ITTO950112A1 - Composizione e procedimemto per prevenire e trattare infiammazioni con immunoglobina a. - Google Patents

Abstract

L'infiammazione può venire trattata o pervenuta del tutto somministrando una preparazione comprendente IgA. Queste preparazioni possono anche effettuare immunomodulazione. Preferibilmente, la preparazione comprende IgA multimerico ed è praticamente priva di IgG nelle sue varie forme. Si possono pure somministrare altri composti come antibiotici, antiflogistici ed antiacidi. L'immunoglobulina A può pure essere impiegata in vaccini per prevenire l'infiammazione. Inoltre, si provvede un saggio migliorato per valutare l'attività antiinfiammatoria.

Description

DESCRIZIONE dell'Invenzione Industriale dal titolo: "Composizione e procedimento per prevenire e trattare Infiammazioni con ImmunoglobulIna A"

DESCRIZIONE

SFONDO DELL?INVENZIONE

La presente Invenzione si riferisce ad un procedimento per la prevenzione o il trattamento di reazioni infiammatorie, sia acute che croniche', mediante somministrazione di una preparazione * farmaceutica contenente ImmunoglobulIna A ("IgA"). L'Invenzione si riferisce pure all'Impiego di una preparazione farmaceutica contenente IgA multimerlco per il trattamento, la prevenzione o la cura di tali reazioni Infiammatorie, anche nel corso di vaccinazione. L'Invenzione si riferisce inoltre ad un test in vitro* per valutare l'attivit? antiinfiammatoria ed Immunomodulante di una sostanza.

Nel corpo si possono verificare situazioni Infiammatorie dannose. Per esemplo, si possono verificare situazioni Infiammatorie alle superfid mucosall. quali Infiammazione del tratto respiratorio superiore e stomatite aftosa. Eventi Infiammatori si possono pure verificare nel tratto respiratorio, come pure nel tratto gastrointestinale. Alcuni eventi infiammatori della mucosa non vengono direttamente mediati da un agente infettivo, ma sono piuttosto la conseguenza di una sovra reazione del sistema immunitario in risposta ad Infezioni microbiche. Esempi di malattie di questo tipo sono le bronchiti ostruttive acute e le Infezioni del tratto respiratorio esasperate dall'asma.

Infiammazioni deleterie si possono pure verificare in punti diversi dalle superfid mucose. Malattie di tali siti non mucosall comprendono artrite reumatdde (artrite reumatolde giovanile sistemica e artrite psorlatica), sindrome di Relter, spondm te anchllosante, morbo di Crohn e morbo di Whipple con artrite, e lupus eritematoso sistemico.

L?Infiammazione dannosa ? generalmente conseguenza di reazioni incontrollate nel sistema immunitario. Certi antlgenl giocano un ruolo nel processo Infiammatorio e provocano danni per effetto di questo ruolo.'Per esempio, la maggioranza degli effetti tossici dell'Infezione sistemica gramnegativa e l'endotossemia vengono mediate da Interazione con cellule del sistema immunitario, specialmente i macrofagi. Cellule della linea monoclta/macrofago sono la principale fonte di citochlne Infiammatorie quali il fattore alfa della necrosi tumorale ("TNF-?") e l?interleuchina 6 (IL-6">.

Le dtochine infiammatorie vengano prodotte in risposta ad una variet? di stimoli biologici, come lipolisaccaride ("LPS") da batteri gram negativi. Il TNF-? e IL-6 giocano un ruolo centrale nelle funzioni di effettore multiplo e nelle Interazioni cellulari necessarie per montare una efficace difesa dell'ospite durante l'Infiammazione e la risposta immunitaria. Tuttavia, la produzione incontrollata di citochlne infiammatorie ? dannosa per l'ospite. Per esemplo, il rilascio Incontrollato, Indotto da LPS di TNF-? ? risultato essere un mediatore centrale della tossicit? Indotta da LPS, compreso lo shock endotosslco gram-negativo.

L'Iniezione di elevate dosi di TNF-? a ratti o topi induce i sintomi e la mortalit? dello schock settico. Inoltre, elevati contenuti di siero di TNF-? sono correlati alla mortalit? di pazienti con menlngococcemla o schock settico. Elevati livelli di TNF -a sona pure stati trovati in neonati con enterocolite necrotizzante, suggerendo che il TNF-a pu? essere interessato nella patogenesi di tale malattia. In effetti, lo stimolo dell'endotosslna e la somministrazione di TNF-? hanno Indotto necrosi dell'Intestino in un modello sperimentale di enterocolite necrotizzante neonatale. Livelli aumentati di IL-6 sono stati riscontrati in una variet? di condizioni cllniche, comprese meningite batterica e virale e Infezione da HIV. E' noto che le endotossine inducono la sintesi di IL-6, ed i livelli di IL-6 nel siero vengono aumentati in condizioni associate con endotossemla come nella lesione termica. Gli effetti deleteri delle tossine batteriche sono associati con il rilascio esagerato ed autoamplificante di questi composti che provocano infiammazione, spesso con risultati letali. La letalit? della batteremla o endotossemia gramnegativa ? stata prevenuta dalla somministrazione di anticerpi antl-TNF specifici.

I vari componenti del sistema Immunitario sono interessati nel fenomeno Infiammatorio. Uno del principali componenti del sistema Immunitario sono le ImmunoglobulIne. Preparazioni farmaceutiche contenenti Immunoglobul ine sono state precedentemente Impiegate nella profilassi e nel trattamento di Infezioni batteriche e virali, per esemplo, nel brevetto U.S. N. 4.335.099, una preparazione orale contenente IgA ed Immunoglobulina G ("IgG") d stata usata per il trattamento delle infezioni Intestinali. Inoltre, preparazioni contenenti il 73% di IgA ed il 26% di IgG, rispetto al contenuto totale di Immunoglobulina, sono in grado di ridurre l'Incidenza dell'enterocolite necrotizzante, quando vengono somministrate profilatticamente a neonati nati sotto peso. Vedi Elble e altri, 0. CUn. Imm. 10 (6): 72S-79S (1990). Questo effetto d ritenuto essere un risultato della formazione di complessi antlgene-antlcorpo provocata .dagli alti titoli di anticerpo contro una moltitudine di potenziali patogeni e relative tossine. Tali patogeni comprendono agenti batterici che provocano la pertosse, il tetano e la difterite e virus quali poliovirus. virus Coxsackle, rotavlrus ed ecovlrus.

E1 stato dimostrato che IgA.IgG e transferrlna agiscono sinergisticamente contro lo sviluppo batterico (vedi EP 0506 651). Le proporzioni di componenti attivi sono tra 0,40 e 0,80 parti In peso di IgG e tra 0,15 e 0.45 parti in peso di transferrlna per parte in peso di IgA.

E' stato dimostrato che IgG, IgA e IgM agiscono sinergisticamente con altri composti farmacologicamente attlni, quali gli antibiotici. Queste Immunoglobuline si legano presumibilmente al microorganismi Infettivi, il che porta ad una agglutinazione o induzione di fagocitosi.

Vedi EP 0 168830.

E' tuttavia ben noto che le immunoglobul ine possono essere utili poich? uno specifico anticerpo riconosce e si lega ad uno specifico antigene per neutralizzare tale antlgene.

Si ? tuttavia pensato che certi Immunocomplesl possono giocare un ruolo in certi processi Infiammatori. E1 stato per esemplo riportato il ritrovamento di complessi IgA Immuni in pazienti che soffrono di malattie Infiammatorie dell'intestino e di spondm te anchilosante. I pazienti che presentano questi disturbi hanno elevate concentrazioni di IgA nel siero e di immunocomplessi IgA in circolazione. Vedi Peeters e altri, Ann. Rheumat. Dis. 49-638-640 (1990).

Si ? trovato che preparazioni contenenti certi anticerpi IgG proteggono contro malattie sistemiche provocate da Infezioni da stafilococchi Impedendo l'attivazione della cellula T Indotta dalle tossine batteriche (superantlgenD . vedi Takel e altri. J. CUn. Invest. 91: 602-607 (1993). Questo effetto protettivo di preparazioni IgG pud venire attenuato con anticerpi neutralizzanti. L'effetto di questi anticerpi probabilmente si verifica attraverso l'inibizione dell'attivazione della cellula T da parte del superantlgene batterico, che potrebbe altrimenti portare alla propagazione e dall'esaltazione di una reazione Infiammatoria sistemica. Quindi, secondo l'ipotesi anti-super antlgene, l'impiego di certi anticorpl IgG contro varie' malattie Immunologiche, diverse dal disturbi dovuti a deficienza di anticerpi, pud essere realizzabile. Vedi Rich, J. CUn. Invest. 91:378 (1993).

L'altra Immunoglobulina predominante IgA, gioca pure un ruolo importante nel sistema Immunitario. Per esempio, la IgA secretoria ("SIgA") gioca un ruolo principale nella protezione dell'ospite da Infezioni da organismi patogeni e che Invadono attraverso le superflci mucosali del tratto respiratorio, gastrointestinale e urogenitale. Gli anticerpi IgA partecipano all'eliminazione degli organismi batterici patogeni, virali o parassiti ed una variet? di antlgenl Ingestiti o Inalati attraverso le superflcl mucosall, neutralizzando le tossine e le particelle virali. Impedendo l'aderenza di patogeni batterici, e prevenendo la colonizzazione e la penetrazione .di superflcl mucosall da parte di microorganismi patogeni.

Gli effetti antiInfettivi di preparazioni contenenti IgA che sono praticamente esenti da IgG sono descritti dalle pubblicazioni di brevetto giapponese SHO 56-53622 e SHO 57-59815. Queste preparazioni contengono il 92% di IgA ed il 6% di IgG. Tali preparazioni diminuiscono la mortalit? provocata dalla pseudomonas aeruglnosa nel topo. Queste preparazioni contengono IgA monomerlco ed d stato dimostrato che hanno un effetto neutralizzante sul rotavlrus. escherichia coll, e salmonella typhl. Test su varie preparazioni hanno dimostrato che un contenuto totale di IgG Inferiore ? generalmente correlato con effetti entiInfettivi pi? energici.

I procedimenti per ottenere IgA sono noti. Per esempio. un metodo per la produzione di una preparazione di ImmunoglobulIna contenente pi? del ICS di IgA mediante cromatografia a scambio Ionico ? descritto in DE 3927 111 C2. Quando si scelgono condizioni di eluizione tali da escludere IgM. si pu? ottenere un prodotto contenente dal 30 al 60Z di IgA e dal 70 al 40Z di IgG. L'attivit? anti comp?ementare di questa preparazione ? relativamente bassa.

Precedenti procedure per ottenere IgA dal siero sono state centrate sull'Imped?re la polimerizzazione dell'ImmunoglobulIna per evitare la formazione di IgA multimerlco. La polimerizzazione di IgA viene tipicamente evitata anche quando si Isola IgA. che ? realmente dlmerlco. La frazione monomera di SIgA ? stata precedentemente considerata come la pi? importante. Un procedimento per la produzione di una preparazione di SIgA ? descritto in EP 0479 597 A2.

Per ottenere rendimenti in IgA monomerico di circa l'80% sono stati Impiegati stabilizzanti. I polimeri di ImmunoglobulIna vengono quindi separati mediante precipitazione frazionata usando glicole polietilenico. Il fatto di evitare l'IgA multimerlco nella tecnica precedente, ha limitato tuttavia l'uso clinico di IgA. Questo uso limitato ? il risultato di considerazioni relative all?Inattivazione virale e alla necessiti di evitare la polimerizzazione.

Per esemplo, una preparazione di IgA veniva tipicamente riscaldata a circa 60aC per inattivare i virus contaminanti. Questo riscaldamento provocava pure* una denaturazione del l 'Immunoglobulina con successiva polimerizzazione e formazione di IgA multlmerl. Per evitare la poiIme'rlzzazlone durante l'inattivazione virale, si aggiungevano stabilizzanti alla soluzione contenente immunoglobul Ina. Gli stabilizzanti, tuttavia, stabilizzano pure i virus contaminanti e quindi li proteggono dall'inattivazione.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Uno scopo della presente Invenzione consiste nel provvedere un procedimento per il trattamento e la prevenzione di reazioni Infiammatorie acute e croniche In un soggetto, quale un paziente umano.

Un altro scopo della presente invenzione consiste nel provvedere un procedimento per il trattamento e la prevenzione di reazioni Infiammatorie acute e croniche per somministrazione di IgA ad un soggetto.

Un ulteriore scopo della presente Invenzione consiste nel provvedere un procedimento per il trattamento e la prevenzione di reazioni Infiammatorie acute e croniche mediante somministrazione di forme multlmerlche di IgA ad un soggetto .

E' ancora un altro scopo della presente invenzione il provvedere una preparazione farmaceutica IgA nelle sue varie forme, che 6 adatta per la prevenzione ed il trattamento di reazioni Infiammatorie .

Un ulteriore scopo della presente invenzione consiste nel provvedere una vaccinazione migliorata mediante somministrazione di IgA per minimizzare l'infiammazione .

Un altro scopo ancora della presente Invenzione consiste nel provvedere un saggio per selezionare composti entiinfiammatori.

E' ancora un altro scopo della presente Invenzione il provvedere una preparazione per modulare gl i aspetti della risposta immunitaria, quali il rilascio di certe dtochlne.

Per ottenere questi ed altri scopi. si provvede un procedimento per prevenire o trattare Infiammazioni. comprendente la fase di somministrazione di una preparazione comprendente IgA ad un soggetto che necessita di tale terapia. Preferibilmente. la preparazione comprende IgA multlmerlco ed ? praticamente esente da IgG. La preparazione A pure preferibilmente priva di agenti Infettivi vitali, quali i virus. Preferibilmente, i virus contaminanti vengono Inattivati mediante trattamento termico. Altri composti. quali antibiotici, antiflogistici ed antiacidi, possono pure essere somministrati al soggetto.

Secondo un altro aspetto della presente invenzione, si provvede una preparazione farmaceutica comprendente IgA multimerlco.

Secondo un altro aspetto della presente Invenzione, si provvede una preparazione comprendente IgA. Preferibilmente, la preparazione comprende IgA multimerlco ed ? praticamente priva di IgG. La preparazione pu? pure contenere altri composti, quali antibiotici, antiflogistici ed antiacidi. Uno o pi? di questi composti possono essere parte di un kit antiinfiammatorio. Il kit antiinfiammatorio deve contenere Istruzioni per l'Impiego della preparazione per prevenire o trattare l'infiammazione. Le istruzioni debbono pure contenere le dosi e le vie di somministrazione.

Secondo ancora un altro aspetto della presente invenzione, si provvede un procedimento per valutare l'attivit? antiinfiammatoria di una sostanza di prava, comprendente le fasi di Incubare cellule producentl citochine in un mezzo privo di siero In presenza di uno stimolo Infiammatorio. quali antlgenl da batteri Inattivati (Haemophilus Influenzae), e la sostanza di prova e valutare la produzione di cltochlne da parte delle cellule Incubate. Preferibilmente, le cellule sono monodtl e le citochlne valutate comprendono TNF-a, TNF-?, IL-1 oppure IL-6. Preferibilmente. i risultati vengono confrontati alla produzione di citochina di un controllo, quali monocltl esposti allo stimolo Infiammatorio ma non alla sostanza di prova.

Secondo un ulteriore aspetto della presente Invenzione, si provvede un procedimento per la vaccinazione comprendente la somministrazione di IgA e di un antlgene. La somministrazione pu? essere simultanea o sequenziale. Preferibilmente. l'IgA comprende IgA multlmerico e la preparazione 6 praticamente priva di IgG. SI pu? pure somministrare un coadiuvante. Uno o pi? di questi composti possono costituire parte di un kit di vaccinazione. Il kit di vaccinazione deve contenere Istruzioni per l'uso della preparazione per prevenire o trattare l'Infiammazione, prima. durante e dopo la vaccinazione.

Tutti i componenti o le preparazioni debbono venire trattati per eliminare o Inattivare i microbi patogeni potenzialmente contaminanti, quali i virus originati dal sangue. Altri scopi, caratteristiche e vantaggi della presente Invenzione saranno resi evidenti dalla descrizione, tabelle e figure seguenti .

Breve descrizione delle figure La figura 1 illustra in forma grafica come l'IgA del siero umano regola verso il basso il rilascio di TNF-? e IL-6 nel monacitl umani attivati con Haemophllus Influenza tipo B.

La figura 2 Illustra in forma grafica come l'IgA di siero umano regola verso il basso il rilascio di TNF-? e IL-6 Indotto da Hib nei monodti umani, mentre la produzione di GM-CSF conseguente allo stimolo da Hib rimane invariata.

La figura 3 -Illustra in forma grafica l'effetto dell'IgA di siero umano sul rilascio di TNF-? e IL-6 nel monocltl stimolati con LPS purificato.

La figura 4 Illustra in forma grafica l'effetto di IgA multlmerlco (aggregato a caldo) e monomerico sul rilascio di dtochlna.

La figura 5 illustra in forma grafica come l'IgA di siero umano regoli verso il basso il rilascio di TNF-? e IL-6 nei monodti umani, mentre l'IgG di siero umano non ha effetto.

La figura 6 Illustra in forma grafica il legame degli anticerpi IgA e IgG a Haemophllus Influenza tipo B.

La figura 7 Illustra in forma grafica l'effetto dell 'IgA di siero umano sull'Induzione di dtochlna

e sul ri l ascio di dtochl na in monocltl stimolati con Hib.

Descrizione dettagliata dell'Invenzione

In considerazione delle conseguenze di infiammazioni dannose, sono necessari meccanismi per regolare verso il basso la sequela nociva locale e sistemica assodata con l'Infiammazione acuta e cronica. La presente invenzione utilizza vantaggiosamente una propriet? precedentemente sconosciuta dell 'IgA di prevenire o trattare reazioni Infiammatorie dannose. Questa propriet? differisce dal ben noto modello di neutralizzazione dell'anticerpo di antlgeni estranei specifici. L'esistenza di questa propriet? ed utilit? di IgA come antiinfiammator io sono state sorprendenti, in considerazione delle scoperte di Peeters e altri.

opera citata, ed altri.

La presente Invenzione si riferisce quindi alle composizioni ed alla metodologia per prevenire o trattare reazioni infiammatorie acute e croniche, come le reazioni Infiammatorie generalizzate o localizzate, con una quantit? efficace di IgA.

L' Immunoglobulina A pud venire somministrata profilatticamente a soggetti a rischio di sviluppo di infiammazione. Tali soggetti comprendono quelli che debbono essere vaccinati come pure quelli che sono stati recentemente vaccinati o altrimenti esposti a stimoli Infiammatori o dtochlne. L'uso profilattico di IgA deve contrastare o minimizzare l'insorgere di reazioni infiammatorie dannose.

Nel contesto profilattico, i soggetti debbono ricevere IgA prima dell'esposizione allo stimolo Infiammatorio o immediatamente dopo l'esposizione. Per esempio, nel caso di malattie allergiche quali rinite allergica, i soggetti debbono venire trattati prima dell'esposizione ad allergeni quali il polline. Inoltre, i soggetti a rischio di infezioni del tratto respiratorio superiore con relativa Infiammazione debbono ricevere l'IgA ripetutamente durante la normale stagione dei raffreddori.

L'Immunoglobul Ina A pud pure venire somministrata a soggetti che gi? soffrono di reazioni infiammatorie dannose. Reazioni Infiammatorie possono venire Incontrate in soggetti punti da api o altrimenti esposti a stimoli infiammatori. In questo contesto l'IgA pud curare, migliorare o minimizzare l'insorgere, di reazioni inflaminatorie.

La somministrazione di IgA pu? venire effettuata per via'locale, orale o sistemica. Si preferisce impiegare IgA in preparazioni farmaceutiche che sono praticamente prive di IgG. Si preferisce pure Impiegare una preparazione contenente IgA multlmerico. La presenza di IgM deve anche essere ridotta al minino o ' addirittura eliminata.

Le dosi dipendono dalla via e dalla frequenza di somministrazione, come pure dalla gravit? ed alla causa del ilInfiammazione. Quando si devono somministrare dosi totali elevate di IgA, si preferisce spesso somminiatrare l'IgA in successive piccole quantit? nel corso del giorno. Queste considerazioni sul dosaggio e la via di somministrazione possono venire facilmente definite da persone esperte nel ramo.

Per esemplo. l'IgA pu? venire somministrato oralmente (normalmente da 1 a IO g giorno o pi? in casi gravi), preferibilmente in 3 o pi? dosi, insieme ad un antiacido.

Inoltre, l'IgA pud venire somministrato sistemicamente con mezzi quali Iniezioni Intravenose (per mezzo di boli, fleboclisi continua o ambedue). Tipicamente si somministrano da 50 a 2000 mg di IgA/kg/giorno. In rari casi, si pu? effettuare la somministrazione Intramuscolare normalmente con dosi da circa 50 a 100 mg IgA/kg/giorno.

L'immunoglobulIna A pu? anche venire somministrata localmente con mezzi quali Inalazione (fino a 10 ml/giorno. da 10 a 100 mg di IgA/ml; per via nasale : da 50 a 200 mg/ml per spray o gocce) o con Iniezione introarticolare (quando ? necessaria, da 1 a 5 mi con da 10 a 100 IgA/ml). Altre vie comprendono supposte (da 100 a 1000 mg /IgA/dose) e cerotti transdermlci. I cerotti transdermlci possono venire usati per trattare Infiammazioni della pelle (psoriasi o acne).

In precedenza, gli effetti dell'IgA contro germi patogeni sono stati considerati come mediati soltanto da antlcorpl specifici. Per esempio, ? noto che gli anticorpi sono Interessati nell'Inibizione dell'attacco microbico e nella neutralizzazione di tossine batteriche e particelle virali. E' stato sorprendente, quindi, scoprire l'effetto generale antl Infiammatorio ed Immunomodulante dell'IgA. Contrariamente all'Ipotesi esistente relativa agli effetti anti-superantigenici di certi anticerpi IgG, l'IgG non ha effetto comparabile a quello dell'IgA quando viene testato In parallelo. Piuttosto. l'IgG sembra realmente migliorare l'attivit? Infiammatoria. il che ? Indesiderabile. Per conseguenza si preferisce Impiegare IgA praticamente privo di IgG.

Secondo la presente Invenzione, la profilassi e la terapia delle reazioni Infiammatorie comportano la somministrazione di IgA ad un soggetto che ne abbisogna. Tale soggetto deve essere un soggetto passibile di Infiammazione o attualmente sottoposto ad eventi Infiammatori deleteri In atto. A tale soggetto pu? anche venire somministrato un appropriato antibiotico e/oppure un antiflogistico. In alcune condizioni si pud comprendere anche un antiacido. Uno o pi? di questi componenti possono venire confezionati come un tutto con Istruzioni appropriate, che debbono Indicare dosaggi e regimi di somministrazione. Preferibilmente, ciascuno di questi componenti A praticamente privo di IgG.

L'espressione "praticamente privo di IgG" denota un massimo contenuto di IgG del 20X rispetto alla somma di Immunoglobuline, e preferibilmente non pi? del 10X di IgG. Si preferisce pure che la frazione di ImmunoglobulIna sia praticamente priva di IgM (non pi? del 5X, preferibilmente non pi? del 3X> . Per conseguenza, s i preferisce ridurre al minimo o eliminare la presenza di IgG e IgM nella realizzazione della presente Invenzione.

La metodologia ed il kit corrispondente della presente invenzione sono pure utili in combinazione con coadiuvanti. I coadiuvanti sono tipicamente microorganismi Inattivati o tossine che vengono usati per migliorare la risposta immunologlca ad un antigene impiegato nella vaccinazione. La somministrazione di IgA insieme al coadiuvante assicura che l'Infiammazione indesiderabile indotta dal coadiuvante verr? minimizzata o eliminata del tutto.

Un ulteriore aspetto della presente Invenzione si riferisce ad una preparazione farmaceutica contenente almeno il 5X, preferibilmente almeno il 10X di IgA multlmerlco. Questa preparazione deve essere praticamente di IgG polimerico. "Praticamente priva di IgG polimerico" Indica un massimo del 10X di IgG polimerico rispetto alla somma delle immunoglobulIne. Preferibilmente, la somma delle Immunoglobuline contiene non pi? del 5X di IgG polimerico. Si preferisce pure che la preparazione di ImmunoglobulIna contenente IgA multimerlco sia praticamente priva di IgM.

La desiderabilit? di IgA multimerlco ? basata sulla sorprendente scoperta che anche un basso grado di polimerizzazione -di IgA (per esemplo mediante aggregazione termica) migliora l'effetto antiinf iammatorlo dell'IgA. Questo effetto dell'IgA multimerico ? Inatteso tenendo conto del ben noti effetti dannosi dell'IgG polimerico. che ? responsabile per attivit? non specifiche ed eccessiva anticomplementarlet?. Una preparazione farmaceutica secondo la presente Invenzione comprende preferibilmente IgA come Ingrediente principale, che opzionalmente 6 almeno praticamente privo di IgG. SI preferisce minimizzare o eliminare la presenza di IgM ed IgG nelle loro varie forme.

L'attivit? entiInfiammatoria di una sostanza pu? venire determinata per mezzo di un nuovo ed affidabile saggio in vitro. Il saggio della presente invenzione comporta l'incubazione di monociti (una cellula producente cltochlna) in un mezzo privo di siero in presenza di una sostanza da provare. I monodtl vengono quindi esposti in uno stimolo infiammatorio, che tipicamente costringerebbe 1 monodtl ad esprimere citochine infiammatorie. La quantit? delle citochine espresse, come TNF-a. TNF-?. IL-1 e IL-6. viene quindi determinata. Confrontando la quantit? di citochine espresse nei monociti Incubati con la sostanza di prova, con un controllo, che viene realizzato in assenza della sostanza di prova. si ottiene una accurata indicazione dell'attivit? antiinfiammatoria della sostanza che deve essere provata. In questo saggio si possono puTe usare linfociti e granulociti.

Lo stimolo infiammatorio impiegato nel saggio della presente invenzione ? preferibilmente un batterlo Inattivato, quale Haemophllus influenza, o un suo costituente. Altri stimoli adatti comprendono escherlchla coli. LPS o polisaccaride menlngococdco.

Il nuovo saggio precedentemente descritto ha dimostrato che IgA possiede una attivit? antiInfiammatoria generale, che differisce dal ben noto modello di funzione di anticorpo. Tale attivit? entiinfiammatoria pu? pure venire dimostrata dall'inibizione del rilascio del radicale ossigeno da parte di monodtl e granulocitl. Il rilascio di questi radicali in una reazione Infiammatoria porta ad un significativo danneggiamento del tessuto nel sito dell'Infiammazione. Questo fenomeno ? noto come "combustione respiratoria" che pud venire misurata con un modello in vitro usando Hib Incubato in presenza di granulocitl neutrofm . L'attivit? anti Infiammatoria pud pure venire determinata dall'inibizione dell'attivazione di linfocito T in risposta ad un super antlgene (quali enterotosslne stafilococciche, tossina una di sindrome da schock tossico) e antlgene di richiamo (come toxolde del tetano) .

L'effetto antlinfiammatorio di IgA non ? soltanto basato sulla presenza di antlcorpl neutralizzanti specifici. Questo ? stato dimostrato dall'analisi dtometrlca di flusso usando immunofluorescenza Indiretta. Questa analisi dimostra che le preparazioni di IgA e IgG contengono quantit? comparabili di anticorpi che legano H1b, ma soltanto IgA diminuisce il livello di produzione di TNF-? e IL-6. Le preparazioni di IgG esaminate in concentrazioni analoghe in esperimenti paralleli, non hanno effetto di regolazione verso il basso sul rilascio di dtochlna Indotta da Hib.

Il non affidamento dell'IgA su attivit? neutralizzante specifica ? ulteriormente confermato da studi in cui gli antlcorpl IgA vengono Incubati con Hlb prima dell'aggiunta della miscela al monodtl. Questa Incubazione permetterebbe la formazione di complessi antigene - anticorpo. Tuttavia, l'Incubazione di Hib con IgA non migliora l'Inibizione del rilascio di citochlna infiammatorla.

Secondo la presente Invenzione. l'IgA di siero umano, che A prevalentemente monomero. Impedisce il rilascio di citochlna da monodtl. L'aggregazione termica, che forma multimerl di IgA, migliora l'effetto Inibitore di IgA sul rilascio di TNF-a. Una preparazione farmaceutica secondo la presente Invenzione. contiene preferibilmente IgA multlmerico. che pud venire ottenuto riscaldando una preparazione contenente almeno l'SOX. e pi? preferibilmente almeno il 90%. di IgA in soluzione o in forma liofilizzata. La preparazione deve essere praticamente priva di IgG e non contenere una quantit? rivelabile di IgM. IgG e IgM possono venire rivelati con immunodiffusione radiale singola ("RID").

Preferibilmente, come fonte di IgA si Impiega una frazione di plasma. Per esemplo, una frazione di IgA pu? venire ottenuta mediante cromatografia a scambio Ionico. cromatografia Idrofoba, cromatografia Idrofila o cromatografia per affinit? di una frazione di plasma, quale la frazione Cohn III. Questo procedimento contribuisce pure alla riduzione di una potenziale infettivit? virale, poich? i virus vengono Inattivati e oppure rimossi con il frazionamento di Cohn.

Il riscaldamento pu? venire effettuato tra 40 e 70"C. preferibilmente tra 60 e 65*C per un tempo da vari minuti a 24 ore. preferibilmente tra 1 e 10 ore. Per eliminare gli aggregati macroscopici, la frazione pu? quindi essere centrifugata. Successivamente si pu? determinare il grado di multimerizzazione mediante cromatograf la a permeazione di gel o altri metodi comuni. La quantit? relativa di multimerl di IgA pu? venire controllata scegliendo la temperatura ed il tempo appropriati per il procedimento di riscaldamento.

Una preparazione. farmaceutica secondo l'Invenzione deve essere priva di attivit? anticomplementare. Questo viene ottenuto minimizzando il contenuto di IgG polimerico. L'attivit? antlcomplementare di una composizione pu? venire misurata con procedimenti secondo Kabat e Mayer. EXPERINENTAL IMMUNOCH EMISTR Y (Thomas. Springfield 1961) e Public Healt Monograph No.

74 :STANDARDIZED OIAGNOSTIC CONPLEMENT FIXATION METHOD AND ADOPTION TO MICROTEST (Washington. 1965) (eh. 4. Comp?ement e Complement Flxation) e valutata in modo che corrisponda ad un valore secondo il quale sono necessari almeno 10 mg di proteina per la neutral izzazione di una unit? C'H50 ( il 50Z dell'unit? emolitica, definita come quantit? di complemento necessario per una lisi del 50%). Preferibilmente, per la neutralizzazione di una unit? C'H50 sono necessari almeno 35 mg di proteina.

Poich? l'IgA somministrata al soggetto verr? tipicamente ottenuta da varie frazioni del suo sangue, questa deve essere trattata per eliminare o inattivare germi patogeni potenzialmente contaminanti. come virus. Procedure per l'Inattivazione di virus i? prodotti del sangue sono descritte in EP 0 159 311 e nella domanda U.S. N.

07/900.164. qui Incorporate per .riferimento nella loro completezza. Si possono anche adottare altri metodi di inattivazione virale. L'inattivazione virale rende le preparazioni di IgA prive di virus.

Come indicato in precedenza, le preparazioni di IgA della presente invenzione possono venire somministrate localmente o sistemicamente. Cosi, la preparazione contenente IgA pud venire somministrata per via orale, nasale, intravenosa, intraarterlosa. intracavltarla, Intramuscolare, sottocutanea, transdermale. rettale o per altre vie note agli esperti del settore.

Tipicamente, l'IgA ? combinata con un veicolo farmaceuticamente accettabile. Tali veicoli comprendono soluzioni acquose, eccipienti non tossici, compresi i sali, conservanti, tamponi e slmili, come descritto in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15th Ed. Easton: Mack Publishlng Co. pp 1405-1412 e 1461-1487 (1975) e THE NATIONAL FORMULARY XIV.. 14 th Ed. Washington: American Pharmaceutical Assoclation (1975), il contenuto delle quali ? qui Incorporato per riferimento. Esempi di solventi non acquosi sono glicole propilenico, glicole poi ietllenlco, olio vegetale ed esteri organici Iniettabili come etiloleato. Veicoli acquosi comprendono acqua, soluzioni Idroalcoliche, soluzioni saline, veicoli parenterall come cloruro di sodio, destrosio di Rlnger, ecc. Veicoli Intravenosl comprendono fluidi e riempitivi nutrienti. I conservanti comprendono antlmicrobicl, antiossidanti, agenti chelantl e gas Inerti. Il pH e l'esatta concentrazione del vari componenti della composizione legante vengono regolati in funzione dell'esperienza in questo settore. Vedi GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS 7a ed.).

I seguenti esempi intendono illustrare ulteriormente la presente invenzione senza intendere limitarla in alcun modo.

Esempio 1. Purificazione di IgA di siero umano

Le preparazioni di IgA di siero umano purificato vengono preparate mediante frazionamento del plasma. Anzitutto, l'IgA viene purificato dalla frazione di siero Cohn II di grandi quantit? di plasma secondo EP 0 506 651. La preparazione arricchita di IgA viene poi ulteriormente purificata per ottenere un IgA finale che contiene pi? del 95% di IgA e non contiene quantit? rivelabili di IgM oppure IgG. all'esame per immunodlffuslone radiale singola. Una preparazione di IgG, da Impiegare per studi comparativi, viene preparata in modo analogo dalla frazione Cohn II del siero (purezza > del 97%).

Ambedue le preparazioni di ImmunogloblulIna vengono conservate In forma liofilizzata a - 4"C. e tutti gli esperimenti vengono effettuati con un lotto della preparazione di IgA oppure IgG. Immediatamente prima del loro Impiego nelle colture cellulari, le preparazioni di ImmunoglobulIna vengono dlsclolte in mezzo RPMI 1640 (Flow Laboratories. Irvine, UK) addltlvato di penicillina (100 IU/ml), streptomicina (100 pg/ml) e glutammina (2mM. Gibco, Palsley, Scotland) (supplemento RPMI) contenente 1% di albumina di siero umano, disponibile In commercio (frazione di proteina di plasma umano 3.5X, IMMUNO AG, Vienna).

Il mezzo ? noto come "RPMI-HSA".

Esempio II Preparazione di IgA multlmerlco.

IgA di siero umano viene dlsclolto ad una concentrazione di 20 mg/ml in RPMI-HSA ed aggregato mediante riscaldamento a 63?C per 20 minuti. La preparazione viene poi centrifugata a 600x g per 10 minuti per allontanare gl i aggregati macroscopici. Esemplo III. Preparazione di monostratl di monoclta umano e stimolazione del rilascio di citochina.

Cellule mononuclearl umane ("MNC") vengono Isolate da sangue periferico eparlnlzzato (7,5 IU di eparina priva di conservante per mi) prelevato da volontari sani, mediante centrifugazione a gradiente di densit? di galleggiamento su Lymphoprep (Nyegaard & Co. Oslo. Norway). secondo il procedimento di Bayum A Scan. J. Clln. Lab. Invest. 21 (Suppl. 97):77 (1968). Le cellule dell'Interfase vengono aspirate e lavate tre volte In cloruro di sodio allo 0.9X. Dopo l'ultima fase di lavaggio, le cellule vengono

rlsospese ad una concentrazione di 1 x 106/mi in complemento RPNI contenente il 10X di siero umano AB Inattivato (30 minuti a 56*0 oppure il 10X di siero fetale bovino Inattivato a caldo (FKS. Flou Laboratories) (mezzo completo).

Per la preparazione dei monostratl monodtlci. aliquote di 1 mi della sospensione HNC vengono pipettate in piastre di coltura in plastica a fondo piatto da 24 pozzetti (Falcon 3047 Hultlwell Ussue Culture Piate, Becton Dickinson Labuare, Lincoln Park. NJ). Dopo un tempo di Incubazione di 90 minuti a 37*C in un Incubatore contenente il 5X di anidride carbonica in aria umidificata, gli strati monodtlci aderenti vengono lavati tre volte con soluzione salina per rimuovere le cellule non aderenti. Le cellule aderenti vengano poi ulteriormente Incubate in mezzo completo per-24 ore per diminuire la produzione di citochina di fondo non specifica. Le cellule vengono poi lavate tre volte con cloruro di sodio 0.15 M. ed il rilascio della cltochlna viene Indotto aggiungendo Hlb di ceppo Eagan incapsulato e Inattivato a caldo (partita di 2 x IO9 batteri/ml. concentrazione finale 1 x IO6 batterl/ml) oppure LPS purificato (lipopoiIsaccarlde preparato da sierotlpo di E. coll 0111:B4 per estrazione fenollca, fornito dalla Sigma Chemical Co., Sigma No L-2630, concentrazione finale 1 ng/ml) alle colture cellulari. 500 mlcrolltri di RPMI-HSA contenente Hlb (2 x 106/ml) o LPS (2ng/ml) vengono miscelati con 0.5 mi di IgA oppure IgG In RPMI-HSA con diluizioni varianti tra 0,2 mg e 20 mg/ml. Un mi di questa miscela viene aggiunto ad un pozzetto della piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti contenente i monod ti aderenti. In esperimenti scelti, la miscela di batteri e di Immunoglobulina viene prelncubata per 30 minuti a 37*C prima dell'aggiunta alle colture cellulari. Le colture di monod tl fissate in presenza di solo Hib, IgA oppure IgG da soli, o del solo mezzo servono come controllo.

Dopo aggiunta di Hib con o senza immunoglobulina alle cellule, i monostratl di monocito aderenti vengono Incubati per 24 ore a 37*C in un Incubatore a anidride carbonica. Le cellule supernatantl vengono quindi aspirate e centrifugate a 9000 x g x 3 minuti per eliminare i7 materiale cellulare contaminante. Si determina il contenuto di citochlna. Se la determinazione del contenuto di citochina non pud essere effettuata nello stesso giorno. i supernatanti vengono distribuiti In aliquote che vengono conservate congelate a - 20"C per un massimo di 3 giorni, fino a quando si effettua la misurazione delle concentrazioni di TNF-? e IL-6.

Per determinare il numero di cellule aderenti per pozzetto e la purezza del manodtl aderenti dopo 24 ore di stimolazione con Hib, le cellule aderenti vengono distaccate con cautela. Le cellule vengono poi centrifugate e il numero delle cellule viene contato con un contatore Coulter. In 4 prove, possono essere raccolte, dopo 24 ore di stimolazione

con Hib. 1,0 ? 0,3 x 105 cellule per pozzetto (media ? SEM di quattro determinazioni). La vitalit? delle cellule (determinata con esclusione di blu trypan) 6 di 76 ? 5.5X. Con l'esame mediante citometrla di flusso usando un anticerpo monoclonale CD14-specifico (M02, Coulter Immunology. Hlaleah, FL) In Immunofluorescenza diretta, le cellule aderenti contengono 86 ? 4.9% di monocltl.

Esemplo IV. Esame del rilascio di citochlna In monodtl pretrattatl con Hlb.

Anzich? 24 ore di stimolazione di monodtl aderenti, come precedentemente descritto, le cellule vengono stimolate per 3 ore con Hib in presenza di IgA (IO mg/ml) oppure di solo Hib. I monostrati monocitici vengono poi lavati due volte con soluzione salina per rimuovere Hib libero, e le cellule vengono successivamente coltivate per 21 ore in mezzo fresco contenente IgA (10 mg/ml} oppure RPMI-HSA fresco da solo (mezzo di controllo). I monodtl supernatanti vengono poi raccolti come precedentemente descritto, e le concentrazioni di citochlna vengono determinate mediante ELISA.

Esemplo V. Misurazione di TNF-?, IL-6 e GM-CSF nel supernatantl monocitld.

Le concentrazioni di TNF-?, IL-6 e GM-CSF vengono determinate nel supernatantl monodtid diluiti 1:30 per TNF-a, 1:5 x IL-6 oppure 1:2 x GM-CSF. usando kits ELISA disponibili In commercio (TNF-? EASIA, e IL-6-EASIA, Medgenlx Diagnostics, Fleurus. Belglum e Ouantikine Human GM-CSF Immunoassay, R & D Systems, Minneapolis, MN).

Gli anticorpi monoclonall specifici per la rispettiva citochlna usati nel saggi TNF-? e IL-6 sono anticerpi non neutralizzanti che reagiscono con un epitopo sulla molecola della citochina differente dal sito legante recettore. Conseguentemente. i risultati di questi saggi non debbono essere spostati dalla presenza di recettori o Inibitori di cltochlna solubili. I risultati sono espressi come pg/ml di IL-6, TNF-? o GM-CSF, calcolati da una curva di taratura ricavata per regressione lineare sulle concentrazioni logaritmiche trasformate degli standard di cltochlna forniti con il kit ELISA, con riferimento alla rispettiva densit? ottica di ELISA trasformata logaritmicamente.

Per valutare l'effetto di IgA o IgG sul rilascio di cltochlna, l'Inibizione Indotta da Immunoglobul ina viene espressa come percentuale di controllo rispetto al rilascio di cltochlna osservato in colture cellulari stimolate con solo Hlb In assenza di ImmunoglobulIna (controllo positivo al 100X) oppure come percentuale di inibizione (cio? 100- percentuale di controllo}. La percentuale di controllo viene calcolata con la formula seguente.

in cui X ? la concentrazione di cltochlna del campione sperimentale (monodtl pi? Immunoglobulina pi? Hib oppure LPS) . I ? la concentrazione di dtochina nel supernatante nel monodtl incubati in presenza di sola Immunoglobulina, B ? il rilascio di dtochina di fondo (coltura di soli monodtl). e C ? la concentrazione di dtochina rilasciata da monodtl Incubati in presenza di Hib oppure LPS senza immunoglobulIna (100 Z del controllo).

Esempio 6. Effetto di IgA sul rilascio.di TNF-? e IL-6 in monodtl umani.

I monodtl umani rilasciano quantit? significative di dtochine Infiammatorie quando vengono Innescati da batteri gram-negativi quali Hib. Si esamina l'effetto di IgA sul rilascio di TNF-? e IL-6 indotto da Hib.

Si isolano anzitutto monociti umani da cellule mononuclearf di sangue periferico mediante piastre di coltura tlssutall in plastica per aderenza a 24

pozzetti (mezzo completo 1 x 106 ) MNC/pozzetto/ml). I monociti aderenti vengono stimolati per 24 ore con

Hib (1 x 106 batteri/ml/pozzetto) in RPMI-HSA contenente IgA di siero umano alle concentrazioni indicate. I pozzetti di controllo contengono monodtl coltivati i.n presenza di solo Hib. Dopo 24 ore di Incubazione, si determinano mediante ELISA, le concentrazioni di TNF? IL nelle cellule

libere del supernatante. I risultati sono espressi in pg/ml (media ? SEM di otto singole prove). I monodtl coltivati in mezzo solo rilasciano 18 ? 9 pg/ml di TNF-? e 61 ? 50 pg/ml di IL-6. Il rilascio di dtochlna di fondo in colture contenenti solo IgA ? di 31 ? 20 pg/ml (0,1 mg/ml) e 562 ? 263 pg/ml (10 mg/ml) per TNF-?, e 255 ? 148 e 121 ? 82 pg/ml per IL-6 .

I dati presentati nella figura 1 dimostrano che l'Incubazione del monodtl in presenza di Hib (1 x 6

10 batteri/ml) in condizioni prive di siero (in supplemento RPMI contenente 1'1Z di HSA) inducono il rilascio di quantit? significative di TNF-a (43198 ? 6912 pg/ml) e IL-6 (10990 ? 669 pg/ml). L'asterisco ("*") Indica una differenza statisticamente significativa tra le cellule trattate con IgA ed il controllo (p < di 0,005, test Mann-Whitney U).

L'aggiunta di IgA in concentrazioni finali comprese tra 0.1 e 10 mg/ml alle colture di monociti e Hib ha portato ad una diminuzione dose-dipendente nel rilascio di ambedue le cltochlne (figura 1). L'Inibizione mediata da IgA del rilascio di TNF-? d massima a 3 mg/ml (percentuale di Inibizione, media ? SEM di otto esperimenti : TNF-a 65 ? 5. differenza significativa se confrontata a colture con solo Hib. in cui si ha p - 0.001636 con il test Mann-Whltney U. e non viene ulteriormente aumentata aumentando la concentrazione di IgA fino a 10 mg/ml. L'effetto di IgA sul rilascio di IL-6 ? massimo a 10 mg/ml (Inibizione di 81 ? 5X. p - 0.000389), ma si pu? anche osservare una inibizione statisticamente slgnlficativa del 59 ? 9% a 3 mg/ml (p ? 0,001161).

L'Inibizione mediata da IgA nel rilascio della dtochlna non ? dovuta ad una riduzione del numero dimonociti nelle colture o a una diminuzione della vitalit? delle cellule. Come si pu? vedere nella tabella 1 seguente, l'aggiunta di IgA (10 mg/ml) alle colture non ha effetto sul numero di monocitl per pozzetto. La vitalit? delle cellule (determinata con esclusione di blu trypan ? pure invariata (dato non riportato). Ci? indica che l'IgA ha un effetto sulla produzione e/oppure il rilascio delle citochine che interessano.

1 valori rappresentano la media ? SEM per quattro esper (1) Il numero di cellule 6 stato determinato con un contatore Coulter dopo distacco delle cellule aderenti con una bacchetta di gomma.

(2) Determinata mediante ciclometria di flusso con un CD14 mAB in immunofluorescenza diretta dopo aver staccato le cellule aderenti.

(3} IgA di siero umano ? stato Impiegato a 10 mg/ml. (4) Differenza significativa se confrontata a Hib da solo (p - 0,0455. test di Frledman del chi quadrato per serie).

La figura 2 mostra che l'IgA di siero umano regola verso il basso il rilascio di TNF-? e IL-6 Indotto da Hib nel monociti umani, ma non ha effetto sulla produzione di GM-CSF dopo la stimolazione con Hib

aderenti vengono stimolati per 24 ore con Hlb In presenza o assenza di IgA (IO mg/ml) come 6 stato spiegato per l'esperimento della figura 1. Le concentrazioni di TNF-?. IL?6 e GM-CSF vengono determinate mediante ELISA, ed i risultati sono Indicati come pg/ml (media ? SEM di otto singoli esperimenti). Il rilascio di dtochlna di fondo di TNF-? e IL-6 ? descritto nella discussione della figura 1. I monodtl coltivati nel solo mezzo non rilasciano quantit? rivelabili di GM-CSF. e soltanto In due degli otto esperimenti si ? rivelato un basso rilascio di fondo di GM-CSF (inferiore a 50 pg/ml) in colture contenenti IgA (10 mg/ml) senza Hib. L'asterisco ("*") indica una differenza statisti cernente significativa tra le cellule trattate con IgA ed il controllo (p < 0.005. test U di Mann-Whitney).

Anche elevate concentrazioni di IgA (10 mg/ml) non hanno effetti inibitori sul rilascio di GM-CSF dopo la stimolazione con Hib, mentre il rilascio di TNF-? e IL-6 misurato negli stessi supernatantl sono diminuiti in modo significativo. Quindi. la modulazione verso il basso del rilascio di TNF-? e IL-6 non 6 dovuta ad una capacit? generalmente diminuita dei monodtl a rilasciare dtochine dopo la stimolazione con Hib.

La diminuzione della concentrazione di TNF-? e IL-6 misurata nel supernatantl monodtld in presenza di IgA, A dovuta ad una reale modulazione verso il basso del rilascio di certe dtochlne e non 6 dovuta ad Inibizione della rivelazione della cltochlna. I risultati Illustrati nella tabella 2 seguente mostrano che l'aggiunta di fino a 25 mg/ml di IgA o IgG di siero umano al supernatante del monodtl attivati con -Hib. non ha effetto signiflcatlvo sulla quantit? di TNF-a oppure IL-6 rivelato, che esclude una possibile Interferenza degli anticerpi di IgA e IgG con la misurazione di queste cltochlne con i saggi ELISA.

CD IgG o IgA diluiti in RPMI-HSA oppure RPMI-HSA da solo A stato aggiunto a supernatanti di 24 ore (diluiti 1:3 in RPMI-HSA) di monodtl stimolati con Hib.

(2) I valori rappresentano la media ? SEM di tre esperimenti indipendenti.

Inoltre, la diminuzione osservata del rilascio di TNF-? e IL-6 mediata da IgA non ? un artificio dovuto ad una elevata concentrazione di proteine nelle colture contenenti IgA. L'aggiunta di quantit? equivalenti di albumina di siero umano ( HSA) alle colture che si ottengono In una concentrazione finale di 20 mg/ml di HSA. non ha effetto sul rilascio Indotto da Hib di queste citochine. I risultati sono i seguenti: rilascio di TNF-?, pg/ml (% di controllo) : (i) HSA 10 mg/ml 18.540 ? 5678. HSA 20 mg/ml 14.922 ? 5040 (84 ? BX) e di) rilascio IL-6 . pg/nl : HSA 10 mg/ml 2426 ? 687. HSA 20 mg/ml 2567 ? 766 (109 ? 10X) (media ? SEM di quattro esperimenti) .

L'Inibizione mediata da IgA del rilascio di TNF-? e IL-6 indotto da Hib non viene aumentata facilitando l'Interazione di IgA con Hib. I dati dimostrano che la preincubazione di Hib con IgA (10 mg/ml) non migliora l'effetto percentuale di Inibizione di rilascio di dtochina. media ? SEM (1) IgA IO mg/ml e Hib aggiunti alle cellule senza prelncubazlone (n - 8). TNF-a 63 ? 7. IL-673 ? 11 e (2) Hib preincubato con IgA per 30 minuti a 37?C prima dell'aggiunta di Hib e IgA alle cellule (n -11) : TNF-a 59 ? 9. il-6 (51 ? 18).

G1i esperimenti illustrati nella figura 3 mostrano che IgA regola pure verso il basso il rilascio di TNF-? e IL-6 in risposta a stimolo con uno stimola solubile, LPS purificato da E. coli. Anzitutto, i monodtl aderenti vengono stimolati per 24 ore con LPS (1 ng/ml) in RPMI-HSA contenente IgA di siero umano (da 0.1 mg/ml a 10 mg/ml). I pozzetti di controllo contengono monocitl e LPS, monocitl e IgA oppure monocitl coltivati in solo RPHI-HSA. Dopo l'Incubazione di 24 ore. si determina il rilascio di TNF-? e IL-6 nel supernatanti privi di cellule, mediante ELISA. I risultati presentati nella figura 3 sono espressi come percentuale di rilascio di dtochina di controllo (citochine rilasciate da monodti stimolati con LPS in assenza di IgA), calcolata come precedentemente descritto (media ? SEH di sei esperimenti). Le cellule di controllo stimolate con LPS rilasciano 16.657 ? 5.536 pg/ml di TNF-? e 1110 ? 294 pg/ml di IL-6. Test di Wllcoxon delle serie segnate con coppia affiancate della differenza di livelli di dtochina (pg/ml) tra colture trattate con IgA e colture di controllo : p - 0.029586, (**) p - 0.018016.

I risultati della figura 3 mostrano che la risposta alla dose dell'Inibizione mediata da IgA ? comparabile al rilascio di TNF-? e IL-6.

Esemplo VII. Effetto di IgA multimerlco su rilascio di TNF-? e IL-6 Indotto da Hib.

I dati della figura 4 mostrano che l'effetto Immunomodulante dell'IgA di siero umano sul rilascio di TNF-? viene significativamente migliorato se ? presente IgA In forma multlmerica.

I monociti umani Isolati da cellule mononuclearl di sangue periferico di volontari adulti sani. mediante aderenza a superflcl plastiche, vengono coltivati In 24 pozzetti di piastre di tessuto di plastica. I monociti aderenti

vengono Incubati alla presenza di H ib (1x106 batteri/ml/pozzetto) e IgA aggregato a caldo o monomerlco (concentrazione finale 10 mg/ml). Le colture di controllo vengono fissate con monociti e Hib da solo. Dopo 24 ore, i supernatantl privi di cellule vengono raccolti e si determinano le concentrazioni di TNF-? e IL-6 mediante ELISA. I risultati sono espressi come pg/ml (media ? SEM di sei singoli esperimenti).

I sei esperimenti, l'IgA monomero riduce il rilascio di TNF-? di 48 ? 9X, mentre l'Inibizione al rilascio di TNF-? Indotta da IgA multlmerlco (aggregato a caldo) In parallelo ? di 73 ? 5X (media ? SEM. n - fi, p - 0,018686 rispetto alla percentuale di Inibizione di IgA monomerlco, test U di Mann-Whltney). L'aggregazione termica migliora solo leggermente l'effetto Inibitore di IgA sul rilascio di IL-6 (X di Inibizione, media ? SEM: IgA monomerlco 78 ? 8X, IgA polimerico 89 ? 3X).

Esemplo VIII. Studi sull'inibizione con IgA e IgG. La figura 5 Illustra che IgA riduce in nodo significativo il rilascio di TNF-? e IL-6 mediante monodtl aderenti dopo la stimolazione con Hib, ma IgG esaminato ad una concentrazione slmile non ha effetto sul valori di rilascio di dtochlna. Anzitutto, monodtl umani Isolati da sangue periferico di volontari sani per aderenza a plastica vengono coltivati in piastre di coltura di tessuto

(circa 1 x 105 nonoclti aderiii/pozzetto/ml) in

presenza di Hib (1x106 batterl/ml/pozzetto) e IgA o IgG (concentrazione finale 10 mg/ml) per 24 ore.

SI determinano quindi i livelli di TNF-? e IL-6 nel supernatantl privi di cellule mediante ELISA. .1 risultati rappresentano pg/ml (media ? SEM di otto singoli esperimenti).

I monodtl coltivati in presenza di Hib senza immunoglobul ina servono come controllo positivo, e le cellule coltivate in mezzo solo senza Hib sono state esaminate per determinare il rilascio di cltochlna di fondo (TNF-a 202 ? 123 pg/ml, IL-615 ? 8 pg/ml). I monodti coltivati in presenza di IgG (19 mg/ml) da solo rilasciano 449 ? 182 pg/ml di TNF-? e 9 ? 5 pg/ml di IL-6: i supernatanti delle cellule trattate con IgA (10 mg/ml) da solo

contengono 721 ? 244 pg/ml di TNF-? e 6 ? 2 pg/ml di 'IL-6. La valutazione statistica della differenza tra il rilascio di cltochina in presenza di IgA o IgG, rispetto alle cellule coltivate in presenza di Hib* da solo ? stata effettuata usando il test U di Hann-Whltney : * p-0,004326. ** p - 0,001636.

Esempio IX. Legame di IgA e IgG a Hib.

Poich? soltanto IgA e non IgG regola verso il

basso il rilascio di dtochlna indotto da Hib, ? stato studiato il legame delle preparazioni di IgA e IgG con Hib. Anzitutto Hib ? stato incubato con diluizioni logaritmiche di IgA oppure IgG di siero umano purificato, ed il legame degli anticorpi di

IgA e IgG ? stato rivelato con immunofluorescenza indiretta e valutato con un dtofluorografo. Il

mezzo di controllo rappresenta la colorazione dei

batteri con anti - IgA coniugato con FITC, oppure il

solo reagente anti IgG.

Listogramma FACS rappresentativo riportato

nella figura 6 mostra che sia gli anticorpi di IgA

che di IgG si legano ad Hib, e le determinazioni

semiquantitative Indicano che ambedue le

preparazioni contengono titoli comparabili di

anticerpi Hib - specifici.

Esempio X. Effetto di IgA di siero umano sull'Induzione di dtochlna e rilascio di dtochlna in monocltl stimolati con Hlb.

Vi sono molte spiegazioni possibili per l'effetto inibitore di IgA su rilascio di TNF-? e IL-6 Indotto da Hib. Per esempio, IgA pu? interferire con la stimolazione Indotta da Hib del rilascio di citochina bloccando il legame di Hib alla membrana superficiale del monocito. Questo porterebbe successivamente alla diminuzione del livello di rilascio di citochina. La diminuzione mediata da IgA del rilascio di TNF-? e IL-6 Indotto da Hlb, pu? anche essere il risultato di una vera regolazione verso il basso della produzione di citochina e/oppure rilascio di citochina. nel monociti stimolati con Hib.

Lo studio seguente ? stato eseguito per ottenere altre Informazioni sui meccanismi antiinfiammatori di IgA. I monocltl umani sono stati isolati da cellule mononuclearl di sangue periferico C'MNC") mediante aderenza a piastre di tessuto

plastico a 24 pozzetti (1 x106 MNC/ml/pozzetto). I monostratl di monocito sono stati stimolati per tre

ore

contenente 10 mg/ml di IgA. I monociti aderenti vengono quindi lavati due volte per Mnuovere l'Hib, e poi vengono Incubati per 21 ore in mezzo fresco (RPMI-HSA) contenente 10 mg/ml di IgA di siero umano CHib IgA ? > IgA) oppure In RPMI-HSA fresco da solo CHib - IgA ? > Med). Colture parallele sono state stimolate per tre ore con Hib, lavate e quindi esposte a 10 mg/ml di IgA durante le seguenti 21 ore di periodo di Incubazione (Hib - > IgA). I supernatanti privi di cellule vengono raccolti dopo l'Incubazione di 21 ore dopo la stimolazione con Hib per tre ore, quindi si determinano le concentrazioni di TNF-di e IL-6 mediante ELISA. Le cellule di controllo che vengono stimolate per tre ore con Hib vengono lavate, quindi coltivate per 21 ore in RPMI-HSA senza IgA (Hib --> Med) e rilasciano 4939 1588 pg/ml di TNF-? e 1626 728 pg/ml di IL-6. Il rilascio di citochina nelle cellule trattate con IgA viene espresso come percentuale di questo rilascio di citochina di controllo, calcolato come precedentemente descritto ( media SEM di quattro singoli esperimenti). Altri pozzetti che non vengono trattati con Hib ma che subiscono gli appropriati cambi di mezzo e vengono esposti a IgA o mezzo solo, contengono tra 65 54 (Med- > IgA) e 113 38 (IgA ? >IgA) pg/ml di TNF-? e tra ? ? 8 (IgA ? >Med) e 21 ? 14 (Med - > IgA) pg/ml di IL?6.

1 supernatantl raccolti innnediatamente dopo la stimolazione di 3 ore con Hib, contengono soltanto quantit? molto basse di TNF-? (502 ? 178 pg/ml) e IL-6 (288 ? 124 pg/ml, media ? SEM di tre esperimenti), mentre i supernatantl raccolti dopo una incubazione di 21 ore successiva alla stimolazione di 3 ore con Hib (dopo che lo stimolo ? stato rimosso con lungo lavaggio) contengono 3385 ? 463 pg/ml di TNF-? e 1900 ? 953 pg/ml di IL-6, Indicando che 1'88 * 3X del TNF-? totale e 1186 ?3% del1 1IL?6 totale che vengono indotti dalla stimolazione di tre ore con Hib, viene rilasciato durante le 21 ore successive alla stimolazione. La stimolazione continua per 24 ore con Hib porta ad un livello da 2 a 3 volte pi? alto di TNF-? (12.849 ? 2.904 pg/ml) e IL-6 (4278 ? 766 pg/ml) rispetto al livelli di queste dtochine nelle colture di 21 ore del monociti pretrattatl per 3 ore con Hib.

Come si vede nella figura 7, i monociti stimolati per 3 ore con Hib rilasciano quantit? notevolmente ridotte di TNF-a e IL-6 quando si aggiunge IgA (10 mg/ml) al sistema durante il tempo di rilascio della citochlna. dopo che l'Hib ? stato asportato per lavaggio (Hib ? > IgA). Inoltre. l'IgA aggiunto alle colture cellulari durante le tre ore di stimolazione con Hib diminuisce pure il rilascio di TNF-? e IL-6 durante le 21 ore successive alla stimolazione, dopo che l'IgA e lo stimolo sono stati rimossi con lungo lavaggio (Hib Iga - > Med).

Questi risultati Indicano che l'IgA modula verso il basso sia l'Induzione della produzione di citochlna che il rilascio di citochlna. Se l'IgA 6 presente sia durante l'Induzione di citochlna (le prime tre ore} che durante il rilascio di citochina in assenza dello stimolo (le 21 ore successive), l'effetto Inibitore sul rilascio di TNF-? e IL-6 ? massimo (Hib IgA - >IgA).

Riassumendo, IgA regola verso il basso il rilascio di TNF-? e IL-6 in monodtl umani attivati con lo stimolo partlcolato Hib. Il rilascio di TNF-a e IL-6 viene regolato verso il basso quando l'IgA ? presente durante il periodo di stimolazione continua del manodtl con Hib. L'IgA inibisce pure il rilascio di TNF-? e IL-6, se presente durante l'Induzione di citochlna. Inoltre, l'IgA ? inibitore se viene aggiunto al monodtl pretrattati con Hib dopo l'Induzione della produzione di citochina.

durante il tempo del rilascio di dtochina ed anche dopo che lo stimolo ? stato rimosso mediante lungo lavaggio. Quando IgA ? presente sia durante l'Induzione di dtochina che durante il rilascio di dtochina, la regolazione verso il basso della produzione di TNF-? e IL-6 mediata da IgA ? massima. Questo indica fortemente non soltanto un effetto preventivo di IgA sulle reazioni infiammatorie ma anche un effetto terapeutico. La conoscenza o l'accuratezza del modo proposto di azione dell'IgA precedentemente descritto, tuttavia, non ? necessario per la realizzazione della presente Invenzione .

Si comprender? che la descrizione, tabelle, figure ed esempi specifici, mentre indicano realizzazioni preferite dell'invenzione, vengono forniti a semplice titolo di illustrazione e non Intendono limitare la presente Invenzione. Vari cambiamenti e modifiche nello spirito e scopo della presente invenzione saranno evidenti agli esperti di questo settore dalla descrizione e dai dati in essa contenuti .

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la prevenzione di Infiammazione, comprendente la fase di somministrare profilatticamente una preparazione comprendente IgA ad un soggetto. Z. Procedimento secondo la rivendicazione 1. in cui detta preparazione 6 praticamente esente da IgG. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detto IgA comprende IgA multlmerico. 4. Procedimento secondo la rivendicazione 3. in cui detta preparazione A praticamente esente da IgG polimerico . 5. Procedimento secondo la rivendicazione 1, comprendente inoltre la fase di somministrare un composto scelto dal gruppo costituita da antibiotici, antiflogistici ed antiacidi. 6. Metodo.di trattamento, comprendente la fase di somministrare una quantit? di IgA ad un soggetto che soffre di infiammazione, in cui detta quantit? A sufficiente a migliorare detta Infiammazione. 7. Procedimento secondo la rivendicazione 6, in cui detta preparazione A praticamente priva di IgG. 8. Procedimento secondo la rivendicazione 6, In cui detto IgA comprende IgA multlmerico. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui detta preparazione 6 praticamente priva di IgG poi imerico. 10. Procedimento secando la rivendicazione 6. comprendente Inoltre la fase di somministrare un composto scelto dal gruppo costituito da antibiotici, antiflogistici e antiacidi. 11. Kit antlinfiammatorio comprendente: una preparazione comprendente IgA in'un veicolo farmaceuticamente accettabile, e Istruzioni per la somministrazione dell'lgA per prevenire o trattare l'infiammazione. 12. Kit antlinfiammatorio secondo la rivendicazione 11. in cui detta IgA comprende IgA multimerlco. 13. Kit antlinfiammatorio secondo la rivendicazione 11, in cui detta preparazione comprende inoltre un composto scelto dal gruppo costituito da antibiotici, antiflogistici ed antiacidi . 14. Preparazione antiinfiammatorla comprendente IgA multimerlco che ? praticamente privo di IgG. 15. Kit antlinfiammatorio secondo la rivendicazione 11, in cui detta preparazione ? protetta da virus. 16. Procedimento per valutare l'attivit? anti inilaminatoria di una sostanza da provare, comprendente le fasi di : incubare cellule che producono citochlna in presenza di uno stimolo Infiammatorio e detta sostanza da provare; e valutare dette cellule di detta fase di Incubazione per la produzione di dtochine. 17. Procedimento di vaccinazione, comprendente la fase di somministrare IgA ed un antigene. 18. Procedimento di vaccinazione, secondo la rivendicazione 17, comprendente inoltre la fase di somministrare un coadiuvante. 19. .Procedimento di vaccinazione secondo la rivendicazione 17. in cui detto IgA comprende IgA multimerico . 20. Procedimento di vaccinazione secondo la rivendicazione 19, in cui detta preparazione ? praticamente priva di IgG. 21. Preparazione per vaccinazione comprendente un antlgene ed IgA. 22. Preparazipne per vaccinazione secondo la rivendicazione 21. in cui detta IgA comprende IgA multlmerlca. 23. Preparazione per vaccinazione secondo la rivendicazione 21, in cui detta preparazione ? praticamente priva di IgG. 24. Preparazione per vaccinazione secondo la rivendicazione 21, comprendente inoltre un coadiuvante . 25. Procedimento per immunomodulazione, comprendente la fase di somministrar?e una preparazione comprendente IgA ad un soggetto che necessita l'immunomodulazione. 26. Procedimento secondo la rivendicazione 25, in cui detta IgA comprende IgA mu?timerica. 27. Kit per immunomodulazione, comprendente: uria preparazione comprendente IgA in un veicolo farmaceuticamente accettabile, e istruzioni per la somministrazione di IgA per effettuare l'immunomodulazione. 28. Kit per immunomodulazione secondo la rivendicazione 27, in cui detta IgA comprende IgA multimerica .