TW200406216A - Novel acid-and bile salt-resistant Lactobacillus isolates having the ability to lower and assimilate cholesterol - Google Patents

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五、發明說明（1 ) 發明之背景 1. 發明之技術領域 本發明係有關於具有耐膽鹽與耐胃酸特性且同時具有 降低血清膽固醇能力之新穎乳桿菌分離株及 其闬途。 2. 相關技藝的描述， * “乳酸菌（lactic acid bacteria)”為一群能發酵類並以乳 酸為主要產物·之細g，其目前廣為接受的形態與生理特徵 為：（1)革蘭氏陽性菌；（2)外形為球菌或桿菌；（3)過氧化 氫酶試驗（catalase test)為陰性；（4)從其所代謝的葡萄糖可， 生成50%以上之乳酸；（5)不形成内生性孢子；以及（6)多不 具運動性，可在微好氧情況下生長。 截至1980年眾所皆知的一般乳酸g包含乳桿菌屬 、鍵球菌屬、明串珠菌屬 、片球菌屬（Pe心ococcws)等 4 個菌屬（W.C. Frazier and D.C. Westhoff. 1978· Food Microbiology, 3rd ed. McGraw-Hill· Inc.· New York· USA)，而廣義的乳酸菌尚包 括雙歧桿茵屬（5///心與芽抱乳桿菌屬 (5>oro/acfo6ac///ws)這兩個菌屬。而近年來，微生物在分類 體系上已可依據DNA相似性（homology)和rDNA序列比對 分析而被明確獨立成為一個分類群組（taxonomic group)，益· 被賦予分類學上的位置。就申請人所知，截至1999年12 月，乳酸菌家族已擴增至包含16個菌屬以及223個物種。 經由人類或動物宿主的攝食後，可改善該人類或動物， 4 200406216 五、發明說明（2) 宿主的腸内微生物相平衡的單一或混合菌種是為所謂的益 生菌（probiotics)(<9 5w//iva/7 以 α/. (7992入 h 5W. Technol., 3:309-314; Fuller, R.f P.J. Heidt, V. Rush and D. van der Waaij. (eds.) (1995), Probiotics: prospects of use in opportunistic infections. Old Herborn University Seminar A^· S, pp」），其中最為人所熟知及使用的益生菌 是乳桿菌（Z^cioZ?acz7/w*s·)與雙歧桿菌。 自1908年Eli Metchnikoff提出「食用含乳桿菌之酸 乳，可以取代正常存在於腸内之產毒菌體，而不僅有益健 象 I說延年基壽 j (Eli Metchnikoff，1908，The Prologation Of Life，Ed. P. Chalmers Mitchell, G.P. Putnam’s Sons， The Preu，TorA: c& 的理論後，近年來 的研究及臨床試驗結果也顯示「乳桿菌與健康具有重要關 連性」。乳桿菌因此受到廣泛的重視。 乳酸菌不僅能在腸道複雜的生態系中佔有一席之地， 而且對宿主還有健康上的助益。乳酸菌已被發現的功效包 括增進宿主所攝食的食物之營養品質與促進維生素合成及 酵素 A t (J. Denter and B. Bisping，1994，Int· J. Food MicrMb/., 22:23-^7)、抑制腸道内致病菌的生長以及安定腸 道内正常菌相平衡（//we，//· wdSozzz·, Γ. <7外7人乂 C/zem· 丁echnol. And Biotech, 5 j :540-544)、1 ί 机德物質增加宿主 之也 ϋ 力（H. Majamaa ei al. (1995)，Journal of Pediatric Gastro-enterology and NuMtion, 20:333-338)以反降低大腸癌 之風險及抑制腫瘤（U. W a/., i9P7，jw. J. 67ζ·«· 200406216 五、發明說明（3) 胸心（5(5..575心52似）。同時，亦有研究顯示，服用經乳朴菌 發酵的乳品也可以降低血清膽固醇的含量。 心血管疾病被列為工業國豕人民之一主要死因在' 國，因心血管疾病而死亡的人數多於癌症及、其他疾病 ”

中有四分之三之死因係歸因於粥狀動脈硬化 (atherosclerosis)及其併發症，而南血清膽固醇疋^成 管疾病及粥狀動脈硬化的原因之一（尤仍加/以α/·

Ann· Intern· Med·，90:85-91; Pekkanen et aL (199〇)，NeW 以g/aWJ. Md., Π· /700-/707)。在台灣地區’近年來月包血 管及心臟疾病亦一直名列十大死因前茅，且更是老年人最 主要的病因與死因，因此，高膽固醇血症是一不容忽視的 病因。

1974年Mann及Spoerry發現，飲用經乳桿菌發酵後的 發酵乳（yogurt)可降低人體血清膽固醇濃度，而食用新鮮牛 奶則無影響（jm. j. C/h. A^r., 27:46心469, /974)。因此，近 年來人們對乳酸菌降低膽固醇的處理與功效進行了廣泛的 研究。 1982 年，K.K. Grunewald 於 J. of Food Science， #7··2〇7&中i導，當大鼠被餵食以含有經過嗜酸乳桿 菌發酵之10%發酵乳的食物歷時 4週後，其血清膽固醇濃度被顯著地下降。1989年， Danielson等人於67:9(5(5-974中報導，以經嗜酸 乳桿菌acz·心p/n7w5*) LA16分離株發酵的嗜酸 菌發酵乳（ac/Wop/^/w yogurt)來银食被給予高膽固醇飲食 6 200406216 五、發明說明（4) 之豬隻歷時56天後，會降低豬隻的血清膽固醇與低密度脂 蛋白（LDL)，而對血清三酸甘油脂與高密度脂蛋白（HDL) 則無效用。 上述有關嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus) LA16 •分離株的論文，是Dr· khem ML Shahani所領導的研究群組 所進行的有關嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus)的特 性與生物活性的多項研究之一。特別地，Dr. khem Μ. Shahani所領導的研究群組曾針對一人類來源的嗜酸乳桿 菌（Lactobacillus acidophilus) DDS-1 分離株的特性與生物 活性而進行相當多的研究，其中包括降低血清膽固醇位准 (serum cholesterol level)的研究，該DDS-1分離株後來有 獲得專利權保護（參見Nebraska Cultures, Inc.公開於網際 網 路上有 關 於 DDS-1™ 之 資 料 ， http://www.nebraskacultures.com.benefits.htmn ° 1997年，Akalin等人比較一般的發酵乳[由嗜熱鏈球菌 (Streptococcus Mermop/n’/ws)及德氏乳桿菌物種 〜.）發酵而來]與嗜酸菌發酵乳 [由嗜熱鏈球菌Mermop/n’/wi1)及嗜酸乳桿菌 (1(2以(9 6(^/7/1^(3(：心〇；7/^71^)發酵而來]對於老鼠血清膽固醇 之影響，而發現嗜酸菌發酵乳降低血清膽固醇濃度的能力 明顯要高於一般的發酵乳（儿& π以"997人J. Sci.t 80:2721-2725) 〇 \99?> 年 Smet 等 k於 British J. of Nutrition，79:185-194 中報導··緒隻在食用嗜酸乳桿菌 200406216

五、發明說明（5) 的第3至.7週内，糞便中膽鹽中的排出量有明顯增加，且 在第3至7週内，豬隻體内總血清膽固醇濃度也有明顯的 下降。因此，乳桿菌所具有的BSH之酵素活性，可能是造 成試驗豬隻的血清膽固醇降低的作用機制之一。

人體内的膽固醇可由肝臟自行合成，也可由動物性食 物中攝取。膽固醇的排泄作用途徑有二：（1)因肝臟的代謝 作用而形成膽酸（cholic acid)，繼而與甘胺酸（glyCine)或牛 磺酸（taurine)結合而可溶於水，再與鉀或鈉離子形成諸如甘 胺膽酸鹽（glycocholates)或牛續膽酸鹽（taurocholates)等之膽 鹽（bile salts)，此等鹽類可經由糞便被排出體外；以及（2) 形成類固醇激素（steroid hormone)，再因激素的代謝作用而 由尿中排出體外，但此途徑只佔小部分。 膽鹽是贍固醇代謝過程中的水溶性終產物物質，而這 些膽鹽可能進入至腸肝循環中，因為腸内菌[包括：乳桿菌 屬、腸球菌屬（五”/erococxws)、消化鍵球菌屬 (Peptostreptococcus)、雙故桿菌屬（Bifidobacterium)、梭菌屬 (C/o价和類細菌等]的膽鹽水化酶（bile salt hydrase，BSH，E.C.3.5.1.24)之酵素作用可使膽酸與甘胺酸或 牛石黃酸分開’而.產生去結合的膽鹽（deconjugated bile salts)。該等去結合的膽鹽不溶於水，且易與血清中膽固醇 形成共沈澱作用（co-precipitation)而被排出體外。 除上述之外，據報導，膽固醇的代謝機制尚有同化作 用（assimilation)及共沈殿作用（co-precipition)。 1985 年 ’ S.E. Gilliland 等人於 Appl· Environ· Microbiol， 200406216 五、發明說明（〇 49: 377-381 中報導，嗜酸乳桿菌μ/如p；2//Wiy) 對膽固醇有吸附及同化作用，且在0.3%牛膽汁（oxgall)的環 境下，乳桿菌降低膽固醇的能力較佳。同樣地，Noh等人 於J· Z)dr少Scz·· "997入S2·· 中報導，嗜酸乳桿菌 ac/Wop/z//w)的細胞膜可鍵結膽固醇，而被吸 附的膽固醇會進一步被同化代謝成細胞所需物質。 另一方面，F.A.M. Kalver 和 R. van der Meer 於 Environ. Microbiol (1993), 59: 1120-1124 中報導，乳桿菌 和雙歧桿菌對於膽固醇沒有 同化作用，而是在pH值低於6·0時，由於菌體對膽鹽的共 軛活性增加（此現象也可能和菌體所具有的BSH活性有 關），而使膽固醇與膽鹽形成共沉澱，從而降低了培養基中 的膽固醇含量。 1997 年，M.M. Brashears 和 S.E· Gililland 指出，在不控 制pH值的情況下（即正常pH值為4.5至5.5)，乳桿菌具有 良好的膽固醇共沈澱作用，而若控制pH值維持在6.0左 右，該菌降低膽固醇的能力明顯地減低（MM S.E. Gililland (1997), Influences of pH during growth on removal of cholesterol from MRS broth by Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus, Animal Science Research Report, pp.32-37; http://www.ansi.okstate.edU/research/l997n7006.htm、〇 1998年，張佳程與駱承庠以高脂乳、食用油脂來進行 試驗，而認為“同化作用”是乳酸菌得以降低膽固醇之主要 作用。（張佳程與駱承庠（1998)，“乳酸菌對食品中膽固醇脫 200406216 五、發明說明（7) 除作用的研究”乳酸菌菌種（株）的筛選，”食品科學（中國）， 19:20-22)。 ’ 9 年 Usman 及 H〇s〇no 於 J· /)心少如·， 中報導，-種新發現的乳桿菌物種Ζα⑽叫—·在 無膽鹽的培養條件下可吸收膽固醇。

以生物方法來降低人體血清膽固醇含量是一種比較經 、且有放的方式。而由以上文獻資料可知，乳酸菌在活體 内㈤Wvo)和活體外w w叫均可能展現出有效的降低膽固 醇效用，其中可能之作用機制包括了膽鹽水解酶之去結合 作用、膽固醇與去結合的膽鹽於酸性pH值下所產生共同 沉澱作用以及乳酸菌細胞對膽固醇的同化作用。

但礼酸菌在被攝入人.體後，會面臨人腸胃環境壓力以 及對腸道吸附性之專-性，因此，乳酸菌要在腸道中發揮 功效，首先就必須要能克服消化道的惡劣環境，並能夠定 殖（colonization)於腸道。再者，嗜酸乳桿菌是一群營養要 求複雜的菌種，除在發酵乳品中較穩定外，其餘市售的各 種以乾燥菌粉或其他加工型態（粉末狀、粒狀及錠狀）所製 成之產品，菌體經長時間於室溫或冷藏儲存下皆存活不 易，而造成菌數木易維持在起始儲存的數目，因此，市售 非發酵乳品的產品内所含實際菌數，往往不及其包裝上所 私不的菌數。是以，在乳酸菌產品之產製上，在銷售及儲 存過程中如何維持乳酸菌的菌數，是一極為重要的課題。 而具有耐酸、耐膽鹽及良好降低血清膽固醇能力等特性之 菌株的筛選，是開發優良乳桿菌產品之一重要目標。 10 五、發明說明（8) 從上述可知，若在篩選菌種時直接針對菌株之耐酸、 耐膽鹽以及儲存安定性等特性來進行筛選，可以節省後續 製程的開銷’更可將所筛選得的菌株做更廣泛的應用。而 分離源及地域性也與有效菌株之選出有關、、因此，近年來 人體來源即成為菌株筛選源之一主要訴求。 目别，在日本厚生省所核准的171件特定保健用食品 中，有36件（約佔全部的21%)為益生性菌種，但產值卻佔 總數的82%。纽洲，益生性菌種於食品市場之產值高達 10彳思美元。在美國，2000年酸酪乳之銷售值即達18·6億 美元。在我國，於2000年，益生性菌種的市場已成長至 42億元，而產品的應用形式也從發酵乳品、牛奶、冰淇淋、 糖果、膳食補充劑等逐年擴增，應用的對象更包含了成人、 嬰兒及各種家禽、家畜類。由此可預期，益生性菌種的市 場有一廣大的成長空間。 截至目前為止，世界各地對乳酸菌的發展研究眾多， 其中有關於乳桿菌菌株之耐酸性4及降膽固醇能力之已公 開的專利與發表文獻，大多以嗜酸乳桿菌心cf/心 μ/如菌株為主，且主要是揭示膽鹽耐受性及耐酸性 菌株，或是僅有^調降低膽固醇能力及膽鹽耐受性部分。 目前有關乳桿菌之膽鹽耐受性的研究，是強調菌株可於含 0.3%甘胺膽酸鹽（giyCOCh〇iate)下生長，而耐酸性則以出現 於胃液分泌初期之pH 2來進行耐胃酸狀態試驗。 查諸已公開的專利，乳桿菌降低血清膽固醇能力約在 20%左右，而在發表文獻方面，依照使用方法而有1〇〜8〇% 200406216

五、發明說明（9) 左右之差異。 在US 4,839,281、US 5,032,399中提到一種由人類糞便 分離出的嗜酸乳桿菌（Z· ㈣GG (ATCC 53103)，其 可生長於含0.15%膽鹽中，而其在pH 1<2之酸性環境下 培養2小時後的菌數殘存數為1〇3 CFU。 S.E. Gilliland 與 D.K. Walker 於 J· 心/· "9仰入 7^05-97/中報導，由豬隻為來源之嗜酸乳桿菌（ζ. μζ·办；7/π·/ι^) ATCC 43121 (對應於 CCRC 17064)及由人類來 源之嗜酸乳桿菌（Ζ. ATCC 4356 (對應於CCRC 10695)皆可在含0.3%膽鹽中生長，並具有降低血清膽固醇 能力。 又，Danieloson 等人於 J·"夕(57..PM-W 中所報導的由豬隻分離出的嗜酸乳桿菌（i. 心；?/n7w) LA16菌株以及Dr· khem M. Shahani等人所研究並成為 Nebraska Cultures，Inc.之專利產品的人類來源的嗜酸乳桿 菌（Z^cM6acr/7/t^ acWop/n’/ws) DDS-1 分離株（其係為内源性 人類菌株）被顯示為具有降低血清膽固醇的能力（參見 http:"www/nebraskacultures.com./benefits.html) 〇 Usman 及 Hosono 於 J. £^，>少 Sd. "PPPj, S2·· 2以-245 中 報導，一株被分離出的乳桿菌物種gwwrz·具 有耐酸、耐膽鹽及降膽固醇能力。 Yoshio Saito 與 Jun Mizutani 在 US 5,516,684 與 US 5,707,584中揭示兩種嗜酸乳桿菌菌株，亦即嗜酸乳桿菌（i. acWop/n’/ws) FERM:P-14204 與嗜酸乳桿菌（I. 12 200406216

五、發明說明（10 ) FERM-IM挪，此等菌株不會展現膽汁酸的去結合作用、 不會抑制養份吸收以及會降低血液與肝中的膽固醇。 就上述所提之非本土來源的乳桿菌菌株，若能由本土 分離筛選出具有耐酸'耐膽鹽及良好降低▲清膽固醇能力 等特性之本土性乳桿g菌株，應較能確保其於國人腸道環 境之適應性’這樣的本土性轉_株在作為菌元（s滅r) 或是添加至加工產品中，可確保食用後有效到達腸内並定 殖之訴求，而因此提高產品之機能性。 發明之概要說明 於是，本發明之第一方面是從本土人類樣品中篩選出 具有耐酸、财膽鹽及良好降低血清膽固醇能力等多重特性 之乳桿菌分離株（isolates) 〇 申請人以台灣本土健康幼兒糞便作為菌株分離來源， 就腸胃環境耐酸性、膽鹽耐受性與降低膽固醇能力來篩選 所分離出的菌株，而得到6株具有此等多重特性之新穎乳 桿菌分離株，即 gwwrz· B21T1、B21T6、C21T1、 X21B7與B38T38，以及嗜酸乳桿菌（Zm·心pWw) B6T7， 此等分離株已於西元2002年6月18日寄存於食品工業發 展研究所（中華民、國.台灣省300新竹市食品路331號）’寄 存編號分別為 CCRC 910195、CCRC 910196、CCRC 910198、 CCRC 910199、CCRC 910197 以及 CCRC 910194。此等分離 株亦有依據布達佩斯條約之規定，於西元2002年6月21 曰被寄存於美國類型培養物收集中心（ATCC，p·0·Box 1549, Manassas，VA 20108，USA)，寄存編號分別為 PTA·4483、 13 200406216 五、發明說明（ii ) ΡΤΑ-4484、PTA-4479、ΡΤΑ-4480、PTA-4481 以及 ρΤΑ·4482。

&與習知菌株嘻酸乳桿菌（£ ATCC 4j121、ATCC 4356與DDS-1比較，本發明之新穎乳桿菌 (Z^/o6aW/w)分離株被證實具有更佳之降，低膽固醇能力。

本發明之第二方面是提供一種包含有至少一種依據本 發明之新穎乳桿菌分離株或其繼代培養後代或由此等所衍 生出的突變株以及一合適的賦形劑的組成物來供製備諸如 飲料、糕點、嬰兒食品、發酵乳、營養補充品、動物飼料 等之食用品。 本發明之第二方面是提供一種包含有一益生有效數量 之至；一種依據本發明之新穎乳桿菌分離株或其繼代培養 後代或由此等所衍生出的突變株的藥學組成物，來供用於 治療與預防腸胃疾病以及降低血清膽固醇。 圖式之簡要說明 本發明之上述以及其他目的與特徵可藉由參照下文之

描述、隨文檢附的申請專利範圍和伴隨之圖式而變得更為 明顯，其中： 第1圖顯示本發明的新穎乳桿菌分離株與習知乳桿菌 菌株在耐酸性上乂·比較，其中耐酸性以Alog (a_b)來表 不，a ir、為以生理鹽水（pH 7)處理2小時後的存活細胞數， 而b為以生理鹽水(pH2)處理2小時後的存活細胞數； 第2圖顯示本發明的新穎乳桿菌分離株與習知乳桿菌 菌株在膽鹽耐受性上之比較，其中膽鹽耐受性以Δΐ〇““) 來表不，c係為以MRS肉湯培養基（MRS心⑽⑴處理％小 14 五、發明說明（12) 時後的存活細胞數，而d為以加有0.3%牛膽汁的MRS肉 湯培養基處理24小時後的存活細胞數； 第3圖顯示本發明的新穎乳桿菌分離株與習知乳桿菌 菌株，在有加與未加0.3%牛膽汁的MRS肉、湯培養基内之 生長比較； 第4圖顯示本發明為進行菌株降低膽固醇能力的試驗 而參考 S. Razin et al. (1980)，Biochimica Biophysica Acta， 分&所製備的磷脂醯膽鹼-膽固醇容積與膽固醇濃 度之關係。 第5圖顯示本發明所分離出的一株乳桿菌物種 分離株的 16SrDNA 之核苷酸序 列； 第6圖顯示本發明所分離出的一株乳桿菌物種 gaweW B21T6 分離株的 16S rDNA 之核苷酸序 列； 第7圖顯示本發明所分離出的一株乳桿菌物種 分離株的 16SrDNA 之核苷酸序 列； 第8圖顯糸.本發明所分離出的一株乳桿菌物種 gawen· X21B7 分離株的 16S rDNA 之核苷酸序 列； 第9圖顯示本發明所分離出的一株乳桿菌物種 gaueW B38T38 分離株的 16S rDNA 之核苷酸 序列；以及 15 五、發明說明（η) 第ίο圖顯示本發明所分離出的一株嗜酸乳桿菌 Β6Τ7 分離株與嗜酸乳桿菌（I. acz·而;7/2//W5·)以及植物乳桿菌（Ζ. /?/⑽/ariz/w)之間的16S rDNA 核苷酸序列差異，其中“以加框標示者”是'該，B6 丁 7分離株 與嗜酸乳桿菌（I. ac Wo;?/π7μ)之間的核菩酸差異位址處，而 “以*標示者”是該Β6Τ7分離株與植物乳桿菌（Z./7/w/artzm) 之間的核苷酸差異位址處。 發明之詳細說明 為得到符合本土習性以確保能適應本國人之腸道環境 的本土性乳桿菌，申請人以居住於台灣新竹地區的1至6 歲健康嬰幼兒之糞便作為所欲菌株之篩選源，使用一系列 以羅格莎緩脂為主之選擇性培養基（Rogosa agar-based selective media)來篩選乳桿菌疑似菌株(suspected strains)， 而從43個樣品中所得的828個分離株（isolates)中找到400 株疑似菌株。此等疑似菌株被進一步測試是否具有於上述 「發明之概要說明」一節内所言特性，亦即： 1 ·對酸之安定性， 2.對膽鹼之安定性，以及 3·具有降低:膽固醇之能力， 且將這些疑似菌株拿來與公開菌株就此等特性作比較，而 篩選出6株符合所求之具良好能力的新穎乳桿菌 分離株。 所得到的6株分離株進一步使用API鑑定系統、微生 物電腦鑑定系統（Micro-IS System)與16S rDNA序列分析等 16 2〇〇4〇62l6 五、發明說明（l4) 來作菌株鑑定，而依據鑑定結果，這6株分離株分別被分 類命名為/gwwn· Β21ΊΠ、B21T6、C2m、X21B7 與B3 8T38 ’以及嗜酸乳桿菌（Z. B6T7，此等分 離株已於西元2002年6月18曰寄存於食品工業發展研究 所（中華民國台灣省300新竹市食品路331號），寄存編號 分別為 CCRC 910195、CCRC 910196、CCRC 910198、CCRC 910199、CCRC 910197 以及 CCRC 910194。此等菌株亦有依 據布達佩斯條約之規定，於西元2002年6月21日被寄存 於美國類型培養物收集中心（ATCC，Ρ·0· Box 1549, Manassas， VA 20108，USA)，寄存編號分別為 PTA-4483、PTA-4484、 PTA-4479、PTA-4480、PTA-4481 以及 PTA-4482 〇 基於上述之有利特性，依據本發明之新穎乳桿菌 分離株適用作為一種益生菌。例如，該等分 離株可被配製於廣泛種類之可食性材料内，該等材料包 括：流體乳品（牛奶、濃縮牛奶），發酵乳品（優酪乳、酸乳、 冷凍優格、乳酸菌發酵飲料），奶粉，冰淇淋，乳酪，乾酪， 豆奶與發酵豆奶，蔬果汁、果汁及運動飲料等飲料，甜點， 糖果，嬰兒食品，食療產品，動物飼料，腾食補充品等。 每種產品之含菌臺可為每公克或每毫升有約1〇6至1〇9菌 落形成單位（colony forming units，CFU) 〇 明顯地，熟習本項技藝者可明瞭，本發明之新穎乳桿 菌分離株可被當作食品添加成分，藉由習知 方法於原料製備時添加，或是不參與發酵而於發酵製程之 後添加，而被配製成任何適用之形式來供人類及非人類之 200406216

五、發明說明（l5) 動物的吸收。更佳地，本發明之新穎乳桿菌 分離株可單獨地或與至少一種其他益生性生物共同配製於 可食性材料内，該等其他益生性生物包括：乳桿菌屬物種’ 如嗜酸乳桿® 、乳酸乳桿菌（4·/ac沿）、短乳 桿菌（Z. 以）、乳酪乳桿菌（Z· am·)、植物乳桿菌（Z· 、唾液乳桿菌（Z. M//var—)、雙歧乳桿菌（i· 、保加利亞乳桿菌（Uw/garfcws)、高加索乳桿菌（Z. cawjahcws)以及鼠李糖乳桿菌（I. Μα所㈣*;鍵球菌屬物 種，如嗜熱鏈球菌（&、乳酸鏈球菌 /“c沿）；酵母菌，如念珠菌屬物種 A/yr、弗羅棱酵母菌（Sacc/zarom少;或此等菌 種之組合。 另有一種應用形式是將本發明之新穎乳桿菌 (Ζ^(：ί<9 6α^7/ί^)分離株本身或含有此菌株之上述產品予以製 成冷凍乾燥粉末或噴霧乾燥粉末，而使每個產品中約含1 〇8 至109以上的活性乳桿菌菌體。將此產品添加以酵母粉、 醣類或其他填充劑，可再製成錠劑或膠囊形式，例如含有 乳桿菌之消化整腸藥劑或者即溶沖泡食品以及供直接食用 之菌體粉末。 > 另外，本發明亦預期將上述新穎乳桿菌（iacm6acz7h〇 分離株單獨地或與其他活性組份共同使用作為控制非所欲 腸道微生物在一哺乳動物之消化道内集生的藥物，以減輕 該非所欲腸道微生物所造成的不適腸胃症狀。該組成物可 被配製成溶液、乳劑、粉末、鍵劑、膠囊或供用於口服投 18 200406216 五、發明說明（16) 藥的其他適合形式。 又’基於本發明之新穎乳桿菌分離株所 具有的降低膽固醇能力，本發明亦預期該等乳桿菌 (Lacr〇6aci//w)分離株被用於製備用以降低'血清膽固醇的保 健食品與非處方醫藥品之應用。 就以上所述，被預期落在本發明的技術概念範疇内的 是，具有相同於本發明之新穎乳桿菌（i：acr〇“cz7/t^)分離株 的菌學特徵之菌株，本發明之新穎乳桿菌分 離株的繼代培養後代（subcultured offspring)，或是由本發明 之新穎乳桿菌分離株所衍生出的突變株。 如此處所用者，“突變株”此術語意指一種所具遺傳組 成相對於一參考菌株（reference strain)或親代菌株（parent strain)有至少一個核苷酸差異（例如，經由核苷酸的取代、 插入或刪除所致）的菌株。除天然突變之外，本發明的突變 株可藉由多種方法來生成。例如，此等突變株可藉由親代 菌株的隨機突變生成（random mutagenesis)，例如藉由化學 突變劑、轉位因子（transposon)或輻射照射，而被獲得。此 外，本發明之突變株可包含一重組型核酸序列。舉例來說， 一突變株可為一帶有一額外的核酸序列（例如一經轉形 (transformed)、性狀引入（transduced)或他種方式而被插入 至親代菌株之一細胞内的序列）之菌株。該額外的核酸序列 可編碼一被通常地或有條件地表現之聚胜肽。另擇地，該 額外的核酸序列可編碼一能改變細胞生理學之核酸序列， 例如一反訊息（anti-sense)、一核酶（ribozyme)或其他核酸序 19 200406216

五、發明說明（l7) 列。在另一例中，被插入的核酸是被插入至 一内源性基因 内，並改變（例如增強或破壞）該基因之功能 。舉例而言， 該被插入的核酸可為一種將該内源性基因去活化的剔除建 構物（knockout construct);或為一種會增'力1該内源性基因 的轉錄作用之人工增強子（enhancer)或啟動子（promoter)。 本發明將就下面實施例來作進一步說明 ，但應瞭解的 是，該等實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發 明的實施之限制。 實施例1乳桿菌分離棟的分離與_選（Isolation and screening of Lactobacillus isolates) 材料與方法： 一、培養基及稀釋液： 1·篩選培養基： (A)蕃莊汁瓊脂（tomoto juice agar)培養基 路蛋白之酵素水解物（casein enzymatic 10 g hydrolysate，Sigma，Louis, Mo，USA) 脫脂奶（skim milk) 10 g 蕃 5S 汁（tomato juice) 400 ml 填脂（agar) 12 g 蒸館水（distilled water) 加至1 L (B)羅格莎瓊脂（R〇g〇sa agar)培養基 羅格莎道脂（M'er9k，Darmstadt，Germany) 74.5 g 蒸餾水 1 L 經微波加熱溶解後，待冷卻至55°C，以醋酸調整pH值 至 pH 5.5 (C)乳桿菌選擇培養基selective medium，LBS) 羅格莎瓊脂 8.4 g 蕃茄汁 40 ml 蒸餾水 60 ml 經微波加熱溶解後，待冷卻至55°C，以醋酸調整pH值 20 200406216 五、發明說明（18) 至 pH 5.5 (D)Rogosa + X-glu瓊脂培養基 將80 mg的5-溴-4-氣-3-吲哚基I_y3-D-吡喃葡糖苷（5· bromo-4-cliloro-3-indolyl-冷-D-glucopyranoside，X-glu)(Sigma， Louis，MO, USA)加入至 100 ml 的 0·2 M tris 緩衝液（pH 8·5)中，利用超音波振盈溶解之。將10 ml所形成的溶液加 入至190 ml的55°C羅格莎瓊脂中，即成為含X-glu最終濃 度為 40 // g /mL 之 Rogosa + X-glu 填脂。 2·菌種活化培養基（bacterial activation medium): (A)Bacto 乳桿菌 MRS 肉湯培養基（Bacto MRS broth, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) (B) MRS璦月旨：Bacto乳桿菌MRS肉湯培養基再添加細菌 壤 脂(Agar bacteriological)(Scharlau Chemie S.A·， Barcelona, Spain，歐盟製造的）（15g/L) 0 3 ·核糖利用性培養基（ribose utilization medium): 基礎培養基（basal medium)之組成： Bacto 月示腺 3 號（Bacto proteose peptone ηο·3) 10 g Bacto 酵母萃取物（Bacto yeast extract) (上述兩種組份之製造商為Difco Laboratories, 5 g Detroit, MI, USA) Tween 80 , 1 g 擰檬酸氫錄（ammonium hydrogen citrate) 2 g 乙酸鈉（sodium acetate) 5 g 硫酸鎭（magnesium sulfate) 0.1 g 硫酸猛（manganese sulfate) 0.05 g 填酸氫二卸（dipotassium (hydrogen) phosphate) 2 g 氣紛紅（chlorophenol red) 0.05% 蒸餾水 利用HC1將pH值調整至pH 6.3 1 L 將配好的基礎培養基分裝至試管中，每管含4.5 ml， 21 200406216

五、發明說明（l9) 經121°C滅菌15分鐘後，再加入0.5 ml經過濾滅菌後的 10%核糖（ribose)溶液。 三、 稀釋液（diluent) 四、 1 % 的腺水（peptone water) (BACTO™ Peptone, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 二、分離及篩選菌株的操作程序： 2. 取1至6歲幼兒之糞便中段，以長竹籤取出約一小截 指頭大小之樣品，並將之加入至一内含9 ml稀釋液 (0 · 1 %腺水）之試管中，而製成一經10倍稀釋的檢液， 將之充分均勻攪拌後靜置數分鐘，以使樣品中所含微 生物被釋放至稀釋液中； 3. 取出1 ml的上述稀釋檢液，並將之置入至另一支内含 9 ml稀釋液之試管中，依此重覆進行系列稀釋（serial dilution)直至達成104-倍稀釋。 4. 就上述步驟2中所為之系列稀釋，分別取出0.2 ml之 經102-、103-、104-倍稀釋的檢液，並將之置於各種篩 選培養基（羅格莎瓊脂、蕃茄汁瓊脂、乳桿菌選擇培養 基以及Rogosa + X-glu填脂）上，以一 L型玻棒予以塗 抹均勻後，將該等篩選培養基置於一設定在37°C之溫 度下的厭氣培養箱（内含混和氣體：5% H2、10% C02 與85% N2)内進行培養2至4天； 5. 挑選在Rogosa + X-glu瓊脂上呈現藍色且經顯微鏡檢 查（microscopic examination)為無移動性（non-mobile)之桿 菌菌落，或是在其他篩選培養基上外觀為半透明且經 22 200406216 五、發明說明（2〇 ””員微鏡k查亦為無移動性之桿菌菌落，以竹籤挑菌並 將之置入一含有MRS肉湯培養基以及一發酵内管之試 官中，於37°C下予以培養i至2天後，收集有生長但 不會產生氣體且經革蘭氏染色（Gram staining)顯示為陽 性之菌株。 ^ 6·就上述步驟4所收集到的菌株，以MRS肉湯培養基予

以活化兩次後，依下面所述來進行生長溫度及核糖利 用性試驗： (1)將1%接種物接種至一 MRS肉湯培養基内，並將 該培養基置於15。(：下靜置培養歷時14天，若有菌 體生長，則表示該菌株可以於15°C生長，而若於 第14天仍無菌體生長，則表示該菌株無法於15°C 下生長； (η)將1%接種物接種至一 MRS肉湯培養基内，並將 該培養基置於45 °C下靜置培養歷時2天，若有菌

體生長’則表示該菌株可以於45。(：生長，而若無 菌體生長’則表示該菌株無法於45。〇下生長； (in)將1 %接種物接種至一於核糖利用性培養基，並於 37°C下靜置培養數天，若培養液由紫變黃，表示菌 體可以利用核糖生長並產酸；若7天後培養液仍為 紫色’再繼續靜置培養，若第14天培養液仍未變 成黃色’則表示此菌株無法利用核糖生長並產酸。 三、結果： 在此實施例中，有關乳桿菌的篩菌培養

200406216 五、發明說明（21 ) 基主要以羅格莎瓊脂為基礎，有的則再添加以番茄汁或 X-glc。番茄汁含豐富維他命B群，而有利於乳桿菌 的生長，而羅格莎瓊脂中的醋酸除了降低pH 值以抑菌外，高濃度的醋酸根離子同時也有抑制微生物生 長的效果。 '

嗜酸乳桿菌生長在羅格莎環 脂上的外觀是呈現白色菌落，而不易與其他的乳桿菌 (Zacio6aci//〇分辨。若於羅格莎瓊脂中添加X-glc，嗜酸 乳杯囷囷落的外觀即會變成藍 色’這是因為嗜酸乳桿菌具有冷-D-糖苷酶（々-D· glucosidase)活性而會打斷x-glc之冷_D_糖苷鍵（石 -D-glucosidic bond)，而產生藍色的發光團（chr〇m〇gene)，進 而使嗜酸乳桿菌以油咖·心）菌落呈現藍色。 但是，於細胞中擁有此酵素的微生物並不在少數，故仍須 作進一步鏡檢、革蘭氏染色及進行上述的醣類與生長溫度

等生理生化的試驗，再挑出具有所欲性質之疑似菌株 (suspected strains)。 申請人從居住於台灣新竹市地區的丨i6歲健康嬰幼 兒之糞便共收集了 43個樣品，每個樣品經稀釋後塗抹於各 選擇性培養基巾，g株長出後，再從選擇性培養基中挑出 顏色㈣態不同的菌落進行鏡檢，若鏡檢結果為桿菌，再 進行革蘭氏染色，挑選出革蘭氏陽性的桿菌，並將之稱為 分離株㈣伽）。此等分離株被置於含發酵内管之MRS肉 湯培養基中，再從中挑選出不會產生氣體之g株來進行生

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=溫度與核_用性試株能在饥下生長 但:能在15°C下生長，且不能利用核糖作為生長所需碳源 =菌株則進行保存，於此階段所收集的菌株被稱之為疑似 囷株。 ** 參見表1 ’申請人在所收集的43個樣品中總計挑選出 828株分離株，其中有4〇〇株疑似菌株。關於菌株之編號 方式’舉B6T7為例，B是指培養基種類（LBS)，6是指樣 品來源標號’ T是指菌株顏色（外觀透明），而7是指菌落 之流水標號。 表1·收集的樣品*標號及其分離菌數 樣品標號 分離菌數 疑似菌株 樣品標號 分離菌數 疑似菌株 1 40 0 23 3 0 一 2 0 0 24 0 0 一 3 0 0 25 100 100 一 4 26 0 26 0 0 5 45 0 27 0 0 6** 68 55 28 0 0 7 0 0 29 0 0 8 0 0 30 60 0 9 0 0 31 0 0 10 0 0 32 0 0 11 0 0 33 0 0 12 60 60 34 0 0 13 0 0 35 0 0 14 0 0 36 139 115 15 0 0 37 0 0 _ 16 0 0 38** 120 40 17 0 0 39 〇 1 0 _ 18 0 0 40 0 0 19 0 0 42 1 60 0 20 14 0 42 ^ 0 0 21** 30 30 43 60 0 22 3 0 總數 823 400 __H__J_J__^__一— -1— - * :樣品來源：台灣新竹市之1至6歲幼兒的糞便 本發明分離株的樣品來源編號 25 200406216

五、發明說明（23) 該等疑似菌株接而進行下面實施例所描述的耐酸性、 膽鹽耐受性試驗及降低膽固醇能力試驗，其中6株經試驗 而顯示具有良好特性之分離株，即B21T1、B21T6、C21T1、 X21B7、B38T38與B6T7，被拿來下列習知的菌株進行此等 性質之比較： 1. 嗜酸乳桿菌CCRC 17064 (對 應於ATCC43121，分離來源為豬），此菌為具降低血清 膽固醇能力之乳桿菌（S.E. Gilliland以α/· (1985)， Environ. Microbiol., 49: 377-381; S.E. Gilliland and D.K. Walker (1990), J. Dairy Sci.f 73:905-911; F.A.M. Kalver and R. van der Meer (1993), Appl. Environ. Microbiol, 59: 1120-1124; D.O. Noh et al (1997), J. Dairy Sci.t 82: 3107-3113)； 2. 嗜酸乳桿菌acz·心CCRC 10695T (對 應於ATCC 4356，分離來源為人類），此菌為來自人體 之嗜酸乳桿菌標準株（D.K. Walker and S.E. Gilliland (1993),7. Dairy Sci,y 76:956-961) ^ 3. 嗜酸乳桿菌DDS-1 (分離來源 為人類），菌為一目前市面有售之產品（Nebraska Cultures，Inc.); 4. 嗜酸乳桿菌CCRC 14065 [對 應於CSCO 2401，商業上可獲自於Commonwealth Scientific Industrial Research Organization (CSIRO)， Canberra, Austrilia];以及 26 200406216 五、發明說明（24 ) 5. 一種乳桿菌物種之寄存物gwwrf CCRC 14619τ (對應於ATCC 33323，分離來源為人類）(/从汄 Syst· Bacteriol· (1980)，30, 601; E. Lauer and O. Kandler， Bakteriol· Parasitenkd· Infektionskr· Hyg· Abt· 1 Orig, Reihe C，1980, 1，75-78、。 實施例2而十酸性試驗（acid tolerance test) 一、 實驗操作程序： 參考 J.E. Holcombe e/1 αΛ (1991)，Cw/Λ Dairy ZVod J·, 26(3):4-5以及發證予Y.s. Yang等人之US 5,711，977中所揭 示的方法，以中性（pH 7)及仿胃酸環境（pH 2)中來作存活菌 數之測試。 各試驗菌株以MRS肉湯培養基活化兩次後，取其菌 液邊心（3,000 rpm，10分鐘），去除上清液後，添加1 ml 的生理食鹽水溶液（0.85% NaCl，pH 7)，先以竹籤將菌體攪 散’再振盪均勻，然後分別取〇.5 ml經散浮的菌液置於pH 7及pH 2的生理食鹽水溶液中，於一為37°c的恆溫培養箱 内靜置2小時後，分別測其存活菌數。△ i〇g菌數[==1〇g(在 pH 7下之菌數—在pH 2下之菌數）]之數值越小，視為耐酸 性較佳之菌株。、 二、 結果二 大部分的微生物在酸性環境中均無耐受性。乳酸菌本 身雖為一產酸菌，但其生長環境僅能達pH 3.2至4.5，因 此’在胃中極低pH之環境（pH 2.0至3.2)亦為影響其存活 之主要因素。胃酸pH值會隨胃内容物之進入時間及種類

27 200406216 五、發明說明（25) 而有pH 1.5〜4.5之不同，平均歷時2小時，故試驗時採 用pH 2作為代表，且因酸性物質與鹽酸相似，故以經鹽酸 調整pH值為2之生理食鹽水（〇·85% NaCl/0.01 N HC1系 統）’於3 7 C下處理2小時後測試存活的菌數，並與pH 7 之對照組作比較。

試驗結果顯示，經不同pH值、37°C/2h處理後，以喻 酸乳桿菌ac/如CCRC 17064 耐酸性為 最佳（第1圖），接受處理的菌數只降低1.9個log值，而嗜 酸乳桿菌acidophilus) CCRC 10695τ 與 14619τ 的而ί 酸性較差，菌數分別 降低4.3及4.4個log值。

本發明於實施例1所得到的新分離株B21T1 (後經菌 學特徵鑑定被分類為別swr/，如下面實施例 所示）與CCRC 14065的耐酸性相近，菌數降低了 3.9個log 值。本發明之另外5個分離株（B21T6、C2m、X21B7、B38T3 8 與B6T7)的耐酸性相近，且皆達到△ log菌數小於4之耐酸 性篩選指標（參見Y.S. Yang等人之US 5,711，977)。 實施例3.膽鹽耐受性試驗（bile salt tolerance test) 一、實驗操作程序..·· 各試驗菌株以MRS肉湯培養基活化兩次後，再分別取 1%接種物接種於10 ml MRS肉湯培養基以及10mL含0.3% 牛膽汁之MRS肉湯培養基（MRSO)中，於37°C予以培養24 小時後，以分光光度計分別測定菌體濃度（OD66〇)。另外， 亦計數其殘存菌數，其中△ log菌數值=log (MRS肉湯培養 28 200406216 五、發明說明（26 ) 基之菌數-MRSO肉湯培養基之菌數），而Alog菌數值越 小，表示試驗菌株的膽鹽耐受性越佳。 二、結果： 乳酸菌經膽鹽處理後，不同菌種間之存彦率有很大差 異，因此，篩選具有膽鹽耐受性之乳酸菌株在選用益生菌 上有其重要性（S.E. Gilliland 以 g/.(1984)，&/··, 67:3045-3051; P. Marteau et al (1997), J. Dairy Sci.t 80:1031-1037)。於先前之研究中，牛膽汁被普遍使用於培 養基中來供選擇性培養人類腸内菌，因此其效力應很類似 於人類膽鹽且平均濃度為0.3%(w/v)(S.E. Gilliland and D.K. Walker (1990), J. Dairy Sci., 73:905-911; D.K. Walker and S.E. Gilliland (1993)，乂 Scz··，76:956-961)。 試驗結果顯示，除 CCRC 10695T、CCRC 14619T、CCRC 14065外，各試驗菌株不論在含有或不含0.3%牛膽汁的培 養基中，所測得的OD660值（菌體濃度）皆在2以上（表2)， 這顯示0.3%牛膽汁對於試驗菌株的生長，似乎影響不大。

29 200406216 五、發明說明（27) 表2·試驗菌株培養物在含有或不含〇·3%牛膽汁之MRS 肉湯培養基内培養24小時之生長比較Λ 培養物 菌體濃度（〇d660值） MRS肉湯培養基 MRS肉湯培養基+ 0·3ο/〇牛膽汁 B6T7 2.49 2.74 C21T1 2.44 2.56 B38T38 2.45 2.03 B21T1 2.57 2.53 B21T6 2.62 2.29 X21B7 2.69 2.50 CCRC 17064 2.91 2.37 CCRC 10695τ 2.35 1.09 CCRC 14065 2.55 1.79 CCRC 14619 丁 2.96 1.58 DDS-1 2.87 2.72 但疋’亦注意到本發明的BN?及C21T1這兩個菌株 在MRSQ肉湯培養基之菌體濃度高於mrs肉湯培養基， 這顯示可能有其他干擾因子形成而影響到吸光。因此，進 株在兩組培養基内培養24小時後的存活 菌數。 多見第2圖’由觀察到的菌數降低可知，CCRC 14619丁 的膽鹽耐受性較差，复·Α 共-人為CCRC 10695了以及本發明的 Β38Τ38囟株。而膽趟+ % π耐叉性最佳者為本發明的分離株 B6T7 ’其餘各菌株的膦踏 一 膽風耐党性相近，即於含0.3%牛膽汁 之MRS肉湯培養基中执差 甲培養24小時後，其死滅菌數皆在1 至2個log值内。

30 200406216 五、發明說明（28) 另外’觀察部分菌株在含〇.3〇/0牛膽汁之MRS肉湯培 養基中的生長曲線，以生長曲線斜率代表生長速率，斜率 越大’表示生長速率越快，即膽鹽耐受性較佳。由第3圖 可知’ CCRC 17064之生長速率最快，其次為本發明的分離 株 X21B7 與 Β21ΤΊ，而 CCRC 14065、CCRC 10695丁 及 DDS-1 的生長最慢。 雖然由不同觀測方式所得之結果略有小差異，由這些 試驗可知，本發明所筛選出的乳桿菌皆具有耐酸性及膽鹽 财受性。 實施例4.菌株降低膽固醇能力之分析 一、實驗操作程序： (A)膽固醇來源 關於菌株降低膽固醇能力之測試，習知文獻與已公開 的專利前案所用的膽固醇來源大多採用PPLO (BACT PPLO SERUM FRACTION)，但此產品目前已停止生產，因此，於 本實施例中，申請人參考Huang, C. and Τ·Ε· Thomopson (1974)，32:485-489 以及 S· Razin a/. (1980) dc/a, 598:628-640 中所揭示的填脂醯 膽鹼-膽固醇製備'方法，採用馬血清及磷脂醯膽鹼-膽固醇 作為膽固醇來源，而製備出一均勻分佈的磷脂醯膽鹼-膽固 醇溶液，其容積與所含膽固醇濃度呈一正相關曲線關係（第 4圖）。 1 ·馬血清（Horse serum) 將馬血清溶於水中，以一孔徑為〇·45 // m的過濾膜予

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五、發明說明（29) ’ 以過濾後，將之存放於-20°C冰箱中。2.磷脂醯膽鹼-膽固醇[蛋卵磷脂（Egg Lecithin)+膽固醇] 依據 S· Razin et a!. (1980)，Biochimica Biophysica Acta, 598:628-64〇，將蛋卵磷脂及膽固醇加入至一旋轉真空濃縮 儀（Rotary vacuum evaporator，EYELA)之磨砂塞瓶中，以足量 之氯仿將其均勻溶解，再以氮氣吹乾，以使膽固醇與蛋即 磷脂均勻混合並在磨砂塞瓶内之玻璃壁上形成一均勻薄 膜，繼之以0.4M蔗糖溶液予以覆溶（re_dissolved),將氮氣 吹入至該磨砂塞瓶内並封上瓶蓋，再以鋁箔（aluminurn foil) 包覆，俾以降低脂質氧化之機率。 在4 C下以水必式超音波震邊器震盪該經密封之磨砂 塞瓶歷時15分鐘後，將上述混合溶液加壓通過具一孔徑為 0.22//m的過濾膜2次，隨即將之保存於4。(：冰箱内（須於 3天内使用）。 (B)試驗組別 試驗（1):試驗菌株以MRS肉湯培養基予以活化兩次 後，取1%接種物接種於10 ml MRSS (内含8.8 ml MRS以 及1·2 ml膽固醇溶液與〇·3〇/0牛膽汁）中，並於一為37〇c之 厭氧培養箱（10% C〇2及90% N2)内進行培養歷時24小時， 然後依下面（C)項中所述，收集接種有試驗菌株之培養物的 上清液樣品以及細胞沉澱丸樣品來供膽固醇含量測定之 用。 »式驗（2) ·囷株以MRS肉湯培養基活化兩次後，取1 % 接種物接種於10 mL MRS0中，在37°C下予以培養歷時20 32 200406216 五、發明說明（3〇) 至22小時，再取出1%接種物接種於10 mL MRSS中，並 於一為37°C之厭氧培養箱（10% C〇2及90% N2)内進行培養 歷時24小時，然後依下面（〇項中所述，收集接種有試驗 菌株之培養物的上清液樣品以及細胞沉澱、樣品來供膽固 醇含量測定之用。 (C)膽固醇含量之測定 膽固醇含量之測定係依據苯二甲醛（〇-phthalaldehyde)方法來進行（L.L. Rudel and M.D. Morris (1973), Notes on Methodology, 14:364-366; S.E. Gilliland et al (1985), AppL Environ. Microbiol, 49: 377-381) ° 就上述試驗（1)與試驗（2)，各取1 ml的測試菌液，以 12,000 rpm離心1〇分鐘後，將〇.5 ml上清液置於一試管 中’此即為接種有試菌株之培養物的上清液樣品。 就上述試驗（1)與試驗（2)，各取i mi的測試菌液，以 3,00〇rpm離心10分鐘後，除去上清液，所形成的細胞沉 殿丸（cell-pellet)以 1 〇 ml MRS0 肉湯培養基覆溶（rediss〇lve) 並混合均勻後，取出〇·5 ml溶液置於一試管中，此即為接 種有試驗菌株之培養物的細胞沈澱丸樣品。 各測試樣品+以加入3 ml的95%乙醇並振盪均勻，再 加入2 ml 50%KOH振盪均勻，接而於6〇。〇水浴下加熱1〇 分鐘，再置於室溫下冷卻。經冷卻的溶液予以加入5 ml 己烷（hexane)並振盪均勻，再加入3ml的h2〇。所形成的 混合物在振盪均勻後於室溫下靜置15分鐘，取出2·7 ml 的己烷層並移到另一試管内，於6(rc下利用氮氣將己烷蒸 200406216 五、發明說明（31 ) 發。蒸發後的固體被加入4 ml的…苯二甲醛試劑溶液 (o-phthalaldehyde reagent，0.5 mg …笨二甲醛/；1 ml 乙酸），振 盪均勻後靜置於室溫下歷時10分鐘，再加入2 ml濃硫酸， 振盪均勻後靜置於室溫下歷時10分鐘，再以分光光度計來 測定0D55 0值。 (D) 菌株降低膽固醇能力之評估 依據下列公式來評估菌株降低膽固醇的能力： A = 1〇〇 — [(B/c)xi〇〇】 A==膽固醇之降低率（〇/0) B =接種有試驗菌株之培養物的上清液樣品内之膽固 醇含量（mg) C =未接種有試驗菌株之培養物的上清液樣品内之膽 固醇含量（對照組） 若A值達80%以上，即視為具有明顯之降膽固醇能力。 (E) 試驗菌株的膽固醇同化作用之評估

Af = l〇〇 -[(Bf + Cf)xl〇〇] A’=膽固醇之同化作用（％) B =接種有試驗菌株之培養物的上清液樣品内之膽固 醇含量 C =接種有試驗菌株之培養物的細胞沉澱丸樣品内之 膽固醇含量（％) 右A值達15%以上，即視為具明顯之膽固醇同化能力。 -一、結果： I、菌株降低膽固醇的能力

34 200406216 五、發明說明（32) 比較試驗（1)(亦即在MRS肉湯培養基内之生長）與試 驗（2)(亦即在MRSO肉湯培養基内之生長），兩者間之差別 在於試驗（2)中的試驗菌株有先被接種至MRSO肉湯培養基 内培養20至22小時，再取1%接種物予以接種至10 ml MRSS中，此用意係在於再一次篩選菌株是否有好的膽鹽 耐性，同時也可篩選具有降膽固醇能力之菌株。 以馬血清作為膽固醇來源之試驗結果顯示（表3)，習知 的口耆酸乳桿菌aczWop/n’/ws) CCRC 17064 以及 DDS-1，在此試驗同樣也有明顯效果，降低膽固醇能力達 88 至 98%。而 CCRC 14065、CCRC 106957與 CCRC 14619丁 的降膽固醇能力則不明顯，這可能是因為此等菌株的膽鹽 耐性較差，在MRSO肉湯培養基内的生長差，以致所觀察 到的降低膽固醇能力僅達30至43%。 而本發明所得的分離株B6T7、C211H、Β21ΊΠ、B21T6、 B38T3 8及X21B7在兩組試驗中，降低膽固醇的能力皆達 91至99%以上，略高於CCRC 17064及DDS-1所具者，而 顯示出本發明所篩選之菌株亦具有良好的降低血清膽固醇 的能力。 35 200406216

五、發明說明（33) 表3.試驗菌株降低膽固醇（馬血清模型）a能力之評估 於MRS肉湯培養基之生長 於MRSO肉湯培養基e内之生長 培養物 膽固醇d _ml) 膽固醇降低率 (%) 膽固醇d _ml) 膽固醇降低率 (%) B6T7 6.71 92.2 7.14. 92.7 C21T1 0.69 99.2 2.41 97.2 B38T38 2.24 97.4 7.57 91.2 B21T1 3.10 96.6 0.34 99.6 B21T6 2.84 96.7 2.24 97.4 X21B7 1.34 98.4 3.27 96.2 CCRC 17064 1.12 98.7 9.81 88.4 CCRC 10695 8.00 90.7 56.97 33.8 CCRC 14065 11.70 86.4 59.90 30.4 CCRC 14619 2.84 96.7 49.14 42.9 DDS-1 5.94 93.1 5.16 94.0 Control 86.06 — 86.06 — a:補充有0.3%牛膽汁與12%馬血清的MRS肉湯培養基· b:在試驗前，所有培養物使用1%接種物被繼代培養（subcultured)於 MRS肉湯培養基内，並於37°C下被培育歷時24小時. e:在試驗前，所有培養物使用1%接種物被次·培養於MRSO肉湯培養 基（MRS肉湯培養基加上0.3%牛膽汁）内，並於37°C下被培育歷時 24小時. d:肉湯培養基内的初始膽固醇含量為86.06 pg/ml. 參見表4，比較馬血清試驗中具有降低膽固醇能力的 菌株，改以磷脂醯膽鹼-膽固醇作為膽固醇來源時，發現到 各菌株的膽固醇降低率（％)有下降趨勢，這顯示乳桿菌 菌株對於不同型態的膽固醇的降低能力會有 變化，其中CCRC 17064對於磷脂醯膽鹼-膽固醇的降低率 為11至29%，而本發明所得到的菌株對於磷脂醯膽鹼-膽 固醇的降低率為23至48%，顯然要比CCRC 17064為高， 但略低於DDS-1所具之50%。 36 200406216 五、發明說明（34 ) 表4.試驗菌株降低膽固醇（磷脂醯膽鹼-膽固醇模型）a能 力之評估 於MRS肉湯培養基1)内之生長 於MRSO肉湯培養基£内之生長 培養物 膽固醇α (μ.ζ/πιΐ) 膽固醇降低率 (%) 膽固醇° (pg/ml) 膽固醇降低率 (%) Β6Τ7 45.05 23.92 33.-70 43.10 C21T1 30.71 48.15 43.59^ 26.40 Β38Τ38 33.75 43.01 35.16 40.62 Β21Τ1 32.34 45.39 32.83 44.57 Β21Τ6 35.43 40.16 36.25 38.79 Χ21Β7 35.11 40.71 39.29 33.65 CCRC 17064 52.66 11.07 42.01 29.06 DDS-1 29.24 50.63 29.46 50.26 Control 59.22 — 59.22 — a:補充有0.3%牛膽汁與12%磷脂醯膽鹼-膽固醇的MRS肉湯培養基. b:在試驗前，所有培養物使用1°/。接種物被繼代培養（subcultured)於 MRS肉湯培養基内，並於37°C下被培育歷時24小時· e:在試驗前，所有培養物使用1%接種物被次·培養於MRSO肉湯培養 基（MRS肉湯培養基加上0.3%牛膽汁）内，並於3 7°C下被培育歷時 24小時. d：肉湯培養基内的初始膽固醇含量為59.22 pg/ml. Π、試驗菌株對膽固醇的同化作用 有關乳酸菌降低膽固醇的機制，主要是利用膽固醇和 去結合的膽鹽（deconjugated bile salt)產生共沈殿作用而將 膽固醇排除（F.A.M. Kalver 和 R. van der Meer (1993)，同前 述；M.M. Brashears 和 S.E. Gililland (1997)，同前述），以及 菌株本身對膽固醇的同化作用（Gilliland et al. (1985)，同前 述；D.O· Noh er α/. (1997);同前述；以及張和駱等人（1998)， 同前述）。 參見表5所示，可看出CCRC 17064、本發明所得到的 6個分離株以及DDS-1對膽固醇皆具有同化作用，但不同 菌株對於膽固醇的同化能力略有差異，所觀察到的同化率 約在 11 至 40%左右。而 CCRC 14065 及 CCRC 10695τ 及 CCRC 1461 ”的膽固醇同化能力則不明顯。 37 200406216

五、發明說明（35) 表5.試驗菌株的膽固醇a同化率之評估

Cultures MRS肉湯培養基°内之生長 於MRSO肉湯培養基^内之生長 用過的肉湯培養 基内之膽固醇d (%) 細胞沉观丸 内之膽固醇 (%) 被同化的 膽固醇 (%) 用過的肉湯培養 基内之膽固醇d (%) 細胞沉殿九 内之膽固酵 (%) 被同化的 膽固醇 (%) B6T7 7.8 51.4 40.8 7.3 74.1 18.6 C21T1 0.8 86.0 13.2 2.8 ,72.3 24.9 B38T38 2.6 79.1 18.3 8.8 83.7 7.5 B21T1 3.4 81.7 14.9 0.4 88.4 11.2 B21T6 3.3 67.2 29.5 2.6 81.4 16.0 X21B7 1.6 67.0 31.4 3.8 71.3 24.9 CCRC 17064 1.3 68.5 30.2 11.6 72.9 15.5 CCRC 10695 9.3 71.7 19.0 66.2 33.4 0.4 CCRC 14065 13.6 82.0 4.4 69.6 27.8 2.6 CCRC 14619 3.3 80.6 16.1 57.1 42.7 0.2 DDS-1 6.9 78.5 14.6 6.0 81.3 11.2 a:補充有0.3%牛膽汁與12%馬血清的MRS肉湯培養基· b:在試驗前，所有培養物使用1°/❶接種物被繼代培養（subcultured)於 MRS肉湯培養基内，並於37°C下被培育歷時24小時· c:在試驗前，所有培養物使用1%接種物被次·培養於MRSO肉湯培養 基（MRS肉湯培養基加上0.3%牛膽汁）内，並於3 7°C下被培育歷時 24小時. d:對照組内的膽固醇濃度被界定為100份· 綜合以上試驗結果，本發明所筛選出之6株本土性乳 桿菌分離株被顯示具有良好耐酸、耐膽鹽及降膽固醇能力 之特性。於下進一步進行此等分離株的菌學特徵鑑定。 實施例5.乳桿菌分離株的特徵鑑定（Identification and characterization of Lactobacillus isolates) 一、實驗操作程序 (1)初步試驗 ' 將新鮮培養（18至24小時）之菌株進行初步鑑定，試驗 項目包括：革蘭氏染色（Gram staining)、形態觀察 (morphological observations)、過氧彳匕氫酶反應、運動性 (motility)、在好氧（aerobic)與厭氧（anaerobic)條件下之生長 情形等試驗（0. Kandler and N. Weiss (1986), Regular, 38 200406216 五、發明說明（36 ) nonsporing Gram-positive rods and Cocci. In: Bergey^ Manual of Systematic Bacteriology. (Sneath, P. H. A., Mair, N. S., Sharpe, Μ. E., and Hotl, J. G., ed.) Vol. II. pp. 1208-1234. The Williams & Wilkins Co·，Baltimore, USA) o (2) API鑑定系統 此鑑定試驗係依據G· Η· Fleet以α/. (I984)，々7/?/· M/croHo/. 48: 1034·1 038，而乳酸菌鑑定係使用 API 50 CHL 套組（法國 API BioMerieux Research laboratory, La Balme Les Grottes，Montalien，Jeraeh，France)，戶斤用之測試項 目為：甘油、赤蘚糖醇（erythritol)、D-阿拉伯糖 (D-arabinose)、L-阿拉伯糖（L-arabinose)、核糖、D-木糖 (D-xylose)、L-木糖（L-xylose)、核糖醇（adonitol)、-甲基-木糖苷（石-methyl-xyloside)、半乳糖（galactose)、D-葡萄糖、 D-果糖（D-fructose)、D-甘露糖（D-mannose)、L-山梨糖 (L-sorbose)、鼠李糖（rhamnose)、衛矛醇（dulcitol)、肌醇 (inositol)、甘露糖醇（mannitol)、山梨糖醇（sorbitol)、α-甲 基甘露糖苷（a -methyl-D-mannoside)、α -甲基-D-葡萄糖 苷（a -methyl-D-glucoside)、Ν-乙醯葡萄糖胺（N-acetyl glucosamine)、苦法仁苷（amygdalin)、熊果甘（arbutine)、七 葉甘（esculin)、水楊甘（salicin)、纖維二糖（cell〇bi〇se)、麥芽 糖（maltose)、乳糖（lactose)、木蜜二糖（meiibi〇se)、蔗糖 (saccharose)、海藻糖（trehalose)、菊糖（inuline)、落葉松糖 (melezitose)、D-植物蜜糖（D-raffinose)、殿粉（amidon)、肝 糖（glycogen)、木糖醇（xylitol)、冷-龍膽二糖（冷

39 200406216 37 五、發明說明 -gentiobiose)、D-松二糖（D-turan0Se)、D-來蘇糖（D-lyxose)、 D-塔格糖（D-tagatose)、D-炭藻糖（D-fucose)、L-炭藻糖 (L-fucose)、D-阿拉伯膠醇（D-arabitol)、L-阿拉伯膠醇 (L-arabitol)、葡萄糖酸（giuc〇nate)、2- _ -葡萄糖酸 (2-keto-gluconate)、-葡萄糖酸（5-keto_gluconate)等 49 種 碳源之產酸試驗。

此系統之操作程序為：以無菌棉棒沾取平板上之菌 落，將之均勻懸浮於2ml之0.85%生理食鹽水中，以滅菌 過之滴管吸取懸浮菌液，置η滴於另一 5ml之0.85%無菌 生理食鹽水中，使其濃度與McFarland No· 2 (由9.8 ml的 1%Ηβ〇4與0.2 ml的l%BaCl2所構成的混合溶液）之標準 液濃度相當。此時另取懸浮菌液，置2n滴於API 50 CHL 培養液之玻璃管中，予以混合均勻後，分別加入適當體積 至每個測試條之孔洞（tubes of the strip)中，並加蓋礦物 油’然後放入培養盒（incubation tray)中（盒内事先加水，俾 ，於培養時培養液不被蒸乾），加上蓋子（incubation lid)後置 於37°C下培養歷時48小時，之後取出判讀。將結果記錄 下來，並與API LAB Software鑑定系統之資料庫（database) 做比對，以鑑定由最適當之屬名與種名。 (3)微生物電腦鑑定系統（Micro-IS System) 此鑑定試驗係依據 M. Rogosa e/ α/ (1971)，Method for coding data on microbial strains for computers (edition AB), Int. J· Syst. Bacteriol· 21:1A-184A，利用 Micro-IS System 之 Matrix 5 [乳桿菌物種印.）適用]，所用之測試項目包 40 200406216 五、發明說明（38) 括··運動性；溫度生長試驗（15°c、45。〇 ;好氧下生長； D-葡萄糖及葡萄糖酸產氣試驗，苦杏仁苷（amygdalin)、L-阿拉伯糖（L-arabinose)、纖維二糖（ceii〇bi〇se)、D·果糖、D-半乳糖、D·葡萄糖、乳糖、麥芽糖<、D-甘露糖醇 (D-mannitol)、D-甘露糖（D-mannose)、落葉松糖（melezitose)、 木蜜二糖（melibiose)、鼠李糖（rhamnose)、L-鼠李糖 (L-rhamnose)、D-核糖、水楊甘（saiicin)、D-山梨糖醇 (D-sorbitol)、庶糖、海藻糖（trehalose)、D-木糖（D-xylose) 等之產酸試驗，七葉甘（esculin)之水解以及精胺酸脫胺作用 (L-arginine deamination)之生長試驗等。將各項試驗之正、 負結果輸入Micro-IS電腦鑑定程式中，即可得到鑑定之屬 名或種名。 (4) 16S rDNA序列分析 此鑑定試驗係依據Rosenblum以“/· (1997)，Wwc/以·〔 Λα·，25: 4500-4504，將新鮮的菌體刮取少許放入1.5 ml微 量離心管中，以蛋白酶K (proteinase K)及核酸核糖酶（RNase) 處理後，利用自旋管柱（spin column)取得基因群DNA (genomic DNA)後，進行聚合酶鏈反應擴增（PCR amplification)，接而純化之。PCR擴增後的產物經電泳確 認後，以 MicroSeq™ 16SrDNA Gene Kit (PE Co.，USA)進行反 應，接而利用 ABI Prism 310 Genetic Analyzer 進行 DNA 序 列分析，再將所得的12條DNA序列以MicroSeq™軟體（PE Co·，USA)來進行分析、整合，可得約1500bp之16S rDNA 序歹1J，然後再與 DNA 資料庫（MicroSeq™ Reference Manual，

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五、發明說明（39) 1999, PECO·，USA)進行比對分析。 二、結果 1.本發明之分離株B21T1 (i) 依初步試驗決果，此分離株為革蘭氏陽性桿菌，不具 過氧化氫酶，無可動性（non-mobile)，於好氧及厭氧條 件下均可生長； (ii) 利用API System之API 50 CHL鑑定套組，所得之測試 結果如表6所示，鑑定分數為91 ·0 (%ID)，鑑定結果 為嗜酸乳桿菌0c/而; (iii) 以微生物電腦鑑定系統（Micro-IS System)進行本案分 離株B21T1之鑑定，所得結果如表7所示，鑑定菌名 為嗜酸乳桿菌，鑑定分數達 0.682 (ID 計分）； (iv) 本案分離株B21T1之16S rDNA序列分析結果如第5 圖所示，將所得序列與DNA資料庫（MicroSeq™ Reference Manual，1999, PE CO·，USA)進行比對，發現本 案分離株B21T1之16S rDNA序列（SEQ ID ΝΟ:1)與 Lactobacillus gaueri [為嗜酸乳桿菌 aczWop/iZ/ws)族群中的1群]之16S rDNA序列相似度最 高（G. Klein α/· (1998)， Microbiology. 41:103-125)； 42 200406216 五，發明說明（40) Λβ$ΑΨ酿{LQC/O. Acidophilus) 1 iL 雜 (GAL) s 雜 (TRE) 75% σ·ί (FRC) 77 % 100% ------------------------------------4^SK弃h Λβ%^酿(卜 ΩαΟΩρ.ί/ορ/ιίίιίΆMiBis^

莖其宗：API 50 OHL ai^(proflle) ：----Μ--- 0 丨 GLY 丨 ERY ore+FRU - MNE ZAG + AMY + ARB INU 丨 MLZ 丨 RAF LFUC 丨 DARL 丨 LARL

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五、發明說明（41 )

Micro-IS 系統 菌株名稱：B21T1、B21T6、C21T1、X21B7、B6T7 —013001運動性 一 017013 生長 15°C + 016059好氣性生長 一 028528葡萄糖酸，氣體 - 0 2 5 1 8 1 L -阿拉伯糖，酸 + 025193 D-果糖，酸 + 025195 D-葡萄糖，酸 + 025213麥芽糖，酸 + 025196 D-甘露糖，酸 + 025214木蜜二糠，酸 - 025 19 1 L-鼠李糖，酸 + 025210水楊甘，酸 + 02521 5蔗糖，酸 -025186 D-木糖，酸 一 006001内孢子 + 017017 生萇 45°C - 024045葡萄糖成為c〇2 + 025203苦杏仁苷，酸 + 025211纖維二糖，酸 + 025194 D-半乳糖，酸 + 025212乳糖，酸 - 026371 D-甘露糖醇，酸 -025217落葉松糖，酸 + 02521 8植物蜜糖，酸 -025 184 D-核糖，酸 - 026374 D·山梨糖醇，酸 + 025216海藻糖，酸 + 028060 L-蘋果酸利用性 **ID計分 **可能性 **最佳可能性.

1 嗜酸乳桿菌 0.68224 2 積乳桿菌（L. v//«//wwj) 0.3 I 76 I 0.0791 10108 0.0791 ΙΟΙ 0.036828671 0.1104860 建議再做的試驗 **成组的數值**單獨的數值 1 024029 (L + )乳酸生成 ！ 依上述之鑑f結果，本案之分離株B21T1最可能為嗜 酸乳桿菌acidophilus)族群中的 B!群 •-Lactobacillus gasseri ° 44 200406216 五、發明說明（42 ) 2.本發明之分離株B21T6 (i) 依初步試驗決果，此分離株為革蘭氏陽性桿菌，不具 過氧化氫酶，無可動性，在好氧及厭氧條件下均可生 長； ’ (ii) 利用API System之API 50 CHL鑑定套組，所得之測 試結果如表8所示，鑑定分數為93.6 (%ID)，鑑定結 果為嗜酸乳桿菌; (iii) 以微生物電腦鑑定系統（Micro-IS System)進行本案分 離株B21T6之鑑定，所得結果如表7所示，鑑定菌名 為嗜酸乳桿菌，鑑定分數達 0.682 (ID 計分）； (iv) 本案分離株B21T6之16S rDNA序列分析結果如第6 圖所示，將所得序列與DNA資料庫（MicroSeqTM Reference Manual，1999, PE CO·，USA)進行比對，發現本 案分離株B21T6之16 S rDNA序列（SEQ ID NO:2)與 gaMer/ [為嗜酸乳桿菌 族群中的Βι群]之16S rDNA序列相似度 最高； (v) 依上述之鑑定綽果，本案之分離株B21T6最可能為嗜 酸乳桿菌族群中的Βι群 --Lactobacillus gasseri ·， 200406216 Φ 五、發明說明（43) Λβ%^0^Ω!ζο· sp.dopsrl^}r D-_嶙雜 (MAL) 75% -------------sss^ --------------------- 4鞒SK莽缺 Λβ%^&^α2ο. acidophilus} Lacto. Delb.delb. M丨窗锔骗 Lacto· Crispatus 0ore ZAG INU LFUn

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GAL 丨 MDG I TRE I DFCO I >8 46 200406216 五、發明說明（44 ) 3.本發明之分離株C21T1 (i) 依初步試驗決果，此分離株為革蘭氏陽性桿菌，不具 過氧化氫酶，無可動性，在好氧及厭氧條件下均可生 長； < (ii) 利用API System之API 50 CHL鑑定套組，所得之測 試結果如表9所示，鑑定分數為95.6 (%ID)，鑑定結 果為嗜酸乳桿菌; (iii) 以微生物電腦鑑定系統（Micro-IS System)進行本案分 離株C21T1菌株之鑑定，所得結果如表7所示，鐘定 菌名為嗜酸乳桿菌，鑑定分 數達0·682 (ID計分）； (iv) 本案分離株C21T1之16S rDNA序列分析結果如第7 圖所示，將所得序列與DNA資料庫（MicroSeq*m Reference Manual，1999, PE CO·，USA)進行比對，發現本 案分離株C21T1之16S rDNA序列（SEQ ID NO:3)與 gauerz·[為嗜酸乳桿菌 ac/心尸/π7μ)族群中的Bi群]之16S rDNA序列相似度 最南， (v) 依上述之鑑定結果，本案分離株C21T1最可能為嗜酸 乳桿菌acidophilus)族群中的 Βι 群 —Lactobacillus gasseri 〇

47 200406216 五、發明說明（45) ^^%^m(Laco· acidophilus) 1 : + (gal) 75% (TRE) 77% D.nt鰣雜 (MNE) 96% ...........................IΘ猙SK莽；g A^^^Bt(Lacto. acidophi/us) M 丨盒1¾¾ Lacto. crispatus

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GAL I MDG I TRE I DFUC I >9 + 48 200406216 五、發明說明（46) 4.本發明之分離株X21B7 (i) 依初步試驗決果，此分離株為革蘭氏陽性桿菌，不具 過氧化氫酶，無可動性，在好氧及厭氧條件下均可生 長； (ii) 利用API System之API 50 CHL鑑定套組，所得之測 ^式結果如表10所示，鑑定分數為94.3 (%ID)，鑑定結 果為嗜酸乳桿菌; (iii) 以微生物電腦鑑定系統（Micro-IS System)進行本案分 離株X21B7之鑑定，所得結果如表7所示，鑑定菌名 為嗜酸乳桿菌，鑑定分數達 0.682 (ID 計分）； (iv) 本案分離株X21B7之16S rDNA序列分析結果如第8 圖所示，將所得序列與DNA資料庫（MicroSeq™ Reference Manual，1999, PE CO·，USA)進行比對，發現本 案分離株X21B7之16S rDNA序列（SEQ ID NO:4)與 gwser/ [為嗜酸乳桿菌 族群中的Βι群]之16S rDNA序列相似度 最南， (v) 依上述之鑑定綽果，本案分離株X21B7最可能為嗜酸 乳桿菌acidophilus)族群中的 Βι 群 --Lactobacillus gasseri。 49 200406216 五、發明說明（47) Λβ⑽一&(卜 ono· Rs:ophi!us} (iE) 96% SM (TRE) 77% ...................ssi ------------------------------ I4st%^酿(LQCO. acidophilus) 1 Tisii% 讲CHx^mipesrococcus Dafmlosus) 2 20 0.43 94.3 % Id. P65

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GAr MDG TRE DFUC + 50 200406216 五、發明說明（48) 5.本發明之分離株B38T38 (i) 依初步試驗決果，此分離株為革蘭氏陽性桿菌，不具 過氧化氫酶，無可動性，在好氧及厭氧條件下均可生 長； ， (ii) 利用API System之API 50 CHL鑑定套組，所得之測 試結果如表11所示，鑑定分數為90.8 (%ID)，鑑定結 果為嗜酸乳桿菌; (iii) 以微生物電腦鑑定系統（Micro-IS System)進行本案分 離株B38T38菌株之鑑定，所得結果如表12所示，鑑 定菌名為嗜酸乳桿菌，鑑定 分數達0.646 (ID計分）； (iv) 本案分離株B3 8T38之16S rDNA序列分析結果如第9 圖所示，將所得序列與DNA資料庫（MicroSeq™ Reference Manual，1999, PE CO.，USA)進行比對，發現本 案分離株B38T38之16S rDNA序列（SEQ ID NO:5)與 gauer/ [為嗜酸乳桿菌 族群中的Bi群]之16S rDNA序列相似度 最向； (v) 依上述之鑑定轉果，本案分離株B38T38最可能為嗜 酸乳桿菌族群中的Bi群 --Lactobacillus gasseri。 51 200406216 五、發明說明（49) Λβ$ΑΨ0{ιααο. acidophilus) 0 -------------sss ...............-........................... %Id· Λβ^^&^οηβ snopsr^s1 90.8 Tl®is 骗 Lactp delb.lactis 2 6.2

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GAL MDG THE + + 52 200406216 五、發明說明（50) 表12

Micro-IS 系統 菌株名稱：B38T38 一 013001 運動性 一 006001 内孢子 一 017013 生長15°C + 017017 生長45t： + 016059 好氣性生長 一 024045 葡萄糖成為C02 一 028528 葡萄糖酸，氣體 + 025203 苦杏仁苷，酸 - 025181 L-阿拉伯糖，酸 + 025211 纖維二糖，酸 + 025193 D-果糖，酸 + 025194 D-半乳糖，酸 + 025195 D-葡萄糖，酸 + 025212 乳糖，酸 4* 025213 麥芽糖，酸 一 026371 D-甘露糖醇，酸 + 025196 D-甘露糖，酸 + 025217 落葉松糖，酸 + 025214 木蜜二糖，酸 + 025218 植物蜜糖，酸 - 025191 L-鼠李糖，酸 一 025184 D-核糖，酸 + 025210 水楊甘，酸 — 026374 D-山梨糖醇，酸 + 025215 蔗糖，酸 + 025216 海藻糖，酸 一 025186 D-木糖，酸 — 028060 L-蘋果酸利用性 *檢驗* **ID計分 1 L. delbrueckll ssp lactis 0.64607 2 嗜酸乳桿菌 0.35240 **可能性 **最佳可能性 0.145038024 0.4351140 0.079110108 0.0791101 建議再做的試驗 **成組的數值**單獨的數值 1 024029 (L+)乳酸生成 2 2 029268 L-精胺酸脫胺作用 2

53 發明說明（51 ) 6·本發明之分離株B6T7 (1) 依初步試驗決果，此分離株為革蘭氏陽性桿菌，不具 過氧化氫酶，無可動性，在好氧及厭氧條件下均可生 長； < (U)利用API System之API 50 CHL鑑定套組，所得之測 試結果如表13所示，鑑定分數為92.4 (%ID)，鑑定結 果為植物乳桿菌（Lacic^ac/7/w ;?/⑽〇 (出）以微生物電腦鑑定系統（Micro-IS System)進行本案分 離株B6T7之鑑定，所得結果如表7所示，鑑定菌名 為嗜酸乳桿菌，鑑定分數達 0.682 (ID 計分）； (iv)本案之分離株B6T7之16S rDNA序列分析結果如第 10圖所示。由於在API 50 CHL鑑定套組所的之結果 與Micro-IS System鑑定系統所得結果分別為乳桿菌 屬中的植物乳桿菌 plantarum)$^v養酸乳得菌（Lactobacillus acidophilus)， 故將本案分離株B6T7所得之16S rDNA序列（SEQ ID NO:6)，與嗜酸乳桿菌之 DNA 序列、（gEQ ID NO:7)以及植物乳桿菌 ⑽iarwm)之 DNA 序列（SEQ ID ΝΟ··8) 進行比對，發現本案分離株B6T7之16S rDNA序列與 嗜酸乳桿菌之 16S rDNA 序 列相似度最高，而與植物乳桿菌（Z^ciokcz_//w 之16S rDNA序列相差甚大； 200406216 五、發明說明（52 ) ii^A4-\uf® (卜 Qc/O. p/§/al) D_t樂鑲a (SPR) 75%cv濉49SC) 99% (Με) 92 % -------------ssi ......................^^s®茶h 碎芽％^酿{Laco. plantarum) ^^Al-\L^K(t>g/o. §//να/‘δ·5) INU 丨 MLZ 丨 RAF rFUO I DARr丨rAur

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五、發明說明（53) ♦ (v)依上述之鑑定結果，本案分離株B6T7最可能為嗜酸 乳得镜[Lactobacillus acidophilus)。 綜合以上鑑定結果，本發明所篩選之6株分離株皆屬 於嗜酸乳桿菌株，其中B6T7為嗜酸乳桿..菌 acidophilus)^ ^ B21T1 ^ B21T6 ^ C21T1 ^ X2 1B7 A B38T38 為其 Bi 群的 gwwr。 參見表14,當與習知專利案以及文獻中所揭示的乳桿 菌菌株相比較，本發明所得之乳桿菌分離株不但可在含 0.3%膽鹽環境下生長，在pH 2之酸性環境下培養2小時 後具有較高的存活率，具有良好降低膽固醇作用，且同時 對膽固醇具有共沈澱作用及同化作用。由是顯見，本案之 分離株及其繼代培養之後代會是優良的益生菌（probiotic bacteria)，而能供用於製備諸如飲料、糕點、嬰兒食品、 發酵乳、營養補充品、動物飼料等之食用品，還有用於製 備治療與預防腸·胃疾病以及降低血清膽固醇用的藥學組成 物。 舉例而言，可以參照US 5,516,684所揭示的參考例1 (Referential Example 1)與參考例2，將本發明所得之乳桿 菌分離株拿來製邊乳酸飲料（lactic acid beverage)以及發酵 乳飲料（yogurt drink)。 56 200406216 五、發明說明（54) 表14.金f明的分離株與被揭示於前案專利及文獻中的已知菌 株的比較 菌株 分離源 特徵 專利/文獻 嗜酸乳桿菌（/·. 人類 1.耐膽鹽 US 4839281 acidophilus) GG (ATCC 53 103) 可生長於含0.1 5%膽汁酸之環境中 2. 耐酸 在PH 5環境中，可生長至1〇9 CFU 在PH 3環境中，可生長至l〇7<CFU 在pH 2.5的胃汁中30分錢後，® k減少2 個log值以内 在pH 1〜2/2 hr後，菌數殘存103 CFU 3. 降膽固醇 可降低人類直便中膽固醇的排泄量 US 5032399 嗜酸乳桿菌 公豬 1·降膽固醇 Danielson " U. acidophilus) LA16 可降低血清膽固酵60% (於含0.4%牛膽汁 及10 mg膽固醇系統中） 動物試驗，餵食56天後，血清膽固醇可降 低10.5%，LDL-膽固酵含量可降低9% (註：LA 1 6 為"f 酸乳桿菌（乙. DDS-1 (人類來源）製成之酸酪乳餵食豬隻 後，再由豬糞中所分離出具有降膽固酵能 力之菌株） al., 1989 嗜酸乳桿菌 豬 1.耐膽鹽 Gilliland (L. 0.3%牛膽汁下分別生長2.93及7.4小時， and Walker, acidophilus) ATCC 43121 ATCC 4356 人類 菌體濃度（〇D620nm)可增加0.3單位 2.降膽固醇 可降低血清膽固醇55.4%及12.9% (於含 0.3%牛膽汁及0.1% PPLO系統中培養14 小時後） 1990 L. gasseri 人類 1.耐膽鹽 Usman and SBT 0274 可在含0.3%牛膽汁環境中生長 Hosono, SBT 0270 2. 耐酸 在pH 2.5，3 7°C /3 h，菌數下降2個log值 在pH 1.5，37°C /2 h，菌數下降4〜5個log 值 3. 降膽固醇 在含0.3 %牛膽汁及1〇〇 Pg贍固酵微胞/ml 系統中培養20小時後’可分別降低膽固醇 含量47 %及36 % 1999 L, gasseri 徤康幼 1.耐膽鹽 本發明菌株 B21TI B21T6 C21T1 兒 在含0.3 %牛膽汁下生長24 h，g株殘存量 達80%，即菌數減少0.5〜2個log值 2.耐酸 X21B7 B38T38 嗜酸乳桿菌 u. acidophilus) B6T7 在pH 2，37°C /2 hr處理菌數減少3〜4個 •Mog 值（0.85 % NaCl/0.01 N HC1 系統） 3.降膽固醇 在含0.3 %牛膽汁及12%馬血清之MRS肉 湯培養基系統中，厭氧培養24 hr，可降低 膽固醇含量達93%以上 在含0.3%牛膽汁及12%膽固醇微胞之MRS 肉湯培養基系統中’厭氧培養24hr，可降 低膽固酵含量達25-45% 對膽固酵吸附同化效果達12〜40% 註：ATCC 43121= CCRC 17064 ATCC 4356 = CCRC 10695 PPLO (BACT PPLO SERUM FRACTION)係由 DIFCO LABORARORIES所出品，目前 已經停產 57 200406216

五、發明說明（5S) 於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併 入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明（包含 界定在内）將佔上風。 雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地 在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變 化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範 圍所示者之限制。 本發明的6個乳桿菌分離株已於西元2002年6月18 曰寄存於食品工業發展研究所的「生物資源保存及研究中 心」（BCRC，簡稱生資中心）][註：該中心之舊名為菌種保 存中心（CCRC)，已於九十一年元月公告更名](中華民國台 灣省300新竹市食品路331號），寄存編號分別為：

Lactobacillus gasseri B21T1 Lactobacillus gasseri B21T6 Lactobacillus gasseri C21T1 Lactobacillus gasseri X21B7 Lactobacillus gasseri B38T38 嗜酸乳桿菌 CCRC 910195 CCRC 910196 CCRC 910198 CCRC 910199 CCRC 910197 CCRC 910194 此等分離株亦有依據布達佩斯條約之規定，於西元 2002年6月21日被寄存於美國類型培養物收集中心（ATCC， P.O. Box 1549, Manassas，VA 20108, USA)，寄存編號分別為：

Lactobacillus gasseri B21T1 Lactobacillus gasseri B21T6 Lactobacillus gasseri C21T1 Lactobacillus gasseri X21B7 Lactobacillus gasseri B38T38 今後乳桿菌（LcictobaciHus acidophi!us)B6T7 PTA-4483 PTA-4484 PTA-4479 PTA-4480 PTA-4481 PTA-4482 58 200406216 五、發明說明（56) 序列表 <110>劉玉茹 游金珠 譚靜芬 ϋ 廖啓成 k < 120 >具有降低與同化膽固醇能力的新穎耐酸與耐膽鹽乳桿菌 分離株 <160〉8 <170> Microsoft Word 2000 <210> 1 <211 > 500 <212> DNA <213> Lactobacillus gasseri B21T1 <220> <223〉16S ribosomal DNA <400> 1 u caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagcttg cctagatgaa 60 tttggtgctt gcaccaaatg aaactagata caagcgagcg gcggacgggt gagtaacacg 120 tgggtaacct gcccaagaga ctgggataac acctggaaac agatgctaat accggataac 180 aacactagac gcatgtctag agtttaaaag atggttctgc tatcactctt ggatggacct 240 gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcaatgatgc atagccgagt 300 tgagagactg atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc 360 agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa 420 gggt-ttcggc tcgtaaagct ctgttggtag tgaagaaaga tagaggtagt aactggcctt 480 tatttgacgg taattactta 500 59 200406216

五、發明說明（57) <210> 2 ， <211 > 500 <212〉DNA <213> Lactobacillus gasseri B21T6 <220> <223> 16S ribosomal DNA <400> 2 60 120 180 240 300 360 420 480 500 <210> 3 <211 > 500 <212> DNA <213> Lactobacillus gasseri C21T1 <220> <223> 16S ribosomal DNA <400> 3 caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagcttg cctagatgaa tttggtgctt gcaccaaatg aaactagata caagcgagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcccaagaga ctgggataac acctggaaac agatgctaat accggataac aacactagac gcatgtctag agtttaaaag atggttctgc tatcactctt ggatggacct gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcaatgatgc atagccgagt tgagagactg atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaagct ctgttggtag tgaagaaaga tagaggtagt aactggcctt tatttgacgg taattactta 60 200406216 五、發明說明（58) caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagcttg cctagatgaa tttggtgctt gcaccaaatg aaactagata caagcgagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcccaagaga ctgggataac acctggaaac agatgctaat accggataac aacactagac gcatgtctag agtttaaaag atggttctgc tatcactctt ggajtggacct gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcaatgatgc atagccgagt tgagagactg atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaagct ctgttggtag tgaagaaaga tagaggtagt aactggcctt tatttgacgg taattactta 60 120 180 240 300 360 420 480 500 <210> 4 <211 > 500 <212〉DNA <213> Lactobacillus gasseri X21B7 <220> <223> 16S ribosomal DNA <400> 4 caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagcttg cctagatgat tttggtgctt gcactaaatg aaactagata caagcgagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcccaagaga ctgggataac acctggaaac agatgctaat accggataac aacactagac gcatgtctag agtttgaaag atggttctgc tatcactctt ggatggacct gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcaatgatgc atagccgagt tgagagactg atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc 60 120 180 -240 300 360 61 200406216

五、發明說明（59) agtagggaat cttccacaat ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa 420 gggtttcggc tcgtaaagct ctgttggtag tgaagaaaga tagaggtagt aactggcctt 480 tatttgacgg taattactta 500 <210> 5 <211 > 500 <212> DNA <213> Lactobacillus gasseri B38T38 <220> <223> 16S ribosomal DNA <400> 5 caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagcttg cctagatgaa 60 tttggtgctt gcaccaaatg aaactagata caagcgagcg gcggacgggt gagtaacacg 120 tgggtaacct gcccaagaga ctgggataac acctggaaac agatgctaat accggataac 180 aacactagac gcatgtctag agtttaaaag atggttctgc tatcactctt ggatggacct 240 gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcaatgatgc atagccgagt 300 tgagagactg atcggccaca t tgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc 360 agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa 420 gggtttcggc tcgtaaagct ctgttggtag tgaagaaaga tagaggtagt aactggcctt 480 tatttgacgg taattactta 500 <210> 6 <211 > 480 <212> DNA <213> Lactobacillus acidophilus B6T7 <220> 62 200406216 五、發明說明（60) <223> 16S ribosomal DNA <400〉6 cagacgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcgacctgaa ccaacagatt cacttcggtg atgacgttgg gaacgcgagc ggcggatggg tgagtaacac gtggggaccc tgccccatag tctgggatac cacttggaaa caggtgcaat accggataag aaagcagatg ccatgatcag cttataaaag gcggcgtaag ctgtcgctat gggatggccc cgcggtgcat tagctagttg gtagggtaac ggcctaccaa ggcaatgatg catagccgag tttgagagac tgatccggcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggg caagcagtag ggaatcctcc acaatggacc aaagtcctga tggagcaacg ccccgtgagt tgaagaagtt ttcggatcgt aaagccctgt tgttggtgaa gaaggataga ggtaagaact ggcctttatt 60 120 180 240 300 360 420 480 <210> 7 <211〉480 <212> DNA <213> Lactobacillus acidophilus <220> <223> 16S ribosomal DNA <400> 7 caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgagctga accaacagat tcacttcggt gatgcagttg ggaacgcgag cggcggatgg gtgagtaaca cgtggggaac ctgccccata gtctgggata ccacttggaa acaggtgcaa taccggataa gaaagcagat gccatgatca gcttataaaa ggcggcgtaa gctgtcgcta tgggatggcc ccgcggtgca ttagctagtt ggtagggtaa cggcctacca aggcaatgat gcatagccga gttgagagac 60 120 180 240 300 63 200406216

五、發明說明（61 ) tgatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt ggtgaagaag gatagaggta gtaactggcc tttatttgac <210> 8 <211 > 480 <212〉DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <223> 16S ribosomal DNA <400> 8 caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg aacgaactct ggtattgatt ggtgcttgca tcatgattta catttgagtg agtggcgaaa tggtgagtaa cavgtgggaa acctgcccag aagcggggga taacacctgg aaacagatgc taataccgca taacaacttg gaccgcatgg tccgagttga aagatggctt cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag atgctggggt aacggctcac catggcaatg atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa aactctgttg ttaaagaaga acatatctga gagtaactgt tcaggtattg 360 420 480 60 120 180 240 300 360 420 480 64

Claims (1)

1. 200406216 六、申請專利範圍 1· 一種乳桿菌物種π.)之分離株，其菌學特 徵（bacteriological characteristics)相同於 gc/5^er/B21Tl所具者，該被寄 存於食品工業發展研究所，寄存編號為CCRC 910195， 以及寄存於美國類型培養物收集中心（ATCC，P.O. Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)，寄存編號為 ATCC PTA-4483 ° 2. 一種乳桿菌物種印.）之分離株，其菌學特 徵相同於 gaaerz· B21T6 所具者，該 gaaerz· B21T6被寄存於食品工業發展研究 所，寄存編號為CCRC 910196，以及被寄存於美國類型 培養物收集中心，寄存編號為ATCCPTA-4484。 3. —種乳桿菌物種51；?·)之分離株，其菌學特 徵相同於 gauerz· C21T1 所具者，該 gwwrz· C21T1被寄存於食品工業發展研究 所，寄存編號為CCRC 910198，以及被寄存於美國類型 培養物收集中心，寄存編號為ATCC PTA-4479。 4. 一種乳桿菌物種（Ιπίί>6ύΤί：/7/ι^ 之分離株，其菌學特 徵相同於以gauerz· Χ21Β7所具者，該 gwwW X21B7被寄存於食品工業發展研究 所，寄存編號為CCRC 910199，以及被寄存於美國類型 培養物收集中心，寄存編號為ATCCPTA-4480。 5 . 一種乳桿菌物種5^·)之分離株，其菌學特 徵相同於 gwwrz· B38T38 所具者，該 65 200406216

   六、申請專利範圍 Ζαοω心c，7/w gauerz· B38T38被寄存於食品工業發展研 究所，寄存編號為CCRC 910197，以及被寄存於美國類 型培養物收集中心，寄存編號為ATCC PTA-4481。 ^ 6· —種乳桿菌物種)之分離株，其菌學特 徵相同於嗜酸乳桿菌ad/心;7/ζζ·/μ) Β6Τ7所 具者’該嗜酸乳桿菌（ZacMkc/Z/ws ac/^/c^/n7w*y) Β6Τ7被 寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為CCRC 910194,以及被寄存於美國類型培養物收集中心，寄存 編號為 ATCC PTA-4482。 7· —種食品產品，其包含有一可食性材料與一如申請專 利範圍第1至6項中任一項之乳桿菌物種 印·）分離株或其繼代培養後代或由此等所衍生出的突 變株。 “ 8·如申請專利範圍第7項之食品產品，其進一步包含至少 一種選自於下列群組中的益生性生物：乳桿菌屬物 種，如嗜酸乳桿菌aczWop/z/Vws)、乳酸乳桿 窗（Lactobacillus lactis)、短乳得菌（Lactobacillus brevis)、 乳S各乳桿菌c似ez·)、植物乳桿菌 (Lactobacillus。pjantarum)、嗜液 Ί 得镜（Lactobacillus •sa/Zvar/ws)、雙歧乳桿菌、保加利 亞乳桿菌（ZacMkc/V/ws ftw/gar/cw)、高加索乳桿菌 {Lactobacillus cawsw/cws)以及鼠李糖乳桿菌 ;鏈球菌屬物種，如嗜熱鍵球 菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸鏈球菌 66 200406216

   申請專利範圍 (&re；m>c〇c:c w /以山）；酵母菌，如念珠菌屬物種c⑽山·而 心加、弗羅稜酵母菌（心声j ”⑽⑽·聰）；戈此 寻囷種之組合。

   9·如申請專利範圍第7項之食品產品，其中該可食性材料 係選自於下列群組：流體乳品（牛奶、濃縮牛奶），發酵 乳品（優酪乳、酸乳，、冷凍優格、乳酸菌發酵飲料），奶 粉，冰淇淋，乳酪，乾酪，豆奶與發酵豆奶，蔬果汁、 果汁及運動飲料等飲料，甜點，糖果，嬰兒食品，食 療產品，動物飼料，以及膳食補充品。 10·如申請專利範圍第7項之食品產品，其被製造成為即溶 沖泡食品。 U·種藥學組成物，其包含有一益生性有效數量之一如 申明專利範圍第丨至6項中任一項之乳桿菌物種 印.）分離株或其繼代培養後代或由此等所 衍生出的突變株。

   12.如申請專利範圍第1〇項之藥學組成物，其中該組成物 被配製成一選自於下列群組中之供用於口服投藥的形 式：溶液、乳劑、粉末、錠劑以及膠囊。 13·如申請，專利範固第10項之藥學組成物，其中該組成物 被製作為消化整腸藥劑。 14·如申請專利範圍第10項之藥學組成物，其中該組成物 被製作為用以降低血清膽固醇的藥品。

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