HK40000996A

HK40000996A - Improvements in or relating to nucleic acid amplification processes

Info

Publication number: HK40000996A
Application number: HK19124207.2A
Authority: HK
Inventors: Jarrod Provins; Daiwei Shen; Bryan Kraynack
Original assignee: Lumiradx Uk Ltd
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2020-02-21

Claims

Procédé d'exécution d'une réaction non isotherme d'amplification d'acides nucléiques, le procédé comprenant les étapes :
(a) de mélange d'une séquence cible avec une ou plusieurs amorce(s) en simple brin complémentaire(s) dans des conditions qui permettent d'obtenir un événement d'hybridation dans lequel les amorces s'hybrident avec la cible, lequel événement d'hybridation conduit, direct ou indirectement, à la formation d'une structure en duplex comprenant deux sites de cassure disposés au niveau de sites opposés du duplex ou près de ceux-ci ; et d'exécution d'un processus d'amplification en ;

(b) causant une cassure au niveau de chacun desdits sites de cassure dans les brins du duplex ;

(c) d'utilisation d'une polymérase pour allonger les brins cassés de sorte à former un acide nucléique nouvellement synthétisé, lequel allongement recrée, avec la polymérase, des sites de cassure ;

(d) de répétition des étapes (b) et (c) tel que souhaité de sorte à causer la production de multiples copies de l'acide nucléique nouvellement synthétisé ;
caractérisé en ce que la température à laquelle le procédé est exécuté n'est pas isotherme et est soumise à une réduction d'au moins 2°C pendant le processus d'amplification des étapes (b) à (d), et dans lequel la température de la réaction ne retourne pas à une température prédéterminée.
Procédé selon la revendication 1, dans lequel, dans l'étape (a), la cible comprend deux brins complémentaires d'acides nucléiques et l'amorce comprend des amorces avant et arrière qui sont chacune complémentaires à un brin respectif de la cible, tel que les extrémités 3' des amorces avant et arrière soient orientées les unes vers les autres.
Procédé selon les revendications 1 ou 2, dans lequel la température est soumise à une réduction contrôlée d'au moins 5°C, de préférence d'au moins 10°C, mieux préféré d'au moins 15°C, pendant la réaction d'amplification et dans lequel le niveau moyen de réduction de la température pendant la réaction d'amplification se trouve dans la plage de -0,10 à - 6,0°C min^-1, de préférence de -0,20 à -3,5°C min^-1, mieux préféré de -0,30 à -3,5°C min^-1 et, de manière préférée entre toutes, de -0,40 à -3,5°C min^-1.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les étapes (b) à (d) sont exécutées substantiellement immédiatement après l'étape (a) et dans lequel les étapes (a) à (d) sont exécutées, de préférence, dans le même récipient de réaction ou sur le même support solide.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape (a) est exécutée à une température comprise dans la plage de 55 à 62°C, de préférence de 57 à 61°C, mieux préféré de 58 à 60°C.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre l'étape de détection, direct ou indirectement, de l'acide nucléique nouvellement synthétisé.
Procédé selon la revendication 6, dans lequel ladite étape de détection comprend l'utilisation d'une balise moléculaire ou d'un colorant fluorescent, d'une sonde marquée en flux latéral ou d'une enzyme qui catalyse une réaction électrochimique.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape (b) comprend l'utilisation d'une enzyme de cassure.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant l'utilisation d'une première polymérase et/ou d'une première enzyme de cassure ayant une température optimale ainsi que d'une deuxième polymérase et/ou d'une deuxième enzyme de cassure ayant une température optimale, dans lequel la température optimale de la deuxième polymérase et/ou de la deuxième enzyme de cassure est inférieure à la température optimale de la première polymérase et/ou de la première enzyme de cassure respectives et dans lequel la deuxième polymérase est, de préférence, une Bsu polymérase ou un fragment de Klenow d'une ADN polymérase.
Procédé selon la revendication 9, dans lequel la température initiale de la réaction d'amplification se trouve à la température optimale, ou au-dessus de celle-ci, de la première enzyme de cassure et la température est réduite pendant le déroulement de la réaction d'amplification jusqu'à une température en-dessous de la température optimale de la première enzyme de cassure et dans lequel, de préférence, la température de la réaction d'amplification est réduite jusqu'à la température optimale, ou en-dessous de celle-ci, de la deuxième polymérase et/ou de la deuxième enzyme de cassure.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre l'étape de mise en contact du mélange, obtenu par une exécution du procédé, avec une enzyme thermolabile qui dégrade l'acide nucléique, le mélange étant mis en contact avec l'enzyme thermolabile à une température à laquelle l'enzyme thermolabile est substantiellement active, et dans lequel l'enzyme est, de préférence, une uracile-ADN glycosylase (UDG) de cabillaud ou une UDG thermolabile Antarctique.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape (a) est précédée de l'exécution d'une étape de transcription inverse, comprenant une mise en contact d'un analyte d'ARN d'intérêt avec une transcriptase inverse de sorte à former un transcrit d'ADN de l'analyte d'ARN d'intérêt, en option comprenant en outre l'étape d'élaboration d'un ADN en double brin à partir du transcrit d'ADN.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre une étape de préamplification ou d'enrichissement.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une ou plusieurs des amorces comprend/comprennent un nucléotide modifié, de préférence dans lequel le nucléotide modifié est dans une partie de l'amorce complémentaire à une cible.
Procédé selon la revendication 14, dans lequel l'une ou les plusieurs amorce(s) comprend/comprennent un nucléotide modifié en 2', de préférence un nucléotide modifié par 2' O-méthyle, mieux préféré une pluralité de nucléotides modifiés par 2' O-méthyle et, de manière préférée entre toutes, jusqu'à sept nucléotides modifiés par 2' O-méthyle.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la température de la réaction pendant les étapes (b) à (d) ne retourne pas à la température à laquelle est exécutée l'étape (a).
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une ou plusieurs des amorces comprend/comprennent une partie auto-complémentaire, laquelle partie auto-complémentaire forme typiquement une structure en épingle à cheveux, et dans lequel ladite structure en épingle à cheveux comprend, de préférence, de 5 à 10 paires de bases.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la magnitude de la réduction de température pendant les étapes (b) à (d) se trouve dans la plage de 8 à 20°C.
Appareil destiné à exécuter le procédé de l'une quelconque des revendications précédentes, l'appareil comprenant un moyen de régulation de la température et un moyen de contrôle programmable, le moyen de contrôle programmable étant programmé pour faire fonctionner le moyen de régulation de la température pour exécuter une réduction de la température d'au moins 2°C, de préférence d'au moins 5°C, pendant le processus d'amplification d'un mélange réactionnel utilisé pour exécuter le procédé, et dans lequel le moyen de régulation de la température est programmé pour ne pas retourner à une température prédéterminée pendant le processus d'amplification.