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TW201000905A - Use of cathepsin C - Google Patents

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TW201000905A
TW201000905A TW098109457A TW98109457A TW201000905A TW 201000905 A TW201000905 A TW 201000905A TW 098109457 A TW098109457 A TW 098109457A TW 98109457 A TW98109457 A TW 98109457A TW 201000905 A TW201000905 A TW 201000905A
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cathepsin
pain
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protein
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TW098109457A
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TWI510784B (zh
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Mathias Gebauer
Martin Michaelis
Danping Ding-Pfennigdorff
Anke M Schulte
Christiane Metz-Weidmann
Original Assignee
Sanofi Aventis
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Publication date
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Description

201000905 六、發明說明： 【發明所屬之技術销域】 ^本發明係有關組織蛋白酶c之用途；本發明其他態樣 係、有關筛述窗藥劑、診斷疼痛敏感性及治療疼痛等方法。 【先前技術】 於西方世界，慢性疼痛係破壞數百萬人民健康及幸福 之重要未解決之健康問題。慢性疼痛對罹患個體之安康造 成嚴重困擾且常伴隨或隨後常導致抑鬱之心理症狀。慢性 疼痛結果產生巨大程度之個人苦惱及社會經濟損失。現行 藥理學上之疼痛療法就效力及安全性而言廣泛地無法令人 滿意。 鑑於與疼痛治療技藝狀況相關之嚴重缺點，業界對於 治療進行中之疼痛、診斷及預知有關慢性疼痛可能進展之 新穎選擇有極大需求。尤其鑑於疼痛神經生物學理解^快 速進展與提供不具治療技藝狀況缺點之有效治療上未令人 滿足之臨床需求間存在巨大差距，業界努力之方向需 發現新穎類別止痛劑之新目標。 此，本發明之目的在於提供開發及供錢類別疼痛 §周節藥物之新穎方法。 此目的藉由使用組織蛋白酶0或其功能性片段或衍生 物以鑑疋§周即疼痛之化合物而獲得解決。 本發明乃基於發明人等令人驚奇之發現，於小鼠 中第-次證明組織蛋白酶C表現與神經性疼痛之疼痛敏感 3 201000905 性密切相關。 在組織傷際疼痛研究齡之界定，係與實際或潛 驗。疼痛通常係傷害所述之不愉快感覺及情感體 一部分，用於皮因此疼痛為身體警告系統之 小。疼痛可^丨發反應使對身體之實際或潛在傷害減至最 #，當;療狀況之初始症狀或為疾病狀況之續發效 應吊不具任何生物學意義。 宝之生、性或慢性。急性疼痛乃表示潛在或實際傷 因而發峰，i伴隨組織傷害、感染、發炎或其他急性病 性疼身體受傷或功能失常後使個體所有警覺。急 右未適當處理，則可能導致慢性疼痛。 it ϋ疼痛係具有不同起因、持續時間、強度與特定症 狀之疾病狀態。 慢性疼痛可能具感痛來源、為炎性或神經性。感痛性 疼痛被_為與對體腔或内臟疼痛敏感的神經纖維之持續活 化相當。神經性疼痛係起因於任何種類之周邊或令樞神經 組織傷害之疼痛；一般相信為持續之周邊神經系統、CNS、 或一者之異常體感過程（疼痛機制之概述參閲例如scholz and Woolf, 2002 ； Julius and Basbaum, 2001, Woolf and Mannion, 1999 ； Wood, J.D., 2000 ; Woolf and Salter, 2000.) ° 不同病患間之慢性神經痛具多變性。最近之數據指 出’個人之疼痛敏感性在個人受痛苦之量上扮演重要角 色，亦即對疼痛（特別是對神經痛之進展）存在重要之遺傳 201000905 體質。本發明乃根據本發明人等於慢性疼痛之齧齒動物模 式中致力於鑑定疼痛敏感性基因（亦即決定於所示、固定程 度組織傷害存在下感覺到之疼痛量之基因）之精深研究。本 發明人等所用之齧齒動物模式及實驗設定考慮到不同個體 間a)可精確地控制神經傷害之性質與一致性及b)遺傳與環 境變異性可減至最小之實驗條件。 組織蛋白酶C (CTSC;替代標題：二肽基(胺基)肽酶卜 〇?卩1;(£0 3.4.14.1))係一種溶酶體蛋白酶。 組織蛋白酶C之基因位點係在染色體Ilql4.1-ql4.3 上（參閱Rao et al·，1997)。組織蛋白酶C之基因體序列可自 公開之NCBI核苷酸資料庫取得，其係歸入：NW_925129 (包含人類組織蛋白酶C序列之基因體序列，SEQIDNO:3) 或NW—001030863 (包含小鼠組織蛋白酶C之基因體DNA 序列）。 編碼組織蛋白酶C之多核苦酸序列可自公開之NCBI 核苷酸資料庫取得，其列入數個登入號碼中，例如： ΝΜ_001814 (智人組織蛋白酶C轉錄本變異體1 mRNA)、 BC113897 (智人組織蛋白酶C之完整編碼序列（c(js)，轉錄 本變異體2，mRNA)、BC109386 (智人組織蛋白酶c， mRNA’完整cds)、NM—009982 (小家鼠組織蛋白酶c mRNA)。熟習此項技藝人士瞭解如何自該ncbI資料庫檢 索組織蛋白酶C進一步之編碼序列（其他物種之組織蛋白 酶C;若存在之組織蛋白酶C之突變體或各種同功型）。下 文中論及組織蛋白酶C編碼序列時，可意指上述任何 5 201000905 mRNA或編碼序列；較佳為，係意指根據索引編號 NM_001814 (人類）（SEQ ID NO: 1)或 NM_009982 (小鼠）之 序列。 組織蛋白酶C之蛋白質序列可自公開之NCBI蛋白質 資料庫取得，例如歸入下述登入號碼：智人(hs):完整cds : CAA6067、AAL48191、AAL48192、AAL38195、 AAH54028、AAQ08887、AAI00893、AAI00894、AAI00892、 AAI00895、AAI09387、AAI10072、AAI13851 ; hs 同功型 CRA—b : EAW59364 ; hs 同功型 CRA_a ： EAW59363 ； hs 組織蛋白酶C同功型a前蛋白原：NP_001805 ; hs同功型 b前驅體：AAI13898或NP_680475。鼠科動物（小家鼠）組 織蛋白酶C : AAH67063 ;前蛋白原：NP_034112 ;同功型 CRA-b (小家鼠）：EDL06796 ;同功型CRA-a (小家鼠）： EDL06795。此外，蛋白質序列可自公開之UniProtKB資料 庫（www.beta.uniprot.org、敗得，登入號碼為：P53634 (人類 —CATC ’ 人類組織蛋白酶 c，SEQ ID NO:2)、或 P97821 (CATC_小鼠，鼠科動物組織蛋白酶c)。下文中論及組織蛋 白酶C蛋白質或胺基酸序列時，可意指上述任何蛋白質序 列；較佳為’係意指根據索引編號P53634 (人類序列）或 P97821 (鼠科動物序列）之序列。 NCBI係生物技術資訊之全國性中心（郵政地址： National Centre for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, US A，網址.wwwjicbi.nhrn.nih.gov)。更多序列（例如帶有 201000905
SwissProt或EMBL登入號碼之序列）可從UniProtKB資料 庫檢索，網址為 www.beta.uniprot.org。 hs組織蛋白酶C之選殖由paris等於1995年發表；鼠 科動物組織蛋白酶C之選殖由Pham等於1997年發表。5' 側邊區域(啓動子/促進子）由Rao等於1997年發表（尤其是 參閱第10263頁圖4及該頁下方之詳細說明，其併入本文 以資參考；例如從-1127開始上達至+ 1之基因序列）。組織 蛋白酶C在肺、腎及胎盤中高量表現，在多種其他器官中 (包括免疫系統之細胞）表現程度較小（Rao et. al., 1997)。 組織蛋白酶C係能自蛋白質基質胺基端移除二肽之溶 酶體蛋白酶。組織蛋白酶C涉及顆粒絲胺酸蛋白酶(彼等於 免疫系統之骨髓衍生之效應細胞中表現)之活化；並涉及T-淋巴細胞顆粒酶A (GZMA)與B (GZMB)及顆粒酶C之處理 (processing)與活化；進一步功能為各種溶酶體組織蛋白酶 之處理、利用移除抑制性N端二肽殘基之各種絲胺酸蛋白 轉(似騰凝乳蛋白酶之絲胺酸蛋白酶)(例如上述顆粒酶、組 織蛋白酶C本身、嗜中性白血球彈性蛋白酶、蛋白酶_3、 肥大細胞凝乳酶與胰蛋白酶）之活化（T〇〇mes et al.，1999, Pham and Ley 1999, Turk et al, 2000, Henningsson et al, 2003 ； McGuire et al., 1993 ； Adkison et al., 2002 ； Wolters et al, 2001 ； Pham et al, 2004 ； DeHaar et al, 2004 ； Sheth et al, 2003，Methotetal.，2007)。其功能通常包括··蛋白酶活性、 肽酶活性例如二肽基肽酶、外肽酶或内肽酶活性；絲胺酸 蛋白酶(例如下述一或多種：彈性蛋白酶、組織蛋白酶G及 7 201000905 顆粒酶A與B、神經胺酸苷酶及因子χπΙ)之活化。 組織蛋白酶C為2〇〇kD四聚體蛋白（paris et吐， 1995) ’與其他組織蛋白酶(例如組織蛋白酶BHL與s) 對照下，為小單體酵素。組織蛋白酶c蛋白質係蛋白前驅 體型，經處理成為具蛋白水解活性之酵素。組織蛋白酶c 之成熟單體型由重鏈、輕鏈及與該活性酵素相關之殘留原 肽（propeptide)組成（Wolters et al.，1998 ; Cigic et al” 2000);四個該等組織蛋白酶c單體形成具蛋白水解活性之 200kD組織蛋白酶C四聚體。 組織蛋白if C基因剔除小鼠①卯丨-基因剔除小鼠)之產 生由Pham與Ley於1999年發表（參閱材料與方法部分， 從第8627至8629頁，尤其是第8627頁右攔下半部至第 8628頁左攔上半部有關Dppi標靶載體之構築及Dppi 小鼠之產生；亦參閱 Heuseletal，1994; Mansouretal” 1988 及 Soriano et al.，1991 ;其中 pham and Ley, 1999 係論及胚 月台幹細胞產生;）。 【發明内容】 、根據本發明之用途得以較狀預防及㈤治療疼痛 尤，是神經性疼痛）之新穎物質。根據本發明之用途包括 二定具有所而特性（亦即降低疼痛感）之化合物以及鑑定具 不為所A之特性（亦即增加疼痛感）之化合物。此外，本 ^谷5午進—步鏗定已確定可用於預防及/或治療任何疾 病或疾病狀態之化合物。於此情形下，本發明可例如用於 8 201000905 排除確定具有有害副作用（亦即增加疼痛感）之活性化合 物：對既定疾病之候選化合物可例如描述其對組織蛋白酶 c之影響（蛋白質及/或核酸、表現及/或功能等）。 擬用於本發明各種態樣之化合物/測試化合物/活性化 合物可為利用生物化學或分子生物方法純化、部分純化、 合成或製造之任何生物性或化學物質或天然產物萃取物。 於本發明各態樣之感覺中被視為具有調節疼痛活性之 化合物可為對組織蛋白酶C諸功能之一者或對細胞中組織 蛋白酶C量（蛋白質或核酸）、對組織蛋白酶c表現、轉錄 後修飾作用（例如N-糖基化作用或處理(例如排外功能部位 之裂離，例如於位置58或61))、單體之寡聚作用、蛋白質 摺疊或活化具影響力之任何物質。 欲達此目的，該物質可調節組織蛋白酶C之任何功能 (例如上文或下文列舉者）。組織蛋白酶C蛋白質活性可利 用該物質予以調節，例如利用直接與組織蛋白酶C多肽/ 蛋白質或其片段相互作用及進行干擾。該物質亦可調節組 織蛋白酶C表現，例如於轉錄（開始、延長、處理等）、轉 錄本穩定性、轉譯層次上；此外其可調節轉錄後修飾作用、 從不具活性至活性型之處理（使前蛋白原型裂離成為三多 肽形成活性單體）及/或使單體寡聚成為四聚體型、以及組 織蛋白酶C之蛋白質摺疊等。該物質可直接或間接發揮上 述效應（間接意指利用對組織蛋白酶C功能/蛋白質活性/表 現等具影響力之天然傳訊級聯進行干擾(正面或負面）等）。 組織蛋白酶C之功能包括上述列舉者，例如蛋白酶活 9 201000905 性；自一或多個蛋白質基質胺基端移除二肽之能力；與一 或多個蛋白質基質特異性地相互作用（蛋白質-蛋白質相互 作用）之能力’例如上述列舉者；裂離及/或活化一或多個 蛋白質基質之能力，例如上述列舉者；處理蛋白質基質之 能力’例如上述列舉者。 組織蛋白酶c之功能通常亦包括組織蛋白酶c蛋白質 或核酸或其片段與其他分子（包括，惟不限於：蛋白質、核 酸、合成分子)相互作用之能力，較佳為有關其與蛋白質基 質相互作用及將其裂離之能力。 於本申請案之名詞中，酵素之基質乃可被酵素修飾之 任何分子。於本發明範圍内，天然存在之基質係相當於彼 等於天然生理或病理環境中存在形式之分子（例如顆勒1轉、 胺酸蛋白酶、GZMA、GZMB)，彼等亦能被各個酵素修飾 疼痛之調節可為減少或增加。 根據與本發明相關組群間之一態樣，可使用級織蛋白 酶c之片段或衍生物。片段可為蛋白質、多肽或多核酉楚 片段。 X欠之 蛋白質或多肽之片段係相較於全長組織蛋白酶C帶有 一或多個終端(n端及/或c端）及/或一、二或多個胺基酸内 部缺失之蛋白質或多肽；片段包括，例如 1 ·其胺基酸鏈中帶有二肽Xaa-Yaa、Zaa-之η端缺失之会 織蛋白酶C片段，尤其當Xaa為Arg或Lys，或Yaa或& 為Pro時除外； 2·其中缺失訊息肽(胺基酸鏈之胺基酸1-24)之組織蛋白酶 201000905 C片段或由胺基酸25-463組成之組織蛋白酶c片段； 3. 包含或由根據SEQ ID ΝΟ··2之胺基酸鏈(二肽基-肽酶j 排外功能部位鏈)位置25-134組成之組織蛋白酶c片段； 4. 其中缺失原肽（胺基酸135-230)之組織蛋白酶C片段； 5. 包含或由二肽基肽酶1重鏈(胺基酸231-394)組成之組 織蛋白酶C片段； 6. 包含或由二肽基肽酶丨輕鏈(胺基酸395_463)組成之組 織蛋白酶C片段； 7. 包含二肽基肽酶丨輕鏈(胺基酸395_463)與重鏈(胺基酸 231-394)之組織蛋白酶c片段； 8. 包含二肽基肽酶1輕鏈(胺基酸395-463)與重鏈(胺基酸 231-394)之組織蛋白酶匚片段。 土 —，述片段之位置參照SEQ Π) N〇:2 ;上述片段之較佳 貫例係有關根據SEQIDNO:2之蛋白質之片段。 、組織蛋白酶C蛋白質之功能性片段乃具有全長蛋白浙 (尤其是如上文列舉者)之至少—或多個功能特性之^ 質之任何片段。 蛋白 f核苦酸之片段係相較於全長基因體或編 終端(5，-及/或巧及/或一、二或多個核“二有 酸或寡㈣酸。組織蛋白酶c核酸之功能： 有王長多核酸(mRNA、基因體或編碼序列)之至少 一或多個魏祕之任何諸。 υ之至乂 組織蛋白酶C之衍生物一詞包含相較 式（尤其是相較於未缺失之根 11 201000905 N02之組織蛋白酶c) 用。組織蛋白酶。 7:二之、，且織蛋白鉍C之修飾作 至少-個，㈣為it射物乃具有未修•蛋白質之 生物。衍生物包括，例力钟性之此蛋白質之任何衍 如核酸域之硫代例如綠或多核糊I定(例 專)、或使多肽或多核苷酸特 1之鍵、、、。乂換 其進入細胞中、 ’、 ¥向特疋細胞或促進 偶聯於細_=、=;^(例如細胞滲紐舰類，鄰位 透、TAT與訊自肽2體，例如以觸足（___a)/滲 或輸入子之配位"八^基^ ;或偶聯於特異性轉運子 用 <任何之絲酸或核苷酸序狀修倚作 ^ 種類之修飾仙（例如化學或生物性修飾作 包含組織蛋白_c諸片段之功能性衍生物。 ㈣樣係有關使用非人類基因選殖動物異源 义、'·且、我蛋白酶C或其功能性片段鑑定或分析調節疼痛 化合物之用途。 非人類動物可為任何非人類動物；較佳為齧齒動物例 如大鼠或小鼠。 基因選殖動物乃其基因體中帶有已謹慎移入之外來 DNA之動物。外來DNA之引入動物基因體中可根據標準 程序進行（參閱例如 Transgenic Animal Technology A Laboratory Handboook. C.A. Pinkert, editor ； Academic Press Inc.，San Diego, California, 1994 (ISBN: 0125571658))。 異源表現一詞係指與宿主生物中正常基因表現不同之 12 201000905 表現（關於所表現基因之穩定狀態程度、量、時序或組織分 佈或關於所表現基因之類型（亦即該基因通常根本不在宿 主中表現)）。異源表現可為構成性或誘導性。適當之誘導 性表現系統為此項技藝中悉知（例如四環素可誘導系統 等）。該生物可為細胞或非人類動物。 根據另一態樣、本發明係有關使用非人類基因選殖動 物異源表現之組織蛋白酶c或其功能性片段作為增強疼痛 敏感性模式系統之用途。 本發明又一態樣係有關使用非人類組織蛋白酶C基因 剔除動物鑑定或分析調節疼痛化合物之用途。 基因剔除生物（例如動物或細胞）係指其中基因之表現 或功能部分或完全缺失及包含基因體以及功能性剔除、可 誘導以及構成性剔除之生物。基因剔除生物之產生為此項 技藝中悉知，用於產生基因剔除生物之細胞或動物亦然。 組織蛋白酶C -基因剔除小鼠之產生見述於Pham and Ley, 1999。 本發明之進一步態樣係有關使用非人類組織蛋白酶C 基因剔除動物作為模式系統以降低疼痛敏感性之用途。 使用異源表現組織蛋白酶C或其功能性片段之細胞鑑 定調節疼痛化合物之用途為本發明之另一態樣。 細胞可為任何原核生物或真核生物細胞，例如能被核 酸載體轉染及能表現報導基因之細胞。彼等主要包括初級 細胞及得自細胞培養之細胞，例如包含衍生自多細胞生物 與組織(例如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3細胞）或單細 13 201000905 胞生物例如酵母（例如裂殖酵母(& p_e)或釀酒酵母 等細胞之真核生物細胞培養物、或原核生物細 胞培養物(較佳為畢赤酵母(乃/β)或大腸桿菌）'。' 彳^生自組 織之細胞與試樣可利用悉知技術取得，例如採血;組穿 刺或外科手術。 根據一具體實例，係使用相較於其未修飾狀態，具有 車父低組織蛋白酶C活性之修飾細胞。以此方式，例如，可 測試欲測試之化學化合物是否可提高或恢復已降低或徹底 被破壞之組織蛋白酶c活性；或可測試該物質是否能於降 低疼痛敏感性狀況下執行其功能（例如疼痛調節或甚至另 一疾病狀態或疾病環境中之功能）。 修飾作用可為導使組織蛋白酶〇活性、組織蛋白酶C 轉錄本穩定狀態程度（亦即利用活化組織蛋白酶c轉錄或 轉錄本穩定化）或組織蛋白酶C蛋白質穩定狀態程度（亦即 利用活化組織蛋白酶C轉譯或其轉譯後處理；利用調節組 織蛋白酶C轉譯後修飾作用或活化其穩定性或抑制其降解) 降低之任何類型之修飾作用（穩定性或短暫性，較佳為穩定 性），此可藉由使用組織蛋白酶C之顯性抑制突變體、反義 券核普酸、組織蛋白酶C之RNAi構築體、利用產生功能 性或基因體組織蛋白酶C剔除（其可為例如可誘導）或此項 技藝内已知之其他適當技術達成。上述技術之綜述可參閱 你J 如：Current protocols in Molecular biology (2000) J.G.
Seidman, Chapter 23, Supplemtent 52, John Wiley and Sons, Inc.； Gene Targeting: a practical approach (1995), Editor: A.L. 14 201000905
Joyner, IRL Press ； Genetic Manipulation of Receptor Expression and Function, 2000 ； Antisense Therapeutics, 1996 ; Scherr et al，2003。 根據一具體實例，係使用組織蛋白酶C基因剔除細 胞。用於產生基因剔除之適當細胞株為此項技藝中悉知， 參閱例如 Current protocols in Molecular Biology (2000) J.G. Seidman, Chapter 23, Supplement 52, John Wiley and Sons,
Inc ;或 Gene Targeting a practical approach. (1995) Ed. A.L.
Joyner, IRL Press。組織蛋白酶C(DPPI)基因剔除細胞之產 生亦發表於Pham and Ley, 1999 (參閱第8628頁，左攔上 半部，DPPI鼠科動物胚胎幹細胞基因剔除選殖株之產生）。 本發明另一態樣係有關使用組織蛋白酶基因剔除細胞 鑑定或分析調節疼痛化合物之用途。 再者，使用組織蛋白酶基因剔除細胞作為降低疼痛敏 感性模式系統之用途乃與本發明相關組群間之另_態樣。 根據本發明另一具體實例，相較於參照細胞(例如呈其 未修飾狀態之相同細胞），細胞可具有較高量之組織蛋白酶 C。由於組織蛋白酶C表現量與疼痛敏感性相關，因此此 細胞系可用於模擬增強疼痛敏感性之狀態。 因此本發明亦有關使用異源表現組織蛋白酶C或其功 能性片段之細胞作為增強疼痛敏感性模式系統之用途。 本發明亦有關使用異源表現可表現地連接於組織蛋白 _ C啓動子及/或促進子或其功能性片段的報導基因之細 胞鑑定或分析調節疼痛之化合物之用途。 15 201000905 報“因測疋法。欲達此目 = 游，俾使於料子載巾㈣擇報導基因上 該構築體引人所選擇宿=:^以表現報導基因。接著將 為此項技藝"===== 準4獻):適當條件為此項： 、 ’土 及舄要之试劑亦市售可得。 菌體==使多 割__擴增及父=(:== 細胞或生物中擴增。表現栽體俾使所關注基因二也= 因)於宿主細胞或生物中異源表現。細胞或生物類型= 決於目的’其選擇隸屬熟習此項技藝者知識範圍之内。用 於擴增核酸之適當生物為例如具有高增殖率之多數單細胞 ，物’例如細菌或酵母。適當之生物亦可為自多細胞組： 單離及培養之細胞，例如自多樣生物產生之細胞株(例如得 自草地黏蟲(Spodo/>ίer<3/r^^/penifl)之SF9細胞等）。適ί#之 選殖載體為此項技藝中已知’可自不同生物科技供應薇商 購得’例如 Roche Diagnostics、New England Biolabs、
Promega、Stratagene等等。適當細胞株可自例如美國菌種 保存中心(ATCC)購得。 就蛋白質或多肽之異源表現而言’細胞可為能被核酸 載體轉染及表現所關注基因（例如報導基因）之任何原核生 16 201000905 物或真核生物細胞；彼等主要包括初級細胞及得自細胞培 養之細胞，較佳為真核生物細胞培養物包括衍生自多細胞 生物與組織之細胞（例如HEK293、RIN-5F、HeLA、CHO、 cos、SF9或3T3細胞）或單細胞生物例如酵母(例如裂殖酵 母或釀酒酵母）、或原核生物細胞培養物（較佳為畢赤酵母 或大腸桿菌）。衍生自組織之細胞與試樣可利用悉知技術取 付’例如採血、組織穿刺或外科手術。 ^於本申請案說明書中’「轉染」一詞係指將核酸載體引 入宿主細胞(原核生物或者真核生物細胞）中，因此包含「轉 形」一·詞。 轉染可為穩定或短暫轉染。 組織蛋白酶C啓動子為組織蛋白酶C基因之_部分， 若將其引入基因產物編碼序列適當表現載體上游，動 所關注基因產物表現。較佳為，組織蛋白酶c啓動子包八 =據如Rao et a1.，1997第10263頁圖4發:之核ί: 所組成。組織蛋白酶c啓動子之功能性片 二二右入基因產物編碼序列適當表現载體上游，能 所關注基因絲表狀喊蛋白紅軸子之=動 ^佳片段包括如Rao et al” 1997 第10263頁圖4 ^表 織蛋白酶C料子之功鎌諸。 表之組 用於可為得以容^量其基因產物之任何基因。 測方:物或原核生物宿主之各式各樣報導基因以及於 括例如V?試縣此項技藝巾已知及市f可得。彼等ΐ Ρ内醯胺酶(lacZ)、蟲螢光素酶、綠或藍螢光蛋白 201000905 (GFP 或 BFP)、DsRed、HIS3、URA3、TRP1 或 LEU2 或 β 半礼糖㈣等之基g。彼等基因編碼可·看得見(顏色或 螢光)之反應容易地予以檢測之蛋白質（例如laeZ、蟲營光 素酶）；包括可利用看得見(顏色或螢光)之反應容㈣予以 檢測之基目產物絲現時賦予對例如胺$青彳时錢徽素 (Kanamycin)等抗生素之抗性之基因產物。其他報導基因產 物使得表現之細胞於特定條件下生長，例如營養缺陷型基 因。 報導基因之功能性片段為得以容易定量其基因產物之 既定報導基因之任何片段。 於本申請案說明書中，「轉染」一詞係指將核酸載體引 入宿主細胞(原核生物或者真核生物細胞）巾，因此包含「轉 形」一詞。 轉染可為穩定或短暫轉染。 細胞可為能被核酸載體轉染及表現報導基因之任何原 核生物或真核生物細胞；彼等主要包括初級細胞及得自細 月匕σ養之、田胞’車父佳為真核生物細胞培養物包括衍生自多 -田月l生物與:且織之細胞(例如j_jeLA、、仰9或 3T3細胞）或單細胞生物例如酵母(例如裂殖酵母或釀酒酵 =)、或原核生物細胞培養物（較佳為畢赤酵母或大腸桿 i) °衍生自組織之細胞與試樣可利用悉知技術取得，例如 採血、組織穿刺或外科手術。 於本發明上述態樣之說日轉巾，對照㈣可為包含報 ¥基因或其功能料段，惟其中報導基因表現不被(功能性） 18 201000905 組織蛋白酶c啓動子驅動之任何適當載體；此可例如意謂 4報^基因或其功心段未操作性地偶聯於功能性組織 蛋白酶C啓動子（亦即或為完全缺乏組織蛋白酶c啓動 子、包合非功能性組織蛋白酶c啓動子或啓動子片段、或 其中啓動子與報導基因之偶聯不具功能性）。另—可能性為 報導基因或其功此性片段倍、操作性地偶聯於另—啓動子而 非組織蛋白酶c啓動子(例如SV4G或另—標準啓動子)。功 能性載體及對照載體亦可被轉染至相同細胞，惟於此情形 下’報導基因必須不同。 根據上述用途之化合物之鑑定可例如根據如下文敘述 或如此項技藝中已知之測定法進行。 A測定法為監測生物程序之任何類型分析方法或系統。 適虽地，代表部分生理代謝路徑以及病理狀況之分子級聯 與機制係於細胞或生化(試管内）系統中複製。潛在醫藥劑 化合物之藥理活性因此亦根據其干擾或調節彼等級聯或機 制之能力予以測定。 用於藥物篩檢，尤其是新穎醫藥化合物之高速篩檢 時，該測定法必須可再現及較佳為亦具可擴展性及穩健 性。於本發明範圍内，高速篩檢意指根據本發明方法係呈 極小規模進行，例如於96、386或1536槽盤上，試樣容積 小至呈數毫升至數奈升(nan〇liters)不等或甚至更少。因 此，可於短時間内進行極大量試樣之分析。高速量篩檢通 常包括利用單一測定法針對特定能力篩檢大約5〇〇 〇〇〇個 不同化合物。該測定法較佳為適用於高速篩檢化學物質調 19 201000905 節研究中之標靶分子活性之能力。測定法之類型取決於例 如所用標靶分子（例如多肽或多核苷酸）之類型及「讀數 (read out)」，亦即據以測定標靶分子活性之參數（參閱下 文）。 不同類型之此等測定法通常為此項技藝中已知及可向 市面上之供應商購得。 供不同目的之適當測定法包括放射性同位素或螢光測 定法’例如螢光極化測定法(例如由panvera市售供應者) 或 Packard BioScience (HTRF ; ALPHAScreenTM)，係用於 測量標記成員與未標記成員之相互作用（例如標記蛋白與 其未標記蛋白-配位體之相互作用）。 更夕貫例包含細胞系測定法，其中細胞株穩定地（可誘 導與否；染色體性或游離基因體性）或短暫地表現所關注之 重組蛋白。彼等測定法包括例如報導基因測定法，其中訊 息轉導級聯成貝之特定啓動子或訊息轉導雜之調控係根 據報導子酵素之活性測定，其表現在轉定啓動子^制 下。針對此類測定法，必須構築含有於其本身被研究$被 所研九傳況級聯调控之界定啓動子控制下的報導基因之重 組細胞株。適當之報導子酵素通常為此項技藝中已知及勹 括螢火蟲蟲螢光素酶、水母蟲螢光素酶（例如市售可得= Packard試劑）、β_半乳糖苷酶。適當細胞株視測定、去之目 的而定’惟包括容易轉染及容易培養之多數細胞株 HeLA、COS、CHO、ΝΙΗ-3Τ3 等。 關於測定蛋白酶活性，已知之典型蛋白酶測定方式如 20 201000905 下：例如使用於基質之一部位帶有報導子標記（例如發光/ 螢光或其他訊息發射蛋白/肽或實體）及於另一部位帶有抑 止子（實體（例如只要該基質完整/未裂離，即能抑制報導子 標記之訊息發射之另一肽））之基質；於適當條件下使基質 與組織蛋白酶c 一起培養，俾使由於抑止子與報導子標記 分離引致基質裂離而導使發射可檢測訊息（例如光發射）。 其他類型測定法及其他類型之「讀數」為此項技藝中 悉知。 根據本發明之測定法係有關： 鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，該方 法包括下述步驟： a. 提供至少兩個試樣； b. 使含有組織蛋白酶C或其功能性片段或衍生物之 一試樣與化合物接觸； c. 於化合物存在下，測定組織蛋白酶C之活性； d. 於化合物不存在下，測定組織蛋白酶C之活性；及 e. 比較根據c)與根據d)之組織蛋白酶C活性； 鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，包 括： a. 使組織蛋白酶C蛋白質或其功能性片段或衍生物與 測試化合物接觸；及 b. 測定該測試化合物是否調節組織蛋白酶C蛋白質或 其功能性片段或衍生物之活性； 鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，包 21 201000905 括： a. 使具有可檢測之組織蛋白酶C或其功能性片段或衍 生物量或活性之細胞與測試化合物接觸；及 b. 測定該測試化合物是否能調節存在該細胞中之組織 蛋白酶C或其功能性片段或衍生物之量或活性； 鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，包 括： a. 於具轉錄活性之系統中使編碼組織蛋白酶C蛋白質 或其功能性片段或衍生物之核酸與測試化合物接 觸；及 b. 測定於該測試化合物存在下，存在該系統中之編碼 組織蛋白酶C蛋白質或其功能性片段或衍生物之 mRNA之量；及 c. 測定該化合物是否能於該系統中調節編碼組織蛋白 酶C蛋白質或其功能性片段或衍生物之mRNA之 量° 具轉錄活性之系統為至少具有執行轉錄單元之轉錄反 應能力之任何生化或細胞系統。此等系統為此項技藝中悉 知及包含市售可得之細胞以及試管内轉錄系統或套組（例 如以細胞卒取液為基礎者）。 鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法包括： a.提供被包含操作性地偶聯於報導基因或其功能性片 段之組織蛋白酶C或其功能性片段啓動子之核酸載 體轉染之細胞； 22 201000905 b. 提供被包含未操作性地偶聯於功能性組織蛋白酶C 啓動子之報導基因或其功能性片段之對照載體轉染 之細胞； c. 於測試化合物存在下，測定根據a)與b)之細胞之報 導基因活性； d_於測試化合物不存在下，測定根據a)與b)之細胞之 報導基因活性。 鑑定或分析調節疼痛化合物之方法包括： a.選定調節組織蛋白酶C活性之化合物作為測試化合 物； b ·投與具疼痛感之病患該測試化合物以確定疼痛是否 被調節。 鑑定或分析調節及/或預防病患疼痛化合物之方法，包 括： a. 於一或多種測試化合物存在下測定組織蛋白酶C或 其功能性片段或衍生物之生物活性以鑑定調節組織 蛋白酶C生物活性之一或多種調節化合物；及 b. 測試該一或多種調節化合物減少病患疼痛、疼痛感 或疼痛敏感性之能力。 本發明之進一步態樣係有關將病患組群分類及協助醫 師適應/改進其治療個別病患之藥物基因體方法，例如： 分析個體疼痛閥值之方法包括分析該個體採樣中組織蛋白 酶C之量相較於一或多個參考試樣，是否存在該試樣中之 組織蛋白酶C mRNA及/或蛋白質之量與一或多個參考試 23 201000905 声若較高量表示該個體疼痛敏感性增加’存在 1 乂低里表不疼痛敏感性降低； S防及/或冶療個體疼痛之醫藥_量之方法，該 醢V'xr檢測個體採樣有關是否存在該試樣中之組織蛋白 $ A及7或蛋白質之量與一或多個參考試樣不同，讀 =見存在個體採樣中蛋白質及,或m顏之量是否輿： ii:酶樣Ϊ同而調整;其中個體採樣中較高量之級 蛋白酶^要較高劑量，個體採樣中較低量之技織 1白扭C表不需要較低劑量。 ，文所用之r採樣」一詞係指自一或多個個體（人 嘴俨二員：物)身體取得’分離之生物試樣。生物材料及生： i二或器官(例如腦、血液、肝、牌、 細胞，較佳括人類；亦包括得自細胞培養之 盥组^ 胞培養物包括衍生自多細胞生物 …沖、、田胞（例如HeLA、CHO、cos、SF9或 ^:生物例如酵母(例如裂殖酵母或釀酒酵:胞) =i=;rf:組織之細胞與試樣可利= 或組織萃取物之製傷為熟 如下文列舉之標 V文獻勢人士悉知(亦參閱例 >考试樣」—詞係指具有已知既定㈣表現型之得 201000905 自-或多個個體之生物試樣—㈣營内生物試樣(例如 源自試管内細胞或組織培養之試樣(例如培養細胞)），其於 特定特性上(例如纽織蛋㈣c活性、量絲現程度)與 既定疼痛表現型（例如高疼痛敏感性或低疼痛敏感性 致。 〜 本發明又一態樣係有關使用檢測組織蛋白酶c之工具 測定增強個體疼痛敏感性之用途，其藉由分析取自欲檢測 個體之生物試樣。 檢測組織蛋白酶C之工具可為能特異性地檢測存在生 物試樣中之組織蛋白酶C多肽/蛋白質或核酸之任何工具。 特異性地檢測組織蛋白酶C蛋白質或多肽之工具可為 月特異性地檢測任一野生型組織蛋白酶c蛋白質/多狀之 任何工具及亦可為特異性地檢測相較於野生型多肽/蛋白 質，帶有有關大小或胺基酸序列之一或多個突變之組織蛋 白酶C蛋白質/多肽之工具。此等工具之較佳實例為例如用 於免疫組織學或免疫組織化學技術之能特異性地檢測組織 蛋白酶C蛋白質之抗體(例如組織學組織切片中之組織蛋 白酶C蛋白質或其特定突變之檢測或固定於適當載劑如 膜、晶片（chips)、ELISA盤等上之組織蛋白酶C蛋白質之 檢測）。組織蛋白酶C抗體為市售可得，例如Goat Anti-Human Cathepsin C, Catalog# AF1071, R&D Systems (Minneapolis, USA)'Goat Anti-Mouse Cathepsin C, Catalog# BAF1034, R&D Systems (Minneapolis, USA) o 特異性地檢測組織蛋白酶C核酸之工具可為例如檢測 25 201000905 野生型亦或相較於野生型組織蛋白酶c核酸帶有有關其長
度或其核酸序列之一或多個突變之組織蛋白酶C mRNA /cDNA或基因體DNA之工具。彼等工具可為例如特異性 地檢測及/或定量組織蛋白酶C mRNA [較佳為包含或為能 擴增組織蛋白酶C DNA或例如用於PCR定序（用於檢測核 苦酸序列中之突變）或能擴增組織蛋白酶C cDNA，例如用 於RT PCR (用於檢測及/或定量組織蛋白酶匚表現） 之特異性組織蛋白酶C核酸探針或引子組]之工具。另外之 工具可為例如於標準條件下能特異性地與組織蛋白酶c mRNA或cDNA雜交（例如用於北方墨點法或晶片雜交技術) 之核酸探針。 野生型一詞係指於自然界中發現或於標準實驗室貯存 之既疋生物之基因型或表現型。根據一較佳具體實例，組 織蛋白酶C之野生型序列為根據SEQIDNOs: 1、2、3之 序列。 適當引子之設計與合成為此項技藝中悉知（亦參閱上 文）。根據本發明之較佳具體實例，該工具為用於擴增組織 蛋白酶C核酸(例如人類組織蛋白酶c核酸)之引子組，較 佳為含有至少一個根據SEQ ID No.4及/或5的引子之引子 組。 根據本發明之進—步較佳具體實例，該工具為用於檢 測組織蛋白酶C核酸之探針，較佳為具有根據SEQ ID No.6 之序列之探針。適當探針之設計與合成為此項技藝中悉知 (亦參閱下文之標準文獻）。 26 201000905 根據本發明之又另一較佳具體實例，該工具為用於特 異性檢測組織蛋白酶c蛋白質或多肽之抗體。適當抗體或 其功能性片段之製備亦為此項技藝中悉知，例如以組織蛋 白酶C蛋白質或其片段對哺乳動物(例如兔子），適當時於 例如弗氏佐劑（Freund’s adjuvant)及/或氫氧化鋁凝膠存在 下，進行免疫處理（參閱，例如Diamond，B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine : 1344-1349)。免疫反 應結果於動物中形成之多株抗體隨後可使用悉知方法自血 液中分離及，例如，利用管柱層析法予以純化。單株抗體 可，例如’根據Winter & Milstein之已知方法（Winter, G. & Milstein，C. (1991) Nature, 349, 293-299)製備。製造單株抗 體之適當程序亦為此項技藝中悉知（參閱例如下文列舉文 獻之標準方法）。於本發明說明書中，抗體或抗體片段一詞 亦包含經重組製造及適當時經修飾之抗體或其抗原結合部 分，例如嵌合型抗體、人類化抗體、多功能抗體、雙特異 性或寡特異性抗體、單股抗體及F(ab)4 F(ab)2片段(參閱， 例如，EP-B1-0 368 684、US 4,816,567、US 4,816,397、WO 88/01649、WO 93/06213 或 WO 98/24884)。 本發明另一態樣係有關用於測定個體疼痛敏感性之診 斷套組，該測試套組包含用於檢測生物試樣中之組織蛋白 酶C之至少一種工具。 於本發明說明書中，測試套組欲被瞭解為係本申請案 中鑑定之諸成分之任何組合物，彼等成分於空間共存成為 功能性單元及可含有進一步成分。 27 201000905 於本發明說明書中，測試套組包含用於檢測生物試樣 中之組織蛋白酶c (例如量/或突變)之至少一種工具，適當 地連同用於進行檢測反應（例如利用抗體之組織蛋白酶c 之免疫檢測、用於測定組織蛋白酶C活性之酵素反應等） 之適當缓衝劑及/或試劑、及/或試樣製備、與視需要之進行 各個檢測技術之操作手冊。 本發明之其他態樣係有關諸治療方法，例如： 一種用於治療罹患疼痛病患之疼痛之方法，該方法包 括投與該病患治療有效量之降低該病患之組織蛋白酶c量 或活性之組成物。此可為組織蛋白酶c全部量或活性或特 定組織例如神經組織、淋巴組織或免疫系統細胞例如肥大 細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、T-細胞（例如CD8+ T-細 胞）等中之量或活性；其中治療有效量包括足以改善個體之 疼痛感或敏感性之量。 本發明又另一態樣係有關降低病患之疼痛敏感性之方 法’该方法包括投與該病患治療有效量之降低該病患之組 織蛋白酶C之量（例如表現、半衰期）或活性(例如於免疫系 統中之淋巴或神經組織或細胞中）之組成物。 此外，本發明係有關調節非人類雌性對象之後代之疼 痛敏感性之方法，該方法包括轉移（例如電穿孔）賦與調節 組織蛋白酶C表現之核酸至接合子中，轉移該接合子至非 人類育雛母體中，及根據其組織蛋白酶c表現特性(相較於 野生型病患，例如小鼠，表現較低或徹底破壞之組織蛋白 酶C)挑選後代。 ' 28 201000905 本發明另一態樣係有關能降低組織蛋白酶c活性及/ 或表現以治療疼痛之化合物。 、、且、哉蛋白_ c之抑制劑為此項技藝中已知，例如肽腈 抑制劑（參閱例如Methotetal.，2007，此文獻併入本文以資 參考，苓閱尤其是第20839頁圖1有關不同組織蛋白酶c 抑制劑之結構，例如Gly_Phe_DMK、Gly4 (I)phe 及 該圖之化合物1*與化合物2*)。 關於藥劑之製造，本發明組織蛋白酶c之調節劑視投 與種類而定，可與適當添加劑或輔助物質例如生理緩衝液 (如氯化納溶液）、脫礦質水、安定劑(例如蛋白酶或核酸酶 抑制劑，較佳為抑肽酶、ε _胺基己酸或胃蛋白酶抑制素a ) 或分離劑例如EDTA、凝膠調配劑例如白凡士林、低黏性 石蝶及/或黃蝶等一起調配。 週虽之f加劑為，例如，去垢劑舉例而言如 Triton謂或去氧膽酸納、以及多元醇舉例而言如聚乙二 醇或甘油、糖類舉例而言如蔗糖或葡萄糖、兩性離子化合 物舉例而言如胺基酸例如甘魏或特別是牛或甜菜ς 及/或蛋白質舉例而言如牛或人類血清白蛋白；以去垢劑、 多元醇及/或兩性離子化合物較佳。 生理缓衝液較佳為具有約6騎0 < ρΗ，尤其是約 ⑻·8之二’特別是約7·4<ρΗ’及/或約鳳4渗 量/公升，較佳為約彻姻毫渗量/公升^之 ΡΗ通常使用適當有機或無機緩衝劑調整，舉例而言樂::之 較佳為使用妓舰賴、tds緩_⑷ 29 201000905 烷）、HEPES緩衝劑（[4-(2-經乙基)旅畊基]乙磺酸）或M〇ps 緩衝劑（3-嗎啉基-1-丙磺酸）。各個缓衝劑之選擇通常取決 於所需之緩衝劑莫耳濃度，例如，磷酸鹽緩衝劑適當用於 注射及輸注溶液。 藥劑可以習知方式投與，例如使用口服劑量型舉例而 言如錄:劑或膠囊、經由黏膜例如鼻腔或口腔、呈埋置於皮 膚下之貯劑（dispositories)型、使用含根據本發明藥劑之注 射液、輸注液或凝膠；進一步亦可進行藥劑之局部投與以 治療如上述之特定關節疾病（適當時，呈脂質體複合物之形 式）；再者，可利用得以經時控制釋放藥劑之經皮治療系 (TTS) ; TTS 可自例如 EP 0 944 398 Al、EP 0 916 336 A1、 EP 0 889 723 A1 或 EP 0 852 493 A1 得知。 注射液通常於只需投與（身體)相當少量溶液或懸浮液 (例如約1至約20毫升）時使用。輸注液通常於欲投與大量 溶液或懸浮液(例如1公升或1公升以上）時使用。由於相 較於輸注液，於注射液情形下僅投與數毫升，因此注射中 血液或組織液pH及滲透壓之微小差異就疼痛感而言並不 顯著’或僅為無足輕重之程度；因此，使用之前通常不需 要稀釋根據本發明之調配劑。然而，於投與相當大量之情 形下’則必須於投與之前稀釋根據本發明之調配劑到至少 獲得大約等張溶液之程度。等張溶液之實例為0.9%強度之 氣化鈉溶液。於輸注之情形下，稀釋可例如使用無菌水進 行而投與可例如經由所謂分流術(bypass)進行。 根據本發明不同態樣之一較佳具體實例，可使用組織 30 201000905 蛋白酶c，其衍生物或片段作為單離分子。 於本發明說明書中，尤其是有關組織蛋白酶c之「單 離分子」一詞係指自天然來源純化之組織蛋白酶C多核苷 酸或多肽以及純化之重組分子（其中純化一詞包含部分純 化以及完全純化）。 重組多肽或多核苷酸分子之製備與得自細胞或組織之 天然存在分子之純化，以及細胞-或組織萃取物之製備為熟 習此項技藝人士悉知（亦參閱例如下文列舉之標準文獻）。 彼等包括例如根據所公告基因體或編碼多核苷酸序 列，經由聚合酶連鎖反應(PCR)擴增所需長度之多核苷酸； 接著於宿主細胞中選殖所製造之多核苷酸（參閱例如下文 列舉之標準文獻）。 於本發明說明書中，「多肽」一詞係指由利用肽鍵結互 相結合之胺基酸組成之含有至少50個胺基酸呈線型模式 互相連接形成多肽鏈之分子；此類型之較短分子稱為肽 類。「蛋白質」一詞係指含有至少一個多肽鏈之分子惟亦指 含有相聯或互相結合之一個以上多肽鏈之分子。因此，「蛋 白質」包含「多肽」。 茲於下文利用實例更詳細說明本發明，惟彼等實例不 擬構成偈限。 【實施方式】 實例： 材料與方法. 31 201000905 所用小鼠品系： 使用五種不同之近親交配小鼠品系：AKR/J (AKR)、 CBA/J (CBA)、C3H/HeJ (C3H)、C57BL/6J (B6)與 C58/J (C58)。小鼠係得自 The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)。彼等小鼠品系被證實於有關數種活體内疼痛之測量 上明顯不同（Mogil et al 1999)。 總RNA單離： 根據廢商操作指南，使用PicoPure™ RNA Isolation Kit (Arcturus)，從DRG (背根神經節）單離總RNA。使用2100 Bioanalyze 及 RNA 6〇00 Nano LabChip™ 套組(Agilent)評估 RNA品質。
Affymetrix GeneChipTM 微陣列： 根據廠商之操作指南，使用500奈克根據Baugh, L.R, Hill, A.A., Brown, E.L. and Hunter, C.P. (2001) Nucleic Acids Res. 29, e29 之具 l〇〇pM T7-(dT)24 寡聚物 (GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC GG-dT24 SEQ ID NO:4)之總 RNA 與 Superscript II 反轉錄酶 進行第一股cDNA合成。合成雙股cDNA，然後使用苯酚_ 氯仿萃取，隨後進行乙醇沉澱步驟。根據廠商之操作指南，
以該雙股 cDNA 試樣’使用 BioArray High Yield RNA
Transcription Labeling套組(Enzo)進行試管内轉錄反應。於 37°C培育該轉錄反應16小時。使用純化RNA用之 RNeasy™ Mini套組(Qiagen)實驗流程純化cRNA並以分光 光度計定量。使用RNA段裂化緩衝液(200mM Tris-乙酸 32 201000905 鹽，500mMKOAc，150mMMg〇Ac，ρΗ8·1)段裂化生物素 -標記cRNA。根據廠商之操作指南，進行小鼠基因體43() 2 〇
GeneChipsTM(Affymetrix)之雜交及染色。使用 GeneChip™ 3000 Scanner掃瞄微陣列，輸入掃瞄數據，使用Res〇lver v5.1表現數據分析軟體(Rosetta Bi〇s〇ftware)進行分析。 L5脊髓神經橫斷及模擬手術程序： 暴露麻醉小鼠之左L5脊髓神經，然後移除部分橫突 (transverse process)。與L4脊髓神經分離後，將乙5脊髓神 經橫斷。模擬手術與L5脊髓神經橫斷手術相同，然而， L5脊髓神經未橫斷(參閱DeLe〇 et 2〇〇〇)。 爪退縮疼痛閥值之測定: 使用疏觸覺測定儀（參閱Szabo et al. 2005)評估爪退縮 疼痛閥值(PWTs)。於金屬、網眼地板隔間適應環境後，將刺 激物（stimulator)置於動物後爪下方，卩由電動式促動器驅 動之平直金屬絲接觸絲面，施加逐漸增強之力度至動物 移開其爪為止（爪退縮疼痛閥值，pWTp針對同側、手術 側及對侧之後爪評估而。每隻動物—種情況只用一次。 所有動物實驗均遵守有意識動物研究之道德指導方針，諸 程序均為當地道德委員會認可。 相關性分析： 進行相關性分析時，界定各神經_橫斷動物（鍾氏動 物，Chung animal)之「疼痛表現型」為〇 —幻，其中c卜 In(同側PWT/對側PWT)1 S1 =平始 巧相同品系所有模擬動物1γι( j貝ij pwt/對側 pwt)。 33 201000905 ,界疋各鍾氏動物及根據其強度表現數據之 差別轉錄驗之二測量。使用於解析料現 = 相同品系 量」？姆算特定基因及鍾氏動物之「比车 ㈣C2〜鍾氏動物表現強度平均 所有棋擬動物 模擬表現強度。 計异相雜之w ’過縣目組以排除純在雜訊桿準 (noise leVd)以下且無顯著（Chung vs sham，鍾氏動物％ 模擬動物）調控之基因。合格之基因必須於至少6〇%絕對差 異倍數(fold-change) =>L5之鍾氏動物中或於至少2〇%絕 對差異倍數=>2.0之鍾氏動物中被調控。而且，由各別強 度p-值< 0.001之相對基因表現必須於至少五隻動物中可 檢測（「呈現」）。 使用R套裝軟體(http://www.r-proiect.orp/、計算各基因 於疼痛表現型記分與所界定轉錄調控測量之一者間之 Pearson相關性係數。據此，依照Storey et al. (2〇〇2)之方法 產生統計顯著性之p-值與對應之錯誤發現率（FDRs)。於「比 率對數值測量」或「強度測量」下FDR< 0.05之基因被視 為顯著相關。 參考文獻
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Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 545 pp ；
Current Protocols in Molecular Biology; regularly updated, e.g. Volume 2000; Wiley & Sons, Inc; Editors: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert Eg. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl.
Current Protocols in Human Genetics; regularly uptdated; Wiley & Sons, Inc; Editors: Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R. Smith.
Current Protocols in Protein Science; regularly updated; Wiley & Sons, Inc; Editors: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield.
Molecular Biology of the Cell; third edition; Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D.; Garland Publishing, Inc. New York & London，1994 ;
Short Protocols in Molecular Biology, 5th edition, by Frederick M. Ansubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston (Editor), David D. Moore (Editor), J.G. Seidman 39 201000905 (Editor), John A. Smith (Editor), Kevin Struhl (Editor), October 2002, John Wiley & Sons, Inc., New Yorku
Transgenic Animal Technology A Laboratory Handboook. C.A. Pinkert, editor; Academic Press Inc., San Diego, California, 1994 (ISBN: 0125571658)
Gene targeting: A Practical Approach, 2nd Ed., Joyner AL, ed. 2000. IRL Press at Oxford University Press, New York
Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A, Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R., 2003, Cold Spring Harbor Press, New York ；
Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17 Edition, 1985 (for physiologically tolerable salts (anorganic or organic), see esp. p. 1418) 實驗室方法標準文獻： 除非未另行指示，否則實驗室方法係或可根據下述標 準文獻中列舉之標準方法進行：
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 545 pp or Current Protocols in Molecular Biology ；
Current Protocols in Molecular Biology; regularly updated, e.g. Volume 2000; John Wiley & Sons, Inc; Editors: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert Eg. Kingston, David D. Moore, 40 201000905 J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl.
Current Protocols in Human Genetics; regularly uptdated, e.g. Volume 2003; John Wiley & Sons, Inc; Editors: Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R. Smith.
Current Protocols in Protein Science; regularly updated, e.g. Volume 2003; John Wiley & Sons, Inc; Editors: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield.
Molecular Biology 〇f the Cell; third edition; Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D.; Garland Publishing, Inc. New York & London, 1994 ；
Gene Targeting: a practical approach (1995), Editor: A.L. Joyner, IRL Press
RemingtoiTs Pharmaceutical Sciences, Edition 17, 1985。 【圖式簡單說明】 圖1 .組織蛋白酶c-相關性作圖 與圖1頦不每一各別小鼠之神經性疼痛表現型（機械式痛 見過敏’ X-轴）與L5 DRG中組織蛋白酶C之對應基因調控 (比率對數值(鍾氏動物vs.模擬對照組），Υ—軸）。小鼠數據 根據所用品系進行顏色編碼。進行Pew·相關性分析後 41 201000905 顯示疼痛表現型及組織蛋白酶c基因調控二參數間之顯著 正相關性，此意§胃就各別小氣而言，於鍾氏手術神經性小 鼠中組織蛋白酶C之L5 DRG表現愈高，則於行為測試中 展現更顯著之機械式痛覺過敏。此顯著相關性指出組織蛋 白酶C基因表現於誘發神經性疼痛表現型上之因果關係。 圖2:組織蛋白酶C-強度數據 品系AKR、CBA與C57之各別小鼠於鍾氏手術或模 擬手術後L5神經節中組織蛋白酶c表現之絕對值。 圖3 :利用Affymetrix探針組1416382—at (小鼠基因體430 2.〇微卩車列）所檢測之小鼠組織蛋白酶C mRNA片段(SEQ ID NO.7) 圖4:根據NM—001814之組織蛋白酶CcDNA序列（SEQID NO.l) 圖5 ··根據Swiss-Prot人類—CATC P53634之組織蛋白酶c 蛋白質序列（SEQ ID NO.2) 圖6 :用於檢測根據SEQ ID NO. 1之人類組織蛋白酶c cDNA 之引子組(SEQ Π) NOs 4 與 5) 圖7 .用於檢測小鼠組織蛋白酶C cDNA之探針(SE〇仍 N0.6) 42 序列表 <110> sanofi-aventis <120>组織蛋白酶C之用途 <130> IS2008/026 <150> 08290285.9 <151> 2008-03-26 <160> 6 <170> Patent In version 3·3 <210> 1 <211> 1924 <212> DNA <213>智人 <400> 1 egtagetatt tcaaggcgcg cgcctcgtgg tggactcacc gctagcccgc agcgctcggc ttcctggtaa ttcttcacct cttttctcai ctccctscag catgggtgct gggccctcct tgctgctcsc cgccctcctg ctgcttctct cc£gcgac££ cgccgtgcgc tgc^acacac ctgccaactg cacctatctt gacctgcteg gcacctgggt cttccag^tg ggctccagcg gttcccagcg csatgtcaac tgctcggtta tgggaccaca agaaaaaaaa gtastggtgt accttcagaa sctggataca scatatgatg accttggcaa ttctggccat ttcaccatca tttacaacca aggetttgag att£tgtt£a atgactacaa stggtttgcc ttttttaagt ataaagaaga gggcagcaas gt£accactt actgcaacga gacaatgact gggtgggtgc atgatgtgtt sggccggaac tgggcltgxt tcaccggaaa gaaggtggga actgcctctg agaatgtgta tgtcaacata gcacacctta agaattetea ggaaaastat tetaatagge tctacaagta tgatcacaac tttgtgaaag ctatcaatgc cattcagaag tcttggactg caactacata cats^aatat gagactctta ccctgggaga tatgattagg aeaagtg£tg gc^cacagtcg aaaaatccca aggcccaaac ctgcaccact gactgctgaa atacagcaaa agattttgca tttgccaaca tcttgggact £gagaaatgt tcat^gtatc aattttgtca gtcctgttcg aaaccaagca tcctgtssca sctsctactc atttgettet atssgtatgc tagaagegag aatcegtata ctaaccaaca attctcagac cccaatccta agccctcagg assttgtgtc ttgtagccag tatgctcaag gctgtgaagg cgecttccca taccttattg caggaaagta cgcccaagat tttgggctg£ t£gaagaagc ttgcttcccc tacacaggca ctsattctcc atscaaaatg aag^aagact gctttcgtta ttactcctct gagtaccact atgtagga£g tttctatgga sgctgcaatg aagccctgat gaagettgas ttg£tccatc atgggcccat ggcagttect tttsaaetat atgatgaett cctccactac aaaaag^gga tctaccacca cactggtcta agagaccctt tcaacccctt tgagctsact aatcatgctg ttctgctt£t g££Ctatfi£C actgactcas cctctgggat g£attactg£ attgttaaaa acagctgggg caccg^ctsg ggtgagaatg gctacttccs gatccscaga ggaact^atg agtgtgcaat tgagageata gcagtggcag ccacaccaat tcctaaatts tagggtatsc cttccagtat ttcataatga tctgcatcas ttgtaaaggg gaattg^tat attcacagac tgtasacttt cagcagcaat ctcagaagct tacaaatasa tttccatgaa gatatttgtc 第1頁 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1924 ttcagaatta aaactgccct taattttaat atacctttca atcggccact ggccattttt ttctaagtat tcaattaagt gggaattttc tggaagatgg tcagctatga agtaatagag tttgcttaat catttetaat tcaaacatgc tatatttttt aaaatcaatg tgaaaacata gacttatttt taaattgtac caatcacaag aaaataatgs caataattat caaaactttt aaaatagatg ctcatatttt taaaataaag ttttaaaaat aactgcaaaa aaaaaaaaaa aaaa <210> 2 <211> 463 <212> WT <213>智人 <400> 2
Met Gly Ala Gly Pro Ser Leu Lea Lea Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15
Scr Gly Asp Gly Ala Val Arg Cys Asp Thr Pro Ala Asn Cys Thr Tyr 20 25 30
Leu Asp Leu Leu Gly Thr Trp Val Rie Gin Va丨 Gly Ser Scr Gly Scr 35 40 45
Gin Arg Asp Val Asn Cys Scr Val Met Gly Pro Gin GIu Lys Lys Val 50 55 60
Val Va! Tyr Leu Gin Lys Leu Asp Thr Ala Tyr Asp Asp Leu Gly Asn 65 70 75 80
Ser Gly His Phe Thr lie lie Tyr Asn Gin Gly Phe Glu lie Val Leu 85 90 95
Asn Asp Tyr Lys Trp Phe Ala Fhe Phe Lys Tyr Lys Glu Glu Gly Scr 100 105 110
Lys Val Thr Thr Tyr Cys Asn Glu Thr Met Thr Gly Trp Val His Asp 115 120 125
Val Leu Gly Arg Asn Trp Ala Cys Phe Thr Gly Lys Lys Val Gly Thr 130 135 140
Ala Ser Glu Asn Val Tyr Val Asn Thr Ala His Leu Lys Asn Ser Gin 245 150 155 160
Glu Lys Tyr Ser Asn Arg Leu Tyr Lys TyT Asp His Asn Bie Val Lys 165 170 175
Ala lie Asn Ala lie Gin Lys Ser Trp Thr Ala Thr Thr Tyr Met Glu 180 185 190
Tyr Glu Thr Leu Thr Leu Gly Asp Met lie Arg Arg Scr Gly Gly His 195 200 205
Scr Arg Lys lie Pro Arg Pro Lys Pro Ala Pro Leu Thr Ala Glu lie 210 215 220 第2頁
Gin Gin Lys lie Leu His Leu Pro Thr Ser Trp Asp Trp Arg Asn Vaf 225 230 235 240
His Gly lie Asn Phe Val Scr Pro Val Arg Asn Gin Ala Scr Cys Gly 245 250 255
Ser Cys Tyr Scr Phe Ala Ser Met Gly Met Leu Glu Ala Arg lie Arg 260 265 270 lie Leu Thr Asn Asn Scr Gin Thr Pro lie Leu Ser Pro Gin Glu Val 275 280 285
Val Scr Cys Scr Gin Tyr Ala Gin Gly Cys Glu Gly Gly Phe Pro Tyr 290 295 300
Leu lie Ala Gly Lys Tyr Ala Gin Asp Phe Gly Leu Va】Glu Glu Ala 305 310 315 320
Cys Phe Pro Tyr TTjr Gly llir Asp Ser Pro Cys Lys Met Lys Glu Asp 325 330 335
Cys Phe Arg Tyr Tyr Ser Ser Glu Tyr His Tyr Val Gly Gly Phe Tyr 340 345 350
Gly Gly Cys Asn Glu Ala Leu Met Lys Leu Glu Leu Val His His Gly 355 360 365
Pro Met Ala Val Ala Phe Glu Val Tyr Asp Asp Phe Leu His Tyr Lys 370 375 380
Lys Gly lie Tyr His His Thr Gly Leu Arg Asp Pro Hie Asn Pro Phe 385 390 395 400
Glu Leu Thr Asn His Ala Val Leu Leu Val Gly Tyr Gly Tlir Asp Scr 405 410 415
Ala Scr Gly Met Asp Tyr Trp lie Val Lys Asn Sci Trp Gly Thr Gly 420 425 430
Trp Gly Glu Asn Gly Tyr Phe Arg lie Arg Arg Gly Thr Asp Glu Cys 435 440 445
Ala lie Glu Ser lie Ala Val Ala Ala Thr Pro lie Pro Lys Leu 450 455 460 <210> 3 (Desciption ID No.4) <211> 30
<212> DNA <213>智人（前置） <400> 3 gctccctgca gcatgggtgc tgggccctcc <210> 4 (Desciption ID No.5) <211> 30
<212> DNA <213>智人（反置） 第3頁 201000905 <400> 4 gcatacccta caatttagga attggtgtgg 30 <210> 5 (Desciption ID No.6) <211> 40 <212> DNA <213>小家鼠 <40Q> 5 ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata ggsaggcggt 40 <21Q> 6 (Desciption ID No.7) <211> 360 <212> DNA <213>小家鼠 <22Q> <22I>各項特徵 <222> (157)..(157) <223> n 為 a，c，g,或 t <40Q> 6
Sctgttttgc ttgtggscta tggaagasat ccagttactg ggatasaata ctggattata 60 aagaacagct ggggctctaa ctggsssgag astsgctact tccgtatccg cagagsaact 120 satgaatgtg caattga£ag tatageegtg gcsgccnata ccgattccta aattatagga 180 catagctccc astgttacat acgggtcttt atcactcaca gagtgattta gtcacatsct 240 gaagactttt tcagagcaat atcagaasct taccactaas catctttaaa £aattttstc 300 tttgaaetta aaaccatcct tgattttttt cttttaatat cttccccatc aactactgaa 360 第4頁

Claims (1)

  1. 201000905 七、申請專利範圍： 1. 一種使用組織蛋白酶C或其功能性片段或衍生物鑑定調節疼 痛之化合物之用途。 2. —種使用異源表現組織蛋白酶C或其功能性片段之非人類基 因選殖動物鑑定或分析調節疼痛之化合物之用途。 3. —種使用異源表現組織蛋白酶C或其功能性片段之非人類基 因選殖動物作為增強疼痛敏感性模式系統之用途。 4. 一種使用非人類組織蛋白酶C基因剔除動物鑑定或分析調節 疼痛之化合物之用途。 5 · —種使用非人類組織蛋白酶C基因剔除動物作為降低疼痛敏 感性模式系統之用途。 6. —種使用異源表現組織蛋白酶C或其功能性片段之細胞鑑定 調節疼痛之化合物之用途。 7. —種使用異源表現組織蛋白酶C或其功能性片段之細胞作為 增強疼痛敏感性模式系統之用途。 8. —種使用組織蛋白酶基因剔除細胞鑑定或分析調節疼痛之化 合物之用途。 9. 一種使用組織蛋白酶基因剔除細胞作為降低疼痛敏感性模式 系統之用途。 10. —種使用異源表現可表現地連接於組織蛋白酶C啓動子及/ 或促進子或其功能性片段的報導基因之細胞鑑定或分析調 節疼痛之化合物之用途。 11. 一種鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，該方法 包括下述步驟： 43 201000905 a. 提供至少兩個試樣； b. 使含有組織蛋白酶C或其功能性片段或衍生物之一試 樣與化合物接觸； c. 於化合物存在下，測定組織蛋白酶C之活性； d. 於化合物不存在下，測定組織蛋白酶C之活性；及 e. 比較根據c)與根據d)之組織蛋白酶C活性。 12. —種鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，包括： a. 使組織蛋白酶C蛋白質或其功能性片段或衍生物與測試 化合物接觸；及 b. 測定該測試化合物是否調節組織蛋白酶C蛋白質或其 功能性片段或衍生物之活性。 13. —種鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，包括： a. 使具有可檢測之組織蛋白酶C或其功能性片段或衍生物 量或活性之細胞與測試化合物接觸；及 b. 測定該測試化合物是否能調節存在該細胞中之組織蛋 白酶C或其功能性片段或衍生物之量或活性。 14. 一種鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，包括： a. 於具轉錄活性之系統中使編碼組織蛋白酶C蛋白質或其 功能性片段或衍生物之核酸與測試化合物接觸；及 b. 測定於該測試化合物存在下，存在該系統中之編碼組織 蛋白酶C蛋白質或其功能性片段或衍生物之mRNA之 量；及 c. 測定該化合物是否能於該系統中調節編碼組織蛋白酶C 蛋白質或其功能性片段或衍生物之mRNA之量。 44 201000905 15. —種鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，包括： a. 提供被包含操作性地偶聯於報導基因或其功能性片段之 組織蛋白酶C或其功能性片段啓動子之核酸載體轉染 之細胞； b. 提供被包含未操作性地偶聯於功能性組織蛋白酶C啓 動子之報導基因或其功能性片段之對照載體轉染之細 胞； c. 於測試化合物存在下，測定根據a)與b)之細胞之報導基 因活性； d. 於測試化合物不存在下，測定根據a)與b)之細胞之報導 基因活性。 16. —種鑑定或分析調節疼痛之化合物之方法，包括： a. 選定調節組織蛋白酶C活性之化合物作為測試化合物； 及 b. 投與具疼痛感之病患該測試化合物以確定疼痛是否被 調節。 17. —種鑑定或分析調節及/或預防病患疼痛之化合物之方法，包 括： a. 於一或多種測試化合物存在下測定組織蛋白酶C或其功 能性片段或衍生物之生物活性以鑑定調節組織蛋白酶C 生物活性之一或多種調節化合物；及 b. 測試該一或多種調節化合物減少病患疼痛、疼痛感或疼 痛敏感性之能力。 18. —種分析個體疼痛閥值之方法，該方法包括分析該個體採樣 45 201000905 中組織蛋白酶c之量相較於一或多個參考試樣，是否存在該 試樣中之組織蛋白酶C mRNA及/或蛋白質之量與一或多個 參考試樣不同，其中存在較高量表示該個體疼痛敏感性增 加，存在較低量表示疼痛敏感性降低。 19. 一種調整用於預防及/或治療個體疼痛之醫藥劑劑量之方 法，該方法包括檢測個體採樣有關是否存在該試樣中之組織 蛋白酶C mRNA及/或蛋白質之量與一或多個參考試樣不 同，該劑量視存在個體採樣中蛋白質及/或mRNA之量是否 與一或多個參考試樣不同而調整；其中個體採樣中較高量之 組織蛋白酶C表示需要較高劑量，且個體採樣中較低量之組 織蛋白酶C表示需要較低劑量。 20. —種使用檢測組織蛋白酶C之工具用於診斷增強個體疼痛敏 感性之用途，其藉由分析取自欲檢測個體之生物試樣。 21. —種用於診斷個體疼痛敏感性之測試套組，該測試套組包含 用於檢測生物試樣中之組織蛋白酶C之至少一種工具。 22. —種用於治療罹患疼痛病患既有疼痛之方法，該方法包括投 與該病患治療有效量之降低該病患之組織蛋白酶C量或活 性之組成物。 23. —種用於降低病患之疼痛敏感性之方法，該方法包括投與該 病患治療有效置之降低該病患之組織蛋白i# C望或活性之 組成物。 2 4. —種用於調節非人類雌性對象之後代之疼痛敏感性之方法， 該方法包括轉移賦與經調節之組織蛋白酶C表現之核酸至 接合子中，及根據其組織蛋白酶C表現特性(經調節）挑選後 46 201000905 代。 π =能降低_蛋㈣c活性及/或表現峰_之化合 26. = 2專·圍第1至3、6、8與10項中任—項之用途或 節係減少、去除或預防疼痛。中任頁之方法，其中該調 27. ^射請專利範圍第^3、6、wi(^^ 根據申請專利範圍第以 、·^述或 節係增加。 貝以壬項之方法，其中該調 28t據申請專利範㈣27項之用途或方法，其中該化人物俜用 於預防或治療疼痛之化合物。 。物係用 29.==，/任一項之用途、測試套組或方法， 織動物組織蛋白酶C及較佳為人類組 3〇.=上述申請專利範圍中任一項之用途、測試套組、方 物’、其巾雜痛為紐或慢性疼痛及触為慢性疼痛5 31·根據上述申請專利範圍中任—項之 ；、甬。 化合物，1申哕疼痛為#套，，且、方法或 W㈣Μ ^ ^炎性、炎性或神經性疼痛。 32=^ ^利範圍第i至3、6、8與⑽項中任 蛋白酶m，射任—項之方法，其令組織 蛋白i#C係王早離蛋白質或多核芽核酸使用。 飞 33.^2請專利範圍第u3、6、8與⑺項中任 :據申請專利範圍第η至17項中任一 ，二： 蛋白酶C係為 八Τ組識 47 201000905 a. 包含或由根據SEQ ID N〇 2序列組成之多肽或其功能性 片段、或 b. 由包含或由根據SEQΠ)N0. !序列組成之多核苷酸編 碼之多肽、或 c. 由於^苛條件下能與由SEQIDN〇1序列組成之多核苷 酸雜交之多核苷酸編碼之多肽。 34.根據申請專利範圍第1至3、6、8與1〇項甲任一項之用途或 根據申請專利範圍第u至17項中任一項之方法，其中 蛋白酶C係為 ' a. 包含或由根據SEQIDNai序列組成之多核苷酸、或 b. 於嚴苛條件下能與由SEQIDN〇. i序列組成之多核苷 酸雜交之多核苷酸、或 、、扁馬根據SEQ ID NO. 2之組織蛋白酶c或其功能性片段 之多核苷酸。 =申，專利範圍第13或14項之方法，其中係使用表現重 、、且、、且織蛋白酶C之細胞。 申，專利範圍第u至17項中任—項之方法，其中組織 蛋白活性之測定係有·蛋自酶活性。 專利範㈣6至1G項巾任1之⑽或根據申請專 物Γ / 13或14項之任—項之方法，其中該細胞係哺乳動 物細胞及較佳為齧齒動物細胞。 3 8 ·根據申請專利範圍第2 i $苜& 刺項中任—項之用途或根據申請專 件^初I 25項之方法’其中該非人類動物係靖乳動物’較 佳為齧齒動物，更佳為小鼠。 平乂 48 201000905 39.根據申睛專利範圍第ι〇項之用途或根據申請專利範圍第Μ 項之方法，其中該報導基因係lacZ、蟲螢光素酶、gfp、bfp、 DsRed、HIS3、URA3、TRP1、β半乳糖苷酶之任一者。 4〇·根據申請專利範圍第21項之用途或根據申請專利範圍第19 或20項之方法或根據申請專利範圍第22項之測試套組，其 中4亥试樣係哺乳動物試樣及較佳為人類試樣。 41. 根據申請專概圍第21項之用途、根據申請專利範圍第β 或2〇項之方法或根據申請專利範圍第22項之測試套组，豆 中該試樣為組織學試樣、活檢試樣、細胞萃取物、—或栖 細胞或體液採樣。 或夕们 42. 根據巾請專利第21項之麵或根 斤 其中該檢測工具“:2: 43. 根據申請專利範圍第42項之用 引子或引子組、適當探斜劣& 、]Λ套組，其中該工具為 从如申請專利範μ 二/']特異性抗-DNA抗體。 mRNA量之變化被分析，較、—項之方法，其中該 cDNA之一或多個適當引^或於，用用於擴增組織蛋白酶C 白酶CcDNA或mRNA雜交2於榡準條件下適用於與組織蛋 45.根據申請專利範圍第44項^^或多個探針進行。 PCR、北方墨點法、陣列_、或晶法，其中該mRNA量係利用 46·如申請專利範圍第21項之用雜交法分析。 測試套組，其中該檢測工具如申請專利範圍第22項之 之 組織蛋白酶C mRNA及/或蛋白^於檢測存在生物試樣中 <之工具。 49 201000905 套組’其中用於檢測組織 49.根據申請專利範圍第牦項之方法 少-個抗體予以檢測。 ㈣U “於至 專利範圍第48或49項之用途、方法或測試套租，且 中，檢測係經由ELISA、西方墨點法或蛋白質晶片進行。，、 .專利範圍第48或49項之用途、方法 =檢測係湘免疫組織化學方法或免疫放射化學檢測; 52.:射請專利範圍第17或18射任—項之方 低組織蛋白酶C之量。 承1牛 53·根據申請專利範圍第52項之方 織蛋白酶C之量。 ，、中係降低神經組織中組 =據申請專利範圍第17或18項中任—項之方法，其中係降 低組織蛋白酶C之活性。 ’、 认=申請專利範圍第54項之方法，其中降低之組織蛋 活性為蛋白酶活性。 呢 56t"f請專利範圍第％項之方法，其中係降低神經組織中之 組織蛋白酶C活性。 據申請專鄕圍第19項之方法，其中該表現係於神經或淋 巴組織中调郎。 5M艮據巾請專利範圍$ 22或23項中任—項之方法或根據申請 50 201000905 專利範圍第25項之用途，其中該化合物為組織蛋白酶C之 可逆之肽腈抑制劑及較佳為組織蛋白酶C之二肽α-胺基乙 腈抑制劑。 51
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