TW200900075A - Method for treating or preventing systemic inflammation - Google Patents

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200900075 九、發明說明 相關專利及專利申請案之交叉參考資料 本申請案爲非臨時申請案並主張2007年2月28日提 出申請之美國臨時專利申請案號60/904,122 (其全部內容 倂入本文作爲參考資料）之優先權。 【發明所屬之技術領域】 本發明大抵關於用於治療或預防全身性發炎之方法。 【先前技術】 發炎反應爲身體被感染劑入侵、抗原挑戰或物理、化 學或外傷傷害後修復及維持恆定狀態的企圖。局部發炎係 包含在特殊部位並可顯示出多種不同之症狀，包括紅、腫 、熱及痛。 雖然發炎反應通常被認爲係對傷害之健康反應，但若 其未被適當調節則免疫系統可出現不利之生理反應。在此 情況中，身體之正常保護性免疫系統可經由將健康組織當 作被感染或異常來處理而對其本身之組織造成傷害。或者 ，若出現受傷，則發炎反應可能與引起傷害之處理不成比 例。當此種情況發生時，發炎反應可較該作用劑本身所產 生者對身體造成更多傷害。 發炎反應已被發現部分係由表現增加之前發炎及抗發 炎細胞活素所組成。細胞活素爲涉及協調免疫及發炎反應 以及特殊免疫細胞族群間之聯繫的低分子量、生物活性蛋 -5- 200900075 白質。許多類型之細胞在發炎反應期間製造細胞活素，這 些細胞包括：嗜中性白血球、單核細胞及淋巴球。 在發炎部位所產生之細胞活素可藉由多種機制影響發 炎反應。然而，若前發炎反應未被抗發炎細胞活素成功壓 制則可發生失控之全身性發炎。 相對於局部性發炎，全身性發炎廣佈於全身。此類型 之發炎可包括特殊部位之局部性發炎，但亦可能結合一般 之“似感冒”症狀，包括發熱、發冷、疲倦或無活力、頭 痛、無食慾及肌肉僵硬。全身性發炎可導致蛋白質降解、 分解代謝及高度代謝。因此，重要器官（諸如肌肉、心臟 、免疫系統及肝臟）之構造及功能可能被危及且可能造成 多重器官衰竭及死亡。er a/., /nsw/h the System i c Inflammatory Response to Thermal Trauma, Mol. Med. 8 ( 8) : 443-450 ( 2002)。雖然對於全身性發 炎之機制的了解已取得極大進展，但由此病症所造成之死 亡率仍高得令人無法接受。 通常，該細胞活素反應是否爲前發炎或抗發炎反應係 取決於定居於腸腔內之個別微.生物在任何特殊時點之平衡 。吾人熟知腸道之黏膜表面定居著非常大、複雜且爲動態 聚集之微生物。腸道菌叢之組成沿著消化道及不同之微生 育地（諸如表皮黏膜層、腺窩之深黏膜層表皮細胞表面） 而改變。特殊菌落係取決於外在因子及內部因子，包括腔 內可利用之分子、黏液品質及宿主-微生物和微生物-微生 物父互作用。Murch，S.H.，ΓοΠ 〇y &少 200900075

Probiotics, Lancet, 3 57 ： 1 057- 1 059 ( 200 1 )。 這些組成腸道菌叢之微生物主動涉及免疫反應。其與 表皮交互作用之情況爲二位夥伴互蒙其利（互利共生）之 關係或爲對一位夥伴有利但對另一方無害（片利共生）之 情況 ° Hooper， e t al ·， ffo w Host-Microbial Interactions

Shape the Nutrient Environment of the Mammalian Intestine, Annu. Rev. Nutr. 22 : 2 8 3 -3 07 ( 2002 )。事實 上，相當多之證攄浮現，顯示出小腸菌叢與小腸黏膜中多 樣之細胞群間有強烈之交互作用或“串擾（cross-talk) ” 。Bourlioux，e t al., The Intestine and its Mi cr of l or a are Partners for the Protection of the Host ·· Report on the Danone Symposium “The Intelligent Intestione，’’ held in Paris，June 14, 2002, Am. J. Clin. Nutr. 78 : 675 ( 2003 ) » Hooper， L. V. & Gordon, J.I., Commensal Host 一

Bacterial Relationships in the Gut，Sci. 292 : 1115 ( 2001 )；Haller, et al. y Non-Pathogenic Bacteria Elicit a Differ ential Cytokine Response by Intestinal Epithelial Cell/Leuco cyt e Co-Cultures， GUT 47 : 79 ( 2 0 0 0 )；

Walker， W.A.， Role of Nutrients and Bacterial Colonization in the Development of Intestinal Host Defense, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 30 : S2 ( 2000) 。另外，腸道菌叢顯示出可在成人體內引起局部及全身性 層級之特殊免疫反應。15〇1汪\11：1,£.，以£1/.,户厂〇6/〇/^<：·?.· Effects on Immunity, Am. J. Clin. Nutr. 73 ： 444S-50S ( 200900075 2001 ) ° 已知嬰兒之腸道菌叢的發展遠少於成人之腸道菌叢。 雖然成人之菌叢係由接近5 00種菌株之超過1〇3個微生物 所組成，這些菌叢中某些有害，某些有利，而嬰兒僅含有 一部分此等微生物（絕對數目及品種之多樣性均如此）。 嬰兒出生時具有無菌之腸道，但自產道（其初始環境）及 其攝入之飲食取得小腸菌叢。由於新生命之腸道菌叢群非 常不穩定，嬰兒腸道中之害菌及益菌很難維持微妙的平衡 ，因此降低了免疫系統正常運作之能力。 餵食配方乳之嬰兒特別難維持此種平衡，因爲餵食配 方乳及餵食母乳之嬰兒的腸道中之細菌品種有些不同。餵 食母乳之嬰兒的糞便主要含有比非德氏菌（ Bifidobacterium )，而鏈球菌及乳桿菌則較少。相反地， 餵食配方乳之嬰兒的菌叢則較多樣，包含比非德氏菌和類 桿菌以及較多之致病菌種，葡萄球菌、大腸桿菌及梭狀桿 菌。餵食母乳和餵食配方乳之嬰兒的糞便中的多種比非德 氏菌種亦不相同。現已提出多種造成餵食母乳和餵食配方 乳之嬰兒的糞便菌叢不同的因子，包括人乳中之蛋白質含 量較低且組成不同、人乳中之磷含量較低、人乳中之寡醣 較多樣且母乳中有多種體液及細胞免疫功能之傳介子。 Agostoni, et al.} Probiotic Bacteria in Dietetic Products for Infants · A Commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition,, J. Pediatr. Gastro. Nutr. 38 ； 3 65-3 74 ( Apr. 2004 ) 〇 200900075 由於餵食配方乳之嬰兒的菌叢如此不穩定，而腸道菌 叢大量參與刺激腸道免疫力，餵食配方乳之嬰兒較可能發 展出發炎疾病。許多影響嬰兒之主要疾病，包括慢性肺病 、白質軟化症、新生兒腦膜炎、新生兒肝炎、敗血症及壞 死性腸炎本質爲發炎性。根據該特殊疾病，伴隨出現之發 炎可出現在特殊器官（諸如肺、大腦、肝臟或小腸）中， 或者，發炎本質上確實爲全身性。 例如：慢性肺病引起肺臟內之組織發炎，而新生兒腦 膜炎涉及大腦和脊柱襯裡細胞之發炎。白質軟化症係由發 育中之大腦的腦室周圍區的發炎傷害造成。壞死性腸炎造 成小腸發炎，而此可造成一部分或全部小腸損壞且新生 兒肝炎涉及嬰兒早期發生之肝臟發炎。敗血症（亦稱爲全 身性發炎反應症候群）爲一種由產毒細菌造成血流無法克 服之感染所引起的嚴重疾病。此疾病中，血流中的病原將 引起全身之發炎反應。 早產及病情嚴重之嬰兒亦代表在發展腸道免疫力及預 防全身性發炎上的嚴峻挑戰。早產或病情嚴重之嬰兒通常 係立即置入無菌保溫箱中，這些嬰兒在其中可維持不暴露 在健康之足月兒於正常情況下所暴露之細菌群中。此點可 能延遲或損害天然群集過程。這些嬰兒常亦接受廣效抗生 素之治療’此廣效抗生素將殺死企圖群集在嬰兒腸道之 片利共生的細菌。另外’這些嬰兒常經由嬰兒配方而非母 乳來提供營養。這些因子各自可能造成嬰兒腸道菌叢不正 常發展而造成或促成威脅生命之全身性發炎。 -9- r V. 200900075 近年已建議在餵食配方乳之嬰兒的影 ，以助長有益之微生物群集在腸道。益5 健康益處之存活的微生物。Fuller, R.尸 and Animals, J. Appl. Bacteriol. 66 : 3 6 5 雖然存活之益生菌可能使腸道菌叢IE 之評估其在早產兒及免疫抑制嬰兒體內的 少。這些特殊族群具有不成熟之腸道防_ 腔內細菌轉位的風險，造成感染風險可會g 況中，並不建議免疫抑制患者、心臟手f 官能障礙患者或有血便之患者使用存活之 制個體因補充益生菌而使亡之報告 MacGregor G ., e t al. Yoghurt biotherapy in immunosuppressed patient si Postgrad 367 ( 2002 )。 因此，對於免疫抑制患者或早產兒 或預防全身性發炎之非存活性補充品將 菌對熱、濕度及光敏感，理想上應冷藏 使如此小心，典型之益生菌的耐儲時間 生菌之非存活替換品可規避冷藏之必要 耐儲時間的產品。然後，該產品可分佈 可隨手取得之冷藏室。益生菌之非存活 品組成分交互作用之風險（諸如發酵及 新鮮度改變）亦較少。因此，提供包含 嬰兒去活化之益生菌，以減輕或預防該 ：：食中補充益生菌 L菌爲可帶給宿主 robiotics in Man -78 ( 1989)。 ί常化，但已發表 丨安全性之硏究很 ?屏障，因而增加 ?提高。在許多情 ί後之患者、胰臟 :益生菌。免疫抑 至少有一例。 :contraindicated Med J. 78 ： 3 66- ί言，提供可治療 1所助益。活益生 :維持存活力。即 相當短。存活益 ί且可提供具較長 i全世界可不需要 ί替換品與其他食 i品味道、質地和 [:給韻食配方乳之 ^兒之全身性發炎 -10- 200900075 的方法將會有所助益。 【發明內容】 發明摘要 因此，簡單地說，本發明針對用於治療、預防或減輕 個體之全身性發炎的新穎方法，該方法包含投給個體治療 上有效量之去活化的LGG。

於其他較佳體系中，本發明係針對一種用於製造供治 療、預防或減輕個體之全身性發炎的藥物之方法，其特徵 在於使用每天每公斤體重約lxlO4至lxlO6個去活化之鼠 李醋乳酸桿囷 r/jawwosws GG) (LGG )之細胞同等物作爲藥學活性物質。 於其他較佳體系中，本發明係針對一種用於治療、預 防或減輕個體之呼吸道發炎的新穎方法，該方法包含投給 個體治療上有效量之去活化的L G G。 於其他較佳體系中’本發明係針對一種用於減輕或預 防個體內系統性釋出一或多種前發炎性細胞活素或趨化素 的方法，該方法包含投給個體治療上有效量之去活化的 LGG。 於另一較佳體系中’本發明包含用於預防個體內I/cB 表現之泛素化的方法’該方法包含投給個體治療上有效量 之去活化的LGG。再者’本發明可包含用於減少個體內 NF /c B轉位之方法，該方法包含投給個體治療上有效量之去 活化的L G G。 -11 - 200900075 於一特殊之較佳體系中，本發明係針對一種用 、預防或減輕個體之全身性或呼吸道發炎的方法， 包含投給個體治療上有效量之去活化的LGG與至 LCPUF A及/或至少一種存活之益生菌。於特殊之較 中’該LCPUFA可爲二十二碳六烯酸（DHA)或花 酸（ARA)。 在數種可藉本發明取得之利益中，本發明可用 或預防全身性發炎。本發明可減輕肝臟、血漿、肺 腸之發炎。另外，本發明減輕或預防多種不同之前 細胞活素及趨化素（包括間白素1 β ( IL - 1 β )、 CINC-1及與生長相關之致癌基因（GRO/KC)之量 。由於本發明可用來改良發炎情況，因此，本發明 防有害之感染或疾病開始。 較佳體系之詳細說明 現在將詳細參照本發明之較佳體系，下文中列 或多種實例。各實例係用於解釋本發明，而非限制 。事實上，熟習此技術之人士可清楚察知可在不悖 明之範圍或精神之下進行多種不同的修改及變化。 作爲某一較佳體系之部分所說明或描述之特性可應 一較佳體系中而再產生另一較佳體系。 因此，本發明係意欲涵蓋於後附之申請專利範 均等物之範圍內之該等修改及變化。本發明之其他 特性及観點揭示於下列詳細說明或可從其中顯明。 於治療 該方法 少一種 佳體系 生四烯 來減輕 臟及小 發炎性 IL-8、 )釋出 亦可預 舉其一 本發明 離本發 例如， 用於另 圍及其 目的、 本技藝 -12- 200900075 之一般技術人士了解本討論內容僅爲示範之較佳體系的描 述而不欲限制本發明之較寬闊的觀點。 本文中使用下列縮寫：LGG，鼠李醣乳酸桿菌GG ; LCPUFA，長鏈多不飽和月旨肪酸；LPS ，月旨多醣；IL，間白 素；CINC-1，由細胞活素誘導之嗜中性白血球趨化因子-1 ;GRO/KC，與生長相關之致癌基因；ELISA，酶連結免疫 吸附分析；RT-PCR，逆轉錄聚合酶鏈反應；ANOVA，方 差分析；SD，標準差；RMS，老鼠乳汁替代品；TLRs， 類鐸受體；核因子/cB’ NF-/cB; EPA’二十碳五稀酸； DHA，二十二碳六烯酸；ARA，花生四烯酸。 “去活化之益生菌”或“去活化之LGG”等詞意指該 益生菌或LGG有機體之代謝活性或生殖力被減弱或破壞 。然而，該“去活化之益生菌”或“去活化之LGG”在細 胞層級仍保留至少一部分其生物醇-蛋白質及DNA/RNA構 造。此文所使用之“去活化”一詞與“非存活”同義。 “益生菌” 一詞意指可發揮有益於宿主健康之效果的 活、活性的或能存活的微生物。 “益生素”一詞意指可刺激益生菌之生長及/或活性 的不可消化之食品成分。 此文所使用之“治療”一詞意指緩和、改良或治療疾 病、病症或疾病或病況之症狀。 “減輕” 一詞意指範圍、量或程度減少。 “預防”一詞意指透過某些作用停止或阻礙疾病、病 症或疾病或病況之症狀。 -13- 200900075 此處所使用之“全身性” 一詞意指關於或影響整個身 體。 “治療上有效量” 一詞意指可改良或矯正疾病、病症 或疾病或病況之症狀的量。 “早產”一詞意指在懷孕3 7週前出生的嬰兒。 “嬰兒”一詞意指小於約1歲之人類。 “兒童”一詞意指介於約1至1 2歲之人類。於某些 較佳體系中，兒童係指介於約1至6歲之人類。於其他較 佳體系中，兒童係指介於約7至12歲之人類。 此處所使用之 嬰兒配方 一 思指可藉由成爲人乳 替代品來滿足嬰兒之營養需求的組成物。 根據本發明現已發現一種用於治療或預防全身性發炎 之新穎方法。該方法包含投給個體治療上有效量之去活化 的LGG。於某些較佳體系中，該個體爲嬰兒。 先前欲有效投服去活化之益生菌的企圖有實質上的阻 礙。例如：柯傑文（Kirjavainen,P.)等人報告將活 LGG 與經加熱去活化之LGG相比較時，將近40%之補充之去 活化之LGG的兒童曾經歷嚴重腹瀉。 in the Management of Atopic Disease ·· Underscoring the Importance of Viability, J. Ped. Gastro. 36 ： 223-227 ( 2003 )。在安慰劑或存活之LGG組中並無不良反應之報 導（上述文獻第225頁）。因爲腹瀉主要與發炎有關，柯 傑文之硏究指出去活化之LGG確實可能引起胃腸道發炎 。事實上，該硏究指出“熱去活化過程可能引起表面肽變 -14- 200900075 性及表現熱休克蛋白質，因此，將LGG加熱去活化 改LGG之免疫刺激性質時將引起發炎反應並因此增 子之滲透性。”（上述文獻第226頁）。相反地，本 者硏發一種透過投服去活化之LGG來治療或預防全 發炎之新穎方法。 LGG爲一種自健康人類小腸菌叢分離出之益生菌 其揭示於授與Gorbach等人之美國專利第5,03 2,3 99 其全文倂爲此文之參考資料）中。LGG對大部分抗生 抗性，在酸及膽汁之存在下可保持穩定並強力附著於 小腸道之黏膜細胞上。其在大部分個體中可存活1 - 3 在30 %之個體中可存活至多7天。除了其群集能力 LGG亦可有利地影響黏膜免疫反應。LGG係存放在美 型微生物菌種保藏中心，編號爲ATCC 53 1 03。 本發明中係使用已經過去活化之L G G。去活化作 透過本技藝目前已知之任何方法或欲發展之方法產生 活化作用可經由’例如熱處理、冷凍乾燥、紫外線、 線、壓力、化學破壞或機械破壞完成。例如：L G G可 貯存在8 0 °C至1 0 0 °C間1 0分鐘而藉加熱處理去活化。 亦可經由在距離3 0瓦特UVC燈之5公分處以紫外線 放射線照射5分鐘來去活化。或者，可經由在距離| 來源之2G公分處藉r射線經由放射線照射以2kg-格 Gray ) ( kGy )將 LGG 去活化。 於本發明之方法中，治療上有效量之去活化之 爲足夠減輕或預防個體之全身性發炎的量。此量可能 來修 加腸 發明 身性 種。 號（ 素具 人類 天且 外， 國典 用可 。去 γ射 經由 LGG 經由 ^ 60 雷（ LGG 相當 -15- 200900075 於母天母公斤體重約1x10至lxl〇12細胞同等物。於另— 較佳體系中’此量可能相當於每天每公斤體重約1χ1〇6至 1x1 〇9細胞同等物。再於另一較佳體系中，本發明包含每 天每公斤體重投服約lxlO8細胞同等物。 於本發明之某些較佳體系中，該個體需要治療、減輕 或預防全身性發炎。該個體可能因遺傳傾向、飲食、生活 型態、疾病、病症’等而處於全身性發炎之風險中。例如 •早產或免疫抑制嬰兒可能處於全身性發炎之風險中，因 此’可能需要這類治療、減輕或預防。 於某些較佳體系中，可給予嬰兒或兒童該去活化之 L G G以預防、治療或減輕全身性發炎。於一較佳體系中， 該嬰兒可爲小於1歲。於另一較佳體系中，該兒童可爲介 於約1至6歲之間。再於另一較佳體系中，該兒童可爲介 於約7至1 2歲之間。 本發明之方法中所投服之去活化的LGG之形式並無 嚴格限制’只要所投服者爲治療上有效量。於某些較佳體 系中’去活化之LGG係經由錠劑、藥九、膠囊化、橢圓 形藥錠、膠囊錠、膠囊、油滴或藥袋投給個體。於此方法 之較佳體系中可將去活化之LGG補充品與其他營養補充 品（諸如維他命）一起食入或與LCPUFA補充品（諸如 DHA或ARA ) —起食入。 於另一較佳體系中係將去活化之LGG包囊在糖 '脂 肪或多醣中。再於另一較佳體系中係將去活化之LGG加 入食品或飲品中並食用之。該食品或飮品可爲兒童之營養 -16- 200900075 品，諸如成長配方、成長乳、飲料、乳汁、優格、果汁、 以果汁爲底質之飲料、可咀嚼之錠劑、餅乾、薄脆餅或奶 粉’或者該產品可爲嬰兒之營養品，諸如嬰兒配方。 於一較佳體系中，該用於本發明之嬰兒配方含有完整 營養且含有合適類型及量之脂質、碳水化合物、蛋白質、 維生素及礦物質。該脂質或脂肪之量通常可在約3至約7 克/100千卡間變動。該蛋白質之量通常可在約1至約5克 /100千卡間變動。該碳水化合物之量通常可在約8至約 12克/100千卡間變動。蛋白質之來源可爲任何本技藝中 所使用者，如：脫脂乳、乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、 水解蛋白質、胺基酸，等。碳水化合物之來源可爲任何本 技藝中所使用者，如：乳糖、葡萄糖、玉米糖漿固體、麥 芽糊精、蔗糖、澱粉、稻米糖漿固體，等。脂質之來源可 爲任何本技藝中所使用者，如：脫脂乳、乳清蛋白、酪蛋 白、大豆蛋白、水解蛋白質、胺基酸，等。脂質之來源可 爲任何本技藝中所使用者，如：蔬菜油，諸如棕櫚油、大 豆油、棕櫚液油、椰子油、中鏈三酸甘油脂、高油酸葵花 油、高油酸紅花油，等。 爲了方便可使用市售之嬰兒配方。例如：可在嬰兒美 ® ( Enfamil® )、嬰兒美®早產兒配方、含鐵之嬰兒美®、 不含乳糖配方® ( Lactofree®)、營養美素® ( Nutramigen® )、哺力美 ®(Pregestimil®)及寶素 & ®(ProSobee®)( 可自美國伊利諾州Evansville美強生（Mead Johnson)公 司取得）中補充合適量之去活化的LGG來執行本發明之 -17- 200900075 方法。 於本發明之一較佳體系中可將去活化之LGG與一或 多種可存活及/或去活化之益生菌組合以治療或預防餵食 配方乳之嬰兒體內之全身性發炎。本較佳體系中可接受本 技藝中已知之任何存活或去活化之益生菌，惟其該益生菌 可達到所欲之結果。於特殊之較佳體系中，該可存活及/ 或去活化之益生菌係選自乳桿菌或比非德氏菌。 若將活益生菌與去活化之益生菌組合投服，則該活益 生菌之量可相當於每天每公斤體重約Ιχΐ 04至ΙχΙΟ12菌落 形成單位（cfu)。於另一較佳體系中，該活益生菌可包 含每天每公斤體重約lxio6至lxl09cfu。再於另一較佳體 系中，該活益生菌之量可包含每天每公斤體重約lxl08cfu 0 於本發明之另一較佳體系中可將去活化之LGG與一 或多種益生菌組合以治療或預防餵食配方乳之嬰兒體內之 全身性發炎。本較佳體系中可接受本技藝中已知之任何益 生菌，惟其該益生菌可達到所需之結果。本發明之益生菌 可包含乳果糖、半乳-寡醣、果寡醣、異麥芽-寡醣、大豆 寡醣、乳蔗糖、木-寡醣及龍膽-寡醣。 於本發明之另一較佳體系中該嬰兒配方可含有其他活 性劑，諸如長鏈多不飽和脂肪酸（LCPUFA )。合適之 LCPUFA包括，但不限於：α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸 、次亞麻油酸、亞麻酸、二十碳五烯酸（ΕΡΑ ) 、ARA及 DHA。於一較佳體系中係將去活化之LGG與DHA —起投 -18- 200900075 服。於另一較佳體系中係將去活化之LGG與ARA —起投 服。再於另一較佳體系中係將去活化之LGG與DHA和 ARA —起投服。市售之含有DHA、ARA或其組合之嬰兒 配方中可補充去活化之L G G並用於本發明中。例如：可 購買含有有效量之DHA和ARA的嬰兒美@1^1?11^®並可在 其中補充以去活化之LGG再用於本發明中。 於一較佳體系中係將DHA和ARA與去活化之LGG-起投服以治療嬰兒體內之全身性發炎。於此較佳體系中， ARA : DHA之重量比通常爲約1 : 3至約9 : 1。於本發明 之一較佳體系中此比例係約1 : 2至約4 : 1。而於另一較 佳體系中，該比例係約2 : 3至約2 : 1。於一特殊之較佳 體系中’該比例係約2 : 1。於本發明之另一特殊較佳體系 中該比例係約1 : 1 · 5。於其地較佳體系中，該比例係約1 :1 _ 3。再於其他較佳體系中該比例係約1 : 1 .9。於一特 殊較佳體系中’該比例係約1 · 5 : 1。再於另一較佳體系中 該比例係約1 . 4 7 : 1。 於本發明之某些較佳體系中，DHA之量係介於約 0 · 0 %至1 . 〇 〇重量％之脂肪酸。 該DHA之量可爲約〇_32重量％。於某些較佳體系中 ，該DHA之量可爲約0.33重量％。於另一較佳體系中， 該DHA之量可爲約0.64重量％。於另一較佳體系中，該 DHA之量可爲約0.67重量％。再於另一較佳體系中，該 DHA之量可爲約0.96重量％。而於進一步之較佳體系中該 DHA之量可爲約1.〇〇重量％。 -19- 200900075 於本發明之較佳體系中，該ARA之量係介於約0·0重 量％至0.67重量％之脂肪酸。於另一較佳體系中，該ARA 之量可爲約0.67重量％。於另一較佳體系中，該ARA之 量可爲約0.5重量％。再於另一較佳體系中，該DHA之量 係介於約0.4 7重量％至〇 . 4 8重量％之脂肪酸。 於本發明之一較佳體系中，該DHA之有效量通常係 每天每公斤體重介於約3毫克至約150毫克。於本發明之 一較佳體系中，該量爲每天每公斤體重介於約6毫克至約 100毫克。於另一較佳體系中，該量爲每天每公斤體重介 於約1 0毫克至約6 0毫克。再於另一較佳體系中，該量爲 每天每公斤體重介於約15毫克至約30毫克。 於本發明之一較佳體系中，該ARA之有效量通常係 每天每公斤體重介於約5毫克至約150毫克。於本發明之 一較佳體系中，該量爲每天每公斤體重介於約10毫克至 約120毫克。於另一較佳體系中，該量爲每天每公斤體重 介於約15毫克至約90毫克。再於另一較佳體系中，該量 爲每天每公斤體重介於約20毫克至約60毫克。 用於本發明之嬰兒配方中之DHA的量通常係在約5 毫克/100千卡至約80毫克/100千卡間變動。於本發明之 —較佳體系中，DHA的量係在約10毫克/100千卡至約50 毫克/100千卡間變動；而於另一較佳體系中，係在約15 毫克/100千卡至約20毫克/100千卡間變動。於本發明之 —特殊較佳體系中，DHA的量係約17毫克/100千卡。 用於本發明之嬰兒配方中之ARA的量通常係在約1〇 -20- 200900075 毫克/100千卡至約100毫克/100千卡間變動。於本發明之 —較佳體系中，ARA的量係在約15毫克/100千卡至約70 毫克/100千卡間變動。於另一較佳體系中，ARA之量係在 約20毫克/100千卡至約40毫克/100千卡間變動。於本發 明之一特殊較佳體系中，ARA的量係約34毫克/1〇〇千卡 〇 用於本發明之補充以含有DHA和ARA之油的嬰兒配 方可利用本技藝中已知之標準技術製造。例如：其可經由 取代等量之正常存於配方中之油（諸如高油酸葵花油）來 加入。另一實例爲：可經由取代等量之正常存於不含DHA 和ARA之配方中的剩餘全部脂肪混合物來加入含有DHA 和ARA之油。 DHA和ARA之來源可爲本技藝所已知之任何來源， 諸如海產油、魚油、單細胞油、蛋黃脂質、大腦脂質，等 。DHA和ARA可爲天然形式，惟其剩餘之LCPUFA來源 不會對嬰兒造成任何實質有害之影響。或者，DHA和 ARA可以精緻形式使用。 於本發明之較佳體系中，DHA和ARA之來源爲如美 國專利案第 5,374,567 號；5,550,156;及 5,397,591 (其掲 示內容全部倂爲此文之參考資料）中所教示之單細胞油類 。然而，本發明並不僅限於這類油。 於一較佳體系中，該LCPUFA來源含有EPA。於另一 較佳體系中，該LCPUFA來源實質上不含EPA。例如：於 本發明之一較佳體系中，該嬰兒配方含有少於約1 6毫克 -21 - 200900075 EPA/100千卡；於另—較佳體系中係含有少於約10毫克 EPA/100千卡；再於另—較佳體系中係含有少於約5毫克 EPA/100千卡。於一特殊之較佳體系中實質上不含有EP A 。於另一較佳體系中該配方不含有EPA，甚至是微量之 EP A亦不存在。 咸信，去活化之LGG與DHA及/或ARA之組合可提 供含有這些作用劑之配方的抗發炎性質互補或協同之效果 。不欲受限於本學說或任何其他學說，咸信，去活化之 LGG係經由預防抑制性-κΒ ( I/cB)之泛素化來（部分）賦 予抗發炎效果。在正常細胞中，I/cB結合胞漿內之核因子-kB ( NF/cB)。當發生UB泛素化時會釋出NF/cB，進入細胞 核內並活化負責發炎反應之基因。此特殊交互作用及所產 生之基因表現的轉變被認爲涉及發炎之調整。咸信，去活 化之LGG防止I/cB泛素化以藉此防止NF/cB釋出，並減輕 或預防發炎。 相反地，ω -3脂肪酸（諸如DHA )被認爲係透過改 變泛稱爲類花生酸（eicosanoid )之自脂肪酸衍生的前發 炎性傳介物的製造來涉入抗發炎作用。位於細胞膜之磷脂 集合庫中之ω -6脂肪酸（諸如ARA )係在發炎反應期間 釋出並釋放游離ARA集合庫。然後，此ARA集合庫藉二 種類型之酶（稱爲脂氧合酶及環氧化酶）作用而產生特殊 之類花生酸譜，包括2系列之前列腺素類，諸如前列腺素 、血栓素及白三烯。 已知這些類花生酸在許多細胞類型及器官中具有過度 -22- 200900075 之前發炎性作用。已知在此過程之數種步驟中，富含ω -3 脂肪酸（諸如ΕΡ Α及DH Α)之飲食爲ω -6脂肪酸之競爭 者，因此可減輕ARA之前發炎效果。例如：ω -3脂肪酸 調整ω -6脂肪酸延長成ARA、ARA併入細胞膜磷脂集合 庫中及自 ARA製造前發炎性類花生酸。因此，DHA和 ARA之組合可提供區別但互補之作用來減輕數種組織中之 發炎反應。 另外，於本發明之某些較佳體系中係將活LGG與去 活化之LGG彼此組合投服。咸信，活LGG與去活化之 LGG的組合可對含有這些作用劑之配方的抗發炎性質提供 互補或協同之效果。不欲受限於本學說或任何其他學說， 活益生菌（諸如LGG)被認爲部分係透過與特殊免疫細胞 表面上之稱爲類鐸受體（TLRs )之特殊受體交互作用來賦 予抗發炎效果。介於活LGG及這些受體間之直接或間接 交互作用起使一胞內信號轉導串聯反應，此反應造成這些 靶的細胞之基因表現改變。此特殊交互作用及所產生之基 因表現的改變和其他細胞作用被認爲涉及調整發炎。由於 活LGG與去活化之LGG據信係透過不同機制操作，因此 ，咸信，這些組成分之組合可提供互補或協同之抗發炎效 果。 另外，於本發明之某些較佳體系中係將活LGG、去活 化之LGG及至少一種LCPUFA —起投服。由於活LGG、 去活化之LGG及LCPUFA據信係各自透過不同機制操作 ，因此，咸信，這些組成分之組合可對含有這些作用劑之 -23- 200900075 配方的抗發炎性質提供互補或協同之效果。 於本發明之一較佳體系中，該個體爲餵食配方乳之嬰 兒。於一較佳體系中，該嬰兒係自出生即餵食配方乳。於 另一較佳體系中，該嬰兒係自出生即餵食母乳直至小於一

歲，之後，改餵食配方乳並於此時開始補充去活化之LGG 〇 · 於本發明之特殊較佳體系中，該方法包含治療或預防 餵食配方乳之早產兒體內之全身性發炎。於此方法中可將 去活化之LGG以嬰兒配方之形式或任何其他合適之形式 投給早產兒。另外，若需要時可將去活化之LGG與DHA 、AR A及/或一或多種活益生菌一起投給早產兒以創造潛 在之協同抗發炎效果。 於本發明之方法中，去活化之LGG可減少或預防系 統性釋出一或多種前發炎性細胞活素或趨化素。此文所使 用之“前發炎性”細胞活素或趨化素包括那些本技藝中已 知之涉及向上調節發炎反應者。這些實例包括，但不限於 ：TNF-α ' IL-1 /3、IL-6、IL-8、IL-1 8 及 GRΟ/KC。 趨化素爲一群可使發炎處之白血球自血液往組織移動 的細胞活素。當製造過量時，趨化素可導致健康組織受損 。與生長相關之致癌基因（GR0/KC )爲一種可補充免疫 細胞至發炎處之趨化素。其爲老鼠中由細胞活素誘導之嗜 中性白血球趨化因子（CINC-1 )的人類對應部分且在功能 上與間白素-8 —族有關。 於本發明之另一較佳體系中，去活化之LGG顯示出 -24- 200900075 可抑制核因子/c B ( N F /C B )之轉位。N F /C B爲所有細胞 類型中所發現之主要轉錄因子，其被認爲在發炎之起始上 扮演重要角色。在大部分細胞中，N F - /c B在細胞質中係 以潛伏、去活化之抑制性/cB ( UB)-結合複合物之形式存 在。當細胞接受任何一大群胞外信號（諸如來自細胞活素 、細菌抗原或自由基者）時’ NF-zcB快速進入細胞核並活 化負責發炎反應之基因。在發炎開始時抑制N F /c B顯示出 可減少發炎反應。Lawrence, ei a/.，Posh6/e iVew /of NFkB in the Resolution of Inflammation, Nature Med. 7 ： 1 2 9 1 ( 2 0 0 1 )。因此’經由本發明之去活化L G G補充品 來抑制N F /c B可協助減輕或預防全身性發炎。 從實例中可知’去活化之LGG顯示出可減輕餵食配 方乳之嬰兒的全身性發炎。當補充以LGG時，餵食配方 乳之大鼠嬰兒中的CINC-1及不同之細胞活素的量可降低 至類似於顧食母乳之大鼠嬰兒的量。 從實例中可知去活化之LGG亦顯示出可顯著降低IL-8之產量、減少NF- /cB轉位並增加小腸上皮組織中I π之 產製。令人驚訝地，本發明者發現去活化之LGG可同時 防止I /c Β泛素化，而活L G G則無此作用。 下列實例描述本發明之多種不同的較佳體系。熟習本 技藝之人士在考量專利說明書或執行如此處所揭示之本發 明後可清楚明白其他在此文之申請專利範圍內之較佳體系 。本專利說明書與實例僅欲用於示範，本發明之範圍及精 神係藉實例後附之申請專利範圍指明。除非另外指出，實 -25- 200900075 例中之所有百分比係以重量計。 【實施方式】 實例1 此實例說明去活化之L G G對餵食配方乳之新生幼鼠 體內之全身性發炎的效果。 材料&方珐 在二個分別之實驗中將史普格-道利（Sprague-Dawley )(塔可尼（Taconic)公司，紐約州 Germantown)幼鼠 任意分配至4組胃造口餵食組中，每組5隻：對照組（無 LPS或LGG) 、LPS組、LPS加活LGG組及LPS加去活 化之LGG組。使用同齡之母鼠餵養的幼鼠作爲參考對照 組。利用大鼠嬰兒人工飼育（p u p - i η -1 h e - c u p )模型在幼鼠 生下來第7天開始胃造口餵食。胃造口餵食管爲由每節長 24公分之聚乙烯製管材料所構成之插入幼鼠胃中的管。在 異氟烷之麻醉下置入胃造口管。將定時控制針筒式幫浦（ timer-controlled syringe pumps )連接餵食管並設定成在 每一小時之前20分鐘以重量倚賴性之流速館食大鼠。 在2天之適應期間以大鼠母乳替代品（RMS )餵食經 胃造口餵食之幼鼠。適應期過後給予一組RMS餵食組每 天每公斤體重1x1 08之去活化LGG的細胞同等物補充品。 LGG係經由致命性熱處理來去活化。給予第二組每天每公 斤體重lxlOscfu/升之活LGG補充品。第三組係餵食不含 -26- 200900075 任何類型LGG之RMS。持續供給這些飼料6天。所有胃 造口餵食組均接受等量之脂肪及碳水化合物，而蛋白質組 成分則類似於正常生長所需之量。使用同齡之母鼠餵養的 幼鼠作爲參考對照組。 經由震盪混合將來自大腸桿菌0 1 2 7 : B 8 ( L P S ;密蘇 里州聖路易市，史格馬（Sigma )公司）之脂多醣（LPS ) 溶解在水中使濃度成爲2毫克/毫升。在開始人工餵食後2 天開始經由胃造管給予胃造管餵食組0.25至0.5毫克/公 斤/天之LPS。給予幼鼠LPS補充品6天。在先驅硏究（ pilot study )中決定此劑量，以造成偶然之發抖及毛髮直 立和體重增加不良，但其與6天內之死亡率明顯增加無關 〇 在6天處置期結束時以過量之戊巴比妥鈉麻醉幼鼠。 移除小腸並分成三部分：迴腸、空腸及十二指腸，將其貯 存在-8 0 °C以供進行酶分析和E LI S A，或將其固定在用於小 腸形態學之1 〇%中性的緩衝福馬林中。將肺臟、肝臟及血 漿貯存在-8 0 °C以供進行酶分析和ELI S A。 使用Sigm as tat統計軟體（SPSS，伊利諾州芝加哥市 )來分析體重’ CINC-1之ELISA結果及細胞活素/趨化素 多重化分析結果。所有數據係記錄成平均値±標準差（S D )。使用各組間之單因子變異分析（ΑΝ Ο V A )來測定所有 治療組間是否出現顯著差異。當ANOVA具p<〇.〇5之顯著 性時執彳了 Η ο 1 m - S i d a k方法以進行成對比較。 -27- 200900075 結果&討論 生長 本實例說明LGG對胃造口餵食後之幼鼠的生長效果 。在胃造口銀食後每日爲幼鼠稱重並將其與由母鼠餓養之 參考動物相比較。由母鼠餵養之動物較以LPS處置之胃造 口餵食的幼鼠生長快速。提供以LP S處置之經由胃造口餵 食的幼鼠活LGG或去活化之LGG並不會改良體重增加的 情形。 CINC-1 活LGG及去活化之LGG可降低本發明中CINC-1之 量。藉由用於大鼠中與生長相關之致癌基因/CINC-1的 TiterZyme 酶免疫計量分析套組（Immunometric Assay kits)來決定 CINC-1 之量（Assay Designs，密西根州 A η η Arbor )。自肝臟、小腸、血漿及肺臟中之全部組織的細 胞萃取物分離出組織樣本。在45 Onm處測定吸收並利用自 線性標準曲線衍生之公式計算濃度。 如第1圖至第3圖中所示’ ELISA之結果顯示出LPS 可增加肝臟、肺臟及血漿中之CINC-1的量。活LGG及去 活化之LGG均可減少肝臟（第1圖）及血漿（第2圖） 中由LPS誘導之CINC-1的產製（ρ<〇·〇5)，肺臟中亦顯 示此趨勢（Ρ = 0·09)(第3圖）。 第1圖說明當與LPS組比較時，活LGG補充品可降 低肝臟中之CINC-1的量約50%。然而，與LPS組比較時 -28- 200900075 ，去活化之LGG補充品可降低肝臟中之CINC-1的量約 75%。因此，去活化之LGG較活LGG對肝臟之CINC-1量 具有明顯較大之降低效果，此表示一種較強之抗發炎效果 。類似地，第2圖說明在去活化之LGG組的血漿中之 CINC-1量較活LGG組中者低。活LGG與去活化之LGG 使肺臟中之CINC-1的量降低至類似程度（第3圖）。

GRO/KC 如第4和5圖所示，該細胞活素多重化分析顯示出肝 臟及肺臟中之GRO/KC量的降低程度類似。去活化之LGG 所降低之肝臟中GRO/KC之量較活LGG爲多，此表示其 具較強之抗發炎效果（第4圖）。活LGG及去活化之 LGG二者可將肺臟中GRO/KC之量降低至類似程度（第5 圖）。 本實驗中所觀察到之肺臟中CINC-1及GRO/KC量降 低表示去活化之LGG的抗發炎效果可延伸至遠端器官。 因此，去活化之LGG的抗發炎效果本質上確實爲全身性 〇 去活化之LGG補充品將肝臟中之CINC-1的量降低至 確實低於由母乳餵養之幼鼠的CINC-1之量。在肺臟及血 漿中，去活化之LGG將CINC-1之量降低至非常類似於由 母乳餵養之幼鼠的量。這些結果顯示出去活化之LGG具 有將餵食配方乳之大鼠嬰兒體內之全身性發炎降低至類似 於（在某些情況中係低於）由母乳餵養之大鼠嬰兒的能力 -29- 200900075 細胞活素&趨化素 活及去活化之LGG亦降低細胞活素及趨化素之量。 自 LINCO硏究公司（美國密蘇里州，St.Charles )購得多 樣小珠套組（Multiplex bead kits )。藉由套組分析之細 胞活素/趨化素包括：顆粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子（ GMCSF)、干擾素-X(IFN-A)、間白素- la(IL-la)、 IL-1 β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70 、IL-1 8、單核細胞趨化蛋白-1 ( MCP-1 ) 、GRO/KC (大 鼠CINC-1)及TNF-a。多重化分析係根據製造者之說明 書進行。利用由製造者提供之參考濃度產生各細胞活素/ 趨化素之標準曲線。藉MasterPlex定量軟體（MiraiBio公 司，美國加州 Alameda )分析原始數據（平均螢光強度） 以取得濃度値。 如第6圖中所示，以LPS處置之經胃造口餵食之幼鼠 肝臟中的IL-1々量明顯較對照組幼鼠增加。活LGG及去 活化之LGG明顯減弱由LPS誘導之IL-1冷量提高。事實 上，去活化之LGG所降低之IL-1点的量多於由活LGG補 充品所降低之量。去活化之LGG將IL-1々之表現降低至 與對照組的程度類似。因此，此部分之實驗進一步說明去 活化之L G G的抗發炎活性。 總結之，這些結果顯示出去活化之LGG補充品可減 輕全身性發炎。再者，該結果顯示出去活化之LGG將餵 -30- 200900075 食配方乳之大鼠嬰兒的全身性發炎減輕至與餵食母乳之大 鼠嬰兒類似的程度。此點係透過將去活化之LGG處置組 與完全餵食母乳組進行比較來說明於此文中所描述的結果 中。在數種情況中，投服去活化之LGG可產生非常類似 於母乳餵食組之發炎反應。 實例2 本實例進一步說明去活化之LGG對餵食配方乳之新 生幼鼠之發炎的效果。 以lxl08cfu/升之活LGG或經UV去活化之LGG預先 處理小腸上皮細胞，再藉由ELISA測量由500奈克/毫升 鞭毛蛋白（Flagellin )刺激所造成之IL-8的產製情形。藉 由西方點墨及免疫沈澱法測量I/cB及泛素化之I/cB(UbQ-I /cB)的表現。藉由免疫螢光染色評估NF/cB之局部化。 實驗期間，鞭毛蛋白誘導細胞IL-8之產製明顯增加 (p<0.05)。預先以活LGG或經UV去活化之LGG處理再以 鞭毛蛋白刺激之細胞顯示出在IL-8、NF/cB核轉位、i/cB及 UbQ-1/cB中有明顯改變（p<〇.〇5)。結果顯示於表1中。 向上指之箭頭代表參數增加而向下指之箭頭代表參數減少 -31 - 200900075 表 1 由於存活或去活化之LGG補充品造成之表現所變 IL-8 NFkB轉位 IkB UbO-TlcR 僅有鞭毛蛋白 t 个 个 活LGG t f 去活化之LGG 1 1 个 1 如表1中所示，鞭毛蛋白引起小腸上皮細胞性IL_8 之產製明顯增加（p<0.〇5)。在活LGG及去活化之LGG 之存在下，IL-8之產製被明顯向下調節。另外，以鞭毛蛋 白刺激之細胞顯示出NF /c B核轉位，而此點可藉由活l G G 及去活化之LGG來防止。鞭毛蛋白減少UB之產製，但此 作用可經由以活LGG及去活化之LGG預先處理來逆轉 (p<0.05)。鞭毛蛋白及活 LGG 可增加 UbQ-I/cB(p<0_05) ，但去活化之L G G則減少U b Q -1 /ΰ B。 此實例說明活LGG及去活化之LGG可有效減少IL-8 (一種前發炎性細胞活素）之產製，因此具有抗發炎效果 。由於鞭毛蛋白及活LGG可增加UbQ-1/cB，但去活化之 LGG減少UbQ-1/cB，因此，去活化之LGG似乎係透過防 止I/cB泛素化之機制運作而活LGG則不。因此，本實例進 一步說明活LGG及去活化之LGG似乎係透過不同機制達 作’若將其一起投服時可能具有協同效果。 本發明顯示出可減輕肝臟、血漿及肺臟中之發炎。由 於本發明可用來改良發炎狀況，其亦可預防有害之感果或 疾病開始。 -32- 200900075 本專利說明書中所列之所有參考資料（包括’但不限 於所有論文、刊物、專利案、專利申請案、發表文章、課 本、報告、手稿、小冊子、書本、網路張貼之文章、雜誌 論文、期刊，等）的全文倂爲本專利說明書之參考資料。 此文中參考資料之討論僅欲摘要其作者之主張，並未承認 有任何參考資料構成習知技藝。申請者保留挑戰所列舉之 參考資料的正確性及適切性之權利。 本發明之這些及其他修改和變化可由本技藝之一般技 術人士執行而不悖離本發明之精神及範疇（其更特別列於 後附之申請專利範圍內）。另外，需了解：不同較佳體系 之觀點可全部或部分交換。再者，熟習此技術之人士可領 會前述內容僅用於示範而不欲如後附之申請專利範圍般限 制本發明。因此，後附之申請專利範圍的精神及範疇不應 侷限於其中所包含之較佳變體的描述。 【圖式簡單說明】 爲了更完整了解本發明，現在參考下列說明與附屬圖 形。 第1圖說明利用酶連結免疫吸附分析（ELISA)測量 活LGG及去活化之LGG對肝臟中由細胞活素誘導之嗜中 性白血球趨化因子-1 (CINC-1)肽之產製的效果。去活化 之L G G係標示爲“熱_ L 〇 G ” 。 第2圖說明利用酶連結免疫吸附分析（ELIS A ) 測 量活LGG及去活化之LGG對血漿中由細胞活素誘導之嗜 -33- 200900075

中性 化之 量活 中性 化之 as s a; 關之 係標 去活 )之 去活 LGG 白血球趨化因子-1 (CINC-1)肽之產製的效果。去活 L G G係標示爲“熱_ L 〇 〇，，。 第3圖說明利用酶連結免疫吸附分析（ELIS a )測 LGG及去活化之LGG對肺臟中由細胞活素誘導之嗜 白血球趨化因子-1 (CINC-1)肽之產製的效果。去活 L G G係標示爲“熱-l G G ” 。 第4圖說明利用細胞活素多重化分析（multip丨ex 〇 測量活LGG及去活化之LGG對肝臓中與生長相 致癌基因（GRO/KC )之產製的效果。去活化之LGG 示爲“熱-LGG” 。 第5圖說明利用細胞活素多重化分析測量活LGG及 化之LGG對肺臟中與生長相關之致癌基因（GRO/KC 產製的效果。去活化之LGG係標示爲“熱-LGG” 。 第6圖說明利用細胞活素多重化分析測量活LGG及 化之LGG對肝臟中IL-Ιβ之量的效果。去活化之 係標示爲“熱-LGG” 。 -34-

Claims (1)

1. 200900075 十、申請專利範圍 1. 一種用於製造供治療、預防或減輕個體之全身性 發炎的藥物之方法，其特徵在於使用每天每公斤體重約lx 1〇4至 1 X 101()個去活化之鼠李醣乳酸桿菌 GG ( Lactobacillus rhamnosus GG) ( LGG)之細胞同等物作爲 藥學活性物質。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中存在之去活 化的LGG量係介於每天每公斤體重約ΙχΙΟ6至ΙχΙΟ9細胞 同等物。 3 .如申請專利範圍第1項之方法，其中存在之去活 化的LGG量係每天每公斤體重約lxlO8細胞同等物。 4.如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥物進一 步包含至少一種其他去活化之益生菌。 5 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥物進一 步包含至少一種存活之益生菌。 6-如申請專利範圍第5項之方法，其中該存活之益 生菌包含LGG。 7 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該藥物額外 包含至少一種長鏈多不飽和脂肪酸（LCPUFA)。 8 .如申請專利範圍第7項之方法，其中該L C P U F A 係選自DHA或ARA。 9.如申請專利範圍第1項之方法，其中該個體爲兒 童 ° 10-如申請專利範圍第1項之方法，其中該個體爲嬰 -35- 200900075 兒。 11.如申請專利範圍第1 〇項之方法，其中該嬰兒爲 早產兒。 -36-