TW200900507A - Processes for producing coenzyme Q10 - Google Patents

Description

200900507 九、發明說明：

【發明所屬之技術領域】 本發明係關於以下式（I) OH

所表示之還原型輔酶qig及以下式（π)

(Π) 表示之氧化型輔酶qiq之製造方法。 更詳細的說，係關於一種還原型輔酶Qm之製造方法， 〃藉由養還原型辅酶q W生產性微生物，以得到還原型 輔酶Ql°佔總輔冑Qi〇巾70%以上之微生物細胞，再依需 要將》玄微生物細胞破碎、回收所生產《還原型辅酶。 ^又，亦為關於氧化型輔酶Qig之製造方法，係將前述 微生物細胞或該細胞破碎物作氧化處理後，时氧化型輔 酶QlG，或者由前述微生物細胞或該細胞破碎物回收還原 里輔酶Q10後進行氧化處理以製造氧化型辅酶&。 【先前技術】 還原型輔酶％⑴及氧化型輔冑〜(ιι)為人 中粒腺體之雷4Λ ^ ^ 跟體之電子傳遞鏈構成因子，其作用係在氧化性鱗酸 6 200900507 化反應中作為電子之載體，肖ATP之生成有關。 之荜2生=輔酶^便已因係對各種疾病顯示優良 :理。生理效果之物質，_品以外亦使用在營養補 助食品或化粧品等廣泛用途上。 力一 、 方面，還原型輔酶Qw雖迄今尚未受到注目，但 2來’已有報告顯示其在各種用途上比起氧化型辅酶〜 更為有效。

，比如>，日本專利㈣平丨㈡遍丨號公報中揭示以還 :型輔酶Ql。作為有效成分之具有良好降膽固醇作用的抗 兩膽固醇血症劑、抗高脂血症劑甚至動脈硬化症治療劑及 預防劑。又，特时1(M()9933號公報中，揭示以含有還 原型輔酶Q1G之輔肖Qi。作為有效成分之在口服吸收性上 良好的醫藥組成物。 再者還原型辅酶Q1 〇作為抗氧化劑、游離基清除劑 使：亦有效，R_ Stocker等曾提出還原型輔酶h。相較於脉_ 生月酚、莊紅素或β_胡蘿^素更能有效防止人類[叫低 密度脂蛋白）之過氧化（PrQeeedings Gf NatiQnal〇f

Science of the united states of America, 88 4,1646-1650 1 1991 年）。 在活體内，已知氧化型輔酶Qi〇與還原型輔酶有 某種平衡關係，在活體内’被吸收之氧化型_ Μ還原 型輔酶Q1q會互相被還原/氧化。 還原型輔酶Q1G之製法與氧化型輔酶Qiq同樣，可考 慮用化學合成法，但該合成製程可想而知係煩雜、危險且 7 200900507 高成本的。且，化學合成時’必需使有安全性顧慮之（z)_ 異構物之副產、混入（Biomedical and Clinical aspects of coenzyme Q，3卷，19-30項，1981)最小化。在歐洲藥典中 規疋氧化型輔酶Q 1()之（Z)-異構物之含量必需在〇.丨％以下。 還原型輔酶Q1G之其他製法亦可考慮利用微生物細胞 之方法，即，由還原型辅酶Q1G生產性微生物分離、回收 還原型輔酶Q1q之方法，但上述微生物細胞所生產之還原 型輔酶Q10中含有多量之氧化型輔酶Qi〇，且用已知方法分 離、回收還原型輔酶Q1()之成本很高。 被s己載微生物細胞中存在有還原型輔酶Pi。者，比如， 有以下細菌。 ^ 1)於光合成細菌之培養菌體中，還原型輔酶QiG在總 輔酶Q!。中之存在量’少的情形為5〜1〇重量％，多的情形 為30〜60重量％之例子（特開昭57_7〇834號公報 2)將假單胞菌屬（Pseud〇m〇nas)菌體於氫氧化鈉及連苯

二盼（py—UoD之存在下’以有機溶劑進行加熱萃取後， 以5%連：亞硫酸鈉水溶液處理，再藉脫水濃縮以採取丙 Γ溶部分，取得含有還原型輔以。之油狀物之例(特開 昭60-75294號公報）。 在上述1)及2)中任一者皆以ύ» AtL 2t » „ . 有白以將所侍到之還原型輔酶Qin 氧化化型輔酶Ql°之混合物，或將還原型輔酶Ql。進—步 :化轉變為氧化型輔酶Qi。為目的，還原型 為氧化型輔酶q1g製造過程之中間物質。 1G作 上述υ係使用光合成細菌，不但培養須雜，且上述微 8 200900507 生物細胞中以還原型輔酶q1q之製造作為目的時，在總輔 酶Q1G中還原型辅酶q1g之比例不能說是很足夠。 上述2)包含將己烷相中所含氧化型輔酶以還原劑 連二亞硫酸鈉轉變為還原型輔酶Qu之操作（參照特開昭 60-75294號公報之實施例3)，在微生物細胞中還原型輔酶 Q1 〇佔總輔Q1 〇之比例並不明確。 又，上述1)及2)中並未記载在培養時輔酶Qiq之生產 量° 如以上所述，含有高比例還原型輔酶Qig之微生物細 胞到目前未被報告，且將還原型輔酶qig以工業規模發酵 生產’即，培養微生物以得到還原型輔酶Qi(>佔總辅酶Qi〇 中高比例之微生物細胞’並藉回收還原型辅酶QU以得到 高純度還原型辅酶Q1〇之例亦尚未知。 在此狀況下’若能夠找到培養微生物以大量得到還原 型輔酶Qie所佔比例高之輔酶Q1G之方法，則可作為還原 型輔酶Q i 〇之極有利製造法。 【發明内容】 發明之簡單説明 本發明之目的為提供一種可安全並有效以工業規模生 產還原型輔酶Q1()之方法’其係藉由培養還原型輔酶QW 生產性微生物，以得到含有高比例還原型輔酶qig之微生 物細胞’再由該生物適當回收還原型輔酶Qi〇。 又’本發明之目的亦為提供可依簡便操作製造氧化型 輔酶Q1G之方法’其係藉由培養還原型輔酶qig生產性微 9 200900507 生物’以得到含有高比例還原型輔酶Qi。之微生物細胞， 再將由該生物所得到之還原型輔酶Qi。作為氧化型輔酶仏 製造時之中間產物’並使其氧化以製造氧化型輔酶〜。。 即，本發明為一種以下式（工）

OH

所示還原型_ Ql。之製造方法，其特徵為：在含有 碳源、氮源、磷源及微量營養素所構成之培養基中，進行 還原型輔ϋ (5丨。生產性微生物之培養，以得到還原型輔： Q10佔總輔酶Q】。中70莫耳％以上之微生物細胞，再依需 要將該微生物細胞破碎，將所生產之還原型辅 Y 1 0 有 機溶劑萃取。 又，本發明為一種以下式（π) 〇

其特徵為 在含 10 200900507 有碳源、氮源、磷源及微量營養素所構成之培養基中，進 行還原型輔酶q1g生產性微生物之培養，以得到還原型辅 酶Q10伯總辅酶Q1〇巾70莫耳％以上之微生物細胞，再依 需要將該微生物細胞破碎，將所生產之還原型輔酶氧 化轉變為氧化型輔Qi。後，以有機溶劑萃取；或者，將 所生產之還原型_ Qi。以有機溶劑萃取，再依需要施以 精製處理之後’使還原型卓_ Qi。氧化轉變為氧化型辅酶

Qio。 右依本發明，因藉由微生物之培養、還原型輔酶Q1〇 之：收此種非常簡便之操作，故可在工業規模下便宜地製 =還原型輔酶q1g。又’對於氧化型辅酶Qi。亦可藉簡便之 知作製造。再者’以微生物所生產之該等輔酶Ql。基本上 不3 (Z)異構物’可得到和肉、魚中所含者相同（全E型） 之異構物。

本發明係"T先’培養還原型辅酶Qu生產性微生物， 以得到（發酵出）還原型輔酶Qi。在總輔酶仏。中含有之比例 為〇莫耳％以上，較佳為75莫耳％以上之微生物細胞。 ⑪在、息輔酶Ql。中，如上述含有高比例還原型輔酶Q10 :微生物細胞基本上係以培養可生產還原型辅_ Qi。在總 Q:°中含有之比例為7〇莫耳。/。以上，較佳為75莫耳％ 以上之微生物細胞所得到。 慨王物在總輔酶Qi。 辅酶Qio，比如可利用試管 竟生成多少比例之還原型 21mm、全長 200mm)，將 11 200900507 ，生物培養在1GmL之培養基㈣萄糖酵母 卒取物3g、麥芽萃取物3g)/L、pH6 o]中以说、κ小 時振盪培養(振幅2cm、310往返/分)之方法來進行評價。 、對於以工業規模下之發酵生產其較佳培養條件將在後 述’但上述培養條件為標準化方法之―，目的為使能反映 出作為微生物能力所具還原型制Qi。之比例誤差範圍不 會太大。 在上述培養條件下，將顯示還原型輔酶Q1G在總輔酶 Q〗。中含有之比例為70莫耳％以丨，較佳為75莫耳％以上 之微生物細胞用於本發明中為較佳的。又，更佳者，在上 述培養條件下，以使用每單位培養基之還原型辅酶Q10之 生產能力通常在1μ§/Γη1以上、更佳為2pg/ml以上之微生 物為佳。 此處’上述還原型辅酶Qiq含量及總輔酶Qu中還原 型輔酶Q1G之比例可藉由將微生物細胞經物理性破碎後， 以有機溶劑萃取再進行HPLC分析以確認。具體來說，係 依以下步驟測定。 1) 將微生物增殖液依需要濃縮，將該增殖液體積份 移至螺口試管（内徑16.5mm、全長130mm)，並加入玻璃珠 (425-600pm;SlGMA公司製）ι〇體積份❶ 2) 於氣氣環境氣氛下，對該增殖液體積份添加異丙 醇3體積份及正己烷18.5體積份。 3) 於敗氣環境氣氛下，以3分鐘劇烈振盪進行微生物 細胞之破碎及萃取。 12 200900507 4)將所得到之疏水性有機溶劑相（正己烷相）於減壓下 進行蒸發（浴溫：4〇°C )，再以HPLC做分析。 管柱：YMC-Pack 4.6x250mm(YMc. Co·, Ltd 製） 移動相：甲醇/正己烷=85/15 流速：1 mL/min 檢出：UV275nm 滞留時間：還原型輔酶q 1 〇 1 3.5分 氧化型辅酶Q1G 22.0分 上述測定方法係為使所得到結果極正確反映出還原型 辅酶Q1()含量及總輔酶q1g中還原型輔酶Qie之比例，且可 最低限度保證還原型輔酶qig含量及比例標準化而被採行 之方法。該方法為本發明者等經過數次實驗所發現之實施 容易且適切之方法。 本發明所使用之上述還原型輔酶qiq生產性微生物， 可使用細菌、酵母、真菌任一者而無限定。上述微生物具 體上’比如有農桿菌（Agrobacterium)屬、麴黴菌（Aspergillus) 屬、醋酸菌（Acetobacter)屬、胺基桿菌（Amin〇bacter)屬、 農單胞菌（Agromonas)屬、嗜酸菌（Acidiphilium)屬、布雷 絡酵母菌（Bulleromyces)屬、布雷拉菌（Buuera)屬、布佛迪 單胞菌（Brevundimonas)屬、隱球菌（Cryptoeoccus)屬、開奴 思非拉菌（Chionosphaera)屬、念珠菌（Candida)屬、西利奴 司提魯思菌（Cerinosterus)屬、艾克索費拉菌（Exis〇phiala) 屬、外擔孢子菌（Exbasidium)屬、非羅酵母菌（Fei1〇myces) 屬、線黑粉菌（Filobasidiella)屬、線擔孢子菌（Filobasidium) 13 200900507 屬、地黴（Geotrichum)屬、杯黑粉菌（Graphiola)屬、葡糖酸 桿菌（Gluconobacter)屬、扣克維拉菌（Kockovaella)屬、庫 爾茲曼酵母菌（Kurtzmanomyces)屬、拉拉亞菌（Lalaria)屬、 白孢酵母（Leucosporidium)屬、退伍軍人病菌（Legionella) 屬、甲基桿菌（Methylobacterium)屬、土 壌絲菌（Mycoplana) 屬、卵孢子酵母菌（Oosporidium)屬、假單胞菌（pseu(i〇monas) 屬、假發酵菌（Pseudozyma)屬、副球菌（paracoceus)屬、皮 托酵母菌（Petromyces)屬、紅酵母（Rhodotorula)屬、紅擔孢 1 : 子菌（Rhodosporidium)屬、根單胞菌（Rhizomonas)屬、紅瘤 菌（Rhodobium)屬、紅平菌（Rhodoplanes)屬、紅假單胞菌 (Rhodopseudomonas)屬、紅細菌（Rhodobacter)屬、擲孢酵 母（Sporobolomyces)屬、司伯迪歐伯樂司酵母（Sporidiobolus) 屬、赛托艾拉菌（Saitoella)屬、裂殖酵母 (Schizosaccharomyces)屬、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas) 屬、孢子絲菌（Sporotrichum)屬、共柄體黴菌 (Sympodiomycopsis) 屬 、擔 子柄擔 孢子菌 (ί J (Sterigmatosporidium)屬、塔發利那菌（Tapharina)屬、銀耳 (Tremella)屬、絲孢酵母（Trichosporon)屬、腥黑穗粉菌 (Tilletiaria)屬、托力波孢子菌（Tolyposporium)屬、白粉菌 (Tilletiopsis)屬、黑粉菌（Ustilago)屬、午丹尼歐酵母 (Udeniomyce)屬、黃葉酵母（Xanthophllomyces)屬、黃桿菌 (Xanthobacter)屬、擬青黴（Paecilomyces)屬、頂孢黴 (Acremonium)屬、亥后莫内思菌（Hyhomonus)屬、根瘤菌 (Rhizobium)屬等微生物。 14 200900507 以培養容易度或生產性之觀點上，以細菌（較佳為非 光合成細菌）及酵母為較佳，比如，細菌有農桿菌 (Agrobacterium)屬、葡糖酸桿 g(Gluc〇n〇bacter)屬，酵母 有裂殖酵母（Schizosaccharomyces)屬、赛托艾拉菌 (Saitoella)屬等。 較佳種有比如’根瘤農桿菌（Agrobacterium tumefacience IF013263)、放射形農桿菌（Agr〇bacterium radiobacter ATCC 4718)、棒麴菌（Aspergillus clavatus JCM1718)、塞里醋酸菌（Acetobacter xylinum IF015237)、 阿加奴恩西司胺基桿菌（Aminobacter aganouensis JCM7854)、奥立各托非克農單胞菌（Agro monas oligotrophica JCM1494)、多食逝嗜酸菌（Acidiphilium multivorum JCM8867)、阿爾巴斯布雷絡酵母（Bulleromyces albus IF01192)、杏布雷拉菌（Bullera armeniaca IFO10112)、縮小布佛迪單胞菌（Brevumdimonas diminuta JCM2788)、羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii IF00609)、阿波巴索達力司開奴思非拉菌（Chionosphaera apobasodalis CBS7430)、冑曲念珠菌（Candida curvata ATCC 10567)、橙黃阿爾巴斯西利奴司提魯思菌 (Cerinosterus luteoalbus JCM2923)、嗜驗艾克索費拉菌 (Exisophiala alcalophila JCM12519)、細枝外擔孢子菌 (Exobasidiium gracile IF07788)、福澤恩西司非羅酵母菌 (Fellomyces fuzhouensis ISO10374)、新型線黑粉菌 (Filobasidiella neoformans CBS132)、卡布蘇羅依吉線擔孢 15 200900507 子菌（Filobasidium capsuloigenum CBS1906)、白地黴 (Geotrichum capitatum JCM6258)、圓柱杯黑粉菌（Graphiola cylindrica IF06426)、次氧化葡糖酸桿菌（Gluconobacter suboxydans IF03257)、不完全扣克維拉菌（Kockovaella imperatae JCM7826)、尼克塔雷庫爾茲曼酵母菌 (Kurtzmanomyces nectairei IFO 1 0 11 8)、切拉西拉拉亞菌 (Lalaria cerasi CBS275.28)、史卡提白孢酵母 (Leucosporidium scottii IF01212)、阿尼沙退伍軍人病菌 (Legionella anisa JCM7573)、依克托固恩甲基桿菌 (Methylobacterium extorguens JCM2802)、分支土 壤絲菌 (Mycoplana ramosa JCM7822)、馬加利提非卵抱子酵母 (Oosporidium margaritiferum CBS253 1)、脫氮假單胞菌 (Pseudomonas denitrificans IAM12023)、蘇奇里恩司假單 胞菌（Pseudomonas shuylkilliensis IAM1092)、財假發酵菌 (Pseudozyma aphidis CBS517.23)、脫氮副球菌（Paracoccus denitrificans JCM6 8 92)、阿力阿西司皮托酵母菌（Petromyces alliaceus IF07538)、黏紅酵母（Rhodotorula glutinis IF01125)、小紅酵母（Rhodotorula minuta IFO0387)、迪歐 玻發紅擔孢子菌（Rhodosporidium diobovatum ATCC1830)、 薩伯利發西司根單胞菌（Rhizomonas suberifaciens IF015212)、東方紅瘤菌（Rhodobium orients JCM9337)、雅 緻紅平菌（Rhodoplanes elegans JCM9224)、沼澤紅假單胞 菌（Rhodopseudomonas palustris JCM2524)、莢膜紅細菌 (Rhodobacter capsulatus SB1003)、和撒提克司擲孢酵母 200900507 (Spoprobolomyces holsaticus IFO1034)、副玫瑰擲包酵母 (Sporobolomyces pararoseus IFO0471)、強森尼司伯迪歐伯 樂司酵母（Sporidiobolus johnsonii IFO1840)、完全賽托艾 拉菌（Saitoella complicata IFO 10748)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe IFO0347)、副帕西模比力司 鞘#*醇單胞菌（Sphingomonas parapaucimobilis IFO15100)、 嗜細胞孢子絲 菌（Sporotrichum cellulophilium ATCC20493)、 帕非歐匹地利共柄體黴菌 (Sympodiomycopsis paphiopedili JCM8318)' 多形擔子柄擔 孢子菌（Sterigmatosporidium polymorphum IFO10121)、阿 德黑西發朝氨醇單胞菌（Sphingomonas adhesiva JCM7370)、紫塔發利那菌（Tapharina caerulescens CBS35 1.35)、金耳（Tremella mesenterica ATCC24437)、皮 癬菌（Trichosporon cutaneum IF01198)、異常腥黑穗粉菌 (Tilletiaria anomala CBS436.72)、網腥黑穗病（Tilletia caries JCM1761)、大葉托力波抱子菌（Tolyposporium bullatum JCM2006)、華西托尼西司白粉菌（Tilletiopsis washintonesis CBS544)、茭草黑粉菌（Ustilago esculenta IF09887)、巨孢 午丹尼歐酵母（Udeniomyces megalosporus JCM5269)、丹 朵河司黃葉酵母（Xanthophllomyces dendrohous IFO10129)、黃色黃桿菌（xanthobacter flavus JCM1204)、 淡紫擬青黴（Paecilomyces lilacinus ATCC10114)、產黃頂 孢黴（Acremonium chrysogenum ATCC1 1550)、西爾司奇阿 那亥后莫内思菌（Hyphomonas hirschiana ATCC33886)、 17 200900507 草木樨組根瘤菌（Rhizobium meliloti ATCC9930)等。 還原型輔酶Q1G生產性微生物，不僅可使用上述微生 物之野生株’亦可適宜使用比如，可將與上述微生物之還 原型辅酶Q10生物合成相關基因之轉錄及轉譯活性或表現 蛋白質之酵素活性作改變或改良之微生物。

將基因之轉錄及轉譯活性或表現蛋白質之酵素活性作 改變或改良之方法’比如有基因重組(包含自身基因改良、 放大破壞或引入外來基因及該基因之改良、放大）或以突 變原進行突變等’但以突變原誘發突變者為較佳。 λ本發明中可使用之較佳微生物為將上述經改變或改良 之微生物、較佳為藉突變原經突變後之微生物，以利用前 ^增殖方法及測定方法進行評價時，呈現還原型輔酶〜 在總輔酶Ql。中含有之比例為7〇莫耳％以上，較佳為Μ 莫耳/。以上’更佳為8〇莫耳％以上，又更佳& ^莫耳％以 2特別較佳為90莫耳％以上之微生物。又，以工業規模 發酵生產時，以每單位培養基之還原型輔酶Ql。之生產 X達心㈤以上，較佳為、/ml以上、更佳為 、X更佳為5Mg/ml以上、特別更佳為叫⑽以上、 物^更佳為Wg/ml以上、最佳為2〇μδ/ηι1以上之微生 之突可利用單—次突變進行，但以料2次以上 ρ逻’、"乂佳。原因為發現隨著在各突變誘發階段，可改 =型辅酶〜之生產能力。當然，做為與突變誘發處 有關之微生物細胞候選者，通常較佳者當然是在以前Ϊ 18 200900507 定方法進行評價時’具有較高還原型輔酶〜 突變誘發處理可利用任意之適當突變原進行。「突變 原」-居之廣義意思不只包含比如具有突變誘發效果之藥 劑’亦包括如uv M射之具有突變誘發效果之處理合 突變原之例子比如有乙基曱烷磺酸酯、uv照射、甲基: 基 亞硝基 脈(N-methy-N'-nitro-N- 崎〇soguanidine，MNNG)、；臭尿㈣（Br〇_rac⑴之類的核 口考酸鹽類似物及確咬類，但不限定於該等。 若依常用之突變誘發技術，在突變誘發之後要接著對 具高還原型辅酶Ql❶生產能力之微生物細胞進行適當之選 擇。其方法為對由單一菌落生長出之培養物進行評價，比 如，使用前述增殖方法及測定方法。因為還原型輔酶仏〇 之結晶會形成白色固體層或無色液相，在菌落之選取時^ 以利用前述測定法適當進行還原型輔酶生產能力之 價。 ^ 本發明之方法中以工業規模下發酵生產還原型輔酶 f高生產性，部分可藉由使用含有還原型輔酶Qi〇在總輔 酶Q1G中含有之比例為70莫耳％以上之微生物細胞得到， 2部分可使用以下所記載之用以使每單位培養基還原型輔 酶Q1()之生產能力提高之適當培養（發酵）條件而得到。而 且，特別是組合使用上述較佳之微生物細胞及以下之較佳 培養（發酵）條件為較佳。 培養通常係在適合微生物增殖之含多量營養素或微量 19 200900507 營養素所構成之培養基中進行。上述營養素比如為由碳源 (比如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、澱粉、玉米糖漿、糖蜜等碳 水化合物；甲醇、乙醇等醇等）、氮源（比如，玉米筋質粉、 硫酸銨、磷酸銨、氫氧化銨、尿素、腺等）、磷源（比如磷 酸錢、磷酸等），及微量營養素（比如鎂、鉀、鋅、銅、鐵、 錳、鉬、硫酸、鹽酸等礦物質；生物素、脫硫生物素、維生 素B1等維生素類；丙胺酸、組胺酸等胺基酸；酵母萃取物或 麥芽萃取物等含維生素類之天然㈣等)所構成，但並不限 定於該等，而可使用一般所使用者。又酵母萃取物等天然 培養基成分中亦含有磷酸鹽等磷源。又上述營養素可適當 組合使用。 培養溫度通常為14〜45。(：，較佳在2〇〜37<t下進行。 未滿15t時，在工業生產上所容許之微生物增殖速度會有 變慢的傾向’而超㉟价之高溫會有容易傷害微生物生存 之傾向。培養pH通常為4〜9,較佳為5〜8βρΗ3以下及pHi〇 以上對微生物增殖易有阻害之傾向。 以工業規模下之發酵生產中，雖然依微生物種類有所 不同’但以培養t將碳源(包含所生成之醇類)之濃度控制 ，實質上對於還原議％之生產能力不會產生不利影 響之濃度内為較佳。而培養液中之碳源濃度較佳為以控制 培養在實質上對於還原型辅冑之生產能力不會產生不 利影響之漢度’即’通常為使能在2〇g/L以下，較佳為5心 以下，更佳為2g/L以下。 為控制碳源之濃度，以採用連續分批式（fed_batch)培 20 200900507 養法為較佳。以 養管理指標基準容存氧濃度(D〇)或殘糖濃度作為培 可控制培養液中碳父：營養源(特別是碳源)之供給， 種類有所不同，作 營養源之供給雖依微生物之 始。營養源之供給可為連續的亦了由培養中途開 源供給時以使上述碳源…二=的…在營養 基中為較佳。 、八匕成刀刀開（为別）供給於培養 f

培養可在逹到所欲還原型辅酶〜。之生 束。支立差^ ni. pa 呀"點ν'口 時間不特別限定’但通常為20〜200小時。 上述培養通常以好氧下進行。 意指培養基中不舍*从名〆 灯乳」一列係 給，較佳氧乳限制(氧氣缺乏)下進行氧氣供 佳“心使培養基中實質上不產生氧氣限 進仃軋氣供給。谇卷诵赍兄 進行。 培4通吊在通氣下，較佳為在通氣攪拌下 使用如上述之微生物及培養條件下，可得到還原型辅 Q〗。在總輔酶q〗g中含有之比例為7〇莫耳％以上、較佳 :75莫耳%以上之微生物細胞。又，亦可得到還原型輔酶 〜之生產量在lMg/ml以上，較佳為2μ§/ιη1以 3叫/ml以上之高值。 吾至 其次，對關於以上述培養所生產之還原型輔酶 回收作說明。 10 本發明中，欲以工業規模下有效製造還原型輔酶Qi〇, 部分可依上述之適當培養使成為可能，又，部分可藉進。行 以下還原型輔酶Q1G之適當回收操作使成為可能。 订 21 200900507 還原型輔酶q1g之回收可藉 細胞使用有機溶劑進行萃取來進1上34培養所得到微生物 進行萃取時，可依需求將前订述細胞破碎。細胞之破碎 係欲將細胞中所生產儲藏之還 * 〇 ^ 辅酶Q10有效萃取出 來虽然，細胞之破碎與萃取亦可同時進行。 又本發明之「破碎 g a /、要在可將還原型辅酶Qi。萃取 出來的程度内使細胞壁等表面構造損傷即τ，不-定需將 r 微生物細胞毀壞或使其斷片化。 又，上述之細胞破碎處理對細菌不—定為必要的。但， 在酵母或真菌通常須要作細胞破碎處理，若不作細胞破碎 時很難將細胞中所生產儲藏之還原型輔酶Ql。有效萃取出 來。 j述微生物細胞之破碎可藉以下一種或幾種破碎方法 以任思順序進行。破碎方法比如，藉物理性處自、化學性 處理、酵素處理之外，肖可藉加熱處理、自我消化、滲透 壓溶解、原生質溶解等進行。 上述物理性處理比如可使用高壓均質機、超音波均質 機、法式擠壓機（french press)、球磨機，或該等之組合等。 上述化學性處理比如可使用鹽酸、硫酸等酸（較佳為強 酸）處理、以氫氧化鈉或氫氧化鉀等鹼（較佳為強鹼）處理或 該等之組合等。 上述酵素處理比如，可使用溶菌酵素、水解酵素 (zymolase) »葡聚糖酵素（glucanase)、脂肪酵素 (Novozyme)、蛋白酵素、纖維素酵素等’亦可使用該等之 22 200900507 適當組合。 上述加熱處理比如，可利用60〜10(rc下處理3〇分〜3 小時左右。 上述自我消化比如有以乙酸乙酯等溶劑處理等。 广以與細胞内鹽濃度不同之溶液處理細胞使細胞被 破壞之滲透壓溶解或原生質溶解，以該方法單獨使用時常 不能達到充分之細胞破碎效果，常和上述之物理性處理、 化學性處理、酵素處理、加熱處理、自我消化等組合使用。 作為還原型輔酶q1g之萃取、回收之前處理之細胞破 碎方法中，較佳者為物理性處理、化學處理（特別是酸處理， 較佳為強酸（比如，在水溶液中pKa為25以下之酸）在如 後述之還原型辅酶Q1G在被保護不受氧化反應之條件下進 行酸處理）或加熱處理為較佳，且由破碎效率之觀點上，以 物理性處理為較佳。 先前之細胞破碎及輔酶Q1G萃取方法，具體而言，在 氫氧化鈉與連苯三酚存在下以有機溶劑萃取之方法，在成 本、廢棄物處理、廢微生物（廢菌體）有效利用（蛋白質回收） 時之安全性等方面有問題。但，本發明中之細胞破碎方法， 特別是物理性處理法不會產生因中和作用而副產多量鹽 類且不僅對於廢棄物處理，對於廢微生物（廢菌體）之有 效利用方面也為適當之方法。 上述細胞破碎中所使用之微生物形態可為培養液、培 養液經濃縮者、由培養液#將微生物細胞以㈣體形式採 取者、將其洗淨者、將濕菌體懸浮於溶劑（比如，亦包含水、 23 200900507 生理食鹽水、緩衝液等）中者 ^ _ 便則述濕菌體乾燥後之私π 菌體、將乾燥菌體懸浮於溶劑 後之乾燥 水、緩衝液等）中者，但較佳者 理食鹽 且由操作性等方面，更佳者；^&_ 「心孑液， 尺住者為培養液、 將其洗淨者。 f狀展縮者或 ，… Ql°之萃取回收時所使用之前述微生物或 该細胞破碎物之形態也和上述_，不特別限定 二

生物細胞或該細胞破碎物之濕菌體或乾燥菌體，"交佳 為’微生物細胞或該細胞破碎物之水性懸浮液，更 =養液、將培養液濃縮者及/3切其洗淨者或㈣之破碎液 (白為水性懸浮液）。 上述微生物細胞或該細胞破碎物之懸浮 度’不特別限定，可以乾燥重量下通常…重量二: 用，但經濟性上以10〜20重量％為較佳。 將藉此所得到之前述微生物細胞及該細胞破碎物，以 有機溶劑進行萃取，可以回收還原型輔酶〜。 萃取時使用之有機溶劑比如有烴類、脂肪酸酿類、醚 類、醇類、脂肪酸類'_類、含氮化合物類（猜類、酿胺類）、 硫化合物等。 _特別是，在萃取還原型輔酶Q1G時’在保護不受分子 氧之氧化之觀點上，以使用烴類、脂肪酸醋類、醚類及腈 至 > 種作為萃取溶劑為較佳，其中又以烴類、脂肪 酸酷類為較佳，以烴類為最佳。 以工業規模製造時，將氧氣完全去除非常困難，且因 24 200900507 個別操作所需時間與在實驗室製造上 長，因此，所路—& 時間變得相當 與由還原型鍤紿八 个不』之影響。上述氧化

、 辅酶Ql〇副生成氧化型輔酶Q 此，在還原剂M A 啤Wo直接相關。因

定原i輔轉Q丨〇萃取時使用 A 果之有機、！ μ 述具有高氧化防護效 有效之萃取。 賦類及腈類)可有助於

烴類不特別限定，比如， iS化烴類等。以脂肪族烴類 族烴類為更佳。 有脂肪族烴類、芳香族烴類、 方香族烴類為較佳，以脂肪 取飽和、非飽和 月曰肪族烴類不論環狀、非環狀 特別限制，但-般以飽和者為較佳。通常，使用碳數： 3 20，較佳為碳數5〜]2，更佳為碳數$〜8者。具體例，比 如’丙烧、丁院、異丁貌、戊院、2_甲基丁院、己烧、2_ 甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,3_二甲基丁烷、庚烷、庚烷 異構物（比如，2_甲基己烷、3_曱基己烧、2,3_二甲基戍院、 2,4_二曱基戊烷）、辛烷、2,2,3_三甲基戊烷、異辛烷、壬

垸、2,2,5-三甲基己炫、癸院、_|_二院、2_戊稀、卜已稀、 h庚烯、1-辛烯、卜壬烯、丨_癸烯、環戊烷、甲基環戊烷、 裒己烷、甲基環己烷、乙基環己烷、對孟烷、環己烯等。 較佳者為戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-曱基戊烷、2,2-二甲 基丁燒、2,3·二曱基丁烷、庚烷、庚烷異構物（比如，2甲 基己烷、3-甲基己烷、2,3-二甲基戊烷、2,4-二甲基戊烷）、 辛烷、2,2,3-三甲基戊烷、異辛烷、壬烷、2,2,5_三甲基己 燒、癸烷、十二烷、環戊烷'曱基環戊烷、環己烷、曱基 25 200900507 環己烷、乙基環己烷、對孟烷等。更佳者為戊烷、2_甲基 丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2,2_二甲基丁烷、2,3_二曱基丁 烷、庚烷、庚烷異構物（比如，2_曱基己烷、3_甲基己烷、 2,3-一曱基戊烷、2,4-二曱基戊烷）、辛烷、2,2,3-三甲基戊 烷、異辛烷、環戊烷、甲基環戊烷、環己烷、曱基環己烷、 乙基環己烷等。 一般而言’庚烷類中較佳為使用庚烷、具有7個碳之 甲基％己烷等庚烷異構物或該等之複數混合物。又較佳為 石反數為5之戊烷類（比如，戊烷等）、碳數6之己烷類（比如， 己烷、環己烷等）、碳數7之庚烷類（比如，庚烷、甲基環 己烧等）等。特別較佳者為由上述在對氧化防護效果特別高 之觀點，為庚烷類（比如庚烷、甲基環己烷等），最佳者為 庚烷。 芳香族fe類，不特別限定，但通常以碳數6〜2〇，較佳 為碳數6〜12 ’更佳為使用碳數7〜10者。具體例，比如有， 苯甲苯、二甲笨、鄰二甲苯、間二曱苯、對二甲苯、乙 本異丙本、丨，3,5 -三甲基苯、四氫萘、丁苯、對甲基異丙 基本、環己苯、二乙苯、戊苯、二戊苯、十二烷基苯、笨 乙烯等。較佳者為甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、 對二甲笑、7 ++ 本、異丙苯、1，3,5 -三甲基苯、四氫萘、丁笨、 對甲基異丙基苯、冑己笨、二乙苯、戊苯等。更佳者為甲 本、一甲笨、鄰二曱苯、間二甲苯、對二曱苯、異丙笨、 四氫萘等。 齒化烴類，不論環狀、非環狀，或飽和、非飽和，無 26 200900507 特別限制’但一般以使用非環狀者為較佳。更 煙類、氟化烴類，而又更佳者為氪化歧 尺住省馬鼠化烴類。又以碳數為i〜6， 較佳為碳冑卜4’更佳為碳數卜2者為適用者。具體例， 比如有’二氯代甲烷、氯仿、四氣化碳、Μ-二氣乙烷、】2_ 二氯乙烧、U山三氣乙烧、U，2_三氯乙院、^2-四氣 乙,、1’1，2’2-四氯乙烷、五氣代乙烷、六氣代乙烷、μ· 二氣乙烯、1，2-二氣乙烯、三氯乙烯、四氣乙烯、a二氣 r

丙烷、1，2’3-三氯丙烷、氣苯、“μ，四氟乙烷等。較佳 者為二氣代甲烷、氣仿、四氣化碳、1，1-二氣乙烷、1)2-二 氣乙烷二三氯乙烷、u，2_三氣乙烷、u•二氣乙烯' 二氯乙烯、三氣乙烯、氣苯、四氟乙烷等。更 ^者為二氣代甲炫、氣仿、二氣乙稀、三氣乙稀、氣 笨、1,1，1，2-四氟乙烷等。 月曰肪酸酯類不特別限定，比如有丙酸酯、乙酸酯、甲 S文酯等。較佳者為乙酸酯、甲酸酯，&更佳者為乙酸酯。 酯基不特別限定，但通常使用碳數i〜8之烷基酯、碳數7〜12 之方烷基酯，較佳為使用碳數之烷基酯，更佳為使用 碳數1〜4之烷基酯。 丙酸酯之具體例，比如有丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸 丁酯、丙酸異戊酯等。較佳者為丙酸乙酯。 乙酸S旨之具體例比如有，乙酸曱酯、乙酸乙酯、乙酸 丙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁 S旨、乙酸二級丁 酉曰、乙酸戊酯、乙酸異戊酯、乙酸二級己酯、乙酸環己酯、 乙酸苯曱酯等。較佳者為乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、 27 200900507 乙酸異丙酯、乙醆丁 ，说田 5曰、乙酸異丁酯、乙酸二級丁酯、 酸戊酯、乙酸異戊酯、7絲 b 1 乙酸二級己酯、乙酸環己酯等。 更佳者為乙酸甲輅— 乙馱乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙醋、 乙酸丁醋、乙酸異丁酿等，最佳者為乙酸乙醋。 曱酸醋之具體例’比如有甲酸甲醋、甲酸乙輯、甲酸 丙酯、甲酸異丙酯、甲 _ ^ β T S曼丁酯、甲酸異丁酯、甲酸二級 酉旨、甲酸戊S旨等。較伟去A m & m 者為甲酸甲醋、甲酸乙醋、甲酸丙 醋、甲酸丁醋、甲酸里T ro f T S文異丁酯、甲酸戊酯等。最佳者為甲酸 乙酉旨。 醚類，不論環狀、非環狀，或飽和、非飽和 限制，但一般以飽和者為鲂祛、SA ± 热符別 t為較佳。通常，使用碳數為3〜2〇， 車义佳為奴數4〜12，更佳a难奴1。〜 尺住馮奴數4〜8者。具體例，比 二乙醚、甲基三級丁驗、- 一丙醚、二異丙醚、二丁 _ 己喊、乙基乙稀基轉、丁基7祕且d m 基乙烯基醚、回香醚、苯乙醚、 2本基醚、甲氧基甲苯、二卿。xane)H 基呋喃、四氫呋喃、四氫哌喃 '乙 - 7甘T丞鞑、乙二醇 一乙基醚、乙二醇二丁基醚、 呼 υ — Θ子早甲基醚、 β 乙基鍵、乙二醇單丁基輕等。較佳者為二乙鱗、甲：= 丁喊、二丙域、二異丙趟、二丁峻、二己趟 二二 乙醚、丁基苯基醚、甲氧基曱笨、二噁烷、2·.、笨 四氫呋喃、四氫哌喃、乙二醇二甲基醚、乙二夫南 乙-醇二丁基醚、乙二醇單曱基醚、乙二乙基醚、 更估本< β 早乙基趟等。 更佳者為二乙醚、甲基特丁基醚、菌香醚、 等 呋喃、乙二醇單甲基醚、乙 似’元、四氫 醇单乙基喊等。又更佳者為 28 200900507 、 丫 基鍵。 、 醇類，不論環狀、非環狀，或飽和、非飽和， 限制，但-般以飽和者為較佳。通常，使用碳:，、、' 4 較佳為碳數卜〗2，更佳為碳數Μ者。1 ‘，、、〜2〇’ 之一元醇，石诗齡？ _ 、 以碳數1〜5 兀％，碳數2〜5之二元醇，碳數3 5 該等醇之具體例，比如古 醇為較佳。 丹瓶妁比如有甲醇、乙醇、工 Γ 醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、= 醇、2-丙 3-戊醇、2_甲基丁醇、里 知、2-戊醇、 醢、紅〇·、 ”戍醉、三級戊醇、3田甘 醇新戍醇、1-己醇、2-甲篡， 甲基-2-丁 乙基-1·戊醇、N庚醇、2_ T基~2-戊醇、 2-乙其， 庚醇、3_庚醇、1-辛醇。. 土-1·己醇、1_壬醇、κ八# - 2-辛醇、 稀丙鮮、丙块醉、苯甲醇十醇、Κ十二醇、 基環己醇、”基環己醇、Γ甲己其醇：”基環已醇、” 1,4 醇 二醇―丙二醇、⑶丙/醇甲基環己醇等-元醇;1，2_乙 二醇、2,3_ 丁二醇:5?’2-丁二醇、如二醇、 上，5、戊二醇等二元醇， 凡羿，甘油等三元 70醇中較佳者為甲醇 丁醇、2-丁觭 乙醇、Κ丙醇、2 π # 丁醇、異丁醇、三组 2_丙醇、κ 醇、2·甲基丨 、丁醇、1 _戊醇、 丞丁醇、異戊醇 戍醇、3-戊 新戊醇、Ip X醇、三級戊醇、3-甲其Λ 1-己醇、2_甲基 甲基-2、丁醇、 戊醇、戍醉、4-甲基-2-戊& ^ 1庚醇、2-庚醇、3_电〜 叹醇、2-乙基、 基-1·己醇、！ 庚醇、1_辛醇、2 -去& Κ壬醇、1-癸a 辛醇、2-乙 醇、環已醇, 、 丨_十一醇、1-十_ r 醇、丨_甲基環已醇、,β * 卞一醇、苯甲 2_甲基環己醇、3-甲基環已 29 200900507 醇、4·，基環已醇等。更佳 丙醇、丁醇、2-丁醇、異 ？醇、乙醇、I.丙醇、2_ 醇、3_戊醇、基]•丁醇^戍三級丁醇、I.戍醇、2•戍 2_ 丁醇、新戊醇、1.己醇、2 ^切、三級戊醇、3-甲基_ 2·乙基小戊醇、環已醇等。又戍醇、 醇、2_丙醇、1-丁醇、2_ 丁醇異者為甲醇、乙醇、！-丙 2_戊醇I:戊醇、2,〜醇丁二三:…^ r 甲基2_ 丁醇、新戊醇等。特别較佳者為甲一級戊醇、3_ 醇、2_丙醇、丁醇、2-丁醇、異丁 ：甲醇、乙醇、"丙 異戊醇等’而最佳者為Μ醇。 2·甲基小丁醇、 二元醇…，2-乙二醇、〗，2_丙二醇、 佳，月:1，2-乙二醇為最佳。三元醇以甘油為較佳。二醇為較 腊肪酸類比如有甲酸、乙 巧較佳 乙酸，最佳者為乙酸。 & °較佳者為甲醆、 嗣類不特㈣定，以❹錢為3〜 例比如有㈣、甲基乙基，、甲基丁基_、甲二：體 等。較佳者為丙嗣、甲基乙基嗣，最佳者為丙二基嗣 猜類不論環狀、非摄壯，+ < & γ i 狀或飽和、非飽和，無特别限

制，但—般以飽和者為較佳。通常，使用碳數為2〜20,較 佳為碳數2〜】2，更佳為碳數2〜8者。 平X 具體例’比如有乙腈、丙腈、丙二腈、丁腈、異丁腈、 丁二腈、戊腈、戊二腈、己腈、庚基氰、辛基氛、十一烷 基腈、十二炫基腈、十三燒基腈、十七㈣腈、硬脂基猜^ 氯代乙腈、溴代乙腈、氯代丙腈、溴代丙腈、尹氧基乙腈、 30 200900507 氰基乙酸甲酯、氰基乙酸乙酯、苯乙腈、苄腈、氯代苄腈、 漠代节腈、氰基苯甲酸、硝基节腈，腈、對苯二甲腈、 溴代苯乙腈、甲基氰基苯曱酸、甲氧基苄腈、乙醯基苄腈、 蔡腈、聯苯基腈、苯基丙腈、苯基丁腈、甲基苯基乙腈、 二苯基乙腈、萘基乙腈、硝基苯基乙腈、氯代节基氰、環 丙腈、環己腈、環庚烷腈、苯基環己腈、甲苯基環己腈等。 較佳者為’乙腈、丙腈、丁二腈、丁腈、異丁腈、戊 二腈、氰基乙酸甲醋、氰基乙酸乙醋、节腈、“腈、氯 代丙腈等，更佳者為乙腈、丙腈、丁腈、異丁腈，最佳者 為乙腈。 N-甲基甲 N-甲基。比 除腈類以外之含氮化合物類比如有甲醯胺 醯胺、Ν，Ν·二甲基曱醯胺、N，N_二甲基乙醯胺 咯烷_等醯胺類或硝基甲烷、三乙胺、吡啶等 硫化合物比如有二亞甲鐵、環丁礙等。 為使溶解 上述有機溶财’以考慮沸點、黏性(比如 度提高可適度加溫，且具有由㈣使耗乾燥去除 析處液中回收溶劑可易於進行之沸點（1大氣壓下約3〇〜i5〇 C) ’及以室温下處理時及室溫以下冷卻時亦不易固化之融 點（約〇 C以上’較佳為約1〇t以上更佳為約⑽以上）， I !·生低（在20C下約l〇cp以下等）)之性質作選定者為佳。 在溶劑中之還原型輔酶〜之氧化防護效果在還原型 每Q!。之高濃度溶液中具有提高之 對於高氣仆P大禮祕1 . T ^ ^ ^ ^10 _ 之上述有機溶劑（比如，烴類、脂肪酸 曰類專）顯示有高溶解性，且該高溶解性使在高濃度溶液下 31 200900507 可進仃處理並且能幫助氧化防護。用於還原型輔酶Qi。之 氧化防效果之較佳萃取濃度不特別限定，但對於上述有 合劑還原型輔酶Q丨。之濃度通常為o.ool重量％以上， 較佳為〇.01重量％以上’更佳為0.1 4量％以上。上限i 特別限定’但通常為10重量％以下。 "’、 + 述有機/谷劑中，由微生物細胞或該細胞破碎物之濕 2或乾燥菌體萃取回收還原型辅酶U，以使用 ^ 佳。具體上，比如有丙酮、乙腈、甲醇、 乙醇、1-丙醇、2_丙醇等。 之二懸由微生物細胞或該細胞破碎物 水性有機溶劑為還：型輔酶Q1°時’以使用疏 ‘、、較佳，且其可幫助除去來自微生物之水溶 質。疏水性有機溶劑多數為前述具有高氧化 之有機溶劑，因此非常適用。 隻政果 佳。4水性有機溶劑以烴類、脂肪酸酯類、醚類為較 水:懸浮二中，微生物細胞或該細胞破碎物之 以物理性處理！胞破碎物之水性懸浮液，特別是 進行萃取時’之水㈣料巾^機溶劑 成乳化物，有白f等細胞成分存在很容易形 述乳化物之形成以進二得困難之傾向，因此抑制上 進订有效萃取變得很重要。 因此’萃取溶劑除 親水性有機溶劑輔/之疏水性有機溶劑，以併用 削作為辅助性溶劑為佳。 32 200900507 此情形中’作為疏水性右 .,^ , ± 性有機溶劑者不特別限定，可使 用上述之物質，但較佳為烴類， 定 族烴類中又以碳數5〜8者為適用者。 知肪 上述碳數5〜8之脂肪族烴 田且丁 κ·〜 、炷類具體例比如有，戊烷、2- 甲基丁烧、己烧、2-甲基戊燒、2,2_二甲基丁燒、 基丁烧、庚烧、庚燒異構物(比如，2_甲基己燒 烷、2,3-二甲基戊烷、2,4_二 土匕 甲土戊虎）、辛燒、2,2,3-三甲 基戊烷、異辛烷、環戊烷、 衣戊況環己燒、甲基環 己烧、乙基環己院等。特別較彳圭& 引敉佳者為己烷、庚烷、甲基環 己烷，最佳者為己烷、庚烷。 7&衣 可與上述疏水有機溶劑組合使用之親水性有機溶劑不 特別限定，可使用上述者’但較佳者為醇類。醇類中又以 碳數1〜5之一元醇為適用者。該等具體例比如有，甲醇、 乙醇、1-丙醇、2-丙醇、卜丁醇、2_丁醇、異丁 _ —、 醇、1-戊醇、2-戊醇、3_戊醇、2_甲基小丁醇、異戊醇、 三級戊醇、3_甲基_2_丁醇、新戊醇等。特別較佳者為甲醇、、 乙醇、1-丙醇、2-丙醇，而最佳者為2-丙醇。 上述親水性有機溶劑及疏水性有機溶劑之使用量 特別限定，但以萃取時之濃度相對於總溶液 不 肢積，較佳 者為親水性有機溶劑佔5-50體積％，疏水性古址 丨王有機溶劍壮 25〜65體積％之範圍。 回收還原型輔酶q 時’萃取時之溫度 .^ , 个将別限制， 但通吊為0〜60。〇，較佳為20~50°C之範圍。 萃取之方法可利用批式萃取或連續式萃取（較佳 ’逆流 33 200900507 多段萃取）任一者之方法，但連續式萃取（較佳為逆流多段 萃取）在生產性方面特別較佳。在批式萃取之攪拌時間不特 別限疋，但通常為5分鐘以上，而連續萃取之平均滞留時 間不特別限制’但通常為10分鐘以上。 回收還原型輔酶Q1G時，以注意避免所回收之還原型 輔酶QlG分解（如，避免使其氧化為氧化型輔酶Q10)為佳。 為此，上述之萃取以在酸性〜弱鹼性條件下，較佳為酸性〜 中性條件下進行為較佳。以pH作為指標時，雖亦取決於 接觸時間，但以pH10以下，較佳為pH9以下，更佳為_ 以下，又更佳為PH7以下。 如以上，可實質上防止氧化反應，但依所需又以在 更嚴密的防止還原型輔酶Qiq被氧化之條件下進行上述細 胞之破碎及/或萃取為佳❶至少在該條件下進行上述萃取為 較佳，且在該條件下進行上述破碎及萃取更佳。

防止受氧化之條件下」比如有在脫氧環境氣氛下（氮 氣、二氧化碳、氦氣、氬氣、氫氣等之惰性氣體環境氣氛 下、減壓下、；弗騰下）；高鹽濃度下，比如較佳為水相之鹽 類（比如氯化鈉、硫酸鈉等無機鹽）濃度在約5%以上之條件 下、強酸（比如，在水溶液中pKa為2·5以下之酸）存在下， 比如， 酸0.1莫耳％以上 對於還原型辅酶Q1G1莫耳存在強 比如，抗壞血酸、捧樣酸、 對於還原型辅酶qig1莫耳 可在還原條件下（氧化型輔酶 之條件），比如，接觸次亞硫 之條件下、抗氧化劑存在下， 該等之鹽或酯類共存下（比如， 為0.1重量％以上）等。又，亦 Qi〇被轉變為還原型輔酶Qu 34 200900507 酸類等之還原劑。 2上之培養（發酵）及萃取，還原型辅酶A。可被適 田 回收。較佳者為可得到含有 佔總辅酶之中7n ^ 1。比例 萃取液。 冑耳％以上’較佳為75莫耳％以上之 管柱層析去i 原型_ Ql°之萃取液可依所需以 > =析法、還原處理等進行精製後，以晶析操作

向純度之還原型_ Qie結晶。又，該情形下—連串之操 作以在上述「防止受氧化之條件下」進行為佳。 ’、 本發明亦可將上述微生物細胞或該細胞破碎物 处里後之氧化型輔冑以有機溶劑萃取，或者由前述微 生物細胞或該細胞破碎物將還原型_ Qi。以有機溶劑萃 取，再依需要施以精製處理後，#進行氧化處理 化型輔酶q1q。 k

上述氧化比如可藉將還原型輔酶Q1◦(較佳為含有上述 還原型輔酶q1g之微生物細胞或該細胞破碎物之水性辩= 液或者還原型輔酶Q1()之萃取液）與氧化劑（比如，二氧^ 錳）混合，在比如室溫下（比如，30t)處理3〇分鐘來進行。 將微生物細胞或該細胞破碎物經氧化處理後，對於氧化型 辅酶Q1G之萃取操作可依與上述還原型輔酶之萃取操 作同樣進行，並且藉此可以有效回收還原型輔酶Ql。又 氧化型輔酶Q】G之回收不需要在還原型輔酶回收時所 建議之「防止受氧化之條件下」進行，只要考慮通常之安 全操作實施即可。以此所得到之氧化型輔酶Q丨G 35 200900507 求以管柱層析進行精製，並且使用最終之晶析操作，取得 到高純度之氧化型輔酶Qiq之結晶。 【實施方式】 以下舉實施例對本發明更進一步說明，但本發明不限 定於該等實施例。 (實施例1) 將下表1〜3之各種輔酶生產性微生物用試管（内徑 21mm、全長20〇mm)培養在1〇Γη[之培養基[(葡萄糖2〇§、 脒5g、酵母萃取物3g、麥芽萃取物3g)/L、pH6.〇]中，以 25 C 72小時振蘯培養（振幅2cm、3 1 〇往返/分），將所得 到之增殖液依需要濃縮，並在氮氣環境氣氛下對該增殖液 1〇體積份，在異丙醇3體積份及正己烷185體積份共存 下，用玻璃珠（425〜60〇μηι)10體積份，作3分鐘激烈振盪 進行細胞之破碎及萃取。將所得到之己烷相於減壓下蒸發 (40°C )，並以高速液相層析法（HpLC)分析以檢查還原型辅 酶Q 1 0比例及還原型輔酶Q 1 G生產量。 HPLC條件 管柱.YMC-Pack 4.6><250mm(YMC· Co·，Ltd 製） 移動相：甲醇/正己烧=85/1 5 流速：lmL/min 檢測：UV275nm 結果如表1〜3所示，又，還原型辅酶Q1G比例係意指 以還原型輔酶q1q及氧化型輔酶Qig波峰面積及兩者之莫 耳吸光係數比（1:7.5)為基準，將還原型辅酶相對於氧 36 200900507 化型輔酶Q丨〇及還原型輔酶Q1 〇總和之比例以莫耳百分率 表示。 表1

菌株名 上段：還原型輔酶qid比例(％) 下段:還原型輔酶Q1()生產量(pg/ml) 根瘤農桿菌IFO13263 82 (Agrobacterium tumefacience) 7 放射形農桿菌 ATCC 4718 (Agrobacterium radiobacter) 78 7 棒麴菌JCM1718 83 (Aspergillus clavatus) 2 塞里醋酸菌IF015237 77 (Acetobacter xylinum) 2 阿加奴恩西司胺基桿菌JCM7854 70 (Aminobacter aganouensis) 3 奥立各托非克農單胞菌JCM1494 75 (Agromonas oligotrophica) 2 多食逝嗜酸菌JCM8867 73 (Acidiphilium multivorum) 3 阿爾巴斯布雷絡酵母IFOl 192 72 (Bulleromyces albus) 2 杏布雷拉菌IFO10112 85 (Bullera armeniaca) 7 縮小布佛迪單胞菌JCM2788 82 (Brevumdimonas diminuta) 5 羅倫隱球酵母IF00609 79 (Cryptococcus laurentii) 6 阿波巴索達力司開奴思非拉菌CBS7430 71 (Chionosphaera apobasodalis) 2 彎曲念珠菌ATCC10567 74 (Candida curvata) 3 橙黃阿爾巴斯西利奴司提魯思菌JCM2923 79 (Cerinosterus luteoalbus) 5 嗜鹼艾克索費拉菌JCM12519 77 (Exisophiala alcalophila) 3 細枝外擔孢子菌IF07788 79 (Exobasidiium gracile) 2 福澤恩西司非羅酵母菌ISO10374 70 (Fellomyces iuzhouensis) 2 新型線黑粉菌CBS132 88 (Filobasidielia neoformans) 2 卡布蘇羅依吉線擔孢子菌CBS1906 82 (Filobasidium capsuloigenum) 3 白地黴JCM6258 77 (Geotrichum capitatum) 3 圓柱杯黑粉菌IF06426 75 (Graphiola cylindrica) 4 次氧化葡糖酸桿菌IF03257 86 (Gluconobacter suboxydans) 6 不完全扣克維拉菌JCM7826 78 (Kockovaella imperatae) 2 37 200900507 表2 菌株名 上段：還原型輔酶Q1()比例(％) 下段:還原型輔酶Q1q生產量(Hg/ml) 尼克塔雷庫爾茲曼酵母菌IFO10118 79 (Kurtzmanomyces nectairei) 2 切拉西拉拉亞菌CBS275.2 75 (Lalaria cerasi 8)、 2 史卡提白孢酵母IF01212 88 (Leucosporidium scottii) 6 阿尼沙退伍軍人病菌JCM7573 73 (Legionella anisa) 3 依克托固恩甲基桿菌JCM2802 72 (Methylobacterium extorguens) 2 分支土壤絲菌JCM7822 80 (Mycoplana ramosa) 2 馬加利提非卵孢子酵母CBS2531 76 (Oosporidium margaritiferum) 2 脫氮假單胞菌IAMl2023 85 (Pseudomonas denitrificans) 8 蘇奇里恩司假單胞菌IAM1092 84 (Pseudomonas shuylkilliensis) 6 蚜假發酵菌CBS517.23 79 (Pseudozyma aphidis) 5 脫氮副球菌JCM6892 83 (Paracoccus denitrificans) 5 阿力阿西司皮托酵母菌IF07538 72 (Petromyces alliaceus) 2 黏紅酵母IF01125 79 (Rhodotorula glutinis) 7 小紅酵母IFO0387 74 (Rhodotorula minuta) 8 迪歐玻發紅擔孢子菌ATCC1830 86 (Rhodosporidium diobovatum) 4 薩伯利發西司根單胞菌IF015212 82 (Rhizomonas suberifaciens) 2 東方紅瘤菌JCM9337 80 (Rhodobium orients) 2 雅緻紅平菌JCM9224 74 (Rhodoplanes elegans) 2 沼澤紅假單胞菌JCM2524 90 (Rhodopseudomonas palustris)、 6 莢膜紅細菌SB 1003 95 (Rhodobacter capsulatus)、 6 和撒提克司擲孢酵母IFO1034 72 (Spoprobolomyces holsaticus)、 9 副玫瑰擲包酵母IFO0471 93 (Sporobolomyces pararoseus) 8 強森尼司伯迪歐伯樂司酵母IFO1840 73 (Sporidiobolusjohnsonii)、 7 完全賽托艾拉菌IFO10748 97 (Saitoella complicata) 9

表3 38 200900507 菌株名 上段：還原型輔酶Q1()比例(％) 下段:還原型輔酶Q1q生產量Wg/ml) 粟酒裂殖酵母IFO0347 90 (Schizosaccharomyces pombe) 8 副帕西模比力司鞘氨醇單胞菌IF015100 78 (Sphingomonas parapaucimobilis)、 7 嗜細胞孢子絲菌ATCC20493 73 (Sporotrichum cellulophilium)、 6 帕非歐匹地利共柄體徽菌JCM8318 80 (Sympodiomycopsis paphiopedili) 6 多形擔子柄擔孢子菌IFO10121 72 (Sterigmatosporidium polymorphum) 2 80 阿德黑西發鞘氨醇單胞菌JCM7370 (Sphingomonas adhesiva) 3 紫塔發利那菌CBS351.35 81 (Tapharina caerulescens) 2 金耳 ATCC24437 89 (Tremella mesenterica)、 3 皮癬菌(Trichosporon cutaneum IFOl 198) 95 8 異常腥黑穂粉菌CBS436.72 75 (Tilletiariaanomala)、 4 網腥黑穗病JCM1761 80 (Tilletia caries) 3 大葉托力波孢子菌JCM2006 73 (Tolyposporium bullatum)' 4 華西托尼西司白粉菌CBS544 76 (Tilletiopsis washintonesis) 2 茭草黑粉菌IF09887 78 (Ustilago esculenta) 2 巨孢午丹尼歐酵母JCM5269 87 (Udeniomyces megalosporus)、 2 丹朵河司黃葉酵母IFO10129 84 (Xanthophllomyces dendrohous) 2 黃色黃桿菌JCM1204 80 (Xanthobacter flavus) 2 淡紫擬青徽ATCC10114 80 (Paecilomyces lilacinus) 5 產黃頂孢黴ATCC11550 75 (Acremonium chrysogenum) 5 西爾司奇阿那亥后莫内思菌ATCC33886 72 (Hyphomonas hirschiana) 3 草木樨組根瘤菌ATCC9930 85 (Rhizobium meliloti) 10 (實施例2) 將黏紅酵母（Rhodotorula glutinis) IF01125 以培養基 (脒5g、酵母萃取物3g、麥芽萃取物3g、葡萄糖20g /L、 ρΗ6·0)於好氧下以25°C培養48小時。將培養後之菌體以 39 200900507 離心分離收集，並懸浮於已添加濃度2〇〇μ§/ιη1之甲基硝基 亞硝基胍之ΡΗ7磷酸緩衝液中。於25〇c下經過1小時後， 將菌體以0.9%氣化鈉溶液洗淨5次，再懸浮於〇9%氣化 鈉溶液中。將該細胞懸浮液適當稀釋，並使其於上述培養 基之洋菜平板上形成菌落。對已離析之突變株其還原型輔 酶Q1G生產量及還原型辅酶Qiq比例與實施例丨同樣的進 订檢驗。對和野生株比較在生產量及還原型輔酶Qlc比例 較兩之菌株再進一步反覆進行突變操作。其結果，藉由1〇 次反覆突變，得到顯示具有15^/ιη1以上生產能力之突變 株。又’此時還原型輔酶qiq之比例為8〇莫耳％以上。 (實施例3) 將元王賽托又拉菌（Saitoella complicata)IFO10748 以 k養基（脒5g、酵母萃取物3g、麥芽萃取物3g、葡萄糖2〇g /L、pH6.〇)l〇L於好氧環境下以25<t培養72小時。將所得 到之菌體以氮氣密閉之拉尼社製壓力式均質機以破碎壓力 80MPa進行2次破碎，以調製菌體破碎液。由該菌體破碎 液以異丙醇30體積份、己烷40體積份之比例反覆進行3 次萃取以得到萃取液。萃取率為99%且還原型輔酶之 比例為97%莫耳。 (實施例4) 將黏紅酵母（Rhodotorula glutinis) IF01125 之突變株 以培養基10L(脒（pept〇ne)i〇g、酵母萃取物3g、麥芽萃取 物3g、葡萄糖20g /L、ΡΗ6·0)於好氧環境下以25°C培養， 自48小時起將葡萄糖以4g/小時之比例連續分批添加直到 200900507 第96小時（連續分批添加之葡萄糖量i9〇g)。單位培養基 之還原型輔酶Qio生產量為20pg/mL以上，且還原型輔酶 Q1 〇之比例為80%莫耳以上。 (實施例5) 將實施例3所得到之萃取液取代為己烷溶液，並使其 吸附於已填充矽膠之管柱，以正己烷/二乙醚（9/1)溶液做展 開、溶出’以得到含有還原型輔酶Qig之提取物。又，將 該提取物一面攪拌一面冷卻到2ΐ，以得到白色之漿狀物。 以上所有之操作皆在氮氣下進行。將所得到之漿狀物進行 減壓過濾，並將濕結晶以上述展開液洗淨（洗淨時使用之溶 劑溫度為2。(：），並藉使濕結晶減壓乾燥，得到白色之乾燥 結晶8 1 mg。所得到之結晶純度為99 9%，且還原型輔酶 之比例為90%莫耳。 (實施例6) 將實施例3所得到之萃取液取代為正己烷溶液，並加 入二氧化錳50mg，於3〇t下攪拌3〇分鐘。將該反應液分 離，與實施例5同樣進行精製，可得到高純度之氧化型輔 酶 Qi〇74mg。 (實施例7) 將元全赛托又拉菌（Saitoella complicata)IF01〇748 以 培養基（脒5g、酵母萃取物3§、麥芽萃取物3g、葡萄糖20g /L、PH6.0)50〇mL於好氧下以25〇c培養72小時。將所得 到之菌體以密閉於氮氣内之拉尼社製壓力式均質機以破碎 壓力8GMPa進行2 :欠破碎，以調製菌體破碎液。破碎液中 41 200900507 還原型輔酶Q1G之比例對於包含氧化型之總輔酶QlG為 97%。對該菌體破碎液2〇〇mL ’將異丙醇及正己烷以^表 4中第1次萃取欄中所示之比例，使溶劑量合計為则 進行混合，以溫度4(TC下攪拌3〇分鐘，進行第i次之萃 取操作。萃取結束後，靜置10分鐘，並將已分離之上層 分離掉。以此時下層（殘逢）對於總液量之體積比作為分^ 性之指標，並以界面位置顯示於表4中。 Γ：： 再者，為進行第2次之萃取，要測定殘逢層之溶劑濃 度，並添加異丙醇及己烷使全體溶劑比成為表4中第2次 襴中所示之比，並於溫度4〇t下攪拌3〇分鐘。接著，靜 f 10分鐘，與上述同樣分離上層，並測定殘渣層之溶劑 濃度，再添加異丙醇及己烷使全體溶劑比成為表4中第3 次攔中所示之比，再於溫度2VC下攪拌30分鐘，進行第 3次之萃取操作。 將第1次、第2次、第3次各階段所分離到之上層中 (；所含有之還原型辅酶之量相對於進行萃取操作前之菌 體破碎液或萃取殘渣中所包含之還原型辅酶Qia量之比， 當成各階段還原型輔酶qig之萃取率，並將該計算結果表 示=表4中。又，第2次、第3次累計之還原型輔酶〜 之卒取率亦表示在該表。無論在任一階段其靜置分離性皆 為良好，且進行3次萃取之累計萃取率為9〇%以上，顯示 有高回收率。特別是，使異丙醇濃度為3〇%以上時，會有 99%以上之高回收率。 表4 「 一— 溶劑比例(％) 42 界面位置 萃取率(％) 200900507 異丙醇 己烧 各次萃取率 累計萃取率 例1 第1次 18.8 52.7 0.492 73.6 7Ϊ6 第2次 19.0 52.4 0.624 47.6 S62 第3次 1 29.7 41.7 0.645 55.5 9ΪΙ 例2 第1次 31.3 40.2 0.499 90.7 90J 第2次 37.7 33.7 0.549 83.7 W5 第3次 40.6 30.9 0.565 40.1 991 例3 第1次 1 31.3 40.2 0.526 89.0 89^0 ~~ 第2次 34.1 37.3 0.553 85.8 983 ~~ 第3次 36.8 34.6 0.555 46.6 991 例4 第1次 31.3 40.2 0.526 89^0 ~ 89.0 —~ 第2次 34.1 37.3 0.553 85.8 983 第3次 ^ 42.4 29.0 0.644 50.0 99^0 ~~ 例5 第1次 31.3 40.2 0.526 89.0 89^0 ~~ 第2次 40.1 31.4 0.595 88.1 W6 第3次 i 40.7 30.7 0.593 45.3 」 99Λ ' 例6 第1次 31.3 40.2 0.526 89.0 8^0 第2次 40.1 31.4 0.595 88.1 ~~ 第3次 」 45.8 25.7 0.663 40.7 99Λ ~~

(實施例8) 將完全賽托艾拉菌（Saitoella complicata)IF〇l〇748 以 培養基（脒5g、酵母萃取物3g、麥芽萃取物3g、葡萄糖20g /L、pH6.0)75〇mL於好氧下以25°C培養72小時。將所得 到之菌體以密閉於氮氣内之拉尼社製壓力式均質機以破碎 壓力140MPa進行2次破碎，以調製菌體破碎液。將該菌 體破碎液以圖1所示之逆流3段連續萃取裝置㈣ ^擾拌槽之體積定為6飢，靜置分離槽之體積定為200L。 ^生物諸破碎液㈣丨段_槽進彳 二烧對各段進行供給。菌體破碎液之供 ^ =及 以異丙醇及正己燒之供給量作為對各…曰為刀 量，異丙醇供給為H/分、正各&供給1之合計總 各段溶劑之濃度要適當調整使：3·:。惟，此時’ J /晨度在5〜50v/v%、正 43 200900507 己院辰度在25〜65v/v0/〇之範圍内。萃取溫度為4〇<)(：，處理 時間為6小時。依第6小時時點在第3段靜置分離槽之萃 取殘'中所殘留之還原型輔酶〜之量，計算由菌體破碎 液中所萃取還原型辅酶Q〗。之回收率結果，為98.9%。又， 在整個運轉的過程中，#置分離可良好的被進行，且可安 定的進行萃取之連續操作。 上之可利用枓 ^ 依本發明，可以藉微生物培養及還原型輔酶Q1()之回 收此種非常簡便操作，將還原型輔酶Q1G以工業規模來便 宜地製造，又，對於氧化型輔酶Q1G亦可藉簡便之操作來 製造。 【圖式簡單說明】 圖1為實施例8中所使用逆流3段連續萃取裝置之示 意圖。 【主要元件符號說明】

Claims (1)

1. 200900507 申請專利範圍： i.一種以下式（π)

   (Π) 所示之氧化型輔酶Qw之製造方法，其特徵為： r (a)在含有碳源、氮源、磷源及微量營養素所構成之培 養基中，進行還原型輔酶Qig生產性微生物之培養，以得 到還原型輔酶q1g佔總輔酶qiq中7〇莫耳％以上之微生物 、’·田胞再依需要將該微生物細胞破碎， 〃（b)使用氧化劑將所生產之還原型辅_ q〗。氧化轉變為 乳化型輔酶Q1〇 |，以有機溶劑萃取；或者， ()將所生產之還原型輔冑Q"以有機溶劑萃取，再依 而要施以精製處理之後 & 使用巩化劑使還原型輔酶Qw氧 化轉變為氧化型辅酶。 " •萃取時· 細胞之 加熱處 細胞之 2.如申請專利範圍第丨項之 係將微生物細胞破碎。 彳法’其中 3·如申請專利範圍第2 破碎係以物理性處理、化學^ “方法，其中 理、自我消化、渗透處理、酵素性處理 4. 如申請專利原生#溶解來進行。 τ @寻利範圍第2 破碎係以物理性處理來進行。之製艳方法，其中 5. 如申請專利範圍第2 处理係以高壓均質機、 之製造方法，其中，物理性 曰歧岣質機、法式擠壓機或球磨 45 200900507 機來進行。 #6.如申請專利範圍第i項之製造方法，其中，辅酶Qi〇 之卒取，係由微生物細胞或該細胞破碎物之濕菌體或乾燥 菌體，以親水性有機溶劑進行。 —7.如申請專利範圍第1項之製造方法，其中，輔酶 之萃取係由微生物細胞或該細胞破碎物之水性懸浮液，使 用疏水性有機溶劑來進行。 8.如申請專利範圍第1項之製造方法，其中，還原型 輔酶Q10生產性微生物’係使用試管（内徑21mm、全長 2〇Omm)，於10mL之培養基[(葡萄糖2〇g、腺&、酵母萃 取物3g、麥芽萃取物3g)/L、pH6 〇]中，以乃艽、π小時 振盪培養（振幅2cm、310往返/分），將所得到之增殖液依 需要濃縮’並在氮氣環境氣氛下對該增殖液1 〇體積份， 在異丙醇3體積份及正己烷18·5體積份共存下，用玻璃珠 (425〜600μιΏ)1〇體積份，作3分鐘激烈振盪進行破碎所調 製之疏水性有機溶劑相（正己烷相）之以HPLC測定時，還 原型辅酶Q1()佔總輔酶Q1G之70莫耳％以上者。 9·如申請專利範圍第1項之製造方法，其中，微生物 為農桿菌（Agrobacterium)屬、麴黴菌（Aspergillus)屬、醋酸 菌（Acetobacter)屬、胺基桿菌（Aminobacter)屬、農單胞菌 (Agromonas)屬、嗜酸菌（Acidiphilium)屬、布雷絡酵母菌 (Bulleromyces)屬、布雷拉菌（Bullera)屬、布佛迪單胞菌 (Brevundimonas)屬、隱球菌（Cryptococcus)屬、開奴思非拉 菌（Chionosphaera)屬、念珠菌（Candida)屬、西利奴司提魯 46 200900507 思菌(Cerinosterus)屬、艾克索費拉菌（Exisophiala)屬、外 擔孢子菌（Exbasidium)屬、非羅酵母菌（Feii〇myces)屬、線 黑粉菌（Filobasidiella)屬、線擔孢子菌（Fii〇basidium)屬、 地黴（Geotrichum)屬、杯黑粉菌（Graphiola)屬、葡糖酸桿菌 (Gluconobacter)屬、扣克維拉菌（Kockovaella)屬、庫爾茲 曼酵母菌（Kurtzmanomyces)屬、拉拉亞菌（Lalaria)屬、白 孢酵母（Leucosporidium)屬、退伍軍人病菌（Legi〇nella)屬、 甲基桿菌（Methylobacterium)屬、土 壞絲菌（Mycoplana)屬、 卵孢子酵母菌（Oosporidium)屬、假單胞菌（pseud〇m〇nas) 屬、假發酵菌（Pseudozyma)屬、副球菌（paracoccus)屬、皮 托酵母菌（Petromyces)屬' 紅酵母（Rhodotorula)屬、紅擔孢 子菌（Rhodosporidium)屬、根單胞菌（Rhizomonas)屬、紅瘤 菌（Rhodobium)屬、紅平菌（Rhodoplanes)屬、紅假單胞菌 (Rhodopseudomonas)屬、紅細菌（Rhodobacter)屬、擲孢酵 母（Sporobolomyces)屬、司伯迪歐伯樂司酵母（Sporidiobolus) 屬、賽托艾拉菌（Saitoella)屬、裂殖酵母 (Schizosaccharomyces)屬、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas) 屬、抱子絲菌（Sporotrichum)屬、共柄體黴菌 (Sympodiomycopsis) 屬 、擔 子柄擔孢子菌 (Sterigmatosporidium)屬、塔發利那菌（Tapharina)屬、銀耳 (Tremella)屬、絲孢酵母（Trichosporon)屬、腥黑穗粉菌 (Tilletiaria)屬、托力波孢子菌（Tolyposporium)屬、白粉菌 (Tilletiopsis)屬、黑粉菌（Ustilago)屬、午丹尼歐酵母 (Udeniomyce)屬、黃葉酵母（Xanthophllomyces)屬、黃桿菌 47 200900507 (Xanthobacter)屬、擬青黴（paecil〇myces)屬、頂孢黴 (Acremonium)屬、亥后莫内思菌（Hyhomonus)屬或根瘤菌 (Rhizobium)屬之微生物。 10·如申請專利範圍第1項之製造方法，其中，係將 所得到之氧化型辅酶。依需要精製後，進行晶析以得到 氧化型輔酶Q1()之結晶。

   、圊式： 如次頁。 48