TW200803836A - Estrogen cancer therapy - Google Patents

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200803836 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於用於為各種男性及女性癌症選擇一種療法 並隨後治療該等癌症之方法。 【先前技術】 水溶性紫杉醇偶聯物、製備該等之方法及使用該等治療 紫杉烷響應性疾病之方法闡述於美國專利第5,977，163號及 第6,262，107號中。如其中所報道，發現含有該等藥物之經 _ 偶聯形式之組合物作為抵抗示例性腫瘤模型之抗腫瘤劑顯 示令人驚奇的功效且預計該等組合物至少與可抵抗已知紫 杉烷類或紫杉醇類對其有效之任何疾病或病況的紫杉醇或 多西他賽（docetaxel) —般有效。該等專利亦提供如下優 點：方便調配（藉由克服與該等藥物自身之不溶性相關之 缺點）、控制釋放及較少副作用（至少部分係由於消除了對 與於先前紫杉醇組合物中所觀察到之副作用相關之溶劑的 需要）。 ^ 【發明内容】 本發明之第一態樣係關於一種治療具有診斷為癌症之更 年期前雌性素含量之女性的方法，該方法包括向需要其之 女性遞送一包含偶聯至抗癌藥之聚（胺基酸）聚合物的偶聯 物（本文稱作經偶聯藥物或藥物偶聯物），其中該癌症之特 徵係存在具有雌性素受體之癌細胞或者其中可產生癌症之 器官或組織中存在具有雌性素受體之正常（未患疾病）細 胞0 116852.doc 200803836 本發明之第二態樣係關於一 方、& ! /σ療4斷為癌症之患者的 者^中該癌症之特徵係存在具有雌性素受體之癌細胞 之正二“可產生癌症之器官或組織中存在具有雌性素受體 ^未患疾病)細胞，且其中該療法包括向該患者遞送 、、、二偶聯藥物及雌性素治療。 、本發明之另-態樣係關於_種驗根據血清雌性素含量 選擇癌症治療方案之方法。

仏管不欲受限於任-特定作業理論，㈣請者認為雖性 素之存在（即，可以内源或外源方式提供雌性素治療）可藉 由增加遞送給癌性組織（例如，腫瘤）之藥物數量增強該等 偶聯藥物之功效。雌性素亦可造成細胞自溶酵素Β(-種與 活性藥物自高分子載體主鏈分離相關之酵素）上調，從而 使癌性組織中未偶聯（或游離）抗癌藥物之數量增加。 【實施方式】 θ 本發明係urn症療法。本文所用術語「具有雖性 素又體之癌症」係指特徵為存在具有雌性素受體之癌細胞 的任何癌症、腫瘤形成或其他（例如，諸如白血病等造血 性癌症”或指可發生於含有具有雌性素受體之正常（未患 病）細胞之器官或組織中的癌症。該雌性素受體可為瞬時 表現及/或具有雌性素受體之細胞可代表細胞（癌細胞或未 患疾病之細胞）總數量之一部分。換言之，並非所有與特 定癌症相關之細胞或始發組織中之細胞必定具有雌性素受 體。而且在疾病進展過程中該等癌細胞並非總是表現雌性 素受體。始發組織中正常細胞在其整個壽命中不一定表現 116852.doc 200803836 雌性素受體。 有2種雌性素受體形式，即心及|3_受體。癌細胞上受體 之患病率可能與特定類別之癌症及/或癌症進展之特定階 段相關。因此，該等癌細胞在該疾病進展期間的不同時間 表現不同形式。參見Leav等人，J. ρα也759:79-92 (2001)。具有雌性素β受體之癌症包括但不限於非小細胞 型肺癌（NSCLC)、乳腺癌、印巢癌、子宮上皮癌及肉瘤、 結腸癌、神經膠質瘤、前列腺癌、睾丸癌及黑色素細胞 瘤。對於此應用而言，雌性素β受體尤為有用，乃因其係 在肺組織及NSCLC中表現之唯一功能受體。參見Patr〇ne等 人 ’ Mo/· Ce//·价〇· 23:8542-8552 (2003)。 如本文所述，視所選患者群體而定，本發明之方法亦可 包括施與雌性素療法。在本發明之某些實施例中，所選患 者群體係由具有更年期前（或較高）内源性雌性素含量之女

ί*生構成。本文所用短語具有「更年期前内源性雌性素含 量」之女性通常具有一自約30至約1〇〇〇皮克雌性素/毫升 血清或血漿（例如，約30至約300 pg/ml)之血清或血漿雌性 素含量（通常利用（例如)諸如彼等來自Fitzgerald Industries InteTnati〇nai (Conc〇rd，MA)之Rm部門者等市售酵素聯免 疫吸附分析（ELISA)套組量測生物活性激素雌二醇（雌二醇一 17β)或E2)。更年期前内源性雌性素含量經常發現於未經 歷更年期ϋ且不具有可顯著改變雌性素含量之其他有損健 康之因素之青春期後女性中。此群體通常包括年齡為7、 8、9、 10、 U、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 192〇、 116852.doc 200803836 21 ' 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45 ' 46 ' 47 ' 48、49、50、51、52、53 至約 54及其中任一 子集範圍内之女性。此外，儘管稀少，但是會有男性時常 具有類似於更年期前女性之血清或血漿雌性素含量。因 此，本文結合血清或血漿雌性素含量所用術語「更年期 前」亦包括男性。 在本發明之其他實施例中，所選患者群體係由具有低含 量=性素之患者（通常為男性及更年期後女性）組成。在此 等灵施例中，使用需要遞送或施與該藥物偶聯物及雖性素 療法之組合療法治療該等患者。此等患者通常具有低於定 量分析下限值（-般低於3G皮克/㈣，例如約Μ至正好低 於30皮克/¾升）之血清或血漿雌性素含量。儘管吾人已知 男並不會經歷「更年期」，但如本文所用術語「更年期 :血清或血漿雌性素含量」亦涵蓋隸。更年期後女性通 常在55歲以上。然而，在某些個別情況下，不足55歲之婦 女可能具有更年期後雌性素含量。此等情況包括已經受外 科印巢切除術或因治療癌症而施與可影響㈣或腦垂體功 能之細胞毒性化學治療或其他藥物而導致卵巢功能喪失或 =有原發”巢功能衰竭之婦女。此群組可包括年齡為 、15、16、17、18、19'2〇、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、4〇、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 51 52、53、或54歲之較年輕女性。 n6852.doc 200803836 可用於本發明之聚合物包括胺基酸。此等聚合物之實例 閣述於美國專利第5,977，163號及第6,262，1〇7號中。本文所 用術來（胺基酸）聚合物」係指由自然生成或合成胺基 -夂構成之共t物及均聚物。㉟等胺I酸無需、經由肽鍵聚合 而是可以任一容許胺基酸單體依次鍵結之方式鍵結。 可用於本發明之聚合物包括但不限於聚（1-麩胺酸）、聚 (d_麩胺酸）、聚（dl_麵胺酸）、聚（1·天冬胺酸）、聚（d-天冬胺 酸）、聚（di-天冬，胺酸）、聚（1_離胺酸）、聚（d_離胺酸）、聚 (dl_離胺酸）、聚絲胺酸）、聚絲胺酸）、聚（dl-絲胺 酉欠）、聚（1_甘胺酸）、聚（d-甘胺酸）、聚（dl_甘胺酸）、聚屮 丙胺6〇、聚（d_丙胺酸）、聚（dl_丙胺酸）、聚（i_酪胺酸）、 聚（d-酪胺酸）、聚（dl-酪胺酸）、聚屮蘇胺酸）、聚蘇胺 酸）、聚（dl-蘇胺酸）、聚（(1_半胱胺酸）、聚屮半胱胺酸）及 聚（dl-半胱胺酸）。在其他實施例中，該等聚合物係上述聚 (胺基酸）與非胺基酸聚合物（例如，聚乙二醇、聚己内酯、 聚乙醇酸及聚乳酸以及聚（2_經乙紅麵醯胺）、脫乙酿殼 多糖、羧曱基葡聚糖、透明質酸、人類血清白蛋白及海藻 酉文）之/、I物（例如，肷段、接枝或無規共聚物）。特別佳者 係聚-麩胺酸及聚-離胺酸。所述任一聚（胺基酸）（例如，聚 (麩胺酸）)並不限於異構現象，因此其涵蓋所有同分異構形 式，包括d、1及dl形式。 在某些實施例中，可使用「_種水溶性聚胺基酸」、「若 干水溶性聚胺基酸」或「胺基酸之水溶性聚合物广對於 此等術語，意指該等聚合物包括包含(1及/或1同分異構體 116852.doc 200803836 構型麩胺酸及/或天冬胺酸及/或離胺酸之組合的胺基酸 鏈。在某些實施例中，此「水溶性聚胺基酸」含有一或多 個麩胺酸、天冬胺酸及/或離胺酸殘基。在較佳實施例 中，該聚合物係聚（陰離子胺基酸）聚合物。聚（陰離子胺基 酸）聚合物之實例包括聚_麩胺酸、聚_天冬胺酸及其他^ pH 7下具有一淨負電荷之同種_或異種-胺基酸聚合物。 在其他實施例中，該等聚合物係含有麩胺酸之共聚物， 例如嵌段、接枝或無軌共聚物。因此，本發明包括含有至 少一種其他（較佳為生物可降解的）單體、寡聚物或聚合物 之麵胺酸共聚物。此等包括（例如）含有至少一個其他胺基 酉文（例如，天冬胺酸' 絲胺酸、絡胺酸、甘胺酸）、乙二 醇、環氧乙烷-或任一該等之寡聚物或聚合物-或聚乙烯醇 之’、t物麵胺酸殘基可攜有一或多個取代基且該等聚合 物包括彼等其中一部份或全部麩胺酸單體經取代者。取代 基基團包括（例如）烷基、羥基烷基、芳基及芳基烷基_通常 母個基團具有至多1 8個碳原子_或經由酷鍵結連接之聚乙 二醇。除非另有要求，否則措辭「聚（麩胺酸）」及同類措 —在本文中應理解為涵蓋任一上述可能性。 自然生成、不尋常或經化學修飾胺基酸之各種替代物可 包括聚（胺基酸）聚合物之胺基酸組成。 作為胺基酸或聚（胺基酸）之替代物用於本發明之自然生 成胺基酸係丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺、天冬胺酸、瓜 胺酸、半胱胺酸、麩醯胺、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、 白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、鳥胺酸、苯丙胺酸、脯胺 116852.doc -10- 200803836 酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸、羥基脯 胺酸、ε-羧基麵胺酸、苯基甘胺酸或〇_磷酸絲胺酸。 可用於本發明之非自然生成胺基酸包括（例如）β-丙胺 酸、α-胺基丁酸、γ_胺基丁酸、(胺基苯基）丁酸、α_胺基 異丁酸、瓜胺酸、ε-胺基己酸、7-胺基庚酸、β-天冬胺 酸、胺基苯甲酸、胺基苯基乙酸、胺基苯基丁酸、γ_麩胺 酸、ε-離胺酸、甲硫胺酸砜、正白胺酸、正纈胺酸、鳥胺 酸、d-鳥胺酸、ρ_硝基-苯丙胺酸、羥基脯胺酸、ι，2,3,4，_ 四氫異喹啉-3-甲酸及硫代脯胺酸。 胺基酸替代物通常係基於胺基酸側鏈取代基之相對類似 性，例如，其疏水性、親水性、電荷、大小及諸如此類。 對胺基酸侧鏈取代基之大小、形狀及類別的分析表明：精 胺酸、離胺酸及組胺酸皆為帶有正電荷之殘基；丙胺酸、 甘胺酸及絲胺酸皆具有類似尺寸；苯丙胺酸、色胺酸及酿 胺酸皆具有大體類似形狀。因此，基於此等考慮因素，在 本文中將精胺酸、離胺酸及組胺酸；丙胺酸、甘胺酸及絲 胺酸，及苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸界定為具有生物學功 月之專效物。 假-聚（胺基酸）亦可用於本發明。假-聚（胺基酸）與上述聚 (胺基酸）之不同為二肽單體係藉由非正規肽鍵結共價結 合。適用於本發明之假_聚（胺基酸）係彼等闡述於（例 如）Kohn 等人，如er· c/zem· 5W” /09:917 (1987)及 Pulapura等人，乂〜⑽以〜叩"·叫η 23 (199〇)中者， 該等文獻各自以引用的方式併入本文中。該假_聚（胺基酸） 116852.doc 200803836 可單獨使用或與經典聚（胺基酸）和本發明之假-聚（胺基酸) 的混合物組合使用。 聚（胺基酸）於胺基酸替代範圍之下限可具有丨、2、3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、19、20、21、22、23、24、25或更多個麵胺酸、天冬 胺酸、絲胺酸、赂胺酸或甘胺酸殘基，該等殘基可經任一 自然生成、經修飾或本文所述不尋常胺基酸替代。 在本發明之其他態樣中，包含某些或全部這5種胺基酸 之聚（胺基酸）均聚物（例如，聚-麩胺酸、聚-天冬胺酸、聚_ 絲胺酸、聚-酪胺酸、聚-甘胺酸）或聚（胺基酸）共聚物於下 限處可分別具有約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約 6%、約 7%、約 8%、約 9%、約 10%、約 11%、约 12%、約 13%、約 14%、約 15%、約 16%、約 17%、約 18%、約 19%、約 20%、約 21%、約 22%、約 23%、約 24%至約 25% 之麩胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、酪胺酸或甘胺酸殘基（重 量％或殘基％)及/或該等胺基酸殘基可經任一自然生成、經 修飾或本文所述不尋常胺基酸替代。 諸如聚-麩胺酸、聚-天冬胺酸、聚-絲胺酸、聚-酪胺酸 或聚-甘胺酸等聚（胺基酸）均聚物可於胺基酸取代範圍之上 限處分別具有小於25%、小於26%、小於27%、小於28%、 小於29%、小於30%、小於31%、小於32%、小於33%、小 於34%、小於35%、小於36%、小於37%、小於38%、小於 39%、小於40%、小於41%、小於42%、小於43%、小於 44%、小於45%、小於46%、小於47%、小於48%、小於 116852.doc •12· 200803836 49%至小於約50%之麩胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、酪胺酸 或甘胺酸殘基（重量％或殘基％)，該等胺基酸殘基可經任 一自然生成、經修飾或本文所述不尋常胺基酸替代。較佳 地，大部分殘基包括麩胺酸及/或天冬胺酸及/或絲胺酸及/ 或酪胺酸及/或甘胺酸。 本發明之聚合物具有通常介於約1，〇〇〇道爾頓至小於 10,000,000道爾頓之間的分子量。在某些實施例中，本發 明之聚合物具有約10道爾頓至約5,000道爾頓之分子量， 包括此範圍内之所有整數值，包括（例如）1 〇〇、2〇〇、300、 500、1，〇〇〇、1，500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000 及4，5 0 0道爾頓且在某些其他實施例中，具有約6 〇 〇道爾 頓、約32,000道爾頓或約33,000道爾頓之分子量。 該等聚（胺基酸）聚合物可按照若干種標準技術（包括，化 學及重組方法）合成。舉例而言，可在2步反應中製備麩胺 酸均聚物，其中⑴使用光氣或一等效試劑（例如，雙光氣） 在自15 °C至70 °C之溫度下處理麩胺酸以形成N_羧酸酐 (NCA) ’及（ii)使用驗對該N-叛酸gf實施開環聚合以生成 聚-(麩胺酸）。適宜驗包括烧氧化物，例如，諸如甲醇鋼等 驗金屬烷氧化物、有機金屬化合物及一級、二級或三級胺 (例如，丁胺或三乙胺）。參見美國專利第5,47〇,51〇號。有 許多可用於化學合成聚（胺基酸）之其他方法。 本奄明之胺基酸聚合物可藉助（例如）經轉化大腸桿菌（五· 以重組方式製備。聚（麩胺酸）之能力有限的細菌性製 備闡述於（例如）歐轉專利第ΕΡ-Α_41〇,638號中。使用細菌 116852.doc -13- 200803836 實施重組反應時經常會應生成聚（1_麩胺酸），但已知細菌 會提供d-形式。 在某些實施例中，偶聯至該聚合物之抗癌藥物係紫杉 烷。紫杉烷類包括紫杉醇、多西他賽及其他具有紫杉烷骨 架之化學物質。參見Cortes等人，j· c/z>2. /3:2643— 2655 (1995)。紫杉烷化合物之實例及其製備方法陳述於美 國專利第4,942，184號中。 在車父佳實施例中，紫杉醇偶聯至聚_(1_麩胺酸）。本發明 之經偶聯藥物係多個紫杉烷骨架分子而未偶聯藥物（例 如’習用紫杉醇）係單一紫杉烷骨架分子。為了在經偶聯 藥物與未偶聯藥物之間提供至少一個有意義的對照，計算 經偶聯藥物中作為一個紫杉醇（即，未偶聯紫杉醇）等效體 之各紫杉烷骨架分子。在一實施例中，該藥物偶聯物 (即，聚麩胺酸紫杉醇偶聯物）係一多個紫杉烧骨架分子， 其化學名稱為具有(X-聚小麩胺酸2,之（2R，3S)_N_苯甲醯基_ 3-笨基-異絲胺酸），γ缓酸酯之5_β、2〇_環氧基、4,7_ β 1〇ββ、13-α_六•基-紫杉·11-烯酮4，10-二乙酸酯2_苯 甲酸ί旨13 -酉旨。 有用的聚麩胺酸紫杉醇偶聯物之實例包括聚麩胺酸紫杉 醇（paclitaxel p〇liglumex)(PPX ; united States Appr〇ved

Name (USAN) Council所採用之非專利名稱（商標名稱 Xyotax·))。PPX具有一介於約 35,〇〇〇至約 4〇,〇〇〇 Da但不 超過75,000 Da之平均MW，其中含有約35%至約37%(重量/ 重量（w/w))紫杉醇。 116852.doc -14- 200803836 在其他實施例中，該抗癌藥物或藥劑係喜樹鹼或其類似 物、衍生物或前藥。喜樹鹼（CPT)化合物包括各種20(s)_喜 树驗、20(S)-喜樹鹼之類似物及2〇(S)-喜樹驗之衍生物。 當用於本發明時，喜樹鹼包括植物鹼2〇(s>喜樹鹼（經取代 及未經取代喜樹鹼）及其類似物。喜樹鹼衍生物之實例包 括但不限於9-硝基-20(S)-喜樹鹼、9-胺基-2〇(S)-喜樹鹼、 9-曱基-喜樹驗、9-氯-喜樹鹼、9-氟-喜樹鹼、7-乙基-喜樹 驗、10-甲基喜樹鹼、10-氯-喜樹鹼、10_溴·喜樹鹼、1〇•氣_ 喜樹驗、9-甲氧基-喜樹鹼、U•氟-喜樹鹼、7_乙基-1〇_經 基喜樹鹼、10,11-亞曱基二氧基喜樹鹼及iOji —伸乙基二 氧基吾树驗及7_(4-甲基六氫吼唤基亞甲基）_ 1 〇, 1亞甲基 二氧基喜樹鹼。喜樹鹼之前藥包括但不限於如美國專利第 5,731，316號所述之經酯化喜樹驗衍生物，例如喜樹鹼2〇_ 〇·丙酸酯、喜樹鹼20-0-丁酸酯、喜樹鹼20-0-戊酸醋、喜 树驗20_〇_庚酸|旨、吾樹驗20-0 -壬酸g旨、喜樹驗2〇_〇_ 丁稀 酸酯、喜樹鹼20-〇-2，，3，·環氧基-丁酸酯、硝基喜樹驗2〇-0-乙酸酯、硝基喜樹鹼20-0-丙酸酯及硝基喜樹鹼2〇-〇_丁 酸酯。20(S)-喜樹鹼之具體實例包括9-硝基喜樹鹼、9_胺 基喜樹驗、10，11-亞甲基二氧基-20(S)-喜樹鹼、拓撲替康 (topotecan)、伊立替康（irinotecan)、7-乙基 _1〇_ 經基直樹 驗或在7、9、10、11或12位中的至少一個位置經取代之另 一經取代喜樹鹼。此等喜樹鹼視情況可經取代。 可對喜樹鹼支架實施取代，同時仍保持活性。在某些實 施例中，該喜樹鹼支架在7、9、10、:^及/或12位受到取 116852.doc -15- 200803836 代。此等取代可用於提供不同於未經取代喜樹鹼化合物之 活性。經取代喜樹鹼之實例包括9-硝基喜樹鹼、9-胺基喜 樹鹼、10，11-亞甲基二氧基-20(S)-喜樹鹼、拓撲替康、伊 立替康、7-乙基-10 -經基喜樹驗或在7、9、10、11或12位 中的至少一個位置經取代之另一經取代喜樹鹼。 天然未經取代喜樹驗可藉由純化天然提取物獲得或可自 Stehlin Foundation for Cancer Research (Houston，Tx)獲 得。 經取代喜樹鹼可使用文獻中已知方法獲得或可自商業供 應商獲得。舉例而言’ 9·石肖基喜樹驗可自SuperGen公司 (San Ramon，CA)獲得且9-胺基喜樹驗可自Idee Pharmaceuticals (San Diego，CA)獲得。喜樹鹼及各種類似 物亦可自標準精細化學品供應室（例如，Sigma Chemicals (St. Louis，MO))獲得。 除紫杉烷及喜樹鹼以外，可用於本發明之組合物及方法 之其他抗癌藥物包括依託西蔔（etopside)、替尼泊苷 (teniposide)、氟達拉濱（fludarabine)、多柔比星 (doxorubicin)、道諾黴素（daunomycin)、大黃素（emodin)、 5-氟尿嘧啶、FUDR、雌二醇、喜樹鹼、·視黃酸、維拉帕 米（verapamil)、埃坡黴素（epothilones)及環孢素 (cyclosporin)。更通常地，可使用具有可提供偶聯位點之 游離經基的抗癌藥物。 本發明涉及使用單一聚合物以及兩種或多種不同聚合 物。不同聚合物包括（例如）具有不同長度之類似聚合物以 116852.doc -16- 200803836 及實質不同聚合物。本發明包括使用偶聯至單一聚合物之 藥物及偶聯至多種不同聚合物之藥物。類似地，本發明包 括使用各自偶聯至同類別聚合物之兩種或多種藥物以及各 自偶聯至不同類別聚合物之兩種或多種藥物之混合物。在 某些實施例中，兩種或多種不同藥物部分可偶聯至單一聚 合物。除施與藥物偶聯物及/或雌性素療法之外，本發明 亦包括施與其他抗癌藥（例如，卡鉑）。 該藥物與聚合物間之鍵結或缔結之性質並不十分重要。 舉例而言，經偶聯藥物-聚合物係藉由共價鍵相互作用而 締合可藉由電荷-電荷相互作用、Vander Wahl力及諸如此 類來實現。共價鍵可以合成方式產生或藉由基因融合以生 成重組聚合物-藥物融合蛋白。偶聯聚合物與藥物之示例 性方法闡述於（例如）美國專利第5,977，163號 '第6,262，1〇7 號和第6,441，〇25號及國際專利公開案第霄〇 99/499〇1號、 第 WO 97/33552號、第 W0 01/26693 號及第彻 〇1/7〇275號 中〇 該聚合物與該藥物可直接偶聯或締合或者藉由諸如連接 子或間隔子等二級分子偶聯或締合（參見（例如）wo 01/70275 ’其中所揭示技術可應用於任一藥物偶聯物，尤 其是聚胺基酸偶聯物）。較佳連接子包括彼等在環化反應 中對水解反應相對穩定者。示例性連接子包括胺基酸、羥 基酸、二醇、胺基硫醇、羥基硫醇、胺基醇、卜丙胺酸、 乙二醇及其組合。另外’該藥物在進行偶聯之前可能需要 修飾’例如引入新賴官能團、修飾預存在官能團或連接間 116852.doc -17- 200803836 隔子分子。 使用市售同種或異種雙官能團交聯化合物按照此項技術 中已知或可獲得之方法可達成化學偶合，例如彼等闡述於 (4列如)Hermanson， Bioconjugate Techniques, Academic Yyqss公司（1995)反 Wong，Chemistry of Protein Conjugation CRC Press(1991)中之方法0 用於連接聚合物與藥物或其他分子之方法的額外實例闡 述於 Hoffman 等人，价〇/. Chem. 370:575-582 (1989)； • Wiesmuller 等人，Faccke 7:29-33 (1989) ; Wiesmuller 等 ·% k，Int· J· Peptide Protein Res. 40:255-260 (1992)； Defourt 等人，iVoe· NatL Acad· Sci· 5P:3879-3883 (1992) ; Tohokuni等人，《/· Jw. C/zem· /7(5:395-396 (1994) ； Rachel, Chem. Common. 2087-2088 (1997) ί

Kamitakahara，Angew. Chem. Ed. 37:1524-1528 (1998) ;及 Dullenkopf 等人，所·价c· J· 5:2432-2438 (1999) 中。 _ 在某些實施例中，聚合物藉由化學結合偶聯至藥物’如 美國專利第5,977,163號所述。在此方法中’製備作為鈉鹽 之聚麩胺酸偶聯物，實施滲析以移除小分子量污染物及過 量鹽並隨後凍乾。其他化學結合方法闡述於WO 01/26693 * Α2中。按照此方法，聚麵胺酸聚合物藉由聚麩胺酸羧酸殘 基與一藥物官能團間之直接連接鍵或者藉由經由一或多個 雙官能團之間接連接鍵以共價方式鍵結至該藥物。其他方 法揭示於 March，Wv⑽如rj；，Wiley 116852.doc -18- 200803836

Interscience，第 4版（1992)中。 在一實施例中，聚麩胺酸載體係按照下列方法偶聯至藥 物： (a) 提供一經質子化形式之聚麩胺酸聚合物及用於與該 聚合物偶聯之藥物； (b) 在一惰性有機溶劑中以共價方式連接該藥物與$ 聚麩胺酸聚合物以形成聚麩胺酸-藥物偶聯物；

(c) 藉由添加過量體積之鹽水溶液自溶液中沉殿該聚麵 胺酸-藥物偶聯物；並 (d)收集作為經質子化固體之該偶聯物。 步驟（a)中經質子化形式之聚麩胺酸聚合物係藉由酸化含 有擬用作起始材料之聚麩胺酸鹽之溶液並將該鹽轉化成其 酸形式來獲得。在藉由離心分離該固體之後，用水洗務該 =獻隨後在偶聯至期望藥物⑻之前乾燥(較佳藉由束乾) 胺酸且較佳乾燥至—包含介於約2%至約21%間之 恒重：於約7%至約21%間之水或介於約7%與21%間之水的 言，—=崎技術一次或分批製備偶聯物。舉例而 後締合或偶聯者-者皆可藉由重組方法製備並隨 多肽可作為融合蛋;n(例如）聚合物及藥物之單一 項技術所& 1 t 造重組表現載體之方法為此 現重組多肽之方：各種有機體(例如，細菌及酵母菌)中表 偶聯至聚人弘 。之藥物數量可有所變化。於下限處，該藥 116852.doc •19- 200803836 物聚合物偶聯物可包含佔該偶聯物質量之約1%、約2〇/〇、 約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約 10%、約 11%、約 12%、約 13°/。、約 14%、約 15。/。、約 16%、 約 17%、約 18%、約 19%、約 20%、約 21%、約 22%、約 23%、約24%至約25% (w/w)的藥物。於上限處，該藥物_ 聚合物偶聯物可包含佔該偶聯物質量之約26%、約27%、 約 28%、約 29%、約 30%、約 31%、約 32%、約 33%、約 34%、约 35%、約 36%、約 37%、約 38%、約 39%、約 4〇% 至約5〇%或更多（w/w)的藥物。 類似地，每個聚合物分子所偶聯藥物分子之數量可有所 麦化。於下限處’該樂物·聚合物偶聯物可包含自約1、約 2、約3、約4、約5、約ό、約7、約8、約9、約1 〇、約11、 約12、約13、約14、約1 5、約16、約17、約1 8、約19至約 20或更多個藥物分子/聚合物分子。於上限處，該藥物-聚 合物偶聯物可包含自約21、約22、約23、約24、約25、約 26、約27、約28、約29、约30、約31、約32、約33、約 34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約 42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約 50、約51、約52、約53、約54、約55、約56、約57、約 58、約59、約60、約61、約62、約63、約64、約65、約 66、約 67、約68、約69、約70、約71、約72、約73、約74 至約75或更多個藥物分子/聚合物分子。 一聚合物可與藥物分子上之一或多個獨立或重疊位點締 合。相反’在某些實施例中’藥物分子可與聚合物上之一 116852.doc -20- 200803836 =個獨立紙缔合。因此’在某些實施例中，本發明之 、、且σ物包括藉由藥物上不同位點與該等藥物缔合之聚人物 以及藉由聚合物上不同位點與該聚合物締合之藥物。可使 用不同連接子經由不同位點直接締合，或者可使用單一連 • 接子，此視每個位點上所存在特定官能團而定。在某此實 ㈣中，本發明包括一種包含混合物之組合物，該混合二 係由一或多種聚合物與一或多種藥物藉由各藥物或聚合物 上之一或多個不同或重疊位點締合形成。 〃本發明之藥物偶聯物可藉由任—治療適宜之方式遞送或 施與。舉例而言’可非經腸或經口施與。在較佳實施例 中，可經靜脈内（i.V·)施與。 組合物包含該偶聯物及一醫藥上可接受之载劑。本文所 2醫藥上可接受之載劑包括溶劑（例如，經緩衝之水介 質）、分散介質、塗佈劑、抗菌劑及抗真菌劑、等渗劑^ 如’葡萄糖）及諸如此類。含有適用於經靜脈使用之偶聯 • 2的醫藥組合物包括無菌水溶液或分散液以及隨後可在水 溶液中重構之無菌粉末。該載劑可為一溶劑或含有（例如） :乙醇、多兀醇、該等之適宜混合物及植物油之分散介 二卞。適宜注射用溶液可藉由將.適當數量之偶聯物併入適當 /合刈中，視情況與上述各種其他成份混合來製備。可藉由 過濾滅菌溶液。分散液可藉由將偶聯物併入含有分散^質 盔1 k自彼等上述者之其他成份的無菌媒劑中來製備。 Ί泰末可藉由真空乾燥及;東乾技術，生成該偶聯物與來 /、預先經無菌過濾溶液之任何額外期望成份的粉末來製 116852.doc -21- 200803836 備。 可以適當劑量、適宜療程及頻率遞送或施與醫藥組合 、、，。通常根據諸如患者狀況、患者疾病之類別及嚴重性、 ^性成份之特定形式及施與方法㈣素確定施藥劑量及療 程。可設計適當的劑量及治療方案以達成治療益處（例 力’經改良臨床結果，如更經常的完全或部分好轉或者更 :的：疾病狀恶及’或os)。不同範圍之劑量及投藥方案的 貝例提供於美國專利第5,67G，537號（揭示紅豆杉醇之劑量 及施藥方案）中。 、本^月之某些實施例中，需要此治療之患者藉助雙週 或了他L床上有用的方案以常用於所涉及特定偶聯物之劑 量含量接受諸如PPX等藥物偶聯物。為了提供具有多個紫 杉烧骨架之分子療法與其他具有單一紫杉烧骨架之分子療 法間的有意義對照，可將紫杉燒偶聯物之劑量表示為「紫 心醇等效物」。舉例而言，出於施藥目的，紫杉貌偶聯物 • I子中每個紫杉燒骨架作為-個紫杉醇等效物計算。該劑 量含量通常係介於約175至約250毫克/平方米（毫克/米2)紫 杉醇等效物之間。在較佳實施例中，每21天或約每3週1次 使用相當於約200至約250毫克/米2紫杉醇之量的ρρχ治療 患者。在最佳實施例中，每21天或約每3週〗次使用相當於 約175毫克/米2紫杉醇之量的ΡΡχ治療患者。在其他實施例 中，每21天使用相當於約250毫克/米2以上紫杉醇之量或者 每21天使用相當於約275毫克/米2以上紫杉醇之量的紫杉烷 偶聯物（例如，ΡΡΧ)治療患者。 116852.doc -22- 200803836 可靜脈注射任-適當時段，此可由—個—般技術者容易 地確定。舉例而言，可持續注射約1至約24小時，但更短 或更長的注射時間亦屬於本發明之範圍。 本發明之某些實施例涵蓋組合使用雌性素療法與該藥物 偶聯物。本文所用雌性素療法係指施與可升高患者之雌性 素含量或與非癌性組織相比可導致癌性組織（例如，肺臟） 中抗癌藥物之更高聚集的雌性素藥物。因此，本文所用 「雌性素」包括但不限於任一自然生成的哺乳動物雌性素 及其同類物，例如，雌二醇及其有機酯（例如，苯甲酸雌 二醇酯、環戊丙酸雌二醇酯及戊酸雌二醇酯）、雌酮、二 乙基己烯雌酚、哌嗪硫酸雌酮、乙炔雌二醇、炔雌醇曱 醚、聚磷酸雌二醇、雌三醇、半琥珀酸雌三醇酯、炔雌 醚、雌酮硫酸哌嗪、松雌醚（pinestrol)、雌酮硫酸鉀及替 勃龍（tibolone)、雌性素代謝產物（例如，ι7·ρ_雌二醇）、雌 性素類似物、具有雌性素活性之天然化合物（例如，諸如 吉尼斯旦（genestein)或異黃酮等植物雌性素）、雌性素激動 劑（例如，具有某些激動劑（例如，他莫昔芬（tam〇xifen))活 性之選擇性雌性素受體調節劑）及其他能夠與細胞表面雌 性素受體相互作用之物質。此等雌性素及雌性素藥物可為 天然的或合成的。 雌性素或雌性素藥物可藉由任一可與哺乳動物生理學及 選擇遞送途徑相適合之方式調配。此等方法為此項技術所 “、、矣 U·S· PhcivTncicopeici Ndtional Fονιτινιΐci7*y，

United States Pharmacopeal Convention公司，第 530至 541 116852.doc -23- 200803836 頁（1990)。 雌性素療法可藉由任一適宜途徑（例如，外敷、經口、 經全身、經靜脈内、經肌肉内、經黏膜或經皮（例如，貼 片））施與。此雌性素療法可有規律（例如，每日一次/每週 -人）地轭與且其相對於藥物-偶聯物療法可以間斷或實質 連續方式施與。典型劑量範圍取決於該化合物及患者之特 欲。雌性素之日劑1通常係基於當使用雌性素或其代謝產

物時將血清或血漿雌性素含量維持在等於或大於30皮克/ 毫升所需既定製劑之量。 治」療方案包括但不限於激素替代療法，例如每日施與 0.3毫克/1.5毫克、〇.45毫克/15毫克、〇 625毫克/2 5毫克 或0.625毫克/5.G毫克之雌性素/黃_療法。在另—實施例 中，療法可包括每日丨次或2次施與〇 15毫克、〇3毫克、 〇.625毫克或W毫克之雌性素療法。在較佳實施例中，療 法括每日3 -人細與1G宅克雌性素。雌性素之實例係 〜⑽如⑧（Wyeth Pharmaeeutieals公司，pA)。在某些實施 例中’該雌性素/黃體酮組合係藉由施與。⑧州说

Pharmaceuticals公司，PA)來完成。交替療法包括每日以 10毫克劑4/次之方式分多次施與20至40毫克或者每日以 單一劑量之方式施與20毫克他莫昔芬。 本發明之方法並不需要耝士 ^ 要精由相同途徑或甚至在相同時間 遞送該組合療法之每—組份。“，在本發明之某些實施 例中，可在相同時間藉由柏回 相门施與途徑給予該藥物偶聯物 及雌性素療法。在更佳實施例中，該雌性素療法可經皮 I16852.doc -24- 200803836 (例如，藉由貼片）或經口（例如，曰片劑、膠囊或藥九）施 與以便在整個藥物偶聯物治療過程中係實質連續的。 本發明亦係關於一種根據血清或灰漿雌性素含量選擇 (selecting或choosing)癌症治療之方法。具有更年期前雌性 素含畺之患者更有可能對使用抗癌藥物（例如，PPX)偶聯 形式之治療產生有利地響應，而可使用PPX或諸如未偶聯 紫杉醇之另一癌症療法來治療彼等具有較低（例如，絕經 後）雌性素含量之患者（參見實例1及2,尤其是圖3及4)。 用於選擇癌症治療之方法具體包括量測自癌症患者獲得 血樣之血清或血漿中雌性素含量並根據該雌性素含量選擇 一種治療。更年期前雌性素含量與包括施與PPX之癌症治 療相關。更年期後雌性素含量與可包括施與ρρχ或紫杉醇 之癌症治療相關。該方法尤其可用於具有雌性素受體之癌 症，如上文所述，該癌症包括任一種特徵為存在具有雌性 素受體之癌細胞的癌症或者可在含有具有雌性素受體之正 常（未患疾病）細胞的器官或組織中發生之癌症，其中該雌 性素受體可經瞬時表現及/或具有雌性素受體之Z胞^示 全部細胞數量之一部分。 為了全面闡明本發明及其優點，給出下列具體實例，應 理解：該等實例僅欲說明本發明而非以任—方式對其加以 限制。 實例1 只紫杉 例1中所提供實驗及結 醇治療間之關系，如藉 果闡明雌性素含量與ct_2103/ 由整體存活率（OS)所量測。圖 U6852.doc -25- 200803836 1及2中所繪示數據係源自多國III期開放式研究。首先，將 400名患有NSCLC之患者隨機等分到2個治療組之1組中： 第1組（CT-2103即，PPX)中199名患者接受210毫克/米2劑量 之PPX以及卡鉑（AUC 6);第2組（未偶聯紫杉醇）中2〇1名患 者接受225毫克/米2劑量之未偶聯紫杉醇以及卡鉑（Auc 6)。隨機分組旨在最小化2個治療組間之不平衡。在選擇 用於研究之患者後，按照疾病發展階段（IV對其他）、性 別、地理位置（美國對西歐及加拿大對世界其他國家）及腦 轉移瘤之歷史（有對無）對該等患者進行分組。 自初始試樣組，分析由高或低雌性素婦女組成的小組。 研究來自第1組之29名高雌性素婦女及丨5名低雌性素婦女 並研究來自弟2組之25名高雌性素婦女及17名低雌性素婦 女。藉由競爭性免疫測試（例如，DPC IMMULITE 2000分 析儀，NY ; DPC IMMIJLITE分析儀，愛爾蘭）測定婦女之 雌性素含量比較第1組與第2組之低雌性素小組（圖1)以及第 1組與第2組之局雌性素小組（圖2)。 納入標準係由下列組成： 1.以組織學或細胞學方式確診nSClc ; 2 ·滿足一個下列疾病狀態標準 a ·先前、經受輻射及/或外科手術治療之局部重大疾 病或復發性疾病， b·不為綜合療法之候選者的ΠΙΒ期患者，或 c·具有IV期疾病之患者； 3. ECOG效能得分為2 ;及 116852.doc -26- 200803836 4·適當的骨髓、腎臟及肝臟功能。此外，具有已知腦 轉移瘤之患者必須已接受標準抗腫瘤治療（不為全身性 化療與輻射之組合）·，患者必須自療法完全恢復並在隨 機化之前展示穩定的神經功能達2週。 在各21天循環（總共有6個循環）的第丨天，患者藉由靜脈 注射接受CT-2103/卡鉑或紫杉醇/卡鉑。評定每位患者就診 時之毒性。在研究時期之前或期間評定血液學、臨床化學 及凝結參數。按照實體腫瘤響應標準（RECIST)評定腫瘤負 荷；藉由功能評價癌症療法-肺癌得分（FACT_LCS)來量測 疾病相關性症狀並以規定間隔評定計算機化斷層顯象（CT) 掃描。患者退出有以下幾種情況：疾病發展，難以忍受毒 性’患者贊同退出，或研究者決定使患者退出。在完成最 終研究治療後，實施治療結束時鑒定22_26天；在治療結 束時就診後，亦需每隔8週接觸患者以獲得額外存活及疾 病狀態資訊。由獨立的數據檢測委員會（DMC)監控此研究 之效能及安全性結果。 藉由按照RECIST評定腫瘤負荷來測定該等治療之效 能。此外，在基線及各偶數循環之第3週實施CT掃描。藉 由在每次治療研究前之3天内功能評價癌症療法_肺癌得分 (FACT-LCS)來量測疾病相關性症狀。 實施對數級序統計學分析以比較第1組與第2組之高雌性 素婦女以及第1組與第2組之低雌性素婦女。 源自以上研究之結果表明：診斷為NSCLC並經CT-2103 + 卡鉑或1杉醇+卡鉑（圖〇治療之更年期後（即，低雌性素） 116852.doc -27- 200803836 婦女的os在統計學上無明顯不同。與此完全相反，與紫杉 醇+卡鉑相比，當施與患有NSCLC(即，高雌性素）之青春 期後更年期前婦女CT-2103 +卡顧時，存活率在統計學I出 現明顯升咼（圖2)。若使用小試樣尺寸，則圖2中所繪示研 究結果之統计學上的明顯不同甚至會更令人感到吃驚。 此等結果表明：診斷為NSCLC並具有更年期前雌性素含 量之婦女會受益於包括CT-2103 (即，PPX)之癌症治療， 而可使用CT-2103或紫杉醇來治療具有更年期後雌性素含 量之婦女。 實例2 實例2中所提供實驗及結果闡明雌性素含量、性別與 PPX對紫杉醇治療間之關系’如藉由整體存活率（os)所量 測。實施總共有781名患有NSCLC並具有較弱體力狀態 (PS2)之患者參與的兩個III期研究。在一個研究（STELLAR 3)中，將患者分成2個治療小組，實驗組接受ρρχ(21〇毫克/ 米2+卡鉑AUC 6，每3週）且對照組接受紫杉醇（225毫克/米2+ 卡翻AUC 6’每3週）。在另一研究（STELLAR 4)中，實驗 組接受PPX( 1 75宅克/米2 ’每3週）且對照組接受吉西他濱 (gemcitabine)(l〇〇〇毫克/米2，在第1、8及15天時，每4週） 或長春瑞濱（vinorelbine)(30毫克/米2，在第ι、8及15天 時’每3週）。為了研究性別及雌性素對各治療小組之存活 的影響，組合來自兩個III期臨床試驗之結果並實施複合分 析。 性別對存活率結果之影響的結果示於下表1中。此等結 116852.doc -28- 200803836 果表明：與對照組中女性相比，經ρρχ治療之女性在統計 學上有更大數量能夠存活！年。另一方面，ρρχ組中男性 與對照組中男性相比在i年存活方面沒有此差別。 表1

1-YR 40% 25% 26% 3 0% HR 0.70 1.05

為了評定雌性素對經吧治療婦女之存活的影響，回顧 分析更年期狀態下之該等數據。按照年齡及當可獲得時治 療前雌二醇含量劃分功能更年期狀態。此研究係來自兩個 臨床研究之結果的複合。在55歲以下的婦女中，與對照組 中彼等患者相比’接受PPX之患者的os受収長（圖在 55歲以上的婦女中，兩個治療小組間的〇s係類似的(圖 在STELLAR 3中，可獲得某些婦女之雌性素含量。盘對 照相比，當使紐X治療時，具有更年期前雖性素含量之 婦女展現改良結果（圖5)。相反，在具有更年期後雌性素含 董之患者中，治療群組未展現對存活率之明顯影⑸數據 116852.doc -29- 200803836 未示出）。 實例3 實例3中所提供實驗及結果闡述藉助其可將ρρχ帶入細 胞中之機制。在體外研究兩種自美國典型菌種保藏中心

(ATCC)獲得的細胞系（NCI-H460人類肺癌瘤（Η460 ; ATCC HTB-m)及RAW 264·7小鼠單核細胞/巨噬細胞（RAW ; ATCC TIB-71))中PPX之細胞吸收，該等細胞係經培養並獨 立地使用PPX處理。 在一組貫驗中’利用放射性標記ρρχ量測ρρχ吸收，該 放射性標記PPX按照下列製備：藉由使聚_L麩胺酸標準製 劑與在2-苯甲醯基環中經14c均勻標記之紫杉醇偶聯來製備 放射性標記 PPX(14C-PPX; Sigma-Aldrich，1.762 微居裏 (μ(：ι)/毫克特異活性）。使用〇 〇1-1〇 MC-ppx將細胞處 理2分鐘或3-4小時。隨後藉由閃爍計數量化介質中放射 性。在乙酸乙酯中提取所收穫細胞並計數上方有機相（含 有未偶聯紫杉醇及低分子量代謝產物[即，單麩醯基及二 麩醯基紫杉醇])及下方水性相（含有麩醯基—紫杉醇代謝產 物及完整PPX)。 為了研究PPX分佈，使用1 μΜ或10 μΜ放射性標記PPX (14C-PPX)處理raw細胞。在2分鐘、及第3或第4個小時 時’提取試樣。按照上文所述量化放射性。來自3個試樣 之結果表示為衰變/分鐘（DPM)士標準偏差。 下表2中所示結果表明··經1〇 μΜ 14C-PPX治療3小時之 細胞中完整PPX在統計學上明顯增加（p<0.001)。 116852.doc -30 - 200803836 表2 [14C-PPX] ΙμΜ 10 μΜ 培育時間 2分鐘 4小時 2分鐘 3小時 試樣 DPM+/—標準偏差，Ν=3(%對照)_ 起始介質 25298914366 252989±4366 2490999116716 2490999116716 196±11 1980+197 454土66 2554±90 水性細胞層提取物 (0.077%) (0.783%) (0.018%) (0.103) 323±360 693+410 207±29 275+50 有機細胞層提取物 (0.128%) (0.273) (0.008%) (0.011%)

在另一實驗中，使用14C_PPX將2組RAW或Η460細胞處 理2分鐘或3小時。另外使用具有能量依賴性胞呑作用之抑 制劑（20 μΜ細胞鬆弛素D {Cyto D，EMD Biosciences}或 1 μΜ 苯基氧化胂{POA，Sigma})處理其中1個組。按照上文所述 量化放射性。藉由自在經乙酸乙酯提取細胞層區室水性相 中培育3小時之DPM減去培育2分鐘之DPM來計算DPM。 下表3中所示結果表明：經具有胞吞作用抑制劑預治療 之細胞可導致14C-PPX在統計學上明顯下降，如在水性相 中所測得（完整PPX)。 表3 [14C-PPX] ΙμΜ 10 μΜ +/—抑制劑 - + - + 抑制劑/細胞類別_DPMS+/—標準偏差，N=3__

CytoD/RAW 細胞 1784±197 808±106 21001112 1318±57 PAO/H460細胞 73±15 54土 6 217±6 128±11 DPM係藉由自在經乙酸乙酯提取細胞層部分水性相中培育3小時之DPM減去培育2分 鐘之DPM來計算 116852.doc -31 - 200803836 來自14C-PPX吸收研究之結果表明：完整ρρχ係藉由能 量依賴性胞吞作用以劑量依賴性及時間依賴性方式被吸收 於RAW培養巨嗤細胞及Η460腫瘤細胞之細胞區室中。

在另一組實驗中，藉由間接免疫螢光法研究PPX吸收。 按照下列製備一抗-PPX單株抗體（MAb):藉由二異丙基碳 二亞胺反應偶聯惡性瘧原蟲〇P. 肽（GGG GGA GLL GNV STV LLG GV; Genemed Synthesis 公司）與 PPX (CTI ;編號1116-91)以致使PPX分子具有免疫原性。惡性 癔原蟲肽-PPX抗原用於藉由專有Rapid Prime®免疫步驟 (ImmunoPrecise Antibodies Ltd.)生成 MAb。使用具有經固 定惡性癔原蟲肽-PPX抗原的固相ELISA選擇陽性雜交瘤純 系。藉由對BALB/c小鼠實施腹膜腔内（i.p.)注射來擴展一 種雜交瘤純系，CT-2D5。藉由Protein G屠析法自腹水純化 CT-2D5。藉由固相ELISA方法評定鍵結親和力。使用 Instant ChekTM-ISOTYPE套組（EY Laboratories Ltd·)測得 MAb同種型為IgG-2b。藉助競爭ELISA方法繪製CT-2D5之 鍵結抗原決定部位。 在使用10 nM至10 Μ PPX將彙集細胞層培育4小時後， 隨後固定該等細胞並藉由下列方法進行螢光免疫檢驗：使 用CT-2D5、1 °抗體（Ab)及經AlexaFluor488標記之ii羊抗· 小鼠 F(ab’)2 2° Ab (Molecular Probes)的 1:5000稀釋液沾染 固定細胞。使用Nikon Diapljot螢光顯微鏡及Cool Snap HQ 照相機獲得圖像。利用Metamorph圖像處理軟件 (Metamorph v.6.2 r6)來處理並儲存該等圖像。 116852.doc -32- 200803836 按照所述處理RAW細胞層且隨後用抗-早期内體抗原-1 Ab (EEA-1，Santa Cruz Biotechnology)共沾染之。按照所 述處理H460細胞層。使用Hoechst核染劑及抗-(χ·微管蛋白 Ab共沾染另一組H460細胞層。 · 來自間接免疫螢光研究之結果表明：PPX免疫沾染與内 體標記共同定位（數據未示出）。核内體與溶酶體融合，使 PPX暴露於可分解代謝該藥物之溶酶體酵素（主要為細胞自 溶酵素B)。 實例4 實例4中所提供實驗及結果闡述PPX之體内運輸。因 此，需研究患有腫瘤並經PPX治療之雌性裸鼠中的PPX分 佈。在雌性裸鼠左橫腹部經皮下（s.c·)植入H460人類腫瘤 片段。當該腫瘤體積達到100-150毫米3大小時，使用單一 ί·ν·劑量之ρρχ(90毫克/公斤作為PTX等效物）治療小鼠。在 治療後24小時對小鼠實施無痛致死術。採集肺臟、肝臟、 脾臟及腫瘤試樣，固定於10%緩衝甲醛中並用石蠟包埋。 使用下列數種抗體沾染組織部分（4微米（μιη)) : CT-2D5(先 前闡述於實例3中）、CD45大鼠抗-小鼠（BD Pharmingen， Cat Nr : 55039，Clone:30-Fll)、F4/80大鼠抗-小鼠（Novus Biologicais，Cat NB 600-404 Clone CI:A3-)、MHCII (HLA) 小鼠抗-人類單株Ab HLA-DR a-鏈（Dako Cytomation，Clone TAL.1B5, REF: M 0746, LOT: 00006515)、溶菌酶多株兔子 抗-人類（Dako Cytomation，EC 3·2·1·17, Code A 0099)及髓 過氧化酶（MPO)多株兔子抗-人類（Dako Cytomation，Code 116852.doc -33- 200803836 NP082)。 使用Dako-ARK小鼠-對-小鼠套組實施CT-2D5沾染。使 用 Vectestain ABC-Alkaline-Phosphatase 套組實施 CD45 及 F4/80 沾染。使用 Vectestain ABC-Peroxidase 套組實施 MHCII、溶菌酶及MPO沾染。為了測定非特異性沾染，按 照下列製備陰性對照部分。在CT-2D5、CD45、F4/80及 MHCII免疫沾染期間，使用常用封閉血清作為一級Ab培育 陰性對照部分。在溶菌酶及MPO免疫沾染期間，使用不相 關兔子多株一級Ab培育陰性對照部分。 使用配備有數字相機之光學顯微鏡實施組織學檢查。顯 微鏡檢查以盲式實施。在隨意提增（自小至大）後，評價陽 性免疫反應之強度。藉由在隨機選取的10個域中計數高放 大率（400x)陽性細胞來實施IHC陽性率之半定量評價。捕 獲經放大ΙΟΟχ之代表域以闡明組織中陽性分佈。 在使用PPX治療後24小時，在網狀内皮系統之有機體中 發現強細胞質内沾染；在肝臟中，具有與Kupffex細胞兼容 之形態的約20個細胞/域（cpf)係強陽性的；肝細胞顯現陰 性；在脾臟中，具有巨噬細胞形態之細胞係陽性〇10-15 cpf)而淋巴濾泡係陰性；在肺臟中，陽性細胞（<1 cpf)在形 態學上與II型肺細胞兼容。 在腫瘤組織中，在腫瘤囊中發現強細胞質内沾染（=2 cpf);陽性細胞之形態係與浸潤性巨噬細胞之形態一致。 活細胞與壞死細胞間之邊緣藉由中等至強微粒體、細胞外 及偶然細胞内（細胞質内及細胞核内）沾染來表徵。此區域 116852.doc -34- 200803836 中、、且、我t構文壞死過程的嚴重影響，因此，不能夠藉由對 CT 2D5陽欧細胞進行形態分析來實施可靠的鑒定。 在脾臟中’紅髓中幾乎每個細胞對CD45皆顯示強細胞 貝内陽性且亦在白髓中發現輕度至中等的陽性；在少量細 胞之紅髓中發現F4/8〇受到中等細胞質内沾染卜1〇_15 cPf)。在肝臟中，發現CD45AF4/8〇受到輕度至中等細胞 貝内沾染卜20 cPf)。在肺臟中，發現CD45受到中等至強烈 細胞貝内沾染（二2_5 cpf);在少數細胞中發現f4/8〇受到輕 度細胞質内沾染（<1 cpf)。肝臟、脾臟及肺臟中F4/8〇陽性 細胞之形態學及分佈圖案係與相同組織中CT-2D5陽性細胞 之形態學及分佈圖案一致。 在腫瘤中，發現腫瘤囊中CD45及F4/80受到強烈細胞質 内沾染（分別為二6 cpf及4 cpf)。極少CD45及以/肋陽性細胞 位於活腫瘤組織中。活細胞與壞死細胞間之邊緣藉由 CD45之中專至強細胞外微粒體沾染及偶然細胞内沾染來 表徵。此等細胞之形態係與核分葉-核破裂粒細胞之形態 一致。壞死區域之特徵係對CD45之明顯陽性。周邊壞死 區域及壞死區域對F4/80呈現陰性。 MHCII特異性免疫反應p10 cpf)係位於腫瘤囊外部。在 腫瘤之有生存力部分中發現了極少（^1 epf)散落陽性細 胞。免疫反應性細胞之形態學分析表明源自組織細胞。在 壞死區域中未發現陽性沾染。 溶菌酶陽性免疫反應係位於腫瘤囊之外部〇 cpf)。在 腫瘤之壞死區域中發現強陽性沾染（細微粒體碎片 116852.doc -35- 200803836 在腫瘤壞死區域中發現在形態學上與核分葉-核破裂粒 細胞一致的大量MPO免疫反應性細胞。 此研究之結果證實：在注射後24小時，可測定不同有機 體及腫瘤組織中的PPX吸收及聚集。 、 藉由協同定位CD45(常見白細胞抗原）與F4/80(特異性鼠 類巨噬細胞抗原）-信號證實之形態評價表明：CT-2D5陽性 細胞皆源自肝臟、脾臟、肺臟及腫瘤囊中之髓-組織細 胞。此等證明：PPX在網狀内皮系統中大部分被組織相關 • 性巨噬細胞吸收，而不會顯著分佈於肝細胞、肺臟中肺泡 襯細胞或脾臟之白髓中。 有限數量之活細胞使周邊壞死及壞死區域中CT-2D5陽性 之評定變得複雜。然而，CD45、MPO及溶菌酶陽性及形 態學測試表明：此等腫瘤區域中PPX聚集係與多形核 (PMN)白細胞滲透相關且細胞内PPX係歸因於其於此區域 中之呑嗟活性。

_ 此腫瘤模型中心部分因缺乏巨噬細胞聚集而無法對PPX 與腫瘤相關巨噬細胞（ΤΑΜ)間之潛在相互作用實施評定， 此潛在相互作用係作為腫瘤内ΡΡΧ新陳代謝之潛在重要根 源以及高濃度及延長濃度細胞内游離紫杉醇ΡΡΧ對ΤΑΜ功 能之潛在影響。 Λ Η460腫瘤異種移植腫瘤組織之外周壞死區域中所檢測得 ΡΡΧ聚集可與藉由腫瘤脈管系統之增強滲透性及滯留 (EPR)效應形成的ΡΡΧ分佈增強兼容。 Η460異種移植腫瘤囊中高含量ΡΡΧ之存在係與先前生物 116852.doc -36- 200803836 分佈研究一致並證實了 PPX之優先腫瘤聚集。 觀測到PPX之細胞内定位主要在吞噬細胞即組織相關性 巨喔細胞（肝、脾）或腫瘤滲透巨噬細胞内。 在腫瘤組織中，細胞内及細胞外ppx與溶酶體活性標記 共同定位。 同日寸’此#觀測結果係與其中PPX優先在腫瘤組織中聚 集繼而藉由具有蛋白酶解活性之溶酶體酵素釋放紫杉醇的 模型一致。 實例5 實施一研究以檢查人類腫瘤異種移植中雌性素對細胞自 溶酵素B及PPX活性之影響。為研究此效應，將HT-29人類 結腸直腸癌（CRC)及H460人類非小細胞型肺癌（NSLCL)(二 者皆來自ATCC)細胞經皮下植入雌性CD nu/nu小鼠中。在 第0天時經皮下植入安慰劑或〇·17毫克/60天、0.36毫克/60 天、〇·72毫克/60天之17β雌二醇（Ε2)控制釋放顆粒（IRA)並 在5天後植入人類腫瘤片段。在顆粒植入後第5、21、28及 35天時，採集血液及腫瘤（5隻小鼠/時間點）。 藉由下列方法分析雌性素治療對ΡΡΧ及紫杉醇抗腫瘤活 性對ΗΤ-29人類CRC異種移植腫瘤模型之影響：當腫瘤係 120-150毫克（即，晚期腫瘤）時，向腫瘤及對照（Ρ)或具有 Ε2顆粒之小鼠施與PPX (i.v./qdl 90毫克/公斤（kg) ΡΤΧ等效 物）及 PTX (i.v./qdl 90 毫克 / 公斤，Sigma Aldrich)。在樂物 治療後第1天（24小時）及第7天（168小時），採集腫瘤並將其 切開，隨後立即在液氮中迅速凍結。 116852.doc 37· 200803836 按照下列確定抗腫瘤活性參數： 1 ·腫瘤重量抑制％(TWI%)等於100減去（所治療TW除 以對照TW)乘以100，其在顆粒植入後第60天時評定。 2·腫瘤生長延遲（TGD) : TGD等於所治療TG減去TG對 照，其中TG係腫瘤達到1克（g)重量所需平均時間（以天 計 3·藉由下式計算對數細胞死亡（LCK) : LCK等於（(TGD 1克）除以3·32)乘以DT，其中DT係對照小組及實驗小組 中腫瘤體積增倍所需時間（天）。 藉助單向ANOVA Bonferroni實驗後方法實施統計學分 析。 藉由RadioImmunoAssay套組（DiaSorin)測定雌性素血漿 含量。 藉由下列方法分析腫瘤組織中未偶聯及全部紫杉醇：在 適當地勻質化該等組織後，藉由使用甲基-第三丁基醚 (MTBE)進行液體/液體提取來確定未偶聯紫杉醇濃度。在 對PPX實施曱醇分解反應之後量測全部紫杉醇，繼而使用 MTBE提取所釋放紫杉醇。藉由在經選擇反應監控優化條 件下實施LC/MS/MS來分析經處理試樣中紫杉醇含量。 藉由RT-PCR測定ERa、ΕΙΙβ、E-鈣黏著蛋白及Id-2基因 表現，比較其RNA表現與GAPDH基因之RNA表現。藉由 Thermoscript RT-PCR System (INVITROGEN)反轉錄自腫 瘤提取之全部RNA。所生成cDNA用作具有對ERa及β、E_ 鈣黏著蛋白及Id-2具有專一性之引物的PCR模板。 116852.doc -38 - 200803836 按照下列實施西方點潰分析：藉由在RIPA缓衝液中勻質 化來提取蛋白質並藉由Bio-Rad Protein Assay確定其含 量。使用10% SDS-PAGE根據大小劃分各等份蛋白質並將 其轉移至硝基纖維素膜。使用下列實施免疫檢測：抗-ERa 多株 Ab (HC-20，Santa Cruz Biotechnologies)、抗-ERb 多株 Ab(06-629，Upstate Biotechnologies)、抗-α-Actin (Sigma) 及抗-a-微管蛋白（Santa CruzBiotechnologies) o 按照下列實施細胞自溶酵素B活性試驗：藉由以1毫升緩 衝液：100毫克組織之比例在細胞自溶酵素B缓衝液中勻質 化來提取蛋白質。該測試利用細胞自溶酵素B消化合成基 質Z-Arg-Arg-AMC之能力。在激發波長390奈米及發射波 長460奈米處以螢光量測方式測定所釋放AMC。依據AMC 標準曲線定量細胞自溶酵素B之活性。 藉由西方點潰分析證明人類腫瘤細胞系及HT-29和H460 人類異種移植腫瘤模型中之ERa及ΕΙΙβ表現（圖6)。 循環雌性素含量對腫瘤生長及細胞自溶酵素Β活性之影 響闡明於ΗΤ-29人類CRC異種移植腫瘤模型中。該等結果 表明：升高含量之雌性素（17β雌二醇）導致腫瘤重量及細胞 自溶酵素Β活性增加（圖7)。在Η460人類NSCLC異種移植腫 瘤模型中觀測到類似效應（圖8)。 藉由西方點潰圖來分析雌二醇對ΗΤ-29人類CRC及Η460 人類NSCLC中ΕΙΙβ表現之影響（分別為圖9及10)。 藉由RT-PCR分析雌二醇對ΗΤ-29人類CRC及Η460人類 NSCLC細胞中ΕΙΙβ活化之影響，其中Ε-鈣黏著蛋白基因（在 116852.doc -39- 200803836 HT-29細胞中）表現增強及Id-2基因（在H460細胞中）表現增 強表明ERp受到活化（分別為圖11及12)。 利用HT-29 CRC異種移植腫瘤模型闡明雌性素治療對 PPX新陳代謝之影響。結果展示於下表4中。（+(E2):補給 有0.72毫克17β雌二醇之患腫瘤小鼠；-(P):未經補給之雌 二醇之患腫瘤小鼠。數據來自3種腫瘤之匯總）。與當給予 1 未偶聯紫杉醇本身所達成彼等濃度相比時，當施與ΡΡΧ後 觀測到腫瘤中未偶聯紫杉醇之濃度升高。 • 表4 PPX iv.90毫克/公斤PTXeq. 紫杉醇 iv.90毫克/公斤 雌二醇治療 時間(小時） 總PTX 游離PTX PTX +(Ε2) 24 93300 11200 6810 -(Ρ) 24 114700 17900 7310 +(Ε2) 168 29230 8480 421 -CP) 168 94300 28100 nd 概言之，實例5中所示結果表明：雌性素介導之信號傳 導主要取決於ΕΙΙβ，Ε2補充劑引發的ERP活化及/或表現， 及細胞自溶酵素Β活性增強係與ΗΤ-29細胞中ΡΡΧ抗腫瘤活 性增強相關。 實例6 實例6中所提供實驗及結果闡述：在大鼠模型中，於存 在或不存在雌性素時，各組織中游離及全部紫杉醇。對於 此等研究，將大鼠分成3組：1)雄性組，2)經假手術（即， 完整）雌性組，及3)卵巢經切除之雌性組。對大鼠提供作為 116852.doc -40- 200803836 毛克/ A斤單一靜脈注射液之[14C]_CT2103(經[14c]標記 之偶聯紫杉醇，即，[14C]標記PPX)。 … 、=主射後各時間點，對每組中3只大鼠實施安樂致死術 、、’刀析各、、且織（即，肺、肝臟及骨髓）中未偶聯及全部紫杉 醇。 源自此研究之結果表明：經假手術之雌性大鼠的肺組織 中所聚集未偶聯㈣醇及全部㈣醇含㈣雄性切巢經 切除之雌性大鼠中之彼等含量明顯更高。相反，在雄性、 、、二假手術之雌性或即巢經切除之雌性大鼠之肝臟或骨髓中 藥物聚集沒有明顯不同(圖13)。總而言之，&等數據證 明·當存在雌性素時，肺組織中紫杉醇聚集含量明顯升 本況明書中所引用全部公開案（專利公開案及非專利公 開案)表示彼等熟習此項技術者對本發明相關内容之熟習 程度。全部此等公開案以引用方式併入本文中，其併入程 度如同每一個別公開案以指定的具體及個別方式併入本文 中一般。 雖然本文中已參照具體實施例對本發明進行了闊釋，但 應瞭解，該等實施例僅用於閣述本發明之原理及應用。因 而，應瞭解’可對《釋性實_進行許多修飾並可在不背 離隨附申請㈣_所界叙本發以旨及料的情況下 設計其他佈置。 【圖式簡單說明】 圖1係一表明使用經偶聯紫杉醇+卡鉑（CT_2 i 〇3+carb〇 116852.doc -41 - 200803836 (即，卡銘）；具有空心圓之實線）或未偶聯紫杉醇+卡鉑（紫 杉醇+Carbo(即，卡鉑）；具有空心方形之虛線）治療具有更 年期後（即，較低）血漿雌性素含量之婦女時的存活（以天 計）之線圖。 圖2係一表明使用經偶聯紫杉醇+卡鉑（CT_21〇3+Carbc (即，卡鉑）；具有空心圓之實線）或未偶聯紫杉醇+卡鉑（紫 杉醇+Carbo(即，卡鉑）；具有空心方形之虛線）治療具有更

年期前（即，較高）血漿雌性素含量之婦女時的存活（以天 計)之線圖。 圖3係一繪示經聚麩胺酸紫杉醇（ΡΡχ)治療之5 5歲以下婦 女及其對照之整體存活率（OS)的線圖。 圖4係一繪示經ΡΡΧ治療之55歲以上婦女及其對照之〇s 的線圖。 圖5係一繪示經PPX治療之更年期前婦女及其對照之〇s 的線圖。 圖6係一繪示在人類腫瘤細胞系及HT-29. H46〇腫瘤模 型中Era及ERp表現之西方點潰分析圖。 圖7係一組繪示在HT-29腫瘤模型中雌性素對腫瘤重量及 細胞自溶酵素B活性之影響的線圖。 圖8係一組繪示在H460腫瘤模型中雌性去m站— 1對腫瘤重量及 細胞自溶酵素B活性之影響的線圖。 圖9係一繪示在HT-29腫瘤模型中雌二醇對雌性素受體^ (ERP)表現之影響的西方點潰分析圖。 圖10係一緣示在H460腫瘤模型中雌二醇 奸對雌性素受體β 116852.doc -42- 200803836 表現之影響的西方點潰分析圖。· 圖11係一纷示對雌性素受體信號傳導路徑E _鈣黏著蛋白 下游基因實施RT-PCR分析的圖。 圖12係一緣示對雌性素受體信號傳導路徑下游基因（Id_ 2)實施RT-PCR分析的圖。 圖13係一組表明在雄性（A)、雌性（B)或卵巢經切除之雌 性大鼠（C)之肝臟、肺臟或骨髓中未偶聯或全部紫杉醇（以 奈克藥物/克組織計）含量之線圖；其中·· • (A)(具有空心方形之黑色實線）； (B) (具有空心方形之藍色實線）；及 (C) (具有空心方形之紅色實線）。

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Claims (1)

1. 200803836 十、申請專利範圍： ι_ 一種癌症治療方法，其中該癌症之特徵係存在具有雌性 素受體之癌細胞，或者其中該癌症係在含有具有雌性素 受體之細胞的組織或器官中發生，該方法包括鑒定具有 更年期前雌性素含量之癌症患者或具有更年期後雌性素 含量之患者並向該患者施與包含偶聯至抗癌藥物之聚（胺 基酸）聚合物的偶聯物，其中視情況向該具有更年期後雌 性素含量之患者施與雌性素療法。

   2·如凊求項1之方法，其中該患者被雲定為具有更年期前 雌性素含量。 月求項2之方法，其申該患者係具有至少約％皮克雌 性素/毫升企清或血漿之血清或血漿雌性素含量的女性。 4.如請求項2之方法’其中該女性係不足55歲。 其中該患者係正接受激素替代療法 5 ·如凊求項2之方法 之更年期後女性。

   6·如睛求項2之方法 之男性。 其中該患者係正接受激素替代療法 如請求項2之方法， 之男性。 其中該患者係正接受抗雄激素療法 月求項1之方法，其中該患者被馨 雌性素含昔曰甘山 又為具有更年期後 抗癌㈣治療包括向該患者施與包含偶聯至 /、之聚（胺基酸）聚合物的抗癌藥劑及雌性素療 9·如叫求項8之方法，其中該患者係男性。 116852.doc 200803836 10.如請求項8之方法，其中該患者係女性。 η·如請求項ig之方法，其中該女性係至少55歲。 12·^請求項1G之方法，其中該女性具有小於30皮克雌性素/ 窀升血清或血漿之雌性素含量。 13. 如《月求項1至12中任一項之方法，其中該聚（胺基酸）聚合 物係聚（麩胺酸）。 14. 如睛求項1至13 φ jv 中任一項之方法，其中該抗癌藥物係紫 杉烷。 15. 如請求項14之方法，其中該抗癌藥物係紫杉醇。 16_如：求項1至13中任一項之方法，其中該抗癌藥物係紫 杉醇且該聚合物包含聚（麩胺酸）。 如哨求項16之方法，其中該偶聯物包含。 18_如η月求項17之方法，其中該偶聯物係以約工乃至約⑽毫 克/米2紫杉醇等效物之量施與。 19·如任-上述請求項之方法，其中該偶聯物係經靜脈内遞 送。 如任上述睛求項之方法，其中該癌症係肺癌。 21·如請求項20之方法，其中該肺癌係非小細胞型肺癌症。 22· -種用於根據雌二醇含量選擇癌症治療方案之方法，豆 包括： ' s確疋癌症患者之血清或血漿雌性素含量係更年期前還 疋更年』後’其中更年期前雌性素含量表明使用偶聯至 :麩胺I之|杉醇進行治療會比使用未偶聯紫杉醇進行 、有效而其中低更年期後血清或血漿中雌性素 I16852.doc 200803836 含量表明使用偶聯至聚麩胺酸之紫杉醇進行治療將不比 使用未偶聯紫杉醇進行治療更加有效。

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