TW200303212A - Selection of poultry eimeria strains through extra-intestinal sporozoites - Google Patents
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Description
200303212 玖、發明說明 (發明說明應敘明：發明所屬之技術領域、先前技術、內容、實施方式及圖式簡單說明) (一） 發明所屬之技術領域 本發明係關於一種家禽疫苗，更具體而言，係關於一種 抗球蟲病之新穎疫苗。本發明亦係關於最新產生之具強免 疫原性質及低病原性之艾美球蟲種（Eimeria )株，其對於 產生抗球蟲疫苗之卵囊是有用的，此外，本發明係關於一 種獲得艾美球蟲種減毒株之新穎方法，其在調配抗球蟲病 之疫苗上是有用的。 (二） 先前技術 球蟲病是一種由數種球蟲中之一或多種球蟲所引起之禽 類疾病，爲端複胞器亞門之艾美屬球蟲之細胞內原蟲寄生 蟲，球蟲病已知爲由數種不同艾美球蟲種，即堆型艾美球 蟲巨型艾美球蟲柔 嫩艾美球蟲（_£· 毒害愛美球蟲（£. 布 氏艾美球蟲（jE · Z? r t/ w e / / 〇、和緩艾美球蟲（£ . m / n· s )、早 熟艾美球蟲（五.)，及可能有變位艾美球蟲（五· m z’ v a / / )及哈氏艾美球蟲（£； · /2 β g β w )所引起，這些種類在 鳥類上之病原性效果確實不同，且鳥類品種亦扮演一個角 色。因此，肉雞將易遭受由寄生蟲如堆型艾美球蟲所引起 之大量傷害，因爲其感染小腸之大部分區域，其中食物消 化扮演主要角色。 在整個生活循環間，艾美球蟲寄生蟲具有數種階段，在 200303212 磨碎食物及藉由吸入塵土時，雛雞消化感染階段之球蟲， 已知爲芽胞化卵囊，其生活循環開始，在砂囊及腸道中由 於機械作用使芽胞化卵囊壁破裂，造成4個胞子囊 (sporocyst )釋出，此胞子囊通過至十二指腸，而在此處 暴露於膽汁及消化酵素中，造成每個胞子囊平均有2個子 孢子（sporozoite)之釋出。 胞子蟲爲可動的，且爲了穿透並在其中生殖而會尋找適 合的宿主上皮細胞，隨著上皮細胞感染，寄生蟲會進入生 命循環之裂殖體（schizont)期，每個裂殖體可產生8至16 個至多於200個之裂殖子（merozoite)，一旦由裂殖體釋放 出來，裂殖子則可自由的進一步感染上皮。由2至5個此 種無性生殖循環後，細胞內裂殖子生長進入有性形式，即 所知之雌性或大配子體（macrogametocyte )及雄性或小配 子體（microgametocyte)，隨後大配子體經由自小配子體釋 放出來之小配子（m i c r 〇 g a m e t e )之受精，形成合子 (zygote )，其會製造環繞其周圍之囊壁，新形成之卵囊會 隨著糞便通過此感染雛雞。 在溫度及溼度之適當環境條件及在空氣中之充足氧氣 下，卵囊將芽胞化而進入感染階段，準備感染新宿主藉以 散播疾病，因此，寄生蟲在鳥類間之移轉不需中間宿主。 艾美球蟲寄生蟲感染鳥消化道之結果可能爲增重減少、 飼料轉換率降低、停止產蛋，以及在一些情況中會死亡。 家禽密集生產之增加已由於此寄生蟲而伴隨嚴重損失，估 200303212 計在美國及歐洲之損失每年超過數十億美金。 數種嘗試現已被用來控制球蟲病，在化學治療劑出現之 前，使用消毒劑與機械移除墊料一起來改良公共衛生，爲 主要使用之方法，此外，在飼料及飮水中加入抑球蟲劑 (c 〇 c c i d i 〇 s t a t i c a g e n t s )，伴隨良好管理實行，在疾病控制 上已有一些成功，然而，經過這些年後發現一些製劑已減 低有效性，此部分是由於球蟲抗藥性株之產生，此外，已 發現數種化學治療劑在經濟鳥類之肉中會造成殘留，因此 通常使其不適於消費。 控制此疾病之其它嘗試已由免疫學地製造，此等已包括 活疫苗之發展及基因工程之運用以調配疫苗，許多此等努 力已集中在艾美球蟲蛋白質作爲疫苗活性成分之使用，例 如，Tomley等人在U.S.專利案第5,885,568號及6,001，363 號提出具免疫原性特質之艾美球蟲蛋白質，以及編碼此等 蛋白質之DNA序列，相似方法陳述於Kok等人之U.S.專利 案6,1 0 0,24 1號。一種具有特定核酸序列之DNA分子陳述 於 Andrews 等人之 U.S·專利案 4,874,7 05 及 5，1 8 7,0 8 0 號， 而Mewman等人之U.S.專利案5,02 8,6 9 4號描述一種能夠在 雞中產生抗毒害愛美球蟲或柔嫩艾美球蟲之免疫反應之經 純化抗原蛋白質。抗球蟲病之疫苗亦描述於Brown等人之 U · S .專利案 6，0 1 9，9 8 5 號。 在此項技藝中現所需之一種新抗球蟲病疫苗爲安全的、 有效的、容易施予的及價錢經濟實用的，亦需者爲艾美球 200303212 蟲種之新株，其可用來激發家禽中之免疫反應，因而提供 作爲疫苗之適當卵囊，進一步所需者爲艾美球蟲新減毒株 之方法，因而其可被利用於疫苗發展，此項技藝進一步需 要具卵囊之艾美球蟲株之產生，當倂入疫苗中時，可交叉 保護對抗較廣的艾美球蟲種樣本。 (三）發明內容 發明摘述 因此本發明之目標係提供一種經分離之艾美球蟲株，其 在產生對抗球蟲病疫苗之卵囊上是有用的。 本發明之一部分亦提供在家禽有效對抗球蟲病之疫苗， 其包含每劑量中至少約1 〇4個卵囊之減毒艾美球蟲，與醫藥 上可接受的載體一起。 進一步提供接種家禽抗球蟲病之方法，其包含給予該家 禽至少約1 〇4個之由減毒堆型艾美球蟲而來的卵囊。 本發明亦提供一種獲得免疫原性艾美球蟲株之方法，在 生產作爲抗家禽球蟲病之疫苗之卵囊上是有用的，其包含 下列循環：a)以由艾美球蟲而來之卵囊感染至少一種無特定 病原供給鳥；b)收集供給鳥之血液；c)以由供給鳥而來之 血液感染至少一種第二無特定性病原鳥；d)收集自第二鳥 的卵囊；且〇增殖此卵囊以實質地完成此循環。然後使用 次步驟e所增殖的卵囊，重複此循環至少超過2次（總共至 少3次）。 本發明之進一步方面，爲減毒一或多株艾美球蟲之方 200303212 法，其包含經由至少三組無特定性病原家禽成功繼代蟲 株’其中每一繼代包含至少兩個連續接種組。 本發明亦提供另一減毒堆型艾美球蟲之方法，其包含下 列循環： a) 以由具毒力的堆型乂美球蟲所產生之卵囊接種至少一個 第一組無特定性病原供給鳥； b) 經由接種後約3至約6小時時放血，自第一組供給鳥收 集血液； Ο以所得到的血液接種至少一個第二組無特定性病原供給 鳥； d) 自第二組鳥收集卵囊；且 e) 增殖卵囊以因而實質完成此循環；且然後使用由次步驟 e)所增殖之卵囊重複此循環，其中約完成3次循環。 除了前述者外，本發明亦提供由艾美球蟲種而來之卵 囊，特別是堆型艾美球蟲，其中堆型艾美球蟲已經由約通 過無特定性病原家禽之3次循環之繼代而減毒。 在本發明之進一步具體實施例中，其提供一株具有堆型 艾美球蟲之免疫原性特徵之艾美球蟲，該堆型艾美球蟲以 編號爲 02010911 號寄存於 European Collection of Cell C u 11 u ι· e 中。 亦提供者爲一種疫苗’該具有抗球蟲病疫苗抗原反應特 性之疫苗’含有自寄存於European Collection of Cell Culture之編號02010911號之堆型艾美球蟲株所獲得具免 200303212 疫生成量之卵囊。 由下列本發明所給予之較佳具體實施例之詳細說明，將 使前述及本發明之其它特徵和優點成爲更明顯。 較佳具體實施例之詳細說明 本發明預計將在此描述之所有具體實施例運用在所有家 禽類’如在此所使用「家禽」之詞，將指作爲蛋或肉類來 源之被馴養鳥類，且應包括（但不限於）例如商業上重要 的種類如雞、鴨、鵝、珍珠雞、雉雞、鴿子、孔雀、矮腳 雞（本丹種，bantam fowl)等。 「免疫原性」及「抗原性」之詞亦將交替使用，且將指 一或多個全部有機體或其片段，包括蛋白質、多生肽、或 胺基酸片段，其在動物如家禽中誘導或激發免疫反應上是 有用的，在此項技藝中彼等熟習此藝者將看出免疫反應通 常經由已暴露於特定免疫原株之宿主中之抗體產生及/或細 胞免疫而被承認。 在一具體實施例中，本發明係關於一種獲得適合於生產 在抗球蟲病疫苗中使用的卵囊之免疫原株的方法，此方法 涉及一種艾美球蟲通過供給家禽樣品至少3次循環或繼代 以獲得具有適當免疫原之減毒株，如此可運用此方法對艾 美球蟲株減毒，於是疫苗發展期間，在生產卵囊上則可容 易且有效地製作。 在第一循環中，此方法涉及以一數量之自艾美球蟲種之 卵囊接種無特定性病原（SPF )之供給家禽樣本，較佳爲一 200303212 或多隻供給雞，較佳地，此種爲艾美球蟲之毒力種’可在 宿主家禽中產生循環的子孢子，而更佳者爲堆型艾美球 蟲。家禽之每單位暴露劑量，例如一隻鳥，其範圍在約1 〇6 至約1 〇8個卵囊，且較佳爲約1 X 1 〇7個卵囊，較佳地此卵囊 在接種之前使用此項技藝中可取得之方法先芽胞化。供給 家禽樣本之數量可稍微變化，但通常在約3至1 5隻雞之範 圍間，較佳爲約3至約1 2隻雞，以年輕的、孵化後的雛雞 或小雞爲較佳。 之後，將至少一些供給小雞放血，較佳爲接種後（P . i.) 約3小時至約6小時，更佳爲在約3小時p · i ·時，然後將自 此等供給小雞所收集之血液用來接種，較佳爲口服給予至 另一群SPF家禽樣本之嗉囊中。然後自已接種血液樣品之 鳥群中收集卵囊，此等卵囊較佳係由感染鳥的糞便中收 集，然後將由此所收集的卵囊於另一組SPF家禽樣本中增 殖（當在此項技藝中使用「增殖」之詞時，爲增加可用的 卵囊之質及/或濃度）。之後，由此等受感染樣本收集糞便並 自糞便分離出卵囊，此步驟可完成第一繼代或循環，依序 將此等卵囊，然而較佳地用於隨後的循環以進一步繼代寄 生蟲。 如此繼代或循環可包含下列次步驟： 1)以芽胞化卵囊接種血液給與鳥； 2 )自給卞鳥收集血液樣品， 3 )以獲自給予鳥之血液接種乾淨的鳥； -12- 200303212 4)自接種血液樣品的鳥中收集卵囊； 5 )增殖並收集卵囊以用於進一步繼代或循環。 在第二次循環中，然後使用自上述第一循環增殖並收集 之糞便中所發現之卵囊來接種另一組S P F家禽樣本，卵囊 應當爲芽胞化的。在較佳具體實施例中，其劑量程度會高 於上面第一循環，因此在第二循環使用應當爲約1 X 1 07至 約3 X 1 07個由第一循環所獲得的卵囊來作初使接種於血液 供給鳥，較佳地，使用每劑約2 X 1 07卵囊或約在第一循環 中所使用每劑卵囊數量之兩倍，之後，在第二循環之SPF 家禽中重複上述次步驟2)至5)。 在第三循環，自第二循環之後感染家禽之糞便樣本收集 卵囊，將其用於接種至少一個第三組SPF家禽，則總共三 次（3 X )繼代了特定艾美球蟲株。在第三循環開始時，應 當爲約1 X 1 0 7至約3 X 1 0 7個由第二循環所獲得的卵囊來作 初使接種於血液供給鳥，較佳地，使用每劑約2 X 1 07卵囊 或約在第二循環中所使用每劑卵囊數量之兩倍，之後，在 第三循環之SPF家禽中重複上述次步驟2)至5)。 彼等熟習此藝者可考慮通過額外的s P F家禽組之艾美球 蟲株卵囊之額外的循環或繼代，申請者已發現利用如上所 述之總共約3次繼代或循環者爲較佳。 然後由上述三循環步驟後分離堆型艾美球蟲最終株，其 較佳地如其結果已被減毒，此蟲株獲自一或多隻在第三循 環完成時之接種鳥，使用在此項技藝中可使用的分離步驟 -13- 200303212 而獲得此蟲株，然後可使用此株作爲抗原。 了疫苗，將 此株接種至另一組S P F家禽以生產卵囊，藉由暴露於此株 之家禽糞便來收穫卵囊爲較佳獲得之卵囊，若希望時，其 亦可自血液獲得。 現已分離出堆型艾美球蟲之較佳株且鑑定爲A3 C2A2 株，其在200 1年12月19日以臨時編號020 1 09 1 1號被寄存 於 European Collection of Cell Cultures5 Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom (並可自此處取得的），且將擔任適當的抗 原株。一般而言，現已發現依據在此所述方法學獲得產自 艾美球蟲株之卵囊，當被倂入疫苗中時可生產高免疫原性 程度，進一步發現此等卵囊亦較彼等產自原始艾美球蟲珠 (接種循環前）者不具病原性，依據如在此所述步驟所產 生之卵囊亦典型地爲具較高交叉保護，意味著其提供抗較 廣範圍艾美球蟲種之保護。因此，本發明之疫苗使用來自 艾美球蟲之卵囊，較佳爲堆型艾美球蟲，應預期提供至少 抗三種且較佳爲至少四種其他艾美球蟲種，包括（但未限 制於）巨型艾美球蟲、柔嫩艾美球蟲、毒害愛美球蟲、布 氏艾美球蟲。 本發明亦因此涵蓋其他抗原性株，以及其所衍生之產 物，例如卵囊及含有此等卵囊之疫苗，具有堆型艾美球蟲 株之特徵及依據在此所述方法學而獲得之附屬產物。 了在動物中誘導足夠的免疫生成性反應，本發明之最 終疫苗每劑應含有至少約1 04個卵囊，較佳爲芽胞化卵囊， -14- 200303212 每劑疫苗亦可含有較局量之卵囊，例如每劑至少1 〇 5個卵 囊，而因此每劑範圍約1 〇4至約1 〇6個卵囊爲所欲的。使用” 足夠的免疫生成性反應”之詞意指一種反應，其在此項技藝 中指出抗球蟲病之特定免疫量時將一般辨認出，而已賦予 經免役化鳥之保護免於其死亡、疾病或抑鬱表現以作爲用 毒力艾美球蟲株作免疫激發之結果。 在此所述疫苗可以口服、皮下、皮內、肌肉內、腹腔內、 靜脈內或鼻內給予，以及其它在此項技藝中已知途徑給 予。前述中，口服途徑給予爲一般較佳者，因此，可例如 經由其飮水或透過食團將疫苗給予年幼家禽。此疫苗可被 給予至卵中，但一般被給於孵化後之年幼動物，通常以彼 等數小時至數週齢爲最佳候選者。一般而言，計畫每隻動 物一個劑量，但後續的加強劑亦在本發明範疇中。 本發明疫苗與醫藥上可接受的載體一起調配，其可包括 水溶性介質，以及懸浮液或乳劑等。此載體亦可包括此項 技藝中可使用之鹽類、防腐劑、Ph緩衝液、穩定劑及乳化 劑。此外，疫苗亦可含有一或多種佐劑以改良成果或增加 活性，例如免疫反應，且因而可包括如油劑、胞壁醯雙胜 M ( murarnyl dipeptide )、氫氧化鋁、皂素、聚陰離子、 兩性物質等材料。因此每劑中醫藥上可接受的載體之量（包 括任一佐劑）在約0 · 0 0彳至約1 0毫升之範圍間，約〇 . 1至約5 毫升爲較佳，且約0 · 5至約1毫升爲更較希望的。 在此所述疫苗亦可含有其它家禽之免疫生成劑，因此， -15- 200303212 例如與新城雞瘟病毒（NDV)來源病原相關之免疫原，亦可作 爲本發明疫苗之一部份被調配，因此，在此所述疫苗可爲 單價，或亦可爲雙價、三價、四價或五價等。 提供下列實例以說明本發明之各種較佳觀點，但其範疇 不應被限制於此。 (四）實施方式 實例 1 .材料及方法 1.1材料 1-1-1雛雞及農業 將無球菌病之雄性Arbor Acres肉雞（獲自商業的Arbor Acres雞孵化場（Putten，The Netherlands))於一日齢時 在隔離條件下將其留宿在籠中，一部份雛雞作爲給予雛雞 來使用並於1 4日齡時以芽胞化堆型艾美球蟲卵囊接種此等 給予雛雞，將一次繼代之所有給予鳥留宿在一籠子中。 將給予雛鳥於接種後3-6小時（p.i.)時放血，一次三隻’ 且使用每一分離血液樣品來接種其它3隻雛鳥，接受自一給 予雛鳥血液之雛鳥留宿於一籠子中，檢查糞便中有無卵囊 且使用自選擇之陽性樣品的卵囊作下一次繼代，實行三次 系列繼代以獲得最終抗原株。 每一樣品在下一次繼代前將自經選擇的陽性樣品中之卵 囊於四隻SPF雛鳥中增殖，SPF雛鳥獲自荷蘭Deventer之 200303212
Animal Health Service，將其分群留宿於隔離籠中。 決定繼代1及3後所收集之卵囊之病原性並與每劑使用 1 〇隻無球蟲病之雄性A r b 〇 r A c r e s肉雞之原始株做比較，每 株4劑，每次繼代總共80隻鳥。 部分用來決定經繼代3後所收集卵囊病原性之雛鳥，亦被 用來決定此等卵囊在以原始株再接種後之免疫原性，而與 原始株之病原性做比較。在隔離條件下將雛鳥分群留宿於 籠中，所有鳥皆留宿在荷蘭Deventer之Animal Health Service 之設備中，位於荷蘭 Beekbergen 之 HetSpelderholt 之3號處所，並以無抗球蟲添加物之食物餵食。 第一繼代 在第一繼代時使用26隻肉雞，8隻給予雛鳥接種芽胞化堆 型艾美球蟲卵囊並分別在接種後3及6小時將6隻給予雛鳥 放血，一次3隻，此6隻每一隻之血液樣品皆分開被使用來 接種另外3隻雛鳥，且將由2隻陽性糞便樣品純化之卵囊在 S P F雛鳥中增殖，而決定一個經增殖分離株之病原性。雛鳥 之組別及數目顯示如下。 組別 使用之雛鳥數目 用途 D 8 給予雛鳥 A1，A2，A3 3x3 取接種後3小時之雛鳥之血液 B1，B2，B3 3x3 取接種後6小時之雛鳥之血液 11,12 2x4 2個陽性樣品卵囊之增殖（A2及A3) 200303212 病原性 2 χ 40 第一繼代及原始株之病原性 下一繼代 在接下來之2次繼代，每次使用1 5隻肉雞，6隻給予雛鳥 接種芽胞化堆型艾美球蟲卵囊，並將3隻給予雛鳥於接種後 3小時放血，每一隻之血液樣品皆分開被使用來接種另外3 隻雛鳥，將所有陽性糞便樣品純化之卵囊在S P F雛鳥中增 殖’而決定在繼代3後經增殖分離株之病原性及免疫原性。 雛鳥之組別及數目顯示如下。 鲁 組別 使用之雛鳥婁々@ 用途 D 6 給予雛鳥 A，B，C 3x3 取接種後3小時之雛鳥之血液 1 2x4 陽性樣品卵囊之增殖（2X) 病原性 2x40 繼代3及原始株之病原性/免疫原性 1 · 1 · 2接種物 原々口堆型乂美球蟲自 Central Veterinary Laboratory， Weybridge，UK獲得，且在荷蘭之 Deventer的 Animal Health Service繼代’於腸道外子孢子之第一繼代時，製備每毫升 含有1 〇7個芽胞化堆型艾美球蟲卵囊之食鹽水懸浮液，於下 Μ & ft日寺’製備每毫升含有於先前繼代之增殖後所獲得 之2x1 〇7個芽胞化堆型艾美球蟲卵囊之食鹽水懸浮液。 1 . 2方法 1-2.1接種 -18- 200303212 給予雛鳥於1 4日齢時，每隻口服接種1毫升中有1 〇7 (第一繼 代）或2x1 07(之後的繼代）個芽胞化堆型艾美球蟲卵囊之食 鹽水至嗉囊中，雛鳥於接種前1 2小時時剝奪食物，部份給 予雛鳥在接種後3或6小時時經由心臟點放血，一次3隻。血 液收集於經肝素塗覆之1 〇毫升試管中，每毫升血液含有1 5 丨Ε之鋰-肝素（S a r s t e d t，E11 e η - L e u r)。雛鳥經由肌肉注射賴 拉寧（xylazine)(若夢（R〇 m p u η )，5 m g/kg 體重）及 K 他命（ketamine)(25mg/kg 體重）麻醉，獲自 AUV，Cuijck， The Netherlands 〇 每一分離的血液樣品’以每隻雛鳥3毫升經混合肝素的血 液口服接種至其他3隻1 4日齡雛鳥之嗉囊，在接種前1 0分 中，此鳥口服接受1毫升之鹼性懸浮液，其由1 0顆R e n n丨e藥 錠，該藥錠獲自商業上藥商的店舖，每錠含有6 8〇毫克之碳 酸鈣及8 0毫克之碳酸鎂，懸浮於2 0毫升之自來水中所組 成。 1 . 2 · 2 卵囊之分離 於每籠剩餘給予鳥及接種血液之鳥’在接種後3至6或7 天中每2 4小時收集其糞便，並計數卵囊數，如下列所述。 若卵囊數目爲陽性時則使用鹽浮力技術由所收集的糞便純 化卵囊，在純化後，將分離出之卵囊懸浮於2 % ( w / v )之重鉻 酸鉀溶液，並使用通常的水族缸技術藉由氣泡將此懸浮液 在2 9 °C時打氣4 8小時以誘導卵囊芽胞化，之後，計數懸浮 液中卵囊數。 -19- 200303212 每一樣品之芽胞化卵囊被增殖於6日齡S P F鳥中，將S P F 鳥口服接種3毫升獲自糞便樣品之芽胞化卵囊至嗉囊中，在 接種後4至6天收集每籠S P F鳥之糞便，且自此糞便純化卵囊 並計數其數目。 於繼代1後增殖，在接受分離自A2及A3組糞便樣品之卵 囊之I 1及I 2組鳥，分別總共含有1 〇，〇 〇 〇及4 5,0 0 0個卵囊， 因 分離物中卵囊數目低，故所獲得之分離物在之後的繼 代中被增殖兩次。 1 . 2.3計數糞便中的卵囊 每籠約25之新鮮糞便被收集，且秤重最大量爲1〇〇克之 糞便，懸浮於1 〇%(w/v)之氯化鈉溶液中（密度=1 . 1 )並混合 直至均質化。1毫升整數懸浮糞便在9毫升氯化鈉飽合溶液 中混合，依據Hawkley使用計數室來計數此稀釋懸浮糞便之 三份樣品中的卵囊數，並計算每克糞便之卵囊數。 1 . 2 · 4病原性 決定繼代1和3之卵囊之病原性並與每劑使用1 〇隻肉雞 且每樣品4劑之原始株比較其病原性，每隻鳥以1 〇3、1 〇4、 1 〇5及1 0 6個芽胞化卵囊之劑量，在8日齡時口服接種，將雛 鳥分組留宿於籠中，在接種後4至6或7日間收集糞便，且如 上所述計數糞便中的卵囊數。在接種後6天，以電刑安樂死 鳥隻，屍解所有經安樂死的鳥並依據J 〇 h n s ο η及R e j d (1 )評 分腸道傷口。 了決定繼代1後所獲得卵囊之病原性，將所 有鳥於接種後6天安樂死並秤重， 了決定繼代3後所獲得 200303212 樂死，且剩下 中收集每籠1 〇 之糞便。 並與使用每組 :所有鳥秤重且 株之芽胞化卵 所述計數糞便 刑安樂死並秤 I卵囊，接種鳥 中發現卵囊而 第A2及A3組之 此等組之糞便 卵囊之病原性，將每組5隻鳥在接種後6天安 的鳥被用來決定免疫原性。在接種後4至6天 隻鳥之糞便且在接種後第7天收集每籠5隻鳥 1 . 2.5 免疫原性 在繼代3後決定所得到的卵囊的免疫原性 用來決定病原性5隻肉雞之原始株作比較。將 每隻鳥於接種後9天再次口服接種1 05個原始 囊，在接種後4至6天收集每籠的糞便並如上 中之卵囊數。在再接種後6天，所有鳥以電 重，屍解所有鳥且如上所述評分腸道之傷口 2.結果 2.1卵囊之分離 第一繼代 在接種後3天，於接種雛鳥之糞便中未發ij 在以血液接種後3天由給予鳥所獲得之糞便 未在以血液接種後6小時所獲得糞便中發現， 所有冀便樣品在接種後5天爲卵囊陽性並自 中純化出卵囊。芽胞化後獲得下列樣品： 組別 卵囊/毫升 總量(毫升) A2 3,000 25 A3 15,000 25 將由第A 2及A 3組所得到的卵囊於s P F鳥中增殖，於增殖 200303212 後，在接受自A2組分離出之鳥之糞便中的卵囊已皺縮且此 等卵囊之存活性並不淸楚，由第I 2組之鳥接受分離自A 3組 之卵囊，獲得每毫升含有290,000個卵囊共500毫升，且決 定此等卵囊之病原性。 第二繼代 第C組之一糞便樣品在接種後5和6天爲卵囊陽性，且自 此等天數中所收集之糞便純化卵囊，此分離株稱爲A3 C2， 含有低量卵囊數，且在SPF鳥中增殖卵囊，增殖後，獲得24 · X 1 06個卵囊且此等卵囊在SPF鳥中被增殖一次。 第三繼代 第A組之一糞便樣品在接種後5天爲卵囊陽性且卵囊自 此糞便中純化出，此分離株稱爲A3 C 2 A2，含有低量之卵囊 且卵囊在S P F鳥中被增殖兩次，在增殖後，收集卵囊且決定 此等卵囊之病原性及免疫原性。 2.2病原性 _ 決定繼代1及3後所收集之卵囊之病原性，此結果摘述在 表1及2中，繼代1後，觀察到在平均體重、平均傷口評分或 每公克糞便之卵囊數目上無明顯差異。 -22- 200303212 表1第一繼代後之病原性 I | 丨丨 _ — 劑量： ----- 1 丨丨 -- 堆型艾美球蟲株之病原性 (每隻 A 3分離株 原始株 鳥之卵 平均 平均 每克糞 平均 平均 每克糞 囊數） 體重 傷口 便中之 體重 傷口 便中之 n=l 0 (公 評分 卵囊數 (公 評分 卵囊數 克） (X103 ) * 克） (xl 03) * 1 03 428 1 .0 480 425 - 0.9 1 50 1 04 414 2.1 1400 426 2.2 1 500 1 05 39 1 2.9 2100 378 2.5 1300 1 06 B. 1 — 332 3.1 528 350 3.1 920 *:第4至6天所收集者 繼代3後，繼代3平均傷口評分較原始株以每隻鳥ι〇4或更 多個卵囊之劑量者低，然而，與原始株比較，每克糞便中 之卵囊數無明顯差異。在兩者情況中所接種的劑量依據卵 囊數，在接受較高劑量分離株之鳥的糞便中的卵囊數指出 此等鳥是嚴重感染的，但傷口評分在此接種劑量下並未增 加。 -23- 200303212 表2 第三繼代後之病原性 劑量： 堆型艾美球蟲株之病原性 (每隻 A3C2A2分離株 原始株 鳥之卵 平均 平均 每克糞 平均 平均 每克糞 囊數） 體重 傷口 便中之 體重 傷口 便中之 η = 5 (公 評分 卵囊數 (公 評分 卵囊數 克） (xlO3)* 克） (xlO3)+ 1 03 未作 1 .0 270 未作 1.2 110 1 04 未作 1 .6 71 0 未作 2.6 1800 1 05 未作 1 .0 51 0 未作 3.2 650 1 06 未作 1 .2 960 未作 _ 3.5 9 10 + :第4至7天所收集者 2.3 免疫原性 決定繼代3後所收集的卵囊之免疫原性’結果摘錄於表3 中。每隻鳥接種1 〇3個卵囊之組觀察到少數的傷口’亦在此 組之糞便中發現卵囊。在接種較高劑量分離株之組中’未 觀察到傷口及糞便之卵囊，每隻鳥接霍彳〇4個或以上分離株 卵囊劑量之所有組皆可保護對抗原始株之再？妾種。此等結 果應與以原始株再接種之對照組（右手邊} €暴露於原始 株後存活作對照。 -24- 200303212 赛__3第三繼代後之免疫原性 劑量： —· 一 _ ____ 堆型球蟲株之病原 性 (每隻 A3C2A2分離株 --------r-- 原始株 鳥之卵 平均 平均 每克糞 平均 平均 每克糞 囊數） 體重 傷口 便中之 體重 傷口 便中之 n = 5 (公 評分 卵囊數 (公 評分 卵囊數 克） (xl 03) * 克） (Χίο3)# 1 03 356 0.25 260 304 0 1 69 1 04 323 0 0 3 14 0 0 1 05 335 0 0 342 0 0 1 06 304 0 0 3 25 0 1 \再接種後；* *:第4至6天所收集者 3 ·結果討論 增殖後，接受由A2組第一繼代分離出的卵囊之鳥糞便中 的卵囊已皴縮，且此等卵囊之存活性並不淸楚，此可能是 由於此等卵囊於純化時暴露於飽和鹽溶液之時間所致，在 增殖前未觀察到卵囊之偏差。 堆型艾美球蟲之腸道外卵囊之第一繼代在A3組成功，但 所分離卵囊之繁殖力及病原性與原始堆型艾美球蟲株並無 差異。 接種較高劑量繼代3分離株之鳥的糞便中的卵囊數說明 此等鳥隻爲嚴重感染，然而’在此接種劑量下傷口評分並 -25- 200303212 未增加，若傷口評分爲蟲株病原性之好的參數，則經分離 之A3 C 2 A2株較堆型艾美球蟲原始株而言是相當少的病原 性。 再次接種原始株後，每隻接種1〇3個A3C2A2分離株卵囊 之鳥顯示極少傷口且在此組之糞便中發現卵囊，每隻接種 104個A3 C 2 A2分離株卵囊或以上之鳥可保護對抗原始株之 再接種。 4.參考文獻 1. Johnson JK, Reid WM., "Anticoccidial drugs: Lesion scoring techniques in battery and floor pen experiments with chickens", Exp. Parasitol·，1 9 7 0； 28: 30-36. 表格
表A 1 .給予鳥及接種血液的鳥於繼代1後之糞便中的卵囊數 組 在接種後指示天數之糞便中每 一計數室之卵囊數 別 第3天 第4天 第5天 第6天 D 40 40 40 330 330 330 250 250 250 50 50 50 A 1 neg.neg.neg. 5 5 5 neg.neg.pos. neg.neg.pos. A2 neg.neg.neg. pos. pos. pos. pos. pos. pos. neg.neg.pos. A3 neg.neg.neg. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. B 1 neg.neg.neg. n e g . 1 1 neg.neg. neg. neg.neg. neg. B2 neg.neg.neg. pos. pos. pos. neg.neg. pos. neg.neg.neg. B3 neg.neg.neg. neg. neg. neg. neg.neg. neg. neg.neg. neg. -26- 200303212
表A2 ·給予鳥及接種血液的鳥於繼代2後之糞便中的卵囊數 組別 在接種後指示天數之糞便中每一計數室之卵囊數 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 D neg pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. A neg.neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. pos. neg. neg. neg. neg. neg. neg. B neg.neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg.neg. neg. C neg.neg. neg. neg.neg.neg. neg. neg. pos. neg. neg. pos. neg.neg. neg. 表A3·給予鳥及接種血液的鳥於繼代3後之糞便中的卵囊數 ~~ — IM — ....... ~ 1 1 "" I ": _._ii ----- 糸且別 在接種後指示天數之糞便中每一計數室之卵囊數
第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 D 未作 pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. A 未作 neg. neg· neg. neg. neg. pos. neg. neg. neg. neg. neg. neg. B 未作 neg. neg· pos. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. C _ 」 未作 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg· neg. neg. neg. neg. neA
-27- 200303212 表A4 .在第一繼代後在病原性決定上之個別結果 組/鳥 堆型艾美球蟲株之病原性 A3C2A2分離株 原始株 體重（公克) 傷口評分 體重（公克） 傷口評分 103 1 429 1 432 1 2 413 1 417 1 3 424 1 416 1 4 424 1 411 1 5 450 1 463 1 6 441 1 451 0 7 393 1 385 1 8 432 1 416 1 9 422 1 457 1 10 450 1 406 1 104 1 426 2 424 1 2 448 2 453 2 3 442 2 441 2 4 428 2 413 2 5 456 3 434 3 6 395 3 437 1 7 364 2 407 2 8 360 1 436 3 9 409 2 356 3 10 408 2 461 3
-28- 200303212 105 1 393 2 397 2 2 388 3 378 2 3 389 3 432 2 4 4 19 3 393 3 5 4 10 2 390 2 6 328 3 333 3 7 438 3 379 3 8 354 3 308 3 9 439 4 392 3 10 352 3 3 78 2 106 1 3 3 3 3 420 3 2 348 2 345 3 3 323 3 338 3 4 3 5 1 3 336 3 5 355 4 394 3 6 282 3 3 12 3 7 3 54 4 27 1 4 8 346 3 4 12 3 9 293 3 349 3 10 332 3 326 3
-29- 200303212 表A5 .在第三繼代後在病原性決定上之個別結果 組/鳥 堆型艾美球蟲株之病原性 A3C2A2分離株 原始株 體重（公 傷口評 體重（公 傷口評 克） 分 克） 分 1 03 1 未作 1 .00 未作 1.00 2 1 .00 1.00 3 1 .00 2.00 4 1.00 1.00 5 1 .00 1.00 1 04 1 未作 2.00 未作 4.00 2 2.00 3.00 3 1 .00 4.00 4 2.00 3.00 5 1.00 2.00 1 05 1 未作 1.00 未作 4.00 2 1 .00 3.00 3 1.00 4.00 4 1 .00 3.00 5 1.00 2.00
•30- 200303212 1 06 1 未作 1.00 未作 4.00 2 1.00 1.00 3 1.00 3.00 4 2.00 3.00 5 1.00 未作 表A6 .在第三繼代後在病原性決定上之個別結果 組/鳥 堆型艾美球 蟲株之 病原性 A3C2A2分離株 原始株 體重 〔公 傷 □ 體重 (公 傷 □ 克） 評 分 克） 評 分 再接 再接 再接 再接 種前 種後 種前 種後 6天 6天 1 03 1 594 9 12 0· 00 644 953 0. 00 2 620 1030 0· 00 547 832 0· 00 3 674 991 1.00 592 847 0.00 4 653 1031 0.00 635 970 0.00 5 未作 未作 未 作 533 870 0. 00 1 04 1 503 839 0. 00 5 5 5 87 1 0. 00 2 609 953 0.00 6 10 969 0. 00
-31 - 200303212 3 55 1 859 0.00 579 852 0.00 4 5 13 798 0.00 624 942 0.00 5 550 890 0.00 480 782 0.00 1 05 1 588 10 13 0.00 5 80 95 1 0.00 2 548 9 19 0.00 5 84 953 0.00 3 420 696 0.00 557 903 0.00 4 403 670 0.00 539 884 0.00 5 560 897 0.00 498 778 0.00 1 06 1 482 79 1 0.00 568 928 0.00 2 470 798 0.00 5 12 856 0.00 3 495 81 9 0.00 552 85 8 0.00 4 498 71 9 0.00 440 709 0.00 5 47 1 8 18 0.00 485 803 0.00
在本發明所描述之每一種具體實施例，在其範疇中之一 些修飾在未違反此發明之精神及範疇下可被此項技藝中熟 習此藝者所進行 -32-
Claims (1)
- 200303212 拾、申請專利範圍 1· 一種產生抗球蟲病疫苗中之免疫原性卵囊上之有用分離 株。 2· —種產生抗球蟲病疫苗中之免疫原性卵囊上之有用分離 株，該分離株被鑑定爲A3C2A2。 3· —種有效對抗球蟲病之疫苗，其包含每劑至少約i 〇 4個經 減毒艾美球蟲之卵囊與醫藥上可接受的載體一起。 4.如申請專利範圍第3項之疫苗，其中該卵囊爲腸胃道外 卵囊。 5·如申請專利範圍第4項之疫苗，其中該卵囊產自堆型艾 美球蟲種。 6·如申請專利範圍第5項之疫苗，進一步包含一種佐劑。 7·如申請專利範圍第4項之疫苗，其中該疫苗包含至少約 1 0 5個卵囊。 8·如申請專利範圍第7項之疫苗，其中該卵囊產自鑑定爲 A3C2A2 之株。 认一種家禽抗球蟲病之接種方法，其包含給予該家禽至少 約1 〇4個由減毒堆型艾美球蟲而來之卵囊。 10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該卵囊爲芽胞化的。 11. 一種獲得在生產抗球蟲病疫苗上有用的免疫原株之方 法，其包含下列循環： (a )以艾美球蟲之卵囊感染至少一隻第一隻無特定性 -33- 200303212 病原供給鳥； (b )收集該供給鳥之血液； (c) 以該血液感染至少一隻第二隻無特定性病原供給 鳥； (d) 收集該第二鳥之卵囊；且 (e )增殖該卵囊以實質完成該循環；且然後使用〇部 分所增殖之該卵囊重複此循環，其中至少完成該方 法之約3次循環。 12. 如申請專利範圍第1 1項之方法，其進一步包含分離該免 疫原株。 13. 如申請專利範圍第1 2項之方法，其進一步包含自該免疫 原株生產卵囊。 14. 如申請專利範圍第1 3項之方法，其進一步包含由該生產 的卵囊來配製疫苗。 15. 如申請專利範圍第1 4項之方法，其中該疫苗使用至少約 1〇4個卵囊來調配。 16. 如申請專利範圍第1 1項之方法，其中該重複包含以至少 約兩倍卵囊數感染該家禽。 17. 如申請專利範圍第1 1項之方法，其包含總共實行三次循 丫 P33 5哀。 18. 如申請專利範圍第1 2項之方法，其中該免疫原株被鑑定 爲寄存於 European Collection of Cell Cultures 之第 0 2 0 1 0 9 1 1 編號。 200303212 Η如申請專利範圍第11項之方法，其中該感染第一供給鳥 包含給予約1 X 1 0 6至約3 X 1 〇8個該卵囊。 20. 如申請專利範圍第1 9項之方法，其中該感染包含給予約 1 X 1 07個卵囊。 21. 如申請專利範圍第2 0項之方法，其中該重複包含在步驟 (a )給予約2 X 1 0 7個卵囊。 22. 如申請專利範圍第1 5項之方法，其包含調配該使用至少 約105個卵囊之疫苗。 | 23. 如申請專利範圍第1 1項之方法，其進一步包含在給予該 鳥之前先芽胞化該卵囊。 24. 如申請專利範圍第〗〗項之方法，其中該艾美球蟲種爲堆 型艾美球蟲。 25. —種減毒一或多個艾美球蟲株之方法，其包含透過至少 三組無特定病原家禽以連續繼代該株，其中每一該繼代包 含至少兩個連續組之接種。 26 —種減毒堆型艾美球蟲之方法，其包含下列循環： 鲁 (f )以有毒力的堆型艾美球蟲所產生之卵囊接種至少 一個第一組無特定性病原供給鳥； (g )接種後約3至約6小時經由自該組供給鳥放血來 收集血液； (h )以該血液接種至少一個第二組無特定性病原供給 鳥； (i )自該第二組鳥收集卵囊；且 -35- 200303212 (j)增殖該卵囊以因而充分完成該循環；然後使用由 次步驟e)所增殖之卵囊重複該循環，其中約完成2 次循環。 27· —種衍生自堆型艾美球蟲之卵囊，該堆型艾美球蟲以約3 次繼代通過無特定病原家禽之循環來減毒。 28· —種具有寄存於 European Collection of Cell Cultures 之 第02 0 1 09 1 1編號之堆型艾美球蟲株之免疫原特性之艾美 球蟲株。 29. —種疫苗，該疫苗具有抗球蟲病疫苗之抗原反應特性， 其含有獲自寄存於 European Collection of Cell Cultures 之第020 1 09 1 1編號之堆型艾美球蟲卵囊之致免疫化的 量。 3〇.如申請專利範圍第2 9項之疫苗，其中該疫苗含有一或多 個醫藥上可接受的載體之佐劑。 -36- 200303212 陸、（一）、本案指定代表圖爲：第____匱 (二）、本代表圖之元件代表符號簡單說明： 柒、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學 式：
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