TW201109011A - Cyclohexenone chemical compounds of Antrodia cinnamomea for suppressing the growth of gastric cancer tumor cell - Google Patents

Description

2〇11〇9〇ii 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係’-種化合物之新應用，尤其係關於—種利用由 牛樟芝___)萃取物中所分離純化之化合物抑 制胃癌腫瘤細胞生長之用途。 【先前技術】 胃癌(gastric cancer)是最常見的消化系統惡性腫瘤，根據行政 院衛生署十年來的統計，胃癌位居台灣癌症死亡的第五位，好發 年齡為45細上’且雜發生率高於女性m患胃癌的相關 危險因子包括遺傳因素、相關病史(例如惡性貧血和慢性萎縮性胃 炎等）、飲食習慣(例如缺乏食用新鮮蔬果食物或長期食用醃潰食物 等）、幽門螺旋桿菌感染、吸煙及酗酒等。95%以上胃癌是由胃黏 膜之上皮細胞形成的胃腺癌(adenocarcinoma)，所以一般所謂胃 癌，即是指胃腺癌而言。依癌細胞侵犯深度又可分為侷限於黏膜 ^ 層或黏膜下層之早期胃癌(early gastric cancer)以及癌細胞已侵犯 至固有肌肉層或更深入組織之進展期胃癌（advanced gastric cancer) ° 胃癌病人早期並沒有特定的臨床症狀，且其不適狀況與一般 的消化性潰瘍並沒有太大的區別，因此大多數患者被診斷出來 時’已經是胃癌晚期’此時病人的主要症狀包括：體重減輕、腹 痛、噁心、食慾不振、吞嚥困難、黑便、易飽、類胃潰瘍疼痛或 下之水腫等。目前胃癌的治療方式包括手術切除(gastrectomy)、化 201109011 學療法(chemotherapy)以及放射線療法(radi〇therapy)等其中以手 術切除腫瘤及其周圍組織與淋巴腺是完全根治胃癌的唯一方法， 但是除了早期胃癌於施予手術切除後可達5〇%存活率，大多數病人 之胃癌被診斷出時已是進展期胃癌，其術後的存活率則遠低於 50%，至於無法制治雜手術嫌哺移性、復發性胃癌病患， 此時只能制化療及放躲治療作為支持療法，赠到癌症局部 的控制，但其預後相當差(PrognosisP〇〇r)，且五年存活率甚至低於 籲15%。此外，治療後胃癌的復發及轉移、化學藥物的副作用、抗藥 性或放射線治剌發的不適症狀，亦是臨床上纽棘手的問題。' 由於月癌具有遠端轉移的高發生率，如腹膜擴散與肝臟轉移 等’ 即使雜的財術或其财法絲療，其職仍然相當 不樂觀。因此，儘管胃癌在全世界的發生率於近十年正逐年降低， 但其仍屬全球高致死率的癌症之―，胃癌對全世界人口來說，確 實疋-威倾康的重要魏’若賊到有效之天然無副作用的治 .療物質，必能更增進胃癌治療成效並避免衍生其他不適症狀。 牛樟芝，在台灣民間又稱為樟菇、樟 藏、樟内II、、牛樟顧紅樟，是本省财之藥關類，其係屬於 非褶菌目、多孔菌科(/^_㈣之多年生孽菌 類。由於樟芝在自然界t僅寄生於台灣特有的保育類牛樟木樹幹 之中空心材内壁組織上，加上人為的盜伐，使得寄生於其中方能 生長之野生牛樟芝數量更形稀少，且由於在自然狀態下樟芝子實 體的生長相當緩慢’所以野生樟芝數㈣纽價格昂貴。 201109011 * 牛樟芝之子實體為多年生，益知 卞王無柄，呈木栓質至木質，其具強 ”、、之樟树曰氣且形態多變化，有板狀、鐘狀、馬蹄狀或塔狀。 初生時為扁平型並呈鮮紅色，之後其周邊會呈現放射反捲狀，並 向四周擴展生長，顏色亦轉變為淡紅褐色或淡黃褐色，並有許多 細孔’且其係科樟芝之_價值最⑫的部位。 在台灣民俗醫學上’牛樟芝具有祛風行氣、化齋活血、溫中 消積、解毒消腫以及鎮靜止痛之功效，並視為上好的解毒劑，凡 鲁食物中毒’腹寫"區吐’農藥中毒均有解毒作用，此外對改善肝、 胃機能障概血麵環疾納具有漏絲功效。牛樟芝如同一 般食藥用之蕈翻’具有許多複㈣成分，6知理活性成分 中’包括：三脑化合物（triterpenGids)、多體（㈣⑽㈣知， 如/5-D-葡聚醣）、腺苷(aden〇sine)、維生素(如維生素B、菸鹼酸）、 蛋白質（含免疫球蛋白）、超氧歧化酵素（super〇xidedismutase， SOD)、微量元素(如：鈣、磷、鍺）、核酸、固醇類以及血壓穩定 •物質(如antodiaacid)等，此些生理活性成分被認為具有抗腫瘤、增 加免疫能力、抗過敏、抗病菌、抗高血壓、降血糖及降膽固醇等 多種功效，且有助於護肝及肝臟相關疾病之治療。 有關樟芝的成分研究’大多著重在大分子的多聽體 (polysaccharides)和小分子的三萜類（triterpenoids)和固醇類 (steroids)，其中，樟芝含有大分子之多醣體，以不同單糖組成存 在於其子實體及菌絲體中，但經光譜分析後皆含有具生理活性之 冷葡聚醣(β-D-glucans);三萜類化合物是由三十個碳元素結合 201109011 成六角形或五角形天然化合物之總稱，牛樟芝所具之苦味即主要 來自三II類此成分’且其亦係被研究最多之成份。從子實體得到 的三萜類化合物有antrocin、4,7-二甲氧基-5-甲基-1，3-苯並二氧環 (4,7-dimethoxy-5-methy-l，3_ benzodioxole)和2,2'，5,5'-四甲氧基 _3,4,3'，4’_雙-亞甲二氧基-6,6，-二甲基聯笨 (2,2',5,5'-teramethoxy-3,4,3',4'-bi-methylenedioxy-6,6'-dimethylbiph enyl) (ChiangeM/.，1995)，以麥角甾烷（ergostane)為骨架之新三 •萜類化合物antcin A、antcin B、antcin C antcin E、antcin F、methyl antcinate G 和methyl antcinate H (Chemg ❹/.，1995，1996)。子實 體另含以麥角甾院為骨架的化合物包含Zhankuic acid A、B及C zhankuic acid D 和 zhankuic acid E (Chen and Yang，1995 ; Yang 1996) ’以羊毛甾烷（lanostane)為骨架的新化合物15a _乙酿· 去氫硫色多孔鹵酸（15 a -acetyl-dehydrosulphurenic acid )、去氫 齒孔酸（dehydroeburicoic acid )與去水硫色多孔菌酸 • (dehydrasulphurenic acid) ° 雖然由目前諸多之實驗可得知牛樟芝萃取物具有前述功效， 且其所含成分亦陸續被分析出’但究竟萃取物中之何種有效成分 可促成牛樟芝之抑制癌症功效，並未發表具體之相關有效成分， 有待進一步實驗研究來釐清，故若能找出該萃取物中所含真正有 效抑制腫瘤生長之成分，將有利於牛樟芝抑癌相關機轉的研究， 並對牛樟芝應用於癌症例如胃癌之治療與預防有莫大的助益。 201109011 【發明内容】 明由牛樟芝萃取物中分離純化出具下列結構式⑴:化你 CH,

樟芝萃取物中究竟是何成分具有抑癌之效果 ，本發 ⑴

甲其Lw、:、乳0或硫⑻’ Υ係氧或硫；Rl係氫基（Η)、 11 3或咖加偶’ R2係氫基、甲基或(CH2)m-CH3，R3 係虱基、曱基或(CH2)m_CH3，m=1〜12 ;㈣〜以。

如式(1)結構式之化合物中’較佳者為如下所示式⑵之化合物: ?H3 CHo fVL,

式(2)之化合物，其化學名為4_羥基_2,3_二甲氧基_6-曱基_5 (3,7，11-二甲基_2,6，10_十二碳三烯）_2_環己烯酮 (2) (4-hydroxy-23-dimethoxy-6-methy.5(3jai.trimethyl_^ O-trienylHyebhexlencme) ’分子式為CAW，聰為淡黃色粉 末狀，分子量為390。 本發明中式(1)、式(2)之化合物係分離純化自牛樟芝水萃取物 或有機溶劑萃取物，有機溶劑可包括醇類（例如甲醇、乙醇或丙 醇）、醋类員（例如乙酸乙酿）、院类員（例如己院）或姐（例如氯 201109011 甲烧、氣乙烧）’但並不以此為限，其中較佳者為醇類，更佳為 乙醇。 藉由前述化合物，本發明係將其應用於抑制腫瘤細胞生長 上’使能進-步應用包括於治療癌症之醫藥組成物中，增益癌症 之治療效果。本發崎該化合物的應用翻包括麟胃癌腫瘤細 胞之生長抑藉由抑制該等腫瘤細胞之迅速生長，進而抑制腫 瘤之增生’而延緩腫瘤之惡化。其中，較佳之化合物係式⑺之4· 羥基-2,3·二曱氧基冬甲基阳灿三甲基_2,6，1〇十二碳三稀）_2_ 攀環己婦_。 另方面’本發明中亦可將式(1)或/與式(2)之化合物利用於抑 希]月癌膜瘤細胞生長之醫藥組成物的成分中。前述醫藥組成物除 包括有效劑量之式⑴或/與却)之化合物外，尚可包括藥學上可接 受的載體。髓可為賦_ (如水）、填細（如練或澱粉）、 黏合劑（如纖維素衍生物）、獅劑、崩解劑、吸收促進劑或甜味 劑’但並未僅’此。本發明醫餘成物可依—般習知藥學之製 鲁備方法生產製造’將式⑴或/與式⑺有效成分劑量與一種以上之载 體相混合，製備出所需之劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、 膠囊或其他液體製劑，但未以此為限。 以下將配合圖式進-步說明本發明的實施方式，下述所列舉 的實施例係用以闡明本發明’並非用以限定本發明之範圍，任何 熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍内，當可做些許吏 動與潤飾’因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界 定者為準。 201109011 【實施方式】 經萃取過後之牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物，可進一步 藉由高效液相騎加时離純化，之後再對每—分液（fracti〇n) 進行抑癌絲_試。驗，料對具抑癌縣之分液進行成分 刀析將可冑b產生抑癌效果的成分分別進一步做胃癌腫瘤細胞之 抑制效果職。最終即發現本發明巾如式(戰(2)之化合物係具有 抑制胃癌腫瘤細胞生長之效果。 φ 為方便說明本發明，以下將以式(2)之4-羥基-2,3-二甲氧基-6- 甲基-5(3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三婦）_2_環己婦酉同化合物進 行說明。此外，為證實4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5 (3,7,u_三甲 基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯酮化合物對腫瘤細胞生長之抑制 效果，本發明中係以MTT分析法，、根據美國國家癌症研究所 (National Cancer Institute，NCI)抗腫瘤藥物筛檢模式，對胃癌腫 瘤細胞進行細胞存活率之測試。由該些測試證實，4_羥基_23-二甲 氧基-6-甲基-5(3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三稀）_2_環己稀_對 φ 於胃癌腫瘤細胞：TSGH-9201細胞系可降低其存活率，相對之下 並可同時降低生長半抑制率所需濃度（即ΙΟ%值），因此得藉由 4_羥基-2,3_二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基_2,6，1()_十二碳三^) -2-環己烯酮，應用於胃癌腫瘤細胞之生長抑制上，而進一步可利 用於胃癌之治療。茲對前述實施方式詳盡說明如下： 實施例1 : 4-經基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5 ( 3,7,11-三曱基_2,6，10•十二碳三婦） -2-環己烯酮的分離 201109011 將100克左右之牛樟芝菌絲體、子實體或二者之混合物，置 入三角錐形瓶中，加入適當比例的水與醇類（70%〜100%醇類水溶 液），其中該醇類較佳為乙醇，於20〜25ΐ下攪拌萃取至少1小時 以上’之後以濾紙及0.45 μιη濾膜過濾，收集濾液即得牛樟芝萃 取液。 將前述收集之牛樟芝萃取液，利用高效能液相層析儀(High

Performance Liquid chromatography)，以 RP18 的層析管(column) • 進行分析，並以曱醇(A)及0.1%〜0.5%醋酸水溶液(B)做為移動相 (mobilephase)(其溶液比例係：〇〜1〇分鐘，B比例為95%〜2〇% ; 10〜20分鐘’B比例為20%〜10%;20〜35分鐘，B比例為1〇%〜9〇〇/0; 35 40分知’ B比例為〜95%)，在每分鐘1此之速度下沖提， 同時以紫外·可見光全波長制器分析。 將25分鐘至3〇分鐘之沖提液收集濃縮即可得淡黃色粉末狀 之固體產物，此即4·麟·2,3·二甲氧基·6·曱基·5 (3,7，11_三甲基 • =，6，1=十二碳三埽）_2_瓖己烯酮。經分析，其分子式為㈣必， 刀子里炫點（m.P.)為48°C〜52°C。核磁共振（nmr)分 析值則如下所不.m):】5i、mm .03 2-07'2.22'2.25'3.68'4.05'5.07#5.14°13C-NMR(CDCl3) 5 ⑦㈣）· 12 31、16.卜 16.12、17.67、25.67、26.44、26.74、27.00、 9.81 4.027、43.34、59.22、60.59、120.97、123.84、124.30、 131.32、135.35、135 92、138 〇5、16〇 45 與 19712。 實施例2 : 201109011 體外抗胃癌腫瘤細胞之活性測試 為進一步測試實施例1中所發現化合物對腫瘤細胞之抑制效 果’本實把例將根據美國國家癌症研究所(Nati〇nai Cancer Ijistitute, NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，首先取實施例1中所分離之4_羥基 _2,3_二曱氧基-6-甲基-5 ( 3,7，11_三甲基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環 己烯酮化合物，加入含有人類胃癌腫瘤細胞TSGH-9201的培養液 中’進行腫瘤細胞存活性之測試。其中，細胞存活性之測試可採 馨習知之MTT分析法進行分析，而胃癌腫瘤細胞tsgH-920 1係為 人類月癌細胞株(human gastric carcinoma cell line)。 MTT分析法是一種常見用於分析細胞增生（cell proliferation)、存活率（percent 0f viable cells)以及細胞毒性 (cytotoxicity )的分析方法。其中，从17' (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide )為一黃色染 劑，它可被活細胞吸收並被粒腺體中的號珀酸四嗤還原酶 (succinate tetrazolium reductase)還原成不溶水性且呈藍紫色的 鲁 formazan，因此藉由formazan形成與否，即可判斷並計算細胞之 存活率。 首先將人類胃癌細胞TSGH-9201於含有10%胎牛血清(fetal bovine serum)之DMEM培養基進行培養，該培養基尚包含1〇〇 IU/ml之盤尼希林（Penicillin)，及1〇〇 mg/mi之鏈黴素 .(Streptomycin)，並於5 % C〇2，37 °C環境中培養24小時。將增生 後之細胞以PBS清洗一次，並以1倍之胰蛋白酶-EDTA處理細 胞’隨後於l，200rpm下離心5分鐘’將細胞沈澱並丟棄上清液。 201109011 之後加入10 ml崎培麵’ I艰搖晃使細祕:域浮，再將細胞 分置於96孔微量盤内。測試時，分別於每一孔内加入3〇、1〇、3、 卜0.3、0.1與〇.〇3 pg/ml的牛樟芝萃取液作為對照組(未經純化分 離之總萃取物）；以及於每-孔内加入3〇、1〇、3小〇 3、〇 i 與0·03 μ#的4-經基_2,3_二甲氧基-6_甲基·5 (3,7，u_三甲基 -2,6，10-十二破三烯)-2-環己歸綱作為試驗組，於3n>5% %下 培養48小時。其後’於避光的環境下於每-孔内加人2.5 mg/ml 的MTT ’反應4小時後再於每一孔内加入1〇〇 μ1的㈣b祿[終 ❿止反應。最後以酵素免疫分析儀在57〇nm吸光波長下測定其吸光 值’藉以計算細胞的存活率’並推算出其生長半抑制率所需濃度 (即IC5〇值）’其結果如表一所示。 表一：體外對胃癌腫瘤細胞存活率之測試結果 --^式樣品^ IC5〇 c Ug/ml) 試驗組(加入式2) : ~ TSGH-9201 1 —-------------丄___ 9 由表一中可知，藉由4·羥基_2,3_二甲氧基_6_曱基-5 (3,7，11- 一甲基2,6，1〇·十一碳二烯）_2_環己婦g同的作用，其對於 TSGH_9201人類胃癌腫瘤細胞之IQo值為1.32 pg/ml，相較於對 照組牛樟芝萃取混合物所測得之IQ〇值(表中未示)係低的多，因此 可證實牛樟芝萃取物中之4_羥基_2,3_二甲氧基冬甲基_5 (3,7，u_ 甲基2,6，l〇-十二碳三烯）·2_環己烯酮確實能夠利用於胃癌腫瘤 細胞生長之抑制。 綜上所述，本發明分離自牛樟芝之4_羥基_2,3_二子氧基_6•甲 -土 5 (3,7，11_二甲基_2,6，1〇_十二碳三稀）_2_環己歸嗣化合物，係 12 201109011 可有效抑制胃癌顧細胞之生長H面，因牛樟芝環己稀嗣 化合物係為天鮮取之物質，故其朗於_胃鱗，並不會引 起患者不適或產生毒性、併發症等其他副侧，且其亦可盘二 樂劑朗’以減少化療祕錢並降低㈣ 之=用；此外’亦可將其製備成治療胃癌之醫藥組成物^ ，醫樂組成物除包含有效劑量之牛樟芝環己稀嶋合物外，尚可 ==接受的载體。載體可為賦形劑(如水)、填充劑(如 收促、黏合劑（如纖維素衍生物）、稀釋劑、崩解劑、吸 樂予之1備方法生產製造，將有效成分劑量之牛樟 型可ί二一:以上之載體相混合，製備出所需之劑型，此劑 限。㈣、蝴、膠囊或其他液體製劑，但未以此為 日達到療胃癌腫瘤疾病之目的。

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Claims (1)

1. 201109011 七、申請專利範圍： 1、一種將具有下列結構式之化合物利用於製備抑制胃癌腫 瘤細胞生長之藥物的應用：

   其中’ X係氧（0)或硫（S )，Y係氧或硫；Ri係氫 基（H)、甲基（CH3)或(CH2)m-CH3，R2係氫基、曱 基或(CH2)m-CH3 ’ R3 係氫基、曱基或(CH2)m_CH3，m =1 〜12 ; n=l〜12。 如申請專利範圍第1項所述之應用，其中該化合物係 ‘羥基·2,3-二曱氧基-6-甲基-5 ( 3,7，11-三曱基-2,6，10-十 -2- 環 己 稀 酮 碳三烯 (4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7，ll-trimethyl-dodeca-2,6，l〇-trienyl)-cyclohex-2-enone)。 3如申凊專利範圍第2項所述之應用，其中該化合物係由 牛樟芝萃取物所分離製得。 4、 如申請專利範圍第3項所述之應用，其中該化合物係由 牛樟芝之水萃取物所分離製得。 5、 如申請專利範圍第3項所述之應用，其中該化合物係由 牛樟芝之有機溶劑萃取物所分離製得。 6、 如申請專利範圍第5項所述之應用，其中該有機溶劑係 選自醋類、醇類、烷類及鹵烷所組成的族群。 201109011 7、 如申請專利範圍第6項所述之應用’其中該醇類係乙醇。 8、 如申請專利範圍第1項所述之應用’其中該胃癌腫瘤細 胞係TSGH-9201細胞系。 9、 一種用於抑制胃癌腫瘤細胞生長之醫藥組成物，包括一有效劑 量如申請專利範圍第1項所述之化合物以及一藥學上可接受之 載體。 10、 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組成物，其中該化合物係 φ 、4-經基-2,3-二甲氧基_6_甲基-5(3,7，11-三曱基-2,6，10_十二碳三 浠）-2-環己稀酮（4-hydroxy-2,3-dimethoxy_6-methy-5(3,7，ll-trimethyl- dodeca-2,6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone )。 11、 如申請專利範圍第l〇項所述之醫藥組成物，其中該化合物係 由牛樟芝萃取物所分離製得。 12、 如申請專利範圍第1丨項所述之醫藥組成物，其中該化合物係 由牛樟芝之水萃取物所分離製得。 13、 如申明專利範圍第11項所述之醫藥組成物，其中該化合物係 由牛棒之之有機溶劑萃取物所分離製得。 14、 如申凊專利範圍帛13項所述之醫藥、组成物，其中該有機溶劑 係選自酯類、醇類、烷類及_烷所組成的族群。 15、 如申请專利範圍帛14項所述之醫藥組成物，其中該醇類係乙 醇。 16、 如中料利縫第9項所述之醫藥組成物，針該胃癌腫瘤 細胞係TSGH-9201細胞系。 15 201109011 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（無）圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明：

   五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：