TW201005097A - Oncolytic viruses as phenotyping agents for neoplasms - Google Patents

Description

201005097 六、發明說明： 相關申請案 本發明請求美國臨時申請案系列號60/392,031(申請 曰：2002年6月28日）；及系列號60/443，188(申請日：2003 年1月29曰）之優惠。此等優先申請各自所揭示之内容以引 述方式納入本文中。 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種檢測腫瘤之潛在成因的方法，特定 言之，係將呼腸孤病毒使用於鑑定ras活化型腫瘤。此外， 具有不同選擇性之其他溶瘤病毒亦可使用於鑑定特定的腫 瘤類型。 參考文獻 美國專利案第6，136,307號案。 WO 94/18992，公告於1994年9月1日。

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Ras致癌基因是大多數腫瘤的主要成因。在所有人類腫 瘤中，約有30%發生ras基因本身的活化突變（Bos, J.L.， ❿ 1989)，主要發生於胰臟癌（90%)、散發型結腸直腸癌（50%)、 及肺癌（40%)、以及骨髓性白血病（30%)。除了 ras基因本身 的突變作用以外，在ras途徑之ras上游及下游因子之活化 作用亦與腫瘤有關。例如，HER2/Neu/ErbB2或上皮生長因 子（EGF)受體過度表現常見於乳癌（25-30%)，而血小板衍生 之生長因子（PDGF)受體或EGF受體之過度表現，則普遍發 生於神經膠質瘤及神經膠母細胞瘤（40-50%)。已知，EGF 受體及PDGF受體二者皆是在ras結合於其各別之配位子時 ® 活化ras，而v-erbB編碼主要被活化之欠缺細胞外區段的受 體。總括而論，一般認為，ras致癌基因或ras途徑上游分 子直接突變在所有腫瘤中約發生三分之二。 既然ras途徑在腫瘤發生上扮演要角，期盼能檢測出腫 瘤是否與ras途徑的活化作用有關，由而可以發展出一種合 宜的治療體系。然而，在本發明以前，未有一種簡單且敏 感之診斷癌症與ras途徑間之相關性的方法。雖然ras結構 基因突變可藉由聚合酶鏈反應（PCR)高度靈敏地測得，但在 201005097 ras途徑中有許多其他因子可能是高ras活性的肇因，例如 位於ras基因兩旁序列之突變（導致ras基因產物的異常高表 現量）、在ras途徑之ras上游及或下游因子的結構基因突 變，或是調節性表現（影響此等ras上游及或下游因子的表 現量）。因此’ ras基因之PCR無法精確地鑑定出所有與ras 途徑有關的癌症。仍需一種簡單且精確診斷ras活化型腫瘤 的方法。 【發明内容】 發明大綱 本發明提供一種診斷具有特定表現型之腫瘤（特別是因 ras途徑異常高活性所形成的腫瘤）的方法，該方法是藉由使 用呼腸孤病毒或其他類似的溶瘤病毒達成。呼腸孤病毒不 會在正常細胞中複製。然而，呼腸孤病毒選擇性地在具有 經活化之ras途徑的細胞中複製，由而導致此等細胞死亡。 由於ras結構基因或ras途徑中的任何其他因子突變可能活 化此等細胞中的ras途徑，由而導致該途徑活化。因此，當 細胞因ras途徑活性升尚（至少佔部分成因）變成腫瘤時，可 藉由其對於呼腸孤病毒複製的易感性而鑑定出來。 據此，本發明之一方向是提供一種檢測生物樣品中之 ras活也型腫瘤細胞的方法，該-方法包括使該樣品與呼腸孤 病毒接觸，及測定呼腸孤病毒在該樣品中複製的能力，其 中，該呼腸孤病毒複製能力係指樣品中含有ras活化型腫瘤 細胞。 該生物樣品較佳是來自哺乳動物，尤其是人類。任一 201005097 種I於ras活化型細胞中複製的呼腸孤病毒皆可使用於本 ^ 例如哺乳類呼腸孤病毒或鳥類呼腸孤病毒。哺乳類 兮腸孤病秦較佳為也清型3號呼腸孤病毒，更佳為迪爾玲 (Dearing)品系呼腸孤病毒。 於較佳具體實例中，該生物樣品是取自帶有由下列 斤成組群選出之腫瘤的動物：肺癌、前列腺癌、直腸結_ Ο 癌、甲狀腺癌、腎臟癌、腎上腺癌、肝癌、胰臟癌、乳癌、 造血系癌及中柩暨周邊神經系統癌。 本發明之另-方向是提供一種診斷動物中之阳活化 型腫瘤的方法，包括： ⑷由動物體取出生物樣品，其中，該樣品包括細胞； 下 在呼腸孤病毒可於…化型細胞中複製的條件 使樣品與呼腸孤病毒接觸； (c)測疋呼腸孤病毒於樣品中複製的能力丨及 ⑷若呼腸孤病毒可於樣品中複製，則證 ras活化型腫瘤。 /籾卿丹有 、該動物較佳為哺乳動物，尤其是人類。任一種能於 活化型細胞中複製的呼 ； 老-，加 腸孤病毒皆可使用於本發明，例如 哺乳類呼腸孤病毒或烏類Μ 較佳為血清型3號呼腸沉…哥甫乳類呼腸孤病毒 病毒。 呼腸孤病毒，更佳為迪爾玲品系啤勝孤 於一較佳具體實例令，該生物樣 所成組群選出之腫瘤的動 自帶有由下列 癌、甲狀腺癌1㈣j脲藏直腸結腸 腎上腺癌、肝癌、胰臟癌、乳癌、 9 201005097 造血系統癌及中枢暨周邊神經系統癌。 本發明之另一方向是提供-種治療或改善動物中之ras 活化型腫瘤的方法，包括： ⑷藉由下列步驟鐘定動物中之…（舌化型通瘤：由動物 體取出細胞群，在呼腸孤病毒可於ras活化型細胞中複製的 條件下，使彼等細胞與呼腸孤病毒接觸，及若啤腸孤病毒 可於細胞中複t，則證明#等細胞包括咖活化型細胞；及 (b)對該動物投予有效量之對阳活化型腫瘤具選擇性 之治療劑。 該對⑴#化型腫瘤具選擇性之治療劑較佳為溶瘤病 毒。該溶瘤病毒較佳為呼腸孤病毒、VA1區域突變之腺病 毒、K3L及/或E3L區域突變的牛痘病毒、ο·肌基因突 =之羊副痘病毒、NS]基因突變之流感病毒、r】34.5基因 突變之疱疹病毒、水泡性口炎病毒(vsv)、或新城疫病毒。 其他對ras活化型腫瘤具選擇性之治療劑包含，但不限於法 呢基轉移酶抑制劑（FTIs)及RAF激酶抑制劑。

於本發明任一具體實例中，+ I 負』甲呼腸孤病毒可為重組體呼 腸孤病毒。該重組體呼腸孤病毒可囍士 I J楮由以不同亞型的呼腸 孤病毒共感染哺乳類細胞*生成。該重組體呼腸孤病毒可 為自然發生或是非自然發生。重組體呼腸孤病毒可來自二 種或更多種呼腸孤病毒品系，尤其是. 。开疋田迪爾玲品系、阿布 尼（Abney)品系、瓊尼絲（Jones)品系、 ,, 尔及雷恩（Lang)品系所 成組群選出之二種或更多種呼腸孤 啊母0口糸。該重組體呼 腸孤病毒亦可為不同血清型之呼 η个J月心吁腸孤病毒基因重排的結 201005097 果’彼等不同血清型之呼腸孤病毒為例如由血清型1號呼 毒U 2號呼腸孤病毒、及血清型3號呼腸孤 病毒所成組群選出者。該等重組體呼腸孤病毒可包括自然 發生之變異體外殼蛋白質編碼序列或突變之外殼蛋白質編 碼序列。 除了呼腸孤病毒以外’亦有若干種其他溶瘤病毒亦對 ⑴活化㈣瘤具選擇性’因此，可依呼腸孤病毒之相同方 式使用彼等病毒而實施本發明。此等病毒包含，但不限於 VA1區域突變之腺病毒、跳及/或肌區域突變的牛瘦病 毒OV20.0L基因突變之羊副痘病毒、基因突變之流 感病毒、或7丨34.5基因突變之祕病毒。因此，例如本發 明之-方向是提供一種檢測生物樣品中之如活化型腫瘤 細胞的方法，包括：使樣品與彼等在pKR缺陷型細胞中選 擇性地複製之溶瘤病毒接觸，及測定該病毒於樣品中複製 的能力，其中，該病毒複製的能力係指樣品中所含之ras活 化型腫瘤細胞。較佳，該溶瘤病毒係由下列所成組群選出 者.VA1區域突變之腺病毒、咖及/或肌區域突變的牛 痘病毒、OV20.0L基因突變之羊副痘病毒、NS1基因突變 之流感病毒、或r l34.5基因突變之疱疹病毒。 再者，有許多種可以選擇性地感染特定的腫瘤細胞之 其他溶瘤病毒亦可依呼腸孤病毒之相同方式使用於本發 明。例如，水泡性口炎病毒（VSV)可用於診斷干擾素抗性腫 瘤，ONYX-015病毒可用於診斷p53缺陷型病毒，而占 病毒可用於診斷Rb缺陷型腫瘤。不過，使用於本發明之溶 201005097 瘤病毒較佳不為腺病毒，尤其是不為猜x Qi5病毒。 本發明進一步提供—種治療或改善干擾素抗性腫瘤、 :缺陷型酸瘤、或Rb缺陷型腫瘤的方法該方法係、藉由 使取自腫瘤的生物樣品與選自vsv、〇nyx_⑴病毒及占 24所成組群的病毒接觸，當診斷結果為陽性時，接著以適 宜的治療劑治療該腫瘤。 本發月之又一方向係提供一種套組，該套組包括呼腸 孤病毒及用於檢測呼腸孤病毒複製的裝置。該檢測裝置可 為一對專-辨識呼腸孤病毒核酸㈣子，且可視需要包含 PCR試劑。該檢測裝置亦可為專__辨識啤腸孤病毒蛋白質 的抗體’以及附加試劑如第二抗體。該檢測裝置又可為適 於在顯微鏡下觀察被感染細胞之形態的玻片及染料，或是 可用於測定呼腸孤病毒力價之病毒培養基及細胞。相仿 地’本發明亦提供他種套組，該等套組包括其他能在特定 腫瘤細胞中複製的病毒，以及用於檢測該病毒複製的裝 置。此等病毒的實例包含，但不限於VSV、ONYX-015病毒 及5 24病毒。 , 本發明的另一方向係提供一種套組，其包括至少兩種 病毒，該病毒可如本發明用於表現型分類腫瘤。該等病毒 較佳係選擇具有不同表現型的腫瘤。較佳，該等病毒係由 呼腸孤病毒、VSV、QNYX_G15病毒及524病毒所成組群選 出者。 ^本發明之再一方向係提供一種套組，該套組包括用於 移斷特定表現型腫瘤之病毒，以及對該腫瘤具選擇性的治 201005097 療劑。 再者，由於溶瘤病毒選擇性地在腫瘤細胞複製而不於 正常細胞複製，本發明之另一方向係提供一種診斷存在於 哺乳動物中之腫瘤的方法，該方法包括使來自該哺乳動物 細胞的樣品與溶瘤病毒接觸，其中，該病毒在該樣品中複 製的能力表示該哺乳動物中有腫瘤。 本發明的其他方向將由本申請案全文之揭示予以證 明。 發明之詳細說明 本發明提供一種藉由使用溶瘤病毒診斷具有特定表現 型之腫瘤的方法。肖定言 < ’因ras途徑異常高活性所致之 =瘤可使用呼腸孤病毒予以診斷出。呼腸孤病毒不會在正 吊細胞中複製。然而’呼腸孤病毒選擇性地在具有經活化 的ras途徑之細胞中複製，由而導致此等細胞死亡。因此， ras活化型踵瘤可藉由其對於呼腸孤病毒的易感性而診斷出 來。而後，該診斷將促使更有效率地治療或改善腫瘤。 本發明可進一步應用於診斷及/或治療或是改善其他腫 瘤例如干擾素抗性脸瘤、P53缺陷型腫瘤、或Rb缺陷型 腫瘤。亦提供用於本文揭示之診斷或治療之套組。 上在進一步詳細說明本發明之前，先將使用於本申請案 之詞彙定義如下，除非另有說明。 定義 ，，使用於本文之“腫瘤細胞”亦作”增殖失調之細 糸才曰增殖時不具正常生長抑制性的細胞。而包括腫 13 201005097 瘤細胞的新生長物即為“腫瘤（neoplasm或是tumor)，，。腫 瘤是一種異常的組織生長物’ 一般是因細胞増殖比正常組 織生長物更迅速地生長所形成的一種獨特團狀物。腫瘤在 結構組織上’以及與正常細胞之功能協調上可能表現部分 或完全缺乏。至於使用於本文之腫瘤大致包含造血系腫瘤 及固體性腫瘤。 腫瘤可為良性（良性腫瘤）或惡性（惡性腫瘤或癌）^惡性 腫瘤可概略區分成三種主要類型。發生於上皮結構的惡性 腫瘤稱為癌瘤，起源於結締組織如肌肉、軟骨、脂肪或硬 ® 骨之惡性腫瘤稱為肉瘤，而影響造血系結構（與形成血液細 胞有關的結構’包含免疫系統成分）的惡性腫瘤稱為血癌及 淋巴癌。其他腫瘤包含但不限於纖維神經瘤病。 \ “PKR缺陷型細胞”是其中之PKR不比正常細胞所含 PKR活躍的細胞。此pKR之缺陷可能是由於例如pKR基因 突變，或是PKR蛋白質量或活性減低。例如，ras活化型腫 瘤細胞之PKR缺陷是由於活化之ras途徑阻斷pKR的磷酸 化PKR蛋白質量或活性的分析法為技藝中周知者。 ❹ 至於本文所用之“ras活化型腫瘤細胞”或“ ras調節 型腫瘤細胞”是指至少部分由於ras途徑之活化作用，導致 其以異常间速進行増殖的細胞。Ras途徑可由下列方式予以 f化咖基因結構突變、ras基因表現量增加、ras基因信 息的穩定度增加、或是導致ras或位於ras途徑之ras下游 ° 的因子，舌化，由而增加ras途徑活性的任何突 其他機制。纟丨^ ^ . 例如，EGF受體、PDGF受體或S0s的活化作用 14 201005097 導致ras途徑活化。Ras調節型腫瘤細胞包含，但不限於ras 調節型癌細胞，彼等細胞係因ras途徑的活化作用，以惡性 腫瘤的方式予以增殖。 “ ras活化型腫瘤”是指ras途徑被活化的腫瘤。 “干擾素抗性腫瘤”或是“具有干擾素抗性表現型的 腫瘤是指可以用干擾素-α、/3或^予以治療或改善的腫 瘤。 Ρ53缺陷型腫瘤”或是“具有ρ53缺 ❹ ❹ 瘤疋指細胞腫瘤抑制物Ρ 5 3含量比正常細胞低的腫瘤。 “Rb缺陷型腫瘤”或是“具有Rb缺陷之表現型的腫 瘤”是指細胞腫瘤抑制物Rb含量比正常細胞低的腫瘤。 “溶瘤病毒”是一種選擇性殺死腫瘤細胞的病毒。腫 瘤細胞的撲殺作用可藉由任何技藝中已確立的方法予以檢 測，例如：測定存活細胞量、細胞病變作用、腫瘤細胞阔 零、腫瘤細胞中合成之病毒蛋白質[例如：代謝標記法、病 毒蛋白質之韋斯頓(Western)分析法、或病毒複製之必要基 因的逆轉料合_反應]、或是腫瘤尺寸減小。 =於本發明所用之“呼腸孤病毒”是指歸類於啤腸孤 毒）為一錄备+ 孤病努之名（土吸及歷_道1兒病 鲁）為一種敘述頭字語，暗指 病狀態無任何相關性，卻可由呼二雖然與已知之人類疾 腸孤病毒，，-詞是指歸類於呼及腸道分離出來。‘‘呼 人類呼腸孤病毒由三種血：二病毒屬的所有病毒。 或T1L)、第2型(違尼絲品系，T2:成：第1型(雷恩品系 、第3型（迪爾玲品系或 15 201005097 阿布尼品系，T3D)。此三種血清型 胞凝集抑制分析輕易地_參^_ η作用及血細 兄例如Nlbert等人，1996)。 可由自然來病毒可為自然發生或經改質者。當呼腸孤病毒 、、、來源分離’且非由實驗 腸孤病毒為“自舞發4，，去, 意改質時’該呼 地來源，亦即，來自經呼腸孤病毒感染的人毒。來自 ❹ 呼腸:病毒可經予改質’但仍能溶解感染具有活化之 ^途^的哺乳類細胞。呼腸孤病毒在投藥至增殖中的細胞 蛋學性或生化性預處理(例如以蛋白酶如胰凝乳 膜及蛋白殼蛋1酶處理)。以蛋白酶預處理去除病毒的外被 =質=:可以增加病毒的感染性。呼腸孤病毒可包 體或膠圏中（chandron與Nibert，1998)，以減少 或方來自人類之已發展出的對於呼腸孤病毒的免疫力。 J病毒粒子可在形成硫酸燒醋清潔劑濃縮物的膠围存 虚胰凝乳蛋白酶處理，而生成一種新穎的感染性次 病毒粒子顆粒。 ❹ 呼腸孤病毒可為經由來自兩種或更多種遺傳性不同之 呼腸孤病毒的基因組片段進行重組/基因重排而產生之重組 體呼腸孤病毒。重組體呼腸孤病毒可來自兩種或更多種具 不同致病表現型之呼腸孤病毒(例如含有不同抗原決定子 者），由而減少或預防因喷乳動物事先曝露於，腸孤病毒亞 型所引起之免疫反應。重組體啤腸孤病毒亦可展現有別於 原始呼腸孤病毒之不同生物活性（例如在腫瘤細胞中的複製 活性及生物分布性）。呼腸孤病毒基因組片段之重組/基因重 16 201005097 排亦可在以至少兩種遺傳性不同之呼腸孤病毒 物後自然發生。重组妒哞允 ’、寄主生 垔組體呼腸孤病毒亦可在細胞块 生，例如：藉A W、耆难L培養時發 生q如藉由以遺傳性不同之呼腸孤病毒共感 寄主細胞（Nibert等人，1996)。 汗的

據此，本發明思及，由來自兩種或更多種遺傳性 之呼腸孤病毒的基因組片段基因重排而得之重组體呼腸二 病毒的用it，該等遺傳性不同之呼腸孤病毒包含，但不限 於人類呼腸孤病毒’例如··帛！型（如，雷恩品系卜第2型 (如’瓊尼絲品系）、第3型（迪爾玲品系或阿布尼品系）、非 人類哺乳類呼腸孤病毒、或鳥類呼腸孤病毒。本發明進一 步思及由來自兩種或更多種遺傳性不同之呼腸孤病毒的基 因組片段基因重排而得之重組體呼腸孤病毒的用途，其中 至少一種母系病毒係由遺傳工程獲得、包括—個或更多個 化學合成之基因組片段、業經化學或物理誘變劑處理、或 其本身為重組事件的結果。本發明進一步思及業己在化學 誘變劑或物理誘變劑存在下進行重組之重組體呼腸孤病毒 的用途，該等化學誘變劑包含，但不限於硫酸二曱酯及溴 化乙鎗，該等物理誘變劑包含，但不限於紫外線或其他型 式之幅射。 本發明進一步思及包括在一個或更多個基因組片段中 發生刪失或複製的重組體呼腸孤病毒、包括因與寄主細胞 基因組重組而產生其他遺傳訊息的重組體呼腸孤病毒、或 包括合成之基因的重組體呼腸孤病毒。 “表現塑分類（phenotyping)，，腫瘤，是指依腫瘤的表現 17 201005097 型進行腫瘤分類。例如. 1 歹·!如·踵瘤表現型包含ras途徑活化、干 擾素抗性、p-53缺陷及灿缺陷。彼等表現型並不相互排 斥’亦即，一種腫瘤可能經表現型分類成一種以上的類別。 生物樣品，，县—接丄， 疋 種由生物個體，例如動物，收集的 樣品。 “有效營” β 疋種足以達到所欲目的的量。例如：為 達到治療或改善疾症a — * θ g 屎病或疋病情的目的之呼腸孤病毒有效 量疋足以導致疾病症狀或病情減輕或完全去除的量。現 存/〇療劑的有效量將依例如下列因子：藥劑屬性、投藥途❹ 徑、接受治療劑之動物大小及種類、以及投藥目的而異。 各個個體案例的有效量可由熟諳技藝之人士，依據技藝上 已確立之方法作實驗決定。 治療或改善”疾病或是病情，是指減輕或完全去除 疾病症狀或病情。 一治療劑對某一特定疾病或病情具“選擇性”，是指 该治療劑對該疾病或病情比對其他疾病或病情更有效。相 仿地，一治療劑對某一特定腫瘤細胞族群具“選擇性”， ❹ 是指該治療劑撲殺該特定腫瘤細胞族群的效率比撲殺其他 腫瘤細胞的效率更高。 方法 本發明有效用於精確地表型分析腫瘤，由而促進發展 出適於特定腫瘤的治療體系。於一較佳具體實例中，呼腸 孤病毒被用於感染由患有腫瘤之動物取得的生物樣品。由 於呼腸孤病毒選擇性地感染ras活化型腫瘤細胞，而不感染 18 201005097 五常細胞或ras途徑未經活化的腫瘤細胞，本方法可以使醫 _精確地判定腫瘤是否與ras途徑活化作用有關。若診斷出 為ras活化型，則可用ras專一性治療體系，例如呼腸孤病 毒治療法（美國專利第6，1636,307號）治療該腫瘤。

Ras途徑為一種導致細胞增殖之複雜的信號傳遞途 輕。Ras為此途控之中柩接替物，其接收來自上游分子（例 如生長因子受體）的信號，並將彼等信號傳遞至下游分子。 許多生長因子受體，例如：上皮生長因子（EGF)受體、 ® 血小板衍生之生長因子（PDGF)受體、及EGF受體相關性分 子（例如Her2/Neu/ErbB2)，具有内在酪胺酸激酶活性，該活 性由配位子誘發之受體二聚體化作用予以活化。如此導致 受體之酪胺酸殘基的自體磷酸化作用，並致使含有Src同源 區2(SH2)之蛋白質的結合作用。此等SH2蛋白質中之二者 Grb2及SHC間接活化結合於漿膜之小型GTP結合型蛋白質 Ras。Ras活化作用亦發生於對結合於7個穿膜區段〇蛋白 質偶合型受體之配位子反應時（例如，Gutkind，1998)。Ras ® 及其他經生長因子經受體調節之信號途徑的活化作用最終 導致細胞骨架及基因表現的改變，此等改變乃是細胞增 殖、分化及轉型所需（回顧Campbell等人，1998)。 三種人類ras基因（Ha-Ras、N-Ras、及Ki - Ras)編碼4 種蛋白質（此因Ki - Ras mRNA選擇性剪接所致）。於正常情 況下，Ras蛋白質在活化態（GTP結合態）及不活化態（GDP 結合態）之間循環。Ras活化作用發生於所結合之GDP轉換 成GTP時，此作用是由鳥嘌呤核苦酸轉換因子家族促成。 19 201005097

Ras不活化作用發生於所結合之GTP轉換GDP時。此反應 是由GTPase活化蛋白質（GAPs)促成。在許多人類癌症中， 因破壞GTPase活性的突變作用，使Ras蛋白質變成癌性活 化型，由而使Ras信號作用失調（參照Campbell等人，1998)。 存在著許多可適用作為Ras訊息傳遞及致癌轉型作用 下游之預定的Ras效應物，彼等效應物包含小型GTPase之 Rho家族成員、磷脂醯肌醇-3激酶（PI3K)、及絲胺酸/酥胺 酸蛋白質激酶c-Raf-Ι (參照Campbell等人，1998)。Raf調 節型信號作用是最富特色之Ras效應物途徑。被活化之Ras © 促使Raf回復至Raf發生活化時之膜。經活化之Raf為激酶 級聯[促細胞分裂素活化型蛋白質激酶（MARK)級聯]的起始 成分。Raf磷酸化並活化MEK1及MEK2 (MAPK/ERK激酶） 蛋白質激酶，由而磷酸化並活化細胞外信號調節激酶ERK1 及ERK2(亦稱為 MAPK1及MAPK2)。與其下游標的物 ERK1、2不同的是：MEK1、2蛋白質為高度專一性酵素， 彼等酵素所辨識的基質僅為ERK1、2蛋白質。當活化時， ERK1及ERK2磷酸化（並由而調節）多種標的蛋白質（包含核 〇 轉錄因子），導致最終的細胞反應。 據此，有若干事件可導致ras途徑的活化作用。例如： 突變可發生於三種ras結構基因的任一者。結構性突變亦可 發生於ras受體上游、ras下游之信號傳遞子（如raf或mek卜 2)、或是最終效應物MAPK1及2。相仿地，導致ras途徑 中之任一種蛋白質異常高量表現的調節性突變亦可能造成 細胞分裂素所致之細胞反應。此種調節性突變可能發生於 20 201005097 ㈣途徑成員之調節性序列的任—處，或者甚至於可發生在 控制⑴途徑成員表現的因子調節區域。因此，檢測阳途 t中任#疋成員的異常並非決定如途徑是否被活化的 有效方式。 *由於MAPK絲本活化作用為咖途徑活化作用的指 心因此可以測定MAPK(ras途徑的最終效應物）的活性。 然而’此種生化性研究需要大量的樣品材料，以及冗長的 程序，例如MAPK的萃取及/或部分純化。 藉由檢測ras ’皮活化的表現型而非任何特定基因或基 因產物的異常’使本發明可有效用於不論⑽活化作用是肇 因於ras結構基因、ras基因之調節性序列、或⑴途徑中之 任何其他因子的突變。因此，本方法相當簡單，且不須由 樣品萃取或純化酵素。 呼腸孤病毒感染樣品令之細胞的能力可藉技藝中的任 ❿ 、、 疋例如.呼腸孤病毒核酸複製作用可使用對 所用之呼腸孤病基, 、 蚕八專一性的引子進行聚合酶鏈反應予以 測疋，呼腸孤病毒蛋白f之合成可由特定抗體檢測；感染 的細胞可在顯微鏡下觀察，並藉由所測得之呼腸孤病毒所 誘發的細胞病理作用證實；而複製之病毒可由樣品收取， 並由所測4之病毒力價評估是否發生病毒之複製作用。其 他測定呼腸孤病毒複製作用之存在的方法為熟諳技藝之I 士已知或可發展出來者。 應庄意，腫瘤可含有多種致癌性異常。特定言之 報導，乳癌在ras活化以先，常有p53過度表現（3獅等人， 21 201005097 2000)。然而，除了 途按活化作用以外之其他致癌性異 '子在不會阻礙專—適合於⑽活化型腫瘤之治療體系 的能力例如’呼腸孤病毒仍可以選擇性地殺死ras活化型 腫瘤細胞’即便彼等細胞亦含有異常高量的… 由於/合瘤病毒選擇性地在fas活化型腫瘤細胞複 製而不於正常細胞福匍，士 複製本發明之另一方向係提供一種診 ❹ 斷存在於哺乳動物中之腫瘤的方法，該方法包括使來自該 甫乳動物細胞的樣在呼腸孤病毒可活化型細胞複 製的條件下，與呼腸孤病毒接觸，其中，該呼腸孤病毒在 該樣品中複製的能力表示該哺乳動物中有腫瘤。 如同呼腸孤病母，若干其他溶瘤病毒亦選擇性地在ras 活化里細胞複製。預期此等溶瘤病毒可依如同呼腸孤病毒 的相同方式用於實施本發明。此等病毒—般為敏感於雙股 RNA激酶（PKR)的突變體’然而其野生型確對服不敏感。 ❹ 一般而言，當病毒進入細胞，pKR被活化並阻斷蛋白 質合成，使病毒不會在體内合成。某些病毒發展出一種抑 制PKR的系統，促使病毒蛋白質合成，以及病毒複製。例 如，腺病毒製造大量小型RNA，VA1 RNA。VA1 RNA具有

廣擴的二級結構並與PKR結合，而與正常地活化pKR的雙 股RNA(dsRNA)競爭。由於活化pKR需要極小長度的 dsRNA，故VA1 RNA不會活化PKR。相反地，VA1 RNA 憑藉著其大數量隔離PKR。繼之，蛋白質合成不被阻斷， 使腺病毒可在細胞中複製。

Ras活化型腫瘤細胞不會進行PKR所抑制之蛋白質合 22 201005097 成作用，因為ras使PKR不活化。此等細胞因而易於感染 病毒，即便彼等病毒不具PKR抑制系統。因此，若腺病毒 中的PKR抑制劑突變而不再阻斷PKR功能，則導致病毒因 蛋白質合成作用不被PKR抑制而無法感染正常細胞（腺病毒 在缺乏PKR活性的ras活化型腫瘤細胞中複製）。 據此，經改質或突變以致於不會抑制PKR功能的病毒 選擇性地在ras活化型腫瘤細胞中複製，而正常細胞抵抗此 等病毒。較佳，病毒為VA1區域突變之腺病毒、K3L及/ _ 或E3L區域突變的牛痘病毒、OV20.0L基因突變之羊副痘 病毒、NS-1基因突變之流感病毒、r !34.5基因突變之疱疹 病毒。 彼等病毒可依已知之結構-功能相關性病毒PKR抑制劑 予以改質或突變。例如，由於E3蛋白質的胺基端區域與PKR 的羧基端區域交互作用，此區段的刪失或點突變防止抗PKR 功能（Chang 等人，1992、1993、1995 ; Sharp 等人，1998 ; Romano等人，1998)。牛痘病毒的K3L基因編碼pK3，一 . 種PKR的偽基質。在K3L中有功能缺失突變。若與eIF-2 之殘基79至83同源的K3L蛋白質之C端部分發生平截或 點突變，貝1J廢止了 PKR抑制活性（Kawagishi-Kobayashi，M. 等人，1997)。 於本發明之另一具體實例，水泡性口炎病毒（VSV)可用 於診斷干擾素抗性腫瘤。干擾素係鍵結於細胞表面受體上 的循環因子，其最終導致抗病毒反應，並誘發標的細胞的 生長抑制及/或凋零信號。雖然干擾素理論上可以用於抑制 23 201005097 腫瘤細胞增殖，但此種企圖並非非常成功，此因干擾素成 員之腫瘤專一性突變所致。 然而，在藉由破壞干擾素途徑防止受干擾素影響之生 長抑制作用的同時，腫瘤細胞可能損及其抗病毒反應。的 確，已證實VSV(一種具被膜之負股RNA病毒）在干擾素存 在下’迅速地在多種人類腫瘤細胞株中複製，並殺死彼等 細胞，而正常的人類初級細胞培養物明顯地受干擾素保 護。VSV因而可用於診斷干擾素抗性但對vsv敏感的腫 瘤。如同呼腸孤病毒之具體實例般，依據VSV的診斷法是 ❹ 一種表現型評估法，且其不依賴干擾素抗性機制。 於本發明之另一具體實例，可使用ONYX_015病毒診 斷p53缺陷型腫瘤。p53是一種重要的腫瘤抑制劑，其存在 於各種細胞並控制細胞生長。由於病毒依賴細胞增殖機制 進行複製，其易受P53調控而不會過度複製。然而，某些 腺病毒（SV40及人類乳突病毒）包含使p53不活化的蛋白 質’由而使其本身複製（Nemunaitis，1999)。 至於血清型5號蛋白質是一種由E1B區域編碼之55 Kd © 蛋白質。若E1B區域編碼之此55 Kd蛋白質被刪失，如同 在0NYX·015 病毒中者一般（Bischoff 等人，1996 ; WO 94/18992)’則該55 kd之P53不再存在。結果，當〇nyx_〇15 進入正常細胞中’ p53發揮抑制細胞增殖及病毒複製的功 月b。因此，ΟΝ ΥΧ-0 1 5不會在正常細胞中複製。另一方面， 在P53功能受損的腫瘤細胞中，〇Νγχ_〇 15可以複製，最後 並造成細胞死亡。因此，此病毒可以用於檢測樣品中之p53 24 201005097 缺陷里腫瘤細胞。熟諳技藝之人士亦可使用已確立之技術 突變f破壞腺病毒5號或其他病毒中之P53抑制劑基因， 且所得病f可用於本方法診斷p53缺陷型腫瘤。 相仿地，<5 24病毒可用於診斷Rb缺陷型腫瘤。5 24 =毒疋種在El A區域帶有24個鹼基對刪失的突變體腺病 毋（y〇等人，2000)。此區域負責結合細胞腫瘤抑制子 Rb並抑制Rb ^力㉟，由而通過細胞增殖機制，因此病毒複 製而發生不可控制的情況。占24在Rb結合區域具刪失片 而無法結合於Rb。因此’該突變體病毒的複製在正常 細胞又到抑制。然而，若Rb不活化，且細胞變為腫瘤，則 = 24、不再受抑制。取而代之的是，突變體病毒有效率地複 製^並溶解Rb缺陷型細胞。據此，524病毒可以用於測定 樣品中是否含有Rb缺陷型腫瘤細胞。 就ras活化型腫瘤細胞而論，p53缺陷型細胞或Rb缺 陷^細胞之產生有多種成因。例如·· P53或Rb結構基因突 變可能導致基因產物機能不全或不良的轉譯作用，p53或 Rb基因的調節性序列突變可能造成轉錄量減少，的或灿 基因的轉錄因子突變可能得到缺陷的p53或Rb產物，或是 對於p53或Rb之功能而言為必要的共因子突變可能也是 P53或Rb缺陷的理由。由於本發明檢測表現型，而非僅檢 測P53或Rb基因/蛋白質的結構異常，因此比以結構為基礎 之方法’例如PCR更有力。 旦決定了腫瘤的表現型，則可依其表現型治療該腫 瘤。例如：ras活化型腫瘤可用呼腸孤病毒或是ras途徑抑 25 201005097 制劑進行治療。據此，本發明亦提供一種治療或改善動物 中之ras活化型腫瘤的方法，包括藉由下列步驟鑑定動物體 中之ras活化型腫瘤：由動物體取出細胞群，在呼腸孤病毒 可於ras活化型細胞中複製的條件下，使彼等細胞與呼腸孤 病毒接觸，若呼腸孤病毒可於細胞甲複製，則證明該等細 胞包括ras活化型腫瘤細胞；及對該哺乳動物投予有效量之 呼腸孤病毒。呼腸孤病毒治療法已揭示於例如美國專利第 6，136,307 號。 因此，本發明亦提供一種治療或改善腫瘤的方法，包 ⑩ 括收集樣品，以VSV、（5 24或ONYX-015病毒鑑定樣品的 表現型’以及依該表現型投予有效量的合宜治療劑。該治 療劑可為病毒本身，或是在p5 3或Rb缺陷的情形下，為p5 3 或Rb功能的活化劑。應注意，5 24及ONYX-015僅為說明 本發明之應用的實例，熟諳技藝之人士應可依本發明之揭 示鑑定或發展出其他可用於診斷及治療腫瘤的病毒。 關於呼腸孤病毒，其他溶瘤病毒之免疫保護型或基因 重排型病毒的用途亦包含於本發明。因此，除了在本申請 ❹ 案中詳細討論的病毒以外，熟諳技藝之人士可依本文之揭 示及技藝中可得之知識使用其他溶瘤病毒實施本發明。溶 瘤病毒可為下列病毒家族的成員：肌病毒科（myoviridae)、 siphoviridae、短尾病毒科（podoviridae)、teciviridae、被脂 病毒科（corticoviridae)、菌原體病毒科（plasmaviridae)、 lipothrixviridae、fuselloviridae、痘病毒科（poxviridae)、虹 彩病毒科（iridoviridae)、 藻類 DNA 病毒科 26 201005097 (phycodnaviridae)、桿狀病毒科（baculoviridae)、抱療病毒 科、腺病毒科、乳多空病毒科（papovaviridae)、多DNA病 毒科（polydnaviridae)、絲桿病毒科（inoviridae)、微病毒科 (microviridae)、雙聯病毒科（geminiviridae)、環狀病毒科 (circoviridae)、小 DNA 病毒科（parvoviridae)、肝 DNA 病毒 科（hepadnaviridae)、反轉錄病毒科（retroviridae)、 cyctoviridae、呼腸孤病毒科、雙 RNA 病毒科（bimaviridae)、 副黏病毒科（paramyxoviridae)、 彈性病毒科 〇 (rhabdoviridae)、線狀病毒科（filoviridae)、正黏病毒科 (orthomyxoviridae)、布尼亞病毒科（bunyaviridae)、砂粒病 毒科（arenaviridae)、輕小病毒科（leviviridae)、微小核糖核 酸病毒科（picornaviridae)、sequiviridae、紅豆花葉病毒科 (comoviridae)、馬鈴薯y病毒科（potyviridae)、杯狀病毒科 (caliciviridae)、星狀病毒科（astroviridae)、野田病毒科 (nodaviridae)、T四病毒科（tetraviridae)、蕃茄叢矮病毒科 (tombusviridae)、冠狀病毒科（coronaviridae)、glaviviridae、 © 披膜病毒科（togaviridae)、或 barnaviridae β 本發明可實施於任何動物，特別是哺乳動物。較佳哺 乳動物包含狗、貓、綿羊、山羊、牛、馬、豬、人類及非 人類之靈長類。最佳，哺乳動物為人類。 套組 本發明提供有效用於診斷及/或治療腫瘤的套組。本發 明之一方向提供一種套組，該套組包括呼腸孤病毒及用於 檢測呼腸孤病毒複製的裝置。該檢測裝置可為一對專一辨 27 201005097 識呼腸孤病毒核酸的引子，、 且可視需要包含PCR試劍 _ 檢測裝置亦可為專一辨識呼腰W 式劑。该 吁賜孤病毒蛋白質的 可視需要含有附加試劑如第·»#^ m 认反 π〜抗體。該檢測裝置又 於在顯微鏡下觀察被感染細胎夕Λ14 』為通 飑之形態的玻片及染料，或 可用於測定呼腸孤病毒力價 3疋 1之病毒培養基及細胞。相仿 地’本發明亦提供他種套組’該等套組包括其他能在特定 腫瘤細胞中複製的其他病毒，以及用於檢測該病毒複製的 裝置。此等病毒的實例包含，但不限於vsv、ONYX 015 病毒及5 24病毒。 本發明的另-方向係提供—種套組，其包括至少兩種 病毒，該病毒可如本發明用於表現型分類腫瘤。較佳，該 等病毒係由呼腸孤病毒、vsv、ONYX_015病毒及占24病毒 所成組群選出者。 下述實施例將用以闞述本發明，但不能以任何方式解 釋為用以限制本發明範疇者。 【實施方式】 於下文之實施例中，下述縮寫具有下述意義。未被定 ❹ 義之縮寫具有其平時廣被接受之意義。 °c =攝氏度 hr=小時 min=分鐘 // M=微莫耳濃度 mM=毫莫耳濃度 M=莫耳濃度 28 201005097 ml =毫升 # 1=微升 mg=毫克 M g=微克 PAGE=聚丙烯醯胺凝膠電泳 rpm=每分鐘迴轉次數 FBS =胎牛血清 DTT=二硫蘇糖醇 © SDS =十二烷基硫酸鈉 PBS =磷酸鹽緩衝鹽液 DMEM =杜貝克（Dulbecoo’ s)改良型伊果（Eagle’ s)培 養基 α -ΜΕΜ= α -改良型伊果培養基 yS -ME=yS -Μ 基乙醇 MOI =感染多樣性 PFU=菌斑形成單位數 . EGF =上皮生長因子 PDGF = jk小板衍生之生長因子 CPE=細胞病理作用 VSV=水泡性口炎病毒 PCR=聚合酶鏈反應 SH2 = src同源區2 實施例1 以呼腸孤病毒表現型分類腫瘤 29 201005097 在一 65歲年長婦女的常規乳房χ光像上發現一硬塊。 於切片檢查時，自該硬塊收集樣品，結果顯示為惡性腫瘤。 為了確疋該腫瘤是否含有ras活化型細胞，將該樣品置於細 胞培養物中，並與呼腸孤病毒一起培養。 使迪爾玲品系呼腸孤病毒血清型3號在依據Smith的方 法（Smith，1969)純化之L_929細胞的懸浮培養物中繁殖， 但該萃取緩衝液中不含沒-疏基乙醇（石-ME)。純化之呼腸孤 病毒的粒子/PFU比為⑽/丨。#片檢查樣品在DMEM中磨 碎，在37°C下，與呼腸孤病毒一起培養2小時，換至含有 _ 20%FBS的新鮮DMEM中，培養48小時。隨後，收集培養 物之上凊液，並測定呼腸孤病毒力價。結果顯示呼腸孤病 毒在樣品中複製。因此’該乳房腫瘤含有⑴活化型腫瘤細 胞。 【圖式簡單說明】 無 【主要元件符號說明】 無 30

Claims (1)

1. ▼ 201005097 七、申請專利範圍： 1. 一種診斷動物中具有特定表現型之腫瘤的方法，其 包括： (a )提供來自動物的生物樣品，其中該樣品包括腫瘤 細胞； (b )提供至少兩種溶瘤病毒，其中每一種病毒選擇性 地於具有選自由ras途徑活化、干擾素抗性、p53缺陷型、 與Rb缺陷型所組成之群組的表現型之腫瘤細胞中複製且其 ❷中每一種溶瘤病毒分別在具有不同表現型的腫瘤細胞中複 製； (c )使該樣品與每一種溶瘤病毒於允許每一種溶瘤病 毒在具有每一種溶瘤病毒所專一之特定表現型之腫瘤細胞 中選擇性複製的條件下接觸.； (d )測定每一種溶瘤病毒是否可在腫瘤細胞中選擇性 複製；及 (e )根據每一種溶瘤病毒於樣品中選擇性複製的能 ® 力，診斷在該動物中之腫瘤為具有特定表現型。 2_如申請專利範圍第1項之方法，其中該病毒係選自由 下列者所組成之群組： (i) 水泡性口炎病毒； (ii) ONYX-015 病毒； (出）5 24病毒；及 (iv)選自由下列者所組成之群組之病毒：VA1區域突 變之腺病毒、K3L及/或E3L區域突變的牛痘病毒、OV20.0L 31 201005097 基因突變之流感病毒 基因突變之羊副痘病毒、NS-1 34.5基因突變之疱瘡病毒。 3.如申請專利範圍第 哺乳動物。 或2項之方法，其中該動物是 其中該哺乳動物是 4.如申請專利範圍第3項之方法 人類。 5. 如申請專利範圍第1 々戍，其中該至少一種沒 瘤病毒是呼腸孤病毒。 6. *申請專利範圍第5項之方法，其中該呼腸孤病毒⑩ 是灰清型3號呼腸孤病毒。 7·如申請專利範圍第13戈2項之方法，其中該生物樣 品為來自帶有選自由下列者所組成的群組之腫瘤的動物： 肺癌、剛列腺癌、直腸結腸癌、甲狀腺癌、腎臟癌、腎上 腺癌、肝癌、胰臟癌、乳癌 '造血系癌及中樞暨周邊神經 系統癌。

   八、圖式： 無 32