HK40000181A - Simultaneous, integrated selection and evolution of antibody/protein performance and expression in production hosts - Google Patents

Claims (15)

1. Procédé d'évolution d'une protéine dans un hôte de production à base d'une cellule de levure, le procédé comprenant :

   a) l'évolution d'une protéine modèle pour produire un ensemble de protéines mutantes dans l'hôte de production à base d'une cellule de levure ;

   b) le criblage de l'ensemble de protéines mutantes pour identifier au moins une propriété, caractéristique ou activité prédéfinie ;

   c) la sélection d'une protéine mutante à la hausse (« UP ») dans l'ensemble de protéines mutantes sur la base de l'au moins une propriété, caractéristique ou activité ; et

   d) l'expression de la protéine mutante UP dans le même hôte de production à base d'une cellule de levure qu'utilisé à l'étape d'évolution a).
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'au moins une propriété, caractéristique ou activité prédéfinie est sélectionnée parmi une réduction de l'agrégation protéine-protéine, un accroissement de la stabilité de la protéine, une plus grande solubilité de la protéine, l'introduction de sites de glycosylation, l'introduction de sites de conjugaison, l'accroissement de l'expression de la protéine, une plus grande affinité envers un antigène, une modification de l'affinité de liaison, une modification de l'immunogénicité, une sélectivité augmentée et un accroissement de la spécificité, par rapport à la protéine modèle.
3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'au moins une propriété, caractéristique ou activité prédéfinie est sélectionnée parmi une plus grande stabilité de la protéine au pH, une plus grande stabilité de la protéine à la température, une plus grande stabilité de la protéine aux solvants, une sélectivité réduite, une affinité réduite envers un antigène, un changement d'activité catalytique, une optimisation du pH et une réduction de l'immunogénicité.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 3, dans lequel à l'étape c), la sélection de la protéine mutante UP parmi l'ensemble de protéines mutantes est également basée sur une expression accrue de la protéine mutante UP, par rapport à l'expression de la protéine modèle, dans l'hôte de production à base d'une cellule de levure.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'étape d'évolution a. comprend une évolution parmi une évolution positionnelle complète ; une évolution d'insertion positionnelle complète ; une évolution de délétion positionnelle complète ; une évolution positionnelle complète suivie d'une synthèse combinatoire de protéine ; une évolution de délétion positionnelle complète suivie d'une synthèse combinatoire de protéine ; ou une évolution de délétion positionnelle complète suivie d'une synthèse combinatoire de protéine.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la protéine modèle est choisie parmi une enzyme, une cytokine, un récepteur, une protéine de liaison à l'ADN, un agent chélatant, un anticorps et une hormone.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel la protéine modèle est une enzyme, une cytokine ou un récepteur.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel l'étape d'évolution a) comprend l'évolution de la protéine modèle pour produire un ensemble de protéines mutantes dans l'hôte de production à base d'une cellule de levure avec présentation à la surface de la cellule.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la protéine est un médicament thérapeutique et la protéine mutante UP est un biosimilaire.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel un ou plusieurs codons de mutation silencieux dans la protéine modèle sont sélectionnés et soumis à évolution.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant en outre les étapes consistant :

    à générer une collection de protéines dans un hôte de production à base d'une cellule de levure ;

    à cribler la collection pour identifier au moins une propriété, caractéristique ou activité ; et

    à sélectionner la protéine modèle dans la collection sur la base de l'au moins une propriété, caractéristique ou activité prédéfinie.
12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel l'étape de génération comprend la génération de l'un parmi :

    i) n-1 ensembles distincts de protéines mutées en faisant muter chaque résidu 2 à n de la protéine parente, un à la fois, chaque protéine mutée comportant n résidus d'acides aminés, chaque ensemble de protéines mutées comprenant des protéines mutées ayant un nombre X de résidus d'acides aminés différents au niveau d'une position prédéfinie unique de 2 à n de la protéine mutée ; chaque ensemble de protéines différant de la protéine parente uniquement au niveau de la position prédéfinie unique ; et le nombre de protéines mutées différentes générées étant égal à (n-1) × X,

    ii) n-1, ou n-2 dans le cas où le résidu initial est une méthionine, protéines mutées distinctes en supprimant chaque résidu de 2 à n dans la protéine parente, un à la fois, chaque protéine différant de la protéine parente en ce qu'un acide aminé est supprimé au niveau d'une position prédéfinie unique, et

    iii) 20 × (n-1) protéines mutées distinctes en insérant chacun des 20 acides aminés d'origine naturelle à chaque position entre deux résidus d'acides aminés adjacents dans la protéine parente, un à la fois, chaque protéine mutée différant de la protéine parente en ce qu'on y a inséré, après une position spécifique dans le parent, l'un des 20 acides aminés d'origine naturelle.
13. Procédé selon la revendication 11, comprenant en outre les étapes consistant

    à tester chaque protéine mutée pour identifier au moins une propriété, caractéristique ou activité prédéfinie ;

    à identifier, pour chaque protéine mutée, une modification de ladite propriété, caractéristique ou activité par rapport à la même propriété, caractéristique ou activité chez la protéine parente ;

    à créer une carte fonctionnelle qui corrèle chaque mutation au niveau de chaque dite position de la protéine parente à la modification identifiée de ladite propriété, caractéristique ou activité de la protéine mutée par rapport à la même propriété, caractéristique ou activité chez la protéine parente ; et

    à utiliser des informations de ladite carte fonctionnelle pour ladite étape d'évolution.
14. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape de criblage (b) comprend :

    le criblage de l'ensemble de protéines mutantes pour identifier au moins une propriété, caractéristique ou activité prédéfinie, et le criblage pour identifier une expression accrue par rapport à la protéine modèle ; et

    l'étape de sélection (c) comprend : la sélection d'une protéine mutante UP parmi l'ensemble de protéines mutantes sur la base (1) de la rétention ou de l'optimisation de l'au moins une propriété, caractéristique ou activité prédéfinie et (2) de l'expression accrue par rapport à la protéine modèle.
15. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'hôte de production à base d'une cellule de levure est choisi parmi des cellules de levure S. cerevisiae et des cellules de levure picchia.