TW200819463A

TW200819463A - Wnt antagonists and their use in the diagnosis and treatment of Wnt-mediated disorders

Info

Publication number: TW200819463A
Application number: TW096133617A
Authority: TW
Inventors: James A Ernst; Paul Polakis; Bonnee Rubinfeld; Venita I Dealmeida
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-09-08
Filing date: 2007-09-07
Publication date: 2008-05-01
Also published as: BRPI0714751A2; US20100266593A1; MX2009002522A; CL2007002609A1; SG174101A1; MA31135B1; IL197240A0; PE20120806A1; CA2662041A1; WO2008031009A3; PE20081217A1; SG174100A1; KR20090060334A; JP2010504081A; CR10699A; US20170349639A1; AU2007292242A1; EP2061495A2; WO2008031009A2; NO20091413L

Description

200819463 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明實質係關於細胞生長之調控。更特定言之，本發明係關於Wnt途徑之抑制劑，以及其在診斷及治療以Wnt 途徑信號轉導活化為特徵之病症中之用途，以及由Wnt途徑信號轉導所介導之細胞事件之調節。【先前技術】

Wnt信號轉導途徑與癌發生之相關性開始作為早期對某些鼠類乳腺腫瘤之觀測及實驗之結果。Wnt-Ι原癌基因 (Int-Ι)最初係自因病毒DNA序列之插入而由小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV)所誘發之乳腺腫瘤中鑑別出。Nusse等人，仏// 1982; 31: 99-109。此病毒之整合使得Int-Ι之表現失調，導致腫瘤形成。Vanooyen，A.等人，CW/ 1984; 39: 233-240; Nusse，R.等人，iVaiwre 1984; 307: 131-136; Tsukamoto 等人，CW/ 1988; 55: 619-625。隨後的序列分析證明，Int_l為與發育相關之果繩基因Wingless之哺乳動物同源基因，且後來將該等術語組合產生n Wnt"以鑑別此蛋白質家族。分泌型配體之人類Wnt基因家族現已發展成至少19個成員（例如 Wnt-1 (RefSeq·: NM—005430)，Wnt-2 (RefSeq·: NM—003391)，Wnt-2B (Wnt-13)(RefSeq·: NM—004185)，Wnt-3 (ReSeq.: NM—030753)，Wnt3a (RefSeq·: NM—033131)，Wnt-4 (RefSeq.: NM__030761)5 Wnt-5A (RefSeq.: NM_003392)5 Wnt-5B (RefSeq.: NM_032642)5 Wnt-6 (RefSeq.: NM__006522)5 Wnt-7A (RefSeq·: NM—004625)，Wnt-7B (RefSeq·: NM—058238)， 124434.doc -6- 200819463

Wnt-8A (RefSeq·: NM一058244)，Wnt-8B (RefSeq·: NM—003393)， Wnt-9A (Wnt-14)(RefSeq·: NM—003395)， Wnt-9B (Wnt- 15)(RefSeq·: NM一003396)，Wnt-lOA (RefSeq·: NM—025216)， Wnt-lOB (RefSeq·: NM—003394)， Wnt-11 (RefSeq·: NM—004626)，Wnt-16 (RefSeq·: NM—016087))。各成員雖具有不同程度的序列一致性，但皆含有23-24個展現高度保守間隔的半胱胺酸殘基。McMahon，AP等人， 1992; 8: 236-242; Miller, JR. Genome Biol. 2002; 3(1): 3 001.1-3 001.15。Wnt蛋白為小的（亦即39-46 kD)經醯化之分泌型醣蛋白，其在胚胎形成與組織成熟中起關鍵作用。胚胎發育期間，Wnt蛋白之表現對經由控制細胞增殖及決定幹細胞命運來形成生長模式具有重要作用。Wnt分子亦經棕櫚醯化，且因此具有比另外僅藉由胺基酸序列分析所預測更強的疏水性。Willert，K·等人，2003; 423: 448-52。亦咸信該或該等棕櫚醯化位點對於行使功能必不习*少〇

Wnt蛋白充當活化七次跨膜受體之Frizzled(Frz)家族之配體。Ingham，P.W· TrenA Ge 加 ί· 1996; 12: 382-384;

YangSnyder，J·等人，Cz/rr. 5b/· 1996; 6: 1302-1306;

Bhanot，P.等人，1996; 382: 225-230。Frz家族存在十個已知成員（例如Frzl、Frz2、Frz3 ··· FrzlO)，各成員特徵為存在半胱胺酸富集域（CRD)。Huang等人，⑽me 2004; 5: 234.1-234.8。雖然各種Wnt-Frizzled相互作用之間存在很大的雜亂度，但Wnt-Fi*z結合亦須合併LDL 124434.doc 200819463 受體相關蛋白（LRP5或LRP6)及膜及細胞質蛋白Dishevelied (Dsh)以形成活性信號轉導複合物。

Wnt與Frizzled之結合可經由典型Wnt信號轉導途徑活化 4吕號轉導’從而使得β·索煙素（β-catenin)穩定且轉錄活性增強[Peifer，Μ.等人，Deve/opmeW 1994; 120: 369-380; Papkoff，J.等人，Mo/· Ce// 5b/· 1996; 16: 2128-2134]，或經由非典型信號轉導途徑（諸如經由Wnt/平面細胞極化 (Wnt/PCP)或Wnt·鈣（Wnt/Ca2+)途徑）活化信號轉導。

Veeman，M.T.等人，Dev. Ce// 2003; 5: 367-377。典型Wnt信號轉導途徑為與癌症發展最相關的Wnt信號轉導途徑。Ilyas，M. J·〜咖/· 2005; 205: 130-144。此途徑之正常活化啟始一系列下游事件，以蛋白質卜索烴素之穩定及含量增加達到極點。此蛋白質通常為非活性細胞質蛋白’且發現於與蛋白質（包括e_鈣黏素）結合之細胞膜上。在Wnt配體不存在之情況下，磷酸化細胞質索烴素通常快速降解。典型途徑活化後，未磷酸化p_索烴素被轉運至細胞核中，在細胞核中其進一步使得各種靶基因轉錄活化。隨後該等靶基因之轉錄上調導致細胞中發生變化，且該等粗基因之連續失調之表現導致腫瘤形成。由於Wnt 信號轉導異常似乎為癌發生之必需先死，因此Wnt信號轉導之有效抑制劑作為癌症治療劑具有重要意義。使用可溶性受體作為配體_受體相互作用之拮抗劑為此項技術中所已知。該等分子若其以使初始受體活化信號轉 V途仏之步驟文阻之方式結合游離配體，則可為有效的治 124434.doc 200819463 療性拮抗劑。已基於結晶學資料鑑別出呈現與Wnt結合之 Frizzled受體之半胱胺酸富集域（CRD)之可溶性最小細胞外域（ECD)片段。Dann等人，412: 86-90 (2001)。然而，儘管該等Frizzled片段呈現與Wnt配體之結合，但該等片段因其在在活體内快速降解而不適合用作治療劑。已有人提出使用與免疫球蛋白Fc偶合之可溶性Frizzled 域作為潛在 Wnt拮抗劑。Therapeutic Opportunities of the Wnt Signaling Pathway in Cancer, New York Academy of

Sciences，2005 年 10 月 25 日；Hsieh，J-C.等人户崩$，96: 3546-355 1 (1999)。然而，在本發明之前，研製可溶性 Frizzled受體-Fc融合體治療劑的努力未成功。舉例而言，一該基於Frz8 CRD之殘基1_173的嵌合體（Frz (173)-Fc， SEQ ID NO: 113)具有次最優的功效（圖12)，且在活體内為不穩定的（圖11)。此外，Frz (173)-Fc嵌合體只不過降低腫瘤體積之增長率（而非使起始腫瘤體積縮小）。此外，儘管通常已知Fc融合體之產生為一種改良所得構築體在活體内之穩定性的技術，但產生有效治療性Fc構築體可因大量問題（包括新穎蛋白質構築體之不當蛋白質摺疊及融合構築體對標靶之空間位阻）而困難重重。因此’對具有強活體内穩定性、用於抑制Wnt配體所誘發之細胞信號轉導的Wnt拮抗劑治療劑存在需要。【發明内容】本發明提供組合物及其在診斷及治療Wnt_中介性病症 (諸如癌症）之方法中及在抑制細胞Wnt信號轉導中的用 124434.doc 200819463 途。特定言之，本發明提供：作為嵌合分子包含諸如來源於Frizzled (Frz)蛋白、Frizzled相關蛋白（sFRP)或另一蛋白質（例如Ror-1、Ror-2等）之多肽的Frizzled域組分及免疫球蛋白Fc域的Wnt拮抗劑，以及其在診斷及治療Wnt-中介性病症之方法中及在抑制細胞Wnt信號轉導中之用途。本發明之一態樣提供包含Frizzled域組分及Fc域的Wnt拮抗劑。Wnt拮抗劑之Frizzled域組分包含來源於Frz蛋白、 FRP蛋白或Ror蛋白的多肽。在一實施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少1小時的活性。在另一實施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少5小時的活性。在另一實施例中，Wnt 拮抗劑在活體内具有至少1天的半衰期。在又一實施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少2天的半衰期。在另一實施例中，Frizzled域組分包含來自Frz多肽的最小CRD (ECD)域，該Frz多肽選自由以下多肽組成之群： hFrzl (SEQ ID NO: 18)? hFrz2 (SEQ ID NO: 19), hFrz3 (SEQ ID NO: 20), hFrz4 (SEQ ID NO: 21)5 hFrz5 (SEQ ID NO: 22)，hFrz6 (SEQ ID NO: 23)，hFrz7 (SEQ ID NO: 24)， hFrz8 (SEQ ID NO: 25)，hFrz9 (SEQ ID NO: 26)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 27)及其活性變體。在又一實施例中， Frizzled域組分包含來自sFRP多肽的最小CRD (ECD)域，該sFRP多肽選自由以下多肽組成之群：sFRPl (SEQ ID NO: 28)，sFRP2 (SEQ ID NO: 29)，sFRP3 (SEQ ID NO: 30)， sFRP4 (SEQ ID NO·· 31)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 32)及其活性變體。在又一實施例中，Frizzled域組分包含來自Ror多肽 124434.doc -10- 200819463 的最小CRD (ECD)域，該Ror多肽選自由hRorl (SEQ ID NO: 33)及hRor2 (SEQ ID NO: 34)及其活性變體組成之群。在又一實施例中，Frizzled域組分包含：選自由以下多肽組成之群的成熟Frz多肽：hFrzl (SEQ ID NO: 50)，hFrz2 (SEQ ID NO: 51), hFrz3 (SEQ ID NO: 52), hFrz4 (SEQ ID NO: 53)，hFrz5 (SEQ ID NO: 54)，hFrz6 (SEQ ID NO: 55)， hFrz7 (SEQ ID NO: 56), hFrz8 (SEQ ID NO: 57), hFrz9 (SEQ ID NO: 58)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 59)及其活性變體；或選自由以下多肽組成之群的成熟sFrp多肽：sFRPl (SEQ ID NO: 60)，sFRP2 (SEQ ID NO: 61)，sFRP3 (SEQ ID NO: 62)，sFRP4 (SEQ ID NO: 63)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 64) 及其活性變體；或選自由以下多肽組成之群的成熟Ror多肽·· hRorl (SEQ ID NO: 65)及 hRor2 (SEQ ID NO: 66)及其活性變體。在又一實施例中，Frizzled域組分包含：選自由以下多肽組成之群的原-Frz多肽·· hFrzl (SEQ ID NO: 35)，hFrz2 (SEQ ID NO: 36)，hFrz3 (SEQ ID NO: 37)，hFrz4 (SEQ ID NO: 38)，hFrz5 (SEQ ID NO: 39)，hFrz6 (SEQ ID NO: 40)， hFrz7 (SEQ ID NO: 41)，hFrz8 (SEQ ID NO: 42)，hFrz9 (SEQ ID NO: 43)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 44)及其活性變體；或選自由以下多肽組成之群的原-sFrp多肽：sFRPl (SEQ ID NO: 45), sFRP2 (SEQ ID NO: 46), sFRP3 (SEQ ID NO: 47)，sFRP4 (SEQ ID NO: 48)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 49) 及其活性變體。 124434.doc -11 - 200819463 在一實施例中，Wnt拮抗劑包含來源於免疫球蛋白的Fc 組分，該免疫球蛋白選自由IgGl、IgG2、IgG3及IgG4組成之群。在另一實施例中，Fc來源於IgGl免疫球蛋白。在又一實施例中，Fc序列包含SEQ ID NO: 67或SEQ ID NO: 68 中所示之F c。

在一實施例中，Wnt结抗劑進一步包含將Frizzled域組分與Fc域連接的連接子。在一該實施例中，連接子為肽連接子，諸如 ESGGGGVT (SEQ ID NO: 69)，LESGGGGVT (SEQ ID NO: 70), GRAQVT (SEQ ID NO: 71)5 WRAQVT (SEQ ID NO: 72)及 ARGRAQVT (SEQ ID NO: 73)。在特定實施例中，Wnt拮抗劑包含選自由以下多肽組成之群的多肽：Frz8-Fc (SEQ ID NO: 74)，Frz5-Fc (SEQ ID NO: 75), Frzl-Fc (SEQ ID NO: 76), Frz2-Fc (SEQ ID NO: 77), Frz3-Fc (SEQ ID NO: 78), Frz4-Fc (SEQ ID NO: 79), Frz6-Fc (SEQ ID NO: 80), Frz7-Fc (SEQ ID NO: 81), Frz9-Fc (SEQ ID NO: 82)，FrzlO-Fc (SEQ ID NO: 83)，sFRPl-Fc (SEQ ID NO: 84)，sFRP2 (SEQ ID NO: 85)，sFRP3-Fc (SEQ ID NO: 86)，sFRP4-Fc (SEQ ID NO: 87)及 sFRP5-Fc (SEQ ID NO: 88)。本發明之另一態樣提供包含至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑及如上所述之Wnt结抗劑的組合物。本發明之又一態樣提供編碼上述任何Wnt拮抗劑的核酸序列。在一實施例中，編碼Wnt拮抗劑的核酸進一步包含含有與該核酸操作性連接之控制序列的載體。在另一實施 124434.doc •12- 200819463 例中，該載體包含於諸如哺乳動物、昆蟲、大腸桿菌（E. coli)或酵母細胞之宿主細胞内。本發明之另一態樣提供包含組合物及容器的製品，該組合物包含至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑及如上所述之Wnt拮抗劑，其中該Wnt拮抗劑包含於該容器内且該容器進一步包含：（a)附著於該容器之標籤；或（b)置於該容器内部、涉及Wnt拮抗劑之使用、指明該組合物用於治療性治療或診斷性偵測Wnt-中介性病症之用途的包裝插頁。本發明之又一態樣提供抑制細胞中Wnt信號轉導的方法，其包含使該細胞接觸有效量的包含Frizzled域組分及 Fc域之Wnt拮抗劑。Wnt拮抗劑之Frizzled域組分包含來源於Frz蛋白、FRP蛋白或Ror蛋白的多肽。在一實施例中， Wnt拮抗劑在活體内具有至少1小時的活性。在另一實施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少5小時的活性。在另一實施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少1天的半衰期。在又一實施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少2天的半衰期。在此態樣之另一實施例中，Frizzled域組分包含來自Frz 多肽的最小CRD (ECD)域，該Frz多肽選自由以下多肽組成之群·· hFrzl (SEQ ID NO: 18)，hFrz2 (SEQ ID NO: 19)， hFrz3 (SEQ ID NO: 20)，hFrz4 (SEQ ID NO: 21), hFrz5 (SEQ ID NO: 22), hFrz6 (SEQ ID NO: 23), hFrz7 (SEQ ID NO: 24)，hFrz8 (SEQ ID NO: 25)，hFrz9 (SEQ ID NO: 26)及 hFrzlO (SEQ ID NO·· 27)及其活性變體。在又一實施例 124434.doc -13- 200819463 中，Frizzled域組分包含來自sFRP多肽的最小CRD (ECD) 域，該sFRP多肽選自由以下多肽組成之群：sFRPl (SEQ ID NO: 28), sFRP2 (SEQ ID NO: 29)? sFRP3 (SEQ ID NO: 30)，sFRP4 (SEQ ID NO: 31)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 32)及其活性變體。在又一實施例中，Frizzled域組分包含來自Ror 多肽的最小CRD (ECD)域，該Ror多肽選自由hRorl (SEQ ID NO: 33)及hRor2 (SEQ ID NO: 34)及其活性變體組成之群。在又一實施例中，Frizzled域組分包含：選自由以下多肽組成之群的成熟Frz多肽：hFrzl (SEQ ID NO: 50)，hFrz2 (SEQ ID NO: 51), hFrz3 (SEQ ID NO: 52), hFrz4 (SEQ ID NO: 53)，hFrz5 (SEQ ID NO: 54)，hFrz6 (SEQ ID NO: 55)， hFrz7 (SEQ ID NO: 56)，hFrz8 (SEQ ID NO: 57)，hFrz9 (SEQ ID NO: 58)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 59)及其活性變體；或選自由以下多肽組成之群的成熟sFrp多肽：sFRPl (SEQ ID NO: 60)，sFRP2 (SEQ ID NO: 61)，sFRP3 (SEQ ID NO: 62)，sFRP4 (SEQ ID NO: 63)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 64) 及其活性變體；或選自由以下多肽組成之群的成熟Ror多肽：hRorl (SEQ ID NO: 65)及 hRor2 (SEQ ID NO: 66)及其活性變體。在又一實施例中，Frizzled域組分包含：選自由以下多肽組成之群的原-Frz多肽：hFrzl (SEQ ID NO: 35)，hFrz2 (SEQ ID NO: 36)，hFrz3 (SEQ ID NO: 37)，hFrz4 (SEQ ID NO: 38)，hFrz5 (SEQ ID NO: 39)，hFrz6 (SEQ ID NO: 40)， 124434.doc -14- 200819463 hFrz7 (SEQ ID NO: 41)，hFrz8 (SEQ ID NO: 42)，hFrz9 (SEQ ID NO: 43)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 44)及其活性變體；或選自由以下多肽組成之群的原-sFrp多肽：sFRPl (SEQ ID NO: 45)5 sFRP2 (SEQ ID NO: 46), sFRP3 (SEQ ID NO: 47)，sFRP4 (SEQ ID NO: 48)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 49) 及其活性變體。在一實施例中，Wnt拮抗劑包含來源於免疫球蛋白的Fc 組分，該免疫球蛋白選自由IgGl、IgG2、IgG3及IgG4組成之群。在另一實施例中，Fc來源於IgGl免疫球蛋白。在又一實施例中，Fc序列展示於SEQ ID NO: 67或SEQ ID NO: 68中。在一實施例中，Wnt拮抗劑進一步包含將Frizzled域組分與Fc域連接的連接子。在一實施例中，連接子為肽連接子，諸如 ESGGGGVT (SEQ ID NO: 69)，LESGGGGVT (SEQ ID NO: 70)，GRAQVT (SEQ ID NO: 71)，WRAQVT (SEQ ID NO: 72)及 ARGRAQVT (SEQ ID NO: 73)。

在特定實施例中，Wnt拮抗劑包含選自由以下多肽組成之群的多肽：Frz8-Fc (SEQ ID NO: 74)，Frz5-Fc (SEQ ID NO: 75)，Frzl-Fc (SEQ ID NO: 76)，Frz2-Fc (SEQ ID NO: 77)，Frz3-Fc (SEQ ID NO: 78)，Frz4-Fc (SEQ ID NO: 79)， Frz6-Fc (SEQ ID NO: 80)，Frz7-Fc (SEQ ID NO: 81)，Frz9-Fc (SEQ ID NO: 82)，FrzlO-Fc (SEQ ID NO: 83)，sFRPl-Fc (SEQ ID NO: 84)，sFRP2 (SEQ ID NO: 85)，sFRP3-Fc (SEQ ID NO: 86)，sFRP4-Fc (SEQ ID NO: 87)及 sFRP5-Fc (SEQ 124434.doc -15- 200819463 ID NO: 88) 〇在該方法之一實施例中，細胞包含於哺乳動物内且投與之量為治療有效量。在另一實施例中，Wnt信號轉導為經由體細胞突變活化Wnt信號轉導組分之結果。在另一實施例中，Wnt信號轉導之抑制導致細胞生長之抑制。在又一實施例中，細胞為癌細胞。本發明之另一態樣提供治療罹患Wnt-中介性病症之哺乳動物之該病症的方法，其包含將治療有效量之包含 Frizzled域組分及Fc域的Wnt拮抗劑投與該哺乳動物。Wnt 拮抗劑之Frizzled域組分包含來源於Frz蛋白、FRP蛋白或 Ror蛋白的多肽。在一實施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少1小時的活性。在另一實施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少5小時的活性。在另一實施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少1天的半衰期。在又一實施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少2天的半衰期。

在此態樣之另一實施例中，Frizzled域組分包含來自Frz 多肽的最小CRD (ECD)域，該Frz多肽選自由以下多肽組成之群·· hFrzl (SEQ ID NO: 18)，hFrz2 (SEQ ID NO: 19)， hFrz3 (SEQ ID NO: 20)，hFrz4 (SEQ ID NO: 21)，hFrz5 (SEQ ID NO: 22), hFrz6 (SEQ ID NO: 23)5 hFrz7 (SEQ ID NO: 24)，hFrz8 (SEQ ID NO: 25)，hFrz9 (SEQ ID NO: 26)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 27)及其活性變體。在又一實施例中，Frizzled域組分包含來自sFRP多肽的最小CRD (ECD) 域，該sFRP多肽選自由以下多肽組成之群：sFRPl (SEQ 124434.doc -16- 200819463 ID NO: 28), sFRP2 (SEQ ID NO: 29), sFRP3 (SEQ ID NO: 30)，sFRP4 (SEQ ID NO: 31)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 32)及其活性變體。在又一實施例中，Frizzled域組分包含來自Ror 多肽的最小CRD (ECD)域，該Ror多肽選自由hRorl (SEQ ID NO: 33)及hRor2 (SEQ ID NO: 34)及其活性變體組成之群。在又一實施例中，Frizzled域組分包含：選自由以下多肽組成之群的成熟Frz多肽：hFrzl (SEQ ID NO: 50)，hFrz2 (SEQ ID NO: 51)，hFrz3 (SEQ ID NO: 52)，hFrz4 (SEQ ID NO: 53)，hFrz5 (SEQ ID NO: 54)，hFrz6 (SEQ ID NO: 55)， hFrz7 (SEQ ID NO: 56)，hFrz8 (SEQ ID NO: 57)，hFrz9 (SEQ ID NO: 58)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 59)及其活性變體；或選自由以下多肽組成之群的成熟sFi*p多肽：sFRPl (SEQ ID NO: 60), sFRP2 (SEQ ID NO: 61)3 sFRP3 (SEQ ID NO: 62)，sFRP4 (SEQ ID NO: 63)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 64) 及其活性變體；或選自由以下多肽組成之群的成熟R〇r多肽：hRorl (SEQ ID NO: 65)及 hRor2 (SEQ ID NO: 66)及其活性變體。在又一實施例中，Frizzled域組分包含：選自由以下多肽組成之群的原-Frz多肽：hFrzl (SEQ ID NO: 35)，hFrz2 (SEQ ID NO: 36)，hFrz3 (SEQ ID NO: 37)，hFrz4 (SEQ ID NO: 38)，hFrz5 (SEQ ID NO: 39)，hFrz6 (SEQ ID NO: 40)， hFrz7 (SEQ ID NO: 41)，hFrz8 (SEQ ID NO: 42)，hFrz9 (SEQ ID NO: 43)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 44)及其活性變 124434.doc •17- 200819463 體；或選自由以下多肽組成之群的原-sFrp多肽：sFRPl (SEQ ID NO: 45)，sFRP2 (SEQ ID NO: 46)，sFRP3 (SEQ ID NO: 47)，sFRP4 (SEQ ID NO: 48)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 49) 及其活性變體。在一實施例中，Wnt拮抗劑包含來源於免疫球蛋白的Fc 組分，該免疫球蛋白選自由IgGl、IgG2、IgG3及IgG4組成之群。在另一實施例中，Fc來源於IgGl免疫球蛋白。在又一實施例中，Fc序列展示於SEQ ID NO: 67或SEQ ID NO: 68中。在一實施例中，Wnt拮抗劑進一步包含將Frizzled域組分與Fc域連接的連接子。在一實施例中，連接子為肽連接子，諸如 ESGGGGVT (SEQ ID NO: 69)，LESGGGGVT (SEQ ID NO: 70)，GRAQVT (SEQ ID NO: 71)，WRAQVT (SEQ ID NO: 72)及 ARGRAQVT (SEQ ID NO: 73)。在特定實施例中，Wnt拮抗劑包含選自由以下多肽組成之群的多肽：Frz8-Fc (SEQ ID NO: 74)，Frz5-Fc (SEQ ID NO: 75)，Frzl-Fc (SEQ ID NO: 76)，Frz2-Fc (SEQ ID NO: 77)，Frz3-Fc (SEQ ID NO: 78)，Frz4-Fc (SEQ ID NO: 79)， Frz6-Fc (SEQ ID NO: 80)5 Frz7-Fc (SEQ ID NO: 81), Frz9-Fc (SEQ ID NO: 82)，FrzlO-Fc (SEQ ID NO: 83)，sFRPl-Fc (SEQ ID NO: 84)，sFRP2 (SEQ ID NO: 85)，sFRP3-Fc (SEQ ID NO: 86)，sFRP4_Fc (SEQ ID NO: 87)及 sFRP5-Fc (SEQ ID NO: 88) 〇在此方法之一實施例中，該病症為與Wnt信號轉導活動 124434.doc • 18 - 200819463 異常相關之細胞增殖性病症。在另一實施例中，異常Wnt 4吕號轉導活性起因於Wnt蛋白之表現增加。在又一實施例中’細胞增瘦性病症為癌症，諸如結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、神經膠質瘤或髓母細胞瘤。本發明之又一態樣提供偵測Wnt蛋白存在的方法，其包含使樣本接觸如上所述之Wnt拮抗劑，其中複合物之存在或Wnt拮抗劑與Wnt蛋白之間的結合度指示Wnt蛋白及/或信號轉導之存在。在一實施例中，該方法進一步包含判定 Wnt信號轉導程度是否異常，該方法進一步包含將該樣本之結合量與已知具有生理學正常Wnt信號轉導之第二樣本之結合量加以比較。該樣本之結合量若高於或低於第二樣本之結合量則指示Wnt信號轉導異常。在又一實施例中， Wnt信號轉導異常進一步指示存在Wnt-中介性病症，諸如癌症。本發明之另一態樣提供調節細胞中以Wnt信號轉導活化或過度為特徵之Wnt靶基因之表現的方法，該方法包含使該細胞接觸有效量之上述Wnt拮抗劑。本發明之又一態樣提供治療性治療Wnt-中介性癌症的方法’其包含投與治療有效量之包含Frizzlecl域組分及以域的Wnt拮抗劑。Wnt拮抗劑之Frizzled域組分包含來源於ρΓΖ 蛋白、FRP蛋白或Ror蛋白的多肽。在一實施例中，買以拮抗劑在活體内具有至少1小時的活性。在另一實施例中， Wnt拮抗劑在活體内具有至少5小時的活性。在另一實施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少1天的半衰期。在又一實 124434.doc -19- 200819463 施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少2天的半衰期。在此態樣之另一實施例中，Frizzled域組分包含來自Frz 多肽的最小CRD (ECD)域，該Frz多肽選自由以下多肽組成之群：hFrzl (SEQ ID NO: 18)，hFrz2 (SEQ ID NO: 19)， hFrz3 (SEQ ID NO: 20)? hFrz4 (SEQ ID NO: 21), hFrz5 (SEQ ID NO: 22)，hFrz6 (SEQ ID NO: 23)，hFrz7 (SEQ ID NO: 24)，hFrz8 (SEQ ID NO: 25)，hFrz9 (SEQ ID NO: 26)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 27)及其活性變體。在又一實施例中，Frizzled域組分包含來自sFRP多肽的最小CRD (ECD) 域，該sFRP多肽選自由以下多肽組成之群：sFRPl (SEQ ID NO: 28)，sFRP2 (SEQ ID NO: 29)，sFRP3 (SEQ ID NO: 30)，sFRP4 (SEQ ID NO: 31)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 32)及其活性變體。在又一實施例中，Frizzled域組分包含來自Ror 多肽的最小CRD (ECD)域，該Ror多肽選自由hRorl (SEQ ID NO: 33)及hRor2 (SEQ ID NO: 34)及其活性變體組成之群。

在又一實施例中，Frizzled域組分包含：選自由以下多肽組成之群的成熟Frz多肽：hFrzl (SEQ ID NO: 50)，hFrz2 (SEQ ID NO: 51), hFrz3 (SEQ ID NO: 52), hFrz4 (SEQ ID NO: 53)，hFrz5 (SEQ ID NO: 54)，hFrz6 (SEQ ID NO: 55)， hFrz7 (SEQ ID NO: 56)，hFrz8 (SEQ ID NO: 57), hFrz9 (SEQ ID NO: 58)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 59)及其活性變體；或選自由以下多肽組成之群的成熟sFrp多肽：sFRPl (SEQ ID NO: 60)，sFRP2 (SEQ ID NO: 61)，sFRP3 (SEQ ID 124434.doc -20- 200819463 NO: 62)，sFRP4 (SEQ ID NO: 63)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 64) 及其活性變體；或選自由以下多肽組成之群的成熟Ror多肽：hRorl (SEQ ID NO: 65)及 hRor2 (SEQ ID NO: 66)及其活性變體。在又一實施例中，Frizzled域組分包含：選自由以下多肽組成之群的原-Frz多肽：hFrzl (SEQ ID NO: 35)，hFrz2 (SEQ ID NO: 36)，hFrz3 (SEQ ID NO: 37)，hFrz4 (SEQ ID NO: 38)，hFrz5 (SEQ ID NO: 39)，hFrz6 (SEQ ID NO: 40)， hFrz7 (SEQ ID NO: 41)，hFrz8 (SEQ ID NO: 42)，hFrz9 (SEQ ID NO: 43)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 44)及其活性變體；或選自由以下多肽組成之群的原-sFrp多肽：sFRPl (SEQ ID NO: 45)，sFRP2 (SEQ ID NO: 46)，sFRP3 (SEQ ID NO: 47)，sFRP4 (SEQ ID NO: 48)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 49) 及其活性變體。在一實施例中，Wnt拮抗劑包含來源於免疫球蛋白的Fc 組分，該免疫球蛋白選自由IgGl、IgG2、IgG3及IgG4組成之群。在另一實施例中，Fc來源於IgGl免疫球蛋白。在又一實施例中，Fc序列展示於SEQ ID NO: 67或SEQ ID NO: 68中。

在一實施例中，Wnt拮抗劑進一步包含將Frizzled域組分與Fc域連接的連接子。在一實施例中，連接子為肽連接子，諸如 ESGGGGVT (SEQ ID NO: 69)，LESGGGGVT (SEQ ID NO: 70)，GRAQVT (SEQ ID NO: 71)，WRAQVT (SEQ ID NO: 72)及 ARGRAQVT (SEQ ID NO: 73)。 124434.doc -21- 200819463 在特定實施例中，Wnt拮抗劑包含選自由以下多肽組成之群的多肽：Frz8-Fc (SEQ ID NO: 74)，Frz5-Fc (SEQ ID NO: 75)，Frzl-Fc (SEQ ID NO: 76)，Frz2-Fc (SEQ ID NO: 77)，Frz3-Fc (SEQ ID NO: 78)，Frz4-Fc (SEQ ID NO: 79)， Frz6-Fc (SEQ ID NO: 80), Frz7-Fc (SEQ ID NO: 81)? Frz9-Fc (SEQ ID NO: 82)，FrzlO-Fc (SEQ ID NO: 83)，sFRPl-Fc (SEQ ID NO: 84)，sFRP2 (SEQ ID NO: 85)，sFRP3-Fc (SEQ ID NO: 86)，sFRP4-Fc (SEQ ID NO: 87)及 sFRP5-Fc (SEQ ID NO: 88)。投與該拮抗劑阻滯癌症在尺寸上之任何後續增加或嚴重性加重。在一實施例中，投與Wnt拮抗劑使得癌症尺寸減小或嚴重程度降低。在另一實施例中，投與Wnt拮抗劑減少癌症之腫瘤負荷。在又一實施例中，投與Wnt拮抗劑殺死癌症。本發明之另一態樣提供Wnt拮抗劑在製造用於治療細胞增殖性病症之藥物中的用途。Wnt拮抗劑包含Frizzled域組分及Fc域。Wnt拮抗劑之Frizzled域組分包含來源於Frz蛋白、FRP蛋白或Ror蛋白的多肽。在一實施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少1小時的活性。在另一實施例中，Wnt 拮抗劑在活體内具有至少5小時的活性。在另一實施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少1天的半衰期。在又一實施例中，Wnt拮抗劑在活體内具有至少2天的半衰期。在此態樣之另一實施例中，Frizzled域組分包含來自Fi*z 多肽的最小CRD (ECD)域，該Frz多肽選自由以下多肽組成 124434.doc -22- 200819463 之群：hFrzl (SEQ ID NO: 18)，hFrz2 (SEQ ID NO: 19)， hFrz3 (SEQ ID NO: 20), hFrz4 (SEQ ID NO: 21), hFrz5 (SEQ ID NO: 22)，hFrz6 (SEQ ID NO: 23)，hFrz7 (SEQ ID NO: 24)，hFrz8 (SEQ ID NO· 25)，hFrz9 (SEQ ID NO: 26)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 27)及其活性變體。在又一實施例中，Frizzled域組分包含來自sFRP多肽的最小CRD (ECD) 域，該sFRP多肽選自由以下多肽組成之群：sFRPl (SEQ ID NO: 28)，sFRP2 (SEQ ID NO: 29)，sFRP3 (SEQ ID NO: 30)，sFRP4 (SEQ ID NO: 31)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 32)及其活性變體。在又一實施例中，Frizzled域組分包含來自Ror 多肽的最小CRD (ECD)域，該Ror多肽選自由hRorl (SEQ ID NO: 33)及hRor2 (SEQ ID NO: 34)及其活性變體組成之群。在又一實施例中，Frizzled域組分包含：選自由以下多肽組成之群的成熟Frz多肽：hFrzl (SEQ ID NO: 50)，hFrz2 (SEQ ID NO: 51)，hFrz3 (SEQ ID NO: 52)，hFrz4 (SEQ ID NO: 53), hFrz5 (SEQ ID NO: 54), hFrz6 (SEQ ID NO: 55), hFrz7 (SEQ ID NO: 56)，hFrz8 (SEQ ID NO: 57)，hFrz9 (SEQ ID NO: 58)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 59)及其活性變體；或選自由以下多肽組成之群的成熟sFrp多肽：sFRPl (SEQ ID NO: 60)，sFRP2 (SEQ ID NO: 61)，sFRP3 (SEQ ID NO: 62), sFRP4 (SEQ ID NO: 63)^sFRP5 (SEQ ID NO: 64) 及其活性變體；或選自由以下多肽組成之群的成熟R0r多肽：hRorl (SEQ ID NO: 65)及 hRor2 (SEQ ID NO: 66)及其 124434.doc -23- 200819463 活性變體。在又一實施例中，Frizzled域組分包含：選自由以下多肽組成之群的原-Frz多肽：hFrzl (SEQ ID NO: 35)，hFrz2 (SEQ ID NO: 36)，hFrz3 (SEQ ID NO: 37)，hFrz4 (SEQ ID NO: 38)，hFrz5 (SEQ ID NO: 39)，hFrz6 (SEQ ID NO: 40)， hFrz7 (SEQ ID NO: 41), hFrz8 (SEQ ID NO: 42)? hFrz9 (SEQ ID NO: 43)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 44)及其活性變體；或選自由以下多肽組成之群的原-sFrp多肽：sFRPl ί ' (SEQ ID NO: 45)，sFRP2 (SEQ ID NO: 46)，sFRP3 (SEQ ID NO: 47)，sFRP4 (SEQ ID NO: 48)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 49) 及其活性變體。在一實施例中，Wnt拮抗劑包含來源於免疫球蛋白的Fc 組分，該免疫球蛋白選自由IgGl、IgG2、IgG3及IgG4組成之群。在另一實施例中，Fc來源於IgGl免疫球蛋白。在又一實施例中，Fc序列展示於SEQ ID NO: 67或SEQ ID NO: 68中。在一實施例中，Wnt拮抗劑進一步包含將Frizzled域組分與Fc域連接的連接子。在一實施例中，連接子為肽連接子，諸如 ESGGGGVT (SEQ ID NO: 69)，LESGGGGVT (SEQ ID NO: 70)，GRAQVT (SEQ ID NO: 71)，WRAQVT (SEQ ID NO: 72)及 ARGRAQVT (SEQ ID NO: 73)。在特定實施例中，Wnt拮抗劑包含選自由以下多肽組成之群的多肽：Frz8-Fc (SEQ ID NO: 74)，Frz5-Fc (SEQ ID NO: 75)，Frzl-Fc (SEQ ID NO: 76)，Frz2-Fc (SEQ ID NO: 124434.doc -24- 200819463 77), Frz3-Fc (SEQ ID NO: 78), Frz4-Fc (SEQ ID NO: 79), Frz6-Fc (SEQ ID NO: 80)? Frz7-Fc (SEQ ID NO: 81)5 Frz9-Fc (SEQ ID NO: 82)，FrzlO-Fc (SEQ ID NO: 83)，sFRPl-Fc (SEQ ID NO: 84)，sFRP2 (SEQ ID NO: 85)，sFRP3-Fc (SEQ ID NO: 86)，sFRP4-Fc (SEQ ID NO: 87)及 sFRP5-Fc (SEQ ID NO: 88)。在一實施例中，細胞增殖性病症為癌症，諸如結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、神經膠質瘤或髓母細胞瘤。【實施方式】 I.定義 "Wnt蛋白”為Wnt信號轉導途徑組分中與Frizzled受體結合以便活化Wnt信號轉導的配體。Wnt蛋白之特定實例包括至少 19個成員，其包括：Wnt-1 (RefSeq·: NM-005430)， Wnt-2 (RefSeq·: NM—003391)，Wnt-2B (Wnt-13)(RefSeq·: NM—004185)，Wnt-3 (ReSeq·: NM—030753)，Wnt3a (RefSeq·: NM—033 13 1)，Wnt-4 (RefSeq.: NM 一 03 076 1 )， Wnt-5 A (RefSeq·: NM—003392)，Wnt-5B (RefSeq·: NM—032642)，Wnt-6 (RefSeq.-.NM—006522)，Wnt-7A(RefSeq.:NM—004625)，Wnt-7B (RefSeq·: NM—058238)，Wnt-8A (RefSeq·: NM—058244)， Wnt-8B (RefSeq.: NM_003393)? Wnt-9A (Wnt-14)(RefSeq.: NM—003 395)，Wnt-9B (Wnt-15 )(RefSeq·: NM—0033 96)， Wnt-lOA (RefSeq.: NM 一 025216)， Wnt-10B (RefSeq·: NM—003 394)，Wnt-11 (RefSeq·: NM—004626)，Wnt-16 (RefSeq·: NM_016087))。儘管各成員具有不同程度的序列 124434.doc -25- 200819463 一致性，但各成員含有23-24個展現高度保守間隔的半胱胺酸殘基。McMahon，AP等人，7>6/7心 8: 236-242 (1992); Miller JR.5 Genome BioL 3(1): 3001.1-3001.15 (2002)。為本發明之目的起見，Wnt蛋白及其活性變體為與Frizzled ECD或該Frz ECD之CRD組分結合的蛋白質。 ”Frizzled" (Frz)蛋白為一種Wnt信號轉導途徑組分，該組分為結合Wnt蛋白且進一步與其他膜相關Wnt信號轉導組分複合以便將Wnt信號傳遞至下游細胞内組分的七次跨膜受體。Frz 蛋白包括 Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、 Frz6、Frz7、Frz8、Frz9及Frzl0。人類全長Frz蛋白之實例為 hFrzl (NP_003496)(SEQ ID NO: 1)， hFrz2 (NP_001457)(SEQ ID NO: 2)，hFrz3 (NP_059108)(SEQ ID NO: 3), hFrz4 (NP_036325)(SEQ ID NO: 4)? hFrz5 (NP_003459)(SEQ ID NO: 5)，hFrz6 (NP_003497)(SEQ ID NO: 6)，hFrz7 (NP—003498)(SEQ ID NO: 7)，hFrz8 (NP—114072)(SEQ ID NO: 8)，hFrz9 (NP—003499)(SEQ ID NO: 9)及 hFrzlO (NP—009128)(SEQ ID NO: 10)(圖 6A-6C)。 ”分泌型Frizzled相關蛋白”（sFRP)為與Wnt蛋白結合作為分泌型細胞外多肽的Wnt信號轉導途徑組分。sFRP蛋白包括 sFRPl、sFRP2、sFRP3、SFRP4 及 SFRP5。人類全長 sFRP蛋白之實例為 sFRPl (NP_003003)(SEQ ID NO: 11)， sFRP2 (NP—003004)(SEQ ID NO: 12)， sFRP3 (NP—001454)(SEQ ID NO: 13)，sFRP4 (NP—003005)(SEQ ID NO: 14)及 sFRP5 (NP—003006)(SEQ ID NO: 15)(圖 6C- 124434.doc -26- 200819463 6D) 〇 ’’Ror"蛋白包括哺乳動物同源體R〇r 1及R〇r2，其特徵為細胞外Frizzled樣半胱胺酸富集域（CRD)以及近膜端圈形域。Ror蛋白在發育形態發生中起關鍵作用且與細胞骨架之不同組分相關。Rorl與F-肌動蛋白沿應力纖維共定位’ 而Ror2部分地與微管共定位。R〇rl與Ror2共有約58%的總體序列一致性。R〇r2與黑色素瘤相關抗原（MAGE)家族蛋白Dlxin-Ι結合且調控其細胞内分布。Rorl蛋白包括Rorl及 Ror2。人類全長R〇r蛋白之實例為hRorl (NP-005003)(SEQ ID NO: 16)及 hRor2 (NP—004551)(SEQ ID NO: 17)(圖 6D-6E)。 nFrz域組分’’為來源於Frz蛋白、sFRP蛋白、Ror蛋白或其他蛋白質且能夠結合Wnt蛋白的多肽。”來源於”蛋白質的多肽意謂具有可存在於參考蛋白質序列内或該蛋白質之活性變體之序列内之胺基酸序列的多肽。Frz域組分之實例包括Frz蛋白、sFRP蛋白或Ror蛋白之細胞外域’’CRD (ECD)"中之最小半胱胺酸富集域（CRD)，諸如Frzl、 Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、Frz6、Frz7、Frz8、Frz9、 FrzlO、sFRPl、sFRP2、sFRP3、sFRP4、sFRP5、Rorl 或 Ror*2及其活性變體之CRD (ECD)。CRD (ECD)為具有100 至250個胺基酸之保守型結構基元且由10個高度保守半胱胺酸界定。人類CRD (ECD)之特定實例以加框文字展示於圖 3B 中且呈示為 SEQ ID NO : hFrzl (SEQ ID NO: 18)， hFrz2 (SEQ ID NO: 19)，hFrz3 (SEQ ID NO: 20)，hFrz4 124434.doc -27- 200819463 (SEQ ID NO: 21)，hFrz5 (SEQ ID NO: 22)，hFrz6 (SEQ ID NO: 23)，hFrz7 (SEQ ID NO: 24)，hFrz8 (SEQ ID NO: 25)， hFrz9 (SEQ ID NO: 26), hFrzlO (SEQ ID NO: 27), sFRPl (SEQ ID NO: 28)，sFRP2 (SEQ ID NO: 29)，sFRP3 (SEQ ID NO: 30)，sFRP4 (SEQ ID NO: 31)，sFRP5 (SEQ ID NO: 32)， hRorl (SEQ ID NO: 33)及 hRor2 (SEQ ID NO: 34)。

Frz域組分之其他實例包括來源於原-Frz蛋白或原-sFRP 蛋白之原-Frz域（諸如 Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、 Frz6、Frz7、Frz8、Frz9、FrzlO、sFRPl、sFRP2、 sFRP3、sFRP4或sFRP5)及其活性變體。人類原-Frz域之特定實例展示於圖3A中且呈示為SEQ ID NO: hFrzl (SEQ ID NO: 35)，hFrz2 (SEQ ID NO: 36)，hFrz3 (SEQ ID NO: 37)， hFrz4 (SEQ ID NO: 38)，hFrz5 (SEQ ID NO: 39)，hFrz6 (SEQ ID NO: 40)，hFrz7 (SEQ ID NO: 41)，hFrz8 (SEQ ID NO: 42)，hFrz9 (SEQ ID NO: 43)，hFrzlO (SEQ ID NO: 44)， sFRPl (SEQ ID NO: 45)，sFRP2 (SEQ ID NO: 46)，sFRP3 (SEQ ID NO: 47)，sFRP4 (SEQ ID NO: 48)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 49)。

Frz域組分之其他實例包括來源於成熟Frz蛋白、sFRP蛋白或Ror蛋白之成熟Frz域（諸如Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、 Frz5、Frz6、Frz7、Frz8、Frz9、FrzlO、sFRPl、sFRP2、 sFRP3、sFRP4、sFRP5、Rorl 或 Ror2)及其活性變體。人類成熟Frz域之特定實例展示於圖3B中且呈示為SEQ ID NO: hFrzl (SEQ ID NO: 50)，hFrz2 (SEQ ID NO: 51)，hFrz3 124434.doc -28- 200819463 (SEQ ID NO: 52), hFrz4 (SEQ ID NO: 53), hFrz5 (SEQ ID NO: 54)，hFrz6 (SEQ ID NO: 55)，hFrz7 (SEQ ID NO: 56)， hFrz8 (SEQ ID NO: 57)，hFrz9 (SEQ ID NO: 58)，hFrzlO (SEQ ID NO: 59), sFRPl (SEQ ID NO: 60), sFRP2 (SEQ ID NO: 61), sFRP3 (SEQ ID NO: 62), sFRP4 (SEQ ID NO: 63), sFRP5 (SEQ ID NO: 64)，hRorl (SEQ ID NO: 65)及 hRor2 (SEQ ID NO: 66)。 ’’Wnt拮抗劑”為包含Frz域組分及免疫球蛋白Fc域，與 Wnt蛋白結合且活性在於衰減細胞Wnt信號轉導或減緩因其所導致之生理症狀的嵌合型多肽。在某些實施例中，Fc域為人類IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc域。在一實施例中，Fc域為人類IgGl Fc域。Fc域之特定實例展示於圖4、圖5及圖7中及SEQ ID NO: 67及SEQ ID NO: 68 中。在一些實施例中，Frz域組分及Fc域由連接子融合。術 §吾π連接子”係指將F r z域組分與F c域系拾在一起的組分。適用於本發明中之連接子對Wnt拮抗劑分子之蛋白質域之表現、分泌及摺疊展現最小的干擾或不干擾，且經由立體方式或其他方式對Fc域之效應功能或Frz域之Wnt蛋白相互作用功能（例如與Wnt蛋白結合）產生最小的干擾或不產生干擾。在特定實施例中，連接子為短肽序列。除為活性所需之最少殘基外，連接子序列亦可包括來自Frz域組分或Fc 域的其他胺基酸殘基。較佳連接子亦提供良好的血清穩定性及對抗蛋白酶裂解之抗性。適用連接子之特定實例呈現 124434.doc -29- 200819463 於圖4、圖5及圖7中，包括序列ESGGGGVT (SEQ ID NO: 69)，LESGGGGVT (SEQ ID NO: 70)，GRAQVT (SEQ ID NO: 71)，WRAQVT (SEQ ID NO: 72)及 ARGRAQVT (SEQ ID NO: 73)。如上所述，除為活性所需之最少殘基外，該等連接子序列亦可包括來自Frz域組分或Fc域的其他胺基酸殘基。該等連接子亦可包含與來自Frz域組分或Fc域組分之胺基酸殘基不同的其他胺基酸殘基。 nWnt信號轉導途徑組分”為轉導起源於Wnt蛋白與Frz受體之間相互作用之信號的組分。由於Wnt信號轉導途徑複雜且涉及廣泛的反饋調控，因此存在諸多且可能尚末發現的Wnt信號轉導途徑成員。Wnt信號轉導途徑組分之實例包括：膜相關蛋白質LRP5及LRP6、Axin及Dishevelled ; 細胞外Wnt相互作用型蛋白質sFRP、WIF-1、LRP失活蛋白質Dkk及Krn、胞質蛋白β-索烴素、β-索烴素”降解複合物” APC之成員GSK3P、CKIa及ΡΡ2Α、細胞核轉運蛋白APC、 pygopus及 bcl9Hegless，及轉錄因子 TCF/LEF、Groucho及各種組蛋白乙醯化酶，諸如CBP/p300及Brg-Ι。 ’’Wnt-中介性病症”為以Wnt信號轉導異常為特徵之病症、病狀或疾病病況。在一特定態樣中，異常Wnt信號轉導為懷疑患病之細胞或組織中超過類似非患病細胞或組織中Wnt信號轉導量之Wnt信號轉導量。在一特定態樣中， Wnt-中介性病症包括癌症。術語’’癌症”係指哺乳動物中特徵通常為細胞生長/增殖失調之生理狀態。癌症之實例包括（但不限於）：癌瘤、淋巴 124434.doc -30- 200819463 瘤、胚細胞瘤及白血病。癌症之更特定實例包括（但不限於）·慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、肺癌（包括非小細胞肺癌(NSCLC))、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、月il列腺癌、結腸直腸癌、腸類癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌（肝細胞癌）、肝母細胞瘤、食道癌、肺腺癌、間皮瘤、滑膜肉瘤、骨肉瘤、頭頸鱗狀細胞癌、青少年鼻咽血官纖維瘤、脂肪肉瘤、甲狀腺癌、黑色素瘤、基底細胞癌（BCC)、髓母細胞瘤及硬纖維瘤。術扣控制序列”係指在特定宿主有機體中表現操作性連接之編碼序列所必需的驗序列。適於原核細胞之控制序列例如包括啟動子、視情況之操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多聚腺苷酸化信號及增強 0

核酉夂當其與另—核酸序列處於功能性關係中時為"操作性連接的"。舉例而言，前序列或分泌性前導序列之DNA 若以參與一種多肽分泌之前蛋白受到表現，則其與該多肽之DNA#作性連接；啟動子或增強子若影響編碼序列之轉其與該序列操作性連接；或核糖體結合㈣若以促進轉譯之方式安置，則其與編碼序列操作性連接， #作性連接”意謂所連接之dna 祕A^1連的，且在分泌性别導序列之情況下，為规連的且處於讀取階段。秋而增強子不必為桃連的。連接藉由:然而，夾會王目斗〇 t 你迥田的限制性位點接合右該專位點不存在，則根據習知方法使核苷酸銜接子或連接子。使用5成养 124434.doc -31 - 200819463 •’活性”多肽、變異多肽或其片段保留活性多肽之天然或天然存在組分之生物活性。生物活性係指由活性多肽之天然或天然存在對應物所介導的功能。舉例而言，結合或蛋白質-蛋白質相互作用形成生物活性。就特定意義而言， /舌性Wnt信號轉導途徑組分為一種可經由與其他Wnt信號返從組分之相互作用來有效轉導信號的組分。就另一種特定意義而言，活性Wnt拮抗劑為一種相對於Wnt拮抗劑投藥前之程度可偵測性地減弱Wnt信號轉導或由其所產生之生理病狀的枯抗劑。雜父反應之"嚴格度”易由一般技術者測定，且通常為根據探針長度、洗滌溫度及鹽濃度的經驗計算。一般而言，探針愈長，則正確黏接需要的溫度愈高，而探針愈短，需要的度愈低。當互補鍵存在於低於其解鍵溫度之環境下時，雜交通常視變性DNA之再黏接能力而定。探針與可雜父序列之間的所要同源度愈高，則可使用之相對溫度愈局。因此，可得知較高相對溫度傾向於使反應條件更嚴格’而較低溫度則相反。有關雜交反應之嚴格度的其他細卽及說明’凊參見Ausubel等人，Current Protocols in

Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers, (1995)。

如本文中所定義之"高嚴格條件"可由如下方式鑑別：（^) 洗滌使用低離子強度及高溫，例如在50°C下、0.015 μ氣化納/0.0015 IV[彳争檬酸鈉/〇1。/❶十二烧基硫酸鈉；（2)雜交期間使用變性劑’諸如甲醯胺，例如在42°C下、具有〇·ι%牛血/月白蛋白/0·1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/具有75〇 mM 124434.doc -32- 200819463 氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉之50 mM磷酸鈉緩衝液（pH 6.5)之 50%(v/v)甲醯胺；或（3)在42°C下、在使用如下物質之溶液中雜交隔夜：50% 甲醯胺、5 X SSC (0.75 M NaCl、0.075 Μ擰檬酸鈉）、50 mM磷酸鈉（pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5 x Denhardt氏溶液、經超音處理之I圭魚精子DNA (50 pg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，在42°C下於0.2 X SSC(氣化鈉/檸檬酸鈉）中洗滌10分鐘，繼而在55°C下以由0·1χ含有EDTA之SSC組成之高嚴格度洗滌液洗滌10分鐘。 ”中等嚴格條件”可如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述加以鑑別，且包括使用比上述彼等條件較不嚴格的洗滌液及雜交條件（例如溫度、離子強度及％ SDS)。中等嚴格條件之一實例為在37°C下於包含以下物質之溶液中培育隔夜：20% 甲醯胺、5 X SSC (150 mM NaCM、15 mM 擰檬酸三納）、50 mM填酸鈉（pH 7.6)、5 x Denhardt氏溶液、10%硫酸葡聚糠及20 mg/mL經剪切之變性I圭魚精 DNA，繼而在約37-50°C下於1 X SSC中洗滌過濾器。熟習此項技術者應瞭解如何視需要調整溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及類似因素之各因素。術語”經標記之抗原決定基’’係指與”標記多肽’’融合的多肽。標記多肽具有足夠的殘基以提供抗體可防禦、但足夠短的抗原決定基，以使得其不干擾與其融合之多肽的活性。標記多肽較佳亦十分獨特以便抗體實質上不與其他抗 124434.doc •33- 200819463 原決定基交又反應。適當的標記多肽通常具有至少六個胺基酸殘基且通常介於約8與50個胺基酸殘基之間（較佳介於約10與20個胺基酸殘基之間）。抗原決定基標記序列之實例包括HA、GD、c-myc、poly-His 及 FLAG。 "治療”或’’減緩”係指治療性治療與預防性措施，其中目標係預防或減緩所靶向之病理性疾病或病狀或病症。需要治療者包括已患病症者以及有患病症之傾向者或待預防病症者。當Wnt-中介性病症為癌症時，若根據本發明之方法接受治療量之Wnt拮抗劑後，患者展示以下方面中之一或多者之可觀測及/或可量測之減少或消失，則受檢者或哺乳動物經成功”治療，，或展示腫瘤負荷降低：癌細胞數減少或癌細胞消失；腫瘤尺寸減小；癌細胞滲入外周器官（包括癌症擴散至軟組織及骨内）受抑制（亦即在某種程度上減緩且較佳終止）；腫瘤轉移受抑制（亦即在某種程度上減緩且較佳終止腫瘤生長在某種程度上受抑制及/或一或多種與特定癌症相關之症狀在某種程度上減輕；患病率及死亡率降低，及生活品質問題提高。就Wnt拮抗劑可阻止生長且/或殺死現存癌細胞之程度而言，其可為細胞生長抑制劑及/或細胞毒性劑。患者亦可感知該等病徵或症狀之減輕。以上用⑤評價成功治療及病症改善的參數易由醫師孰知之常規程序量測。癌症療法之功效可例如藉由評估疾:進展時間（TDP)及/或測定反應率（RR)來量測。轉移可如下測定：分階段測試及骨掃描及測試鈣含量及其他酶以判定是 124434.doc -34- 200819463 否擴散至骨。亦可進行CT掃描以尋查是否擴散至骨盆及該區域内之淋巴結。胸部X·射線及藉由已知方法量測肝酶含量分別用於查診是否轉移至肺及肝。其他監控疾病的常規方法包括經直腸超音波掃描術（T R ϋ s)及經直腸針刺活檢術 (TRNB) 〇 ’’慢性”投藥係指以與急性方式相反之連續方式投與藥劑，以便長期維持初始治療效應（活性）。"間歇”投藥為與連續或依序方式相反之週期性治療，或經受週期性中止之治療。甫乳動物’’係指歸類為哺乳動物的任何動物，包括人類、酬養動物及農畜，以及動物園動物、運動型動物或玩賞動物，諸如犬、f苗、牛、馬、錦羊、豬、山羊、兔等。哺乳動物較佳為人類。與一或多種其他治療劑，，組合”投藥包括同時（並行）投藥及/或依任何順序之連續投藥。如本文中所使用之”載劑"包括醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，其在所使用之劑量及濃度下對所曝露於其中之細胞或哺乳動物無毒。生理學上可接受之載劑通常為pH緩衝水溶液。生理學上可接受之載劑之實例包括：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸，低分子量（少於約丨〇個殘基）多肽；蛋白質’諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚人物，諸如聚乙烯口比咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩心酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水 124434.doc -35- 200819463 化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如 EDTA ;糖醇，諸如甘露糠醇或山梨糖醇，·成鹽平衡離子，諸如鈉；及/或非離子型界面活性劑，諸如 TWEEN®、聚乙二醇（PEG)及 PLURONICS®。

Writ拮抗劑之”有效量”為足以實現明確規定之目的的量。”有效量”可相對於所述目的、憑經驗且以常規方式判定。 f

術語"治療有效量"係指有效”治療"受檢者或哺乳動物中 Wnt-中介性病症之Wnt拮抗劑之量。在癌症之情況下，治療有效量之藥物可減少癌細胞數目；縮小腫瘤尺寸；抑制 (亦即，在某種程度上減緩且較佳終止）癌細胞滲入外周器官；抑制（亦即，在某種程度上延緩且較佳終止）腫瘤轉移；在某種程度上抑制腫瘤生長及/或在某種程度上減輕與癌症相關的一或多種症狀。參見本文中”治療"之定義。就藥物可阻止生長且/或殺死現存癌細胞之程度而言，其可為細胞生長抑制劑及/或細胞毒性劑。

Wnt拮抗劑之"生長抑制量"為能夠在活體外或在活體内抑制細胞、尤其腫瘤細胞（例如癌細胞）之生長的量。用於抑制贅生性細胞生長之Wnt拮抗劑之"生長抑制量瘦驗且以常規方式判定。心，

Wnt拮抗劑之’’細胞毒性看， #注里為忐夠在活體外或在活體内導致細胞、尤其腫瘤鈿睑r γ 廇、、、田胞（例如癌細胞）破壞的量。

制贅生性細胞生長之妊 P 且以常規方式判定。…也_，、·.. 括抗劑之"細胞毒性量"可憑經驗 124434.doc -36- 200819463 術語’•抗體’’與”免疫球蛋白”可互換使用，且就最廣泛之意義而言’包括單株抗體（例如全長或完整單株抗體）、多株抗體、多價抗體、多特異性抗體（例如展現所要生物活性之雙特異性抗體），且亦可包括某些抗體片段，如本文中更詳細描述。抗體可為嵌合抗體、人類抗體、人源化抗體及/或親和力成熟抗體。來自任何脊椎動物物種之輕鏈基於其恆定域之胺基酸序列可指定為兩種截然不同之類型（稱為kappa (“及lajnbda (λ))之一。免疫球蛋白視其重鏈恆定域（Ch)之胺基酸序列而定可指定為不同類別或同型。存在五種免疫球蛋白類別·为別具有名稱為α、δ、ε、γ及μ之重鏈的IgA、IgD、 IgE、IgG及IgM。γ及α類別基於Ch序列及功能之相對微小差異可進一步分成亞類，例如，人類表現以下亞類： IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA2。不同類別之免疫球蛋白之亞單位結構及三維構型已熟知且廣泛描述於例如 Abbas 等人，Cellular and Molecular Biology，第 4 版 (2000)中抗體可為由该抗體與一或多個其他蛋白質或狀共價或非共價結合所形成之較大融合分子之部分。抗體片段’’包含完整抗體之一部分，較佳為完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab,、 F(ab’)2及Fv片段、雙功能抗體、線性抗體（美國專利 5,641，870) ; Zapata等人，Protein Eng. 8(10): i〇57_1〇62 (1995) ’由抗體片段所形成之單鏈抗體分子及多特異性抗體。 124434.doc -37· 200819463 木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的稱為"Fab，，片段之抗原結合片段，及殘餘”FC"片段，其名稱反映其易結晶之能力。Fab片段由連同重鏈可變區域一起之整條輕鏈及一重鏈之第一恆定域（CH1)組成。各Fab片段相對於抗原結合而言為單價的，亦即其具有單個抗原結合位點。胃蛋白酶處理抗體產生單個大F(ab，）2片段，其大致相應於具有二價抗原結合活性的兩個經二硫鍵連接之Fab片段且仍能夠父聯抗原。Fab=片段與Fab片段不同之處在於cHl域之羧基末端處具有其他少量殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab’-SH在本文中為Fab，之名稱，其中恆定域之半胱胺酸殘基具有游離硫醇基。F(ab，)2抗體片段最初係作為Fab’片段對（其間具有鉸鏈半胱胺酸）產生。抗體片段之其他化學偶合亦已知。

Fc片段包含藉由二硫鍵維繫在一起之兩個重鏈的竣基末 ‘部分。抗體之效應功能係由F c區中之序列決定，該區域亦為由存在於某些類型細胞上之Fc受體（FcR)所識別的部分。 "Fv”為含有完整抗原識別位點及完整抗原結合位點的最小抗體片段。此片段由一重鏈可變區域與一輕鏈可變區域以非共價緊密結合成之二聚體組成。如本文中所使用之術語”單株抗體”係指獲自實質上同源之抗體群的抗體，亦即，組成該抗體群的個別抗體除少量存在之可能天然存在突變外均相同。單株抗體具有針對單抗原的同度特異性。與多株抗體製劑（其通常包括針對 124434.doc -38- 200819463 不同決定子（抗原決定基）的不同抗體）相比，各單株抗體係針對抗原上的單個決定子。包括於單株抗體定義内的術語”嵌合”抗體特定言之意謂下列抗體：其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或亞類之抗體中的相應序列一致或同源，而該（該等）鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或亞類之抗體中的相應序列一致或同源，以及該等抗體之片段，只要該等抗體展現所要生物活性（美國專利第 4,816,567號；Morrison等人，P.N.A.S. USA 81: 6851-6855 (1984))。非人類（例如，齧齒動物）抗體之，，人源化”形式為含有來源於非人類抗體之最小序列的嵌合抗體。人源化抗體多半為人類免疫球蛋白（受體抗體），其中來自受體高變區之殘基被置換為具有所要抗體特異性、親和力及容量之來自非人類物種（供體抗體）（諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物）之高變區的殘基。在一些情況下，人類免疫球蛋白之框架區（FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人源化抗體可包含並不存在於受體抗體或供體抗體中之殘基。可作出該等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人源化抗體包含至少一個且通常兩個可變域之實質所有序列，其中高變環之所有或實質所有序列對應於非人類免疫球蛋白之彼等序列，且FR之所有或實質所有序列為人類免疫球蛋白序列之彼等序列。人源化抗體視需要亦包含免疫球蛋白恆定區（Fc)之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白之至少 124434.doc -39- 200819463 一部分。詳情請參見Jones等人，iVWwre 321:522·525 (1986) ; Riechmann 等人，332:323-329 (1988)及 Presta, Curr. Op. Struct· Biol. 2:593-596 (1992) 〇亦可參見 Vaswani 及 Hamilton， Ann· Allergy, Asthma & Immunol· 1:105-1 15 (1998); Harris, Biochem. Soc. Trans. 23: 1035- 1038 (1995); Hurle及 Gross，Cwrr· Op· 5: 428-433 (1994)。聚核苦酸”或n核酸"在本文中可互換使用，且係指具有任何長度之核苷酸的多聚體，包括（但不限於）DNA及 RNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基，及/或其類似物，或可由DNA或RNA聚合酶或合成反應併入多聚體内的任何受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在’則對核普酸結構之修飾可在多聚體組裝之前或之後引入。核苷酸序列可經非核苷酸組分中斷。聚核苷酸可在合成之後進一步加以修飾，諸如與標記接合。其他類型之修飾包括·例如’ ”帽”，一或多種天然存在之核苷酸經類似物取代，核苷酸間修飾，諸如非荷電鍵聯（例如膦酸甲 §曰、磷酸二酯、磷醯胺酸酯、胺基甲酸酯等）；荷電鍵聯 (例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）；懸垂部分，諸如蛋白貝（例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚離胺酸等）’肷入劑（例如吖啶（acridine)、補骨脂素，）’螯合劑（例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等）’烷化劑；經修飾之鍵聯（例如α變旋異構體核酸等）。 1244344 200819463 此外，通常存在於糖中之任何羥基可置換為例如經標準保護基所保護之膦酸酯基、磷酸基，或經活化以製備與其他核苷酸之其他鍵聯，或可與固體或半固體載體接合。5，端及3’端OH可經麟酸化或經具有1至2〇個碳原子之胺或有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生為標準保護基。聚核苦酸亦可含有此項技術中通常已知之核糖或脫氧核糖之類似形式，其包括例如2，-0-甲基-核糖' 2，-〇-烯丙基核糖、2’_氟-核糖或2，-疊氮基-核糖、碳環狀糖類似物、心變方疋異構體糖、差向異構體糖（諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖（lyxoses)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖 (sedoheptuloses))、非環狀類似物及非鹼性核苷類似物，諸如甲基核糖核苷。一或多個磷酸二酯鍵可經替代鍵聯基團置換。該等替代鍵聯基團包括（但不限於）如下實施例，其中磷酸酯置換為P(〇)-S-(硫代酸酯）、p(s)_s-(二硫代酸酯）、（0)NR2-醯胺化物、p(0)R、P(〇)〇R，、cg^CH2_(甲縮駿），其中各R或R’獨立地為Η或視需要含有醚、芳基、烯基、環稀基或芳烷基鍵聯之經取代或未經取代之Ci_2〇烷基。聚核苷酸中並非所有的鍵聯必需相同。以上說明適用於本文中提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。術語’’肽f’通常係指由肽鍵連接連接之胺基酸之連續且較短之序列。通常，但不一定，肽具有約2至5〇個胺基酸、 4-40個胺基酸或1〇_3〇個胺基酸之長度。儘管術語，，蛋白質，，通常係指n多肽’’之較長形式，但該等兩個術語在本文之某些上下文中可互換使用且係指通常較長且或許更複雜（例 124434.doc -41- 200819463 如多重序列、二級及更高級結構）的胺基酸序列。多肽之，，區，，為2個或2個以上胺基酸殘基之連續序列。在替代實施例中，區具有至少約3、5、1 〇、15或15個以上連續胺基酸殘基。如本文中所使用之”C-末端區"、”C-末端序列"及其變化形式係指位於或緊鄰於C_末端（通常3，）之胺基酸序列。通常，該序列包括具有游離羧基的胺基酸。在一實施例中，

C-末端區或序列係指包括位置最接近c_末端之約^5個殘基的多肽區。如本文中所使用之"N-末端區，，、，，N•末端序列，，及其變體係指位於或緊鄰於N_末端（通常5，）之胺基酸序列。通常，該序列包括具有游離胺基的胺基酸。在一實施例中，…末端區或序列係指包括位置最接近多肽之N末端之約丨_15個殘基的多狀區。門冲匕驭内部序列"及其變化形式係指位於多肽内部且其N·末端與C_末端由一或多個不為該序列之部分之胺其 ==序列。”，該序列不包括具有游_ ’’配體，，係指能夠與蛋白質或其他分子定位點結合相互作用的天然存在或 ^上之特配體為與Frizzled受體特異性相互或：刀。編常（但不—定）位於細胞表面或膜上。刀。”受體"通融合蛋白”係指具有兩個以共價鍵多狀，其中各部分來源於不同蛋白質起之部分的、孩等兩個部分可由 124434.doc -42- 200819463 單個肽鍵直接連接或經由含有一或多個胺基酸殘基之肤連接子連接。通常，該等兩個部分及連接子彼此連於讀碼框中且可使用重組技術產生。 ”抑制脸瘤細胞生長"之編括抗劑或"生長抑制性"Wnt 拮抗劑為-種可對具有異fWnt信號轉導活性之腫瘤細胞之生長進行可量測之抑制的括抗劑。與適當對照對照物通常為未用所測試之Wnt枯抗劑分子處理之癌細胞）相 , 心較佳生長抑制性Wnt拮抗劑將具有異常心信號轉導 '活性之腫瘤細胞之生長抑制寫以上、較佳約2〇%至約 50%且更佳50%以上（例如約5〇%至約1〇〇%)。在一實施例中，生長抑制可在細胞培養物中約〇丨至⑽pg/mi或約〇·5 碰至200 ηΜ之Wnt拮抗劑濃度下量測，其中在腫瘤細胞曝露於Wnt拮抗劑後mo天測定生長抑制。活體内腫瘤細胞之生長抑制可以下文實驗性實例部分中所述之多種方式測定。若以約1微克/公斤體重至約1〇〇毫克/公斤體重投與 < Wnt拮抗劑使得腫瘤尺寸或細胞增殖在首次投與抗體後約$ 天至3個月内、較佳約5至3 0天内減少，則Wnt拮抗劑具有活體内生長抑制性。在一特定態樣中，腫瘤尺寸相對於其療法開始時之尺寸減小。術語"細胞增殖性病症，，及”增殖性病症"係指與某種程度之異常細胞增殖相關的病症。在一實施例中，細胞增殖性病症為癌症。如本文中所使用之”腫瘤"係指所有贅生性細胞生長及增痩（無响惡性或良性）’及所有癌變前及癌變細胞及組織。 124434.doc -43- 200819463 π誘導細胞死亡”之Wnt拮抗劑分子為促使活細胞變得無法存活的分子。與相同組織類型之正常細胞相比，該細胞為具有異常Wnt信號轉導活性的細胞。較佳地，該細胞為如本文中定義之癌細胞。活體外細胞死亡可在補體及免疫效應細胞不存在之情況下判定，以區別由抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC)或補體依賴性細胞毒性（CDC)所誘導之細胞死亡。因此，細胞死亡檢定可使用熱滅活血清 (亦即補體不存在）且在免疫效應細胞不存在之情況下執行。為判定Wnt拮抗劑是否能夠誘導細胞死亡，可相對於未經處理之細胞如由碘化丙啶（PI)、錐蟲藍（trypan blue)(參見 Moore 等人，Cytotechnology 17:1-11 (1995))或 7AAD之攝入所評估，評估細胞膜完整性之損失。較佳的誘導細胞死亡之抗體、寡肽或其他有機分子為？1攝入檢定中誘導PI被攝入BT474細胞内的彼等物質。詞語π標記’’當用於本文中時係指與抗體、募肽或其他有機分子直接或間接接合以便生成，，經標記之”抗體、寡肽或其他有機为子的可偵測之化合物或組合物。標記本身為可偵測的（例如，放射性同位素標記或螢光標記），或在酶標記之情況下，可催化可偵測之受質化合物或組合物之化學變化。如本文中所使用之術語”細胞毒性劑”係指抑制或阻礙細胞功能且/或導致細胞破壞的物質。意欲該術語包括放射性同位素（例如，At211、I131、I125、Υ90、Re186、Rei88

Sm > Βι 、P及1^之放射性同位素）；化學治療劑；酶 124434.doc -44· 200819463 及其片段，諸如核酸分解酶；抗生素；及毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或變體；以及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細胞毒性劑在下文中描述。殺腫瘤劑可導致腫瘤細胞破壞。 π化學治療劑’’為適用於治療癌症的化合物。化學治療劑之實例包括：烧化劑，諸如硫替派（thiotepa)及CYTOXAN® 環填醯胺；烧基橫酸酯，諸如白消安（busulfan)、英丙舒凡（improsulfan)及旅泊舒凡（piposulfan);氮丙唆，諸如苯口坐多巴（benzodopa)、卡巴酉昆（carboquone)、米特多巴 (meturedopa)及尤利多巴（uredopa);伸乙基亞胺及甲基密胺，包括六曱蜜胺（altretamine)、三伸乙基密胺（triethylenemelamine)、三伸乙基構醯胺（trietylenephosphoramide)、三伸乙基硫代填醯胺（triethiylenethiophosphoramide)及三甲密胺 (trimethylolomelamine);多聚乙醯類（acetogenins)(尤其布拉他辛（bullatacin)及布拉他辛 _ (bullatacinone)) ; A-9-四氫大麻盼（delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈大麻盼 (dronabinol，MARINOL®)) ; β_拉帕酮（beta-lapachone); 拉帕醇（lapachol)；秋水仙驗（colchicine)；樺木酸 (betulinic acid);喜樹驗（camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康（topotecan)(HYCAMTIN®)、CPT-11 (伊諾替康（irinotecan)， CAMPTOSAR®)、乙醯基喜樹驗（acetylcamptothecin)、斯考普萊叮（scopolectin)及9-胺基喜樹驗）；苔蘚蟲素（bryostatin); 卡利斯塔叮（callystatin) ; CC-1065(包括其阿多來新 124434.doc -45- 200819463 (adozelesin)、卡折來新（carzelesin)及卡折來新合成類似物）；足葉草毒素（podophyllotoxin);足葉草酸（podophyllinic acid);替尼泊戒（teniposide);念珠藻環肽（cryptophycin)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8);海兔毒素（dolastatin);多卡米辛（duocarmycin)(包括合成類似物，KW-2189及CB1-TM1);艾權素（eleutherobin);盤克斯塔叮（pancratistatin); 沙考的 >、丁（sarcodictyin);海綿素（spongistatin);氮芥 (nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥（chlorambucil)、萘氮芥（chlornaphazine)、環填醯胺、雌氮芥（estramustine)、異環鱗醯胺、二氣甲基二乙胺（mechlorethamine)、鹽酸二氯甲基二乙胺氧化物（mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖（melphalan)、新氮芥（novembichin)、膽固醇苯乙酸氮芥（phenesterine)、松龍苯芥（prednimustine)、氯乙環填醢胺（trofosfamide)、尿,σ定氮芥（uracil mustard);硝基脲，諸如亞石肖脲氮芥（carmustine)、氣脲黴素 (chlorozotocin)、福莫司汀（fotemustine)、環己亞硝脲 (lomustine)、鳴口定亞硝脲（nimustine)及拉甯司汀 (ranimnustine);抗生素，諸如烯二炔抗生素（例如，卡奇黴素（calicheamicin)，尤其卡奇黴素γΐΐ及卡奇黴素coil(參見，例如，Agnew，Chem Inti. Ed. Engl·，33: 183-186 (1994));達内黴素（dynemicin)，包括達内黴素A;埃斯培拉黴素（esperamicin);以及新製癌菌素（neocarzinostatin) 發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團）、阿克拉希黴素（aclacinomysin)、放線菌素（actinomycin)、奥拉黴素 124434.doc -46- 200819463 (authramycin)、重氮絲胺酸（azaserine)、博萊黴素（bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛（carabicin)、洋紅黴素 (carminomycin)、嗜癌黴素（carzinophilin)、色黴素 (chromomycinis)、放線菌素 D (dactinomycin)、道諾黴素 (daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN®羥道諾紅黴素（包括嗎啉基-經道諾紅黴素（morpholino-doxorubicin)、氰基嗎琳基-經道諾紅黴素（cyanomorpholino-doxorubicin)、2·σ比口各琳基-經道諾紅黴素（2-pyrrolino-doxorubicin)及去氧經道語紅黴素（deoxydoxorubicin))、表柔比星（epirubicin)、依索比星（esorubicin)、伊達比星（idarubicin)、麻西羅黴素 (marcellomycin)、絲裂黴素（mitomycins)(諸如絲裂黴素 C)、黴盼酸（mycophenolic acid)、諾加黴素（nogalamycin)、橄欖黴素（olivomycins)、培洛黴素（peplomycin)、潑非黴素 (potfiromycin)、嗓吟黴素（puromycin)、奎那黴素 (quelamycin)、羅多比星（rodorubicin)、鏈黑菌素 (streptonigrin)、鏈脲黴素（streptozocin)、殺結核菌素 (tubercidin)、烏苯美司（ubenimex)、淨司他丁（zinostatin)、佐柔比星（zorubicin);抗代謝物，諸如甲胺蝶呤及5 -氟尿喊咬（5-fluorouracil)(5-FU);葉酸類似物，諸如傣諾特呤 (denopterin)、甲胺蝶呤（methotrexate)、蝶羅呤（pteropterin)、三甲曲沙（trimetrexate) ; σ票呤類似物，諸如氟達拉濱 (fludarabine)、6-魏基 17票呤（6-mercaptopurine)、11 塞哺嗓呤 (thiamiprine)、硫鳥嗓呤（thioguanine);喊唆類似物，諸如 124434.doc -47- 200819463 環胞脊（ancitabine)、阿紮胞普（azacitidine)、氮尿普（6-azauridine)、卡莫 IL(carmofur)、阿糖胞普（cytarabine)、雙脫氧尿苦（dideoxyuridine)、去氧氧展苦（doxifluridine)、依諾他濱（enocitabine)、敗尿核苷（floxuridine);雄性激素，諸如二甲睾酮（calusterone)、丙酸屈他雄酮（dromostanolone propionate)、環硫雄醇（epitiostanol)、美雄烧（mepitiostane)、睾内酯（testolactone);抗腎上腺藥，諸如胺基苯乙哌啶酮 (aminoglutethimide)、米托坦（mitotane)、曲洛司坦（trilostane); 葉酸補充劑，諸如夫羅林酸（frolinic acid);醋葡内酯 (aceglatone)；酸磷醯胺葡糖甙（aldophosphamide glycoside);胺基乙醯丙酸（aminolevulinic acid);伊利盧拉（eniluracil);胺苯 ϋ丫咬（amsacrine);倍思塔布（bestrabucil); 比生群（bisantrene);艾達曲克（edatraxate);得弗伐胺 (defofamine);秋水仙胺（demecolcine);地°丫酉昆（diaziquone); 艾弗利散（elfornithine);依利醋銨（elliptinium acetate);埃坡黴素（epothilone);乙環氧咬（etoglucid);硝酸鎵（gallium nitrate);經基脲（hydroxyurea);香益糖（lentinan);羅尼達寧（lonidainine);類美登素（maytansinoids)，諸如美登素 (maytansine)及胺沙托辛（ansamitocins);丙脉腙（mitoguazone);米托蒽酿（mitoxantrone);莫比達摩（mopidanmol);石肖拉維林 (nitraerine);喷司他丁（pentostatin);凡那明（phenamet); 比柔比星（pirarubicin);洛索蒽 S昆（losoxantrone) ; 2-乙基醯肼（2-ethylhydrazide);普魯苄肼（procarbazine) ; PSK® 多醣複合物（JHS Natural Products，Eugene，OR);丙亞胺 124434.doc 48- 200819463 (razoxane);根黴菌素（rhizoxin);西佐糖（sizofiran);螺鍺 (spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid);三亞胺醌（triaziquone) ; 2,2’，2Π-三氣三乙基胺；單端孢黴烯族毒素（trichothecenes)(尤其Τ-2毒素、弗納庫林A (verracurin A)、桿孢菌素 A (roridin A)及胺癸叮 (anguidine));烏拉坦（urethan); 去乙醯長春醯胺 (vindesine)(ELDISINE® ，FILDESIN®);氮烯唑胺 (dacarbazine);甘露醇氮芥（mannomustine);二漠、甘露醇 (mitobronitol);二漠衛矛醇（mitolactol);雙漠丙基旅σ秦 (pipobroman)；曱托辛（gacytosine);阿糖胞苦（arabinoside) ("Ara-C”）；硫替派（thiotepa);紫杉醇（taxoids)，例如 TAXOL® 太平洋紫杉醇（Bristol-Myers Squibb Oncology， Princeton，N_J·) ; ABRAXANETM Cremophor-free太平洋紫杉醇之經白蛋白工程化設計之奈米微粒調配物（American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)及TAXOTERE® 多西他賽（doxetaxel)(Rh0ne-Poulenc Rorer，Antony，France); 克羅南布（chloranbucil);吉西他濱（gemcitabine)(GEMZAR®); 6_硫鳥 ϋ票呤（6-thioguanine);疏基 σ票呤（mercaptopurine); 曱胺蝶吟；始類似物，諸如順翻（cisplatin)及卡翻 (carboplatin);長春花驗（vinblastine)(VELBAN®);翻；依託泊苦（VP-1 6);異環麟醢胺；米托蒽酿（mitoxantrone); 長春新驗（vincristine)(ONCOVIN®);奥沙利 #白（oxaliplatin); 盧考弗文（leucovovin);長春瑞賓（vinorelbine) (NAVELBINE⑨）；諾凡特龍（novantrone);依達曲沙（edatrexate);道諾黴 124434.doc -49- 200819463 素；胺基蝶吟；伊班膦酸鹽（ibandronate);拓撲異構酶抑制劑 RFS 2000 ;二氣i 甲基鳥胺酸（difluorometlhylornithine) (DMFO);類視色素，諸如視黃酸（retinoic acid);卡培他濱（capecitabine)(XELODA®);以上任一種治療劑之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及以上兩種或兩種以上治療劑之組合，諸如CHOP(環磷醯胺、羥道諾紅黴素、長春新驗與潑尼松龍（prednisolone)之組合療法之縮寫）及 FOLFOX(奥沙利鉑（oxaliplatin)(ELOXATINTM)與 5-FU及盧考弗文組合治療方案之縮寫）。此定義亦包括用於調控、減弱、阻斷或抑制可促進癌症生長之激素之效應的抗激素劑，且通常呈系統性或全身性治療之形式。其可為激素本身。實例包括抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑（SERM)，例如包括它莫西芬 (tamoxifen)(包括 NOLVADEX® 它莫西芬）、EVISTA⑧雷洛西芬（raloxifene)、屈洛昔芬（droloxifene)、4-經基它莫西芬（4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬（trioxifene)、雷洛昔芬鹽酸鹽（keoxifene)、LY117018、歐納氏酮（onapristone)及 FARESTON®托瑞米芬（toremifene);抗黃體酮；雌激素受體減量調節劑（ERD);具有抑制或阻止卵巢之功能的藥劑，例如黃體素釋放激素（LHRH)促效劑，諸如LUPRON® 及ELIGARD®乙酸亮丙瑞林（leuprolide acetate)、乙酸戈舍瑞林（goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林（buserelin acetate) 及曲特瑞林（tripterelin);其他抗雄激素，諸如氟他胺 (flutamide)、尼魯米特（nilutamide)及必卡他胺（bicalutamide); 124434.doc -50- 200819463 以及抑制芳香酶的芳香酶抑制劑（芳香酶調節腎上腺中雌激素之產生），諸如4(5)-咪唑、胺基苯乙哌啶酮 (aminoglutethimide)、MEGASE® 乙酸甲地孕酉同（megestrol acetate)、AROMASIN® 依西美坦（exemestane)、弗米斯坦 (formestanie)、法倔嗤（fadrozole)、RIVISOR® 伏氯嗤 (vorozole)、FEMARA® 來曲峻（letrozole)及 ARIMIDEX® 瑞寧德（anastrozole)。此外，該化學治療劑定義包括：雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽（clodronate)(例如，BONEFOS⑧或 OSTAC®)、DIDROCAL® 依替膦酸鹽（etidronate)、NE-58095、ZOMETA®峻來膦酸/峻來膦酸鹽（zoledronic acid/zoledronate)、FOSAMAX® 阿侖膦酸鹽（alendronate)、 AREDIA⑧帕米膦酸鹽（pamidronate)、SKELID®替魯膦酸鹽（tiludronate)或 ACTONEL® 利塞膦酸鹽（risedronate);以及曲沙他濱（troxacitabine)(l，3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物）；反義寡核苷酸，尤其抑制牽涉於異常細胞增殖之信號轉導途徑中之基因表現的彼等反義寡核苷酸，該等基因諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體（EGF-R); 疫苗’諸如THERATOPE®疫苗及基因療法疫苗，例如 ALLOVECTIN® 疫苗、LEUVECTIN® 疫苗及 VAXID® 疫苗；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH ;對甲苯石黃酸拉帕替尼（lapatinib ditosylate)(ErbB-2 與EGFR二元酪胺酸激酶小分子抑制劑，亦稱為 GW572016);及以上任何治療劑之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。 124434.doc -51 - 200819463 ”生長抑制劑”當用於本文t時係指在活體外或在活體内抑制細胞（尤其具有Wnt信號轉導活性之癌細胞）之生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可為使處於s期之該等細胞之百分率顯著降低的藥劑。生長抑制劑之實例包括 (在S期外之處）阻斷細胞週期進行的藥劑，諸如誘導⑴停滯及Μ期停滞的藥劑。典型的“期阻斷劑包括長春花（長春新鹼及長春花鹼）、紫杉烷及拓撲異構酶II抑制劑，諸如羥道諾紅黴素、表阿黴素（epirubicin)、道諾黴素、依託泊芽及博萊黴素。阻滯G1的彼等藥劑亦阻滯8期，例如DNA烷化劑，諸如它莫西芬、潑尼松、達卡巴嗪、二氯甲基二乙胺、順鉑、甲胺蝶呤、5_氟尿嘧啶及ara—C。其他資訊可見 ^The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn A Israel^ ^ 第 1 章，標題為"Celi cycle regulati〇n，〇nc〇genes，and antineoplastic drugs"，Murakami 等人（WB Saunders:

Philadelphia，1995)，尤其第13頁。紫杉烷（太平洋紫杉醇及多西他赛（docetaxel))均為來源於紫杉樹的抗癌藥物。來源於^ ’州兔杉（European yew)的多西他賽（TAXOTERE®，

Khone P〇ulene R〇rer)為太平洋紫杉醇之半合成類似物 (TAXOL®，Bristol-Myers Squibb)。太平洋紫杉醇及多西他^促進祕S蛋白二聚體組裝成微管且藉由防止解聚來穩定微管，從而抑制細胞中之有絲分裂。 ’’搜道諾紅黴素”為蒽環黴素抗生素。羥道諾紅黴素之化為（8S順）_1〇-[(3-胺基·2,3,6-三去氧-α-L-來蘇·六口比南糖基）氧基]_7,8,9，1〇_四氫_6,8，11-三經基-8-(經基乙醯 124434.doc -52· 200819463 基）-1-甲氧基-5,12-并四苯二酮。術語，，包裝插頁"用於指通常包括於治療性產品之商業包裝内的指示，其含有有關適應症、用法、劑量、投藥、禁忌症及/或涉及該等治療性產品使用之注意事項的資訊。 II. 特定實施例之描述本文中所述之Wnt拮抗劑能夠在活體外與Wnt配體結合且能夠抑制或壓製Wnt激發之細胞信號轉導。此外，Wnt 拮抗劑具有長的活體内半衰期且在活體内展現抗腫瘤活性，從而在小鼠MMTV乳房腫瘤模型中抑制誘發之腫瘤之生長。Wnt拮抗劑亦能夠抑制來源於人類畸胎瘤細胞株之腫瘤異種移植物在小鼠中之生長。㈣經編括抗劑治療之小鼠之再生組織似乎符合生理學標準。伽抬抗劑亦能夠在活體外抑制人類腫瘤細胞株中之自分泌冒价信號轉導。 θ

Frizzled受體蛋白質可基於全長序列一致性與細胞外域序列一致性歸入若干家族。此分類以圖8及圖9中所示之比對說月此圖中加下劃線之殘基在所有Frz受體中保守且加陰影殘基在所有同源群組中保守。17]^蛋白可歸入如下家族·· 1)全長序列共有68_77%之同源性且ECD共有9〇%之同源性的Frzl、Frz2及Frz7 ; 2)全長序列共有57%之同源性且ECD共有80%之同源性的Frz5及Frz8 ; 3)全長序列共有 61 /。之同源性且ECD共有74%之同源性的Frz9及FrzlO ; 4) 王長序列共有49%之同源性且ECD共有5〇%之同源性的 rz3及Frz6,及5) Frz4(其與przl〇展現全長序列46%之共 124434.doc •53- 200819463 有同源性及ECD 48%之共有同源性）。Frzl、Frz2及Frz7之家族亦與果蠅Frzl明顯同源且Frz5及Frz8之家族與果蠅 Frz2明顯同源，其經證明分別為導致平面細胞極化及Wnt 信號轉導的原因。

Wnt配體-Frizzled結合行為似乎集聚於Frizzled家族内。 Wnt3a與Wnt5a均以最快速度結合Frz5、Frz8及Frz4(相對於其他Frz蛋白質），而Wnt3a以較慢速率結合Frzl、Frz2及 Frz7。Wnt5a結合行為之幅度及線性性質說明結合親和力比Wnt3a結合親和力低，如由OCTET™結合檢定所測定。高親和力受體與低親和力受體之存在可賦予靈敏且長期的信號轉導之能力。

Wnt拮抗劑抑制Wnt配體誘導之信號轉導的能力似乎亦集聚於Frizzled家族内。在基於細胞之檢定中，Frz5與Frz8 皆展示Wnt3a信號受到完全抑制且Wnt5a信號受到明顯抑制（實例7)。Frz4、Frz2及Frz7展示Wnt3a信號受到明顯抑制。此發現與對果蠅之觀測結果1’dFrz2(與Frz 5及Frz 8同源）強烈活化Wnt途徑而dFrzl (與Frz 1、Frz2及Frz7同源）微弱活化Wnt途徑”一致。儘管不受特定作用理論束缚，但本文中所呈示之資料表明使用Wnt拮抗劑所產生之基於細胞之Wnt信號轉導抑制資料與藉由量測Wnt配體與Wnt拮抗劑之直接結合所獲得之資料相關，表明Wnt拮抗劑直接與Wnt配體結合，從而阻斷其結合細胞上之全長Frizzled受體。本文中所呈示之資料進一步驗證可使用活體外活性預測活體内Wnt拮抗劑 124434.doc -54- 200819463 之Wnt信號轉導阻斷活性。如實例中所述對Fz8-Fc之研究所表明，包含Frizzled域與免疫球蛋白FC域兩者之Wnt拮抗劑與單獨之Frizzled域相比，意外展現對於Wnt配體之較高結合親和力。舉例而言，圖14展示當將Fz ECD域轉變為Fz (156)-Fc構築體時，結合親和力增加兩個數量級。發現Fz (156)-Fc構築體為穩定且高度有效的Wnt信號轉導抑制劑（其中與Fc接合使得結合親和力增加兩個數量級）係非常令人意外且並不為明顯可知者。 A·本發明之組合物及方法 1.多肽本發明係關於用於治療Wnt-中介性病症（包括癌症）及抑制細胞Wnt信號轉導的組合物及方法。本發明之一態樣提供Wnt括抗劑’其為包含Frizzie(j (Frz)域組分及免疫球蛋白Fc域的喪合分子。在此態樣之特定實施例中，該Frz域組分與該Fc域係經由連接子融合。另一態樣提供該等Wnt 拮抗劑用於抑制細胞Wnt信號轉導及治療Wnt-中介性病症 (諸如癌症）的用途。在一態樣中’本發明提供Wnt拮抗劑，其為具有Frz域組分之欲合分子，該Frz域組分包含細胞外域”CRD (ECD)，，之最小半胱胺酸富集域（CRD)。CRD (ECD)為具有1〇〇至250 個胺基酸之保守型結構基元且係由1〇個高度保守性半胱胺酸界定。此蛋白質域以兩類Wnt信號轉導家族出現：稱為 Frizzled的整合型膜Wnt受體蛋白質以及稱為Frizzied相關 124434.doc -55- 200819463 蛋白（sFrp)的分泌型細胞外蛋白質。在一態樣中，本發明提供Wnt拮抗劑，其為具有Frz域組分之後合分子，該Frz域組分包含Frizzled蛋白（諸如Frzl、 Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、Frz6、Frz7、Frz8、Frz9 或 FrzlO)之CRD (ECD)。該等CRD (ECD)之實例提供於圖3B 中。在特定實施例中，該Frz域組分選自由以下多肽之 CRD (ECD)組成之群：hFrzl (SEQ ID NO: 18)，hFrz2 (SEQ ID NO: 19), hFrz3 (SEQ ID NO: 20), hFrz4 (SEQ ID NO: 21)，hFrz5 (SEQ ID NO: 22)，hFrz6 (SEQ ID NO: 23)，hFr*z7 (SEQ ID NO: 24)，hFrz8 (SEQ ID NO: 25)，hFrz9 (SEQ ID NO: 26)及 hFrzl 0 (SEQ ID NO: 27)及其活性變體。或者，該Frz域組分包含例如來自分泌型Frizzled相關蛋白（sFRP)(諸如 sFRPl、sFRP2、sFRP3、SFRP4 或 SFRP5)之 CRD (ECD)。該等CRD (ECD)之實例提供於圖3B中。在特定實施例中，該Frz域組分選自由以下多肽之CRD (ECD)組成之群：sFRPl (SEQ ID NO: 28)，sFRP2 (SEQ ID NO: 29)， sFRP3 (SEQ ID NO: 30)，sFRP4 (SEQ ID NO: 31)，sFRP5 (SEQ ID NO: 32)及其活性變體。或者，該Frz域組分包含例如受體酪胺酸激酶Rorl及 Ror2之CRD (ECD)。該等CRD (ECD)之實例提供於圖3B 中。在特定實施例中，該Frz域組分選自由hRorl (SEQ ID NO: 33)及hRor2 (SEQ ID NO: 34)及其活性變體之CRD (ECD)組成之群。在另一態樣中，Frz域組分為原-Frz或原-sFrp序列，其 124434.doc -56- 200819463 實例展示於圖3A中。在特定實施例中，Frz域組分選自由以下多肽組成之群：hFrzl (SEQ ID NO: 35)，hFrz2 (SEQ ID NO: 36)，hFrz3 (SEQ ID NO: 37)，hFrz4 (SEQ ID NO: 38), hFrz5 (SEQ ID NO: 39)，hFrz6 (SEQ ID NO: 40)，hFrz7 (SEQ ID NO: 41)，hFrz8 (SEQ ID NO: 42)，hFrz9 (SEQ ID NO: 43)，hFrzlO (SEQ ID NO: 44)，sFRPl (SEQ ID NO: 45)，sFRP2 (SEQ ID NO: 46)，sFRP3 (SEQ ID NO: 47)， sFRP4 (SEQ ID NO: 48)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 49)及其活性變體。在又一態樣中，Frz域組分來源於成熟Frz、sFRP或hRor 序列，其實例展示於圖3B中。在特定實施例中，Frz域組分選自由以下多肽組成之群：hFrzl (SEQ ID NO: 50)， hFrz2 (SEQ ID NO: 51)，hFrz3 (SEQ ID NO: 52)，hFrz4 (SEQ ID NO: 53)，hFrz5 (SEQ ID NO: 54)，hFrz6 (SEQ ID NO: 55), hFrz7 (SEQ ID NO: 56), hFrz8 (SEQ ID NO: 57), hFrz9 (SEQ ID NO: 58)，hFrzlO (SEQ ID NO: 59)，sFRPl (SEQ ID NO: 60)，sFRP2 (SEQ ID NO: 61)，sFRP3 (SEQ ID NO: 62)，sFRP4 (SEQ ID NO: 63)，sFRP5 (SEQ ID NO: 64)， hRorl (SEQ ID NO: 65)及hRor2 (SEQ ID NO: 66)及其活性變體。

在特定實施例中，嵌合型Wnt拮抗劑分子中之Frz域組分及免疫球蛋白Fc域經由連接子融合。在一實施例中，連接子為肽連接子。在另一實施例中，連接子選自由以下肽組成之群·· ESGGGGVT (SEQ ID NO: 69)，LESGGGGVT 124434.doc -57- 200819463 (SEQ ID NO: 70), GRAQVT (SEQ ID NO: 71), WRAQVT (SEQ ID NO: 72)及 ARGRAqVT (SEQ m N〇: 73)。視情況，除為活性所需之最少殘基外’該等連接子序列亦可包括來自Frz域組分或Fc域的其他胺基酸殘基。該等連接子亦可包含與來自Frz域組分或Fc域組分之胺基酸殘基不同的其他胺基酸殘基。在一實施例中，Wnt拮抗劑為包含prz8 crd (ECD)及Fc 域的FrZ8-Fc嵌合體。在一些實施例中，化以-^嵌合體進一步包含連接子，諸如肽連接子。在另一實施例中，Frz8_ Fc進一步包含前導序列。在一特定實施例中，Frz域組分包含Frz8蛋白之胺基酸1-156 (SEQ ID NO: 8)。在另一實施例中，Fc組分為人類Fc。在另一實施例中，Fc組分為人類 IgG Fc。在又一實施例中，Frz8_Fc具有Frz域組分，該Frz 域組分包含經由連接子與人類IgG Fc融合之Frz8蛋白之胺基酸1-156。在另一實施例中，Frz8-Fc為具有如圖4B中所示之胺基酸序列的喪合體（SEQ ID NO: 74)。除非另有說明’否則’如實例及附圖中所使用，”Frz8_Fc”係指圖4B中所示之嵌合體（SEQ ID NO: 74)。在另一實施例中，Wnt拮抗劑為包含Frz5 CRD (ECD)及 Fc域的Frz5-Fc嵌合體。在一些實施例中，Frz5-Fc喪合體進一步包含連接子，諸如肽連接子。在另一實施例中， Frz5-Fc進一步包含前導序列。在一特定實施例中，？1^域組分包含Frz5蛋白之胺基酸27-155 (SEQ ID NO: 5)。在另一實施例中，Fc組分為人類Fc。在另一實施例中，Fc組分 124434.doc -58- 200819463 為人類IgG Fc。在又一實施例中，Frz5-Fc具有前導序列及 Frz域組分，該Frz域組分包含經由連接子與人類IgG以融合之成熟Frz5蛋白之胺基酸27-155。在另一實施例中， Frz5-Fc為具有如圖7A中所示之胺基酸序列的嵌合體（SEq ID NO: 75)。除非另有說明’否則’如實例及附圖中所使用，”Frz5-Fc”係指圖7A中所示之嵌合體（SEq id NO: 75)。類似地，其他實施例包括包含Frz域組分及Fc組分的

Frzl-Fc、Frz2-Fc、Frz3-Fc、Frz4-Fc、Frz6-Fc、Frz7-Fc、Frz9_Fc、Frz_10_Fc、sFRPl_Fc、sFRP2_Fc、sFRP3-Fc、sFRP4-Fc及sFRP5-Fc嵌合體，該Frz域組分包含來自各別Frz或sFRP蛋白之Frz CRD (ECD)。在一些實施例中， Frz-Fc嵌合體進一步包含連接子，諸如肽連接子。在其他實施例中，該等嵌合體包含前導序列。在一些實施例中， Fc組分為人類Fc。在其他實施例中，Fc組分為人類IgG Fc。在其他實施例中，該等嵌合體具有前導序列及經由連接子與人類IgG Fc融合的Frz CRD (ECD)。在其他實施例中，該等嵌合體具有如圖7A、7B及7C中所示之胺基酸序列（SEQ ID NOs: 76-8 8)。除非另有說明，否則如實例及附圖中所使用，f’Frzl-Fc、Frz2-Fc、Frz3-Fc、Frz4-Fc、 Frz6，Fc、Frz7-Fc、Frz9-Fc、Frz-10-Fc、sFRPl-Fc、 sFRP2_Fc及sFRP4-Fc”係指圖7A、7B及7C中所示之各別嵌合體（SEQ ID NOs: 76-85 及 87)。

Wnt拮抗劑具有活體内穩定性。先前使用與以組分連接 124434.doc •59- 200819463 之Fnzzled域之構築體因在活體内快速降解而使得其不適宜用作治療性化合物（Hsieh，j_c·等人，%: Μα. 3551 (1999))。本文中所述之Wnt拮抗劑因實質上長於先前構築體而在活體内保持穩定性。如實例4(圖13)中所示， Frz8-Fc Wnt拮抗劑在活體内呈現約4天之半衰期。因此，本發明提供投與哺乳動物後具有至少丨天、2天、3天或4天之活體内半衰期的Wnt拮抗劑。此外，如實例3(圖11)中所示，Wnt拮抗劑因實質上長於先前構築體而保持活性。在一實施例中，Wnt拮抗劑投與哺乳動物後具有至少3 〇分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、8小時、1〇小時、12小時、14小時、 16小時、18小時、20小時、22小時、24小時、30小時、36 小時、40小時、44小時、48小時、52小時、56小時、60小時、64小時、68小時、72小時、80小時、90小時或100小時的活性。例如如實例3及11中所述，藉由測試投與Wnt拮抗劑之哺乳動物之血清抑制Wnt信號轉導之能力，或藉由使用此項技術中已知之其他方法來量測活性。 2.核酸本發明之一態樣提供編碼本文中所述之Wnt拮抗劑的核酸。在特定實施例中，該核酸編碼包含以下多肽之CRD (ECD)的 Wnt拮抗劑：hFrzl (SEQ ID NO: 18)，hFrz2 (SEQ ID NO: 19)，hFrz3 (SEQ ID NO·· 20)，hFrz4 (SEQ ID NO: 21), hFrz5 (SEQ ID NO: 22), hFrz6 (SEQ ID NO: 23)? hFrz7

(SEQ ID NO: 24)，hFrz8 (SEQ ID NO: 25)，hFrz9 (SEQ ID 124434.doc -60- 200819463 NO: 26)5 hFrzlO (SEQ ID NO: 27)5 sFRPl (SEQ ID NO: 28)，sFRP2 (SEQ ID NO: 29)，sFRP3 (SEQ ID NO: 30)， sFRP4 (SEQ ID NO: 31)，sFRP5 (SEQ ID NO: 32)，hRorl (SEQ ID NO: 33)或 hRor2 (SEQ ID NO: 34)。在其他實施例中，該核酸編碼包含原-Frz或原-sFrp蛋白的Wnt拮抗劑，該等原-Frz或原-sFrp蛋白係選自：hFrzl (SEQ ID NO: 35)，hFrz2 (SEQ ID NO: 36)，hFrz3 (SEQ ID NO: 37)，hFrz4 (SEQ ID NO: 38)，hFrz5 (SEQ ID NO: 39)， hFrz6 (SEQ ID NO: 40)，hFfz7 (SEQ ID NO: 41)，hFrz8 (SEQ ID NO: 42)，hFrz9 (SEQ ID NO: 43)，hFrzlO (SEQ ID NO: 44)，sFRPl (SEQ ID NO: 45)，sFRP2 (SEQ ID NO: 46)， sFRP3 (SEQ ID NO: 47)，sFRP4 (SEQ ID NO: 48)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 49)。在其他實施例中，該核酸編碼包含成熟Frz、sFRP或 hRor蛋白的Wnt拮抗劑，該等成熟Frz、sFRP或hRor蛋白係選自：hFrzl (SEQ ID NO: 50)，hFrz2 (SEQ ID NO: 51)， hFrz3 (SEQ ID NO: 52), hFrz4 (SEQ ID NO: 53)5 hFrz5 (SEQ ID NO: 54)，hFrz6 (SEQ ID NO: 55)，hFrz7 (SEQ ID NO: 56), hFrz8 (SEQ ID NO: 57), hFrz9 (SEQ ID NO: 58), hFrzlO (SEQ ID NO: 59)，sFRPl (SEQ ID NO: 60)，sFRP2 (SEQ ID NO: 61)，sFRP3 (SEQ ID NO: 62)，sFRP4 (SEQ ID NO: 63)? sFRP5 (SEQ ID NO: 64), hRorl (SEQ ID NO: 65) 及 hRor2 (SEQ ID NO: 66)。在其他實施例中，該核酸編碼包含以下多肽之Wnt拮抗 124434.doc -61 - 200819463 劑：Frz8-Fc (SEQ ID NO: 74)，Frz5-Fc (SEQ ID NO: 75)， Frzl-Fc (SEQ ID NO: 76)5 Frz2-Fc (SEQ ID NO: 77), Frz3-Fc (SEQ ID NO: 78)，Frz4-Fc (SEQ ID NO: 79)，Frz6-Fc (SEQ ID NO: 80)，Frz7-Fc (SEQ ID NO: 81)，Frz9-Fc (SEQ ID NO: 82)，FrzlO-Fc (SEQ ID NO: 83)，sFRPl-Fc (SEQ ID NO: 84)，sFRP2 (SEQ ID NO: 85)，sFRP3-Fc (SEQ ID NO: 86)，sFRP4-Fc (SEQ ID NO: 87)及 sFRP5-Fc (SEQ ID NO: 88) 〇在一特定實施例中，該核酸編碼Frz8-Fc且包含SEQ ID NO: 122所示之核酸序列（圖5D)。在另一實施例中，該核酸編碼Frz5-Fc且包含SEQ ID NO: 119所示之核酸序列（圖 5C)。在又一實施例中，該核酸編碼Frzl-Fc、Frz2-Fc、 Frz3_Fc、Frz4-Fc、Frz6-Fc、Frz7-Fc、Frz9-Fc、FrzlO-Fc、sFRPl-Fc、sFRP2、sFRP3-Fc、sFRP4-Fc 或 sFRP5-Fc 且包含圖5(A-H)中所示之核酸序列。舉例而言，該核酸包含 Frzl-Fc (SEQ ID NO: 115)，Frz2-Fc (SEQ ID NO: 116)， Frz3-Fc (SEQ ID NO: 117), Frz4-Fc (SEQ ID NO: 118),

Frz5-Fc (SEQ ID NO: 119)，Frz6-Fc (SEQ ID NO: 120)，

Frz7-Fc (SEQ ID NO: 121)，Frz8-Fc (SEQ ID NO· 122)，

Frz9-Fc (SEQ ID NO: 123)，FrzlO-Fc (SEQ ID NO: 124)， sFRPl-Fc (SEQ ID NO: 125)，sFRP2-Fc (SEQ ID NO: 126)， sFRP3-Fc (SEQ ID NO: 127)，sFRP4-Fc (SEQ ID NO: 128) 或 sFRP5-Fc (SEQ ID NO: 129)。本發明之另一態樣提供在高嚴格度條件下與上述核酸雜 124434.doc -62- 200819463 交的核酸。 3. Wilt拮抗劑變體除本文中所述之Wnt拮抗劑多肽外，亦涵蓋可製備之 Wnt拮抗劑變體。該等變體可藉由將適當核苷酸改變引入編碼DNA及/或藉由合成所要變體來製備。熟習此項技術者應瞭解胺基酸改變可改變Wnt拮抗劑之轉譯後加工，諸如改變糖基化位點之數目或位置或改變膜錨定特徵。

Wnt拮抗劑變體包括例如在一或多個域中胺基酸殘基之突變或胺基酸變體，同時仍保持生物活性。Wnt拮抗劑變體亦包括缺失或增添至少一個胺基酸、但仍保持生物活性的Wnt拮抗劑。胺基酸殘基之增添或缺失尤其可發生於Frz 域組分與Fc域連接之胺基酸序列周圍之區域中，無論該區域是否含有連接子。Wnt拮抗劑變體與參考Wnt拮抗劑多肽序列具有至少 70%、75%、80%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%的胺基酸序列一致性。一般而言，該等變體展現與Wnt蛋白的結合親和力與參考序列相比實質上相同或更大，例如大至少〇·75倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、 1.25倍或1.5倍（基於業内公認之結合檢定定量單位/量度）。

在特定實施例中，Wnt拮抗劑變體為包含Frz域組分的嵌合分子，該Frz域組分與如下多肽之CRD (ECD)具有至少 70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92% ' 93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的胺基酸序列一致性：hFrzl (SEQ ID NO: 18)，hFrz2 (SEQ 124434.doc -63- 200819463 ID NO: 19)，hFrz3 (SEQ ID NO: 20)，hFrz4 (SEQ ID NO: 21)3 hFrz5 (SEQ ID NO: 22), hFrz6 (SEQ ID NO: 23)5 hFrz7 (SEQ ID NO: 24)? hFrz8 (SEQ ID NO: 25), hFrz9 (SEQ ID NO: 26)，hFrzlO (SEQ ID NO: 27)，sFRPl (SEQ ID NO: 28), sFRP2 (SEQ ID NO: 29), sFRP3 (SEQ ID NO: 30), sFRP4 (SEQ ID NO: 31), sFRP5 (SEQ ID NO: 32), hRorl (SEQ ID NO: 33)或 hRoi*2 (SEQ ID NO: 34) 〇在其他實施例中，Wnt拮抗劑變體為包含Frz域組分的嵌合分子，該Frz域組分與原-Frz或原-sFrp蛋白具有至少 70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89% ' 90%、 91%、92%、93%、94%、95%、960/〇、97%、98% 或 99% 的胺基酸序列一致性，該等原-Frz或原-sFrp蛋白係選自 hFrzl (SEQ ID NO: 35), hFrz2 (SEQ ID NO: 36)5 hFrz3 (SEQ ID NO: 37)，hFrz4 (SEQ ID NO: 38)，hFrz5 (SEQ ID NO: 39)，hFrz6 (SEQ ID NO: 40)，hFrz7 (SEQ ID NO: 41)， hFrz8 (SEQ ID NO: 42)，hFrz9 (SEQ ID NO: 43)，hFrzlO (SEQ ID NO: 44), sFRPl (SEQ ID NO: 45), sFRP2 (SEQ ID NO: 46)，sFRP3 (SEQ ID NO: 47)，sFRP4 (SEQ ID NO: 48) 及 sFRP5 (SEQ ID NO: 49)。在其他實施例中，Wnt拮抗劑變體為包含Frz域組分的欲合分子，該Frz域組分與成熟Frz、sFRP或hRor蛋白具有至少 70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94% ' 95%、96% ' 97% ' 98%或 99%的胺基酸序列一致性，該等成熟Frz、sFRP或hRor蛋 124434.doc -64- 200819463 白係選自 hFrzl (SEQ ID NO: 50)，hFrz2 (SEQ ID NO: 51)， hFrz3 (SEQ ID NO: 52), hFrz4 (SEQ ID NO: 53), hFrz5 (SEQ ID NO·· 54)，hFrz6 (SEQ ID NO: 55)，hFrz7 (SEQ ID NO: 56)，hFrz8 (SEQ ID NO: 57)，hFrz9 (SEQ ID NO: 58)， hFrzlO (SEQ ID NO: 59), sFRPl (SEQ ID NO: 60), sFRP2 (SEQ ID NO: 61)，sFRP3 (SEQ ID NO: 62)，sFRP4 (SEQ ID NO: 63), sFRP5 (SEQ ID NO: 64), hRorl (SEQ ID NO: 65) 及 hRor2 (SEQ ID NO: 66)。在其他實施例中，Wnt拮抗劑變體為包含Frz域組分的嵌合分子，該Frz域組分與以下胺基酸序列具有至少70%、 75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、 920/〇、930/〇、940/〇、95%、96%、970/〇、980/〇或 990/〇的胺基酸序列一致性：Frz8-Fc (SEQ ID NO: 74)，Frz5-Fc (SEQ ID NO: 75)，Frz卜Fc (SEQ ID NO: 76)，Frz2_Fc (SEQ ID NO: 77)，Frz3-Fc (SEQ ID NO: 78)，Frz4-Fc (SEQ ID NO: 79)， Frz6-Fc(SEQlDNO:80)，Frz7-Fc(SEQIDNO:81)，Frz9-Fc (SEQ ID NO: 82)，FrzlO-Fc (SEQ ID NO: 83)，sFRPl-Fc (SEQ ID NO: 84)，sFRP2 (SEQ ID NO: 85)，sFRP3-Fc (SEQ ID NO: 86)，sFRP4-Fc (SEQ ID NO: 87)及 sFRP5-Fc (SEQ ID NO: 88) 〇 n胺基酸序列一致性百分比（。/❶Γ定義為當比對兩個序列時與參考（親本）多肽序列之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。為測定胺基酸一致％，比對序列且必要時引入缺口以獲得最大序列一致性％ ;保守性取代不視為序列一 124434.doc -65- 200819463 致性之部分。測定一致性百分比的胺基酸序列比對程序已為熟習此項技術者所熟知。通常使用可公開獲得之電腦軟體 (諸如 BLAST、BLAST2、ALIGN2 或 Megalign (DNASTAR)軟體）比對狀序列。熟習此項技術者可判定適用於量測比對的參數’包括為獲得與所比較之全長序列之最大比對所需要的任何演算法。當比對胺基酸序列時，給定胺基酸序列A與給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性％(或者可表示為具有或包含與指定胺基酸序列B之特定胺基酸序列一致性％的給定胺基酸序列A)可如下計算：胺基酸序列一致性％ = χ/γχ 100 其中 X為藉由序列比對程式或演算法比對八與Β記為一致匹配之胺基酸殘基數目且 Υ為Β中胺基酸殘基之總數。若胺基酸序列Α之長度與胺基酸序列β之長度不等，則a 與B之胺基酸序列一致性％不等於B與a之胺基酸序列一致性〇/〇〇經分離”或”經純化f’之肽、多肽、蛋白質或生物活性片段係自其自然環境之組分中分離及/或回收。污染組分包括通常有礙多肽之診斷性或治療性使用的物質，且可包括轉、激素及其他蛋白性或非蛋白性物質。以乾重計較佳具有小於30。/。之非所要污染物質（污染物）、較佳小於2〇%、 124434.doc -66- 200819463 10%且較佳小於5%之污染物的製劑視為實質上經分離。經分離之重組製備肽/多肽或其生物活性部分實質上較佳不含培養基，亦即培養基較佳占肽/多肽製劑體積之2〇%以下、較佳約10%以下且較佳約5%以下。污染物之實例包括細胞碎片、培養基及在活體外合成肽/多肽期間所使用及所產生之物質。本文中所述之Wnt拮抗劑之變異例如可使用例如美國專利第5,364,934號中所述之任何用於保守型及非保守型突變之技術及指南產生。變異可為一或多個編碼該抗體或多肽之密碼子之取代、缺失或插入，從而使得胺基酸序列與天然序列抗體或多肽相比發生改變。變異視情況為在Wnt拮抗劑之一或多個域中至少一個胺基酸經其他任何胺基酸取代。判定可將何胺基酸殘基插入、取代或缺失而對所要活性無不利影響的規則可如下覓得：對比Wnt拮抗劑之序列與已知同源蛋白質分子之序列且使在高度同源區中所產生之胺基酸序列改變數目最小化。胺基酸取代可為一胺基酸經另一具有相似結構性質及/或化學性質之胺基酸置換之結果，諸如白胺酸經絲胺酸置換，亦即保守性胺基酸置換。插入、缺失或取代視情況可在約1至5個胺基酸範圍内。容許之變異可如下判定：系統性地在序列中插入、缺失或取代胺基酸且對所得變體測試全長或成熟天然序列所展現之活性。

Wnt拮抗劑可藉由多種習知技術中之任一種製備。所要肽片段可以化學方式合成。一替代方法包括藉由酶促消化 124434.doc -67· 200819463 產生抗體或多肽片段，例如用已知可在由特定胺基酸殘基界定之位點處分解蛋白質的酶處理蛋白質，或用適當限制酶消化DNA且分離所要片段。另一合適技術包括由聚合酶鏈反應（PCR)分離且擴增編碼所要抗體或多肽片段的DNA 片段。在PCR中，界定DNA片段之所要末端的募核苷酸用於5’及3’引子處。在特定實施例中，所關注之保守性取代展示於表A中較佳取代之標題下。若該等取代導致生物活性改變，則可引入更多實質性改變（如表A命名為”例示性取代’’，或如下文參考胺基酸類別進一步描述），且筛檢產物。

表A 原始殘基例示性取代較佳取代 Ala(A) val、leu、ile val Arg(R) lys、gin、asn lys Asn(N) gin、his、asp、lys、arg gin Asp(D) glu ' asn glu Cys(C) ser ' ala ser Gln(Q) asn ' glu asn Glu(E) asp 、 gin asp Gly(G) ala ala His(H) asn、gin、lys、arg arg He© leu、val、met、ala、phe、正白胺酸 leu Leu(L) 正白胺酸、ile、val、met、ala、phe ile Lys(K) arg、gin、asn arg Met(M) leu、phe、ile leu Phe(F) leu、val、ile、ala、tyr tyr Pro(P) ala ala Ser(S) thr ' cys cys Thr(T) ser ser Trp(W) tyr ' phe tyr Tyr(Y) trp、phe、thr、ser phe Val(V) ile、leu、met、phe、ala、正白胺酸 leu 124434.doc -68 - 200819463 對Wnt拮抗劑之功能或免疫特性之實質性修改可藉由選擇其對以下方面之影響顯著不同的取代來實玉見··維持⑷取代區域内多肽主鏈之結構，例如，摺疊片或螺旋狀構型； (b)靶點處分子之電荷或疏水性；或（c)側鏈之體積。天然存在之殘基可基於共同側鏈性質分為以下群組： ⑴疏水性··正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ; (2) 中性親水性·· Cys、Ser、Thr、Asn、Gin ; (3) 酸性：Asp、Glu ; (4) 驗性·· His、Lys、Arg ; (5) 影響鏈取向的殘基·· Gly、pro ;及 (6) 方族.Trp、Tyr、Phe 〇非保守性取代使該等類別中之一類之成員交換成另一類成員。亦可將該等經取代之殘基引入保守性取代位點，或更佳地，引入剩餘（非保守性）位點。變異可使用此項技術中已知之方法（諸如寡核苷酸介導之（定點）誘變、丙胺酸掃描及PCR誘變）產生。可對經選殖之DNA進行定點誘變[carter等人，Nucl. Acids Res·，13:4331 (1986) ; Zoller等人，Nucl· Acids Res” 10:6487 (1987)]、序列盒誘變[Wells等人，Gene，34:315 (1985)]、限制性選擇誘變[Wells荨人 ’ Philos. Trans· R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)]或其他已知技術以製備本發明之Wnt拮抗劑。亦可採用掃描胺基酸分析以沿連續序列鑑別一或多個胺基酸。較佳掃描胺基酸為相對小的中性胺基酸。該等胺基酸包括丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸及半胱胺酸。丙胺酸通常 124434.doc •69- 200819463 為此群中之較佳掃描胺基酸，原因在於其消除超出卜碳的側鏈且不會改變變體之主鏈構型[Cunningham及Wells，

Science，244:1081-1085 (1989)]。丙胺酸通常因其為最常見之胺基酸而亦較佳。此外，其常見於隱藏位置及曝露位置[Creighton，The Proteins，（W.H. Freeman & Co·，N.Y.);

Chothia，J· Mol· Biol·，150:1 (1976)]。若丙胺酸取代未產生足量的變體，則可使用電子等排胺基酸。任何與維持Wnt拮抗劑之適當構型無關的半胱胺酸殘基通常亦可用絲胺酸取代以改良分子之氧化穩定性且防止異常交聯。反之，可將半胱胺酸鍵添加至Wnt拮抗劑中以改良其穩定性（尤其若抗體為諸如Fv片段之抗體片段）。取代變體之尤其較佳類型包括取代親本抗體（例如，人源化抗體或人類抗體）中之一或多個高變區殘基。通常，選用於進一步開發的所得變體相對於其所來源之親本抗體具有經改良之生物性質。產生該等取代變體的便利方法包括使用噬菌體呈現技術之親和力成熟。簡言之，使若干高變區位點（例如6-7個位點）突變以在各位點產生所有可能的胺基取代。因此產生之抗體變體可作為與封裝於各顆粒内部之M13之基因III產物融合體由絲狀噬菌體顆粒以單價方式呈現。接著如本文中所揭示，針對生物活性（例如，結合親和力）篩檢經嗤菌體呈現之變體。為鑑別用於修飾之候選高變區位點，可執行丙胺酸掃描誘變以鑑別顯著有助於抗原結合的高變區殘基。或者，或此外，分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別介於Wnt拮抗劑與Wnt蛋白之間 124434.doc -70- 200819463 的接觸點可為有利的。該等接觸殘基及相鄰殘基為用於根據本文中詳述之技術進行取代之候選殘基。—旦產生該等變體’則使該組變體如本文中所述經受筛檢，且可選擇在 -或多個相關檢定中具有優良性質的抗體用於進一步開發。

Wnt拮抗劑之共價修飾包括在本發明之範疇内。一類型之共價修飾包括使Wnt拮抗劑之靶向胺基酸殘基與有機衍生劑反應，該有機衍生劑能夠與Wnt拮抗劑之所選側鏈或 N-末端殘基或C_末端殘基反應。用雙官能劑衍生化適用於例如使Wnt拮抗劑與用於純化Wnt拮抗劑之方法中的水不 /谷性支撐基質或表面交聯。常用交聯劑包括：例如，1，^ _ 雙（重鼠乙酿基）_2 -苯基乙烧、戊二酸、N -經基丁二酿亞胺 g旨（例如與4-疊氮基水楊酸之酯）、同雙官能亞胺基酯（包括二丁二醯亞胺基酯，諸如3，3’-二硫基雙（丁二醯亞胺基丙酸酯）、雙官能順丁烯二醯亞胺（諸如雙_N_順丁烯二醯亞胺基-1，8-辛烷）及諸如甲基-3-[(對-疊氮基苯基）二硫基]丙醯亞胺醋之交聯劑。其他修飾包括：使麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基分別脫醯胺為相應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基；使脯胺酸及離胺酸羥基化；使絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基磷酸化；使離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基甲基化[T.E. Creighton，Proteins: Structure and Molecular Properties， W.H. Freeman & Co.，San Francisco，第 79-86 頁（1983)]; 使N-末端胺乙醯化及使任何C-末端羧基醯胺化。 124434.doc -71 - 200819463 包括於本發明之範疇内之Wnt拮抗劑之另—類型之共價修飾包含改變Wnt拮抗劑之Frz、sFRp多肽域之^ = 糖基化模式。"改變天然、糖基化模式"定義為：使存在於組分域之天然序列中之—或多個碳水化合物部分缺失（移除潛在糖基化位點，或藉由化學及/或酶促方式缺失糖基化作用）’及/或增加一或多個不存在於組分域之天然序列中的糖基化位點。此外，該短語包括定性改變天然蛋白質之糖基化包括改變所存在之各種碳水化合物部分之性質及比例。抗體及其他多肽之糖基化通常為N-連接或〇_連接糖基化。N-連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-χ_絲胺酸及天冬醯胺蘇胺酸（其中X為除脯胺酸外的任何胺基酸）為用於使碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈酶促連接的識別序列。因此，該等三肽序列中之任一者存在於多肽中均可形成潛在糖基化位點。〇_ 連接糖基化係指糖Ν-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸（儘管5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸亦可使用，但最兩用絲胺酸或踩胺酸）連接。向Wnt拮抗劑中增添糖基化位點可方便地藉由改變胺基酸序列以使得其含有上述三肽序列中之一或多者（對於N_ 連接糠基化位點）而得以實現。該改變亦可藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基增添至或取代入初始（亦即前變體）Wnt拮抗劑之序列中得以進行。此序列視情況可經由在 DNA層級上改變、尤其藉由在預先選定之鹼基處使編碼該 124434.doc •72- 200819463 序列之DNA突變以使得產生將轉譯成所要胺基酸的密碼子來加以改變。增加Wnt拮抗劑上碳水化合物部分之數目的另一方弋為以化學或酶促方式使糖苷與多肽偶合。該等方法已描述於此項技術中，例如已描述於1987年9月U日公開之w〇 87/05330 中，以及 Aplin 及 Wriston，CRC CHt. Rev Biochem·，第 259-306 頁（1981)中。移除存在於Wnt拮抗劑上之碳水化合物部分可以化學或酶促方式實現，或藉由以突變方式取代編碼充當糖基化之靶點之胺基酸殘基之密碼子來實現。化學去糖基化技術為此項技術中所已知且已描述於例如Hakimuddin等人之

Arch· Biochem· Biophys·，259:52 (1987)及 Edge 等人之

Anal· Biochem” 118:131 (1981)中。酶促裂解多肽上之碳水化合物部分可如Thotakura等人，Meth· Enzymol. 138:350 (1987)所述藉由使用多種内醣苷酶及外醣苷酶來實現。

Wnt拮抗劑之另一類型共價修飾包含以美國專利第 4,640,835 號、第 4,496,689 號、第 4,301，144 號、第 4,670,417號、第4,791，192號或第4，179,337號中所述之方式將該序列與多種非蛋白性聚合物其中之一（例如，聚乙二醇（PEG)、聚丙二醇或聚環氧烷）連接。抗體或多肽亦可包封於例如藉由團聚技術或藉由界面聚合所製備的微膠囊 (例如，分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚（甲基丙烯酸甲酯）微膠囊）中，可包封於膠體藥物傳遞系統（例如，脂 124434.doc -73- 200819463 質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊）中’或可包封於巨乳液中。該等技術揭示於Remingt〇n: The

Science an(j Practice of Pharamacy，第 20版，Gennaro，Α· 編（2000)中。本發明之Wnt拮抗劑亦可以形成具有其他嵌合性質、包含與另一異源多肽或胺基酸序列融合之Wnt拮抗劑（亦即 Frz-Fc、SFRP-Fc或Ror-Fc嵌合體）之分子之方式加以修飾。在一實施例中，該嵌合分子包含Wnt拮抗劑與標記多肽之融合體，該標記多肽提供抗-標記抗體可選擇性結合之抗原決定基。該抗原決定基標記通常安置於Wnt拮抗劑之胺基末端或羧基末端。Wnt拮抗劑經該抗原決定基標記之形式之存在可使用抗標記多肽之抗體偵測。又，提供抗原決定基標記使得Wnt拮抗劑能夠易於使用抗-標記抗體或另一類型與該抗原決定基標記結合之親和基質藉由親和力純化法加以純化。各種標記多肽及其各別抗體已為此項技術中所熟知。實例包括聚組胺酸（poly-his)或聚組胺酸-甘胺酸（poly-his-gly)標記；flu HA標記多肽及其抗體12CA5 [Field等人，Mol· Cell· Biol” 8:2159-2165 (1988)] ; c-myc 標記及其 8F9、3C7、6E10、G4、B7及9E10抗體[Evan等人， Molecular and Cellular Biology，5:3610-3616 (1985)];及單純癌療病毒St蛋白D(gD)標記及其抗體[Paborsky等人， Protein Engineering，3 (6):547-553 (1990)]。其他標記多肽包括 Flag-肽[Ηορρ 等人，BioTechnology，6:1204-1210 124434.doc -74· 200819463 (1988)] ; KT3 抗原決定基肽[Martin 等人，science， 255:192-194 (1992)] ; α-微管蛋白抗原決定基肽[Skinner等人，J. Biol· Chem·，266:15163 -15166 (1991)]及丁7基因 1〇蛋白質肽標記[Lutz-Freyermuth等人，Proc· Natl. Acad. Sci· USA，87:6393 -6397 (1990)]° 在替代實施例中，Wnt拮抗劑包含變體Fc組分。舉例而言，Fc區可包含在一或多個胺基酸位置處（包括鉸鏈半胱胺酸之位置）包含胺基酸修飾（例如取代）的人類Fc區序列 (例如人類IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區）。在一實施例中，該等變體與參考Fc多肽序列具有至少70%、75%、 80%、85%、86%、87%、88%、89% ' 90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%的胺基酸序列一致性。在一實施例中，Fc區變體可呈現改變之新生Fc受體 (FcRn)結合親和力。該等變體Fc區可包含Fc區之以下胺基酸位置中任一處或多處之胺基酸修飾：238、252、253、 254 、 255 、 256 、 265 、 272 、 286 、 288 、 303 、 305 ' 307 、 309 、 311 、 312 、 317 、 340 、 356 、 360 、 362 、 376 、 378 、 380 、 382 、 386 、 388 、 400 、 413 、 415 、 424 、 433 、 434 、 435、436、439或447，其中依1^5&1，？〇區中之殘基編號為EU索引之編號。與FcRn之結合減弱之Fc區變體可包含 Fc區之以下胺基酸位置中任一處或多處之胺基酸修飾： 252 、 253 、 254 、 255 、 288 、 309 、 386 、 388 、 400 、 415 、 43 3、43 5、436、439 或 447(EU 索弓| /Kabat編號）。或者，呈 124434.doc -75- 200819463 現與FcRn之結合增強之變體可包含Fc區之以下胺基酸位置中任一處或多處之胺基酸修飾：238、256、265、272、 286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、 362、376、378、380、382、413、424 或 434 (EU索引 / Kabat編號）。在另一實施例中，Fc區變體可呈現與FcyR之結合減弱，且包含Fc區中以下位置處之胺基酸修飾：238、239、 248 、 249 ' 252 、 254 、 265 、 268 、 269 、 270 、 272 、 278 、 289 、 292 、 293 、 294 、 295 、 296 、 298 ' 301 、 303 、 322 、 324 、 327 、 329 、 333 、 335 、 338 、 340 、 373 、 376 、 382 、 388、389、414、416、419、434、435、437、438 或 439 (EU索引/Kabat編號）。在又一實施例中，Fc區變體可呈現與FcyRII之結合減弱且包含Fc區之以下胺基酸位置中任一處或多處之胺基酸修 # : 238 、 265 、 269 、 270 、 292 、 294 、 295 、 298 、 303 、 324 、 327 、 329 、 333 、 335 、 338 、 373 、 376 、 414 、 416 、 419、43 5、43 8 或 43 9 (EU 索引 /Kabat編號）。在另一實施例中，Fc區變體可呈現與FcyRII之結合增強且包含Fc區之以下胺基酸位置中任一處或多處之胺基酸修飾：238 、 265 、 269 、 270 、 292 ' 294 、 295 、 298 、 303 、 324 、 327 、 329 、 333 、 338 、 373 、 376 、 414 、 416 、 419 、 43 5、438 或 43 9 (EU 索弓| /Kabat編號）° 在另一實施例中，所關注之Fc區變體可呈現與FcgRIII 之結合減弱，且包含Fc區之以下胺基酸位置中一或多處之 -76- 124434.doc 200819463 胺基酸修飾：238、239、249、252、254、265、268、 269 、 270 、 272 、 278 、 289 、 293 、 294 、 295 、 296 、 301 、 303 、 322 、 327 、 329 、 338 、 340 、 373 、 376 、 382 、 388 、 389、416、434、43 5或43 7 (丑11索弓|/1^&1編號）。在另一實施例中，具有經改變（亦即經改良或經減弱）之 Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性（CDC)的Fc區變體描述於WO 99/51642中。該等變體可包含Fc區之胺基酸位置 270、322、326、327、329、331、333 或 3 34 中一或多處之胺基酸取代。關於Fc區變體，亦請參見Duncan及Winter， Nature 322: 73 8-40 (1988);美國專利 5,648,260 ;美國專利 5,624,821 及 WO 94/2935 卜 B.Wnt拮抗劑之製備以下描述主要關於藉由培養經含有編碼Wnt拮抗劑多肽之核酸之載體轉化或轉染的細胞來製備Wnt拮抗劑多肽。當然本發明涵蓋使用此項技術中熟知之替代方法製備該等 Wnt拮抗劑。舉例而言，適當胺基酸序列或其部分可使用固相技術藉由直接肽合成法來製備[參見例如Stewart等 A 5 Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co.? San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc.5 85:2149-2154 (1963)]。活體外蛋白質合成可使用人工技術或藉由自動操作執行。自動合成例如可使用應用型生物系統肽合成器（Applied Biosystems Peptide Synthesizer)(Foster City，CA)使用製造商之說明來實現。Wnt拮抗劑多肽之各部分可單獨化學合成且使用化學方法或酶促方法組合以產 124434.doc •77- 200819463 生所要序列。 1·編碼Wnt拮抗劑多肽之DNA之分離編碼拮抗劑序列或Wnt拮抗劑之任何所要組成域（諸如 Frz或sFRP)的DNA可獲自cDNA文庫，該文庫係自咸信具有該序列且以可偵測量表現其的組織製備。因此，人類 Frz或sFRP序列DNA可便利地獲自由人類組織製備之cDNA 文庫。所要DNA序列基因亦可獲自基因組文庫或藉由已知合成程序（例如自動核酸合成）獲得。文庫可用探針（諸如具有至少約20_80個鹼基之寡核苷酸）篩檢，該等探針經設計以鑑別所關注之基因或由其編碼之蛋白質。用所選探針篩檢cDNA或基因組文庫可使用標準程序（諸如 Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述之標準程序）執行。分離編碼Wnt拮抗劑多肽及其組分之基因的替代方式係使用PCR方法[Sambrook等人，同上；Dieffenbach等人，PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)] ° 篩檢cDNA文庫之技術已為此項技術中所熟知。選作探針之寡核苷酸序列應具有足夠長度及使假陽性最小化之足夠明確性。較佳地，寡核苷酸經標記以使得其與所筛檢之文庫中之DNA雜交後可偵測出。標記方法已為此項技術中所熟知且包括使用放射性標記，如32P-標記ATP、生物素化或酶標記。雜交條件（包括中嚴格度及高嚴格度）提供於 Sambrook等人，同上文中。 124434.doc -78 - 200819463 可將以該等文庫篩檢方法所鑑別出之序列與公共資料庫 (諸如GenBank)或其他私有序列資料庫中所寄存且可獲得之其他已知序列比較且比對。分子之限定區内或整個：長序列之序列一致性（在胺基酸或核苷酸層級上）可使用此項技術中已知及如本文中所述之方法測定。編碼Fc免疫球蛋白域的DNA序列可來源於分泌所要卜亞型之mAbs的雜交瘤細胞。〆具有蛋白質編碼序列的核酸可如下獲得：使用本文中第 ' 一次揭示之推斷出之胺基酸序列篩檢所選基因組文庫’且必要時使用如Sambr〇〇k等人，同上文中所述之習知引子延長程序偵測可能尚未逆轉錄為CDNA之mRNA之前驅物及加工中間物。 2·宿主細胞之選擇及轉化將宿主細胞用本文中所述用於Wnt拮抗劑多肽製備的表現載體或選殖載體轉染或轉化，且培養於適當時經改良以 , 誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所要序列之基因的習知營養培養基中。培養條件，諸如培養基、溫度、pH值及類似條件，可由熟習此項技術者無需不當實驗加以選擇。一般而言，使細胞培養1勿之生產率最大化的原則、方案及實施技術可見於Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach，M. Butler編（IRL Press，1991)及 Sambrook等人，同上文中。真核細胞轉染及原核細胞轉化之方法（例如CaCl2、 CaP04、月旨質體介導法及電穿孔法）為一般技術者所已知。 124434.doc -79- 200819463 視所用宿主細胞而定，轉化可使用適於該等細胞的標準技術執行。使用氯化約之药處理法（如Sambrook等人，同上文中所述）或電穿孔法通常用於原核細胞。如Shaw等人， Gene，23:3 15 (1983)及 1989年 6 月 29 日公開之 WO 89/05859 所述，用根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens)感染係用於某些植物細胞之轉化。對於無該等細胞壁的哺乳動物細胞，可採用 Graham及van der Eb，Virology，52:456-457 (1978)的磷酸鈣沈澱法。哺乳動物細胞宿主系統轉染之一般態樣已描述於美國專利第4,399,216號中。轉化入酵母内通常係根據 Van Solingen 等人，J· Bact·，130:946 (1977)及 Hsiao等人，Proc· Natl· Acad· Sci· (USA)，76:3829 (1979) 之方法進行。然而，亦可使用將DN A引入細胞内的其他方法，諸如細胞核微量注射、電穿孔、細菌原生質體與完整細胞融合，或聚陽離子，例如聚凝胺（polybrene)、聚鳥胺酸。關於各種轉化哺乳動物細胞的技術，請參見Keown等人，Methods in Enzymology， 185:527-537 (1990)及Mansour 等人，Nature，336:348-352 (1988)。適於以本文中之載體選殖或表現DNA的宿主細胞包括原核細胞、酵母或高等真核生物細胞。適當原核細胞包括 (但不限於）真細菌，諸如革蘭氏陰性（Gram-negative)或革蘭氏陽性（Gram-positive)有機體，例如腸内菌科 (五⑽），諸如大腸桿菌（五· co/z·)。各種大腸桿菌菌株可公開購得，諸如大腸桿菌K12菌株MM294 (ATCC 31，446);大腸桿菌 X1776 (ATCC 31，537);大腸桿 124434.doc -80 - 200819463 菌菌株 W3110 (ATCC 27,325)及 Κ5 772 (ATCC 53,635)。其他適當原核宿主細胞包括腸内菌科，諸如埃希氏桿菌屬 (心例如大腸桿菌）、腸桿菌屬化rM沉kr)、歐文氏菌屬（五rwzWa)、克雷伯氏菌屬（Α7βΖ^ζ·β//β)、變形桿菌屬（Proiews)、沙門氏菌屬例如鼠傷寒沙門氏桿菌（以/所叩泛//“ typhimurium))、、?}'雷氏菌屬 (*Serrai/a)(例如黏質沙雷菌（☆rrai/a marcaeaw))及志賀桿菌屬〇S/n_ge//a)以及芽孢桿菌屬（5acz7/〇(諸如枯草芽孢桿菌 (凡 Μδίζ’/ζ、）及地衣芽孢桿菌（5. //c/zemybrm/sX例如，1989 年4月12日公開之DD 266,710中所揭示的地衣芽孢桿菌 41P))、假單胞菌屬諸如綠膿桿菌（户· 及鏈黴菌屬（ArepMmyca)。該等實例為說明性的而非限制性的。菌株W3 110因其為用於重組DNA產物醱酵的常用宿主菌株而為一種尤其較佳的宿主或親本宿主。較佳地，該宿主細胞分泌最少量的蛋白水解酶。舉例而言，菌株W3 110可經改良以實現編碼宿主内源蛋白質之基因中的遺傳突變，其中該等宿主之實例包括：具有完整基因型的大腸桿菌W3110菌株1A2;具有完整基因型 ίο心4 的大腸桿菌W3110菌株9E4 ;具有完整基因型 ptr3 phoA El 5 (argF-lac) 169 degP ompT kanr 的大騰桿儀 W3110菌株27C7 (ATCC 55,244);具有完整基因型 ptr3 phoA El 5 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr 的大腸桿菌W3110菌株37D6;大腸桿菌W3110菌株40B4，其為具有非康黴素（non-kanamycin)财藥性AgP缺失突變的菌 124434.doc -81- 200819463 株3706及具有美國專利第4,946,783號（199〇年8月7曰頒予）中所揭示之突變型周質蛋白酶的大腸桿菌菌株。或者，活體外選殖方法（例如PCR或其他核酸聚合酶反應）為適合的。全長抗體、抗體片段及抗體融合蛋白可於細菌中製備，尤其當不需要糖基化及FC效應功能時，諸如當將治療性抗體與細胞毒性劑（例如毒素）接合且該免疫接合物本身展現腫瘤細胞破壞之功效時。全長抗體在循環中具有較長半衰期。於大腸桿菌中製備較快且成本較低廉。關於在細菌中表現抗體片段及多肽，參見例如美國5,648,237 (Caner等人）、美國5,789，199 (Joly等人），及描述用於優化表現及分泌之轉譯啟始區（TIR)及信號序列的美國5,84〇,523 (Simmons等人），該等專利以引用方式併入本文中。表現後’將抗體以可溶性溶離份自大腸桿菌細胞糊狀物中分離且經由例如蛋白質A4G管柱（視同型而定）加以純化。最終純化可以與純化例如CHO細胞中所表現之抗體之方法類似的方法進行。除原核細胞外，真核微生物（諸如絲狀真菌或酵母）亦為適於Wnt拮抗劑多肽編碼載體的選殖或表現宿主。釀酒酵母（Sacc/mrom少ca cerev/W似）為常用的低等真核宿主微生物其他包括粟酒裂瘦酵母 p(9m6e)(Beach及 Nurse，Nature，290:140 [1981] ; 1985 年 5 月 2曰公開之EP 139,383)，克魯維酵母屬宿主（美國專利第 4,943,529號；Fleer等人，Bio/Technology， 124434.doc -82- 200819463 9:968-975 (1991))，諸如乳酸克魯維酵母（尤· /adz、)(MW98-8C、CBS683、CBS4574 ; Louvencourt 等人，J. Bacteriol·， 154 (2):737-742 [1983])、脆壁克魯維酵母（尤·/r 叹 z7 以)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母（尺· bulgaricus){AlCC 16,045)、維氏克魯維酵母（尺· iWcA：er(2m//)(ATCC 24，178)、沃爾弟克魯維酵母（X. wa/沿)(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母菌（尺· 36,906 ; Van den Berg 等人，

Bio/Technology，8:135 (1990))、耐熱克魯維酵母（尺· i/zermoio/era似）及馬克斯克魯維酵母（尺· marxianus) \耶氏酵母屬Cyarr(9iWa)(EP 402,226);巴斯德畢赤酵母 paWorzjXEP 183,070 ; Sreekrishna等人，J. Basic Microbiol·， 28:265-278 [1988]);念珠菌屬（C⑽心心）；小蒼蘭木黴菌 (TWc/zc^erma rea/a)(EP 244,234);粗糙鏈孢黴 cr^^aMCase等人，Proc· Natl· Acad· Sci. USA，76:5259-5263 [1979]);許旺酵母屬，諸如西方許旺酵母年 10 月 31 曰公開之EP 394,538);及麯黴屬宿主，諸如溝巢麯黴（Α wzWw/α 似）（Ballance等人，Biochem. Biophys. Res· Commun·，112:284-289 [1983] ; Tilburn等人，Gene，26:205-221 [1983] ; Yelton 等人，Proc· Natl· Acad· Sci· USA， 81:1470-1474 [1984])及黑麯黴（i m’ger)(Kelly 及 Hynes， EMBO J·，4:475-479 [1985])。嗜甲醇酵母適用於本發明中且包括（但不限於）能夠在甲醇上生長的酵母，其選自由以下酵母屬組成之群：漢遜氏酵母屬⑽/α)、念珠菌 124434.doc -83- 200819463 屬、克勒克酵母屬（尤沁echra)、畢赤酵母屬、酵母菌屬、球擬酵母屬（τ^α/吵^以）及紅酵母屬。此類酵母之實例之特定酵母物種之清單可見於 C. Anthony，The Biochemistry of Methylotrophs，269 (1982)中。適於表現糖基化Wnt拮抗劑多肽的宿主細胞來源於多細胞有機體。無脊椎動物細胞之實例包括昆蟲細胞，諸如果蠅屬 S2 (Drosophila S2)及夜蛾屬 Sf9 (Spodoptera Sf9);以及植物細胞，諸如棉花、玉米、馬鈐薯、大豆、矮牵牛、番茄及煙草之細胞培養物。已鑑別多種桿狀病毒株及變體及來自諸如以下宿主的相應可侵染昆蟲宿主細胞··草地黏蟲而)（蝎）、埃及伊蚊（Jda (蚊）、白紋伊蚊蚊）、果繩

me/㈣ogwier)(果蠅）及中國家蠶（方⑽6}；JC mor〇。多種轉染用病毒株可公開購得，例如苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒（j⑽NPV)之L-1變體及中國家蠶核型多角體病毒2Bm-5病毒株，且該等病毒在本文中可用作本發明之病毒，尤其用於轉染草地黏蟲細胞。然而’脊椎動物細胞最有利，且在培養液（組織培養液）中繁殖脊椎動物細胞已成為常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為：經SV4〇轉化之猴腎CV1細胞株（c〇s_7, ATCC CRL 1651);人類胚腎細胞株（經次選殖以在懸浮培養液中生長的293或293細胞，Graham等人，J· Gen Virol. 124434.doc -84 - 200819463 36:59 (1977));幼倉鼠腎細胞（ΒΗΚ，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞 /-DHFR (CHO，Urlaub 等人，Proc· Natl. Acad· Sci. USA 77:4216 (1980));小鼠足細胞（TM4， Mather，Biol· Reprod· 23:243-251 (1980));猴腎細胞 (CV1，ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞（VERO-76, ATCC CRL-1587);人類宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2);犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34);布法羅大鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442);人類肺細胞（W138，ATCC CCL 75);人類肝細胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳腺腫瘤 (MMT 060562，ATCC CCL51) ; TRI 細胞（Mather 等人， Annals Ν·Υ· Acad. Sci· 383:44-68 (1982)) ; MRC 5細胞； FS4細胞及人類肝細胞瘤細胞株（Hep G2)。將宿主細胞用上述用於Wnt拮抗劑多肽製備的表現或選殖載體轉化且培養於適當時經改良以誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所要序列的基因的習知營養培養基中。 3·可複製載體之選擇及使用本發明之一態樣提供編碼Wnt拮抗劑多肽的核酸（例如 cDNA或基因組DNA)，該核酸已插入用於選殖（擴增DNA) 或表現的可複製載體中。各種載體可公開購得。載體例如可呈質體、黏質體、病毒顆粒或噬菌體之形式。適當核酸序列可藉由多種程序插入載體中。一般而言，DNA係使用此項技術中已知之技術插入適當的限制性核酸内切酶位點中。載體組分通常包括（但不限於）以下組分中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、增強子元 124434.doc -85- 200819463 件、啟動子及轉錄終止序列。含有該等組分中之一或多者的適當載體之建構採用熟習此項技術者已知之標準連接技術。

Wnt拮抗劑不僅可以重組方式直接製備，而且可重組製備為與異源多肽（其可為信號序列或在成熟蛋白質或多肽之N-末端具有特定裂解位點之其他多肽）的融合多肽。一般而言，信號序列可為載體之組分，或其可為插入載體中〆之編碼Wnt拮抗劑多肽之DNA的一部分。信號序列可為原核信號序列，其例如選自由鹼性磷酸酶、青黴素酶、或熱穩定腸毒素II前導序列組成之群。用於酵母分泌之信號序列可為（例如）酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列 (包括酵母菌屬及克魯維酵母屬（X-因子前導序列，後者描述於美國專利第5,010,182號中）或酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌（C. 葡糖澱粉酶前導序列（199〇年4月4 日公開之 EP 362，179)或 WO 90/13646 (1990 年 11 月 15 日公開）中所述之信號序列。在哺乳動物細胞表現中，哺乳動物信號序列可用於引導蛋白質之分泌，該等信號序列諸如來自相同或相關物種之分泌型多肽的信號序列以及病毒分泌前導序列。表現載體與選殖載體皆含有使載體能夠在一或多種所選宿主細胞中複製的核酸序列。熟知用於多種細菌、酵母及病毒之該等序列。來自質體PBR322之複製起點適於大部分革蘭氏陰性細菌，2μ質體複製起點適於酵母，且各種病毒複製起點（SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)適用 124434.doc -86- 200819463 於在哺乳動物細胞中選殖載體。表現及選殖載體通常含有亦稱為可選擇標記的選擇基因。典型的選擇基因編碼：⑷料針對抗生素或其他毒素 (例如，安比西林（ampieillin)、新黴素（ne〇mycin)、甲胺蝶呤（methotrexate)或四環素（tetracycUne))之耐藥性的蛋白質；（b)補足營養缺陷不足的蛋白質；或⑷提供不能自複合培養基獲得之關鍵營養物的蛋白質，例如，對於芽胞桿菌屬（5πζ7/ζ·)而言編碼D-丙胺酸消旋酶的基因。適於哺乳動物細胞之可選擇標記之實例為使得能夠鑑別有旎力谷納編碼Wnt拮抗劑之核酸之細胞的彼等標記，諸如DHFR或胸苷激酶。當使用野生型DHFR時，適當宿主細胞為缺乏DHFR活性、如Urlaub

Sci· USA，77:4216 (1980)所述製備及繁殖的ch〇細胞株。適用於酵母中的選擇基因為存在於酵母質體YRp7中的trpl 基因[Stinchcomb等人，Nature，282:39 (1979); Kingsman 等人，Gene，7:141 (1979) ; Tschemper等人，Gene，10:157 (1980)]。trpl基因為缺乏在色胺酸中生長之能力的酵母突變株提供選擇標記，例如，ATCC第44076號或PEP4-1 [Jones，Genetics，85:12 (1977)]。表現及選殖載體通常含有與編碼Wnt拮抗劑之核酸序列操作性連接的啟動子以指導mRNA合成。已熟知由多種潛在宿主細胞識別的啟動子。適用於原核宿主的啟動子包括·· β-内醯胺酶及乳糖啟動子系統[Chang等人，Nature， 275:615 (1978) ; Goeddel等人，Nature，281:544 (1979)]; 124434.doc -87- 200819463 鹼性磷酸酶；色胺酸（trp)啟動子系統[G〇eddei，Nuc丨eic ACidSRes.，8:4057 (1980);EP 36,776] ;及雜交啟動子，諸如 tac啟動子[deBoer 等人，Pr〇c. Natl. Acad. Sci. USA， 80.21 25 (1983)]。用於細菌系統中的啟動子亦含有與編碼 Wnt拮抗劑多肽之DNA操作性連接的（s d ) 序列。適用於酵母宿主之啟動序列之實例包括以下酶之啟動子：3-鱗酸甘油酸激酶[Hitzeman等人，丨Bi〇L Chem·， 255:2073 (1980)]或其他糖解酶[Hess等人，j. Adv. Enzyme

Reg.? 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 0978)] ’諸如烯醇酶、甘油醛-3_磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、填酸果糖激酶、葡糖_6_填酸異構酶、 3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡糖異構酶及葡糖激酶。其他作為具有由培養條件控制之轉錄之額外優點之可誘導啟動子的酵母啟動子為以下基因之啟動子區：乙醇脫氣酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關之降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛_3_磷酸脫氫酶及負責麥芽糖及半乳糖利用的酶。適用於酵母表現的載體及啟動子進一步描述於EP 73,657中。哺乳動物宿主細胞中Wnt拮抗劑多肽自載體之轉錄係由例如獲自病毒（諸如多形瘤病毒、鳥痘病毒（1989年7月5日公開之UK 2,211，504)、腺病毒（諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毋、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B型肝 124434.doc -88- 200819463 炎病毒及猿病毒4MSV4G))基因組、異源哺乳動物啟動子 (例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟料）及熱休克啟動子之啟動子控制，其限制條件為該等啟動子與宿主細胞系統相容。、、工由同等真核細胞轉錄編碼Wnt拮抗劑多肽之可藉由將增強子序列插人載體中來增強。增強子為通常約1〇至 300 bp之DNA之順式作用元件，其作用於啟動子以增強其轉錄。現已由哺乳動物基因（球蛋白、彈性酶、白蛋白、心胎蛋白及胰島素）獲知多種增強子序列。然而，通常使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括複製起點晚期側的SV40增強子（bp 100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、複製起點晚期側的多瘤病毒增強子及腺病毒增強子。增強子可在載體中Wnt拮抗劑多肽編碼序列之位置5,或3,處接入，但較佳位於啟動子之位置5,處。用於真核宿主細胞（酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類’或來自其他多細胞有機體之有核細胞）中的表現載體亦含有為終止轉錄及穩定mRNA所需要的序列。該等序列通常可獲自真核生物或病毒DNA或cDNA之5,及偶爾3,非轉譯區。該等區在編碼Wnt拮抗劑之mRNA的非轉譯部分中含有作為多聚腺苷酸化片段轉錄的核苷酸區段。適於與在重組脊椎動物細胞培養物中合成Wnt拮抗劑多狀相適應的其他方法、載體及宿主細胞描述於Gething等人 ’ Nature，293:620-625 (1981) ; Mantei等人，Nature， 281:40-46 (1979); EP 117,060及 EP 117,058 中。 124434.doc -89- 200819463 4·培養宿主細胞本發明之一態樣提供包含編碼Wnt拮抗劑之核酸的宿主細胞。用於製備本發明之Wnt拮抗劑多肽的宿主細胞可在多種培養基中培養。諸如Ham’s F10 (Sigma)、最低必需培養基（MEM)(Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)及杜貝卡改良依格培養基（Dulbecco，s Modified Eagle，s Medium， DMEM)(Sigma)之市售培養基適於培養宿主細胞。此外，

Ham等人，Meth· Εηζ· 58:44 (1979); Bames等人，Anal· Biochem· 102:255 (1980);美國專利第 4,767,704號、第 4,657,866 號、第 4,927,762 號、第 4,560,655 號或第 5,122,469號；WO 90/0343 0 ; WO 87/00 195 或美國專利參考案30,985中所述之任何培養基可用作該等宿主細胞之培養基。該等任何培養基可視需要補充激素及/或其他生長因子（諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽（諸如氣化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽）、緩衝劑（諸如HEpES)、核苷酸 (諸如腺苷及胸苷）、抗生素（諸如GENTAMycin⑧藥物）、痕里7L素（定義為通常以微莫耳量級之最終濃度存在之無機化口物）及葡萄糖或等效能量來源。亦可以熟習此項技術者所已知之適當濃度包括任何其他必要補充物。培養條件（諸如溫度、PH值及類似條件）為上文選用於表現之宿主細胞所用的彼等條件，且對一般技術者顯而易見。 5·偵測基因擴增/表現基因擴增及/或表現可基於本文中所提供之序列、使用經適當標記之探針、藉由例如習知之南方墨點法、量化 124434.doc •90- 200819463 mRNA轉錄之北方墨點法[Th〇mas，pr〇c· Nati. Aea(j· Sci. USA，77:5201-5205 (1980)]、點印潰法（DNA 分析）或原位雜交法直接於樣本中量測。或者，可使用可識別特異性雙鏈體（包括DNA雙鏈體、rnA雙鏈體及DNA-RNA雜交雙鏈體或DNA-蛋白質雙鏈體）的抗體。該等抗體轉而可經標記且可進行檢定，其中雙鏈體結合於表面，從而在雙鏈體形成於表面上之後’可偵測與該雙鏈體結合之抗體之存在。或者，基因表現可藉由免疫學方法量測，諸如以免疫組織化學方式將細胞或組織切片染色及檢定細胞培養物或體液’以直接量化基因產物之表現。適用於免疫組織化學染色及/或樣本流體檢定的抗體可為單株抗體或多株抗體，且可於任何哺乳動物中製備。該等抗體可方便地針對本文中所鑑別之Frz、sFRP或Ror序列或針對基於本文中所提供之DNA序列之合成肽或針對與wnt拮抗劑融合且編碼特異性抗體抗原決定基之外源序列製備。 6· Wnt拮抗劑之純化

Wnt拮抗劑多肽之各形式可自培養基或自宿主細胞溶胞物中回收。若為膜結合型，則可使用適當洗滌溶液（例如，Triton-X 100)或藉由酶促裂解使其自膜中釋放出。用於表現Wnt拮抗劑多肽的細胞可藉由各種物理或化學方法 (諸如凍融循環、超音波處理、機械破壞或細胞溶解劑）分裂。純化來自重組細胞蛋白質或多肽之Wnt拮抗劑多肽可為需要的。以下程序為適當純化程序之實例：離子交換柱分 124434.doc -91- 200819463 二氧化矽層析或陽離子交換

使用例如Sephadex G-75之凝膠過濾；離；乙醇沈澱；逆相HPLC ; VCjE ;硫酸銨沈蛋白質A瓊脂糖柱移除諸如IgG之污染物&結合Wnt拮抗劑之經抗原決定基標記之形式之金屬螯合柱。可使用各種蛋白質純化方法且該等方法為此項技術中所已知且例如描述於D^tscher， Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)中。所選純化步驟例如視所用製備方法之性貝及所製備之特定Wnt抬抗劑多狀而定。當使用重組技術時，Wnt拮抗劑多肽可以細胞内方式產生於周質間隙内’或直接分泌至培養基中。若wnt拮抗劑多肽係以細胞内方式產生，則首先將顆粒碎片（宿主細胞或、/谷解片段）例如藉由離心作用或超濾作用移除。carter等人，Bio/Technology 10:163_167 (1992)描述一種將分泌至大腸桿菌周質間隙中之抗體分離的程序。簡言之，在乙酸鈉（pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯氟（PMSF)存在下、歷經約3 0分鐘將細胞糊狀物融解。細胞碎片可藉由離心作用移除。若Wnt拮抗劑多肽分泌至培養基中，則通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器（例如Amicon或Millip0re peilic〇n超濾、裝置）濃縮取自該等表現系統的上清液。以上任何步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白質水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。舉例而言，自細胞中所製備之Wnt拮抗劑多肽組合物可 124434.doc -92- 200819463 使用例如經基填灰石層析法、凝膠電泳法、滲析法及親和層析法加以純化，較佳純化技術為親和層析法。蛋白質A 作為親和配體之適用性視存在於抗》體中之任何免疫球蛋白 Fc域之種類及同型而定。蛋白質A可用於純化基於人類 γΐ、γ2 或 γ4 重鏈的抗體（Lindmark 等人，j· Immunol. Meth· 62:1-13 (1983))。蛋白質G推薦用於所有小鼠同型及人類 y3(GUSS等人，EMBO J· 5:15671575 (1986))。親和配體所附著之基質最通常為瓊脂糖，然而其他基質亦可用。機械穩定性基質（諸如受控小孔玻璃或聚（苯乙烯二乙烯基）苯）與瓊脂糖相比可達成較快的流速及較短的加工時間。若Wnt拮抗劑多肽包含cH3域，則Bakerbond ABX®樹脂(7· T· Baker，PhillipsbUrg，NJ)適用於純化。視待回收之抗體而定’亦可利用其他蛋白質純化技術，諸如離子交換柱分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層析、肝素 SEPHAROSE®層析、陰離子或陽離子交換樹脂（諸如聚天冬胺酸柱）層析、層析焦集、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。繼任何初步純化步驟之後，可使用pH值介於約2.5-4.5之間的溶離緩衝液使包含所關注之抗體及污染物的混合物經又低pH值疏水性相互作用層析，層析較佳在低鹽濃度下 (例如約0-0.25 Μ鹽）執行。 C ·醫藥調配物本發明之一態樣提供包含Wnt拮抗劑及至少一種醫藥學上可接文之載劑或賦形劑的組合物。根據本發明所使用之 WlU拮抗劑之治療性調配物係藉由將具有所要純度之Wnt 124434.doc -93- 200819463 拮抗劑與可選之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑 (Remington: The Science and Practice 〇f pharmacy，第

20版，A· Gennaro編（2000))混合加以製備以便以凍乾型調配物或水溶液之形式儲存。”醫藥學上可接受之載劑"包括適合投與醫藥的任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及類似載劑。適當載劑或稀釋劑之其他實例包括（但不限於）水、生理鹽水、 Finger氏溶液、右旋糖溶液及5%人血清白蛋白。亦可使用脂質體及非水性媒劑，諸如不揮發性油類。本發明涵蓋該等組合物之使用，除習知介質或藥劑與活性化合物不相容時之外。補充的活性化合物亦可併入組合物中。可接爻之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對受者為無毒的，且包括：緩衝劑，諸如乙酸鹽、Tris、磷酸鹽、擰檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氣化十八基二甲基节基銨、氯化：烴季銨、氣化苯甲烴鏔、氯化节乙氧銨、苯酚、丁醇或苯甲醇、對經苯甲酸烷酯（諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥本甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3_戊醇及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙稀比洛唆胺基酸，諸如甘胺酸、麵醯胺酸、天冬酿胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單_、二酶及其他碳水化合物’包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如贿A ; 張力劓，諸如海藻糖及氯化鈉；糖，諸如蔗糖、甘露糖 124434.doc •94- 200819463 醇、海藻糖或山梨糖醇；界面活性劑，諸如聚山梨醇醋；成鹽平衡離子，諸如納；金屬錯合物（例如，Zn蛋白質錯合物）；及/或非離子型界面活性齊卜諸如，麵⑧、 PLURONICS®或聚乙二醇（PEG)。抗體較佳包含介於5. mg/mL之fs1、較佳介於1〇_1〇()1^/〇1£之間之濃度的抗體。本文中之調配物亦可含有—種以上為所治療之特定適應症所需的活性化合物，較佳為具有彼此無不利影響之補充，活性的彼等化合物。舉例而言，除特定編括抗劑外，希望-種調配物中亦包括另一種抗體(例如結合Wnt蛋白上之不同抗原決定基、完全結合不同之Wnt蛋白的抗體）或結合一些其他標靶（諸如影響Wnt_中介性病症之發展的生長因子）的抗體。或者，或此外，該組合物可進一步包含化學治療劑、細胞毒性劑、細胞激素、生長抑·、抗激素劑及/或保心藥。該等分子適當地以有效實現預定目標之量組合存在。亦可將活性組分包封於例如藉由團聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊（例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚（甲基丙烯酸甲酯）微膠囊）中、包封於膠體藥物傳遞系統（例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊）中或包封於巨乳液中。該等技術揭示於 Remington: The Science and Practice of Pharamacy ^ ^ 20版，Gennaro, A.編（2000)中。用於活體内投藥之調配物必須為無菌的。此易經由無菌過濾膜過濾來實現。 124434.doc -95- 200819463 本文中之治療性組合物通常置放於具有無菌取藥孔的容器中’例如’具有可藉由皮下注射針頭刺穿之塞子的靜脈内、/谷液袋或小航。投藥途徑與已知方法一致，例如藉由靜脈内、腹膜内、腦内、肌内、眼内、動脈内或病灶内途徑注射或輸液、局部投藥或持續釋放系統。本發明之醫藥組合物之劑量及所要藥物濃度可視所預想之特定用途而改變。適當劑量或投藥途徑之確定係充分在普通醫師之技術範圍内。動物實驗為確定用於人類療法之有效Μ畺友：供可罪的指導。有效劑量之種間定量比例可依照以下文獻所擬定之原則執行：Mordenti，j·及chappell， he use of interspecies scaling in toxicokinetics，，，In

Toxicokinetics and New Drug Development，Yacobi 等人編，Pergamon Press，New Y〇rk 1989，第 42 96頁。當採用本發明之物質或分子之活體内投藥時，正常給藥篁視投藥途徑而定，可為每天每公斤哺乳動物體重約1〇 ng至高達100 mg或1〇〇 mg#上不等，較佳為每天每公斤約 1 gg至每天每公斤10 mg。有關特定劑量及傳遞方法之指導提供於文獻中’參見例如美國專利第4,657,76〇號、第 5,2〇6,344號或第5,225,212號。預期不同調配物對於不同治療化合物及不同病症有效，乾向一種器官或組織之投藥例如可需要以不同於傳遞至另_器官或組織之方式傳遞。若需要以具有適於治療任何需要投與物質或分子之疾病或病症之釋放特徵之調配物持續釋放性投與該物質或分 124434.doc •96- 200819463 子，則本發明涵蓋微膠囊化該物質或分子。持續釋放型製劑之適當實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質為成形物品之形式，例如薄膜或微膠囊。用於持續釋放之重組蛋白之微囊化已成功地用人類生長激素（rhGH)、干擾素-α，γ (rhIFN-α，rhIFN-γ)、介白素·2 及 MN rgpl20實施。Johnson等人，Nat. Med·，2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora 等人，8:755-758 (1990); Cleland，"Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems ， ’’ 於

Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach，

Powell及 Newman編，（Plenum Press: New York，1995)，第 439-462 頁；WO 97/03692、WO 96/40072、WO 96/07399 及美國專利第5,654,010號。聚-乳酸-共乙醇酸（PLGA)聚合物因其生物相容性及廣泛生物可降解性質而可用於研製該等蛋白質之持續釋放型調配物。PLGA、乳酸及乙醇酸之降解產物可在人體内快速清除。此外，該聚合物之可降解性視其分子量及組成而定可調整為數月至數年。Lewis，’’Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer，’’於：Μ· Chasin及 R· Langeic (編），Biodegradable Polymers as Drug Delivery (Marcel Dekker: New York，1990)，第 1-41 頁0 持續釋放型基質之其他實例包括聚酯、水凝膠（例如，聚（2-羥乙基-曱基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚乳酸交酯 124434.doc -97- 200819463 (美國專利第3,773,919號）、L·麩胺酸與γ乙基心麩胺酸酉旨之共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸乙醇酸共聚物（諸如LUPRON DEPOT®(由乳酸-乙醇酸共聚物與乙酸亮丙瑞林組成之可注射微球體》及聚小）經基丁酸。 D.Wnt-中介性病症之治療方法本發明提供治療罹患Wnt-中介性病症之哺乳動物中該病症的方法，該方法包含投與該哺乳動物治療有效量之Wnt 抬抗劑。在一實施例中，該病症為與Wnt信號轉導活性之表現異常（例如增強）相關的細胞增殖性病症。在另一實施例中’該病症係因Wnt蛋白之表現增強產生。在又一實施例中’遠細胞增殖性病症為癌症，諸如結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、與各種HSC相關性病症有關之癌症（諸如白血病及其他各種企液相關癌症），及與神經元增殖性病症相關之癌症’包括腦腫瘤，諸如神經膠質瘤、星形細胞瘤、腦膜瘤、許旺氏細胞瘤（Schwannomas)、垂體腫瘤、原始神經外胚層腫瘤（PNET)、髓母細胞瘤、顱咽管瘤及松果體區瘤。藉由投與Wnt拮抗劑治療細胞增殖性病症可使得以下方面中之一或多者之可觀測及/或可量測之減少或消失：癌、、、田胞數減y或癌細胞消失；腫瘤尺寸減小；癌細胞滲入外周器官内（包括癌症擴散入軟組織及骨内）受抑制（亦即在某種私度上減緩且較佳終止）；腫瘤轉移受抑制（亦即在某種耘度上減緩且較佳終止）；腫瘤生長在某種程度上受抑 124434.doc -98- 200819463 制；及/或一或多與特定癌症相關之症狀在某種程度上減輕；患病率及死亡率降低及生活品質問題提高。就Wnt拮抗劑可阻止生長且/或殺死現存癌細胞之程度而言，其可為細胞生長抑制劑及/或細胞毒性劑。患者亦可感知該等病徵或症狀之減輕。以上用於評價成功治療及疾病改善的參數易由醫師熟知之常規程序量測。癌症療法之功效例如可藉由評估疾病進展時間（TDP)及/或測定反應率（RR)來量測。轉移可如下測定：分階段測試及骨掃描及測試約含量及其他酶以判定是否擴散至骨。亦可進行CT掃描以尋查是否擴散至骨盆及該區域内之淋巴結。胸部X-射線及藉由已知方法量測肝酶含量分別用於尋查是否轉移至肺及肝。其他監控疾病之常規方法包括經直腸超音波掃描術（T R U S )及經直腸針刺活檢術 (TRNB) 〇在一特定實施例中，投與Wnt拮抗劑降低腫瘤負荷（例如減小癌症之尺寸或嚴重度）。在又一特定實施例中，投與 Wnt拮抗劑殺死癌症。 E·抑制細胞中Wnt信號轉導之方法本發明提供抑制細胞中Wnt信號轉導的方法，其包含使該細胞接觸有效量之Wnt拮抗劑。在一實施例中，該細胞包含於哺乳動物（較佳為人類）中且投與之量為治療有效篁。在又一實施例中，Wnt信號轉導之抑制進一步引起細胞生長之抑制。在另一實施例中，該細胞為癌細胞。細胞増殖之抑制係使用熟習此項技術者已知之方法量 124434.doc -99- 200819463 測。舉例而言，適於量測細胞增殖之檢定為CellTiter-GloTM 螢光細胞生活力檢定，其係購自Promega (Madison，WI)。彼檢定係基於量化所存在之ATP來測定培養物中活細胞之數目，ATP為代謝活性細胞之指示。參見Crouch等人， (1993) ·/. /所m"ο/· Me160:81-88 ;美國專利第 6602677 號。該檢定可以96孔或3 84孔格式執行，以使得其適於自動化高產量筛檢（HTS)。參見Cree等人（1995) dW/Cawer 6:398-404。檢定程序包括將單一試劑（CellTiter-Glo®試劑）直接添加至培養細胞中。此使得細胞溶解且產生由螢光素酶反應產生之螢光信號。螢光信號與所存在之 ATP之量成正比，而ATP之量與存在於培養物中之活細胞之數目直接成正比。資料可由光度計或CCD相機成像裝置記錄。螢光輸出量表示為相對光單位（RLU)。 F.調節Wnt靶基因表現之方法本發明提供調節以Wnt信號轉導活化或過度為特徵之細胞中Wnt靶基因表現之方法，該方法包含使該細胞接觸有效量之Wnt拮抗劑。在一實施例中，wnt靶基因因Wnt信號轉導而被過度表現，且與Wnt拮抗劑接觸之結果減少Wnt 靶基因之表現。在另一實施例中，Wnt靶基因係選自由以下蛋白質組成之群·· Axin2、APCDD1、Gadl、Saxl、c-myc、細胞週期素 di (CyCiin Dl)、PPARdelta、胃泌素 (gastrin)、凝聚素（clusterin)、存活素（survivin)、環加氧轉、fra-l、骨橋蛋白（osteopontin)、uPAR、緊密連接蛋白-1 (claudin-1)、CD44、MMP-7/9/11/14/26、IGFBP-4、 124434.doc -100- 200819463

Met、BMP4、sox-9、組蛋白脫乙醯基酶2、VEGF。在又一實施例中，Wnt靶基因因Wnt信號轉導而被表現不足，且與Wnt拮抗劑接觸之結果恢復Wnt靶基因之表現。在另一實施例中，Wnt靶基因係選自由以下蛋白質組成之群： Leftyl、Lefty2、sFRPl、Fzd5、fas抗原、卡斯蛋白酶 3 (caspase 3)、整合素 β7 (integrin β7)、a e整合素、hath 1、脂肪酸結合蛋白2、muc-2、kruppel樣因子-4、碳酸酐酶-11、EphrinB 1、EphB2R、EphB3R、muc-3、組織相容性 2、Q區基因座1、β2-微球蛋白。靶基因之表現係使用熟習此項技術者已知之方法（包括本文中所述及下文實例中所述之彼等方法）測定。 G. 偵測Wnt蛋白存在之方法本發明提供偵測樣本中Wnt蛋白存在之方法，其包含使樣本接觸Wnt拮抗劑，其中複合物之存在或Wnt拮抗劑與 Wnt蛋白之間結合之程度表明Wnt蛋白及/或Wnt信號轉導之存在。在一實施例中，該方法進一步包含判定Wnt信號轉導量是否異常。在該實施例中，將該樣本中之Wnt蛋白質結合量與其中Wnt蛋白表現及/或Wnt信號轉導已知在生理學上正常之第二樣本中之結合量加以比較。可疑樣本中與第二樣本相比高於或低於生理學上正常之樣本之結合量表明Wnt信號轉導異常。在另一實施例中，Wnt信號轉導或異常Wnt信號轉導之存在表明存在Wnt-中介性病症，諸如癌症。 H. Wnt途徑及與其相關之病症 124434.doc -101 - 200819463 1. Wnt信號轉導途徑：

Wnt信號轉導途徑為異常複雜的信號轉導過程，其涉及在途徑中施加不同程度之控制的多種蛋白質。對途徑之此多級緊密調控表明其在細胞生物學中之重要性。儘管調節機制複雜，但途徑之初始信號係由Wnt與Frizzled (Frz)受體之結合產生。有效信號進一步需要存在LRP (LDL受體相關蛋白）類別之另一單程跨膜分子，尤其LRP 5及LRP 6。Wnt可進一步與LRP結合以與Frizzled形成三聚體複合物。LRP之細胞質尾轉而又與另一下游組分Axin相互作用。與Frizzled直接相互作用的細胞質組分Dishevelled亦可與Axin直接相互作用，從而形成Frizzled、LRP、Dsh及 Axin之四元複合物。與Axin之此相互作用使β-索烴素自”降解複合物下文論述）中釋放，以供Wnt信號轉導途徑中隨後之下游活性所用。在細胞外，Wnt信號轉導受到可與Wnt結合、由此將其與其受體隔開的各種蛋白質抑制。此類蛋白質包括分泌型 Frizzled相關蛋白（sFRPs，Jones等人，2002; 24: 811-820)及 Wnt 抑制因子-1 (WIF-1，Hsieh，J.C·等人， TVaiMre 1999; 398: 431-436)。在人類中，sFRP 家族由五個成負（例如sFRP-J、sFRP-2.....組成，該等成員各自含有與Frz受體之CRD共有30-50%序列同源性的半胱胺酸富集域（CRD)。（Melkonyan，H.S· jcd 版 1997; 94: 13 63 6-13 641)。咸信 sFRP 可與 Frz 受體形成功能抑制性複合物，且因此為天然拮抗劑，但生 124434.doc -102- 200819463 物學複雜，且在一些情況下sFRP甚至可起作用以激發Wnt 活性。（Uren，Α·等人，/· 5b/· Chem. 2000; 275: 4374-4382) 〇另一類別之細胞外Wnt抑制劑為Dickkopf (Dkk)。[Brott， B.K.^ A ^ Mol Cell Biol. 2002; 22: 6100-6110 ； Fedi? P. # A ^ J. Biol. Chem. 1999; 274: 19465-19472]。Dkk家族中之三個成員（例如Dkk-1、Dkk-2及Dkk-4)可經由使典型途徑之主要組分細胞表面受體LRP-5及LRP-6失活來拮抗Wnt 信號轉導。[Mao, J_H·等人，Λ^/· Ce// 2001; 7: 801-809 ; Pinson，Κ·Ι·等人，2000; 407: 535-538]。Dkk 與 LRP5/6 及單程跨膜受體 Kremen 1 (Krm_ 1)或 Kremen 2 (Krm-2)形成三元複合物[Mao等人，Gew 2003; 302: 179-183 ； Mao^ A ^ Nature 2002; 417: 664-667 ; Mao 等人， 2001; 411: 321-325]。此複合物轉而又經歷細胞内呑作用，由此將LRP5/6受體自細胞表面移除。因此，Dkk可選擇性拮抗典型Wnt信號轉導而不影響非典型信號轉導。典型Wnt信號轉導活化之標誌為高含量之蛋白質β-索烴素。β-索烴素經組成性產生且以單體蛋白質之彙集形式存在於細胞質中。[Papkoff，J.等人，Mo/. CW/ 5ζ·6>/· 1996; 16: 2128-2134]。控制β-索烴素之細胞質含量的主要機制係在募集為較大多蛋白質複合物Γ降解複合物Ί後經由直接物理降解。Axin提供此複合物之主要骨架，且提供β-索烴素、腺瘤性結腸息肉（APC)、糖原合成酶激酶3β (GSK3p)、酪蛋白激酶Ια (CKIa)及蛋白質磷酸酶2Α (ΡΡ2Α)之結合位 124434.doc -103 - 200819463 點[Hinoi，Τ·等人，J.万化/· C/zew. 2000; 275: 34399-34406 ; Ikeda 等人，2000; 19: 537-545 ;

Yamamoto等人，J. CT^m. 1999; 274: 10681-10684 ;

Kishida等人，J. 5/o/· Chem. 1998; 273: 10823-10826 ； Ikeda等人，J· 1998; 17: 1371-1384]。形成後，該複合物因Axin及APC以及PP2A之經介導之磷酸化而得以穩定。GSK3p接著使β-索烴素磷酸化，由此使其被含有 β·轉導素（β-transducin)重複之蛋白質（β-TrCP)識別，從而使其成為泛素化及蛋白酶體降解之目標。[Aberle等人， EMBO J. 1997; 16: 3797-804 ; Latres 等人，Owcogene 1999; 18: 849-54 ; Liu等人，Pr%· 心ζ·. 1999; 96: 6273-8]。儘管與Axin/APC/GSK3p之複合為β-索烴素降解之主要機制，但已展示涉及由與Siah_l及APC之C-末端複合所誘導之泛素化的替代降解途徑。[Matsuzawa等人，Mo/. Ce// 2001; 7: 915-926 ; Liu等人，Mo/· Ce// 2001; 7: 927-936]。除其作為轉錄因子之作用外，β-索烴素進一步牵涉於細胞黏附中。[Nelson等人，2004; 303: 1483-1487 ; Ilyas等人，J. 1997; 182: 128-137]。β_索烴素可在稱為黏附連接之細胞間接觸之細胞表面部位發現，在該處其與Ε-辦黏素（E-cadherin)及α-索烴素複合。因此，Ε-弼黏素表現之任何增加會將β-索烴素引向細胞膜，由此消耗細胞質含量，且轉而抑制Wnt信號轉導。此外，Ε·鈣黏素-索烴素複合物之分解可增加游離β-索烴素之細胞質含量，由 124434.doc -104- 200819463 此激發轉錄活性。[Nelson等人，同上文]。因此’藉由釋放β_索烴素活化細胞表面受體cRON、表皮生長因子受體 (EGFR)及c-ErbB2亦可激發典型Wnt信號轉導。其他信號轉導途徑可活化或促進Wnt信號轉導之效應。舉例而言，整合素信號轉導可引起β-索烴素之細胞核轉運[Eger等人， 2004; 23: 2672-2680]，而經由胰島素樣生長因子（IGF)之信號轉導可藉由”吸收”可用GSK3P(由此阻止形成·’降解複合物π)來活化Wnt信號轉導。在典型信號轉導中，起始步驟包括Wnt與Frz在LRP5/6存在下之結合。[Mao 等人，Mo/· Ce// 2001; 7: 801-809 ; Pinson等人，2000; 407: 535-538]。此三聚體複合物之形成具有兩種下游結果。首先為Dishevelled (Dsh)招募至細胞表面及其經酪蛋白激酶Ιε (CIs)磷酸化[Kishida等人，乂 2001; 276: 33147-33155]。經磷酸化之

Dsh可與Frat 1及GSK30形成複合物，其轉而可抑制GSK3P 之活性。其次，Wnt/Frz/LRP5/6三元複合物促使Axin受 LRP5/6介導之降解。此淨效應為負責磷酸化β-索烴素之降解複合物去穩定。缺少磷酸化時，β-索烴素不經泛素化，由此逃避降解，從而增加細胞内含量及可用性以便遷移至細胞核。 β-索烴素轉運至細胞核之方式尚不完全瞭解，但牵涉與細胞核轉運蛋白APC之相互作用[Rosin-Arbesfeld等人， 2000; 406: 1009-1012 ; Neufeld等人，7V%· Λ^"· Acad. Sci. USA 2000; 97: 12085-12090] ^pygopusSl 124434.doc -105- 200819463

Bcl9"egless ° [Townsky 蓴尺，Nature Cell Biol. 2QQ4.，6·. 626-633] 0 β-索煃素一旦進入細胞核便置換轉錄抑制子Groucho以與T-細胞特異性轉錄因子/淋巴樣增強子結合因子_ i (TCF/LEF)DNA結合蛋白結合。在未由β_索煙素置換之情況下，TCF/LEF與Groucho複合以抑制Wnt，，靶基因”之表現。GVoz/c/zo之抑制作用由與各種組蛋白脫乙醯基酶 (HDAC)之相互作用進一步介導，咸信此使得DNA轉向轉錄活化。[Cavallo等人，iVaiwre 1998; 395: 604-8 ; Chen等人，Gww Dev. 1999; 13: 2218-30]。TCF轉錄抑制子複合物轉化成轉錄活化複合物進一步包括組蛋白乙醯化酶（諸如Creb結合蛋白（CBP)/p300)以及其他活化因子（諸如Brg-1)之募集。[Takemaru等人，CW/ 2000; 149: 249- 54 ; Barker 等人，Ce// 2002; 109: 47-60 ; Brantjes 等人， C/zem. 2002; 383: 255-261 ; Roose等人，万/<9尸/zw Career 1999; 1424: M23_M37]。β_ 索烴素-TCF複合物與染色質之間的相互作用亦可由Zeg/ew 及户介導。Kramps等人，Ce" 2002; 109: 47-60 ; Thompson 等人，Nat. Cell Biol. 2002; 4: 367-73 ； Parker等人，⑼i 2002; 129: 2565-76 o 典型Wnt信號轉導途徑處於M斷開"或非活性狀態及處於’’導通”或活性狀態之簡要概述描述於圖1中。 2·與Wnt信號轉導活性相關之病症：

Wnt信號轉導途徑之失調可由編碼各種Wnt信號轉導途 124434.doc -106- 200819463 徑組分之基因之體細胞突變導致。舉例而言，異常Wnt信號轉導活性與以下病症中之Wnt配體過度表現相關：非小細胞肺癌（NSCLC)[You等人，2004; 23: 6170-6174]、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)[Lu等人，iVoc. Λ^ί/· 心以/. 5W· tASW 2004; 101: 3118-3123]、胃癌[Kim等人，五jc/?· Oncol· 2003; 25: 211-215 ; Saitoh 等人，/狀 J· Mo/· Mei 2002; 9: 515-519]、頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC)[Rhee等人， ⑽ 2002; 21: 6598-6605]、結腸直腸癌[Holcombe 等 A ^ J. Clin. PathoUMol. Pathol. 2002; 55: 220-226] > 卵巢癌[Ricken等人，Endocrinology 2002; 143: 2741-2749]、基底細胞癌（BCC)[Lo Muzio等人，2002; 22: 565-576]及乳癌。此外，各種Wnt配體調控分子（諸如sFRP 及WIF-1)之減少與以下病症相關：乳癌[Klopocki等人， Int. J. Oncol· 2004; 25: 641-649 ; Ugolini等人，Oncogene 2001; 20: 5810-5817 ; Wissmann等人，J. Ραί/20/· 2003; 201: 204-212]、膀胱癌[Stoehr等人，Ιαό /ηναί. 2004; 84: 465-478 ; Wissmann等人，同上文]、間皮瘤[Lee等人， 2004; 23: 6672-6676]、結腸直腸癌[Suzuki 等 k ’ Nature 2004; 36: 417-422 ; Kim 等人，A/W. C⑽77zer· 2002; 1: 1355-1359; Caldwell等人，Cwcer 2004; 64: 883-888]、前列腺癌[Wissman 等人，同上文]、NSCLC [Mazieres等人，C⑽ar 及认 2004; 64: 4717· 4720]及肺癌[Wissman等人，同上文]。用本發明之Wnt拮抗劑分子拮抗Wnt信號轉導預期可治療性治療該等癌症。 124434.doc -107- 200819463 由Frz-LRP受體複合物之各種組分過度表現引起的持續異常Wnt信號轉導亦與某些癌症相關。舉例而言，LRP5過度表現與骨肉瘤相關[Hoang等人，/从J. 2004; 109: 106-111]，而Frz過度表現與以下癌症相關，諸如前列腺癌[Wissmann等人，同上文]、HNSCC [Rhee等人，〇似叹e⑽ 2002; 21: 6598-6605]、結腸直腸癌[Holcombe等人’同上文]、卵巢癌[Wissman等人，同上文]、食道癌 [Tanaka等人，1998; 95: 10164-10169]及胃癌[Kirikoshi等人，/从 J. 〇加0/· 2001; 19: 111-115]。此外，諸如Dishevelled之Wnt信號轉導途徑組分之過度表現與以下癌症相關，諸如前列腺癌[Wissman等人，同上文]、乳癌[Nagahata等人，Career Scz·· 2003; 94: 515-518]、間皮瘤[Uematsu等人，Cwcer 心心 2003; 63: 4547-4551]及子宮頸癌[Okino等人，〇加〇/.及叩.2003;10:1219-1223]。Frat-Ι過度表現與諸如膜腺癌、食道癌、子宮頸癌、乳癌及胃癌之癌症相關。[Saitoh等人，Τ>2ί· «/· 2002; 20: 785-789 ; Saitoh f A ^ Int.J. Oncol. 2001; 19: 3 11-3 15]。Axin功能缺失（LOF)突變與以下癌症相關：肝細胞癌[Satoh 等人，2000; 24: 245-250 ; Taniguchi等人，似 2002; 21: 4863-4871]及髓母細胞瘤[Dahmen 等人，Cawcer 2001; 61: 7039-7043 ;

Yokota等人· ，/πί· J. Cancer 2002; 101: 198-201]。用本發明之Wnt拮抗劑阻斷Wnt-Frz相互作用預期可舒緩與Frz或 LRP之過度表現相關的癌症。 124434.doc -108 - 200819463 總之，多種癌症與經由破壞’’降解複合物π活化β-索烴素 (諸如β-索烴素之功能活化突變或APC之功能缺失突變）相關。β-索烴素降解之減少導致細胞中產生更多的功能性β-索烴素，此轉而導致靶基因之轉錄增強，造成細胞增殖異常。舉例而言，編碼β·索烴素之基因（亦即CTNNB1)之突變與以下癌症相關，諸如胃癌[Clements等人，Cwcer 2002; 62: 3503-3506 ; Park 等人，Cancer Res. 1999; 59: 4257-4260]、結腸直腸癌[Morin等人，1997; 275: 1787-1790 ; Ilyas 等人、Proc· Natl Acad. ScL USA 1997; 94: 10330-10334]、腸癌[Fujimori等人，Λα. 2001; 61: 6656-6659]、印巢癌[Sunaga 等人，

Cancer 2001; 30: 316-321]、肺腺癌[Sunaga 等人，同上文]、子宮内膜癌[Fukuchi等人，C⑽cer及以· 1998; 58: 3526-3528 ; Kobayashi等人，J· Cawcer 1999; 90: 55-59 ; Mirabelli_Primdahl等人，1999; 59: 3 346-3351]、肝細胞癌等人，同上文；Wong等人， C⑽cer 2001; 92: 136_145]、肝母細胞瘤[Koch 等人， C⑽及以· 1999; 59: 269-273]、髓母細胞瘤[Koch等人， /W. «/· Ca/icer 2001; 93: 445-449]、胰腺癌[Abraham等人， dm. J· Ραί/ζο/. 2002; 160: 1361-1369]、甲狀腺癌[Garcia-Rostan 等人，Cancer 1999; 59: 1811-1815 ; Garcia-

Rostan等人，dm· J· Paih/· 2001; 158: 987-996]、前列腺癌[Chesire 等人，2000; 45: 323-334 ; Voeller 等人，C抓1998; 58: 2520-2523]、黑色素瘤 124434.doc -109- 200819463 [Reifenberger等人，T>2，· J. Cancer 2002; 100: 549-556]、毛母質瘤[Chan等人，iVWwre Ge似Λ 1999; 21: 410-413]、威爾姆氏瘤（Wilms’ tumor)[Koesters等人，J. Ραί/ζο/· 2003; 199: 68-76]、胰腺母細胞瘤[Abraham等人，dm. J· ί/· 2001; 159: 1619-1627]、脂肪肉瘤[Sakamoto 等人，3rd Pathol. Lab Med. 2002; 126: 1071-1078] > 青少年鼻咽血管纖維瘤[Abraham等人，dw· J. Pwk/. 2001; 158: 1073-1078]、硬纖維瘤[Tejpar 等人，似 1999; 18: 6615· 6620 ; Miyoshi等人，Oncol· Res· 1998; 10: 591-594]、骨膜肉瘤[Saito等人，J. Ραί/ζο/· 2000; 192: 342-350]。同時功能缺失突變與以下癌症相關，諸如結腸直腸癌[Fearon等 A 5 Cell 1990; 61: 759-767 ; Rowan等人，/Voc. Natl Acad· Sci· 2000; 97: 3352-3357]、黑色素瘤[Reifenberger 等 A 5 Int. J· Cancer 2002; 100: 549-556 ; Rubinfeld等人， 1997; 275: 1790-1792]、髓母細胞瘤[Koch等人， J· C⑽cer 2001; 93: 445-449 ; Huang 等人，dm. J. PaMo/· 2000; 156: 433-437]及硬纖維瘤[Tejpar 等人， ⑽ 1999; 18: 6615-6620 ; Alman等人，dm /· Ραί/2(9/· 1997; ΜΙ: 329-334]。由β-索烴素活性異常進而活化Wnt途徑導致的癌症適合用本發明之Wnt拮抗劑治療。 3. Wnt信號轉導及癌發生

Wnt途徑具有很多轉錄端點或靶基因。其中大部分對某些類型具有特異性，此常見於發育性信號轉導途徑中。此符合經由細胞外信號之基因控制之基本機制，其中由細胞 124434.doc -110- 200819463 而非信號決定反應之性質。然而，除細胞類型特異性基因外，Wnt信號轉導亦控制受到更廣泛誘導之基因，包括 Wnt#號轉導途徑之組分及最可能由Wnt-β-索烴素-TCF級聯活化的基因。正常細胞生理學如何轉變成以贅生性改變為特徵之生理學已成為深入研究之目標，以試圖更透徹瞭解癌症產生之基礎事件。因此β_索烴素對靶基因之不當活化可使有機體產生疾病狀態，即便靶基因本身可不存在任何體細胞突 I。Ilyas已對經由大部分惡性腫瘤所得到之表現型之 Hanahan及Weinberg清單進行修改，包括，，不當幹細胞表現型/無限複製可能型"、”逃避細胞凋亡"、"組織侵入及轉移、生長信號之自足"、"對生長抑制劑之不敏感性"、，，缺乏終末分化”、”逃避免疫反應，，及”持續血管生成"。Ilyas，乂 2005; 205·· 130-144; Hanahan及 Weinberg，心// 2000，100: 57-70。如微陣列分析所展示，對由Wnt信號轉導所調節之基因（包括β_索烴素或表現改變之靶基因）的分析證明，因Wnt信號轉導異常所導致之擾動可直接或經由對靶基因之作用賦予該等幾乎所有”贅生性表現型"。nyas， M·’ J· 2005; 205·· 130_144。Wnt信號轉導之例示性標乾之清單提供於表丨中。受到上調之基因標靶以粗體呈見而又到下調之基因標靶以斜體呈現。因Wnt信號轉導活化及/或過量導致之該等靶基因之異常表現可經由施用本發明之Wnt拮抗劑加以醫冶。 124434.doc -111 - 200819463 表1

Wnt靶基因及表現型結果

c-myc (1)

Cyclin D1 (2) PPARdelta (3)

Gastrin (4)

Fas抗原（5) 卡斯蛋白酶3 (6) 凝聚素（7) 存活素（8) 環加氧酶-2 (9) Fra-l(lO) 骨橋蛋白（7) uPAR (10) 緊密連接蛋白-1(11) CD44 (12) MMP-7/9/11/14/26 (7) IGFBP-4 (7)

Met (13) 整合责ΰ7 (5) a e整合責 BMP4 (14)-

Hath! (15)- 脂肪酸結合蛋白2 (7) Muc2 (16) kruppel樣因子4 (16) 破酸酐酶Π EphrmBJ (1 Muc3 (7).

Sox9 (17) 組蛋白脫乙醯基醻2 (7) 組織相容性2，Q區基因座1 β2-微球蛋白（7) VEGF (18) 癌症日益被視為”幹細胞”疾病（Taipale等人，Nature -112- 124434.doc 200819463 2001 ; 411·· 349-54)，亦即幹細胞之不當活化及/或、維持。業已證明Wnt信號轉導對幹細胞之維持必不可少[He等人， iVa/wre Genei. 2004; 36: 1117-1121 ; Reya等人， 2003; 423: 409-414 ； Willert^ A ^ Nature 2003; 423: 448-452]。TCF4在腸内為β-索烴素之主要細胞核結合因子，且 TCF4敲除小鼠不能在小腸中產生幹細胞進一步支持典型 Wnt信號轉導在幹細胞維持中之作用。[Korinek等人， Genet· 1998; 19: 379-83 ; Pinto等人，Genes Dev, 2003; 17: 1709-13 ； Kuhnertf A ^ Proc. Natl. Acad. Sc· USA 2004; 101: 66-71] 〇

Wnt信號轉導對多種生物過程之作用可由基質金屬蛋白酶基因（MMP)加以說明。業已證明MMP7、MMP14及 MMP26可指向β-索烴素之標乾[Marchenko等人，Int· J· Ce"价〇/· 2004; 36: 942-956; Takahashi等人， 2002; 21: 5861-5867 ; Brabletz 等人，dm· J· 1999; 155: 1033-1038]，而其他 MMP 則被發現係由腸腺瘤直接表現[Paoni等人，2003; 15: 228-235]。MMP為分解基質膠原蛋白從而使腫瘤細胞獲得 "組織侵入及轉移”表現型的蛋白水解酶。該酶活性亦容許潛在生長因子釋放於基質中，該等潛在生長因子與腫瘤細胞本身所分泌之其他生長因子一同將會促成’’生長信號之自足’’。[Coussens 等人，Science 2002; 295: 2387-2392 ; Egeblad等人，TVaiwre i?ev. 2002; 2: 161-174] 〇 MMP亦可對骨橋蛋白（osteopontin)(二級Wnt誘導標把）作用 124434.doc -113- 200819463 [Paoni等人，同上文]，以釋放與血管内皮生長因子 (VEGF)(P-索烴素之直接標靶）一同促成’’持續血管生成’’之特徵的片段。[Zhang等人，C抓“r 及以· 2001; 61: 6050-6054 ; Agnihotri等人，J· 2001; 276: 28261-28267]。儘管Wnt信號轉導途徑可在配體受體相互作用之下游層級上活化，但有力證據表明細胞外配體-受體相互作用組分之抑制可有效降低致瘤性，即使啟始Wnt信號轉導之事件可發生於下游。舉例而言，Ilyas在近期回顧中報導，幾種結腸直腸癌細胞株中Wnt信號之抑制使得致瘤性降低。 [Ilyas，同上文]。此外，將無效frizzled受體（Frz7細胞外域）轉染至癌細胞株（SK-CO-1)内可恢復正常β_索烴素表現型。此細胞株因同型結合的APC_/_突變而具有活性Wnt信號轉導。此外，該等細胞在於活體内傳遞時亦不會顯現腫瘤形成。Vincan等人，2005; 73: 142-153。此證明在細胞外層級上抑制Wnt信號轉導可下調因活化下游細胞内Wnt信號轉導途徑組分所產生的Wnt信號轉導。此進一步建議，抑制Wnt-Frz相互作用之抑制劑，諸如本發明之Wnt拮抗劑，具有針對任何Wnt-中介性病症之治療益處，而此與Wnt信號轉導經活化之特定方式無關。 4·結腸癌中之異常Wnt信號轉導：起初發現，Wnt信號轉導組分APC中之缺陷為遺傳性癌症症候群家族性腺瘤息肉病（FAP)之關健。繼承一缺陷型 APC等位基因之FAP患者在其生命早期長出大量的結腸息肉或腺瘤。該等息肉以其中第二APC等位基因失活之上皮 124434.doc -114- 200819463 細胞之純系贅疲之形式產生。該等FAP腺瘤之累積效應如同其他致癌基因或腫瘤抑制基因（諸如K-Ras、p53及 Smad4)中之突變之較有序或無序累積一樣明顯，不可避免地導致腺癌之出現。此外，APC之損失亦發生於大部分偶發性結腸直腸癌中。Kinzler等人，Ce// 87: 159-170 (1996)。藉由使β-索烴素穩定化且最終自細胞核轉運β-索烴素使APC突變失活，且使Wnt信號轉導突變失活，從而轉化上皮細胞。有趣的是，含有串接之TCF結合位點（諸如 pTOPFLASH)的報導質體（通常僅在Wnt信號轉導後轉錄）係經由β-索烴素/TCF-4轉錄複合物之組成性活化而於APC突變型癌細胞中不當轉錄。在其中APC未突變之結腸直腸癌之其他實例中，骨架蛋白質Axin-2係經突變[Liu等人， Gwer 26: 146_147 (2000)]或 β-索烴素係經突變以便移除Ν-末端Ser/Thr破壞基元。[Morin等人，aSc/mm 275: 1787_ 1790 (1997)。因此，結腸直腸癌不僅與APC缺陷有關，而且亦與β-索烴素/TCF-4轉錄活化之不當持續有關。已進一步報導，在結腸直腸癌中，TCF-4突變導致同一靶基因活化（如由微陣列分析所展示），此如經由隱窩幹細胞及祖細胞中之缺陷型APC表現所觀測。Van de Wetering等人，Ce// 111: 241-250 (2002)。一旦Wnt級聯被活化，八卩(^"腺瘤細胞則無限期維持其祖細胞狀況。因此，Wnt信號轉導之活化可能為結腸直腸癌之癌發生的必需前兆，且Wnt信號轉導之抑制可為治療及/或預防此病症之發作的有效方式。 124434.doc -115- 200819463 5·造血幹細胞中之Wnt信號轉導造血幹細胞在由多潛能造血幹細胞（HSC)發展為譜系定型祖細胞之過程中形成循環系統之成熟血細胞。亦顯而易見，Wnt信號轉導有助於HSC之自我更新及維持，且功能異常之Wnt信號轉導導致多種起因於HSC之病症，諸如白血病及其他多種血液相關癌症。Reya等人，434: 843-850 (2005) ; Baba 等人，23: 599-609 (2005); Jamieson等人 U叹/· J· 351(7): 657-667 (2004)。由於幹細胞轉化成定型骨髓祖細胞，因此Wnt信號轉導通常減少。Reya等人，423: 409-414 (2003)。不僅Wnt配體本身由HSC產生，而且Wnt信號轉導亦具有活性，從而提示為自分泌或副分泌調控。Rattis等人， Curr. Opin. HematoL 11: 88-94 (2004) i Reya^ A » Nature 423: 409-414 (2003)。此外，β·索烴素與Wnt3a促進鼠類 HSC及祖細胞之自我更新，而將Wnt-5 A施用於人類造血祖細胞則促進活體外未分化祖細胞之擴增。Reya等人，同上文；Willert 等人，Nature 423: 448-452 (2003) ； Van Den Berg等人，92: 3189-3202 (1998)。顯然，除HSC外，胚胎幹細胞、表皮幹細胞及上皮幹細胞亦回應或依賴於Wnt信號轉導以維持未分化之增殖狀態。Willert等人，同上文；Korinek等人，iVai· 19: 379-383 (1998) ； Sato ^ A J Nat. Med· 10: 55-63 (2004)； Gat等人，Ce// 95: 605-614 (1998) ; Zhu等人， 126: 2285-2298 (1999)。因此，用本發明之Wnt拮抗劑抑制 124434.doc •116- 200819463

Wnt信號轉導可為治療由造血功能障礙導致之病症之治療劑’該等病症諸如白血病及多種血液相關癌症，諸如急性、慢性淋巴性白血病及骨髓性白血病、骨髓發育不良症候群及脊髓增殖性病症。該等病症包括骨髓瘤、淋巴瘤 (例如霍奇金氏（Hodgkin’s)及非霍奇金氏（non_Hodgkin，s)淋巴瘤）、慢性及非進行性貧血、進行性及症狀性血細胞不足、真性紅細胞增多症、實質性或原發性血小板增多症、特發性骨髓纖維化、慢性骨髓單核細胞性白血病 (CMML)、套細胞淋巴瘤、皮膚丁_細胞淋巴瘤、瓦爾登斯特偷巨球蛋白血症（Waldenstrom macroglobinemia)。 6·白血病中之Wnt信號轉導

Wnt信號轉導途徑之活化失調為白血病形成之前兆。 Reya等人，同上文。存在的實驗證據支持骨髓系與淋巴系之致癌生長依賴於Wnt信號轉導。Wnt信號轉導牽涉於骨髓性白血病之慢性形式與急性形式之調控中。慢性骨髓性白血病患者之粒細胞-巨嗤細胞祖細胞（GMP)以及對療法具有抗性之患者之急性轉化細胞呈現活化之Wnt信號轉導。 Jamieson等人，同上文。此外，經由Αχίη之異位表現來抑制β-索烴素可降低活體外白血病細胞之再殖能力，此表明就生長及更新而言，慢性骨髓性白血病前驅形式依賴於 Wnt信號轉導。又，Wnt過度表現使得GMP獲得類似於幹細胞之長期自我更新之性質。jamies〇n等人，同上文。此發現進一步支持如下假設：Wnt信號轉導為血液譜系之正常發育所必需，然而Wnt信號轉導異常導致祖細胞轉化。 124434.doc •117- 200819463 本發明之Wnt拮抗劑將適用於治療該等類型之白血病。近期研究亦提示淋巴瘤形成亦可受Wnt信號轉導之影響。Wnt_16在具有E2A-PbX易位的前B-細胞白血病細胞株中過度表現，表明自分泌Wnt活性可有助於腫瘤生成。 McWhirter 等人，Proc. Natl· Acad, Sci. USA 96: 11464-11469 (1999)。Wnt信號轉導對正常祖B-細胞之生長及存活的作用進一步支持此觀念。Reya等人，/mm·/" 13: 1 5-24 (2000) ； Ranheim# A ^ Blood 105: 2487-2494 (2005)。亦提出自分泌對Wnt之依賴性以便調控多發性骨髓瘤（一種最終分化之B-細胞之癌症）之生長。Derksen 等人’/Voc· 101: 6122-6127 (2004)。亦發現原發性骨髓瘤及骨髓瘤細胞株穩定表現（亦即不依賴於降解複合物）。儘管Wnt信號轉導組分中不存在突變，但若干組分 (包括Wnt-5A及Wnt_ 10B)之過度表現提示腫瘤依賴性及癌症自我更新不一定取決於出現於Wnt信號轉導途徑組分中之突變，而是僅取決於途徑本身之組成性活化。Reya等人，同上文。經由結合過度表現之Wnt，本發明之Wnt抬抗劑可為治療B _細胞白血病的有效治療劑。自更新多能幹細胞轉變成骨髓祖細胞伴隨Wnt信號轉導之下調。Reya等人，iVaiz/re 423: 409-414 (2003)。類似地，β-索烴素在淋巴祖細胞中之穩定表現恢復多種分化選擇，儘管該等細胞缺乏通常與任一細胞類型相關的標記。Baba等人，23: 599-609 (2005) 〇因此，其強烈表明抑制 Wnt信號轉導之本發明之Wnt拮抗劑可為治療白血病（諸如 124434.doc -118- 200819463 骨髓性白血病及淋巴細胞性白血病，包括急性及慢性骨髓性白血病以及急性及慢性淋巴細胞性白血病）的有效治療劑。 7·神經病症中之異常Wnt信號轉導亦已觀測到，經由β-索烴素活化Wnt信號轉導可增強神經祖細胞之循環及擴增且該信號轉導之缺失可導致祖細胞區室缺失。Chenn等人，297: 365-369 (2002); Zechner等人，5沁/· 258: 406-418 (2003)。正如 Wnt信號轉導之正常活化可促進神經元幹細胞之自我更新，異常 Wnt途徑活化在神經系統中可具有致瘤性。支持此結論之實驗證據為發現髓母細胞瘤（一種兒科小腦之腦腫瘤）在β-索烴素與Axin中含有突變，從而表明髓母細胞瘤係由回應失控之Wnt信號轉導而變為轉化型之原始祖細胞產生。 Zurawel 等人，58: 896-899 (1998) ; Dahmen 等人，Cancer 及已义 61: 7039-7043 (2001) ; Baeza等人 Oncogene 22: 632-636 (2003)。因此，其強烈表明抑制Wnt信號轉導之本發明之Wnt拮抗劑可為治療多種神經元增殖性病症的有效治療劑，該等病症包括腦腫瘤，諸如神經膠質瘤、星形細胞瘤、腦膜瘤、許旺氏細胞瘤、垂體瘤、原始神經外胚層腫瘤（PNET)、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、松果體區腫瘤及非癌性多發性神經纖維瘤。 8·乳癌中之異常Wnt信號轉導在其中幹細胞尚有待確定性分離的乳腺組織中，藉由對發展乳腺腫瘤之Wnt轉殖基因小鼠之研究說明Wnt對祖細 124434.doc -119- 200819463 胞命運或維持的控制作用。該等腫瘤具有增加之具有幹細胞及祖細胞性f之個別細胞的頻率，與過度表現其他致癌基因之小鼠之腫瘤形成明顯對比。[Liu等人，細, 心W· &Z·· 101: 4158_4163 (2〇〇4) ; u等人折％制·」^/· —·· _ 100: 15853七858 (2003)]。此說明

Wnt途徑在其使幹細胞及祖細胞成為轉化目標之能力方面可為獨特的且提示在正常乳房上皮之自我更新中之關健作用。因此抑制Wnt信號轉導之本發明之Wnt拮抗劑可能為治療乳癌的有效治療劑。圖32說明人類乳癌中之活性Wnt信號轉導。圖32八展示最初報導於Wong等人，J· path〇l· 196: 145 (2002)中之正常 (A-1)、低度（Α·2)及高度（Α·3)人類乳房腫瘤中之wnt」表現（如活體外雜交所展示）。圖32B展示乳癌患者中p_索烴素之細胞核（B-1)及細胞質（B-2)定位（如藉由IHC所展示）。亦展示Kaplan-Meier存活率曲線（B-3)，其展示與指定β_索烴素表現权式相關之患者存活機率。此資料最初報導於Lh 荨人 ’ 「仍為）97(8): 4262-66 (2000)中。圖 32C為與自患有侵襲性導管癌（her-2陰性）之患者所分離之組織比車父’對自未患癌症患者之正常乳房中之Wnt-1表現的微陣列分析。 9·老化中之Wnt信號轉導

Wnt信號轉導途徑在老化及年齡相關病症中亦可具有關鍵性作用。如 Brack AS等人，Sckwce，317 (5839):807-10 (2007)中 124434.doc -120- 200819463 所報導，觀測導老化小鼠之肌肉幹細胞在其開始增殖時由肌源性譜系轉化成纖維源性譜系。此轉化與老化肌源性祖細胞中之典型Wnt信號轉導途徑活性增強相關且可由Wnt 抑制劑抑制。此外’老化小鼠之血清中之組分與Frizzied 蛋白結合，且可為老化細胞中Wnt信號轉導升高之原因。將Wnt3 A注入未成熟再生肌肉内減少增生且增加結締組織之沈積。在使用加速老化之Klotho小鼠模型之研究中，Wnt信號轉導途徑進一步牵涉於老化過程中，其中確定K1〇th〇蛋白與Wnt蛋白物理性相互作用且抑制wnt蛋白。Liu Η等人， Science，3 17 (5839):803-6 (2007)。在細胞培養模型中， Wnt-Klotho相互作用使得Wnt生物活性受到抑制，而缺乏 Klotho之動物之組織及器官展示Wnt信號轉導增強之跡象。因此’ Wnt拮抗劑可具有作為降低老化作用且治療年齡相關疾病之治療劑的用途。 I·特定調配物之投藥方式 1·總體考量醫藥組合物經調配以與其預定投藥途徑相容，該投藥途徑包括靜脈内、皮内、皮下、經口（例如吸入）、經皮（亦即局部）、經黏膜及經直腸投藥。用於非經腸、皮内或皮下施用的溶液或懸浮液可包括：無菌稀釋劑，諸如注射用水 '鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對經基苯甲酸甲 124434.doc -121 - 200819463 醋；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸（EDTA);緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及張力調節劑，諸如氣化鈉或右旋糖。pH值可用酸或鹼（諸如鹽酸或氫氧化鈉）調整。非經腸製劑可包封於由玻璃或塑料製成的安瓿、拋棄式注射器或多次劑量小瓶中。 2·可注射調配物適於注射之醫藥組合物包括無菌水溶液（當為水溶性時）或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。用於靜脈内投藥之適當載劑包括生理鹽水、抑菌水、CREMOPHOR EL (BASF，Parsippany，N.J·)或磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)。在所有情況下，組合物必須為無菌的且應為流體以便使用注射器投與。該等組合物在製備及儲存期間應具有穩定性且必須防止諸如細菌及真菌之微生物之污染。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇（諸如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇）及適當混合物的溶劑或分散介質。適當流動性可例如藉由使用包衣（諸如卵磷脂）、在分散液之情況下藉由維持所需粒徑及藉由使用界面活性劑來維持。多種抗菌劑及抗真菌劑（例如對羥苯曱酸、氯丁醇、本盼、抗壞血酸及硫柳汞（thimerosal))會含有微生物、、亏染。組合物中可包括等張劑，例如糖、多元醇（諸如甘露糖醇、山梨糖醇）及氣化鈉。可延遲吸收之組合物可包括諸如單硬脂酸鋁及明膠之藥劑。無菌可注射溶液可如下製備：將活性化合物（例如本發 124434.doc -122- 200819463 :月之任何調節劑物質/分子)以所需量與一種所需成分或所二成分之組合-起併人適當溶劑中，繼而滅菌。通常，分藉由將活性化合物及其他所需成分併人含有驗性分散 "貝之無菌媒劑中來製備。對於用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末’製備方法包括自無菌溶液產生含有活性成分及任何所需成分之粉末的真空乾燥法及凍乾法。 3·全身投藥

全身投藥亦可經黏膜或經皮。對於經黏膜或經皮投藥，選擇可透過標靶障壁的滲透劑。經黏膜滲透劑包括清潔劑、膽汁鹽及梭鏈抱酸衍生&。鼻喷霧劑或检劑可用於經黏膜投藥。對於經皮投藥，可將活性化合物調配為軟膏、油膏、凝膠或乳膏。該等化合物亦可以栓劑（例如用諸如可可脂及其他甘油酉曰之基質）或滞留灌腸劑形式製備以經直腸傳遞。 4·載劑

在一實施例中，將活性化合物用保護化合物免於自體内快速清除的載劑製備，諸如控釋型調配物（包括植入物及微囊封化傳遞系統）。可使用可生物降解性或生物相容性聚合物’諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。該等物質可購自ALZA

Corporation (Mountain View，CA)及NOVA Pharmaceuticals，

Inc· (Lake Elsinore, CA)，或由熟習此項技術者製備。脂質體懸浮液亦可用作醫藥學上可接受之載劑。該等載劑可根據熟習此項技術者已知之方法製備，諸如Eppstein等人 124434.doc -123- 200819463 之美國專利第4,522,811號（1985)中之方法。 5·單位劑量可形成呈單位劑型之經口調配物或非經腸組合物以利於投藥及劑量均一。單位劑型係指適合作為單次劑量用於待 /口療之X檢者的物理離散單元，其含有與所需醫藥載劑結合之治療有效量之活性化合物。單位劑型之規格由活性化合物之獨特特性及所需特定治療效應及混配活性化合物之固有限制規定且直接依賴於該等因素。 6·基因治療組合物可將核酸分子插入載體中且用作基因治療載體。基因治療載體可藉由例如靜脈内注射、局部投藥（Nabel& Nabeli 美國專利第5,328,470號，1994)或藉由立體定向注射（Chen 等人，户roc /cad 仍儿 91:3054-7 (1994))傳遞至受檢者基因’台療載體之醫藥製劑可包括可接受之稀釋劑或可包含基因傳遞工具包埋於其中之緩慢釋放基質。或者， ( 右整個基因傳遞載體可由重組細胞完整產生，例如逆轉錄 " 病毒載體，則醫藥製劑可包括一或多個產生基因傳遞系統的細胞。 7·劑量醫藥組合物及方法可進一步包含常用於投與Wm拮抗劑的其他治療活性化合物。在需要投與Wnt拮抗劑之病狀之治療或預防中，適當劑里含ΐ通常為每天每公斤患者體重約〇〇1至5〇〇 mg，其可以單次劑量或多次劑量投與。較佳地，劑量含量為每天約 124434.doc -124 - 200819463 〇·1至約25 0 mg/kg ;更佳每天約0.5至約loo mg/kg。適當劑量含量可為每天約0.01至250 mg/kg、每天約〇〇5至1〇〇 mg/kg或每天約〇.1至50 mg/kg。此範圍之劑量可為每天〇·〇5至0.5、0.5至5或5至50mg/kge用於經口投藥之組合物較佳以含有1.0至1000毫克活性成分（尤其丨〇、5 〇、1〇〇、 15.0、 20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、15〇〇、2〇〇〇、 250.0、 300.0、400.〇、5〇〇.〇、_ 〇、75〇〇、_ 〇、 900.0及1_.〇毫克活性成分）之錠_式提供以根據症狀調整用於待治療之患者之劑量q匕合㈣以每天… 次、較佳每天一或兩次之方案投與。然而，用於任何特定患者之特定劑量含量及給藥頻率可變化且視多種因素而^，該等因素包括所用特定化合物之活性、彼化合物之代謝穩定性及作用長度、年齡、體重、 :般健康狀況、性別、腾食、投藥方式及時間、排泄率、樂物組合、特定病狀之嚴重程度及經歷治療之主體。 / 8·組合物之套組組蝴例如醫藥組合物)可連同投藥說明書一起包括於套組、谷器、包裝或分配备； έθ ^ ^ 田以套組形式提供時，可將心物之不同組分封裝於單獨容器中且該將各組分單獨封裝可容便用别μ合之功能。以長期健存而不損失活性組分定測試（諸如診套組亦可在單獨容器中包括利於執行特斷性測試或組織定型）的試劑。 (a) 容器 124434.doc •125- 200819463 套、、且中所包括之試劑可供應於任何類別之容器_，以使得不同組分之壽命得以保持且不被容器之材料吸附或改支舉例而5 ’經密封之玻璃安親可含有在中性、非反應氣體（諸如氮氣）下封裝的康乾調節劑物質/分子及/或緩: 月，J女親可由任何適當材料組成，諸如玻璃、有機聚合物 (諸如聚碳酸醋、聚苯乙烯等)、陶究、金屬或其他任何常用於保存試劑的材料。適當容器之其他實例包括可由類似於安親之物質所製造的簡單瓶子及可由落襯襯裏（諸如銘或合金）組成的封套。其他容器包括試管、小瓶、燒瓶、瓶子、注射器或其類似容器。容器可具有無菌取藥孔，諸如具有可由皮下注射針頭刺穿之塞子㈣。其他容器可具有兩個由易移除臈分隔的隔室，該膜移除後容許各組分混合。可移除膜可為玻璃、塑料、橡膠等。 (b) 說明性材料套、、且亦可提供說明性材料。說明可列印在紙或其他基材上，且/或可以電子可讀媒體之形式提供，諸如軟性磁碟CD ROM、DVD-ROM、Zip碟、錄影帶、雷射碟、錄曰贡等。詳細說明書在實體上可不與套組結合；相反，使用者可被指向由套組之製造商或經銷商所指定或以電子郵件形式提供之網際網路網址。 9·組合療法在某些實施例中，將包含Wnt拮抗劑之醫藥調配物與至夕種其他治療劑及/或佐劑組合投與。在某些實施例中，其他治療劑為化學治療劑、生長抑制劑或細胞毒性 124434.doc •126· 200819463 劑，如毋素，诸如類美登素（maytansin〇id)、刺孢黴素 (calicheamicin)、抗生素、放射性同位素、核酸分解酶或其類似物。上述該等組合療法包括組合投藥（其中在同一或單獨調配物中包括兩種或兩種以上治療劑）及單獨投藥，在該情況下，Wnt拮抗劑之投藥可在其他治療劑及/或佐劑之投藥之前、同時及/或之後發生。Wnt拮抗劑亦可與放射療法組合使用。 10.藥物本發明提供用於製備適用於治療Wnt_中介性病症之藥物的Wnt拮抗劑。在一特定態樣中，Wnt_中介性病症為癌症。包括以下實例以證明本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，下述實例中所揭示之技術代表本發明者所發現在本發明之實施中充分起作用的技術，且因此可視為構成其較佳實施方式。然而，熟習此項技術者應瞭解，根據本揭不案，可對所揭示之特定實施例進行諸多修改且該等修改仍可獲得相同或類似結果而不悖離本發明之精神及範嘴。本說明書中通篇引用之全部參考文獻之全部内容明確以引用之方式併入本文中。實例1 通用方案哺乳動物細胞培養使人類腎上皮（HEK) 293細胞（ATCC # dm3)、人類 124434.doc •127- 200819463 卵巢PA1細胞（ATCC # CRL-1572)在已補充有10%胎牛血清之50/50杜貝卡改良依格高葡萄糖培養基Ham’s F12中生長。將人類畸胎瘤來源之NTer2 (ATCC # CRL-1973)及 Tera2 (ATCC # HTB-106)細胞在補充有15%胎牛血清之 McCoy氏培養基中維持，且將NCCIT細胞（ATCC # CRL-2073)在補充有10%胎牛血清之RPMI中維持。所有細胞株進一步在37°C下在5% C02中補充2 mM麩醯胺酸及1%青黴素-鏈黴素。轉染及螢光素酶檢定在轉染之準備中，將（1) 500,000個HEK293及（2) 100,000 個 PA1 細胞（ATCC # CRL-1572)、NCCIT、NTera2 或 Tera2 細胞在轉染前24小時塗鋪在12孔盤（Nuc)之各孔中。用 0.375 pg TOPglow (Upstate，目錄號 21-204)、0.05 mg LEF1、0.01 mg 具有Fugene (Roche)之 SV40 RL轉染細胞且在轉染後24小時更換培養基，且在收集前不處理細胞，或僅用Wnt3a、僅用Wnt-5a或用血清樣本將細胞再處理20-24 個小時。指定細胞株之所有稀釋在完全培養基中進行。將細胞收集於50-100 μΐ之1XSJC溶解缓衝液（20 mM Tris pH 8·0、137 mM NaC卜 1 mM EGTA、1% Triton X_100、10% 甘油、1.5 mM MgCl2、1 mM DTT、50 mM NaF、1 mM NaV04及蛋白酶抑制劑）中，且使用Dual-Glo™螢光素酶檢定套組（Promega，批號TM058)雙重複檢定10 μΐ且以 Envision光度計（Perkin Elmer)偵測。以海腎活性將螢光素酶活性正規化。 124434.doc -128 - 200819463 實例2 構築Frz_Fc嵌合分子選殖及表現

Frz8(173)-Fc及 Frz8(156)-Fc 圖4A及B展示Frz8 (156)-Fc及Frz8 (173)-Fc嵌合型構築體之序列。圖4A展示較長Frz8 (173)序列。前導信號序列以灰色（亦即開頭24個N-末端胺基酸殘基）展示。可存在或不存在於成熟蛋白質中之丙胺酸殘基以下劃線（亦即殘基 25-27)展示。將較長Frz8 (173)嵌合型構築體區別於較短 ?^8(156)欲合型構築體之額外的？^8受體序列以加框文字（亦即殘基157-1 73)展示。連接子序列以粗體（亦即殘基 174-182)展示，而斜體序列（亦即殘基183-409)為Fc區。圖 4B展示較短Frz (156)最小CRD (ECD)域序列。灰色（亦即開頭24個N-末端胺基酸殘基）為前導信號序列。可存在或不存在於成熟蛋白質中之丙胺酸殘基以下劃線（亦即殘基 25-27)展示。連接子序列以粗體（亦即殘基157-164)展示，而斜體序列（亦即殘基165-391)為Fc區。

Frz8 (156)-Fc構築體係如下建構。將編碼Frizzled 8殘基 l-156之cDNA次選殖入pRK來源之質體之EcoRl及XhoI位點。儘管天然人類cDNA較佳，但亦可使用編碼一致蛋白質序列（例如鼠類）的替代序列。在該選殖程序中，經由短連接子區（例如殘基LESGGGGVT)(SEQ ID NO: 70)使Frz8 之叛基末端與人類IgG效應子域（Fc)之胺基末端融合，以產生Frz8-Fc融合體。最終構築體編碼价28之156個殘基。 124434.doc -129- 200819463 選殖係使用標準分子生物學技術執行（Ausubel等人（編）， 2003，Current Protocols in Molecular Biology，第 4 卷’ John Wiley & Sons)。蛋白質係在中國倉鼠卵巢（CHO)細胞中表現。或者，可使用編碼長度與上述長度（例如1-173)不同之 Frz8的cDNA。此外，亦可使用替代連接子序列（例如 ESGGGGVT)(SEQ ID NO: 69)。

Frz-Fc及 sFrp-Fc構築艘以類似於針對Frz8所述之程序之方式建構Wnt拮抗劑與 Frizzled域組分（包含 Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、 Frz6、Frz7、Frz9、FrzlO、sFRPl、sFRP2、sFRP3、 sFRP4或sFRP5)之構築體。使用Xhol及AscI將Frz2、 Frz3、Frz4、Frz5及sFRP3次選殖入pRK來源之質體中。使用 Clal及 Xhol將 Frzl、Frz6、Frz7、Frz9、FrzlO 及 sFRP4 次選殖入pRK來源之質體中，且使用Clal及AscI將sFrpl、 sFrp2及sFRP5次選殖入pRK來源之質體中。如同Frz8構築體，經由短連接子區使Frz域之羧基末端與人類IgG效應子域（Fc)之胺基末端融合，以產生嵌合型Wnt拮抗劑。圖 7(A、B及C)展示該等構築體之例示性胺基酸序列。前導信號序列以粗體展示，斜體指示非天然前導序列。連接子加有下劃線且Fc組分以斜體展示。圖5 (A-H)(SEQ ID NO: 115-129)提供該等Wnt拮抗劑構築體之例示性核酸序列。可製備替代構築體以優化活體内活性或穩定性或提供其 124434.doc -130- 200819463 他有利特徵，諸如增強之溶解度、改良之結合特徵。該等構築體可包括與上述Wnt拮抗劑之連接子不同的連接子。舉例而言，Frz3-Fc嵌合型蛋白質（SEQIDNO:114)之替代構築體可如下製備：使用BstXI及Xhol將Frz3域次選殖入 pRK來源之質體中，且使用LESGGGGVT (SEQ ID NO: 70) 肽連接子將Frz3域與Fc域融合。蛋白質分離藉由使用PROSEP⑧（MilliP〇re)蛋白質·Α接合樹脂之親和捕獲法將Wnt拮抗劑嵌合型蛋白質分離至>9〇%純度。高階聚集體藉由通過Superdex 200® (GE-Healthcare)凝膠過滤柱與二聚體分離。蛋白質特性及對胺基末端加工以移除信號序列係藉由Edmund降解法確定。最終蛋白質之純度經估算大於98%(圖10)。純化後物質中之内毒素含量完成且小於 1.0 EU/mg。實例3

Frz8_Fc嵌合分子之血清穩定性對Frz8 (173)-Fc散合型構築體之血清穩定性之最初研究表明該構築體具有有限的活體内半衰期。活體内不穩定性可能係由於Fnzzled受體組分之£(：域（£(：1))中存在蛋白酶裂解位點。實例2中所述之Frz8 (156)如構築财現比㈣ (173)-FC增強的血清穩定性。將1〇叫心之^ (i73)_Fc或 Μ (叫FC靜脈内注射入無胸腺裸小鼠中。在指定時點收集血清且分析總蛋白質及活性蛋白f。圖nA展示用於伯測1以血清中所存在之蛋白質之人㈣的免疫印跡及25 124434.doc -131 - 200819463

Kg各別經純化之蛋白質之比較。Frz8 (156卜以可在投藥後72小時於企清中偵測到，而Frz8 (173)-Fc在30分鐘後就偵測不到。所收集之血清中Frz8 (156)-Fc及Frz8 (173)-Fc之活性可藉由！測HEK293細胞中Wnt3a依賴性T〇pgl〇w報導者活性之抑制來檢定。儘管用2·5 pg/mL經純化之卜以（156)_Fc及 FrZ8 (173)-Fc治療後觀測到相當活體外功效，但蛋白質投藥後30分鐘自收集之經巧以（173)_Fc治療之小鼠的血清中僅獲得部分抑制活性。相比之下，較強抑制活性可在投藥後多達24小時自經Frz8 (156)_Fc治療之小鼠之血清中獲得，其中可偵測之抑制量持續至少72小時（圖11 b)。該等研究證明Frz8 (156)分子在活體内比基於Frz8 (173)之分子更穩定。此外，Frz8 (173)-FC具有次優功效且作用僅為降低腫瘤體積之增長率而非縮小起始腫瘤體積。此次優功效說明於圖12中，其展示用各種Wnt信號轉導組分-Fc嵌合型拮抗劑 (包括Frz8 (173)-FC分子）治療後產生之腫瘤體積相對時間之曲線圖。在此檢定中，將MMTV-Wwq腫瘤移植入無胸腺裸小鼠之乳腺脂墊内，且在X軸上之箭頭所指示之時點靜脈内投與藥物。實例4

Frz8 (156)-FC之活體内藥物動力學

Frz8(156)_FC之活體内藥物動力學係藉由將單次劑量之此蛋白質以1、5或20 mg/kg靜脈内投與裸小鼠内或以2〇 124434.doc -132- 200819463 mg/kg腹膜内投與裸小鼠内來測試。如圖π中所報導且如此實例中以下進一步所述，Frz8-Fc試劑在所有劑量下、在裸小鼠呈現雙相清除。靜脈内或腹膜内單次給藥後，Frz8-Fc呈現：（丨）曝露劑量成比例增加；（2)腹膜内給藥後快速吸收；（3)約25-30毫升/天之清除率及（4)約4天之半衰期。生物利用率係數：AUCIP/AUCIV=92%。動物方案將雌性無胸腺裸小鼠基於投與之藥物量及投藥方式分成 4組’每組12隻。第1組：Frz8-Fc 1 mg/kg，靜脈内（iv); 第 2組：Frz8-Fc，5 mg/kg，IV ;第 3組：Frz8-Fc 20 mg/kg， IV及第4組：Frz8-Fc，20 mg/kg，腹膜内（IP)。各動物根據組名接受靜脈内或腹膜内Frz8-Fc團式給藥。所投與之劑量體積（5-10 mL/kg)視給藥溶液之濃度及各動物之體重而變。靜脈内給藥係經由尾靜脈投與。根據以下程序自各動物採集約125 μΐ血液。將血清在_7〇 C下儲存，直至ELISA檢定時為止。取樣以使得η=3隻動物/時點。其餘動物係用於給藥前樣本採集及/或採集空白小鼠血清。對於最初兩個時點，使用交替之眼，對各動物以眼眶後放血來採集血液。對於最終時點，經由心臟穿刺收集血液且將約1 ml血液等分入2個試管中。使用一個樣本測疋Frz8-Fc濃度且保留另一個樣本以用於研究。各血液採集時點之後，以體液置換之形式，使各動物接受1〇如生理鹽水之腹膜内快速注射。眼眶後放血係在異氟燒麻醉下執行且終點放血係在氣胺酮（ketamine)/甲苯噻嗪 124434.doc -133- 200819463 (xylazine)此合物下進行。最終放血後，將動物在麻醉下經由頸椎脫臼法安樂死。結果圖13A為經Frz8_Fc治療之小鼠之淨血清之免疫印跡，其展:對20或5 mg/kg#脈内或2〇叫心腹膜内給藥後第了天及第7天後之血清之偵測。在第4、7、1()或14天自個別小鼠取樣。用於對照之血清樣本係自未經治療之小鼠獲取，將Frz8-Fc蛋白添加至2〇 ^/mL且將樣本在37。〇下培育2小時，且接著用SDS裝載緩衝液（標記為2h)處理樣本；亦將未經治療之小鼠之淨血清作為陰性對照（標記為s)操作。圖13B及13C為由藥物動力學研究測定之Frz8_Fc血清含罝之圖不。具體時期包括16天評估（圖13"及2天評估（圖 13C)。Frz8-FC在裸小鼠中以所有劑量投與後呈現雙相清除。曲線表示預測濃度，而個別數據點表示如藉由eusa 所測定之個別小鼠中Frz8-Fc蛋白之平均血清含量。圖13D 為Frz8-Fc藥物動力學之雙相模型之參數總結。當以2〇 mg/kg藉由腹膜内或靜脈内途徑給藥時，蛋白質之相當血清含量可在注射當天内達成，且該蛋白質在血清中可偵測多達7天。以20 mg/kg腹膜内給藥後，蛋白質被快速吸收’ Tmax為約8小時且生物利用率（AUCIP/AUCIV)為92%。蛋白質之清除率為約25至30 mL/d/kg，半衰期為約4天。實例5

Frz-FC分子之結合親和力將FC域添加至Frz8 (1 56)域使得與Wnt3a之結合親和力增 124434.doc -134- 200819463 加兩個數量級。圖14證明當與二聚體Fc域連接時Frz8-ECD 阻斷Wnt3a信號轉導之能力增強。圖14A為Frz8 (156)-FC 之兩種不同製劑之Wnt3a抑制檢定的IC5〇曲線圖。圖14B為確認所分離之Frz8 (156) CRD (ECD)之純度的凝膠圖。圖示為：（a)非還原型Frz8 (156) ECD(泳道1) ; (b)分子量標記 (泳道2)及還原型Frz8 ECD (156)(泳道3)。此凝膠圖表明，結合檢定中所用之Frz8 ECD為完整的且以約為預期之分子量遷移。實例6

Frz-FC嵌合體之結合活性

ELISA 對於Wnt拮抗劑之PK評估，用於PBS中濃度為1 pg/mL之兔抗人類Fc (Jackson Immuno Research，Westgrove，PA)(25 微克/孔）塗覆384孔ELISA微量滴定板（Nunc Maxisorp， Rochester，NY)之孔。在4°C下培育隔夜後，將兔抗人類Fc 溶液傾出，且將滴定板用40微升/孔阻斷緩衝液（含有0.5% BSA及10 ppm proclin之PBS)阻斷。伴以輕柔攪拌在室溫下培育60分鐘後，將塗有兔抗人類Fc之滴定板用洗滌緩衝液 (含有 0.05% Tween 20®及 1〇 ppm proclin之PBS)洗滌三次。將Frizzled-Fc標準液（一系列濃度範圍為0.78-100 ng/mL之稀釋液）及於檢定緩衝液（含有〇·5% BSA、0.05% Tween 20® 及10 ppm proclin之PBS)中稀釋至檢定範圍之樣本添加至檢定板（25微升/孔）中。伴以輕柔攪拌在室溫下培育120分鐘後，將檢定板用洗滌緩衝液洗滌六次。使用稀釋於檢定 124434.doc -135- 200819463 稀釋劑（25毫升/孔）中之辣根過氧化物酶（HRP)接合山羊抗人類IgG-Fc (Jackson Immuno Research)福測剩餘所結合之 Frz-Fc。適當顯色（10-25分鐘）後，用1 Μ磷酸（25微升/孔）終止酶促反應。在450 nm之波長下（參考波長為630 nm)對檢定板讀數。使用4參數演算法、藉由對照標準曲線比較樣本OD來測定樣本濃度。 BIAcore 圖15證明Wnt3a與Frz8 (1-15 6)-Fc嵌合體之直接結合。此嵌合體蛋白質為如Chen，Y.等人，J. Mo/. 5M/· 293: 865· 881 (1999)中一般性描述、以約1700個反應單元與Biocore™ (BIAcore，Inc. Piscataway，N.J.) CM5感應器晶片偶合之胺。簡言之，根據供應商之說明，將羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片（CM5，BIAcoreTM Inc.)用乙基-ν·(3-二甲基胺基丙基）_碳二醯亞胺鹽酸鹽（EDC)及Ν-羥基丁二醯亞胺 (NHS)活化。注射1 Μ乙醇胺以阻斷未反應基團。接著注射估計濃度為0.5 pg/ml之Wnt3a，且藉由改變與時間有關之反應單元來評估結合。發現Wnt3a結合Frz8_Fc。如圖15中所示，與對照蛋白質相比，Wnt3a與Frz-Fc之結合產生 1000個反應單元之大幅增加（大腸桿菌表現之非天然 Wnt3a) °

OCTET

Wnt拮抗劑與Wnt配體Wnt3a及Wnt5a相互作用之能力係使用 OCTET™ QK系統量測。（FortSBio，Inc.，Menlo Park, CA)。此系統容許在生物感應器表面量測蛋白質結合。檢 124434.doc -136- 200819463 定如下執行：首先經由抗人類IgG Fc特異性生物感應器將一種Wnt拮抗劑分子（20 pg/mL)於具有0.5% CHAPS之磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)中培育10分鐘。未結合之Wnt拮抗劑藉由在具有0.5% CHAPS之PBS中洗滌1.5分鐘來移除。接著將 Wnt3a或Wnt5a (5.0 pg/mL)添加至檢定中且與結合於生物感應器表面之Wnt拮抗劑在具有0.5% CHAPS之PBS中一起培育5分鐘。監控相同缓衝液中Wnt拮抗劑分子與Wnt配體之間的相互作用。所有檢定步驟在室溫下、以150 μ：ί之體積執行。圖16展示此結合檢定之結果，其中圖16Α展示來自Wnt3a與Frzl-FrzlO-Fc嵌合體結合之資料，圖16Β展示來自Wnt3a與sFRP-Fc嵌合體結合之資料，且圖16C展示來自 Wnt5a與Frzl-FrzlO-Fc嵌合體及sFRP-Fc嵌合體結合之資料。 OCTET™檢定表明，Wnt3a與Wnt_5a皆以最快速率結合 Fz8-Fc、Fz5-Fc及 Fz4-Fc(相對於其他 Frz蛋白），Wnt3a 以較慢速率結合Fzl-Fc、Fz2-Fc及Fz7-Fc。Wnt>5a結合曲線之波幅及線性性質說明相對於Wnt3a結合其具有較低之結合親和力，如由該結合檢定所測定。OCTET™結合數據之變化幅度說明sFRP-Fc蛋白對Wnt3a具有與對於Frzl、Frz2 及Frz7所觀測到之親和力類似且比對於Frz5及Frz8所觀測到之親和力稍低之親和力。實例7

Wnt拮抗劑對Wnt信號轉導之抑制-細胞檢定使用經TOPglow報導質體轉染之293(人類腎）細胞執行細 124434.doc -137- 200819463 胞檢定。在轉染準備中，在轉染前24小時將約500,000個 HEK293 塗鋪於 12 孔盤（Nuc)之孔中。用 0.375 pg TOPglow (Upstate，目錄號 21-204)、0·05 mg LEF1、0·01 mg具有 Fugene (Roche)之SV40 RL轉染細胞且在轉染後24小時更換培養基，且在收集前不處理細胞，或僅用Wnt3a、僅用 Wnt-5a或用wnt拮抗劑將細胞再處理20-24小時。指定細胞株之所有稀釋均在完全培養基中進行。將細胞收集於50-100 μΐ 之 1XSJC 溶解緩衝液（20 mM Tris pH 8.0、137 mM NaCn、1 mM EGTA、1% Triton X-100、10%甘油、1.5 mM MgCl2、1 mM DTT、50 mM NaF、1 mM NaV04及蛋白酶抑制劑）中，且使用Dual-Glo™螢光素酶檢定套組 (Promega，批號TM058)雙重複檢定10 μΐ且以Envision光度計 (Perkin Elmer)偵測。以海腎活性將螢光素酶活性正規化。除報導者外，亦用Frz4及Lrp5轉染待用Wnt5a處理之細胞。該等其他組分之存在容許Wnt5a對Wnt途徑之活化依照典型途徑進行〇 Mikels AJ，及Nusse R·，PZOS价〇/· 4:ell5 (2006)。將經Wnt3a活化之細胞用 100 ng/ml Wnt3a 處理，且將經Wnt5a活化之細胞用1 pg/ml Wnt5a處理。如圖17A及17B中所示，Frz-Fc拮抗劑抑制Wnt信號轉導至不同程度。Frz5-Fc與Fr*z8-Fc皆展示對Wnt3a信號之完全抑制且明顯抑制Wnt5a信號。Frz4-Fc、Frz2-Fc及Frz7-Fc 展示對Wnt3 a信號之明顯抑制。實例8

Wnt拮抗劑之相對IC50 124434.doc -138 - 200819463

Wnt拮抗劑之相對IC50藉由量測如實例7中所述經 TOPglow螢光素酶TCF報導質體穩定轉染之U20S(人類骨肉瘤）細胞中Wnt拮抗劑對Wnt信號轉導之抑制加以測定。在Wnt3a活化下獲得細胞中之初始Wnt信號轉導。將一系列Frz-Fcs之3倍稀釋液施用於細胞隔夜（圖18)。如藉由該檢定所測定，Wnt3a以亞奈莫耳濃度IC50與Ffz8-Fc、Frz5-Fc及 Frz4-Fc結合（其中 Frz8_Fc具有 0·04 nM之 IC5 0，Frz-5Fc 具有 0.20 nM 之 IC50 且 Frz-4 具有 0.48 nM 之 IC50)，且以奈莫耳濃度IC50與Frz2-Fc及Fi*z7_Fc結合（其中Frz2-Fc具有 1.2 nM 之 IC50 且 Frz2-Fc 具有 1.4 nM 之 IC50)。實例9

Wnt靶基因作為藥物反應之藥效學標記作為β-索烴素之免疫組織化學分析之替代分析，使用 Wnt之轉錄標靶監控Wnt信號轉導活性之抑制。具有自分泌Wnt信號轉導之細胞株展示已知Wnt靶基因之表現增加，且此表現藉由用Wnt3a以及Frz8-F活體外處理來加以調控。對NTera-2細胞之RNA分析表明，Fi:z8-Fc處理影響所測試之Wnt靶基因之表現。因此，可採用該等基因之表現作為治療功效之指示。作為該等觀測之延伸，該等Wnt 靶基因之表現可用作鑑別由Wnt信號轉導所導致且為抗-Wnt治療劑之可能候選者之癌症的診斷工具。活體外對用經純化Wnt3a、Fz8 CRD-Fc或對照蛋白質處理之 PA-1細胞進行活體外比較基因表現分析，以判定Wnt靶基 124434.doc -139- 200819463 因指示畸胎瘤細胞中Wnt信號轉導之活體内抑制之適用性。使自經Wnt3a、Frz8_Fc或對照Fc蛋白處理之PA-1細胞中所分離之RNA經受微陣列分析，且測定指定基因回應外源添加之Wnt3a、Frz8-Fc及對照Fc蛋白之表現量變化。為進行微陣列分析，將細胞用指定蛋白質三重複處理，且使用RNAeasy套組（Qiagen)分離總RNA。以Affymetrix人類基因組U133基因晶片組進行陣列分析（Rubinfeld B等人，㈣/ 2006; 24:205-9)。特異性探針及引子組展示於圖20中。先前鑑別之Wnt信號轉導之標靶（諸如Axin2、APCDD1 及Gadl)之表現量因Wnt3a處理而上調或因Frz8-Fc處理而下調（圖 19A)。此外，諸如 Lefty2 (A)、Leftyl (B)、sFRPl 及Fzd5之一些基因受Wnt3a下調且因Frz8-Fc對Wnt信號轉導之抑制而上調（圖19A)。隨後以qRT-PCR進行之基因表現分析展示，該等轉錄物在NTera-2、Ter*a-2及NCCIT細胞中亦類似地受到Wnt3a及Fz8 CRD-Fc調控。活體内在上述活體外分析中，APCDD1、Gadl及Fzd5為受到最一致調節的基因，且因此在活體内腫瘤異種移植研究中被選用作Wnt反應性之潛在標記。自在功效研究及如Rubinfeld B等人， 2006; 24:205-9先前所述對Wnt反應性轉錄物進行之定量性逆轉錄-PCR (qRT-PCR)分析結束時所收集的異種移植樣本中純化腫瘤組織RNA。各基因之誘導倍率係使用AACt方法 124434.doc -140- 200819463 測定，且相對於甘油醛-3-磷酸脫氫酶呈示結果。特異性探針及引子組展示於圖20中。所有反應雙重複進行且對至少兩個檢定土SEM之平均值作圖。與活體外所見之效應相似，用治療性劑量之Frz8-Fc治療減少APCDD1及Gadl基因之表現且增加來自NTera-2異種移植物之腫瘤中Fzd5之表現（圖19B)。儘管在CD4hFc治療後’存在所有基因之全面非特異性下調，但該等變化與在經Frz8-Fc治療之腫瘤中所見之彼等變化相比在統計學上並不顯著。該等觀測結果表明，Frz8_Fc在活體内之抗腫瘤效應係針對乾基因且該等基因之表現量可用於監控潛在抗_ Wnt治療劑之功效。實例10 wnt拮抗劑對具有同種移植物及人類異種移植物之小鼠中腫瘤生長之抑制效應此實例中所闡述之研究表明Wnt拮抗劑適用於治療表現 Wnt之腫瘤。在Wnt-1-MMTV模型之情況下很大程度上完全之腫瘤退化說明Wnt拮抗劑對由Wnt強烈導致之腫瘤的效應。然而，Wnt拮抗劑對PA-1及NTer2腫瘤的顯著效應亦反映治療不完全由Wnt導致之腫瘤的較強治療可能性。動物使用雌性 C57B16 小鼠（Jackson Laboratory)繼代 MMTV-Wntl腫瘤。小鼠之維持及活體内程序係使用實驗動物管理及使用委員會（Institutional Animal Care and Use Committee) 認可之方案執行。 124434.doc -141 - 200819463 MMTV-Wnt模型：同種移植物圖21為描述用於轉染以產生Wnt動物模型之載體構築體的線形示意圖。此構築體模擬經由MMTA病毒插入所觀測到之組成性Wnt信號轉導活化，如Tsujomoto等人，Cell 55: 619-625 (1988)及 Li 等人，19: 1002-1009 (2000)中所述。在小鼠中繼代MMTV-Wntl轉殖基因腫瘤將來自MMTV-Wntl轉殖基因小鼠之腫瘤藉由手術植入乳腺脂墊中而在C57B16小鼠中連續繼代6至10代。自轉殖基因小鼠無菌收集腫瘤組織，以HBSS沖洗且切成小塊。將接受者小鼠用氣胺酮（ketamine)(75-80 mg/kg)與甲苯嗟嗪（xylazine)(7.5-15 mg/kg)之混合物麻醉，將腫瘤塊在皮喙下插至第三乳腺脂墊，且使用創傷夾將皮膚縫合。將腫瘤繼代歷時最多10代，且在開始2代後，以組織學方式檢查腫瘤組織以確定其為乳腺來源且繼續表現Wnt。乳腺癌在小鼠中生長6-12個月。使用自該等小鼠所分離之腫瘤產生下述移植模型。活體内研究為活體内研究測試Wnt拮抗劑在MMTV-Wnt模型中之功效，藉由皮下注射獲自浸軟腫瘤組織之細胞引入腫瘤細胞。自植有來自Wnt轉殖基因小鼠（上述）之腫瘤的小鼠無菌收集腫瘤組織，以PBS或HBSS沖洗，切成較小塊，且使用細胞離散套組（Sigma)於HBSS中浸軟。將該等細胞以無菌HBSS洗滌兩次且懸浮於50%基質膠（matrigel)於HBSS中 124434.doc -142- 200819463 之溶液中。將細胞懸浮液以不超過15〇微升/小鼠之體積皮下接種至無胸腺裸小鼠之乳腺脂墊内。對於使用NTera2或PA-1動物模型之活體内研究，將細胞如所述加以培養且在處於對數生長期時收集。將細胞懸浮於50%基質膠於HBSS中之溶液中，且以8百萬個細胞/小鼠 (NTera2)之濃度或！千萬個細胞/小鼠（pA-丨）之濃度皮下接種至無胸腺裸小鼠中。接種7-12天後每天監控且量測腫瘤。將動物分為具有在 150-250 mm3範圍内之一致平均腫瘤體積之組。分組後天開始用Wnt拮抗劑治療，且將該等小鼠用1〇〇_2〇〇…之 Wnt拮抗劑、陰性對照蛋白質cd4-Fc或PBS陰性對照每天一次腹膜内（IP)或靜脈r(iv)給藥。隨後每週重複藥物治療2-3次且持續3-4週。每週兩次量測腫瘤體積，當腫瘤體積達到2500 mm3時處死動物。研究期間藉由眼眶靜脈放血來採集血液，且藉由SDS_PAGE、繼而藉由免疫印跡法及使用HRP或螢光接合之抗人類Fc之偵測法檢定血清中治療劑之含量且如實例7中所述藉由檢定治療劑抑制wnt3a活化 TOPgl〇w活性之能力檢定其活性。同種移植腫瘤

Wnt拮抗劑對腫瘤同種移植物生長之抑制作用治療過程中，用！^28-1^藉由腹膜内或靜脈内途徑治療可使得腫瘤在持續抑制下快速退化，而陰性對照蛋白質 CD4-Fc相對於PBS治療則無效應。終止治療後監控經治療之小鼠三週’且最後觀測到腫瘤之再生長。 124434.doc -143- 200819463 圖22說明Frz8-Fc措由腹膜内（IP)給樂在無胸腺裸小鼠中抗MMTV-Wnt腫瘤移植物之功效。圖22A為展示接受 MMTV-Wnt-Ι腫瘤移植物之裸小鼠藉由每週兩次腹膜内注射投與PBS、CD4-FC (10毫克/公斤/天）或Frz8_Fc (1〇毫克/ 公斤/天）之曲線圖。每組具有11隻小鼠，且開始治療之前該組之平均腫瘤體積為226 mm3。相對於時間對平均腫瘤體積作圖，且治療天數由X軸上之箭頭指示。在第25天，將對照組處死，且停止向治療組投藥。圖22B為四個治療組之平均腫瘤體積及腫瘤體積之平均變化％相對於時間之總結表。注意，在圖22B中，平均腫瘤體積在用Frz8-Fc拮抗劑治療後產生減小，在開始治療後第五天腫瘤體積由 226 mm3降至約219 mm3，在第十八天降至約67。此分別表示腫瘤尺寸減少4%及70%。在此研究中，與對照動物相比，投與Frz-Fc拮抗劑之腫瘤展示腫瘤尺寸回歸。此也明本發明之Frz-Fc拮抗劑作為單一藥劑具有殺腫瘤性且適用作抗癌治療劑。圖23說曰月Frz8-Fc藉由靜脈内（IV)給藥在無胸腺裸小鼠中抗MMTV-Wnt腫瘤移植體之功效。圖23」 MMTV-Wnt-Ι腫瘤移植體之裸小鼠藉由每週。圖23A為展示接受

124434.doc -144- 200819463 的小鼠。相對於㈣對平均__作圖，且治療天數由 X軸上之箭頭指示。在第25天，將對照組動物處死，且停止向治療組投藥。圖⑽為四個治療組之平均腫瘤體積及腫瘤體積之平均變化％相對於時間之總結表。注意，在所有用rz Fc 療之小鼠中，腫瘤負荷由mm3之平均值降至開始3治療後第4天之179 _3之平均體積及第十八天後之73 mm3。此分別表示腫瘤體積減少21%及67%。對於高劑量組，腫瘤體積由376 mm3之平均值降至治療第4天之 225 mm及第十八天之53 mm3。此表示腫瘤體積分別減少 39%及 86% 〇獲自經治療之小鼠之血清對Wnt信號轉導的抑制作用自經治療之小鼠所分離之血清對Wnt信號轉導之抑制報導於圖24中，其中圖24A展示自經腹膜内治療之小鼠所分離之血清之結果’而靜脈内治療結果呈現於圖中。資料係以條形圖形式呈示，其展示T〇pgi〇w檢定（如實例7中所述）中之Wnt信號轉導拮抗劑活性。樣本係根據治療、小鼠研究數目及稀釋度分組呈現。TOPglow基因報導者檢定中之相對螢光素酶活性展示於γ轴上。除NA(對照）外，所有樣本皆用約40 ng/mL經純化之Wnt3a治療。其他所有蛋白質對照以5 pg/mL存在於培養基中。人類異種移植腫瘤

Wnt拮抗劑對天然來源之人類腫瘤模型之抑制可充當其適用於治療人類癌症之另一指示。與PA-1畸胎瘤細胞株中所見類似，測試人類腫瘤來源之細胞株以驗證自分泌wnt 124434.doc •145- 200819463 信號轉導’作為適用於測試Wnt拮抗劑活性之指示。與展現不受Frz8-Fc抑制之低基底信號轉導之293細胞相反，畸胎瘤來源之NTera-2、Tera-2及NCCIT細胞株展現可被Frz8· Fc抑制的基底Wnt信號轉導（圖25A)。然而，由於界以“治療進一步激發可被Frz8_Fc阻斷的信號轉導，因此所有四個畸胎瘤細胞株似乎皆表現Wnt受體（圖25B)。該等結果表明畸胎瘤細胞株表現Wnt，其可造成其致瘤性。因此評估該等細胞株在無胸腺裸小鼠中之腫瘤形成，且基於腫瘤形成之一致性，選擇NTera-2及PA-1用於活體内功效研究。

Wnt拮抗劑對NTera2腫瘤異種移植物之生長的抑制作用相對於對照小鼠，用Wnt拮抗劑Frz8_Fc^A療呈現NTera2 腫瘤異種移植物之小鼠使得腫瘤體積減小約5〇%且腫瘤質量減少約70%。圖26展示Frz8-Fc治療對無胸腺裸小鼠中NTera2腫瘤異種移植物生長之抗腫瘤功效。以15毫克/公斤/天之初始劑量將PBS、CD4-Fc及Frz8-Fc投與具有^^^2腫瘤異種移植物之無胸腺裸小鼠，繼而每週三次藉由腹膜内注射投與1〇毫克/公斤/天之後續劑量。每組具有2〇隻小鼠，且開始治療之前該組之平均腫瘤體積為2〇〇 mm3。研究的第四組包括 1〇隻在用Frz8-Fc (10毫克/公斤/天）藉由每週三次腹膜内注射治療之研究開始時平均腫瘤體積為336 mm3的小鼠。圖 26A為例示性流程圖，而圖26B為相對於時間繪示平均腫瘤體積的曲線圖，其中治療天數以又軸上之箭頭指示。圖 26C為繪示在研究第2〇天處死治療組中所有動物時之平均 124434.doc -146· 200819463 腫瘤重量的條形圖。圖26D及26E分別為平均腫瘤體積及腫瘤體積之平均變化％的總結表。獲自具有NTera2腫瘤異種移植物之小鼠之血清對Wnt信號轉導的抑制作用圖27為條形圖，其展示在NTera2腫瘤研究中，在Frz8-Fc Wnt拮抗劑之TOPglow檢定中，自各種動物分離之血清之 Wnt信號轉導拮抗劑活性。相對螢光素酶活性（γ軸）係由 TOPglow檢定自對照及Frz8-Fc Wnt拮抗劑量測而得。未向細胞中添加額外的經純化之Wnt或Wnt條件培養基。該等結果證明，在用Frz8-Fc Wnt拮抗劑治療之該等小鼠中， Wnt信號轉導減少與腫瘤尺寸減小相關。

Wnt拮抗劑對PA-1腫瘤異種移植物之生長的抑制作用用Wnt拮抗劑Frz8-Fc治療呈現PA-1腫瘤異種移植物之小鼠在治療12天内使得腫瘤生長明顯降低。在此模型中，治療期結束時腫瘤比對照小鼠中之腫瘤小約5〇%，質量明顯小於對照小鼠中之腫瘤。圖28證明Frz8-Fc治療對無胸腺裸小鼠中]?八_1腫瘤異種移植物生長之抗腫瘤功效。以丨5毫克/公斤/天將pBS、 CD4-Fc或Frz_Fc投與具有PA」腫瘤異種移植物之無胸腺裸小鼠，繼而每週三次藉由腹膜内注射投與1〇毫克/公斤7天之後續劑量。每組具有13隻小鼠，且開始治療之前該組之平均腫瘤體積為168 mm3。圖28A為例示性流程圖，而圖 26B為繪示平均腫瘤體積相對於時間之曲線圖，其中治療天數以X軸上之箭頭指示。圖28C為處死時平均腫瘤重量 124434.doc -147- 200819463 之曲線圖。細胞接種後第58天（開始治療後第32天）處死小鼠’且將腫瘤切除且稱重。繪示與該組有關的平均腫瘤重量士 SEM。圖28D及28E分別為平均腫瘤體積及腫瘤體積之平均變化％的總結表。實例11 移植有MMTV腫瘤且經Frz8-Fc及Frz5-Fc Wnt拮抗劑治療之小鼠中的Wnt信號轉導

Frz8-Fc及FrztFc Wnt拮抗劑對Wnt信號轉導的效應

Frz5_Fz如同Frz8-Fc—樣有效抑制Wnt3a誘導之信號轉導。將具有MMTV腫瘤（尺寸為約400-800立方毫米）的無胸腺裸小鼠用10 mg/kg之Frz8-Fc、Frz5-Fz或作為陰性對照之 CD4-Fc治療。治療後五小時，藉由心臟穿刺法自小鼠中收集血清，且如實例7所述分析Wnt對經Wnt3a活化且經 TOPglow轉染之293細胞的抑制效應。除NA(對照）外，所有樣本皆用約40 ng/mL經純化之Wnt3a處理。其他所有蛋白質對照係以5 gg/mL存在於培養基中。圖29展示經Frz8-Fc或Frz5-Fz治療之小鼠中的抑製程度。用Frz8-Fc或Frz5_ Fz處理產生類似的Wnt3a誘導之信號轉導之抑製程度。 Frz8-Fc及Frz5-Fc Wnt拮抗劑對Axin2表現的效應如藉由Wnt把基因Axin2之調節所測定，Frz8-Fc及Frz5-Fz化合物活體内抑制Wnt信號轉導。將具有MMTV腫瘤（尺寸為約400-800立方毫米）的無胸腺裸小鼠用10 mg/kg之Frz8-Fc、Frz5-Fz或作為陰性對照之 124434.doc -148- 200819463 CD4-Fc治療。治療後五小時，藉由心臟穿刺法自小鼠收集血清。使用 QIAGEN RNAEASY套組（Qiagen，Valencia，CA) 自腫瘤細胞提取RNA且如實例9中所述分析Axin2之表現。在獲自經Frz8-Fc或Frz5-Fz治療之小鼠的樣本中觀測到 Axin2之量減少，此表明該等化合物能夠活體内抑制Wnt信號轉導。圖30展示經Frz8-Fc及Frz5-Fz治療之腫瘤中之 Axin2表現減少，其中圖30A展示正規化為GAPDH表現之表現且圖30B展示正規化為rpll9表現之表現。實例12 經Wnt拮抗劑治療之再生組織

Wnt信號轉導在再生組織（諸如皮膚、腸及造血細胞）之自我更新中起關鍵作用，且在成熟小鼠中以Dkkl抑制Wnt 信號轉導會對該等組織之結構產生不利影響。以下實例檢測在小鼠中在用於獲得抗腫瘤功效之相同條件下曝露於 Frz8-Fc對腸及皮膚是否具有任何效應。每週三次、經14次治療後自在MMTV-Wntl腫瘤模型（描述於實例10中）中經治療之小鼠中收集組織，且藉由免疫組織化學法將切片中之 β-索烴素蛋白染色。對皮膚及各種腸代謝區之分析揭示，該等組織之結構在所有組之經治療小鼠中形態上表現正系’其中腸潘納斯細胞（intestinal Paneth cells)(圖3 1Α)及皮膚毛囊（圖3 1B)中之細胞質β_索烴素及細胞核卜索烴素具有典型的染色圖案。此外，對使用NTera-2模型每週三 -人、經九次治療後自動物收集之皮膚及腸的組織學及免疫組織化學分析亦揭示，對照組與治療組之間無差異。此說 124434.doc -149- 200819463 明’利用可抑制腫瘤生長之治療方案、用Frz8-Fc治療對皮膚及腸之組織更新不產生不利影響。實例13 此實例描述多種製備Wnt拮抗劑之方法。在大腸桿菌中表現Wnt拮抗劑此實例說明藉由在大腸桿菌中重組表現來製備Wnt拮抗劑之未糖基化之形式。初始，使用選定PCR引子擴增編碼wnt拮抗劑之DNA序列。該等引子應含有與所選表現載體上之限制性酶切位點相對應的限制性酶切位點。可使用多種表現載體。適當載體之實例為pBR322(來源於大腸桿菌；參見B〇livar等人， Gene，2:95 (1977)) ’其含有具有安比西林（anipicillin)抗性及四環素（tetracycline)抗性的基因。將載體用限制酶消化且去磷酸化。接著將經PCR擴增之序列連接至載體中。較佳地’載體包括編碼抗生素抗性基因之序列、trp啟動子、多聚組胺酸（polyhis)前導序列（包括開頭六個STII密碼子、多聚組胺酸序列及腸激酶裂解位點）、Wnt拮抗劑編碼區、 λ轉錄終止子及argU基因。接著使用連接混合物使用Sambrook等人，同上文中所述之方法轉化所選大腸桿菌菌株。轉化體係依據其在LB板上生長之能力來加以鑑別，且接著選擇抗生素抗性菌落。質體DNA可加以分離且藉由限制性分析及DNA測序來確定。可使所選純系在諸如補充有抗生素的LB肉湯之液體培養基中生長隔夜。隨後可使用隔夜培養物接種較大規模之 124434.doc -150- 200819463 培養物。接著使細胞生長至所要光學密度，期間開啟表現啟動子。將細胞再培養數小時後，可藉由離心收集該等細胞。藉由離心獲得之細胞塊可使用此項技術中已知之多種藥劑溶解，且接著可使用金屬螯合柱在容許蛋白質緊密結合之條件下純化所溶解之Wnt拮抗劑蛋白。

Wnt枯抗劑可使用以下程序以經p〇 1 y_η丨s標記之形式在 f 大腸桿菌中表現。初始，使用選定PCR引子擴增編碼Wnt

拮抗劑之DNA序列。引子含有與所選表現載體上之限制性酶切位點相對應的限制性酶切位點及其他提供有效且可靠的轉譯啟始、金屬螯合柱快速純化及利用腸激酶之蛋白水解移除的適用序列。接著將經PCR擴增經p〇1y_His標記的序列連接至表現載體中，使用其轉化基於菌株52 (W3110 fuhA (tonA) Ion galE rpoHts (htpRts) clpP (laclq))之大腸桿菌宿主。首先在搖動下使轉化體在⑽它下在含有5〇 mg/mL ，卡本西林（carbenicillin)的LB中生長，直至O.D.600達到3-5 1.. ' , 為止。接著將培養物以50-100倍稀釋於CRAP培養基（藉由混合以下物質所製備：3.57 g (NH4)2S04、0.71 g檸檬酸鈉·2Η20、1·〇7 g KCM、5.36 g Difco酵母提取物、5.36 g 於 500 mL水中之 Sheffield hycase SF，以及 110 mM MPOS (pH 7.3)、0.5 5% (w/v)葡萄糖及 7 mM MgS〇4)中，且在搖動下在30°C下生長約20-30小時。移除樣本以藉由SDS-PAGE分析驗證表現，且將整體培養物離心以使細胞成團。將細胞塊冷凍直至純化及再摺疊。 124434.doc -151 - 200819463 將來自0 ·5至1 L醱酵之大腸桿菌糊狀物（6_丨〇 g團塊）懸浮於10體積（w/ν)之7 Μ胍、20 mM Tris、pH 8緩衝液中。添加固體亞硫酸鈉及四硫酸鈉以分別形成0.1 m&〇〇2 M之最終濃度，且將溶液在4°C下攪拌隔夜。此步驟產生變性蛋白質，其中所有半胱胺酸殘基皆因亞硫酸化作用而被阻斷。將 H夜在 Beckman Ultracentifuge 中以 40,〇〇〇 rpm離心30分鐘。將上清液用3_5體積之金屬螯合柱緩衝液0 μ 胍、20 mM Tris、pH 7_4)稀釋且經由〇·22微米過濾器過濾以澄清。將經澄清之提取物裝載於經金屬螯合柱緩衝液平衡之5 ml Qmgen Ni-NTA金屬螯合柱上。將該柱用含有5〇 mM咪唑（Calbiochem，Utrol級）的其他緩衝液（ρΗ 7·4)洗滌。用含有250 mM咪唑的緩衝液將蛋白質溶離。彙集含有所要蛋白質的溶離份且在4。〇下儲存。蛋白質濃度係基於其胺基酸序列、使用計算出之消光係數、依據其28〇 nm 下之吸光度估算。

藉由將樣本緩慢地稀釋於剛製備由2〇 mM (pH 8.6)、0.3 M NaC卜2·5 M尿素、5續半胱胺酸、2〇福甘胺酸及1 mM EDTA組成之再摺疊緩衝液中使蛋白質再摺疊。選擇再摺疊體積以便最終蛋白質濃度在50至刚微克/ 笔升之間。將再摺疊溶液在4。。下輕柔攪拌ΐ2·36小時。藉由添加TFA直至最終濃度為〇 4% (ρΗ值為約3)來中止再摺且反應it纟純化蛋白質之前，將溶液經由ο.〗〗微米過遽器過滤且添加乙腈至2顧之最終濃度。使用〇i% tfa 之移動緩衝液、用1()至8()%之乙腈梯度溶離、經由p刪 124434.doc -152- 200819463

Ri/H逆相柱層析經再摺疊之蛋白質。以sds聚丙稀酿胺凝膠分析具有A280吸光度之各等分溶離份，且彙集含有經均勻再摺疊之蛋白質的溶離份。大部分蛋白質之適#再摺疊形式通吊在最低乙腈濃度下溶離出，因為彼等形式最緊密，其中其疏水性内部經屏蔽而不與逆相樹脂相互作用。聚集形式通常在較尚乙腈濃度下溶離。除將蛋白質之錯誤摺璺形式與所要形式拆分之外，逆相步驟亦將内毒素自樣本中移除。茱集含有所要摺疊型Wnt拮抗劑多肽的溶離份且使用指向溶液之輕緩氮氣流移除乙腈。使用於調配緩衝液中平衡且、、工無菌過/慮之G25 Superfine (Pharmacia)樹脂，藉由透析或藉由凝膠過濾將蛋白質調配於具有〇14 M氯化鈉及4% 甘路糖醇的20 mM Hepes (pH 6.8)中。在哺乳動物細胞中表現Wnt拮抗劑此實例說明藉由於哺乳動物細胞中重組表現來製備Wnt 拮抗劑之潛在糖基化形式。使用載體pRK5(參見I%9年3月ls日公開之砂3〇7,247) 作為表現載體。視情況，使用諸如Sambr〇〇k等人，同上文中所述之連接方法，以允許插入Wnt拮抗劑DNA之選定限制酶將Wnt拮抗劑DNA連接至pRK5中。為該實例之目的起見，所得載體稱為pRK5-WA。在一實施例中，所選宿主細胞可為293細胞。在培養基 (諸如補充有胎牛血清及視情況之營養組分及/或抗生素的 DMEM)中使人類293細胞（ATCC CCL· 1573)於組織培養板 124434.doc -153 - 200819463 中生長至融合。將約10 pg pRK5-WA DNA與約1 pg編碼VA RNA基因[Thimmappaya等人，Cell，31:543 (1982)]之DNA 混合且溶解於 500 μΐ 之 1 mM Tris-HCM、0.1 mM EDTA、 0.227 M CaCl2t。將 500 μΐ 之 50 mM HEPES (pH 7.35)、 280 mM NaCl、1.5 mM NaP04逐滴添加至該混合物中，且在25°C下歷時10分鐘形成沈澱物。將沈澱物懸浮且添加至 293細胞中且在37 °C下沈澱約四小時。吸出培養基且歷時 30秒添加2 ml於PBS中之20%甘油。接著將293細胞用無血清培養基洗滌，添加新鮮培養基，且將細胞培育約5天。轉染後約24小時，將培養基移除且置換為培養基（單獨）或含有200 pCi/ml 35S-半胱胺酸及200 pCi/ml 35S-甲硫胺酸的培養基。培育12小時後，收集條件培養基，以旋轉過濾器濃縮，且裝載在15% SDS凝膠上。將所處理之凝膠乾燥且曝露於膜歷時選定時期以揭示Wnt拮抗劑多肽之存在。含有經轉染之細胞的培養物可經歷進一步培育（於無血清培養基中）且以所選生物檢定法測試培養基。在一替代技術中，可使用Somparyrac等人，Proc· Natl. Acad. Sci·，12:75 75 (1981)所述之硫酸葡聚糠方法，將Wnt 拮抗劑瞬時引入293細胞中。使293細胞於旋轉燒瓶中生長至最大密度且添加700 gg pRK5-WA DNA。首先藉由離心將細胞自旋轉燒瓶中濃縮且用PBS洗滌。將DNA-葡聚糖沈澱物於細胞塊上培育四個小時。將細胞用20%甘油處理90 秒，用組織培養基洗滌且再引入含有組織培養基、5 pg/ml 牛胰島素及〇. 1 pg/ml牛運鐵蛋白的旋轉燒瓶中。約四天 124434.doc -154- 200819463 後，將條件培養基離心且過濾以移除細胞及碎片。接著可將含有所表現之Wnt拮抗劑的樣本濃縮且藉由任何選定方法（諸如透析及/或柱層析）純化。在另一實施例中，Wnt拮抗劑可在CH〇細胞中表現。可使用諸如CaP〇4或DEAE-葡聚糖之已知試劑將pRK5屬轉染入CHO細胞中。如上所述，可培育細胞培養物，且可將該培養基置換為培養基（單獨）或含有放射性標記（諸如Μ、 f 甲硫胺酸）的培養基。確定Wnt拮抗劑多肽存在後，可將培養基置換為無血清培養基。較佳地，將培養物培育約6天且接著收集條件培養基。接著可將含有所表現之Wnt拮抗劑的培養基濃縮且藉由任何選定方法純化。經抗原決定基標記之Wnt拮抗劑亦可於宿主CH〇細胞中表現。Wnt拮抗劑可自pRK5載體中次選殖。次純系插入物了、、、工歷PCR以與選疋抗原決定基標記（諸如_hs標記）同框融合至桿狀病毒表現載體中。接著可將經p〇ly_his標記之Wnt拮抗劑插入物次選殖至含有用於選擇穩定純系之選 V. 擇私δ己（諸如DHFR)的SV40驅動載體中。最後，可用s V40 驅動載體轉染CHO細胞（如上所述）。可如上所述執行標記以驗證表現。接著可將含有所表現之p〇1广his標記Wnt拮抗劑的培養基濃縮且藉由任何選定方法（諸如Ni2+_螯合親和層析）純化。

Wnt拮抗劑亦可藉由瞬時表現程序於ch〇及/或C0S細胞中表現’或藉由其他穩定表現程序於CH0細胞中表現。使用以下程序執行於CH0細胞中之穩定表現。蛋白質係 124434.doc -155- 200819463 以IgG構築體（免疫黏附素）之形式表現，其中使各別蛋白質之可溶形式（例如細胞外域）之編碼序列與含有鉸鏈、 CH2及CH2域的IgGl恆定區序列融合且/或為經poly-His標記之形式。繼 PCR擴增後，使用如 Ausubel等人，Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16? John Wiley and Sons (1997)中所述之標準技術，將各別DNA次選殖於CHO表現載體中。建構CHO表現載體以使所關注之DNA之5 =及3 =具有相容限制性位點以便於cDNA=之穿梭。用於在CHO細胞中表現之載體係如1^11〇&8等人，7\^(：/.^^/心7?以.24:9 1774-1779 (1996)中所述，且使用SV40早期啟動子/增強子以驅動所關注之cDNA及二氫葉酸還原酶（DHFR)之表現。 DHFR表現容許選擇以便在轉染後穩定維持質體。使用市售轉染試劑 SUPERFECTt® (Quiagen)、DOSPER® 或 FUGENE® (Boehringer Mannheim)將 12 微克所要質體 DNA引入約1千萬個CHO細胞中。如Lucas等人，同上文中所述培養該等細胞。將約3X 107個細胞於安瓿中冷凍以便如下所述進一步培養及製備。將含有質體DNA的安瓿藉由置於水浴中而融解且藉由渦旋加以混合。將内含物吸移至含有10 mL培養基之離心管中且在1000 rpm下離心5分鐘。吸出上清液且將細胞再懸浮於10 mL選擇性培養基（以0·2 Φιη過濾之PS20，其具有 5%以0.2 Φιη滲濾之胎牛血清）中。接著將細胞等分至含有 90 mL選擇性培養基的100 mL旋轉器中。1-2天後，將細胞 124434.doc -156- 200819463 轉移至裝有150 mL選擇性生長培養基之250 mL旋轉器中且在37°C下培育。再過2-3天後，將250 mL、500 mL及2000 mL旋轉器用3x105個細胞/毫升接種。藉由離心及再懸浮於製備培養基中而將細胞培養基換成新鮮培養基。儘管可使用任何適當CHO培養基，但實際上可使用美國專利第 5,122,469號（1992年6月16日頒予）中所述的製備培養基。將3 L製備旋轉以1 · 2 X 106個細胞/宅升接種。在第〇天測定細胞數、pH值。在第1天，對旋轉器取樣且開始以過濾空氣喷射。在第2天，對旋轉器取樣，將溫度調為33°C，且添加30 mL之500 g/L葡萄糖及0.6 mL之10%消泡劑（例如 35°/〇聚二甲基矽氧烷乳液、Dow Corning 365醫學級乳液）。在整個製備期間，必要時調整pH值以使其保持在約 7.2。10天後，或直至存活率降至70%以下，藉由離心及經由0.22 Φηι過濾器過濾來收集細胞培養物。將濾液在4°c下儲存或立即裝載在管柱上以進行純化。對於經poly-His標記之構築體，使用Ni-NTA柱（Qiagen) 純化蛋白質。純化之前，將咪唑添加至條件培養基中直至濃度為5 mM。將條件培養基在4°C下、以4_5 ml/min之流速抽吸至於含有0·3 M NaCl及5 mM_唾之20 mM Hepes (pH 7·4)緩衝液中平衡之6 ml Ni-NTA柱上。裝載後，將該柱再用平衡緩衝液洗滌且將蛋白質用含有〇·25 Μ咪唑之平衡緩衝液溶離。隨後經由25 ml G25 Superfine (Pharmacia) 柱將經高度純化之蛋白質脫鹽至含有10 mM Hepes、0.14 ]^如(：1及4%甘露糖醇之儲存緩衝液（13116.8)中，且在_8〇 124434.doc -157- 200819463 °c下儲存。如下將免疫黏附素（含有Fc)構築體自條件培養基中純化。將條件培養基抽吸至已於20 mM磷酸鈉緩衝液（pH 6·8)中平衡之5 ml蛋白質A柱（Pharmacia)上。裝載後，將該柱用平衡緩衝液充分洗滌，再用1〇〇 mM擰檬酸（pH 3.5)溶離。將溶離出之蛋白質藉由收集1瓜丨溶離份置於含有275 ΦΕ之1 M Tris緩衝液（pH 9)的試管内來立即中和。隨後如以上對於poly-his標記蛋白質所述，將經高度純化之蛋白質脫鹽至儲存緩衝液中。藉由SDS聚丙烯醯胺凝膠及依據 Edman降解之N-末端胺基酸測序評估同源性。在酵母中表現Wnt拮抗劑以下方法描述在酵母中重組表現Wnt拮抗劑。首先，建構酵母表現載體以自ADH2/GAPDH啟動子細胞内製備或分泌Wnt拮抗劑。將編碼Wnt拮抗劑及啟動子之 DNA插入選定質體中之適當限制性酶切位點中以指導Wnt 抬抗劑之細胞内表現。為分泌起見，可將編碼Wnt拮抗劑之DNA連同編碼ADH2/GAPDH啟動子、天然Wnt#抗劑信號肽或其他哺乳動物信號肽的DNA或例如酵母α_因子或轉化酶分泌信號/前導序列及連接子序列（若需要）一起選殖至所選用於表現Wnt拮抗劑之質體中。接者可用上述表現質體轉化諸如酵母菌株Ab 11 〇之酵母細胞，且於選定醱酵培養基中培養。可藉由用1〇0/〇三氣乙酉文沈;殿且以SDS-PAGE分離’繼而用庫馬斯藍毕料將凝勝染色來分析經轉化之酵母上清液。 124434.doc -158- 200819463 重組Wnt拮抗劑可隨後加以分離且藉由經離心自醱酵培養基中移除酵母細胞且接著使用選定濾筒式過濾器濃縮該培養基來加以純化。含有Wnt拮抗劑之濃縮物可使用選定柱層析樹脂進一步加以純化。在經桿狀病毒感染之昆蟲細胞中表現Wnt拮抗劑以下方法描述在經桿狀病毒感染之昆蟲細胞中重組表現 Wnt拮抗劑。將編碼Wnt拮抗劑之序列融合於包含於桿狀病毒表現載體中之抗原決定基標記之上游。該等抗原決定基標記包括 poly-his標記及免疫球蛋白標記（如IgG之Fc區）。可使用多種質體’包括來源於市售質體（諸如pVL 13 93 (Nov agen))的質體。簡言之，若蛋白質為細胞外蛋白質，則將編碼Wnt 拮抗劑之序列或Wnt拮抗劑編碼序列之所要部分，諸如編碼跨膜蛋白質之細胞外域之序列或編碼成熟蛋白質之序列，用與5’及3’區互補之引子藉由PCR加以擴增。5’引子可併有側接（選定）限制性酶位點。接著將產物用彼等選定限制性酶消化且次選殖至表現載體中。藉由使用脂染劑（lipofectin)(購自GIBCO-BRL)將上述質體及B ACULOGOLD™病毒DNA (Pharmingen)共轉染至草地黏蟲而）（’’Sf9”）細胞（ATCC CRL 1711)中產生重組桿狀病毒。在28 °C下培育4-5天後，收集釋放出之病毒且用於進一步擴增。如O’areilley等人， Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)所述執行病毒感染 124434.doc -159- 200819463 及蛋白質表現。所表現之經poly-his標記之Wnt拮抗劑接著可例如藉由 * 2 1

Ni -螯合親和層析如下加以純化。如RUpert等人，Nature， 362:175-179 ο"3)所述自經重組病毒感染之sf9細胞製備提取物。簡言之，將Sf9細胞洗滌、再懸浮於超音波處理緩衝液（25 mL Hepes，pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 1〇〇/0甘油；〇」〇/〇 Np_4〇; 〇·4 m KC1)中，且在冰上超 f 音波處理兩次歷時20秒。藉由離心澄清超音波處理液，且將上清液於裝載緩衝液（5〇鱗酸鹽、3〇〇 mM NaCl、 10〇/〇甘油，PH 7.8)中稀釋50倍且經由〇·45 (1)111過濾器過濾。製備床體積為5 mL的Ni2+-NTA瓊脂糖柱（購自

Qiagen)，用25 mL水洗滌且用25 mL裝載緩衝液平衡。將經過濾之細胞提取物以每分鐘〇·5 mL裝載於柱上。用裝载緩衝液將柱洗滌至基線，此時開始收集溶離份。接者，將柱用溶離非特異性結合之蛋白質的第二洗務緩衝液 (50 mM鱗酸鹽、300 mM NaCM、1〇%甘油，pH 6 〇)洗滌。再次達到Amo基線後，將柱用於第二洗滌緩衝液中之〇至 500 坐梯度顯現。收集！祉溶離份，且用接合至驗性磷酸酶之Ni2+_NTA (Qiagen)藉由SDS_pAGE及銀染色法或西方墨點法分析。彙集含有溶離出之叫。標記㈣拮抗劑的溶離份且以裝載緩衝液透析。或者，經IgG標記（或Fc標記）之Wnt抬抗劑之純化可使用已知層析技術(包括例如蛋白質A或蛋白質〇柱層析法)執行0 124434.doc -160- 200819463 使用親和層析法來純化Wnt拮抗劑多肽天然或重組Wnt拮抗劑多肽可藉由蛋白質純化技術領域中之多種標準技術純化。舉例而言，原- Wnt、成熟Wnt或前-Wnt拮抗劑多肽可使用對所關注之Wnt拮抗劑多肽具有特異性之抗體藉由免疫親和層析法純化。一般而言，免疫親和柱係藉由使Wnt拮抗劑多肽與活化層析樹脂共價偶合來建構。或者，含有Fc域的Wnt拮抗劑可使用固定化蛋白質A樹脂（諸如pr〇sepA (Millip0re))直接自培養基中純化。多株免疫球蛋白係藉由以硫酸銨沈殿或以固定化蛋白質 A純化（Pharmacia LKB生物工藝學，Piscataway，NJ)自免疫血清中製備。同樣，單株抗體係藉由硫酸銨沈澱或固定化蛋白質A層析自小鼠腹水中製備。將經部分純化的免疫球蛋白共價連接至層析樹脂，諸如經CnBr活化之 SEPHAROSEtm (Pharmacia LKB Bi〇techn〇1〇gy)。使抗體與树月曰偶合，將樹脂阻斷，且根據製造商之說明洗滌衍生物樹脂。該免疫親和柱可用於藉由自含有可溶形式Wnt拮抗劑之細胞製備溶離份純化Wnt拮抗劑多肽。藉由添加清潔劑或此項技術中热知之其他方法溶解完整細胞或經由差速離心獲得之亞細胞部分來獲得該製劑。或者’可使含有信號序列之可/合性Wnt拮抗劑多肽以適用量分泌至該等細胞所生長之培養基中。使3有可溶性Wnt拮抗劑多肽的製劑通過免疫親和柱，且將柱在谷許優先吸收Wnt拮抗劑多肽之條件下（例如，清 124434.doc 161 - 200819463 潔劑存在下之高離子濃度緩衝液）洗滌。接著，將柱在中斷抗體/Wnt拮抗劑結合的條件下（例如低pH值缓衝液，諸如約pH 2-3 ;或高濃度離液劑，諸如尿素或硫氰酸根離子）溶離，且收集Wnt拮抗劑多肽。文獻目錄 1. He TC，Sparks AB，Rago C 等人，Identification of c_MYC as a target of the APC pathway. Sc/⑼ce 1998; 281: 1509_1512 〇 2. Tetsu O, McCormick F. Beta-catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells. iVaiwre 1999; 398: 422-426 o 3. He TC5 Chan TA, Vogelstein B5 Kinzler KW. PPAR delta is an APC-regulated target of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Cell 1999; 99: 335-345。 4. Koh TJ5 Bulitta CJ, Fleming JV, Dockray GJ, Varro A, Wang TC. Gastrin is a target of the beta-catenin/TCF-4 growth-signaling pathway in a model of intestinal polyposis· «/C7z>22000; 106: 533-539 o 5. Sansom OJ，Reed KR，Hayes AJ 等人，Loss of Ape w vzw immediately perturbs Wnt signaling, differentiation, and migration. Genes Dev 2004; 18: 1385-1390。 6. Chen TA，Yang I，Irby R等人，Regulation of caspase expression and apoptosis by adenomatous polyposis coli· 2003; 63: 4368-4374。 7. Paoni NF, Feldman MW, Gutierrez LS5 Ploplis VA, Castellino FJ. Transcriptional profiling of the transition from normal intestinal epithelia to adenomas and carcinomas in the APC(Min/+) mouse. Physiol Genomics 2003;15:228-235。 124434.doc -162- 200819463 8. Zhang T，Otevrel T，Gao ZQ 等人，Evidence that APC regulates survivin expression: a possible mechanism contributing to the stem cell origin of colon cancer. Qmcer 及烈 2001; 61: 8664-8667 o 9. Howe LR5 Subbaramaiah K, Chung WJ5 Dannenberg AJ? Brown AMC.

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DeAlmeida，VL·，Miao L，Ernst JA，Koeppen H·，Polakis P·，Rubinfeld， B5 The soluble Wnt receptor Frizzled8CRD-hFc inhibits the growth of teratocarcinomas in vivo, 2007; 67: 5371-5379 o 【圖式簡單說明】圖1為典型Wnt信號轉導途徑處於”斷開’’或非活性狀態與處於’’導通”或活性狀態下之簡略圖。 / 圖2為表示與人類免疫球蛋白域之Fc區連接之Frizzled細胞外域的示意圖。圖3為17種已知之Frizzled蛋白細胞外域的比對。圖3 A展示10種原-Frizzled蛋白之細胞外域（SEQ ID NO: 35-44)及5 種原-sFRP蛋白之細胞外域（SEQ ID NO: 45-49)的比對，而圖3B展示10種成熟Frizzled蛋白之細胞外域（SEQ ID NO: 50-59)及5種成熟sFRP蛋白之細胞外域（SEQ ID NO: 60-64) 以及成熟Ror蛋白之細胞外域（SEQ ID NO: 65-66)的比對。 124434.doc -164- 200819463 相似殘基以灰色框住，相同殘基以星號指明。相似殘基分組為酸性、驗性、極性及非極性殘基。在圖3B中，最小 CRD (ECD)域指明於兩個框形標箭頭的線之間（SEq ID NO: 18-34)。圖4展示Frz (156)-Fc及Frz (173)-Fc嵌合型構築體之序列。圖 4A展示較長的 prz (173)-Fc序列（SEQ ID NO: 113)。刖V仏號序列以粗體展示（亦即開頭24個N-末端胺基酸殘基）。殘基25-27為可存在於或不存在於成熟蛋白質中的丙胺酸殘基。使較長（Frzl73)嵌合型構築體有別於較短 (Frzl 56)嵌合型構築體之額外Frz8受體序列以加框文字展示（亦即殘基157-173)。連接子序列（亦即殘基174_182)加有下劃線’而Fc域序列以斜體展示（亦即殘基183_4〇9)。圖4B 展示較短的Frz (156)-Fc (SEQ ID NO: 74)。前導信號序列以粗體展示（亦即開頭24個N-末端胺基酸殘基）。殘基25-27 為可存在於或不存在於成熟蛋白質中的丙胺酸殘基。連接子序列（亦即殘基157-164)加有下劃線，而Fc域序列以斜體展示（亦即殘基165-391)。圖5A-5H展示編碼數種Wnt拮抗劑嵌合型構築體的核酸序列（Frzl-Fc (SEQ ID NO: 115)，Frz2-Fc (SEQ ID NO: 116)，Frz3-Fc (SEQ ID NO: 117)，Frz4-Fc (SEQ ID NO: 118)，Frz5_Fc (SEQ ID NO: 119)，Frz6-Fc (SEQ ID NO: 120)，Frz7-Fc (SEQ ID NO: 121)，Frz8-Fc (SEQ ID NO: 122), Frz9-Fc (SEQ ID NO: 123), FrzlO-Fc (SEQ ID NO: 124), sFRPl-Fc (SEQ ID NO: 125), sFRP2-Fc (SEQ ID NO: 124434.doc -165- 200819463 126)，sFRP3-Fc (SEQ ID NO: 127)，sFRP4-Fc (SEQ ID NO: 128)及 sFRP5-Fc (SEQ ID NO: 129))。圖6A-6E展示人類Frz、sFRP及Ror蛋白之全長胺基酸序列。圖7(A、B及C)展示數種Wnt拮抗劑嵌合型構築體之胺基酸序列（Frzl-Fc (SEQ ID NO: 76)，Frz2-Fc (SEQ ID NO: 77)，Frz3-Fc (SEQ ID NO: 78)，Frz4-Fc (SEQ ID NO: 79)， Frz5-Fc (SEQ ID NO: 15), Frz6-Fc (SEQ ID NO: 80), Frz7-Fc (SEQ ID NO: 81)，Frz8-Fc (SEQ ID NO: 74)，Frz9-Fc (SEQ ID NO: 82), FrzlO-Fc (SEQ ID NO: 83), sFRPl-Fc (SEQ ID NO: 84)，sFRP2-Fc (SEQ ID NO: 85), sFRP3-Fc (SEQ ID NO: 86)，sFRP4-Fc (SEQ ID NO: 87)及 sFRP5-Fc (SEQ ID NO: 8 8))。Ffzl-Fc(開頭28個N-末端胺基酸殘基）、Frz2-Fc(開頭31個N-末端胺基酸殘基）、Frz3-Fc(開頭 31個N-末端胺基酸殘基）、Frz4-Fc(開頭31個N-末端胺基酸殘基）、Frz5-Fc(開頭31個N-末端胺基酸殘基）及SFRP3-Fc(開頭3 1個N-末端胺基酸殘基）之粗體文字指示非天然前導序列。連接子加有下劃線，且繼連接子之後之Fc域以斜體展示。圖8展示Frizzled細胞外域之比對，其中塗黑展示所有受體共有之保守型殘基且塗灰表示同源群組共有之保守型殘基。圖9展示基於全長與細胞外域序列一致性分類為各家族之 Frizzled 〇 124434.doc •166- 200819463 圖10描繪自CHO細胞表現且純化之純化型Frizzled_Fc融合蛋白之樣本。樣本係經由非還原型Sds-PAGE凝膠分離且藉由庫馬斯染色法（C〇omassie staining)成像。圖11展示兩種不同Frz8-Fc嵌合體Frz8 (173)-Fc與Frz (156)-Fc之血清穩定性之比較。圖11A為人類fc之免疫印跡’其用於偵測在遞增時點存在於注射有嵌合體之無胸腺裸小鼠之血清中的嵌合蛋白。圖11B展示藉由以相對螢光素酶活性形式量測TOPglow活性（展示於γ軸上）來檢定之嵌合蛋白之Wnt抑制活性。圖12為用Frz8 (173)-Fc嵌合體治療後腫瘤體積隨時間之曲線圖。圖13展示投與單次劑量之蛋白質後，Frz8-Fc之藥物動力學（？幻資料。圖13八為經？1^84(：治療之小鼠之淨血清之免疫印跡，其展示對20或5 mg/kg靜脈内或20 mg/kg腹膜内給藥後第7天及第7天後血清之偵測。圖13B及13C為由藥物動力學研究所測定之Frz8-Fc血清含量之圖示。圖13D為 Frz8-Fc藥物動力學之雙相模型之參數概述。圖14證明當與二聚Fc域連接時Frz8-ECD阻斷Wnt3a信號轉導之能力增強。圖14A為Frz8 (156)-FC之兩種不同製劑之Wnt3a抑制檢定的IC5〇曲線圖。圖14B為確定所分離之 Frz8 (156) CRD (ECD)之純度的凝膠電泳圖。圖示為：（a) 非還原型Frz8 ECD(泳道1) ; (b)分子量標記（泳道2)及還原型 Frz8 ECD(泳道 3)。圖15證明Wnt3a與Frz8-Fc嵌合體直接結合。圖15A為證 124434.doc -167- 200819463 明經純化之可溶性Wnt3a與固定化Frz8-Fc結合的BIAcore 感測圖譜。圖15B為經純化之可溶性Wnt3a經由固定化 Frz8-Fc之免疫沈澱檢定。圖16證明如使用〇cTETTM系統所量測，若干種Frz-Fc嵌合體與Wnt配體直接結合。圖16A展示Wnt3a與Frzl-FrzlO-Fc嵌合體結合之資料，圖16B展示Wnt3a與sFRP-Fc嵌合體結合之資料。圖16C展示Wnt5a與Frzl-FrzlO-Fc嵌合體及 sFRP-Fc嵌合體結合之資料。圖17展示Wnt拮抗劑對經TOPglow螢光素酶TCF報導質體瞬間轉染之經Wnt激發之細胞的影響。圖17A展示經 Wnt3a激發之細胞且圖17B展示經Wnt-5a激發之細胞。除報導基因外，欲經Wnt5a處理之細胞亦經Frz4及Lrp5轉染。用 100 ng/ml Wnt3a或 1 pg/ml Wnt5a將 293(人類腎）細胞活化。細胞接著不處理、用對照Fc處理或用於PBS中之經純化之Frz-Fc蛋白處理，且就螢光素酶反應進行檢定。圖18展示Wnt拮抗劑對經螢光素酶TCF報導質體穩定轉染之U20S(人類骨肉瘤）細胞中之Wnt信號轉導之抑制。以 Wnt3a活化在細胞中得到初始Wnt信號轉導。圖19展示Frz8_Fc對Wnt_靶基因在所培養之畸胎瘤細胞及腫瘤異種移植物中之表現的影響。圖19A展示Wnt-靶基因在經Wnt3a及Frz8-Fc處理之PA-1細胞株中之表現。使自經Wnt3a、Frz8-Fc或對照Fc蛋白處理之PA-1細胞中所分離之RNA經受微陣列分析，且對指定基因之表現量回應外源添加之Wnt3a、Frz8-Fc及對照Fc蛋白之變化作圖。柱形意 124434.doc -168- 200819463 謂三個孔之表現量；條形意謂標準誤差。圖19B展示小鼠 NTera-2腫瘤中Wnt靶基因APCDD1、Gad-Ι及Fzd5之相對表現量，設定PBS、CD4-Fc或Frz8-Fc相對於PBS對照。此資料表示指定腫瘤數之平均表現量且代表至少兩個雙重複進行的獨立qRT-PCR實驗。亦呈示藉由將經純化Wnt3a添加至相應培養細胞中來調控各種基因之表現。圖20展示用於即時定量Pcr分析圖19中所示之基因表現之引子及探針的寄存編號及序列（實例9)。圖21為描述用於轉染以形成Wnt動物模型之載體構築體的線形示意圖。圖22說明Frz8-Fc藉由腹膜内（IP)給藥在無胸腺裸小鼠中抗MMTV-Wnt腫瘤移植體之功效。圖22A為展示接受 MMTV-Wnt-Ι腫瘤移植體之裸小鼠之資料的曲線圖，該等裸小鼠藉由腹膜内注射每週兩次投與PBS、CD4-FC (1〇毫克/公斤/天）或Frz8-Fc (10毫克/公斤/天）。相對時間對平均腫瘤體積作圖，且治療天數由X軸上之箭頭指示。圖22b 為四個治療組之平均腫瘤體積及腫瘤體積之平均變化％隨時間之總結表。圖23說明Frz8-Fc藉由靜脈内（IV)給藥在無胸腺裸小鼠中抗MMTV-Wnt腫瘤移植體之功效。圖23A盔厨- ^ Λ两展示接受 MMTV-Wnt-Ι腫瘤移植體之裸小鼠之資料的曲線圖，該等裸小鼠藉由靜脈内注射每週三次投與PBS、CD4 c ( 1 〇毫克/公斤/天）或Frz8-Fc (10毫克/公斤/天）。相對時間對平均腫瘤體積作圖，且治療天數由X轴上之籥一

J啤知不。圖23B 124434.doc -169- 200819463 為四個治療組之平均腫瘤體積及腫瘤體積之平均變化％隨時間之總結表。圖24為展示在TOPglow檢定中，各種Wnt拮抗劑在自 MMTV Wnt腫瘤研究所分離之血清中之Wnt信號轉導拮抗活性的柱形圖。X軸樣本係根據治療、小鼠研究數目及稀釋度、以群組A-E(圖24A)或A-F(圖24B)呈現。TOPGLOW 基因報導基因檢定中之相對螢光素酶活性展示於Y轴上。除NA(對照）外，所有樣本皆用約40 ng/mL經純化Wnt3a治療。其他所有蛋白質對照以5 pg/mL存在於培養基中。圖 24A展示自IP治療小鼠所分離之血清的測試結果，而自IV 治療小鼠所分離之血清的測試結果呈現於圖24B中。圖25展示在TOPglow檢定中，在不存在（圖25A)或存在 (圖25B)外源添加之Wnt3a之情況下，各種Wnt拮抗劑在指定畸形癌細胞株中之Wnt信號轉導拮抗活性。在各種細胞株中之活性係相對於任何治療不存在（NA)之情況下所觀測之活性表示（代表至少兩個獨立實驗）。相對螢光素酶活性 (Y軸）係由TOPglow檢定、在Wnt抑制劑存在或不存在之情況下自各種癌症細胞株測得。圖26證明Frz8(156)-Fc治療對無胸腺裸小鼠中NTera2腫瘤異種移植體之生長的抗腫瘤功效。圖26A為流程圖，而圖26B為相對時間繪製平均腫瘤體積的曲線圖，其中治療天數以X軸上之箭頭指示。圖26C為在研究第20天對處死治療組中所有動物時之平均腫瘤重量繪製的柱形圖。圖 26D及26E分別為平均腫瘤體積及腫瘤體積之平均變化％的 124434.doc •170- 200819463 總結表。圖27為展示在NTera2腫瘤研究中自多種動物所分離之血清如藉由TOPgl〇w檢定所測定之Wnt信號轉導拮抗活性的柱形圖。γ軸展示TOPglow檢定中對照物及Frz8-Fc Wnt拮抗劑之相對螢光素酶活性（Y軸）。未向細胞添加額外的經純化Wnt或Wnt條件培養基。圖28展示Frz8 (156)-Fc治療對無胸腺裸小鼠中pa-1腫瘤異種移植體之生長的抗腫瘤功效。圖28A為流程圖，而圖 28B為相對時間繪製平均腫瘤體積的曲線圖。圖28C為處死時平均腫瘤重量之曲線圖。對與該組有關的平均腫瘤重量土SEM作圖。圖28D及28E分別為平均腫瘤體積及腫瘤體積之平均變化％的總結表。圖29展示在經Frz8-Fc或Frz5-Fz治療之小鼠中，如藉由 TOPglow檢定所測定之Wnt信號轉導抑制。Y轴展示 TOPglow檢定中對照物及Frz8-Fc及Frz5-Fc Wnt拮抗劑之相對螢光素酶活性（Y轴）。圖30展示經Frz8-Fc及Frz5-Fz治療之腫瘤中之Axin2表現減少，其中圖30A展示對GAPDH之表現正規化的表現且圖 30B展示對rp 119之表現正規化的表現。圖31展示β-索烴素之IHC染色之免疫組織化學（IHC)顯微照片且證明Frz8-Fc對再生組織（諸如腸及皮膚）之治療呈現正常。圖31A展示經PBS (A-1)、對照蛋白質（A-2)及Frz8-Fc (A-3)治療之小鼠之小腸中β-索烴素之IHC。圖31B展示經PBS (B_l)、對照蛋白質（B-2)及Frz8-Fc (B-3)治療之小 124434.doc -171 - 200819463 鼠之皮膚中β-索烴素之IHC。圖32說明人類乳癌中之活性Wnt信號轉導。圖32A展示最初報導於Wong等人，J· Pathol· 196: 145 (2002)中之正常 (A-1)、低度（A-2)及高度（A-3)人類乳房腫瘤中Wnt_i之表現（如藉由活體外雜交所展示）。圖32B展示乳癌患者中卜索烴素之細胞核（B-1)及細胞質（B-2)定位（如藉由IHC所展示）。亦展示Kaplan-Meier存活率曲線（B-3)，其展示與指定β-索烴素表現模式相關之患者存活機率。此資料最初報導於 Lin等人 ’ P.N.A.S· (USA) 97 (8): 4262-66 (2000)中。圖32C為與自患有侵襲性導管癌（her_2陰性）之患者所分離之組織比較，對自非癌症患者之正常乳房中之界价“表現的微陣列分析。 124434.doc -172- 200819463 序列表 <11〇>美商建南德克公司 <120> WNT拮抗劑及其用於診斷及治療wnt-中介性病症之用途 <130> P2368R1 <140> 096133617 <141> 2007-09-07 <150> US 60/825,063 <151> 2006-09-08 <150> US 60/951,175 <151〉 2007-07-20 <160> 129 <170〉Patent In version 3.4 <2I()> 1

<21]> 646 ^ <212> PRT <213>智人 <400〉 1

Met Ala Glu GIu Glu Ala Pro Lys Lys Ser Arg Ala Ala Gly Gly Gly 1 5 10 15

AlaScrTrpG.u Uu CyS Ala Gly Ala Leu Ser Ala Arg Leu Ala Glu

Glu Gly Ser Gly Asp Ala Gly Gly Arg Arg Arg Pro Pro Val Asp Pro 35 40 45

Arg Arg Leu Ala Arg Gin Leu Leu Leu Leu Leu Trp Leu Leu Glu Ala 50 55 60

Pro Leu Leu Leu Gly Val Arg Ala Gin Ala Ala Gly Gin Gly Pro Gly 65 70 75 80

Gin Gly Pro Gly Pro Gly Gin Gin Pro Pro Pro Pro Pro Gin Gin Gin 85 90 95

Ciln Ser Gly Gin Gin Tyr Asn Gly Glu Arg Gly lie Ser Val Pro Asp 100 105 110

His Gly Tyr Cys Gin Pro lie Ser lie Pro Leu Cys Thr Asp lie Ala 115 120 125

Tyr Asn Gin Thr lie Met Pro Asn Leu Leu Gly His Thr Asn Gin Glu 130 135 140

Asp Ala Gly Leu Glu Val His Gin Phe Tyr Pro Leu Val Lys Val Gin 145 150 155 160

Cys Ser Ala Glu Leu Lys Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Ala Pro Val 165 170 175

Cys Thr Val Leu Glu Gin Ala Leu Pro Pro Cys Arg Ser Leu Cys Glu 124434-序列表.doc 200819463 180 185 190

Arg Ala Arg Gin Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys Phe Gly Phe Gin 195 200 205

Trp Pro Asp Thr Leu Lys Cys Giu Lys Phe Pro Val His Gly Ala Gly 210 215 220

Glu Leu Cys Val Gly Gin Asn Thr Ser Asp Lys Gly Thr Pro Thr Pro 225 230 235 240

Scr Leu Leu Pro Glu Phe Trp Thr Ser Asn Pro Gin His Gly Gly Gly 245 250 255

Gly His Arg Gly Gly Phe Pro Gly Gly Ala Gly Ala Ser Glu Arg Gly 260 265 270

Lys Phe Ser Cys Pro Arg Ala Leu Lys Val Pro Ser Tyr Leu Asn Tyr 275 280 285

His Phe Leu Gly Glu Lys Asp Cys Gly Ala Pro Cys Glu Pro Thr Lys 290 295 300

Val Tyr Gly !xu Met Tyr Phe Gly Pro Glu Glu Leu Arg Phe Ser Arg 305 310 315 320

Thr 丁rp lie Gly lie Trp Ser Val Leu Cys Cys Ala Ser Thr Leu Phe 325 330 335

Thr Val Leu Thr Tyr Leu Val Asp Met Arg Arg Phe Ser Tyr Pro Glu 340 345 350

Arg Pro lie lie Phe l.eu Ser Gly Cys Tyr Thr Ala Val Ala Val Ala 355 360 365

Tyr lie Ala Gly Phe Leu Leu Glu Asp Arg Val Val Cys Asn Asp Lys 370 375 380

Phe Ala Glu Asp Gly Ala Arg Thr Val Ala Gin Gly Thr Lys Lys Glu 385 390 395 400

Gly Cys rlljr lie Leu Phe Mel Met Leu Tyr Phe Phe Ser Met Ala Ser 405 410 415

Ser lie Trp Trp Val lie Leu wScr Leu Thr Trp Phe Leu Ala Ala Gly 420 425 430

Mel Lys Trp Gly His Glu Ala lie Glu Ala Asn Ser Gin Tyr Phe His 435 440 445

Leu Ala Ala Trp Ala Val Pro Ala lie Lys Thr lie Thr lie Leu Ala 450 455 460

Leu (ily Gin Val Asp Gly Asp Val Leu Ser Gly Val Cys Phe Val Gly Ί65 470 475 480 -2- 124434-序列表.doc 200819463

Leu Asn Asn Val Asp Ala Leu Arg Gly Fhe Val Leu Ala Pro Leu Phe 485 490 495

Val Tyr Ixu Phe lie Gly Thr vSer Phe Leu Leu Ala Gly Phe Val Ser 500 505 510

Leu Phe Arg lie Arg Thr lie Met Lys His Asp Gly Thr Lys Thr Glu 515 520 525

Lys Leu Glu Lys Leu Met Val Arg lie Gly Val Phe Ser Val Leu Tyr 530 535 540

Thr Val Pro Ala Thr lie Val lie Ala Cys Tyr Phe Tyr Glu Gin Ala 545 550 555 560

Phe Arg Asp Gin Trp Glu Arg Ser Trp Val Ala Gin Ser Cys Lys Ser 565 570 575

Tyr Ala lie Pro Cys Pro His Leu Gin Ala Gly Gly Gly Ala Fro Pro 580 585 590

His Pro Pro Met Ser Pro Asp Phe Thr Val Phe Met He Lys Tyr Leu 595 600 605

Met Thr Leu lie Val Gly I)e Thr Ser Gly Phe Trp lie Trp Ser Gly 610 615 620

Lys Thr Leu Asn Ser Trp Arg Lys Phe Tyr Thr Arg Leu Thr Asn Ser 625 630 635 640

Lys Gin Gly Glu Thr Thr 645 <210〉 2 <211> 565 <212〉 PKT <213〉智人 <400> 2 /

Met Arg Pro Arg Ser Ala Leu Pro Arg Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu 1 5 10 15

Leu Pro Ala Ala Gly Pro Ala Gin Phe His Gly Glu Lys Gly lie Ser 20 25 30 lie Pro Asp His Gly Phe Cys Gin Pro lie Ser lie Pro Leu Cys Thr 35 40 45

Asp lie Ala Tyr Asn Gin Thr He Met Pro Asn Leu Leu Gly His Thr 50 55 60

Asn Gin Glu Asp Ala Gly Leu Glu Val His Gin Phe Tyr Pro Leu Val 65 70 75 80

Lys Val Gin Cys Ser Pro Glu Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr 85 90 95 124434-序列表.doc 200819463

Ala Pro Val Cys Thr Val Leu Glu Gin Ala lie Pro Pro Cys Arg Ser 100 105 110 11c Cys Glu Ser Ala Arg Gin Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys Phe 115 120 125

Gly Phc Gin Trp Pro Glu Arg Leu Arg Cys Glu His Phe Pro Arg His 130 135 140

Gly Ala Glu Gin lie Cys Val Gly Gin Asn His Ser Glu Asp Gly Ala 145 150 155 160

Pro Ala Leu Leu Thr Thr Ala Pro Pro Pro Gly Leu Gin Pro Gly Ala 165 170 175

City Gly Thr Pro Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ala Pro Pro Arg Tyr 180 185 190

Ala Thr Leu Glu His Pro Phe His Cys Pro Arg Val Leu Lys Val Pro 195 200 205

Ser Tyr Leu Ser Tyr Lys Phe Leu Gly Glu Arg Asp Cys Ala Ala Pro 210 215 220

Cys Glu Pro Ala Arg Pro Asp Gly Ser Met Phe Phe Ser Gin Glu Glu 225 230 235 240

Thr Arg Phe Ala Arg Leu Trp lie Leu Thr Trp Ser Val Leu Cys Cys 245 250 255

Ala Ser Thr Phe Phe Thr Val Thr Thr Tyr Leu Val Asp Met Gin Arg 260 265 270

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Met Val Ser Val Ala Tyr lie Ala Gly Phe Val Leu Gin Glu Arg Val 290 295 300 /

V

Val Cys Asn Glu Arg Phe Ser Glu Asp Gly Tyr Arg Thr Val Val Gin 305 310 315 320

Gly Thr Lys Lys Glu Gly Cys Thr lie Leu Phe Met Met Leu Tyr Phe 325 330 335

Phe Ser Met Ala Ser Ser lie Trp Trp Val lie Leu Ser Leu Thr Trp 340 345 350

Phe Leu Ala Ala Gly Met Lys Trp Gly His Glu Ala lie Glu Ala Asn 355 360 365

Scr Gin Tyr Phe His Leu Ala Ala Trp Ala Val Pro Ala Val Lys Thr 370 375 380 lie Thr lie Leu Ala Met Gly Gin lie Asp Gly Asp Leu Leu Ser Gly 385 390 395 400 -4- 124434·序列表.doc 200819463

Val Cys Phe Val Gly Leu Asn Ser Leu Asp Pro Leu Arg Gly Phe Val 405 410 415

Leu Ala Pro Leu Phe Val Tyr Leu Phe He Gly Thr Ser Phe Leu Leu 420 425 430

Ala Gly Phe Val Ser Leu Phe Arg lie Arg Thr lie Met Lys His Asp 435 440 445 (lly Thr Lys Thr Glu I.ys Leu Glu Arg Leu Met Val Arg He Gly Val 450 455 460

Phe Ser Val Leu Tyr Thr Val Pro Ala Thr lie Val He Ala Cys Tyr 465 470 475 480

Phe Tyr Glu Gin Ala Phe Arg Glu His Trp Glu Arg Ser Trp Val Ser 485 490 495

Gin His Cys Lys Ser Leu Ala lie Pro Cys Pro Ala His Tyr Thr Pro 500 505 510

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Leu lie Val Gly lie Thr Ser Gly Phe Trp lie Trp Ser Gly Lys Thr 530 535 540

Leu His Ser Trp Arg Lys Phe Tyr Thr Arg Leu Thr Asn Ser Arg His 545 550 555 560

Gly Glu Thr Thr Val 565 <210> 3 <211> 666 <212> PRT <213>智人 <40ϋ> 3

Mel Ala Met Thr Trp lie Val Phe Ser Leu Trp Pro Leu Thr Val Phe 15 10 15

Met C；ly His lie Gly Gly His Ser Leu Phe Ser Cys Glu Pro lie Thr 20 25 30

Leu Arg Met Cys Gin Asp Leu Pro Tyr Asn Thr Thr Phe Met Pro Asn 35 40 45

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Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Pro (le Cys Met Glu Tyr Gly Arg Val Thr 85 90 95 124434-序列表.doc 200819463

Leu Pro Cys Arg Arg Leu Cys Gin Arg Ala Tyr Ser Glu Cys Ser Lys 100 105 110

Leu Met Glu Met Phe Gly Val Pro Trp Pro Glu Asp Met Glu Cys Ser 115 120 125

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Leu Arg Gly Phe Val Leu Ala Pro Leu Val lie Tyr Leu Phe lie Gly 485 490 495 ITir Mel Phe Leu Leu Ala Gly Phe Val Ser Leu Phe Arg lie Arg Ser 500 505 510

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Gin Glu Gly Leu Glu Asn Thr Gly Cys Thr Leu Val Phe Leu Leu Leu 305 310 315 320 -19- 124434·序列表.doc 200819463

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Mel His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Leu Leu Ala Leu -28- 12443Φ·序列表.doc 200819463 15 10 15

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Ala Arg Ser Arg Thr Pro Lys Pro Arg Glu Leu Cys Arg Asp Glu Cys 245 250 255

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Gin Thr Ser Ser Leu Ser Thr Ser Pro Val Ser Asn Val Ser Asn Ala 770 775 780

Arg Tyr Val Gly Pro Lys Gin Lys Ala Pro Pro Phe Pro Gin Pro Gin 785 790 795 800

Phe lie Pro Met Lys Gly Gin lie Arg Pro Met Val Pro Pro Pro G】n 805 810 815 U、u 丁yr Va! Pro Val Asn Gly Tyr Gin Pro Val Pro Ala Tyr Gly Ala 820 825 830 -34 - 124434-序列表.doc 200819463

Tyr Leu Pro Asn Phe Tyr Pro Val Gin He Pro Met Gin Met Ala Pro 835 840 845

Gin Gin Val Pro Pro Gin Met Val Pro Lys Pro Ser Ser His His Ser 850 855 860 (ily Ser Gly Ser Thr Ser Thr Gly Tyr Val Thr Thr Ala Pro Ser Asn 865 870 875 880

Thr Ser Met Ala Asp Arg Ala Ala Leu Leu Ser Glu Gly Ala Asp Asp 885 890 895

Thr Gin Asn Ala Pro Glu Asp Gly Ala Gin Ser Thr Val Gin Glu Ala 900 905 910

Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ser Val Pro G!u Thr Glu Leu Leu Gly Asp 915 920 925

Cys Asp Thr Leu Gin Val Asp Glu Ala Gin Val Gin Leu Glu Ala 930 935 940 <210> 18 <211> 127 <212> PRT <213>智人 <^4ϋ0> 18 vScr Val Pro Asp His Gly Tyr Cys Gin Pro lie Ser lie Pro Leu Cys 15 10 15

Thr Asp lie Ala Tyr Asn Gin Thr He Met Pro Asn Leu Leu Gly His 20 25 30

Thr Asn Gin Glu Asp Ala Gly Leu Glu Val His Gin Phe Tyr Pro Leu 35 40 45

Val Lys Val Gin Cys Ser Ala Glu Leu Lys Phe Phe Leu Cys Ser Met 50 55 60 \ Tyr Ala Pro Val Cys Thr Val Leu Glu Gin Ala Leu Pro Pro Cys Arg 65 70 75 80 vSer Leu Cys Glu Arg Ala Arg Gin Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys 85 90 95

Phe Gly Phe Gin Trp Pro Asp Thr Leu Lys Cys Glu Lys Phe Pro Val 100 105 110

His Gly Ala Gly Glu Leu Cys Val Gly Gin Asn Thr Ser Asp Lys 115 120 125 <210> 19 <211> 127 <212> PRT <213>智人 <4〇〇> 19

Scr lie Pro Asp His Gly Phe Cys Gin Pro lie Ser lie Pro Leu Cys -35- 124434·序列表.doc 200819463 5 】0 15

Thr Asp lie Ala Tyr Asn Gin Thr lie Met Pro Asn Leu Leu Gly His 20 25 30

Thr Asn Gin Glu Asp Ala Gly Leu Glu Val His Gin Phe Tyr Pro Leu 35 40 45

Val Lys Val Gin Cys Ser Pro Glu Leu Arg Phe Phe I.eu Cys Ser Met 50 55 60

Tyr Ala Pro Val Cys Thr Val Leu Glu Gin Ala lie Pro Pro Cys Arg 65 70 75 80

Ser lie Cys Glu Ser Ala Arg Gin Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys 85 90 95

Phe Gly Phe Gin Trp Pro Glu Arg Leu Arg Cys Glu His Phe Pro Arg 100 105 110

His Gly Ala Glu Gin He Cys Val Gly Gin Asn His Ser Glu Asp 115 120 125 <210> 20 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <400> 20

His Ser Leu Phe Ser Cys Glu Pro lie Thr Leu Arg Met Cys Gin Asp 15 10 15

Leu Pro Tyr Asn Thr Thr Phe Met Pro Asn Leu Leu Asn His Tyr Asp 20 25 30

Ciln Gin Thr Ala Ala Leu Ala Met Glu Pro Phe His Pro Met Val Asn 35 40 45

Leu Asp Cys Ser Arg Asp Phe Arg Pro Phe Leu Cys Ala Leu Tyr Ala 50 55 60

Pro lie Cys Met Glu Tyr Gly Arg Val Thr Leu Pro Cys Arg Arg Leu 65 70 75 80

Cys Gin Arg Ala Tyr Ser Glu Cys Ser Lys Leu Met Glu Met Phe Gly 85 90 95

Val Pro Trp Pro Glu Asp Met Glu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Cys Asp 100 105 110

Glu Pro Tyr Pro Arg Leu Val 115 · <210> 21 <211> 125 <212> PRT <213〉％人 -36- 124434-序列表.doc 200819463 <400> 21

Glu Arg Arg Cys Asp Pro He Arg He Ser Met Cys Gin Asn Leu Gly 15 10 15

Tyr Asn Val Thr Lys Met Pro Asn Leu Val Gly His Glu Leu Gin Thr 20 25 30

Asp Ala Glu Leu Gin Leu Thr Thr Phe Thr Pro Leu lie Gin Tyr Gly 35 40 45

Cys vScr Scr Gin Leu Gin Phe Phe Leu Cys Ser Val Tyr Val Pro Met 50 55 60

Cys Thr Glu Lys lie Asn lie Pro He Gly Pro Cys Gly Gly Met Cys 65 70 75 80

Leu Ser Val Lys Arg Arg Cys Glu Pro Val Leu Lys Glu Phe Gly Phe 85 90 95

Ala Trp Pro Glu Ser Leu Asn Cys Ser Lys Phe Pro Pro Gin Asn Asp 100 105 110

His Asn His Met Cys Met Glu Gly Pro Gly Asp Glu Glu 115 120 125 <210> 22 <211> 129 <212> PRT <213〉智人 <400> 22

Ala Scr Lys Ala Pro Val Cys Gin Glu lie Thr Val Pro Met Cys Arg 15 】0 15

Gly lie Gly 丁yr Asn Leu Thr His Met Pro Asn Gin Phe Asn His Asp 20 25 30

Thr (iln Asp Glu Ala G!y Leu Glu Val His Gin Phe Trp Pro Leu Val 35 40 45

Glu Me Gin Cys Ser Pro Asp Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr 50 55 60

Thr Pro lie Cys Leu Pro Asp Tyr His Lys Pro Leu Pro Pro Cys Arg 65 70 75 80

Scr Val Cys Glu Arg Ala Lys Ala Gly Cys Ser Pro Leu Met Arg Gin 85 90 95

Tyr G!y Phe Ala Trp Pro Glu Arg Met Ser Cys Asp Arg Leu Pro Val 100 105 110

Leu Gly Arg Asp Ala Glu Val Leu Cys Met Asp Tyr Asn Arg Ser Glu 115 120 125

Ala -37- 124434-序列表.doc 200819463 <210> 23 <2Π> 119 <212> PRT <213〉智人 <4()(» 23

His Ser Leu Phe Thr Cys Glu Pro lie Thr Val Pro Arg Cys Met Lys 15 10 15

Met Ala Tyr Asn Met Thr Phe Phe Pro Asn Leu Met Gly His Tyr Asp 20 25 30

Gin i5er He Ala Ala Val Glu Met Glu His Phe Leu Pro Leu Ala Asn 35 40 45

Leu Glu Cys wSer Pro Asn He Glu Thr Phe Leu Cys Lys Ala Phe Val 50 55 60

Pro Thr Cys lie Glu Gin lie His Val Val Pro Pro Cys Arg Lys Leu 65 70 75 80

Cys Glu Lys Val Tyr Ser Asp Cys Lys Lys Leu lie Asp Thr Phe Gly 85 90 95 lie Arg Trp Pro Glu Glu Leu Glu Cys Asp Arg Leu Gin Tyr Cys Asp 100 105 110 C;lu Thr Val Pro Val Thr Phe 115 <21()> 24 <2il> 127 <212> PRT <213〉智人 <4〇0> 24 wScr Val Pro Asp His Gly Phe Cys Gin Pro lie Ser lie Pro Leu Cys 1 5 10 15

Fhr Asp lie Ala Tyr Asn Gin Thr lie Leu Pro Asn Leu Leu Gly His 20 25 30

Thr Asn Gin Glu Asp Ala Gly Leu Glu Val His Gin Phe Tyr Pro Leu 35 40 45

Val Lys Val Gin Cys vSer Pro Glu Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Met 50 55 60

Tyr Ala Pro Val Cys Thr Val Leu Asp Gin Ala lie Pro Pro Cys Arg 65 70 75 80

Scr Leu Cys Glu Arg Ala Arg Gin Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys 85 90 95

Phe Gly Phe Gin Trp Pro Glu Arg Leu Arg Cys Glu Asn Phe Pro Val 100 105 110 -38 - 124434·序列表.doc 200819463

His Gly Ala Gly Glu lie Cys Val Cly Gin Asn Thr Ser Asp Gly 115 120 125 <210> 25 <21l> 129 <212> PRT <213〉智人 <4()0> 25

Ala Ser Ala Lys Glu Leu Ala Cys Gin Glu lie Thr Val Pro Leu Cys 15 10 15

Lys Giy lie Gly Tyr Asn Tyr Thr Tyr Met Pro Asn Gin Phe Asn His 20 25 30

Asp Thr Gin Asp Glu Ala Gly Leu Glu Val His Gin Phe Trp Pro Leu 35 40 45

Val Glu lie Gin Cys Ser Pro Asp Leu Lys Phe Phe Leu Cys Ser Met 50 55 60

Tyr Thr Pro lie Cys Leu Glu Asp Tyr Lys Lys Pro Leu Pro Fro Cys 65 70 75 80

Arg Ser Val Cys Glu Arg Ala Lys Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met Arg 85 90 95

Gin Tyr Gly Phe Ala Trp Pro Asp Arg Met Arg Cys Asp Arg Leu Pro 100 105 110

Glu Gin Gly Asn Pro Asp Thr Leu Cys Met Asp Tyr Asn Arg Thr Asp 115 120 125 <210> 26 <211> 125 <212> PRT <213〉智人 <400> 26

Ala Ala Pro Cys Gin Ala Vai Glu Me Pro Met Cys Arg Gly lie Gly 15 10 15 lyr Asn l.eu Thr Arg Met Pro Asn Leu Leu Gly His Thr Ser Gin Gly 20 25 30

Glu Ala Ala Ala Glu Leu Ala Glu Phe Ala Pro Leu Val Gin Tyr Gly 35 40 45

Cys His Ser His Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met 50 55 60

Cys Thr Asp Gin Val Ser Thr Pro lie Pro Ala Cys Arg Pro Met Cys 65 70 75 80 -39- 124434-序列表.doc 200819463

Glu Gin Ala Arg Leu Arg Cys Ala Pro He Met Glu Gin Phe Asn Phe 85 90 95 (]ly Trp Pro Asp Ser Leu Asp Cys Ala Arg Leu Pro Thr Arg Asn Asp 100 105 110

Pro His Ala Leu Cys Met Glu Ala Pro Glu Asn Ala Thr 115 120 125 <210> 27 <211> 125 <212> PRT <213>智人 <4()0> 27

Asp Gly I.ys Cys Gin Pro lie Glu lie Pro Met Cys Lys Asp lie Gly 15 10 15

Tyr Asn Met Thr Arg Met Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gin Arg 20 25 30

Glu Ala Ala lie Gin Leu His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly 35 40 45

Cys His Gly His Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met M) 55 60

Cys Thr Glu Gin Val Ser Thr Pro lie Pro Ala Cys Arg Val Met Cys 65 70 75 80

Glu Gin Ala Arg Leu Lys Cys Ser Pro He Met Glu Gin Phe Asn Phe 85 90 95

Lys Trp Pro Asp Ser Leu Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp 100 105 110

Pro Asn Tyr Leu Cys Met Glu Ala Pro Asn Asn Gly Ser 115 120 125 <210> 28 <211> 124 <212> PRT <213>智人 <400> 28

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Leu Cys His Asn Val Gly Tyr Lys Lys Met Val Leu Pro Asn Leu Leu 20 25 30

Glu His Glu Thr Met Ala Glu Val Lys Gin Gin Ala Ser Ser Trp Val 35 40 45

Pro Leu Leu Asn Lys Asn Cys His Ala Gly Thr Gin Val Phe Leu Cys 50 55 60

Scr Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro lie Tyr Pro Cys Arg -40- 124434-序列表.doc 200819463 65 70 75 80

Trp Leu Cys Glu Ala Val Arg Asp Ser Cys Glu Pro Val Mel Gin Phe 85 90 95

Phc Gly Phe Tyr Trp Pro Glu Met Leu Lys Cys Asp Lys Phe Pro Glu 100 105 110

Gly Asp Val Cys lie Ala Met Thr Pro Pro Asn Ala 115 120 <210〉 29 <211> 128 <212> PRT <2I3>智人 <40()> 29

Phe Ser Tyr Lys Arg Ser Asn Cys Lys Pro He Pro Ala Asn Leu Gin 15 10 15 /

Leu Cys His Gly lie Glu Tyr Gin Asn Met Arg Leu Pro Asn Leu Leu 20 25 30

Gly His Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Glu Gin Ala Gly Ala Trp lie 35 40 45

Pro Leu Val Met Lys Gin Cys His Pro Asp Thr Lys Lys Phe Leu Cys 50 55 60 vScr Leu Phc Ala Pro Val Cys Leu Asp Asp Leu Asp Glu Thr lie Gin 65 70 75 80

Pro Cys His Ser Leu Cys Val Gin Val Lys Asp Arg Cys Ala Pro Val 85 90 95

Met Ser Ala Phe Gly Phe Pro Trp Pro Asp Met Leu Glu Cys Asp Arg 100 105 110

Phc Pro Gin Asp Asn Asp Leu Cys lie Pro Leu Ala Ser Ser Asp His 115 120 125 <210〉 30 <211> 123 <212> PRT <213>智人 <400> 30

Ala Ala Cys Glu Pro Val Arg He Pro Leu Cys Lys Ser Leu Pro Trp 1 5 10 15

Asn Met Thr Lys Met Pro Asn His Leu His His Ser Thr Gin Ala Asn 20 25 30

Ala lie l.eu Ala lie Glu Gin Phe Glu Gly Leu Leu Gly Thr His Cys 35 40 45

Ser Pro Asp Leu Leu Phe Phe Leu Cys Ala Met Tyr Ala Pro lie Cys 50 55 60 -41 _ 124434-序列表.d〇c 200819463

Thr lie Asp Phe Gin His Glu Pro lie Lys Pro Cys Lys Ser Val Cys 65 70 75 80 G]uArg AlaAr, Gin Gly Cys Glu Pro lie Leu He Lys Tyr Arg His

Scr Trp Pro Glu Asn Leu Ala Cys Glu Glu Leu Pro Val Tyr Asp Arg 100 105 110

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Gin Glu Asn Ala lie Leu Ala lie Glu Gin Tyr Glu Glu Leu Val Asp 35 40 45

Val Asn Cys vSer Ala Val Leu Arg Phe Phe Phe Cys Ala Met Tyr Ala 50 55 60

Pro He Cys Thr Leu Glu Phe Leu His Asp Pro lie Lys Pro Cys Lys 65 70 75 80

Ser Val Cys Gin Arg Ala Arg Asp Asp Cys Glu Pro Leu Met Lys Met 85 90 95

Tyr Asn His Ser Trp Pro Glu Ser Leu Ala Cys Asp Glu Leu Pro Val 100 105 110 v Tyr Asp Arg Gly Vai Cys lie Ser Pro Glu Ala lie Val Thr 115 120 125 5 T人 3212PR智32 <2I()> <211〉 <212> <213〉 <400〉

Ser Tyr Ser Lys

Leu Cys His Thr 20

Glu His Glu Ser 35

Pro 5 Val Leu

Pro Gin Cys Gly Tyr Lys Ala Glu Val 40

Leu Asp 10 lie Pro Ala Asp

Arg Met 25

Lys Gin

Arg Leu Pro Asn 30

Gin Ala Ser Ser 45

Leu 15 Leu Trp

Pro Leu Leu -42- 124434-序列表.doc 200819463

Pro Leu Leu Ala Lys Arg Cys His Ser Asp Thr Gin Val Phe Leu Cys 50 55 60

Scr Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro lie Tyr Pro Cys Arg 65 70 75 80

Ser Leu Cys Glu Ala Val Arg Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met Glu Ala 85 90 95

Tyr Gly Phe Pro Trp Pro Glu Met Leu His Cys His Lys Phe Pro Leu 100 105 110

Asp Asn Asp Leu Cys lie Ala Val Gin Phe Gly His Leu 1)5 120 125 <21ϋ> 33 <211> 142 <212> PRT <213〉智人 <400> 33

Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gin Pro Tyr Arg Gly lie Ala Cys 15 10 15

Ala Arg Phe lie Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met Glu Ser Leu His Met 20 25 30

Gin Gly Glu lie Glu Asn Gin He Thr Ala Ala Phe Thr Met lie Gly 35 40 45

Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gin Phe Ala lie Pro Ser 50 55 60

Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu Thr Ser Ser Val Pro 65 70 75 80

Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu lie Leu Glu Asn Val 85 90 95

Leu Cys Gin Thr Glu Tyr lie Phe Ala Arg Ser Asn Pro Met lie Leu 100 105 110

Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu Pro Gin Pro Glu Ser 115 120 125

Pro Glu Ala Ala Asn Cys lie Arg lie Gly lie Pro Met Ala 130 135 140 10>!1>12>13> 2T人 34I4PR智 <4ϋ0> 34

Asp Tyr His Glu Asp Gly Phe Cys Gin Pro Tyr Arg Glv lie Ala Cys 1 5 10 15 -43- 124434·序列表.d〇c 200819463

Ala Arg Phe lie Gly Asn Arg Thr lie Tyr Val Asp Ser Leu Gin Met 20 25 30

Gin Gly Glu lie Glu Asn Arg He Thr Ala Ala Phe Thr Met lie Gly 35 40 45

Thr Ser Thr His Leu Ser Asp Gin Cys Ser Gin Phe Ala He Pro Ser 50 55 60

Phe Cys His Phe Val Phe Pro Leu Cys Asp Ala Arg Ser Arg Thr Pro 65 70 75 80

Lys Pro Arg Glu Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu Val Leu Glu Ser Asp 85 90 95

Leu Cys Arg Gin Glu Tyr Thr lie Ala Arg Ser Asn Pro Leu lie Leu 100 105 110

Met Arg Leu Gin Leu Pro Lys Cys Glu Ala Leu Pro Met Pro Glu Ser 115 120 125

Pro Asp Ala Ala Asn Cys Met Arg lie Gly lie Pro Ala Glu 130 135 140 <210> 35 <211> 235 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 35

Mel Ala Glu Glu Glu Ala Pro Lys Lys Ser Arg Ala Ala Gly Gly Gly 15 10 15

Ala Ser 丁rp Glu Leu Cys Ala Gly Ala Leu Ser Ala Arg Leu Ala Glu 20 25 30

Glu Gly Ser Gly Asp Ala Gly Gly Arg Arg Arg Pro Pro Val Asp Pro 35 40 45

Ar^» Arg I.eu Ala Arg Gin Leu Leu Leu Leu Leu Trp Leu Leu Glu Ala 50 55 60

Pro Leu Leu Leu Gly Val Arg Ala Gin Ala Ala Gly Gin Gly Pro Gly 65 70 75 80

Gin Gly Pro Gly Pro Gly Gin Gin Pro Pro Pro Pro Pro Gin Gin Gin 85 90 95

Gin Ser Gly Gin Gin Tyr Asn Gly Glu Arg Gly lie Ser Val Pro Asp 100 105 110

His Gly Tyr Cys Gin Pro lie Ser lie Pro Leu Cys Thr Asp lie Ala 115 120 125

Tyr Asn Gin Thr lie Met Pro Asn Leu Leu Gly His Thr Asn Gin Glu 130 135 140 -44- 124434-序列表.doc 200819463

Asp Ala Gly Leu Glu Val His Gin Phe Tyr Pro Leu Val Lys Val Gin 145 150 155 160

Cys Ser Ala Glu Leu Lys Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Ala Pro Val 165 170 175

Cys Thr Val Leu Glu Gin Ala Leu Pro Pro Cys Arg Ser Leu Cys Glu 180 185 190

Ary Ala Arg Gin Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys Phe Gly Phe Gin 195 200 205

Trp Fro Asp Thr Leu Lys Cys Glu Lys Phe Pro Val His Gly Ala Gly 210 215 220

Glu Leu Cys Val Gly Gin Asn Thr Ser Asp Lys 225 230 235 <210> 36 <211> 158 <2!2> PR丁 <213〉智人 <400〉 36

Met Arg Pro Arg Scr Ala Leu Pro Arg Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu 1 5 10 15

Asp lie Ala Tyr Asn Gin Thr lie Met Pro Asn Leu Leu Gly His Thr 50 55 60

Asn Gin Glu Asp Ala Gly Leu Glu Val His Gin Phe Tyr Pro Leu Val 65 70 75 80

Lys Val Gin Cys Scr Pro Glu Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr 85 90 95

Ala Pro Val Cys Thr Val Leu Glu Gin Ala lie Pro Pro Cys Arg Ser 100 105 110 lie Cys Glu Scr Ala Arg Gin Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys Phe 115 120 125 (Jly Phe Gin Trp Pro Glu Arg Leu Arg Cys Glu His Phe Pro Arg His 130 135 140

Gly Ala Glu Gin lie Cys Val Gly Gin Asn His Ser Glu Asp 145 150 155 <210〉 37 <211> 141 <212> PRT <2丨3> %人 -45- 124434-序列表.doc 200819463 <4ϋϋ> 37

Met Ala Met nr Trp lie VaI Phe Ser Leu Trp Pro Leu Thr Val Phe 15 10 15

Met Gly His lie Gly Gly His Ser Leu Phe Ser Cys Glu Pro lie Thr 20 25 30

Leu Arg Met Cys Gin Asp Leu Pro Tyr Asn Thr Thr Phe Met Pro Asn 35 40 45

Ixu Leu Asn His Tyr Asp Gin Gin Thr Ala Ala Leu Ala Met Glu Pro 50 55 60

Phe His Pro Met Val Asn Leu Asp Cys Ser Arg Asp Phe Arg Pro Phe 65 70 75 80

Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Pro lie Cys Met Glu Tyr Gly Arg Val Thr 85 90 95 #

Leu Pro Cys Arg Arg Leu Cys Gin Arg Ala Tyr Ser Glu Cys Ser Lys 100 105 110 I.cu Met Glu Met Phe Gly Val Pro Trp Pro Glu Asp Met Glu Cys Ser 115 120 125

Arg Phe Pro Asp Cys Asp Glu Pro Tyr Pro Arg Leu Val 130 135 140 <210> 38 <211> 166 <2]2> PRT <2】3>智人 <400> 38

Met AU Trp Arg Gly Ala Gly Pro Ser Val Pro Gly Ala Pro Gly Gly 1 5 10 15

Val Gly Leu Ser Leu Gly Leu Leu Leu Gin Leu Leu Leu Leu Leu Gly 20 25 30

ProAlaApGlyPheCyAspGluG.uG.uArgArgCys Asp Pro lie

Ar^ lie Ser Met Cys Gin Asn Leu Gly Tyr Asn Val Thr Lys Met Pro 50 55 60

Asn Leu Val Gly His Glu Leu Gin Thr Asp Ala Glu Leu Gin Leu Thr 65 70 75 80

Thr Phe Thi· Pro Uu lie Gin 丁yr Gly Cys Ser Ser Gin Leu Gin Phe 85 90 95

Phe Leu Cys Ser Val Tyr Val Pro Met Cys Thr Glu Lys lie Asn He 100 105 110

Pro lie Gly Pro Cys Gly Gly Met Cys Leu Ser Val Lys Arg Arg Cys -46- 124434·序列表.doc 200819463 115 120 125

Glu Pro Val Leu Lys Glu Phe Gly Phe Ala Trp Pro Glu Ser Leu Asn 130 135 140

Cys Sor Lys Phe Pro Pro Gin Asn Asp His Asn His Met Cys Met Glu M5 150 155 160

Gly Pro Gly Asp Glu Glu 165 <21()> 39 <211> 155 <212> PRT <2!3>智人 <4()0> 39

Met Ala Arg Pro Asp Pro Ser Ala Pro Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15

Leu Ala Gin Leu Val Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ser Lys Ala Pro Val 20 25 30

Cys Gin Glu lie Thr Val Pro Met Cys Arg Gly lie Gly Tyr Asn Leu 35 40 45 ΊΊη His Met Pro Asn Gin Phe Asn His Asp Thr Gin Asp Glu Ala Gly 50 55 60 I.eu Glu Va) His Gin Phe Trp Pro Leu Val Glu lie Gin Cys Ser Pro 65 70 75 80

Asp Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Thr Pro He Cys Leu Pro 85 90 95

Asp Tyr His Lys Pro Leu Pro Pro Cys Arg Ser Val Cys Glu Arg Ala 100 105 110

Lys Ala Gly Cys Ser Pro Leu Met Arg Gin Tyr Gly Phe Ala Trp Pro 115 120 125 (j)u Arg Mel Ser Cys Asp Arg Leu Pro Val Leu Gly Arg Asp Ala Glu 130 135 140

Val Leu Cys Met Asp Tyr Asn Arg Ser Glu Ala 145 150 155 <210> 40 <211> 137 <212> PRT <213>智人 <400> 40

Mel Glu Met Phe Thr Phe Leu Leu Thr Cys lie Phe Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15

Arg Gly His Ser Leu Phe Thr Cys Glu Pro He Thr Val Pro Arg Cys 20 25 30 •47- 124434-序列表.doc 200819463

Met Lys Met Ala Tyr Asn Met Thr Phe Phe Pro Asn Leu Met Gly His 35 40 45

Tyr Asp Gin Ser lie Ala Ala Val Glu Met Glu His Phe Leu Pro Leu 50 55 60

Ala Asn Leu Giu Cys wSer Pro Asn lie Glu Thr Phe Leu Cys Lys Ala 65 70 75 80

Phe Val Pro Thr Cys lie Glu Gin lie His Val Val Pro Pro Cys Arg 85 90 95

Lys Leu Cys Glu Lys Val Tyr Ser Asp Cys Lys Lys Leu lie Asp Thr 100 105 Π0

Phe Gly lie Arg Trp Pro Glu Glu Leu Glu Cys Asp Arg Leu Gin Tyr 115 120 125

Cys Asp Glu Thr Val Pro Val Thr Phe 130 135 <21()> 41 <211> 168 <212> PRT <213>智人 <400> 41

Met Arg Asp Pro Gly Ala Ala Ala Pro Leu Ser Ser Leu Gly Leu Cys 15 10 15

Ala Leu Val Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu Ser Ala Gly Ala Gly Ala 20 25 30

Gin Pro Tyr His Gly Glu Lys Gly He Ser Val Pro Asp His Gly Phe 35 40 45

Cys Gin Pro lie Ser lie Pro Leu Cys Thr Asp lie Ala Tyr Asn Gin 50 55 60

Thr lie Leu Pro Asn Leu Leu Gly His Thr Asn Gin Glu Asp Ala Gly 65 70 75 80

Leu Glu Val His Gin Phe Tyr Pro Leu Val Lys Val Gin Cys Ser Pro 85 90 95

Glu Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Ala Pro Val Cys Thr Val 100 105 110

Leu Asp Gin Ala lie Pro Pro Cys Arg Ser Leu Cys Glu Arg Ala Arg 115 120 125

Gin Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys Phe Gly Phe Gin Trp Pro Glu 130 135 140

Arg Leu Arg Cys Glu Asn Phe Pro Val His Gly Ala Gly Glu lie Cys 145 150 155 160 -48- 124434-序列表.doc 200819463

Val Gly Gin Asn Thr Ser Asp Gly 165 <2i0> 42 <211> 156 <212〉 PRT <213>智人 <400> 42

Met Glu Trp Gly Tyr Leu Leu Glu Val Thr Ser Leu Leu Ala Ala Leu 15 10 15

Ala I.cu Leu Gin Arg Ser Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ser Ala Lys Glu 20 25 30

Leu Ala Cys Gin Glu lie Thr Val Pro Leu Cys Lys Gly lie Gly Tyr 35 40 45

Asn Tyr Thr Tyr Met Pro Asn Gin Phe Asn His Asp Thr Gin Asp Glu 50 55 60

Ala Gly Leu Glu Val His Gin Phe Trp Pro Leu Val Glu lie Gin Cys 65 70 75 80

Ser Pro Asp Leu Lys Phe Phe I.eu Cys Ser Met Tyr Thr Pro lie Cys 85 90 95

Leu Glu Asp Tyr Lys Lys Pro Leu Pro Pro Cys Arg Ser Val Cys Glu 100 105 110

Arg Ala Lys Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met Arg Gin Tyr Gly Phe Ala 115 120 125 丁rp Pro Asp Arg Met Arg Cys Asp Arg Leu Pro Glu Gin Gly Asn Pro 130 135 140

Asp Thr Leu Cys Met Asp Tyr Asn Arg Thr Asp Leu 145 150 155 <210〉 43 <211> 160 <2I2> PRT <213>智人 <>43

Met Ala Val Ala Pro Leu Arg Gly Ala Leu Leu Leu Trp Gin Leu Leu 15 10 15

Ala Ala Gly Gly Ala Ala Leu Glu lie Gly Arg Phe Asp Pro Glu Arg 20 25 30

Gly Arg Gly Ala Ala Pro Cys Gin Ala Val Glu lie Pro Met Cys Arg 35 40 45

Gly lie Gly Tyr Asn Leu Thr Arg Met Pro Asn Leu Leu Gly Kis Thr 50 55 60 -49- 124434-序列表.doc 200819463

Ser Gin Gly Glu Ala Ala Ala Glu Leu Ala Glu Phe Ala Pro Leu Val 65 70 75 80

Gin Tyr Gly Cys His Ser His Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr 85 90 95

Ala Pro Met Cys Thr Asp Gin Val Ser Thr Pro lie Pro Ala Cys Arg 100 105 110

Pro Met Cys Glu Gin Ala Arg Leu Arg Cys Ala Pro lie Met Glu Gin 115 120 125

Phe Asn Phe Gly Trp Pro Asp Ser Leu Asp Cys Ala Arg Leu Pro Thr 130 135 140

Arg Asn Asp Pro His Ala Leu Cys Met Glu Ala Pro Glu Asn Ala Thr 145 150 155 160

<21()> 44 <211> 155 / <212> PRT <213〉智人 <400> 44

Met Gin Arg Fro Gly Pro Arg Leu Trp Leu Val Leu Gin Val Met Gly 1 5 10 15

Ser Cys Ala Ala lie Ser Ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp Gly 20 25 30

Lys Cys Gin Pro lie Glu lie Pro Met Cys Lys Asp lie Gly Tyr Asn 35 40 45

Met Thr Arg Met Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gin Arg Glu Ala 50 55 60

Ala lie Gin Leu His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly Cys His 65 70 75 80

Gly His Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys Thr 85 90 95

Glu G!n Val Ser Thr Pro lie Pro Ala Cys Arg Val Met Cys Glu Gin 100 105 110

Ala Arg Leu Lys Cys Ser Pro lie Met Glu Gin Phe Asn Phe Lys Trp 115 120 125

Pro Asp Ser Leu Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp Pro Asn 130 135 140

Tyr Leu Cys Met Glu Ala Pro Asn Asn Gly Ser 145 150 155 <210〉 45 <211> 174

<212> PRT -50- 124434-序列表.doc 200819463 <2]3>智人 <400> 45

Met Gly lie Gly Arg Ser Glu Gly Gly Arg Arg Gly Ala Ala Leu Gly 1 5 10 15

Val Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Val Gly Ser Ala Ser 20 25 30 C；lu Tyr Asp Tyr Val Ser Phe Gin Ser Asp lie Gly Pro Tyr Gin Ser 35 40 45

Gly Arg Phe Tyr Thr Lys Pro Pro Gin Cys Val Asp lie Pro Ala Asp 50 55 60

Leu Arg Leu Cys His Asn Val Gly Tyr Lys Lys Met Val Leu Pro Asn 65 70 75 80

Leu Leu Glu His Glu Thr Met Ala Glu Val Lys Gin Gin Ala Ser Ser 85 90 95

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Leu Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro lie Tyr Pro 115 120 125

Cys Arg Trp Leu Cys Glu Ala Val Arg Asp Ser Cys Glu Pro Val Met 130 135 140

Gin Phe Phe Gly Phe Tyr Trp Pro Glu Met Leu Lys Cys Asp Lys Phe 145 150 155 160

Pro Glu Gly Asp Val Cys lie Ala Met Thr Pro Pro Asn Ala 165 170 f <210> 46 <211> 160 <212〉 PRT <213>智人 <40()> 46

Met Leu Gin Gly Pro Gly Ser Leu Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ser His 15 10 15

Cys Cys Leu Gly Scr Ala Arg Gly Leu Phe Leu Phe Gly Gin Pro Asp 20 25 30

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Leu Cys His Gly lie Glu Tyr Gin Asn Met Arg Leu Pro Asn Leu Leu 50 55 60

Gly His Glu Thr Mel Lys Glu Val Leu Glu Gin Ala Gly Ala Trp lie 65 70 75 80 -51 - 124434·序列表.doc 200819463

Pro Leu Val Met Lys Gin Cys His Pro Asp Thr Lys Lys Phe Leu Cys 85 90 95 vSer Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Asp Leu Asp Glu Thr lie Gin 100 105 110

Pro Cys His Ser Leu Cys Val Gin Val Lys Asp Arg Cys Ala Pro Val 115 120 125

Met Scr Ala Phe Gly Phe Pro Trp Pro Asp Met Leu Glu Cys Asp Arg 130 135 140

Phe Pro Gin Asp Asn Asp Leu Cys He Pro Leu Ala Ser Ser Asp His 145 150 155 160 <210> 47 <211> 155 <212> PRT <213>智人 <400> 47

Mel Val Cys Gly Ser Pro Gly Gly Met Leu Leu Leu Arg Ala Gly Leu 15 10 15

Leu Alu Leu Ala Ala Leu Cys Leu Leu Arg Val Pro Gly Ala Arg Ala 20 25 30

Ala Ala Cys Glu Pro Val Arg lie Pro Leu Cys Lys Ser Leu Pro Trp 35 40 45

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Scr Ί'τρ Pro Glu Asn Leu Ala Cys Glu Glu Leu Pro Val Tyr Asp Arg 130 135 140

Gly Val Cys He Ser Pro Glu Ala Ile Val Thr 145 150 155 <210〉 48 <211> 144 <212> PRT <213>智人 <400〉 48

Mcl Phe Leu Ser Ile Leu Val Ala Leu Cys Leu Trp Leu His Leu Ala -52- 124434-序列表.doc 200819463 5 10 15

Leu Gly Val Arg Gly Ala Pro Cys Glu Ala Val Arg lie Pro Met Cys 20 25 30

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Cys I.ys Ser Val Cys Gin Arg Ala Arg Asp Asp Cys Glu Pro Leu Met 100 105 110

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Pro Val Tyr Asp Arg Gly Val Cys lie Ser Pro Glu Ala lie Val Thr 130 135 140 <210> 49 <211> 170 <212> PRT <213〉士人 <400> 49

Met Arg Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Val Arg Thr Ala Ala Leu Ala 15 10 15

Leu Leu Leu Gly Ala Leu His Trp Ala Pro Ala Arg Cys Glu Glu Tyr 20 25 30 /

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Ala Lys Arg Cys His Ser Asp Thr Gin Val Fhe Leu Cys Ser Leu Phe 100 105 110

Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro lie Tyr Pro Cys Arg Ser Leu Cys 115 120 125

Glu Ala Val Arg Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met Glu Ala Tyr Gly Phe -53- 124434-序列表.doc 200819463 130 135 140

Pro Trp Pro Glu Met Leu His Cys His Lys Phe Pro Leu Asp Asn Asp 145 150 155 160

Leu Cys He Ala Val Gin Phe Gly His Leu 165 170 <210> 50 <211> 163 <212> PRT <213>智人 <400> 50

Gin Ala Ala Gly Gin Gly Pro Gly Gin Gly Pro Gly Pro Gly Gin Gin 15 10 15

Pro Pro Pro Pro Pro Gin Gin Gin Gin Ser Gly Gin Gin Tyr Asn Gly 20 25 30 / Glu Arg Gly Me Ser Val Pro Asp His Gly Tyr Cys Gin Pro lie Ser 35 40 45 lie Pro Leu Cys Thr Asp lie Ala Tyr Asn Gin Thr lie Met Pro Asn 50 55 60

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Leu Cys Ser Met 丁yr Ala Pro Val Cys Thr Val Leu Glu Gin Ala Leu 100 105 110

Pro Pro Cys Arg Ser Leu Cys Glu Arg Ala Arg Gin Gly Cys Glu Ala 115 120 125

Leu Mel Asn Lys Phe Gly Phe Gin Trp Pro Asp Thr Leu Lys Cys Glu 130 135 140 I.ys Phe Pro Val His Gly Ala Gly Glu Leu Cys Val Gly Gin Asn Thr 145 150 155 160 vSer Asp Lys <210> 51 <211> 136 <2I2> PRT <2丨3>智人 <4ϋ()> 51

Ala Ciln Pho His Gly Glu Lys Gly lie Ser lie Pro Asp His Gly Phe 15 10 15

Cys Gin Pro lie Ser lie Pro Leu Cys Thr Asp lie Ala Tyr Asn Gin 20 25 30 -54- 124434-序列表.doc 200819463

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Leu Glu Val His Gin Phe Tyr Pro Leu Val Lys Val Gin Cys Ser Pro 50 55 60

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Leu Glu Gin Ala lie Pro Pro Cys Arg Ser lie Cys Glu Ser Ala Arg 85 90 95

Gin Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys Phe Gly Phe Gin Trp Pro Glu 100 105 ]】0

Arg Leu Arg Cys Glu His Phe Pro Arg His Gly Ala Glu Gin lie Cys 115 120 125

Val Gly Gin Asn His Ser Glu Asp 130 135 <210> 52 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <400> 52

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Leu Pro Tyr Asn Thr Thr Phe Met Pro Asn Leu Leu Asn His Tyr Asp 20 25 30 C/ln Gin Thr Ala Ala Leu Ala Met Glu Pro Phe His Pro Met Val Asn 35 40 45

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Cys Gin Arg Ala Tyr Ser Glu Cys Ser Lys Leu Met Glu Met Phe Gly 85 90 95

Val Pro Trp Pro Glu Asp Met Glu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Cys Asp 100 105 110

Glu Pro Tyr Pro Arg Leu Val <210> 53 <211> 130 <2I2> PRT <213>智人 <400> 53 -55- 124434-序列表.doc 200819463

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Pro Pro Gin Asn Asp His Asn His Met Cys Met Glu Gly Pro Gly Asp 115 120 125 (ilu G!u 130 <210> 54 <21]> 129 <212> PRT <213>智人 <400> 54

Ala Ser Lys Ala Pro Val Cys Gin Glu lie Thr Val Pro Met Cys Arg 15 10 15 (ily lie Gly rlyr Asn Leu Thr His Met Pro Asn Gin Phe Asn His Asp 20 25 30

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Tyr Gly Phe Ala Trp Pro Glu Arg Met Ser Cys Asp Arg Leu Pro Val 100 105 110 l.cu Gly Arg Asp Ala Glu Val Leu Cys Met Asp Tyr Asn Arg Ser Glu 115 120 125 -56- 124434-序列表.doc 200819463

Ala <210〉 55 <21l> 119 <212> PRT <213〉智人 <400> 55

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Leu Asp Gin Ala lie Pro Pro Cys Arg Ser Leu Cys Glu Arg Ala Arg 85 90 95 -57- 124434-序列表.doc 200819463 (；ln Gly Cys Glu Ala Leu Mel Asn Lys Phe Gly Phe Gin Trp Pro Glu 100 105 110

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Ala Ser Ala Lys Glu Leu Ala Cys Gin Glu He Thr Val Pro Leu Cys 15 10 15

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Glu Gin Gly Asn Pro Asp Thr Leu Cys Met Asp Tyr Asn Arg Thr Asp 115 120 125

Leu <210〉 58 <2]1> 139 <2I2> PRT <213>智人 <400> 58

Ala Leu Glu He Gly Arg Phe Asp Pro Glu Arg Gly Arg Gly Ala Ala 15 10 15

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Leu Thr Arg Met Pro Asn Leu Leu Gly His Thr Ser Gin Gly Glu Ala 35 40 45

Ala Ala Glu Leu Ala Glu Phe Ala Pro Leu Val Gin Tyr Gly Cys His -58- 124434-序列表.doc 200819463 50 55 60

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Ala Arg Leu Arg Cys Ala Pro lie Met Glu Gin Phe Asn Phe Gly Trp 100 105 110

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Ala Leu Cys Met Glu Ala Pro Glu Asn Ala Thr 130 135 <210> 59 <211> 135 <212> PRT <213〉智人 <400> 59 lie Scr Ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp Gly Lys Cys Gin Pro 15 10 15 lie Glu Me Pro Met Cys Lys Asp lie Gly Tyr Asn Met Thr Arg Met 20 25 30

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Glu Ala Pro Asn Asn Gly Ser 130 135 <210〉 60 <211> 144 <212> PRT <213〉智人 <400〉 60

Ala vSer Glu Tyr Asp Tyr Val Ser Phe Gin Ser Asp lie Gly Pro Tyr 15 10 15 -59- 124434-序列表.doc 200819463

Gin Ser Gly Arg Phe Tyr Thr Lys Pro Pro Gin Cys Val Asp He Pro 20 25 30

Ala Asp Leu Arg Leu Cys His Asn Val Gly Tyr Lys Lys Met Val Leu 35 40 45

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Val Phe Leu Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro He 85 90 95

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Val Met Gin Phe Phe Gly Phe Tyr Trp Pro Glu Met Leu Lys Cys Asp 115 120 125

Lys Phe Pro Glu Gly Asp Val Cys lie Ala Met Thr Pro Pro Asn Ala 130 135 140 <210> 61 <21)> 142 <212> PRT <213〉智人 <40()> 61

Leu Gly Ser Ala Arg Gly Leu Phe Leu Phe Gly Gin Pro Asp Phe Ser 15 10 15

Tyr Lys Arg Ser Asn Cys Lys Pro lie Pro Ala Asn Leu Gin Leu Cys 20 25 30

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Val Met Lys Gin Cys His Pro Asp Thr Lys Lys Phe Leu Cys Ser Leu 65 70 75 80

Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Asp Leu Asp Glu Thr lie Gin Pro Cys 85 90 95

His Ser Leu Cys Val Gin Val Lys Asp Arg Cys Ala Pro Val Met Ser 100 105 110

Ala Fhe Gly Phe Pro Trp Pro Asp Met Leu Glu Cys Asp Arg Phe Pro 115 120 125

Gin Asp Asn Asp Leu Cys He Pro Leu Ala Ser Ser Asp His 130 135 140 - 60· 124434·序列表.doc 200819463 <210> 62 <211〉 123 <212> PRT <213〉智人 <4()()> 62

Ala Ala Cys Glu Pro Val Arg lie Pro Leu Cys Lys Ser Leu Pro Trp 15 10 15

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Ser Trp Pro Glu Asn Leu Ala Cys Glu Glu Leu Pro Val Tyr Asp Arg 100 105 110 (；iy Val Cys lie Ser Pro Glu Ala lie Val Thr 115 120 <210> 63 <211> 126 <212> PRT <213〉智人 <400> 63

Val Arg Gly Ala Pro Cys Glu Ala Val Arg lie Pro Met Cys Arg His 15 10 15 / Met Pro Trp Asn lie Thr Arg Met Pro Asn His Leu His His Ser Thr I 20 25 30

Gin Glu Asn Ala He Leu Ala lie Glu Gin Tyr Glu Glu Leu Val Asp 35 40 45

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Pro lie Cys Thr Leu Glu Phe Leu His Asp Pro lie Lys Pro Cys Lys 65 70 75 80 wScr Val Cys Gin Arg Ala Arg Asp Asp Cys Glu Pro Leu Met Lys Met 85 90 95 lyr Asn His Scr Trp Pro Glu Ser Leu Ala Cys Asp Giu Leu Pro Val 100 105 no -61 - 124434-序列表.doc 200819463

Tyr Asp Arg Gly Val Cys He Ser Pro Glu Ala lie Val Thr 115 120 125 <210> 64 <211> 143 <212〉 PKT <213〉智人 <400〉 64

Arg Cys Glu Glu Tyr Asp Tyr Tyr Gly Trp Gin Ala Glu Pro Leu His 15 10 15

Gly Arg Ser Tyr Ser Lys Pro Pro Gin Cys Leu Asp lie Pro Ala Asp 20 25 30

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Leu l^eu Glu His Glu Ser Leu Ala Glu Val Lys Gin Gin Ala Ser Ser 50 55 60

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Cys Arg Ser Leu Cys Glu Ala Val Arg Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met 100 105 110

Glu Ala Tyr Gly Phe Pro Trp Pro Glu Met Leu His Cys His Lys Phe 115 120 125

Pro Leu Asp Asn Asp Leu Cys lie Ala Val Gin Phe Gly His Leu 130 135 140

V <2I()> 65 <211> 162 <212> PRT <2I3>智人 <400> 65

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Gly Tyr Ser Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Gly Phe Cys Gin Pro Tyr Arg 20 25 30 (ily lie Ala Cys Ala Arg Phe lie Gly Asn Arg Thr Val Tyr Met Glu 35 40 45

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Ihr Met lie Gly Thr Ser Ser His Leu Ser Asp Lys Cys Ser Gin Phe 65 70 75 80 -62- 124434-序列表.doc 200819463

Ala lie Pro Ser Leu Cys His Tyr Ala Phe Pro Tyr Cys Asp Glu Thr 85 90 95

Scr Ser Val Pro Lys Pro Arg Asp Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu lie 100 105 110

Leu Glu Asn Val Leu Cys Gin Thr Glu Tyr lie Phe Ala Arg Ser Asn 115 120 125

Pro Met He Leu Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Cys Glu Asp Leu Pro 130 135 140

Gin Pro Glu Ser Pro Glu Ala Ala Asn Cys lie Arg lie Gly He Pro 145 150 155 160

Met Ala <210> 66 f <211> 162

、 <212> PRT <213>智人 <400> 66 丁hr Cily Val Leu Phe Val Arg Leu Gly Pro Thr His Ser Pro Asn His 15 10 15

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Gly lie Ala Cys Ala Arg Phe lie Gly Asn Arg Thr lie Tyr Val Asp 35 40 45

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Ser Arg Thr Pro Lys Pro Arg Glu Leu Cys Arg Asp Glu Cys Glu Val 100 105 110

Leu Glu Ser Asp Leu Cys Arg Gin Glu Tyr Thr lie Ala Arg Ser Asn 115 120 125

Pro I.eu fie I.eu Met Arg Leu Gin Leu Pro Lys Cys Glu Ala Leu Pro 130 135 140

Mcl Pro Glu Ser Pro Asp Ala Ala Asn Cys Met Arg lie Gly lie Pro 145 150 155 160

Ala Glu -63- 124434-序列表.doc 200819463 <21ϋ> 67 <211> 227 <212> PRT <213>智人 <400> 67

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 15 10 15

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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie 100 105 110

Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 115 120 125 lyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser 130 135 140

Leu I'hr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu 145 150 155 160

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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220

Pro Gly Lys 225 <210> 68 <211〉 230 <212> PRT <2Π> ^人 <4()0> 68

Asp Lys Ala Ala Arg Ser Thr Leu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu -64- 124434-序列表.doc 200819463 5 10 15

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20 25 30

Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 35 40 45

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 50 55 60

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 65 70 75 80 vSer Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 85 90 95

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 100 105 110

Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 115 120 125

Pro On Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 130 135 140

Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He 145 150 155 160

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175

Fhr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 180 185 190 lxu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205

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PRT 人工序列 <220〉 <223>肽連接子 <400> 69

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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 195 200 205

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Asp Cys Ser Arg Asp Phe Arg Pro Phe Leu Cys Ala Leu Tyr Ala Pro 85 90 95 lie Cys Met Glu Tyr Gly Arg Val Thr Leu Pro Cys Arg Arg Leu Cys 100 105 110

Gin Arg Ala Tyr Ser Glu Cys Ser Lys Leu Met Glu Met Phe Gly Val 115 120 125 -94- 124434-序列表.doc 200819463

Pro Trp Pro Glu Asp Met Glu Cys Ser Arg Phe Pro Asp Cys Asp Glu 130 135 140

Pro Tyr Pro Arg Leu Val Asp Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Gly Val 145 150 155 160

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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 180 185 190

Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 195 200 205

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 210 215 220

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr / 225 230 235 240 \

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 245 250 255

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 260 265 270 lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 275 280 285

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val 290 295 300

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 305 310 315 320

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 325 330 335

Pro Val Leu Asp 55er Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 340 345 350

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 355 360 365

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu wSer Leu 370 375 380

Ser Pro Gly Lys <210> 115 <211> 1410 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 -95- 124434-序列表.doc 60 200819463 <223> Frzl-Fc構築體 <400> 115 atggggggga ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc catggggtcc gcggcaaaat cgatgaggag ggcagcgggg acgccggtgg ccgccgccgc ccgccagug acccccggcg attggcgcgc cagctgctgc tgctgctttg gctgctggag gctccgctgc tgctgggggt ccgggcccag gcggcgggcc aggggccagg ccaggggccc gggccggggc agcaaccgcc gccgccgcct cagcagcaac agagcgggca gcagtacaac ggcgagcggg gcatclccgt cccggaccac ggctattgcc agcccatctc catcccgctg tgcacggaca tcgcgtacaa ccagaccatc atgcccaacc tgctgggcca cacgaaccag gag^acgcgg gcctggaggt gcaccagttc taccctctag tgaaagtgca gtgttccgct gagctcaagt tctlcctgtg ctccatgtac gcgcccgtgt gcaccgtgct agagcaggcg ctgccgccci gccgciccct gtgcgagcgc gcgcgccagg gctgcgaggc gctcatgaac aagttcggct tccagtggcc agacacgctc aagtgtgaga agttcccggt gcacggcgcc ggcgagctgt gcgtgggcca gaacacgtcc gacaaggctc gagggcgcgc ccaggtcacc gacaaagctg cgcgctctac tctgtgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtgglggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg iaci>tggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgicctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag i>aglacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaagag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgiggagi gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggaciccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa <210> 116 <211〉 1209 <2I2> DNA <213>人工序列 <220> <223> Frz2-Fc 構築體 <400〉 116 'digggggggdi ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc caiggggtcc gcggcaaaat cgatgctcga ggggcccagi tccacgggga gaagggcatc tccatcccgg accacggctt ctgccagccc atctccatcc cgctgtgcac ggacatcgcc lacaaccaga ccatcatgcc caaccttctg ggccacacga accaggagga cgcaggccta gaggtgcacc agttctatcc gctggtgaag gtgcagtgct cgcccgaact gcgcttcttc ciglgctcca tgtacgcacc cgtgtgcacc gtgctggaac aggccatccc gccgtgccgc tcuu，igig agcgcgcgcg ccagggctgc gaagccctca tgaacaagtt cggttttcag 124434-序列表.doc •96- 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1410 60 120 180 240 300 360 420 / v 200819463 tggcccgagc gcctgcgctg cgagcacttc ccgcgccacg gcgccgagca gatctgcgtc ggccagaacc actccgagga cgggcgcgcc caggtcaccg acaaagctgc gcgctctact clgtgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccci catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg yacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg igtacaccct gcccccatcc cgggaagaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc 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gtgcccagca 540 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctct tccccc caaaacccaa ggacaccctc 600 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 660 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 720 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtgglcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 780 gaclggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 840 a tcgagaaaa ccaictccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 900 ccxccatccc gggaagagat gaccaagaac caggtcagcc igacctgcct ggtcaaaggc 960 ltctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1020 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1080 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1140 ctgcacaacc aciacacgca gaagagcclc tccctgtctc cgggtaaa 1188 <210〉 120 <211> 1119 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> Frz6-Fc 構築體 <400> 120 atggaaatgt ttacattttt gttgacgtgt atttttctac ccctcctaag agggcacagt 60 ctcl icacct gtgaaccaat tactgttccc agatgtatga aaatggccta caacatgacg 120 tttttcccta atctgatggg tcattatgac cagagtattg ccgcggtgga aatggagcat 180 tlt c 11 cc t c icgcaaatct ggaaigttca ccaaacattg aaactttcct ctgcaaagca 240 lttgtaccaa cctgcataga acaaattcat gtggttccac cttgtcgtaa actttgtgag 300 aaa^tatat i ctgat tgcaa aaaat taat t gacacttttg ggatccgatg gcctgaggag 360 ct tgaatgtg acagat taca aiactgtgat gagactgttc ctgtaacttt tctcgagtca 420 ggaggaggag gagtcaccga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 480 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 540 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 600 t tcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 660 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 720 aalggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 780 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 840 cyggaagaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 900 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 960 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1020 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1080 cactacacgc agaagagcci ctccctgtct ccgggtaaa 1119 -99- 124434-序列表.doc 60 60

\ 200819463 <210> 12! <211> 1212 <212> DNA <2】3>人工序列 <220> <223> Frz7-Fc 構築體 <4()0> 121 atgcgggacc ccggcgcggc cgctccgctt tcgtccctgg gcctctgtgc cctggtgctg gcgdgctgg gcgcactgtc cgcgggcgcc ggggcgcagc cgtaccacgg agagaagggc atctccgtgc cggaccacgg cttctgccag cccatctcca tcccgctgtg cacggacatc gcctacaacc agaccatcct gcccaacctg ctgggccaca cgaaccaaga ggacgcgggc ctcgaggtgc accagttcta cccgctggtg aaggtgcagt gttctcccga actccgcttt ttctiatgct ccatgtatgc gcccgtgtgc accgtgctcg atcaggccat cccgccgtgt cgttctctgt gcgagcgcgc ccgccagggc tgcgaggcgc tcatgaacaa gttcggcitc ca^tg^cccg agcggctgcg ctgcgagaac ttcccggtgc acggtgcggg cgagatctgc ijtgggccaga acacglcgga cggcctcgag tcaggaggag gaggagtcac cgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccclgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggic agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggaag agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg ictccgggta aa <210> 122 <211> 1176 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> Frz8-Fc嵌合型構築體 <400> ]22 aiggagiggg gttacctgtt ggaagtgacc tcgctcctag ccgccttggc ggtgctacag cgcictagcg gcgctgccgc ggcttcggcc aaggagctgg cgtgccaaga gatcacggtg ccytlgigca aaggcatcgg ttacaactac acttacatgc ccaaccagtt caaccacgac ac^caa^au7 aggcgggcct agaggtgcac cagtttrggc cgctgglgga gatacagtgc tccccggacc tcaagttctt tctgtgtagc atgtacacgc ccatctgcct ggaggactac aagaagcctc tgccgccttg tcgctctgtg tgtgaacgcg ccaaggccgg ctgcgcgccg 124434-序列表.doc -100- 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1212 6ϋ 120 180 240 300 360 200819463 ctcatgcgcc agtacggctt tgcttggcct gaccgcatgc gctgcgatcg gttgccggag cagggcaacc cggacactct gtgcatggac tacaaccgca ccgacctcga gtcaggagga ggaggagtca ccgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc ccigaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac l^iacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc auggagtaca agigcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggaa gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggclc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac f acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga \ <21()> 123 <211> 1188 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223> Frz9-Fc 構築體 <400> 123 atggccgtgg cgcctctgcg gggggcgctg ctgctgtggc agctgctggc ggcgggcggc gcggcactgg agatcggccg cttcgacccg gagcgcgggc gcggggctgc gccgtgccag tccccatgtg ccgcggcatc ggctacaacc tgacccgcat gcccaacctg ctgggccaca cgtcgcaggg cgaggcggct gccgagctag cggagttcgc gccgctggtg cagtacggct gccacagcca cctgcgcttc ttcctgtgct cgctctacgc gcccatgtgc accgaccagg tctcgacgcc cattcccgcc tgccggccca tgtgcgagca ggcgcgcctg cgctgcgcgc ccatcatgga gcagttcaac ttcggctggc cggactcgct cgactgcgcc \ cggctgccca cgcgcaacga cccgcacgcg ctgtgcatgg aggcgcccga gaacgccacg ctcgagtcag gaggaggagg agtcaccgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga gglcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct ^a^gtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc aicgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaagagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc mtatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac uayaccacgc ctcccgtgci ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc giggacaaga ^caggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 124434·序列表.doc -101 - 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1176 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 200819463 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1188 <2I0> 124 <211> 1173 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223> Frzl〇-Fc構築體 <4()0> 124 /. atgcagcgcc cgggcccccg cctgtggctg gtcctgcagg tgatgggctc gtgcgccgcc 60 atcagctcca tggacatgga gcgcccgggc gacggcaaat gccagcccat cgagatcccg 120 aigtgcaagg acatcggcta caacatgaci cgtatgccca acctgatggg ccacgagaac 180 cagcgcgagg cagccatcca gttgcacgag ttcgcgccgc tggtggagta cggctgccac 240 ygccacctcc gcttcttcct gtgctcgctg tacgcgccga tgtgcaccga gcaggtctct 300 acccccatcc ccgcctgccg ggtcatgtgc gagcaggccc ggctcaagtg ctccccgatt 360 atggagcagt tcaacttcaa gtggcccgac tccctggact gccggaaact ccccaacaag 420 aacgacccca actacctgtg catggaggcg cccaacaacg gctcgctcga gtcaggagga 480 ggaggagtca ccgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 540 ggaccgtcag lettcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 600 ccigaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 660 t^gtacgtgg acggcgtgga ggigcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagiac 720 uacagcacgt accgtgtggt cagcgtccic accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 780 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 840 iccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggaa 900 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc Igcctggtca aaggetteta tcccagcgac 960 aicgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1020 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1080 iggcagcagg ggaaegtett ctcatgctcc gtgatgcatg aggetetgea caaccactac 】140 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1173 <210> 125 <211> 1230 <2I2> DNA <213>人工序列 <220> <223> sFRPl-Fc構築體 <400> 125 atgggcalcg ggcgcagcga ggggggccgc cgcggggcag ccctgggcgt gctgctggcg 60 cigggcgcgg cgcltctggc cgtgggctcg gccagcgagt acgactacgt gagcttccag 120 tcggacatcg gcccgtacca gagegggege ttctacacca agccacctca gtgcgtggac 180 aiccccgcgg acctgcggct gtgccacaac gtgggctaca agaagatggt gctgcccaac 240 ctgctggagc acgagaccat ggcggaggtg aageageagg ccagcagctg ggtgcccctg 300 ctcaacaaga actgccacgc cggcacccag gtcttcctct gctcgctctt cgcgcccgtc 360 -102- 124434-序列表.doc 420 200819463 tgcdggacc ggcccatcta cccgtgtcgc tggctctgcg aggccgtgcg cgactcgtgc gagccggtca tgcagttctt cggcttctac tggcccgaga tgcttaagtg tgacaagttc cccgaggggg acgtctgcat cgccatgacg ccgcccaatg cctggcgcgc ccaggtcacc ^acaaagctg cgcgctctac tctgtgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagict tccicttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacal gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgiggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacglacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaagag aigaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt ctlcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg ( ca^cagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa <210〉 126 <211> 1188 <212> DNA <2]3>人工序列 <22ϋ> <223> sFRP2-Fc構築體 <40ϋ> 126 aigctgcagg gccctggctc gctgctgctg ctctlcctcg cctcgcactg ctgcctgggc tcggcgc^cg ggctcttcct ctttggccag cccgacttct cctacaagcg cagcaattgc aagcccatcc ctgccaacct gcagctgtgc cacggcatcg aataccagaa catgcggctg cccaacctgc tgggccacga gaccatgaag gaggtgctgg agcaggccgg cgcttggatc ccgctggtca tgaagcagtg ccacccggac accaagaagt tcctgtgctc gctcttcgcc cccgtctgcc tcgatgacct agacgagacc atccagccat gccactcgct ctgcgtgcag gtgaaggacc gctgcgcccc ggtcatgtcc gccttcggct tcccctggcc cgacatgctt gagtijcgacc gtttccccca ggacaacgac ctttgcatcc ccctcgctag cagcgaccac iggcgcgccc aggtcaccga caaagctgcg cgctctactc tgtgcccacc gtgcccagca ccigaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga aiggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc aicgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaagagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttciatccca ^cgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 124434-序列表.doc -103 _ 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1230 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 200819463 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggcl ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa <210> 127 <211> 1170 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223> sFRP3-Fc 構築體 <400〉 127 aiggggggga ctgccgccag gtlgggggcc gtgamtgt ttgtcglcat agigggcctc catggggtcc gcggcaaaat cgatgctcga ggggcagcct gtgagcccgt ccgcatcccc clgtgcaagt ccctgccctg gaacatgact aagatgccca accacctgca ccacagcact caggccaacg ccatcctggc catcgagcag ticgaaggtc tgctgggcac ccactgcagc cccgatct^c tcttcttcct ctgtgccatg tacgcgccca tctgcaccat tgacttccag cacgagccca tcaagccctg taagtctgtg tgcgagcggg cccggcaggg ctgtgagccc f alactcatca agtaccgcca ctcgtggccg gagaacctgg cctgcgagga gctgccagtg \ tacgacaggg gcgtgtgcat ctctcccgag gccatcgtta ctgggcgcgc ccaggtcacc gacaaagctg cgcgctctac tctgtgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgicagtct tccicttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggicacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcglggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag ga^tacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaagag aigaccaaga accaggtcag ccigacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc ^ccglggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggclcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcitctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg £ \ cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa <210> 128 <211〉】140 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223> sFRP4-Fc構築體 <400> 128 atgttcctct ccatcctagt ggcgctgtgc ctgtggctgc acctggcgct gggcgtgcgc ggcgcgccct gcgaggcggt gcgcatccct atgtgccggc acatgccctg gaacatcacg cggatgccca accacctgca ccacagcacg caggagaacg ccatcctggc catcgagcag lacgaggagc tggtggacgt gaactgcagc gccgtgctgc gcttcttctt ctgtgccatg lacgcgccca tttgcaccct ggagttcctg cacgacccta tcaagccgtg caagtcggtg 124434-序列表.doc 1188 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1170 60 120 180 240 -104- 300 200819463 tgccaacgcg cgcgcgacga ctgcgagccc ctcatgaaga tgtacaacca cagctggccc i»aaagcctgg cctgcgacga gctgcctgtc tatgaccgtg gcgtgtgcat ttcgcctgaa gccatcgtca cgclcgagtc aggaggagga ggagtcaccg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaagag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggicaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gccicccgig ctggactccg acggdcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg ^ atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa <210> 129 <211〉丨218 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> SFRP5-Fc 構築體 <400> 129 atgcgggcgg cggcggcggc ggggggcgtg cggacggccg cgctggcgct gctgctgggg gcgctgcact gggcgccggc gcgctgcgag gagtacgact actatggctg gcaggccgag ccgctgcacg gccgctccta ctccaagccg ccgcagtgcc ttgacatccc tgccgacctg ccgctctgcc acacggtggg ctacaagcgc atgcggctgc ccaacctgct ggagcacgag agcctggccg aagtgaagca gcaggcgagc agctggctgc cgctgctggc caagcgctgc cactcggata cgcaggtctt cctgtgctcg ctctttgcgc ccgtctgtct cgaccggccc aictacccgi gccgctcgct gtgcgaggcc gtgcgcgccg gctgcgcgcc gctcatggag i gcctacggct tcccctggcc tgagatgctg cactgccaca agttccccct ggacaacgac dctgcatcg ccgtgcagtt cgggcacctg tggcgcgccc aggtcaccga caaagctgcg cgctctactc tgtgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataaigccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tccicaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaygtclcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaagagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 124434-序列表.doc -105- 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200200819463 gtcttcicat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgictc cgggtaaa 1218

I V 124434-序列表.doc •106-

Claims

200819463 十、申請專利範圍： 1· 一種Wnt拮抗劑，其包含： (a) Frizzled域組分，及 (b) Fc域，其中該Frizzled域組分包含來源於選自由以下蛋白質組成之群之蛋白質的多肽：（i) Frizzled (Frz)蛋白、（U) 为/必型Frizzled相關蛋白（sFRP)蛋白及（iii) R〇r蛋白；且此外，其中該Wnt拮抗劑在活體内具有至少1小時的活性。 2·如清求項1之Wnt拮抗劑，其中該Wnt拮抗劑在活體内具有至少5小時的活性。 3· —種Wnt拮抗劑，其包含： (a) Frizzled域組分，及 (b)Fc域，其中該Frizzled域組分包含來源於選自由以下蛋白質組成之群之蛋白質的多肽：（i) Frizzled (Frz)蛋白、（ii) 分泌型Frizzled相關蛋白（sFRP)蛋白及（iii) R0r蛋白；且此外其中該Wnt拮抗劑具有至少1天的活體内半衰期。 4·如請求項3之Wnt拮抗劑，其中該Wnt拮抗劑具有至少2天的活體内半衰期。 5·如請求項卜4中任一項之Wnt拮抗劑，其中該巧丨^丨以域組分包含來自選自由以下多肽組成之群之Frz多肽的最小 CRD (ECD)域·· hFrzl (SEQ ID NO: 18)，hFrz2 (SEQ ID NO: 19), hFrz3 (SEQ ID NO: 20), hFrz4 (SEQ ID NO: 124434.doc 200819463 21), hFrz5 (SEQ ID NO: 22), hFrz6 (SEQ ID NO: 23), hFrz7 (SEQ ID NO: 24)，hFrz8 (SEQ ID NO: 25)，hFrz9 (SEQ ID NO: 26)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 27)，及其活性變體。 6.如請求項1-4中任一項之Wnt拮抗劑，其中該Frizzled域組分包含來自選自由以下多肽組成之群之sFRP多肽的最小 CRD (ECD)域：sFRPl (SEQ ID NO: 28)，sFRP2 (SEQ ID NO: 29)，sFRP3 (SEQ ID NO: 30)，sFRP4 (SEQ ID NO: 31)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 32)，及其活性變體。 7·如請求項1-4中任一項之Wnt拮抗劑，其中該Frizzled域組分包含來自選自由以下多肽組成之群之Ror多肽的最小 CRD (ECD)域：hRorl (SEQ ID NO: 33)及 hRor2 (SEQ ID NO·· 34)，及其活性變體。 8·如請求項1 -4中任一項之Wnt拮抗劑，其中該Frizzled域組分包含選自由以下多肽組成之群的成熟Frz多肽： hFrzl (SEQ ID NO: 50), hFrz2 (SEQ ID NO: 51), hFrz3 (SEQ ID NO: 52), hFrz4 (SEQ ID NO: 53), hFrz5 (SEQ ID NO: 54)，hFrz6 (SEQ ID NO: 55)，hFrz7 (SEQ ID NO: 56)，hFrz8 (SEQ ID NO: 57)，hFrz9 (SEQ ID NO: 58)及 hFrzl0 (SEQ ID NO: 59)，及其活性變體。 9·如請求項1 -4中任一項之Wnt拮抗劑，其中該Frizzled域組分包含選自由以下多肽組成之群的成熟sFrp多肽： sFRPl (SEQ ID NO: 60), sFRP2 (SEQ ID NO: 61), sFRP3 (SEQ ID NO: 62)，sFRP4 (SEQ ID NO: 63)及 sFRP5 (SEQ 124434.doc 200819463 ID NO: 64)，及其活性變體。 10.如請求項1-4中任一項之Wnt拮抗劑，其中該Frizzled域組分包含選自由以下多肽組成之群的成熟Ror多肽： hRorl (SEQ ID NO: 65)及 hRor2 (SEQ ID NO: 66)，及其活性變體。 11 ·如請求項1-4中任一項之Wnt拮抗劑，其中該Frizzled域組分包含選自由以下多肽組成之群的原-Frz多肽：hFrzl (SEQ ID NO: 35)，hFrz2 (SEQ ID NO: 36)，hFrz3 (SEQ ID NO: 37), hFrz4 (SEQ ID NO: 38)5 hFrz5 (SEQ ID NO: 39)，hFrz6 (SEQ ID NO: 40)，hFrz7 (SEQ ID NO: 41)， hFrz8 (SEQ ID NO: 42)，hFrz9 (SEQ ID NO: 43)及 hFrzlO (SEQ ID NO: 44)，及其活性變體。 12.如請求項1-4中任一項之Wnt拮抗劑，其中該Frizzled域組分包含選自由以下多肽組成之群的原-sFrp多肽： sFRPl (SEQ ID NO: 45), sFRP2 (SEQ ID NO: 46), sFRP3 (SEQ ID NO: 47)，sFRP4 (SEQ ID NO: 48)及 sFRP5 (SEQ ID NO: 49)，及其活性變體。 13·如請求項1-4中任一項之Wnt拮抗劑，其中該Fc組分來源於選自由IgGl、IgG2、IgG3及IgG4組成之群的免疫球蛋白。 14·如請求項13之Wnt拮抗劑，其中該Fc來源於IgGl免疫球蛋白。 15.如請求項14之Wnt拮抗劑，其中該Fc包含SEQ ID NO: 67 或SEQ ID NO: 68中所示之Fc序列。 124434.doc 200819463 16. 如請求項1-4中任一項之Wnt拮抗劑，其進一步包含將該 Frizzled域組分與該Fc域連接的連接子。 17. 如請求項16之Wnt拮抗劑，其中該連接子包含選自由以下肽組成之群的肽：ESGGGGVT (SEQ ID NO: 69)， LESGGGGVT (SEQ ID NO: 70)，GRAQVT (SEQ ID NO: 71)，WRAQVT (SEQ ID NO: 72)及 ARGRAQVT (SEQ ID NO: 73)。 18· —種Wnt拮抗劑，其包含選自由以下多肽組成之群的多肽：Frz8-Fc (SEQ ID NO: 74)，Frz5-Fc (SEQ ID NO: 75)， Frzl-Fc (SEQ ID NO: 76)，Frz2-Fc (SEQ ID NO: 77)， Frz3_Fc (SEQ ID NO: 78)，Frz4-Fc (SEQ ID NO: 79)， Frz6-Fc (SEQ ID NO: 80)，Frz7-Fc (SEQ ID NO: 81)， Frz9-Fc (SEQ ID NO: 82)，FrzlO-Fc (SEQ ID NO: 83)， sFRPl-Fc (SEQ ID NO: 84)，sFRP2-Fc (SEQ ID NO: 85)， sFRP3-Fc (SEQ ID NO: 86)，sFRP4-Fc (SEQ ID NO: 87) 及 sFRP5-Fc (SEQ ID NO: 88) 〇 19. 一種組合物，其包含至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑及如請求項1-18中任一項之Wnt拮抗劑。 20· —種核酸序列，其編碼如請求項1-18中任一項之Wnt拮抗劑。 21 · —種載體，其包含與控制序列操作性連接之如請求項20 之核酸。 22. —種宿主細胞，其包含如請求項21之載體。 23·如請求項22之宿主細胞，其係選自由哺乳動物、昆蟲、 124434.doc 200819463 大腸桿菌（五· co//)及酵母細胞組成之群。 24·種製0口，其包含如請求項19之組合物及容器，其中 Wnt拮抗劑包含於該容器内且該容器進一步包含（a)附著至該容器之標籤；或（b)置於該容器内說明該Wnt拮抗劑之用途的包裝插頁，其指示使用該組合物治療性治療或診斷性偵測Wnt-中介性病症。 25. —種抑制細胞中Wnt信號轉導之方法，其包含使該細胞接觸有效量之如請求項1 -1 8中任一項之wnt拮抗劑。 26· —種Wnt拮抗劑在製造供治療細胞增殖性病症用之藥物中的用途，該Wnt拮抗劑包含： (a) Frizzled域組分，及 (b) Fc 域，其中該Frizzled域組分包含來源於選自由以下蛋白質組成之群之蛋白質的多肽：（i) Frizzled(Frz)蛋白、（ii)分泌型Frizzled相關蛋白（SFRP)蛋白及（出）R0r蛋白；且此外，其中該Wnt拮抗劑在活體内具有至少1小時的活性。 27·如請求項26之用途，其中該Wnt拮抗劑在活體内具有至少5小時的活性。 28. —種Wnt拮抗劑在製造供治療細胞增殖性病症用之藥物中的用途，該Wnt拮抗劑包含： (a) Frizzled域組分，及 (b) Fc 域，其中該Frizzled域組分包含來源於選自由以下蛋白質 124434.doc 200819463 組成之群之蛋白質的多肽：（i) Frizzled (Frz)蛋白、（ii) 分泌型Frizzled相關蛋白（sFRP)蛋白及（iii) Ror蛋白；且此外其中該Wnt拮抗劑具有至少1天的活體内半衰期。 29·如請求項28之用途，其中該Wnt拮抗劑具有至少2天的活體内半衰期。 30·如請求項26-29中任一項之用途，其中該Wnt拮抗劑進一步包含將該Frizzled域組分與該Fc域連接的連接子。 31. 如請求項30之用途，其中該連接子為選自由以下肽組成之群的肽：ESGGGGVT (SEQ ID NO: 69)，LESGGGGVT (SEQ ID NO: 70)，GRAQVT (SEQ ID NO: 71)，WRAQVT (SEQ ID NO: 72)及 ARGRAQVT (SEQ ID NO: 73)。 32. 如請求項26-29中任一項之用途，其中該細胞增殖性病症為癌症。 33. 如請求項32之用途，其中該癌症係選自由以下各病症組成之群：結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、神經膠質瘤及髓母細胞瘤。 124434.doc