HK40031637B - Non-integrating dna vectors for the genetic modification of cells - Google Patents

Claims (15)

1. Procédé in vitro destiné à améliorer l'expression et l'efficacité d'implantation d'un vecteur d'expression à S/MAR épisomique auto-réplicable, non intégrant dans une cellule cible de vertébré, comprenant les étapes suivantes :

   a. fournir un vecteur d'expression à S/MAR épisomique comprenant :

   i. une région à sélection de réplication bactérienne comprenant une origine de réplication bactérienne et un marqueur sélectionnable ;

   ii. une unité de transcription destinée à l'expression d'un transgène dans une cellule de vertébré, comprenant un promoteur, une UTR en 5', un transgène et une UTR en 3' ;

   iii. un insert S/MAR situé au sein de ladite UTR en 3' ; et

   b. modifier le vecteur d'expression à S/MAR épisomique de sorte que le S/MAR soit flanqué par un site donneur d'épissage en 5' et un site accepteur d'épissage en 3' au sein de ladite UTR en 3', moyennant quoi le vecteur d'expression à S/MAR épisomique auto-réplicable, non intégrant résultant a une expression et une efficacité d'implantation améliorées après une transfection d'une cellule de vertébré.
2. Procédé de la revendication 1, dans lequel ledit insert S/MAR contient des motifs internes de terminaison de la transcription AATAAA.
3. Procédé de la revendication 2, dans lequel lesdits motifs de terminaison de la transcription AATAAA dans ledit S/MAR sont remplacés par des motifs AATATT.
4. Procédé de la revendication 1, dans lequel ledit S/MAR est choisi dans le groupe constitué par un S/MAR de l'interféron bêta humain, un S/MAR du M18, un S/MAR de l'apolipoprotéine B.
5. Procédé de la revendication 1, dans lequel ledit SMAR, flanqué par un site donneur d'épissage en 5' et un site accepteur d'épissage en 3', a une identité de séquence d'au moins 95% avec une séquence choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID n° : 19, SEQ ID n° : 20, SEQ ID n° : 21, SEQ ID n° : 22 et SEQ ID n° : 23.
6. Procédé de la revendication 1, dans lequel ladite origine de réplication bactérienne est une origine de réplication R6K gamma.
7. Procédé de la revendication 1, dans lequel ledit marqueur sélectionnable est un variant fonctionnel à "RNA-OUT" régulant le "RNA-IN", avec une identité de séquence d'au moins 95% avec une séquence choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID n° : 5 et SEQ ID n° : 7.
8. Procédé de la revendication 1, dans lequel ledit vecteur d'expression à S/MAR épisomique auto-réplicable, non intégrant est choisi dans le groupe constitué par un vecteur plasmidique, un vecteur nano-plasmidique, un vecteur lentiviral à intégration défectueuse et des vecteurs lentiviraux non intégrants.
9. Polynucléotide comprenant au moins un promoteur et un élément S/MAR, dans lequel ledit élément S/MAR est situé en aval dudit promoteur et dans lequel la séquence d'acides nucléiques dudit élément S/MAR (séquence S/MAR) comprend au moins 3 motifs à séquence ATTA par 100 nucléotides sur un allongement d'au plus 200 nucléotides, dans lequel ledit élément S/MAR est flanqué par un donneur d'épissage et un accepteur d'épissage, et ledit polynucléotide comprenant en outre une origine de réplication R6K gamma avec une identité de séquence d'au moins 95% avec une séquence choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID n° : 1, SEQ ID n° : 2, SEQ ID n° : 3, et SEQ ID n° : 4.
10. Polynucléotide de la revendication 9, dans lequel ledit promoteur est compris dans une unité de transcription destinée à l'expression d'un polypeptide cargo et/ou d'un marqueur sélectionnable dans une cellule hôte.
11. Polynucléotide selon la revendication 10, dans lequel ladite unité de transcription comprend un promoteur, une UTR en 5', un transgène et une UTR en 3'.
12. Polynucléotide de la revendication 11, dans lequel ledit S/MAR est situé au sein de ladite UTR en 3'.
13. Molécule d'ADN recombinante circulaire fermée par covalence comprenant :

    a. une unité de transcription destinée à l'expression d'un transgène dans une cellule de vertébré, comprenant un promoteur, une UTR en 5', un transgène et une UTR en 3' ;

    b. un S/MAR situé au sein de ladite UTR en 3', dans laquelle ledit S/MAR est flanqué par un site donneur d'épissage en 5' et un site accepteur d'épissage en 3';

    c. une origine de réplication R6K gamma avec une identité de séquence d'au moins 95% avec une séquence choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID n° : 1, SEQ ID n° : 2, SEQ ID n° : 3 et SEQ ID n° : 4 ; et

    d. un marqueur sélectionnable d'ARN à "RNA-OUT" comprenant un variant fonctionnel à "RNA-OUT" régulant le "RNA-IN" avec une identité de séquence d'au moins 95% avec une séquence choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID n° : 5 et SEQ ID n° : 7.
14. Polynucléotide de l'une quelconque des revendications 9 à 12 ou molécule d'ADN recombinante de la revendication 13, dans lequel/laquelle ledit S/MAR est choisi dans le groupe constitué par un S/MAR de l'interféron bêta humain, un S/MAR du M18, un S/MAR de l'apolipoprotéine B.
15. Polynucléotide de l'une quelconque des revendications 9 à 12 ou molécule d'ADN recombinante de la revendication 13, dans lequel/laquelle ledit S/MAR flanqué par un site donneur d'épissage en 5' et un site accepteur d'épissage en 3' a une identité de séquence d'au moins 95% avec une séquence choisie dans le groupe constitué par les SEQ ID n° : 19, SEQ ID n° : 20, SEQ ID n° : 21, SEQ ID n° : 22 et SEQ ID n° : 23.