PK參數，數種ADC暴露（AUC • (0-無窮大）；圖9A)及清除率（C1 ;圖9B)以DAR為函數之條 • 形表示圖（n=4); 圖10 ·•說明針對Fab2Hll之EphA2抗原決定基定位； 圖11 :為EphA2之序列，其中呈深灰色之殘基為抗原決 定基之一部分；呈淺灰色之殘基在晶體結構中不可見； 圖12A :表示複合物之整體結構，且圖12B為具有兩個 Fab突變之部分的放大圖； 圖13 :表示互補位之結構； 圖 14 : hu2HllR35R74-PEG4-NMeAc-DM4之HRMS譜； 圖 15 : hu2HllR35R74-PEG8-NHAc-DM4 之 HRMS 譜； 圖 16: hu2HllR35R74-PEG4-烯丙基-DM4之HRMS譜；及 圖 17 : hu2Hll-PEG4-NHAc-DM4之 HRMS譜。 150936.doc • 151 · 201116297 序列表 <110> 法商赛諾菲-安萬特公司 <120> 專一性結合至EPHA2受體之抗體
<130> FR2009-082 PCT <140> 099133107 <141> 2010-09-29 <150> 09305938.4 <151> 2009-10-02 <160> 19 <170> Patentin version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> 智人 <400> 1
Ala Tyr Tyr Met His <210> 2 <211> 17 <212> PRT <21B> 小家鼠 <400> 2
Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Gin 15 10 15
Gly <210> B <211> 10 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 3
Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val 15 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 4
Lys Ser Ser Gin Ser Leu lie His
Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 5 150936-序列表.doc <400> 7 gag gtc cag Glu Val Gin 201116297
Leu val ser Arg Leu Asp Ser <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 6
Trp Gin Gly ser His Phe Pro Arg Thr <210> 7 <211> 357 <212> DNA <$13>小家鼠 <220> <221> CDS <222> (1)..C357) ctg caa cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct gag get Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu VaT Lys Pro Gly Ala 5 10 15 tea gtg aag att tcc tgc aag get tct ggt tac tea ttc act gcc tac ser val Lys lie ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr ser Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 tac atg cac tgg gtg aag caa agt cat gta aag agt ett gag tgg att Tyr Met His Trp val Lys Gin ser His val Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45 gga ett gtt aat cct tac aat ggt ttt agt age tac aac cag aat Gly Leu val Asn pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gin Asn 50 55 60 gag Glu gac Asp aag Lys g?c Ala age ser ttg Leu act Thr gta val gat Asp aga Arg ttc phe tcc Ser age ser acc Thr 65 70 75 atg Met gaa Glu etc Leu cac His age ctg ser Leu aca Thr tct Ser gag Glu gac Asp tct ser gca gtc Ala val tat tac Tyr Tyr 85 90 95 gca Ala aga Arg gaa Glu ttc Phe tac Tyr ggc Gly tac Tyr egg Arg tac Tyr ttc Phe gat Asp fai tgg Trp ggc Gly gca Ala 100 105 110 acc Thr geg Ala fa? acc Thr gtc val tcc Ser tea Ser tac
Tyr 80 115 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 8
Glu val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 150936-序列表.doc 48 96 144 192 240 288 3B6 357 201116297
Ser val Lys lie ser Cys Lys Ala Se「 Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tvr 20 25 30 y
Tyr Met His Trp Val Lys Gin ser His val Lys ser Leu Glu Trp lie
35 40 45 M
Gly Leu val Asn pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gin Asn phe 50 55 60 61u Asp Lys Ala ser Leu Thr val Asp Arg Phe ser ser Thr Ala Tvr 65 70 75 80
Met Glu Leu His Ser 85
Leu Thr ser Glu Asp ser Ala Val Tyr 90 IV cys
Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp val Trp Gly Ala Glv 100 105 110 1
Thr Ala val Thr val ser ser 115 <210> 9 <211> 339 <212> ONA <213>小家鼠 <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 9 gat Asp gti val gtg val atg Met acc Thr cag Gin act Thr cca Pro etc Leu act Thr ttg Leu teg ser acc Thr att lie gga Gly 48 1 5 10 15 caa cca gcc tcc ate tet tgc aag tea agt cag age etc ata cat agt 96 Gin Pro Ala ser lie Ser Cys Lys Ser ser Gin ser Leu lie His ser 20 25 30 gat Asp gaa aga Gly Arg aca Thr tat Tyr ttg Leu aat Asn tgg Trp ttg Leu tta Leu cag Gin agg Arg cca Pro ggc Gly cag Gin tet Ser 144 35 40 45 cca aag ege eta att tat ctg gtg tet aga ctg gac tet gga gtc cct 192 Pro Lys Arg Leu lie Tyr Leu vai ser Arg Leu Asp ser Gly val Pro 50 55 60 gac Asp agg Arg ttc Phe act Thr ggc Gly agt Ser gga Gly tea ser ggg Gly aca Thr gat Asp ttc Phe aca Thr ctg Leu aaa Lys ate lie 240 65 70 75 80 age Ser aga Arg fa? gag Glu 起 gag Glu gat Asp ttg Leu gga Gly 搿 tat Tyr tat Tyr tgc Cys tgg Trp caa Gin ggt Gly 288 85 90 95 tea Ser cat His ttt Phe cct Pro egg Arg aeg Thr ttc Phe ggc Gly acc Thr aag Lys ctg Leu gaa Glu ate lie aaa Lys 336 100 105 110 150936-序列表.doc 201116297 egg 339
Arg <210> 10 <211> 113 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 10
Asp val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr lie Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser lie ser Cys Lys Ser Ser Gin ser Leu lie His Ser 20 25 30
Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Lys Arg Leu lie Tyr Leu Val ser Arg Leu Asp Ser Gly val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly 85 90 95
Ser His Phe Pro A「g Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg <210> 11 <211> 357 <212> DNA <213> 智人 <220> <221> CDS <222> (1)..(B57) <400> 11 cag Gin caa Gin ctg Leu gtg val caa Gin tcc Ser SS falc aaa Lys ccc Pro gga Gly gca Ala 48 1 5 10 15 tet Ser gtg vaT aag Lys ata lie tcc Ser tgt cys aag Lys tcc ser ggc tac Gly Tyr act Thr ttt Phe aca Thr tac Tyr 96 20 25 30 tat Tyr atg Met cat His aaa Lys cag Gin agt Ser ccc pro gtg cag Val Gin tcc Ser ctg Leu gaa Glu tgg Trp ate lie 144 35 40 45 150936-序列表.doc -4 80 6297 ggc ttg gtg aac cct tat aac gga ttc tea agt tac aat caa Gly Leu val Asn Pro Tyr Asn GTy Phe Ser ser Tyr Asn Gin 50 55 60 cag Gin ggc Gly aag Lys ?fa tcc Ser ctg Leu act Thr gac Asp aga Arg tet Ser agt Ser tcc Ser aca Thr 65 70 75 atg Met gag Glu etc Leu cat His tea ser ctg Leu aca Thr tea ser gaa Glu gac Asp age Ser gta val tac Tyr 85 90 95 t 9 9Γ c A a a cl 9a
c a cl 9A a r ch aT a,s, 9A t e th t p c Γ5 taTylo a 9 9Γ a A t r t Γ ay c e t T t s c y c Γ oi 9 e 9g a s c Γ ατ ay t a t T 9V c eo a Γ tho ch t PI a T 9U C15 al t al 9G 9V1 c y 91 9G an a<r-CG c yo Q<r 1 9G1 9P 9r t T cl t a <210> 12 <211> 119 <212> PRT <213> 智人 <400> 12
Gin Val Gin Leu Val Gin ser Gly Ala Glu val val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gin Ser Pro Val Gin ser Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Leu val Asn Pro Tyr Asn Gly phe ser Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Lys Ala Ser Leu Thr val Asp A「g Ser ser Ser Thr Ala Tvr 65 70 75 80
Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr cys 85 90 95
Ala Arg GluTyr Gly Tyr Arg Phe Asp val Trp Gly Gin Gly 105 110
Thr Ala Val Thr val ser ser 115 <210> 13 <211> 336 <212> DNA <213> 智人 <220>
<221> CDS 150936-序列表.doc 48 201116297 <222> ⑴..（336) <400> 13 gac gtc gtg atg aca caa acc cct ctg tcc ctg age gtc act ctg gga
Asp val vaT Met Thr Gin Thr Pro Leu ser Leu ser val Thr Leu Gly 15 10 15 caa ccc get tcc att age tgc aaa tea tea caa tet etc ate cac tea
Gin Pro Ala Ser lie Ser cys Lys Ser ser Gin Ser Leu lie His ser 20 25 30 gac ggc cgt aeg tac etc aat tgg ctg ctg cag aga cca gga cag tcc
Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45 cct aaa agg ett ate tac ctg gtc tet cgt ttg gac tet ggt gta cca
Pro Lys Arg Leu He Tyr Leu val ser Arg Leu Asp ser Gly val pro 50 55 60 gac egg ttt act ggt tcc gqg gee gga acc gat ttc act ctg aag att
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 tcc agg gtg gaa get gaa gat etc gga gtg tat tat tgc tgg cag ggc
Ser Arg val Glu Ala Glu Asp Leu Gly val Tyr Tyr cys Trp Gin Gly 85 90 95 age cat ttc ccc cgt act ttt ggt ggg ggt acc aaa ttg gaa att aag ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> 智人 <400> 14 Asp val val Met 96 144 192 240 288 336
Thr Gin Thr Pro Leu ser Leu ser val Thr Leu Gly 5 10 15
Gin Pro Ala Ser lie ser cys Lys ser Ser Gin ser Leu lie His ser 20 25 30
Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Lys Arg Leu lie Tyr Leu val ser Arg Leu Asp ser Gly val pro 50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie
Ser Arg val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr cys Trp Gin Gly 85 90 95 ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 no ^ <210> 15 150936-序列表.doc 48201116297 <211> 717 <212> DNA <213> 智人 <220> <221> CDS <222> Cl)..(717) <400> 15 atg gga tgg tct tgc ate ate ctg ttt etc gtg get act gee acc gga Met Gly Trp ser cys lie lie Leu Phe Leu val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15 gtg cac agt gac gtc gtg atg aca caa acc cct ctg tee ctg age gtc Val His Ser Asp val val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val 20 25 30 act ctg gqa caa ccc get tee att age tgc aaa tea tea caa tct etc Thr Leu Gly Gin Pro Ala ser lie ser cys Lys ser ser Gin ser Leu 35 40 45 ate cac tea gac ggc cgt aeg tac etc aat tgg ctg ctg cag aga cca lie His ser Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro 50 55 60 cag Gin 65
tee cct aaa agg ett ate tac ctg gtc tct cgt ttg gac tct ser Pro Lys Arg Leu He Tyr Leu val ser Arg Leu Asp ser 70 75 80 ggt gta cca gac egg ttt act ggt tee ggg gee gga acc gat ttc act Gly val pro Asp Arg Phe Thr Gly ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctg aag att tee agg gtg gaa get Leu Lys lie ser Arg VaT Glu Ala 100 gaa gat Glu Asp 105 etc gga gtg tat tat tgc Leu Gly Val T^r Tyr Cys tgg cag ggc age cat ttc ccc cgt act ttt gat gag ggt acc aaa ttg Trp Gin Gly Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 gaa att aag cgt aeg gtg get gca cca tct gtc ttc ate ttc ccg cca Glu lie Lys Arg Thr val Ala Ala Pro ser val Phe lie Phe Pro Pro 130 135 140 tct gat gag cag ttg aaa tct gqa act gee tct gtt gtg tgc ctg ctg Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser val val cys Leu Leu 145 150 155 160 aat aac ttc tat ccc aga gag gee aaa gta cag tgg aag gtg gat aac Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin ττρ Lys VaT Asp Asn 165 170 175 gee etc caa teg ggt aac tee cag gag agt gtc aca gag cag gac age Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser val Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190 aag gac age acc tac age etc age age acc ctg aeg ctg age aaa gca Lys Asp ser Thr Tyr Ser Leu Ser ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gee tgc gaa gtc acc cat cag ggc Asp Tyr Glu Lys His Lys val Tyr Ala Cys Glu val Thr His Gin Gly 210 215 220 ctg age teg ccc gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tgt tag Leu ser Ser Pro val Thr Lys ser Phe Asn Arg Gly Glu cys 96 144 192 240 288 336 384 432 480 528 576 624 672 150936-序列表.doc 717 201116297 225 230 235 <210> 16 <211> 238 <212> PRT <213>►智人 <400> 16
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15 val His Ser Asp Val val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu ser val 20 25 30
Thr Leu Gly Gin pro Ala Ser lie ser cys Lys Ser ser Gin ser Leu 35 40 45 lie His Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro 50 55 60
Gly Gin Ser Pro Lys Arg Leu lie Tyr Leu val ser Arg Leu Asp ser 65 70 75 80
Gly val Pro Asp Arg Phe Thr Gly ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95
Leu Lys lie ser Arg val Glu Ala Glu Asp Leu Gly val Tyr Tyr Cys 100 105 110
Trp Gin Gly Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125
Glu lie Lys Arg Thr val Ala Ala Pro ser val Phe lie Phe Pro pro 130 135 140
Ser Asp Glu Gin Leu Lys ser Gly Thr Ala ser val val cys Leu Leu 145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys val Asp Asn 165 170 175
Ala Leu Gin ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser val Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala cys Glu Val Thr His Gin Gly 210 215 220
Leu ser Ser Pro Val Thr Lys ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 150936·序列表.doc 201116297 <21〇> 17 <211> 1404 <212> DNA <213> 智人 <220> <221> CDS <222> (1)·(1404) <400> 17 atg Met 1 gga tgg Gly Trp tee ser tgt cys 5 att lie att lie ctg Leu ttt Phe etc Leu 10 aca Thr aca Thr 15 ggc Gly 48 cat His agt ser cag gtg Gin VaT 20 caa Gin ctg Leu gtg vaT caa Gin 25 tee Ser ggt Gly gee gag gtc gtc Ala Glu Val Val 30 aaa Lys 96 ccc Pro gga Gly gca Ala 35 tet Ser aag Lys ata lie tee tgt ser cys 40 aag Lys 扣 tee ser ggc tac act Gly Tyr Thr 45 ttt Phe 144 aca Thr ?iCa 50 tac tat Tyr Tyr atg Met cat tgg His Trp 55 aaa Lys cag Gin agt ser ccc pro 60 gtg cag vaT Gin tee ser ctg Leu 192 gaa tgg Glu Trp 65 ate lie ggc Gly ttg Leu 70 aac Asn cct tat Pro Tyr aac Asn gga Gly 75 ttc Phe tea Ser agt tac Ser Tyr aat Asn 80 240 caa Gin aag Lys ttt Phe cag Gin ggc Gly 85 aag Lys tee ser ctg Leu act Thr 90 fa? gac aga Asp Arg tet ser agt Ser 95 tee ser 288 aca Thr tac Tyr atg Met 100 gag Glu etc Leu cat tea His ser ctg Leu 105 aca Thr tea Ser gaa Glu gac ASp age ser 110 gee gta Ala val 336 tac tat Tyr Tyr tgc cys 115 gca cgt Ala Arg gag Glu ttc tac Phe Tyr 120 ggc Gly tat aga tac Tyr Arg Tyr ttt gac Phe Asp 125 tgg Trp 384 ggc Gly caa Gin 130 ggc Gly aca Thr 2¾ val aca gtg Thr vaT 135 age Ser tet Ser get Ala tee Ser 140 act Thr aag Lys ggc Gly cca Pro 432 teg Ser 145 ttc Phe ccc Pro Ctg Leu gca Ala 150 CCC Pro tee ser tee Ser aag Lys age acc ser Thr 155 tet Ser aca Thr 160 480 1¾ ^ ctg Leu ggc tgc Gly cys 165 ctg Leu aag gac tac Lys Asp Tyr 170 ttc Phe ccc Pro gaa Glu ccg Pro 175 aeg Thr 528 gtg val teg Ser tgg aac Trp Asn 180 tea Ser ggc Gly ctg acc Leu Thr 185 age Ser ggc gtg Gly val cac His acc Thr 190 ttc Phe ccg Pro 576 get Ala eta Leu 195 cag Gin tee Ser tea ser gga Gly etc Leu 200 tac Tyr tee Ser etc Leu age ser age Ser 205 ^ fa? acc Thr 624 gtg val CCC pro 210 tee Ser age Ser age Ser ttg Leu ggc Gly 215 acc Thr cag Gin acc tac Thr Tyr ate lie 220 tgc Cys aac Asn gtg val aat Asn 672 -9- 150936-序列表.doc 720201116297 cac His 225 aag Lys ccc pro age Ser aac Asn acc Thr 230 aag Lys 3¾ gac Asp aag Lys aaa 留 gag Glu ccc Pro aaa Lys tet Ser 240 tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa etc ctg Cys Asp Lys Thr His Thr cys pro Pro cys pro Ala pro Glu Leu Leu 245 250 255 ccg Pro tea Ser 猎 ttc Phe etc Leu ttc Phe ccc pro cca Pro aaa Lys ccc Pro aag Lys gac Asp acc Thr etc Leu 260 265 270 atg Met ate lie tee Ser egg Arg acc Thr cct pro gag Glu aca Thr tgc Cys gac Asp gtg Val age Ser 275 280 285 cac His gaa Glu gac Asp cct pro gag Glu gtc val aag Lys ttc Phe aac Asn tgg Trp tac Tyr gtg vaT gac Asp ggc Gly gtg VaT gag Glu 290 295 300 fa? cat His aat Asn aag Lys aca Thr aag Lys ccg Pro egg Arg gag Glu gag Glu cag Gin tac Tyr aac Asn age ser aeg Thr 305 310 315 320 tac Tyr cgt Arg age Ser 325 etc Leu acc Thr ctg Leu 330 cac His cag Gin gac Asp tgg Trp ctg Leu 3B5 aat Asn ggc Gly aag Lys gag Glu tac Tyr 340 aag Lys tgc Cys aag gtc Lys val tee ser 345 aac Asn aaa Lys etc Leu cca pro 350 gee Ala ccc Pro ate lie gag GlU aaa Lys acc Thr ate lie tee Ser aaa Lys aaa Lys ggg Gly cag Gin ccc Pro ega Arg gaa Glu cca Pro cag Gin 355 360 365 tac Tyr acc Thr ctg Leu ccc Pro cca Pro tee ser egg Arg gat Asp gag Glu ctg Leu acc Thr aag Lys aac Asn cag Gin fa? 370 375 380 age ser ctg Leu acc Thr tgc cys ctg Leu aaa Lys ggc Gly ttc Phe tat Tyr ccc Pro age ser gac Asp ate lie gee gtg Ala val 385 390 395 400 gag Glu tgg Trp gag Glu age Ser aat Asn ggg Gly cag Gin ccg Pro gag Glu aac Asn aac Asn tac Tyr aag Lys acc Thr aeg Thr cct Pro 405 410 415 ccc gtg ctg gac tee gac ggc tee ttc ttc etc tac age aag etc acc pro vaT Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 gac Asp aag Lys age ser agg Arg tgg Trp cag Gin cag Gin ggg Gly aac Asn gtc val ttc Phe tea Ser tgc cys tee ser 435 440 445 atg cat gag get Met His Glu Ala 450 ctg cac aac cac tac aeg cag Leu His Asn His Tyr Thr Gin 455 aag age etc tee ctg Lys ser Leu ser Leu 460 768 816 864 912 960 1008 1056 1104 1152 1200 1248 1296 1344 1392 tet ccg ggt tga Ser Pro Gly 465 <210> 18 <211> 467 150936·序列表.doc -10- 1404 201116297 <212> PRT <213> 智人 <400> 18
Met Gly Trp ser Cys lie lie Leu Phe Leu val Ala Th「 Ala Thr Gly 15 10 15
Val His Ser Gin Val Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Glu Val Val Lys 20 25 B〇
Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45
Thr Ala Tyr Tyr Met His Trp val Lys Gin Ser Pro Val Gin ser Leu 50 55 60
Glu Trp lie Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser ser Tyr Asn 65 70 75 80
Gin Lys Phe Gin Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg ser ser Ser 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser GTu Asp ser Ala val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp val Trp 115 120 125
Gly Gin Gly Thr Ala val Thr val Ser ser Ala ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 ser val Phe Pro Leu Ala Pro ser Ser Lys ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly cys Leu val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr 165 170 175
Val ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly val His Thr Phe Pro 180 185 190
Ala Val Leu Gin ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu ser Ser val Val Thr 195 200 205 val pro ser ser ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn val Asn 210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys Lys val Glu Pro Lys ser 225 2B0 235 240
Cys Asd Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255 -11 - 150936-序列表.doc 201116297
Gly Gly Pro ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270
Met lie Ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys Val val val asd val ser 275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr val asd Gly Val Glu 290 295 300 val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320
Tyr Arg val val ser val Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 325 B30 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro B40 345 350 lie Glu Lys Thr lie ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 355 360 365 val Tyr Thr Leu pro pro ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin val 370 375 B80
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala val 385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415
Pro val Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 val Asp Lys ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe Ser cys ser val 435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys ser Leu ser Leu 450 455 460
Ser Pro Gly 465 <210> 19 <211> 510 <212> PRT <213>智人 <400> 19
Gin Gly Lys Glu Val val Leu Leu Asp Phe Ala Ala Ala Gly Gly Glu 15 10 15 -12- 150936-序列表.doc 201116297
Leu Gly Trp gu Thr His pro Tyr Lys Gly Trp Asp Met Gln
Asn lie Asn Asp Met Pro Tyr Met Tyr ser Val cys Asn Val 35 40 45
Met Sg「 Gly Asp Gin Asp A|n Trp Leu A「g Thr Asn Trp val Tyr A「g 50 55 60
Gly Glu Ala Glu Arg lie Phe lie Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg Asp 65 70 75 80
Cys Asn ser Phe Pro Gly Gly Ala ser ser cys Lys Glu Thr Phe Asn 85 90 95
Leu Tyr Tyr Ala Glu ser Asp Leu Asp Tyr Gly Thr Asn Phe Gin Lys 100 105 no
Arg Leu Phe Thr Lys lie Asp Thr He Ala Pro Asp Glu He Thr val 115 120 125 ser ser Asp Phe Glu Ala Arg His val Lys Leu Asn val Glu Glu Arg 130 135 140
Ser val Gly Pro Leu Thr Arg Lys Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gin Asp 145 150 155 160 lie Gly Ala Cys val Ala Leu Leu ser val Arg val Tyr Tyr Lys Lys 165 170 175
Cys Pro Glu Leu Leu Gin Gly Leu Ala His Phe Pro Glu Thr lie Ala 180 185 190
Gly Ser Asp Ala Pro ser Leu Ala Thr val Ala Gly Thr cys val asd 195 200 205
His Ala val val Pro Pro Gly Gly Glu Glu Pro Arg Met His cys Ala 210 215
Val Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro lie Gly Gin Cys Leu Cys Gin Ala 225 230 2B5 240
Gly Tyr Glu Lys val Glu Asp Ala cys Gin Ala cys ser Pro Gly Phe 245 250 255
Phe Lys Phe Glu Ala ser Glu Ser Pro Cys Leu Glu cys Pro Glu His 260 265 270
Thr Leu Pro Ser Pro Glu Gly Ala Thr Ser cys Glu cys Glu Glu Gly 275 280 285 150936-序列表.doc -13- 201116297
Phe Phe Arg Ala Pro Gin Asp Pro Ala ser Met Pro cys Thr Arg Pro 290 295 300
Pro ser Ala Pro His Tyr Leu Thr Ala Val Gly Met cly Ala Lys val
Glu Leu Arg Trp Thr pro pro Gin Asp ser Gly Gly Arg Glu Asp lie 325 330 335 val Tyr ser val Thr cys Glu Gin Cys Trp Pro Glu ser Gly Glu Cys 340 B45 350
Gly Pro cys Glu Ala Ser val Arg Tyr ser Glu Pro Pro His Gly Leu 355 360 365
Thr Arg Thr ser val Thr val ser Asp Leu Glu Pro His Met Asn Tyr 370 375 380
Thr Phe Thr val Glu Ala Arg Asn Gly val ser Gly Leu val Thr ser 385 390 395 400
Arg ser Phe Arg Thr Ala ser val ser He Asn Gin Thr Glu Pro Pro 405 410 415
Lys Val Arg Leu Glu Gly Arg Ser Thr Thr ser Leu Ser Val Ser Trp 420 425 430
Ser lie Pro Pro Pro Gin Gin ser Arg val Trp Lys Tyr Glu val Thr 435 440 445
Tyr Arg Lys Lys Gly Asp Ser Asn ser Tyr Asn val Arg Arg Thr Glu 450 455 460
Gly phe Ser val Thr Leu Asp Asp Leu Ala Pro Asp Thr Thr Tyr Leu 465 470 475 480
Val Gin val Gin Ala Leu Thr Gin Glu Gly Gin Gly Ala Gly ser Lys 485 490 495
Val His Glu Phe Gin Thr Leu Ser Pro Glu Gly Ser Gly Asn 500 505 510 -14- 150936-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201116297 七、申請專利範圍： 1 · 一種抗體或其抗原決定基結合片段，其專一性結合至 EphA2受體並包含至少一個重鏈及至少一個輕鏈，其中 该重鏈包含3個具有SEQ ID NO: 1、2及3表示之胺基酸序 列的連續互補決定區，及其中該輕鍵包含3個具有SEq ID NO: 4、5及6表示之胺基酸序列的連續互補決定區。 2. 如請求項1之抗體或其抗原決定基結合片段其中該單 株抗體或其抗原決定基結合片段為經人類化或表面重塑 之抗體或其抗原決定基結合片段。 3. 如請求項1之抗體或其抗原決定基結合片段，其中該重 鏈包含由SEQHDNO: 12組成之胺基酸序列及其中該輕鏈 包含由SEQ ID NO: 14組成之胺基酸序列。 4. 如請求項1之抗體或其抗原決定基結合片$， 又’具中該重 鏈係由胺基酸序列SEQ ID NO: 18組成，及A 士 入丹千該輕鏈係 由胺基酸序列SEQ ID NO: 16組成。 5. —種如請求項1至4之抗體或抗原決定基結八 ° σ月段的結合 物（conjugate) ’其中該結合物包含選自以 卜之細胞毒性 劑： a)式（XIII)之類美登醇（maytansinoid): 150936.doc 201116297
    (XIII); b)式（XIV)之類美登醇：
    Η 150936.doc 201116297 c)式（XXIV)之類美登醇：
    (XXV); 150936.doc 201116297 e)式（XXVI)之類美登醇：
    (XXVI)； f)式（XXVII)之類美登醇：
    6.如請求項5之結合物，其中該細胞毒性劑係共價結合至 該抗體^ 7. 如請求項5或6中任一項之結合物，其中該細胞毒性劑為 該式（XIII)之類美登醇。 8. 一種製備結合物之方法，其包含以下步驟： 150936.doc 201116297 (i) 使視情況經緩衝之細胞結合劑水溶液與細胞毒性化 合物溶液接觸； (ii) 接著視情況分離⑴中所形成之結合物與未反應之 試劑及該溶液中可能存在之任何聚集物； 其中該細胞結合劑為如請求項1至4之抗體，及細胞毒 性劑選自以下： 式（XVII)之化合物：
    (XVII)， 其中Y為:N-丁二醯亞胺基氧基、N_績基丁二醯亞胺基 氧基、N-鄰本一曱醯亞胺基氧基、罐基鄰苯二曱醯亞 胺基氧基、2-硝基苯基氧基、4·硝基苯基氧基、2,4-二硝 基苯基氧基、3-磺醯基-4-硝基笨基氧基、3_羧基_4_硝基 苯基氧基 ' 味。坐基或鹵素原子；及 式（XVIII)之化合物： 150936.doc 201116297
    (XVIII)， 其中Y為N-丁二醯亞胺基氧基、N-磺基丁二醯亞胺基 氧基、N-鄰苯二甲醯亞胺基氧基、N-磺基鄰苯二曱醯亞 胺基氧基、2_硝基苯基氧基、4-硝基苯基氧基、2,4-二硝 基苯基氧基、3-磺醯基-4-硝基苯基氧基、3_羧基_4_硝基 苯基氧基、咪唑基或齒素原子。 9. 10. 如請求項8之方法獲得。 一種結合物，其可由 如請求項9之結合物 式（xv)之結構： ，該結合物具有選自以下之結構
    150936.doc 201116297 及式（XVI)之結構：
    數。 11. 12. 13. 14. 15. 16. 如請求項10之抗體-藥物結合物，其中n包含4至7之間。 如吻求項11之抗體-藥物結合物，其具有式（XV)之結構。 -種醫藥組合物，其含有如請求項…中任一項之抗體 或其抗原決定基結合片段或如請求項6、7及8中任一項 之結合物，及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原決定基結合片 段，或如請求項5、6及7中任一項之結合物，其係用作 藥物。 -種如請求項!至4中任一項之抗體或其抗原決定基結合 片段或如請求項5、6及7中任—項之結合物的用途其 係用於製造治療癌症之藥物。 痒^項15之用途，其中該癌症係選自癌瘤，包括膀胱 癌2癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、#巢癌、姨腺 ；月癌、子宮頸癌、甲狀腺癌及皮膚癌；包括鱗狀細 150936.doc 201116297 胞癌；淋巴系造血腫瘤’包括白血病、急性淋巴球性白 血病、急性淋巴母細胞白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋 巴瘤、伯基特氏淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma);骨髓系造 血腫瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病及前髓細胞白血 病；源於間葉之腫瘤’包括纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤；其 他腫瘤，包括黑素瘤、精原細胞瘤、畸胎癌、神經母細 胞瘤及神經膠質瘤；中樞及周邊神經系統腫瘤，包括星 形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及神經鞘瘤；源 於間葉之腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤； 及其他腫瘤’包括黑素瘤、著色性乾皮病、角化棘皮 瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌及畸胎癌。 17. 如請求項1至4之抗體或其抗原決定基結合片段，其中該 單株抗體或其抗原決定基結合片段之互補位（parat〇pe)在 輕鏈中包含：環L1之Arg35 ; L2之Tyr54、Arg58及 Asp60 ° 18. 如請求項1至4之抗體或其抗原決定基結合片段，其中該 單株抗體或其抗原決定基結合片段之互補位在重鏈中包 含：環 H1 之 Thr30、Ala31、Tyr32 及 Tyr33 ; H2 之 Asn52、Tyr54、Asn55 及 Phe57 ;及 H3 之 Glu99、 PhelOO、TyrlOl、Glyl02、Tyrl03及 Tyrl05。 19. 如請求項1至4之抗體或其抗原決定基結合片段，其中該 單株抗體或其抗原決定基結合片段包含突變在位置Thr H28。 20. 如請求項1至4之抗體或其抗原決定基結合片段，其中該 150936.doc 201116297 單株抗體或其抗原決定基結合片段包含突變在輕鍵之以 下數個位置之一 .35、26至31、34至37、55 ' 56、57、 59及 94至 102。 21. 如請求項1至4之抗體或其抗原決定基結合片段，其中該 單株抗體或其抗原決定基結合片段包含突變在重鏈之以 下數個位置之一 ：28、54及57。 22. 如請求項丨至4之抗體或其抗原決定基結合片段其專一 性結合至人類EphA2受體之抗原決定基’包含£忡八2受 體之細胞外域之LBD的殘基Gly49、Lys50、Gly51、 Asp53、Cys70、Asn71、Val72、Met73、Ser74、 Gly75 ' Gln77、Phel08、pr〇l〇9、GlyllO、Glylll、 361'113及861*114，或其保守取代之形式。 23. 如請求項6、7及8中任一項之結合物，其具有平均DAR 高於4，該DAR係用UV分光光度計測量且由方程式 DAR=cd/ca測定， 其中： 0〇 = [(εΑ280ΧΑ25 2)-(εΑ2 52 ΧΑ280)]/[(ε〇252 χεΑ280)-(εΑ252 χ eD28〇)] °Α=[Α28〇-(ε〇χε〇28〇)]/εΑ280 ε〇252=26,1 59 M-'cm*1 εΟ280=5,1 80 M^cm-1 εΑ28〇=224,000 M·1 cm·1 ε a 2 5 2=8 2，8 8 0 Μ c m Α252及A28G為結合物在UV分光光度計上分別於252 nm 150936.doc ·9· 201116297 及280 nm測量之吸光度。 24. 如請求項23之結合物，其具有包含4至1〇之間或5至8之 間之平均DAR。 25. 如請求項23之結合物，其具有包含5·9至75之間之 DAR。 句 26· —種製品，其包含： a) 包裝材料； b) 如請求項丨至4中任一項之抗體或其抗原决定基妙入 片段’或如請求項6至8及23至25中任一項之結合物.。 c) 該包裝材料内所含之標籤或包裝插頁， 1曰不該括神 或其抗原決定基結合片段對治療癌症有效。 150936.doc
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