TW201032816A - Water extract of antrodia camphorata for immunostimulatory effect and preparation method thereof - Google Patents

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201032816 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本案係關於樟芝子實體萃取物及其製備方法。尤其，本案係 關於一種樟芝子實體水萃取物及其製備方法，對樹突细 ^；备、 疫刺激的效果。 、 有免 【先前技術】 樟芝(v4油Ό也2 又稱樟菇、牛樟菇、牛樟芝等，為 Φ 台灣特有的真菌菌種’生長於海拔4〇〇至2〇00公尺特有的牛樟樹 樹幹腐朽的心材内壁，或枯死倒伏的牛樟 木材陰暗潮濕的表面《因此，要尋找到野生的樟芝子實體 body)或確認此多孔菌目（Aphyll〇phorales)真菌菌株的外觀並不容 易，也由於其生物活性成分具潛在的醫藥價值，因此樟芝的價格 居高不下6 由於樟芝子實體不易採集也難以人工方式培養，目前市面上 多為樟芝菌絲體(mycelia)產品，其宣稱具有抗癌、減少治療引起的 症狀、減少副作用、抗氧化、抗過敏、免疫刺激效果等。 ❿ 在免疫反應中，樹突細胞(dendriticcell,DC)受到刺激與活化， 成為抗原呈現細胞’表現抗原以與未成熟的T淋巴球辨識⑶，而 樹突細胞的成熟及功能受細胞介素(cytohne)及共刺激信號 (costimulatory signals)調節⑼。近來研究發現，以樹突細胞為基礎 的免疫療法可應用於治療惡性腫瘤上⑴。成熟過程(maturati〇n process)為樹突細胞的主要功能，可使細胞依序執行不同的、高度 分化的功能。而許多刺激物’包括脂多醣體(Kp〇p〇lysaccharide， LPS)，具有誘導樹突細胞成熟的功能。 而菇類所產生的多醣體，在現今研究中發現其可成為一種誘 201032816 使，突細胞成熟及功能活化的新藥劑。所以，在尋摘的免疫治 ，藥，時於傳統醫學中被應用治療癌症的食藥用真菌被視為極 具潛力的候選藥物，其巾啡芝最為國人所知曉。 、中華民國專利號1299665揭露了樟芝萃取物及其製備方法，其 係以乙醇萃轉芝獅體獲得多㈣，用以抑雜質金屬蛋白酶 的活性，健非轉芝子實_解取，其絲妹能抑制癌細 胞的生長；中華民國專峨1279439揭露了以樟芝義體進行培 養’藉由調整培養時的酸驗值獲得到培養物，並未揭露萃取方法；

而中華民國專利號59111〇揭露了由樟芝菌絲體萃取出i胺基丁 酸二其係先以冷綠燥樟芝菌絲體，再以水或有機溶劑萃取。上 述这些發㈣非以樟芝子實體進行有機溶劑或水萃取，而且未確 認樟芝子實體水萃轉涉及在嫉細胞免疫反應巾的功效。 、本案㈣人鑑於習知技射料足，經過悉^試驗與研究， ，一本鐵而不捨之精神，終構思出本案「增強免紐性之樟芝子 實體水萃取物及其製财法」，能齡服先前技術料足，以下為 本案之簡要說明。 【發明内容】 本發明以水萃取樟芝子實體，獲得樟芝子實體水萃取物，此 可有效促進免疫反應及刺激樹突細胞。再分別以乙酸乙酯、乙醇 ^水進一步萃取樟芝子實體水萃取物，獲得到樟芝子實體乙酸乙 醋、乙醇萃取物及水再萃取物，確定其含有的多醣體可促進樹突 細胞成熟及活化T細胞。 本發明提供一種樟芝子實體水萃取物的製備方法，包括下列 步，：（a)研磨财子實體成嫌，·雄)水煮、迴料取該粉狀的 樟芝子實體，過濾及離心，獲得樟芝子實體水萃取物。 4 201032816 根據上述構想，該製備方法還包括下列步驟：（C)以至少一有 機心劑萃取該樟芝子實體水萃取物，獲得樟芝子實體有機溶劑萃 取物。 根據上述構想’該有機溶劑包括乙酸乙酯、乙醇及其组合， 該步驟(C)還包括：（cl)以乙酸乙酯萃取該樟芝子實體水萃取物，獲 知樟芝子實體乙酸乙醋萃取物及第一樟芝子實體殘留物；及㈣ 以乙醇萃取第一樟芝子實體殘留物，獲得樟芝子實體乙醇萃取物 及第二樟芝子實體殘留物。 Φ 根據上述構想，製備方法還包括下列步驟：（d)以水萃取第二 樟芝子實體殘留物，獲得樟芝子實體水再萃取物。 根據上述構想，樟芝子貫體水再萃取物的ljj核磁共振圖譜在 化學偏移δ 3.0-5.5之醣類化合物特徵訊號比例最高。而且在化學 偏移4.44、4.46、4.9卜5.00及5.15 ppm處呈現多醣體結構中異位 性碳原子(anomeric carbon)上氫的特徵訊號。 本發明另提出一種樟芝子實體水萃取物，其係由研磨樟芝子 實體，並水煮迴流萃取、過遽及離心該樟芝子實體所獲得。 φ 根據上述構想，樟芝子實體水萃取物經由活化PI3K/Akt及 P38/MAPKS訊息傳遞路徑而誘發樹突細胞成熟，促進丁細胞增生 及干擾素γ的分泌，趨化輔助性T細胞(T helper 1)反應。此外，樟 芝子實體水萃取物亦經由抑制細胞凋亡作用促進樹突細胞之活 性。 【實施方式】 本案所提出之「增強免疫活性之樟芝子實體水萃取物及其製 備方法」將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟/習本 技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施 5 201032816 例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之 實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之 範圍。 生物學實驗 實驗1 :分別自樟芝、靈芝、姬松茸的子實體製備萃取水萃取物 依照過去文獻製備多醣體的方法(5)，分別將乾燥的樟芝 camp/iorato)、靈芝（Gcmoafermfl /wdc/wm)及姬松茸 (jgflWoAsWazez·)的子實體研磨成細粉，再以1: 1〇比例(重量/體積) φ 水煮、迴流萃取8小時，進一步將上清液過濾、以3,000ipm離心 30分鐘以移除沈澱物，再進行冷凍乾燥。所獲得的樟芝水萃取物 (ACW)、靈芝水萃取物(GLW)及姬松茸水萃取物(ABW)保存於 _70°C。此外，以酚—硫酸法測定其多醣體含量(2)。 實驗2 :樟芝子實艘水萃取物之進一步萃取、分姻 將216.4 mg的樟芝子實體水萃取物以極性漸增的溶劑(依序 為乙酸乙酯(ethyl acetate)、乙醇及水)萃取，並依序獲得8.9% (19 3 mg)棒之子實體乙酸乙g旨萃取物、38.5% (83.3 mg)棒芝子實體乙醇 φ 卒取物及52.6% (113.8 mg)樟芝子實體水再萃取物三種不同的萃 取物。百分比表示佔樟芝子實體水萃取物之重量百分比，毫克表 示對應的萃取後的乾重。各萃取物以酚—硫酸法測定其多醣體含 量(2> ’並以核磁共振圖譜分析其光譜特性。 實驗3 :核磁共振實驗 上述的萃取物溶解於氫的同位素(氣，deuterium)溶劑中，例如 D20 及 C5D5N 等，再以 Varian Unity Inova-600 MHz NMR 測定1Η 核磁共振圖譜。化學位移(chemical shift)以ppm(δ)表示。 實驗4 :人類τ細胞及樹突細胞的製備 樹突細胞主要以Lin等人於2006發表的方法製備並加以修飾 201032816 。首先’以12位健康捐贈者並以FicoipHypaque密度低度離心 法(Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)獲得周邊血液單核球細 胞(PBMC)。將周邊血液單核球細胞培養於添加1〇%胎牛血清、2 mM麩胺酸、1〇〇 pg/mi鏈黴素及1〇〇 u/ml盤尼西林的 培養基中2小時。移去未附著的細胞，以尼龍絲分離法(nyl〇nw〇〇1 separation)純化T細胞’做為單核τ淋巴球的來源。將T細胞注入 管柱’而被洗下的非附著性細胞富含T細胞。以流式細胞儀分析 最終獲得的細胞中，80%的T細胞具有高度表現的CD3蛋白。將 φ 附著的細胞培養於添加50 ng/ml顆粒單核球群落刺激生長因子 (GM-CSF)及介白素-4 (interleukin-4, IL-4)的 RPMI1640 培養基中 6 天’每隔2至3天以含有生長因子的新鮮培養液替換原先一半體 積的PRMI1640培養液。於第6天收集細胞，並將細胞與抗CD11C+ 的微珠混合，並以 mini MACs 系統(Becton Dickinson，Mountain View，CA)進行。超過9〇%的CD11C陽性細胞為未成熟的樹突細 胞，此未成熟的樹突細胞再分別以PBS、100 ng/ml脂多醣體及不 同劑量的樟芝水萃取物處理2天，再以流式細胞儀分析。 ❹ 實驗5.混合同種異體T淋巴球反應(mixed allogenic T lymphocyte reaction, MLR) 經過處理的樹突細胞先於37〇C、以25 ng/ml的絲裂黴素C (mitomycin C)處理30分鐘，再以培養液清洗3次，將樹突細胞與 T細胞分別以1 : 1〇及丨：20的比例混合，再將混合後的細胞培 養於96孔盤5天。在第5天的最後4小時，每個孔洞加入20 μΐ WST-1 (Roche，Germany)。！1細胞增殖的程度下列公式計算:450 nm 波長的吸光值一650 nm波長的吸光值(背景值）。收集細胞培養後 的上清液’並以酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)分析IL-4及干擾 素γ (interferon-γ，IFN-γ)含量。 7 201032816 實驗6 :免疫螢光法及流式細胞分析 為了分析樹突細胞的外在表現型，於37。(：、以螢光染料 (fluorochrome)結合抗體或同型匹配對照抗體(is〇type_matched control antibody)標定樹突細胞30分鐘，再以FACScalibur流式細 胞儀及 Cell Quest 軟體(Becton Dickinson，Mountain View, CA)分析 細胞。 實驗7 :細胞介素(cytokine)之分析 本實驗是以高敏感性人類細胞介素套組(R&D Systems, ❹ Minneapolis, U.S.A.)測定樹突細胞或T細胞的培養上清液中的介 白素42、介白素-10、干擾素-γ及介白素4含量。 實驗8:細胞遷移實驗 本實驗是試驗樹突細胞通過transwell chamber的8 μιη孔徑聚 碳酸酯濾贌(polycarbonatefilter)的遷移能力，以了解樹突細胞的化 學趨性。首先’分別以脂多醣體、25 pg/ml及50 pg/ml的樟芝子 實體水萃取物處理樹突細胞48小時。在transwell plate的孔洞中 加入含(或不含）T淋巴球(2 X 106 cells/ml)的500 μΐ無血清培養 ❹ 液，而在transwell chamber中加入含樹突細胞(1 x 1〇5 cells/〇]如) 的無血清培養液。將transwell chamber置於transwell plate的孔洞 中’使樹犬細胞於37°C遷移3小時。收集遷移至transweu piate 孔洞的樹突細胞’並以流式細胞(計數60秒)分析遷移後的樹突細 胞數目。 實驗9:西方點溃分析 以脂多醣體或特定劑量的樟芝水萃取物刺激樹突細胞，再以 RIPA試劑(含 140 mM NaC卜 10 mM EDTA、10% glycero卜 1%

Nonidet P-40 ^ 20 mM Tris (pH 7.0) ^ 1 μΜ pepstatin > 1 μ§/πι1 aprotinin、1 pg/ml leupeptin及 1 mM sodium orthovanadate)裂解細 8 201032816 胞’並以BCA蛋白試劑組(pierce, R〇ckford，il)測定蛋白濃度。膠 體上的每個孔洞注入2〇 蛋白，再進行SDS-PAGE分析，之後將

解析凝膠轉潰至硝化纖維膜。依序以初級抗體偵測蛋白、再以HRP 酵素連結的二級抗體偵測初級抗體、最後aLumiGL〇試劑(pierce) 呈色。 實驗10 : MAPK的抑制及PI3K/Akt的活化 為了分析樟芝水萃取物對樹突細胞成熟的訊息傳導路徑’分 別以 ERK抑制劑 PD98059 (25 μΜ)、JNK抑制劑 SP600125 (25 φ μΜ)、Ρ38 抑制劑 SB203580 (25 μΜ)或 PI3K/Akt抑制劑 LY294002(25 μΜ)處理樹突細胞2小時’再以樟芝子實體水萃取物 刺激樹突細胞。2天後，分析樹突細胞的表現特徵及樹突細胞上清 液中的介白素-12產量。 實驗11 :統計分析 本發明的統計分析是以Student，s ί test進行，ρ值小於〇 〇5表 不具有顯著差異。 實驗結果 ❿1·樟芝H姬松茸子㈣水萃取物促進樹突細胞表型成熟 (phenotypic maturation)的能力： 為了比較各食藥用真菌之多醣體對樹突細胞成熟的影響，將 未成熟的樹突細胞分別與樟芝、靈芝以及姬松茸子實體水萃取物 進行培養，以流式細胞技術分析輔助性刺激分子CD86及 的表現。請參閱第1圖’為樟芝、靈芝及姬松茸子實體水萃取物 分別刺激未成熟的樹突細胞後的CD86及HLA—Dr表現比較圖。 各種處理後的平均螢光贿是計算與PBS她後驗數而得 第1圖可知，以靈芝及姬松茸子實體水萃取物((勝及处 法如同樟芝子實體水萃轉(ACW)—樣具有可促進触細胞表型 9 201032816 ，熟的能力。進-步⑽—硫酸法分析這三種子實體水萃取物的 夕酿體含1： ’發現ACW (82·6%)具有& GLW (52.3%)及ABW (28.3%)含量更高的多醣體(第2圖）。 樟芝子實艘水萃取物之各再萃取物㈣阶咖⑽)促進樹突細跑 表型成熟的能力： 為了更進一步確認多醣體是樟芝子實體水萃取物中促進樹突 細胞成，的活性成分，請參閱第3 ，為本發明實施例的棒芝子 實，水萃取物及其後續的有機溶鮮取物及水再萃取物的製備方 • 法流程圖。首先’將樟芝子實體(步驟101)以水進行萃取(步驟 102) ’獲得到樟芝子實體水萃取物(ACW)(步驟1〇3)。接著，將樟 I子實體水萃取物以乙酸乙酯(ethyl acetate)進行萃取，獲得樟芝子 實體乙酸乙酯萃取物(ACW_EA)(步驟1〇4)及第一掉芝子實體殘留 物(步驟105);再將第一樟芝子實體殘留物以乙醇(ethan〇1)進行萃 取’獲得樟芝子實體乙醇萃取物(ACW_E)(步驟1〇6)及第二樟芝子 實體殘留物(步驟107);最後將第二樟芝子實體殘留物以水萃取， 獲得樟芝子實體水再萃取物(ACW-W)(步驟108)。 φ 樟芝子實體乙酸乙酯萃取物、樟芝子實體乙醇萃取物及樟芝 子實體水再萃取物的產量分別佔樟芝子實體水萃取物重量的 8.9%、38.5%及 52.6%。 接著，將樟芝子實體水萃取物及其分餾的萃取物分別刺激未 成熟的樹突細胞，發現與控制組(PBS)相較，以ACW或Acw-w 分別刺激的樹突細胞增加1.6至1.9倍的CD86及1.5至1.7倍的 HLA-DR表現量’而由ACW-E及ACW-EA分別誘導的樹突細胞 的CD86及HLA-DR表現量明顯的比ACW-W或ACW低(第4圖)。 再以酚一硫酸法分析樟芝子實體水萃取物及其分餾的萃取物 的多醣體含量，與樟芝子實體水萃取物相較(ACW)，樟芝子實體 201032816 水再萃取物(ACW-W)具有含量最多的多醣體(88.2%)，其次依序為 樟芝子實體乙醇萃取物(ACW-均的31.8%及樟芝子實體乙酸乙酯 萃取物(ACW-EA)的12.9% (第5圖）〇 而由1Η核磁共振圖譜分析樟芝子實體水萃取物及其分餾的萃 取物可觀察到以下特性。1Η核磁共振圖譜實驗條件為：解析度6〇〇 MHz的儀器、濃度為1〇 〇 mg/〇 75 ml，水萃取物(Acw)和水再萃 取物(ACW-W)溶於〇2〇溶液’分餾後極性較低的乙酸乙酯萃取物 (ACW-EA)以及乙醇萃取物(ACW_E)則溶於溶液，以利比

请參閱第6圖(A)至第6圖(D) ’分別為(A)樟芝子實體水萃取 物、（B)樟芝子實體乙酸乙酯萃取物、（c)樟芝子實體乙醇萃取物及 (D)樟芝子實體水再萃取物的ιΗ核磁共振圖譜。若將第6圖(A)至 (D)的1Η核磁共振圖譜部分重疊並相互比較，發現在§ 3 〇_5 5之 醣類化合物特徵訊號於水再萃取物(ACW-W)的比例最高。而且在 化學偏移4.44、4.46、4.91、5.00及5.15 ppm處呈現多醣體結構中 異位性碳原子(anomericcarbon)上氫的特徵訊號(第6圖(E；))。 此外，更以多粘菌素B (polymyxin Β)試驗確定ACW確實能 誘發樹突細胞成熟，此活性非來自脂多醣體的污染（LPS eontamination)。多枯菌素B是一種抗生素，在測試藥物之免疫活 性的實驗中，能與脂多醣體結合、用以去除脂多醣體污染所造成 的實驗誤差。因此，以多枯菌素B測試是否會阻斷由樟芝子實體 水萃取物誘導的樹突細胞的表型成熟’結果發現，多粘菌素B加 速了由樟芝子實體水萃取物誘導的樹突細胞之CD86及HLA-DR 的表現量’但是多枯菌素B卻顯著地抑制由脂多_體誘導的樹突 細胞之CD86及HLA-DR的表現量(第7圖）。因此，ACW在無脂 多聽體污染情形下能刺激樹突細胞的成熟。 11 201032816 接著，更以Η核磁共振圖譜針對水再萃取物(acww)以及脂 多醣體(LPS)在相同條件下加以分析比較。請參閱第6圖⑼以及第 8圖’將_譜重#相互比概可魏Acw_w好僅具有醋類化 合物的特徵訊號，而無類似舒_之長鏈上魏號在化學偏移 0.70至2.40ppm處，所以更能排除脂多醣體於實驗中的干擾。 由上述的實驗結果可歸納出樟芝子實體水萃取物之促進免疫 活性確實來自於多醣體。 3.樟芝子實體水萃取物(ACW)對於樹突細胞的成熟與功能之影 β 響： 樹突細胞受到外界刺激時會產生許多細胞介素(cyt〇kine)，而 細胞介素的產生對於活化naiVeT細胞扮演重要的角色。其中，介 白素-12 (IL-12)為樹突細胞的引導因子队士办以fact〇r)，能指揮 辅助性T細胞的生長，產生大量的干擾素_Y(jpN_Y)。請參閱第9 圖，為不同濃度的樟芝子實體水萃取物誘導樹突細胞產生介白素 _12能力比較圖。在第9圖中，以25 μ§/πι1及50 pg/ml的樟芝子 實體水萃取物刺激樹突細胞、產生介白素_12(il-12)的能力皆比脂 φ 多醣體強，而測定的介白素-12濃度分別為235.53 ±2.54 (PBS)、 698.45 ± 5.46 (LPS)、758.14 ± 26.54 (ACW-25)及 855.7 ± 56.21 (ACW-50) pg/ml。 介白素-12能使巨嗤細胞進行趨化作用(chemoattractant)，也為 樹突細胞遷移所需。請參閱第10圖，為未成熟的樹突細胞受不同 濃度的樟芝子實體水萃取物刺激後的遷移能力比較圖。在第1〇圖 中’與PBS及脂多醣體這兩組相較，以不同濃度的樟芝子實體水 萃取物(12.5、25及50 pg/ml)刺激未成熟的樹突細胞皆能夠有效促 進樹突細胞的遷移能力，其中以25 pg/ml的樟芝子實體水萃取物 刺激樹突細胞能產生最大的遷移效果，而樟芝子實體水萃取物濃 12 201032816 度提高至50 pg/ml會使遷移能力降低。 樹突細胞可有效地呈現抗原給T細胞’並依據其表現型造成 T細胞的分化。請參閱第11圖(A)，為樟芝子實體水萃取物刺激樹 突細胞、活化T細胞的曲線圖。在第11圖中，與PBS及100 ng/mi 脂多醣體這兩組相較，以25及50 pg/ml的樟芝子實體水萃取物皆 能有效刺激樹突細胞、活化T細胞。請參閱第11圖(B)，為以不 同濃度的樟芝子實體水萃取物刺激樹突細胞、活化辅助性T細胞 而產生干擾素-γ的比較圖。在第11圖(B)中，與pbs及100 ng/ml φ 脂多糖體這兩組相較’以25及50 pg/ml的樟芝子實體水萃取物皆 能有效刺激樹突細胞、活化輔助性T細胞，並且有效地增強輔助 性T細胞產生干擾素-γ的能力。由上述結果可知··樟芝子實體水 萃取物可誘導的樹突細胞產生大量的干擾素-γ，而受樟芝子實體水 萃取物誘導的樹突細胞可促進Τ細胞進入輔助性Τ細胞免疫反應 路徑0 4·樹突細胞的成熟過程中棟芝子實體水萃取物對於細胞生存率之 影饗： φ 過去的研究發現癌細胞會藉由誘發細胞凋亡來逃避免疫系統 的監視，抑制樹突細胞的凋亡則可提高抗原專一性的免疫反應 (antigen-specific immune responses)。因此，需檢測樟芝子實體水萃 取物是否會對樹突細胞有細胞毒殺作用。實驗結果發現，以樟芝 子貝體水卒取物刺激樹突細胞8天’超過90%以上的樹突細胞已 成熟，而且經過長時間培養，樟芝子實體水萃取物對樹突細胞並 不會產生細胞毒殺作用。此外，以樟芝子實體水萃取物刺激樹突 細胞’會顯著降低Bax蛋白表現量，也會增加Bci_2及 的表現量(第12圖(A))。 5· PI3K/ Akt舆MAPKs在楝芝子實體水萃取物誘導樹突細胞成熟 13 201032816 過程中所扮演的調節： 樹突細胞的成熟、功能化與PI3K/Akt以及MAPKs訊息傳導 路徑相關，樹突細胞被樟芝子實體水萃取物刺激後的細胞内訊息 傳導路徑也被進一步確定。請參閲第12圖(B)，為樟芝子實體水萃 取物刺激樹突細胞後的訊息傳導路徑蛋白表現圖譜。在第12圖(B) 中，與PBS及脂多醣體這兩組相較，樟芝子實體水萃取物可活化 樹突細胞内的磷酸化p38 (p-p38)、磷酸化JNK (p-JNK)及填酸化 AKT (p-Akt)。此外，以12.5 pg/ml的樟芝子實體水萃取物可刺激 ❹ 樹突細胞中大量的磷酸化ERK (p-ERK)表現，但是當樟芝子實體 水萃取物濃度增加’p_ERK表現量降低，而未磷酸化的ERK表現 量在不同濃度的ACW條件下仍相當穩定。 為了分析樹突細胞中PI3K及MAPKs訊息傳導路徑之間的關 係’先將訊息傳導路徑蛋白抑制劑(SB2〇3580、PD98059、SP600125 及LY294002)分別與樹突細胞作用，以抑制p38、ERK1/2、、 PI3K/Akt的活性，再以樟芝子實體水萃取物刺激樹突細胞。結果 顯不：p38 (SB203580)、JNK (SP600125)、Akt (LY294002)會抑制 ❿樹突細胞受樟芝子實體水萃取物所誘導的CD86表現(第13圖 (A))。而被p38及Akt抑制劑抑制、再以樟芝子實體水萃取物刺激 的樹突細胞，其介白素_12蛋白表現相當低；ERK1/2抑制劑則會 ，進介白素^2的蛋白表現(第13 _))。由以上結果可歸納出棒 芝子實體水萃取物是藉由活化p38和他而導致樹突細胞的成 熟、功能化。 *本發明的樟芝子實體水萃取物與靈芝子實體水萃取物及姬松 f子實體水萃取物她’樟芝子實體水萃取物具有較好的促進樹 大、《•田胞成熟的成力。樟芝子實體水萃取物可經由活化以 及P38/MAPKS訊息傳遞路徑而誘發樹突細胞成熟化 ，促進Τ細胞 201032816 增生及干擾素γ的分泌，趨化辅助性τ細胞反應；也可經由抑制 細胞凋亡作用促進樹突細胞功能上之活性。因此，樟芝子實體水 萃取物可應用於免疫治療上。 由樟芝子實體水萃取物依序以乙酸乙酯、乙醇及水萃取所獲 得的萃取物發現，内含的多醣體含量影響了樹突細胞的活化程 度’證實了樟芝子實體水萃取物之促進免疫活性源自多醋體。 本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申 請。此外，本發明可以由本領域技術人員做任何修改，但不脫離 φ 如所附權利要求所要保護的範圍。 【圖式簡單說明】 第1圖為樟芝、靈芝及姬松茸子實體水萃取物分別刺激未成 熟的樹突細胞後的CD86及HLA-DR表現比較圖。 第2圖為樟芝子實體水萃取物、靈芝子實體水萃取物及姬松 茸子實體水萃取物的多醣體含量比較圖。 第3圖為本發明實施例的樟芝子實體水萃取物及其後續的有 φ 機溶劑萃取物及水再萃取物的製備方法流程圖。 第4圖為樟芝子實體各種萃取物分別刺激未成熟的樹突細胞 後的CD86及HLA-DR表現比較圖。 、、 第5圖為樟芝子實體各種萃取物的多醣體含量柱狀圖。 第6圖(Α)至第6圖(D)分別為(Α)樟芝子實體水萃取物、出)棒 芝子實體乙酸乙酯萃取物、(C)樟芝子實體乙醇萃取物及(D)棒芝子 實體水再萃取物的1Η核磁共振圖譜。 第6圖(Ε)為樟芝子實體水再萃取物士核磁共振圖譜 大圖。 第7圖為以多粘菌素B預先處理樹突細胞、再以脂多醣體或 15 201032816 樟芝子實體水萃取物誘導的CD86及HLA-DR表現比較圖。 第8圖為脂多醣體的1Η核磁共振圖譜。 第9圖為不同濃度的樟芝子實體水萃取物誘導樹突細胞產生 介白素-12能力比較圖。 第10圖為未成熟的樹突細胞受不同濃度的樟芝子實體水萃取 物刺激後的遷移能力比較圖。 第11圖(Α)為樟芝子實體水萃取物刺激樹突細胞、活化τ細 胞的曲線圖。 第11圖(Β)為以不同濃度的樟芝子實體水萃取物刺激樹突細 胞、活化輔助性Τ細胞而產生干擾素_γ的比較圖。 第12圖(Α)及(Β)分別為樟芝子實體水萃取物刺激樹突細胞後 的訊息傳導路徑蛋白表現圖譜，其中第i 2圖(Α)包括Bax、Bcl-2、 p65 及 Actin，而第 12 圖(B)包括 p-ERK、ERK、p-p38、p-38、p-JNK、 JNK、p_Akt 及 Actin 〇 第13圖(A)及(B)分別為樹突細胞受訊息傳導路徑蛋白抑制劑 抑制後再以樟芝子實體水萃取物處理樹突細胞的(Α) CD86及毋) 介白素-12表現比較圖。 【主要元件符號說明】 第3圖 1〇 製備方法 101樟芝子實體 102 水萃取 103樟芝子實體水萃取物(ACW) 104樟芝子實體乙酸乙酯萃取物(AC W-EA) 105第一樟芝子實體殘留物 16 201032816 106樟芝子實體乙醇萃取物(ACW_E) 107第二樟芝子實體殘留物 108樟芝子實體水再萃取物(AC w_ w)

縮寫表 EDTA

NFkB PBS SDS

2-[2-(Bis(carboxymethyl)amino)ethyl-(carboxymethyl)a mino]acetic acid horseradish peroxidase

nuclear factor kappa B phosphate buffered saline sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis WST-1 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl )-2f/-tetrazolium PBMC peripheral blood mononuclear cell GM-CSF granulocyte macrophage colony-stimulating factor ERK extracellular signal-regulated kinase JNK c-Jun N-terminal kinase MAPK Mitogen-activated kinase PI3K Phosphoinositide 3-kinase HLA human leukocyte antigen

參考文獻： 1. Banchereau, J., Paczesny, S., Blanco, P., Bennett, L., Pascual, V., Fay, J. and Palucka, A. K. Dendritic cells: Controllers of the immune system and a new promise for immunotlierapy. Arm. N. Y. Acad. Sci. 2003. 987: 180-187. 2. Chen, C.-C., Liu, Y.-W., Ker, Y.-B., Wu, Y.-Y., Lai, E. Y., Chyau, C.-C., Hseu, T.-H., and Peng, R. Y. Chemical characterization and 17 201032816 anti-inflammatory effect of polysaccharides fractionated from submerge-cultured Antrodia camphorata mycelia. J. Agric. Food Chem. 2007. 55(13): 5007-5012. 3. Hart，D. N. Dendritic cells: Unique leukocyte populations which control the primary immune response. Blood, 1997. 90(9): 3245-3287.

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Claims (1)

1. 201032816 七、申請專利範圍·· 一棒料子料，爾场心，獲得 2. 範圍第1項所述的製傍方法’其中該製備方法還包 芝機^有^萃^萃取該梓芝子實艘水萃取物，獲得一樟

   3. =利備方法’細有機溶劑包括 〇毆乙自曰乙.及其組合，該步驟(C)還包括： (cl)以乙酸乙酯萃取該樟芝子實體水萃取物，獲 只體乙酸乙醋萃取物及一第一樟芝子實體殘留物；及 ㈣以乙醇萃取該第一樟芝子實體殘留物，獲得一棒芝 體乙醇萃取物及一第二樟芝子實體殘留物。 、 4t=範圍第3項所述的製備方法，其中該製備方法還包 (d)以水萃取該第二樟芝子實體殘留物，獲得一樟 再萃取物。 5.如申請專利範圍第4項所述的製備方法，其中，該樟芝子實體 水再萃取物的1H核磁共振圖譜在化學偏移5 3.0-5.5之醣類化合 物特徵訊號比例最高，而且在化學偏移4.44、4.46、4.91、5.00 及5.15 ppm處呈現多醣體結構中異位性碳原子(anomeric carb〇n) 上氫的特徵訊號。 6· 一種樟芝子實體水萃取物，其係由研磨一樟芝子實體，並水煮 迴流萃取、過濾及離心該樟芝子實體所獲得❹ 7.如申請專利範圍第6項所述的樟芝子實體水萃取物，其中該樟 芝子實體水萃取物經由活化一訊息傳導路徑，而誘發一樹突細 胞之成熟。 19 201032816 8. 如申請專利範圍第7項所述的樟芝子實體水萃取物，其中該蛋 白表現係選自PI3K/Akt、p38/MAPKs及其組合。 、 9. 如申請專利範圍第7項所述的樟芝子實體水萃取物，其中該樹 突細胞之成熟進一步促進T細胞增升級干擾素γ的分泌，並趨化 輔助性Τ細胞反應。 10. +如申請專利範圍第6項所述的樟芝子實體水萃取物，其中該樟 芝子實體水萃去物、經由抑制細胞瑪亡作用促進一樹突細胞之活 性。 11. -種萃取自—樟芝子實體水萃取物的樟芝子實體水再萃取 物，具有下列核磁共振圖譜特徵：化學偏移444、446、491、 • 5.00及5.15 ppm處呈現多醣體結構中異位性碳原子(an〇meric carbon)上氫的特徵訊號。 ❹ 20