TW200930813A - DNA vaccine comprising IL-6-encoding DNA construct and applications thereof - Google Patents
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200930813 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種含有DNA構築體之DNA疫苗。 本發明亦關於前述DNA疫苗之醫藥組成物及其生產方 法。 【先前技術】 子宮頸癌是女性的主要死亡原因之一，目前已知高 風險型人類乳突病毒（Human Papillomavirus，HPV)如 HPV亞型i6 (HPV-16)的持續性感染與子宮頸癌的發 展與進程是直接相關的。雖然現有的HPV疫苗可被用於 預防子宮頸癌’但還不知道它們是否能夠用於治療HPV 相關之子宮頸癌或減輕既有的HPV感染或HPV相關病 變。因此，發展出一種安全有效的治療性疫苗來治療 HPV相關之子宮頸癌、HPV相關之其他生殖道癌症（如 陰道、外陰、陰莖）和其他位於頭頸部和胃腸系統之Ηργ 相關病變、及治療相同部位的癌前病變是很有用的。 近年來，已在多種疾病模型中開發並評估了 DNA 疫苗，它被視為一種前瞻性治療劑，可用以治療多種疾 病’包括在某些癌症當中作為免疫療法來使用。'治療性 DNA疫苗係被引入接受者之免疫系統的抗原呈獻細胞 (APC)中，以表現蛋白抗原，該蛋白抗原係由第j類 及第11類的主要組織相容抗原（MHC)分子來處理並呈 獻，以誘導免疫反應，如辅助型T細胞反應、毒殺型τ 細胞反應及體液性（抗體）反應，而這會直接導致有表 現前述抗原之腫瘤細胞被免疫系統所清除。 與「傳統」（蛋白抗原）疫苗相較之下，DNA疫苗 200930813 有多種優點，如高特異性、安全性、穩定性、成本效用 (cost-effectiveness )’以及誘導數種類型免疫反應的能 力。與「活菌」及「減毒」疫苗相較之下，DNA疫苗不 具任何感染風險，因為它的製程中只有用到病原體DNa 中的某些序列。另外，DNA疫苗在實際使用上不需要且 有毒性的佐劑。而DNA疫苗在製備上也比「次單位了 疫田（subunit vaccine )來得簡單，因為它在注射到病人 身上之前不需要進行蛋白抗原的表現及純化。 龜 然而’ APC細胞的壽命有限，所以DNA疫苗的效 響 度也會因為APC細胞無法無限期地處理與呈獻抗原而 受到限制。因此，已有數種策略被用來增^ DNA ^苗 的效度，如：藉由融合分子來導向抗原，以增強抗原處 理（Cheng 以 α/.，2001 ; Chen 扣 α/.，2000);以快速胞内 降解（rapid intracellular degradation)的抗原作為導向目 標（Rodriguez “α/·，1997);將之與一 APC受體之配位 體（Boyle1998)或與一病原體序列（如破傷風毒 素之片段C) (King d以·，1998)融合’來使抗原移往 APC細胞；將之與細胞激素共同注射（Weiss以^， ❹ 1998 )、以及將之與cpG券核普酸共同給予病人 (Klinman 以 α/.，1997) ° 目前已有一些用來增強DNA疫苗效果的合併策略 被引入癌症疫苗和免疫療法的開發，而過度表現抗細胞 凋亡分子是一種可能能夠克服APC細胞壽命過短的策 略。舉例來說，給予一包含具有抗原及樹突細胞（DC) 凋亡抑制物之編碼片段的DNA疫苗，可以延長DC細胞 的存活時間’從而增強DNA疫苗的效度（Kim以以， 2003)。其他研究顯示，併用腫瘤抗原與細胞凋亡抑制 物（如Bcl-X卜Bcl-2、XIAP、負顯性胱冬肽酶_9 (dominant negative caspase-9)或負顯性胱冬肽酶_8 )可以增強抗原 200930813 特異性免疫及抗腫瘤效應（Kim eia/·，2003 ; Kim eia/., 2004 ; Kim da/., 2005)。因此，可以透過在活體内抑制 細胞凋亡並延長有表現抗原之DC細胞存活時間這樣的 策略來增強以DC細胞為主的免疫。然而，已知有某些 細胞调亡抑制物（如Bcl-2家族蛋白）會在某些癌症中 有過度表現的情形，這顯示它們與細胞不朽化作用 (cellular immortalization )有關，必須注意這方面的安 全問題。 © 【發明内容】 有鑑於習知DNA疫苗的缺失，本發明之一目的係 開發一種效度有所改善的DNA疫苗，其包含一得自人 類介白素-6 (Interleukin-6，IL-6)基因之序列及一得自 人類乳突病毒E7基因之序列。IL-6和E7的組合會延長 DC細胞的壽命，改善E7抗原之處理與呈獻（pr〇cessing and presentation)，並會增強接受者的免疫反應。 本發明之另一 一目的係提供一種醫藥組成物，I紅各
為了達到上述目的，本發明提供一 種DNA構築體， 前述 又一 其包含： 碼序列。 一表現載體，其可在真核細胞中表現 一核苷酸片段，其包含一江 :以及 IL-6編碼序列及一 E7編 月il述E7編碼序列係可得自hpv 是得自HPV]6者。 在較佳實施態樣中，前 之所有亞型，特別 如述表現载體係 可在人類細胞 200930813 中表現；更佳者，前述表現载體係選自pcDNA3、pSG5 或pCMV ;最佳者，前述表現载體為pcDNA3。 在較佳實施態樣中，前述IL_6編碼序列為SEq ID NO: 3，且前述E7編碼序列為seq id NO: ό。 本發明也提供一種DNA疫苗，其包含： 上述DNA構築體；以及 一顆粒，其係以前述DNA構築體加以包覆。 ❹
在較佳實施態樣中，前述顆粒為金質顆粒；更佳 者，前述金質顆粒之直徑為1.6μιη。 ' 在較佳實施態樣中，其中前述表現载體係可在人類 細胞中表現；更佳者，前述表現載體係選自pcDNA3、 pSG5或PCMV ;最佳者，前述表現載體為pcDNA3。 在較佳實施態樣中’前述IL-6編碼序列為SEQ ID NO: 3，且前述E7編碼序列為seq ID NO. ό。 本發明另提供一種醫藥組成物，其包含上述DNA 疫苗。 —在較佳實施態樣申，前述醫藥組成物進一步包含一 醫藥可接文載劑，更佳者，前述醫藥可接受載劑為ddH2〇 或PBS (填酸鹽緩衝溶液）。 在較佳實施態樣中，前述醫藥組成物係用於治療 HPV所引起的疾病；更佳者’係用於治療生殖道癌症（如 子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、陰莖癌）或癌前病變（如 子宮頸、外陰或陰道之癌前病變）、頭頸部癌症（如口 咽部鱗狀細胞癌（〇r〇pharyngeal叫丽㈣_ 或\腸道癌症（如食道癌或大腸直腸癌广 最佳者’係用於治療子宮頸癌。 8 200930813 本發明又提供一生產上述DNA疫苗之方法，其包 含： (1) 提供一 DNA構築體，其中前述DNA構築體包含： 一表現載體，其可在真核細胞中表現；以及 一核苷酸片段，其包含一 IL-6編碼序列及一 E7編 碼序列，以及 (2) 將前述DNA構築體包覆在顆粒表面。 ❹ 在較佳實施態樣中，前述表現載體為pcDNA3 ;前 述IL-6編碼序列為SEQIDNO: 3，且前述E7編碼序列 為SEQ ID NO·· 6 ;更佳者，前述顆粒為金質顆粒；最值 者’前述金質顆粒之直徑為1.6 μιη。 本發明進一步提供預防或治療HPV所引起的疾病 之方法，其包含： 對已罹患前述HPV所引起的疾病或有發展出該# 病之風險的病患給予有效量之上述DNA疫苗或有效量 @ 之上述醫藥組成物。 在較佳實施態樣中，前述HPV所引起的疾病為生 殖道癌症或癌前病變、頭頸部癌症或胃腸道癌症；更隹 者，前述生殖道癌症包含子宮頸癌、陰道癌、外陰癌及 陰莖癌；前述生殖道癌前病變包含子宮頸、外陰及陰道 之癌前病變；前述頭頸部癌症包含口咽部鱗狀細胞瘤； 且前述胃腸道癌症包含食道癌、大腸直腸癌及肛門癌， 以及其癌前病變；最佳者，前述HPV所引起的疾病為子 宮頸癌。 綜上所述’本發明提供一種DNA疫苗’其包含： 〜DNA構築體’其包含可在真核細胞中表現之表現載 200930813 一核苷酸片段’其包含—IL_6編碼序列及一 優異的效用’可被用於治療 較^起的疾病。此外，本發明亦提供前述DNA疫 田之酉樂組成物及其生產方法。 【實施方式】 因為HPV之早期基因（eadygene)在Hpv的整個 週期都會表現，所以這些早期基因可用作治療性 © 疫苗之目標抗原。我們特別想要將HPV早期基因 E6和E7 (由於它們具有使宿主細胞轉型的能力，也被 稱為致癌基因）祕DNA疫苗，來治療ΗΡν所引起的 疾j，包括生殖道、頭頸部及胃腸道的癌症及相關癌前 病變。然而，有許多DNA疫苗沒有足夠的免疫原性 (nmnunogenicity )，所以不能說它們是有用 是因為這些包含疫苗在内的DNA無法在活=大； 散播，而在有用的治療性DNA疫苗之製造過程中，抗 原的處理與呈獻扮演了一個报重要的角色。 ❹ 介白素-6 (IL_6)是一種正常細胞會表現及分泌的 細胞激素，在T細胞的擴增及活化與B細胞的分化上 扮演重要角色。它也會透過Md] ( myel〇id cdl leukemia-1)路徑來保護細胞，使之免於細胞凋亡。il_6 的這些特性讓它成為一種優選物質，可以用來延長APc 細胞的壽命，從而改善含有IL_62DNA疫苗^ 免疫反應。 下列實施例係用於進一步描述本發明的重要性而 非意圖限制本發明之申請專利範圍。尤置重要的a 本發明中所提及的「E7」係指人類乳突^毒之任二亞 的E7基因。 200930813 實施例 DNA構築及製備 IL-6係使用聚合酶連鎖反應（PCR)加以放大，其 係以人類胎盤互補DNA ( complementary DNA )作為模 板，並使用下列引子對：5’-CCGCTCGAGAGGAGCCCA GCTATGAACTC-3,（ SEQ ID NO: 1 )及 5，-CCGGAATTC GACCAGAAGAAGGAATGCCC-3,（ SEQ ID NO: 2 )。之 後將放大的IL-6核苷酸序列（SEQ ID NO: 3)選殖到 〇 pcDNA3 載體（ Invitrogen，Carlsbad，CA)之 位置，來生產PCDNA3-IL-6。 E7係使用PCR加以放大，其係以CaSki細胞株（一 種含有經嵌入之HPV 16基因體的細胞株，得自ATCC) 之DNA作為模板，並使用下列引子對：5，-CCGGAAGCT TATGCATGGAGATACACCTAC-3,（SEQ ID NO: 4)及 5,-CCCAAGCTTTTGAGAACAGATGG-3, (SEQ ID NO: 5)。之後將放大的E7核苷酸序列（SEQ ID NO: 6)分 別選殖到pcDNA3和pcDNA3-IL-6之所?ίί/ΠΙ位置内， ❹ 來生產pcDNA3-E7和pcDNA3- IL-6/E7(參見第一圖）。 前述pcDNA3-IL-6/E7所含有的IL-6和E7核苷酸序列 會合成一連續的開放讀碼區（open reading frame)，故此 構築體會表現出包含IL-6和E7之融合蛋白。此外，並 將E7核苷酸序列選殖到PcDNA3-Mcl-l (得自台灣中研 院楊性芳博士研究室）之开Ζ>2ί/ΙΙΙ位置内，來生產 pcDNA3_Mcl-l/E7。 其後，以所milll來消化pcDNA3-IL-6/E7或 pcDNA3-Mcl-l/E7，再以由質體 pcDNA3-E7/GFP (得自 Johns Hopkins Medical Institutes 的吳子丑博士經 五消化作用得出的GFP片段補上，連接，來生
II 200930813 產 pcDNA3-IL_6/E7/GFP 和 pcDNA3- Mcl-1/E7/GFP。所 有DNA構築體均以DNA定序加以確認。 小鼠 下文所描述的研究係使用六至八週大的雌性 C57BL/6J小鼠以五隻一組的方式來進行。所有的動物實 驗均依據已核可的程序並依照實驗動物之適當使用及 照護方面的建議在國立臺灣大學醫學院動物中心進行。 DNA免疫作用 製備經DNA包覆之金質顆粒，並使用氦氣基因搶 來進行由顆粒所中介的DNA免疫作用，其係以低壓加 速式基因槍（生物鎵科技股份有限公司，台灣台北）來 進行。將金質顆粒（Bio-Rad 1652263)稱重並懸浮於70% 乙醇中。此懸浮液經劇烈震盪後，離心並收集顆粒。在 以蒸餾水清洗三次後，將0.025 pg收集到的金質顆粒置 ，入Eppendorf管中，並與1〇〇叫之〇.〇5 μ亞精胺 (spermidine)震盪混合，並對混合物進行超音波處理 10至20秒。接下來’加入溶於25 mL ddH20之25 pg DNA，並將混合物加以震盈。加入loo 的1 μ CaCl2， 並將最終混合物加以震盪’在冰上培養1〇分鐘，透過 亞精胺將DNA包覆在金質顆粒上。最後，經包覆之顆 粒以100%乙醇清洗三次，並且再懸浮於2〇〇至250 pL 之100%乙醇中。這些經DNA包覆之金質顆粒懸浮液係 作為基因槍的子彈。溶於ddHbO或pBS中的裸DNA (naked DNA)也可作為子彈使用。使用氦氣排氣壓力 為50 psi之低壓加速式基因槍將經dna包覆之金質顆 12 200930813 粒從已刺毛的腹部送入小鼠體内。 細胞内之細胞激素染色及流式細胞分析 各組小鼠係以下列DNA疫苗當中的一種來進行免 疫：pcDNA3 (無插入序列）、pcDNA3-E7、pcDNA3-IL-6、 pcDNA3-E7 + pcDNA3-IL_6、pcDNA3-Mcl-l/E7 及 pcDNA3-IL-6/E7 (2 pg DNA 構築體/2 pg 金質顆粒/小 鼠）；所有小鼠在一週後接受補強（boost)免疫。其中 Ο 小鼠未進行免疫的DNA原態（naive)組係作為陰性對 照組。補強一週後，犧牲小鼠，收取牠們的脾臟細胞， 將之與 1 pg/ml 之短 E7 胜肽 RAHYNIVTF ( aa 49-57， SEQIDN0: 7)或 10 pg/ml 之長 E7 胜肽 DSSEEEDEIDGP AGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRL ( aa 30-67 » SEQ ID NO: 8)共同培養。一般來說，短E7胜肽可以直接呈 獻；而長E7胜肽則需要先被APC細胞攝入，之後才進 行處理與呈獻。將細胞與前述之短或長E7胜肽混合16 至 20 小時。其後，加入 1 pL/mL Golgistop (PharMigen， _ SanDiego, CA)，來預防細胞激素（如或il-4)分 泌。六小時後’收取細胞，移到管子裡，之後在L200- 1,600 rpm 於 40C 離心 5 分鐘。其後，以 500 pL FACScan 緩衝液（彡谷於PBS之0.5% BSA)清洗細胞，於4°C再 離心5分鐘。細胞再懸浮於以50 pL FACScan緩衝液加 以稀釋之1 ML (0.5飓）與PE共軛結合之抗CD4或抗 CD8抗體（PharMingen)，並將細胞避光培養3〇分鐘。 之後細胞以FACScan緩衝液清洗兩次並離心。這些細胞 再懸浮於500 pL固定緩衝液，在冰上避光2〇分鐘；接 下來，將細胞再次離心，並以500 pL Perm Wash緩衝液
(BioLegendBiotech)清洗。將 1 此（0.5 μδ)與 FITC 13 200930813 共耗結合之抗IFN-γ抗體（PharMingen)或抗IL-4抗體 (Biolegend，San Diego, CA)稀釋到 50 pL Perm Wash 緩衝液中，將之加入前述細胞，並在冰上避光培養3〇 分鐘。將細胞離心並以500 pL Perm Wash緩衝液清洗兩 次。之後將細胞再懸浮於300至500 pL FACScan缓衝 液’並以流式細胞法加以分析。所有經雙重染色的細胞 均以配備 CELLQuest software ( Becton Dickinson Immuno- cytometry System, Mountain View, Calif., USA) 的FACScan或FACSCalibur以標準程序進行分析。結果 ❹ 顯示於第二圖。 第二圖a顯示了 E7特異性之lFN-γ分泌性CD4+ T 淋巴球的流式細胞分析，而第二圖b及第二圖c的柱狀 圖則分別描繪出每3.5xl〇5個脾臟細胞中E7特異性之 IFN了分泌性CD4+ T淋巴球和E7特異性之IL-4分泌性 CD4+T淋巴球的數目。這些數據顯示，以IL_6/F7進行 免疫這一組的小鼠會比其他組生產出更多的E7特異性 之IFN了分泌性CD4+ T淋巴球和E7特異性之IL-4分泌 性CD4+ T淋巴球。易言之’ IL_6/E7可活化Thl路徑（第 ❹ 二圖b )和Th2路徑（第二圖c )。 第二圖d顯示了 E7特異性之π?Ν-γ分泌性CD8+ T 淋巴球的流式細胞分析，而第二圖e的柱狀圖則描繪了 E7特異性之iFN-γ分泌性CD8+ τ淋巴球的數目：il_6/E7 會活化毒殺型T淋巴球（第二圖e)。 無淪我們在這些實驗中使用哪一種E7胜肽，和單 以E7進行免疫之小鼠相較之下，以IL_6/E7進行免疫之 小鼠體内CD4+ IFN-γ分泌性和CD8+ IFN_Y分泌性之E7 特異性Τ淋巴球的數目都明顯較高。 200930813 抗E7抗體之酶標記免殘吸附測定法（ELISA) 在最後一次免疫後14天時，抽取所有小鼠的血清， 並藉由下述直接酶標記免疫吸附測定法將之用於偵測 HPV-16之E7特異性抗體。 ' 將100 pL得自細菌的HPV-16 E7蛋白（0.5 pg/ml) 塗覆在一 96-微孔盤上’並於4°C培養隔夜。之後這些 孔洞以含有20%胎牛血清之pbS於37°C封阻（block) 2小時’之後加入100 pL在PBS中以1 : 100、1 : 500 或1 : 1，000比率稀釋的血清，再將孔盤於370C培養2 小時。之後這些孔洞以含有0.0^% Tween 20之PBS加 以清洗’再以與過氧化酶共軛結合之兔子的抗小鼠IgG 抗體（Zymed，SanFrancisco，CA) 1 : 2,000 稀釋液於室 溫培養1小時。清洗孔盤，以l_StepTurboTMB-ELISA (Pierce，Rockford, IL)來顯色，之後以 1MH2S04 中止 反應’並以標準ELISA分析儀在450 nm讀取ELISA盤。 第二圖f顯示了在以各種DNA疫苗進行免疫之小 鼠身上的E7特異性抗體。以IL_6/E7 DNA疫苗進行免 疫之小鼠的效價會比其他組要來得高。 活體内腫瘤保講眚 為了測定我們觀察到E7特異性T細胞免疫性增強 的情形是否能夠轉化為明顯的E7特異性之保護性抗腫 瘤效應’進行下列活體内腫瘤保護實驗。各組小鼠係以 pcDNA3 (無插入序列）、pcDNA3-E7、pcDNA3-IL-6、 pcDNA3-E7 + pcDNA3_IL_6、pcDNA3 Mcl l/E7 或 pcDNA3_I^6/E7進行免疫（2 小鼠），且所有小鼠在 一週後接雙補強。在補強一週後，對小鼠皮下注射5χ1〇4 15 200930813 ，TC-1細胞/小鼠，進行攻毒（chaiienge)。這些小鼠會 受到監，，直到TC-1攻毒後60天為止。小鼠未進行免 疫的原態組係作為陰性對照組。 〇 TC-1細胞係在補充有10% (v〇l/v〇l)胎牛血清、50 單位/mL之青黴素/鏈黴素、2mMZ-麩醯胺酸、1 mM丙 嗣酸鈉、2 mM非必須胺基酸（Gibco company)及0.4 mg/mL G418 之 RPMI-1640 中於 37°C 及 5% C02 下生 長。在腫瘤攻毒曰時’利用胰蛋白酶消化作用將TC-1 細，收取下來，以lxPBS清洗兩次，最後再懸浮於TCM ® 攻毒用的lxHanks緩衝鹽溶液。 在以TC-1腫瘤細胞進行攻毒後，100%接受il_6/E7 DNA疫苗的小鼠在第6〇天時都保持在無腫瘤狀態。只 有40°/。接受Mcl-1/E7 DNA疫苗的小鼠保持在無腫瘤狀 態’而其他組別的所有小鼠（包括E7組）都在TC-1攻 毒後14天内發展出腫瘤。結果顯示於第三圖a。 适體内抗體魏盡（antibody depletion)竇驗 ® 為了決定淋巴球亞群（CD4+ T淋巴球、CD8+ T淋 巴球及ΝΚ淋巴球）是否在抗腫瘤效應中扮演重要角 色，我們進行了一項活體内抗體耗盡實驗。小鼠係以 IL-6/E7 DNA疫苗進行免疫，一週後補強，之後接受淋 巴球亞群的耗盡處理，其中單株抗體GK1.5係用於CD4 耗盡（Berkeley Antibody Company)，單株抗體 2.43 係 用於 CD8 耗盡（Berkeley Antibody Company)，而單株 抗體PK136係用於自然殺手細胞（Natural Killer) 1.1 耗盡（Berkeley Antibody Company )。 將這些早株抗體以腹腔注射方式送入小鼠體内。耗 16 200930813 盡一週後’所有組別的小鼠均以5X1 〇4個TC-1細胞/小 鼠進行攻毒。流式細胞分析顯示這些特定淋巴球亞群有 99%已耗盡，但其他亞群則維持在正常數量（數據未顯 示）。所有小鼠都在進行腫瘤攻毒後第4〇天終止實驗。
所有原態組的小鼠和所有CD8+ τ細胞耗盡的小鼠 都在TC-1攻毒後14天内長出腫瘤。此外，2〇%CD4+T 細胞耗盡的小鼠和40%自然殺手細胞hl'細胞耗盡的小 ^會在T(^-l攻毒後60天内發展出腫瘤。結果顯示於第 二圖b，這項結果表示，CD8+ 丁細胞、CD4+ Τ細胞和 ❹ NK細胞對IL-6/E7 0皿疫苗所產生的抗腫瘤免疫性來 說都很重要。 活體内腫瘤治唪眚龄 由於肺臟血行性散播（lung hemat〇genous spread) 的模型與癌症轉移相似，所以藉由這個模型來評估
IL 6/E7嵌a型DNA疫苗（咖脱也江_6/£7 DNA ❿
VaCCine)的治療效力（參見Chengeia/.，2005a)。在本 ^驗中，係將5χ104個Τ(Μ細胞由尾部靜脈注射到小鼠 身上。兩天後，各組小鼠係以pcDNA3 (
Pc腦-E7、pc隐IL_6、p__ = H PCDNA3_MC1_1/E7 或 _购 il 6/E7 天進行-次補強免疫。tcm S組者來估算並計算各組小鼠之肺it …即小既未進盯免疫的原態組係作為陰性對照組。 各、.且、、二免疫之小鼠的代表性/士 一 肺部腫瘤結節數目分別肺臟重量平均值和 刀刎顯不於第四圖b及第四圖C。盘 17 200930813 其他組別的小鼠相較之下，以IL-6/E7進行免疫之小鼠 的肺臟重量會低很多’而他們的肺部腫瘤結節也明顯地 比其他所有組別的小鼠要來得少。 ‘ 為了對礙合型DNA疫苗進行直接的比較，將小鼠 分組並使用二種不同的疫苗組合來進行免疫：只使用 IL-6/E7 DNA、只使用 ETA(dII)/E7 DNA (Hung d α/.， 2001 )或混合使用 IL-6/E7 與 ETA(dII)/E7 DNA，之後每’ 7天補強一次。在TC-1攻毒28天後殺死這些小鼠，並 如前文所述來估算肺部腫瘤結節。結果顯示於第五圖a ❹ 及第五圖b。在三組小鼠中，以IL-6/E7與ETA(dII)/E7 混合進行免疫之小鼠的肺臟重量最低，且肺部腫瘤結節 最少。結果顯示於第五圖。 虫JjA疫之小鼠的腹股溝淋巴結槊備CD11C+榭突細胞 用基因搶在小鼠腹部進行pCDNA3-GFP、 pcDNA3-E7/GFP、pcDNA3-Mcl-l/E7/GFP 或 pcDNA3- IL-6/E7/GFP的皮内注射。在進行免疫1天或5天後， ❿ 收取所有小鼠的腹股溝淋巴結。再使用CDllc (N418) 微顆粒（Miltenyi Biotec，Auburn，CA )從淋巴結中富集 (enrich)細胞表面有CDllc+表現的樹突細胞。使用膜 聯蛋白V-PE之細胞〉周亡貞測套組（annexjn v_pe. apoptosis detection kit » BD Bioscience, San Diego, CA) 來偵測GFP+ CD1 lc+細胞中的凋亡細胞，而以流式細胞 法來計算凋亡細胞之百分比。小鼠未進行免疫的原態組 係作為陰性對照組。此外，將2χ1〇4個上述經富集之 CDllc+樹突細胞與2xl〇6個Ε7特異性之CD8+T細胞株 共同培養（參見Kim以α/·，2003 )。之後將這些細胞做表 面CD8及細胞内IFN-γ兩種染色，再如上述以流式細胞 18 200930813 法加以分析。 ❸
流式細胞分析的結果係顯示於第六圖a’而細胞〉周 亡偵測套組的結果係顯示於第六圖b-d。如第六圖b所 示，+在進行，疫後第1天時’各組腹股溝淋巴結中的 GFP+CDllc+細胞數目並無明顯差異。然而在第5天時， 我們發現，與以E7/GFP和僅以GFP進行免疫的組別相 較之下，從以Mcl-1/E7/GFP和IL-6/E7/GEP進行免疫之 小鼠收取下來的淋巴結中的GFP+ CDllc+細胞百分比會 比較高。 我們進一步測定從各組小鼠之腹股溝淋巴結中取 得之GFP+ CDllc+細胞的細胞凋亡情形。與以GFP或 E7/GFP進行免疫之小鼠相較之下，以帶有IL-6/E7/GFP 或Mcl-1/E7/GFP之DNA進行免疫之小鼠的调亡細胞百 分比明顯較低，如第六圖c所示。易言之，樹突細胞之 細胞凋亡會被IL-6/E7或Mcl-1/E7 DNA免疫作用所抑 制。 我們並估算了這些經富集之CDllc+樹突細胞在刺 激IFN-γ分泌方面的能力。如第六圖d所示，我們比較 了在以基因搶進行免疫後1天和5天時的經富集之 CDllc+樹突細胞。與以GFP和E7/GFP進行免疫之小鼠 相較之下，從以IL-6/E7/GFP或Mcl-1/E7/GFP進行免疫 之小鼠分離出來的CDllc+樹突細胞在活化E7特異性之 CD8+T細胞株分泌IFN-γ方面是比較有效的。 使用CaSki細胞作為目標細胞的毒殺型T淋巴破 測定法 從HLA-A2陽性之人類志願者身上取得周邊血液單 19 200930813 核細胞’並將之暴露在顆粒球_巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF) ( 800U/ml)及江_4 (500U/ml)中 6 天，將 之誘導分化為樹突細胞（DC)。將分化後的DC細胞分 組’且各組使用50 mmol/l得自以pCDNA3 (無插入序 列）、pcDNA3-E7、pcDNA3-IL-6 或 pcDNA3-IL-6/E7 DNA 構築體轉染隔夜之293 DbKb細胞的溶胞產物進行衝擊 (pulsed) ’之後各組經衝擊之dc細胞與得自相同人類 志願者之新鮮周邊金液單核細胞共同培養，產出四種E7 特異性之CD8+T細胞。之後進行測定法，其中係 © 以各種E7特異性之CD8+ T細胞作為效應細胞（effect〇r cell) ’並以CaSki細胞作為目標細胞（target cell)。毒 殺型T細胞活性值（CTL level)係使用標準乳酸脫氫酶 (LDH )釋出測定法來加以測量（參見cheng ei «/.， 2005b)。效應細胞和目標細胞（每孔洞有& 1〇4個目標 細胞）係以多種比率（1 : 1、5 : 1、15 : 1及45 : 1 ) 混合在一起’且最終體積為200 pL。這些細胞混合物係 於37°C培養5小時，之後收集50 juL的培養基，來估算 培養基中LDH的置’並根據CytoTox測定套組（Promega, Madison，WI)的說明書來計算溶胞（celllysis)的百分 ® 比。所有實驗均為三重複實驗。 如第七圖所示，與經E7蛋白衝擊之E7特異性毒殺 型T細胞相較之下，經IL-6/E7蛋白衝擊之毒殺型τ細 胞所引起之CaSki細胞特異性溶胞百分比明顯較高。 統計分析 以平均值±SEM表示的所有數據都代表至少兩次不 同的實驗。利用流式細胞分析得出的細胞内細胞激素染 色數據和腫瘤治療實驗數據係以變異數分析（ANOVA) 20 200930813 來加以估算。 【圖式簡單說明】 第一圖為DNA構築體pCDNA3-IL-6/E7之示意圖。 弟一圖顯示了經免疫之小鼠的E7特異性免疫狀態 (immunological pr0file )。⑷由各組中E7特異性之 IFN-γ分泌性CD4+ T淋巴球得出的流式細胞分析代表 圖。（b)該柱狀圖描繪了每3.5x1ο5個脾臟細胞中E7特異 ❹ 性之IFN-γ分泌性CD4+ T淋巴球的數目（平均值±SEM， 尸<0.05 ’單因子變異數分析(one_way ANOVA))。（c)該柱 狀圖描繪了每3.5xl05個脾臟細胞中E7特異性之il-4 为泌性CD4 T淋巴球的數目（平均值士SEM，/^<0.01， 單因子變異數分析）。（d)由各組中E7特異性之IFN-γ分 泌性CD8+ T淋巴球得出的流式細胞分析代表圖。（匀該 柱狀圖描繪了每3.5xl05個脾臟細胞中E7特異性之 IFN-γ分泌性CD8+ T淋巴球的數目（平均值土SEM， Ρ<0·01 ’單因子變異數分析）。⑺該柱狀圖顯示了以各 種DNA疫苗進行免疫之小鼠身上的E7特異性抗體（平 均值士SEM，尸<〇.〇1，單因子變異數分析）。 第三圖顯示小鼠之活體内腫瘤保護實驗和活體内 抗體耗盡實驗的結果。（a)以各種DNA疫苗進行免疫之 小鼠的活體内腫瘤保護實驗。（b)以IL-6/E7 DNA疫苗進 行免疫之小鼠的活體内抗體耗盡實驗。 第四圖顯示了在小鼠身上使用高治療劑量的活體 内腫瘤治療結果。（a)各組經免疫之小鼠的代表性肺部腫 瘤結節。1 :原態（naive )，2 :無插入序列，3 : E7，4 : IL-6，5 : E7 + IL-6 ’ 6 : Mcl-1/E7 ’ 7 : IL-6/E7。（b)各 組經免疫之小鼠的肺臟重量（平均值±8£]^1，尸<0.001， 21 200930813 i,因：ϊ f„斤)。⑻各組經免疫之小鼠的肺部腫卢 結郎數目（料似職，？<_，單因子變異數分析)瘤 腫㈣療實驗的結果，其係比 να疫苗進行治療之小鼠身上的抗 士SE"l’/2001 ’單因子變異數分析〕。⑻各組經 之小鼠的肺部腫瘤結節數目（平均值±SEM)。 尤疫
第六圖顯示了經免疫之小鼠的腹股溝淋巴結 DN A轉染之樹突細胞的流式細胞分析，以及從經之 小氣的腹股溝淋巴結分離出來的E7特異性之CD8+ T纟 胞活化情形。（a)代表性流式細胞數據，其係單核球群體 (gated monocytes)中經 GFP 轉染之 CDllc+細胞的 分比。（b)該柱狀圖描緣了在單核球群體中cDllc+ GFp+ 單核球的百分比（平均值士SEM，ρ<〇.〇ι，單因子變異 數分析）°(c)該柱狀圖描繪了在CDllc+ GFP+細胞中〉周 亡細胞的百分比（平均值土SEM，ρ<〇.〇ι，單因子變異 數分析）。（d)該柱狀圖描繪了每ιχ1〇5個細胞中Ε7特^ 性之IFN-γ分泌性CD8 Τ細胞的百分比（平均值士SEM'， Ρ<0·001，單因子變異數分析）。 第七圖顯示了 Ε7、IL-6及IL-6/E7的CTL·測定結 果’其中經Ε7、IL-6或IL-6/E7蛋白衝擊的Ε7特異性 之CD8+ Τ細胞係用作效應細胞，而caSki細胞則用作 目標細胞。E: T比率為效應細胞對目標細胞的比率，IL_6 為介白素-6。 【主要元件符號說明】 無 22 200930813 參考文獻
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Claims (1)
- 200930813 十、申請專利範固： 種DNA構築體’其包含： 二表’載體，其可在真核細胞中表現；以及 一核苷酸片段，其包含一 IL 6編碼序 一 E7 序列。 2.如申請專利範圍第1項所述之DNA構築體，其中前 述表現載體係可在人類細胞中表現。 3’如申請專職圍第2項所述之DNA構築體，其中前 ® 述表現载體係選自pcDNA3、pSG5或PCMV。 4. 如申請專利範圍第3項所述之DNA構築體，其中前 述表現载體為pcDNA3。 5. 如申請專利範圍第1項所述之DNA構築體，其中前 述1L-6編碼序列為SEQ ID NO: 3。 6·如申請專·®第1項所述之DNA構築體，其中前 述E7編碼序列為SEQ ID NO: 6。 7· —種DNA疫苗，其包含： $㈣專利範園第i項所述之DNA構築體；以及 顆粒’其係以前述DNA構築體加以包覆。 8.如申請專利範圍第7項所述之DNA疫苗，其中前述 顆粒為金質顆粒。 〃 9’如申切專利範園第8項所述之dNa疫苗，前述金質 顆粒之直控為1.6 。 ίο·如申請專利範園第7項所述之DNA疫苗，其中前述 表現載體係可在人類細胞中表現。 11. 如申請專利範園第10項所述之DNA疫苗其中前述 表現載體係選自pCDNA3、pSG5或pCMV。 12. 如申請專利範圍第n項所述之DNA疫苗，其中前述 24 200930813 表現载體為pcDNA3。 13. 如申請專利範圍第7項所述之DNA疫苗，其中妒 IL-6編碼序列為seq ID Ν〇· 3。 八剛迹 14. 如申請專利範圍第7項所述之DNA疫苗，其中驴 Ε7編碼序列為SEQ ID NO: 6。 别κ 15. —種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍 之DNA疫苗。 厅述 16·如申請專利範圍第15項所述之醫藥組成物，其進— φ 包含一醫藥可接受載劑。 八 ’ 17. 如申請專利範圍第15項所述之醫藥組成物，其係用於 治療HPV所引起的病病。 18. 如申請專利範圍第17項所述之醫藥組成物，其係用於 治療子宮頸癌、陰道癌、外陰癌或陰莖癌。 19. 如申請專利範圍第18項所述之醫藥組成物，其係用於 治療子宮頸癌。 20·如申請專利範園第π項所述之醫藥組成物，其係用於 治療子宮頸、外陰或陰道之癌前病變。 ❹ 21.一種生產如申請專利範園第7項所述之DNA疫苗的 方法’其包含： (1) 提供一 DNA構築體’其中前述DNA構築體包含： 一表現載體，其可在真核細胞中表現：以及 一核苷酸片段，其包含一 IL-6編碼序列及一 E7 編碼序列；以及 (2) 將前述DNA構築體包覆在前述顆粒表面。 22. 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中前述表現載 體為 pcDNA3。 23. 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中前述IL_6 25 200930813 編碼序列為SEQ ID NO: 3。 24. 如申請專利範圍第21項所述之方法，A Λ — ，、了剐遮Ε7編 碼序列為SEQ ID NO: 6。 25. 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中前述顆粒為 金質顆粒。 前述金質顆粒之 26.如申請專利範圍第25項所述之方法， 直控為1.6 μιη。27. —種預防或治療hpv所引起的疾病之方法，其包人. 對已罹患前述HPV所引起的疾病或有發展出. 之風險的病患給予有效量之如申請專利範圍第 述之DNA疫苗、或有效量之如申請專利範圍第15項 所述之醫藥組成物。 28. 如申請專利範圍第27項所述之方法，其中前述Ηρν 所引起的疾病為子宮頸癌、陰道癌、外陰癌或陰莖癌。 29. 如申請專利範圍第28項所述之方法，其中前&HP°V° 所引起的疾病為子宮頸癌。 30.如申請專利範圍第27項所述之方法，其中前述 所引起的疾病為子宮頸、外陰或陰遒之癌前病變。 26
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