HK1230245B - Multiplex detection of nucleic acids - Google Patents

Claims (12)

1. Procédé de détection d'une aneuploïdie fœtale par quantification d'un premier chromosome ou locus chromosomique par rapport à un second chromosome ou locus chromosomique dans un échantillon d'ADN acellulaire maternel, ledit l'échantillon contenant un mélange d'ADN fœtal et maternel provenant du sang d'une femme enceinte, comprenant la mise en contact de l'échantillon avec un premier ensemble de sondes et un second ensemble de sondes, lesdites sondes du premier ensemble reconnaissant chacune spécifiquement une séquence cible distincte dans le premier chromosome ou locus chromosomique et lesdites sondes du second ensemble reconnaissent chacune spécifiquement une séquence cible distincte dans le second chromosome ou locus chromosomique, la production de conditions dans lesquelles les séquences cibles dans les premier et second chromosomes ou loci chromosomiques sont au moins en partie simple brin, la production de conditions d'hybridation et de ligature, conditions dans lesquelles les sondes s'hybrident à leurs séquences cibles et génèrent des produits de ligature, chaque produit de ligature étant un cercle d'acide nucléique comprenant une jonction de ligature, la production de conditions d'amplification par cercle roulant (RCA) des cercles d'acide nucléique, de marquage des produits RCA avant qu'ils ne soient répartis à la surface d'un substrat, le comptage du nombre de premiers produits d'amplification par cercle roulant, lesdits produits d'amplification par cercle roulant étant amplifiés à partir des produits de ligature générés par des sondes du premier ensemble pour assurer un premier comptage, le comptage du nombre de seconds produits d'amplification par cercle roulant, les seconds produits d'amplification par cercle roulant étant amplifiés à partir des produits de ligature générés par des sondes du second ensemble pour assurer un second comptage, et la comparaison des premier et second comptage, ainsi la détermination des quantités relatives des première et seconde espèces d'acide nucléique dans l'échantillon.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le premier chromosome est le chromosome 21 et le second chromosome est choisi parmi le chromosome 13 et le chromosome 18.
3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel l'ensemble de sondes comprend au moins 1 000 sondes qui reconnaissent chacune spécifiquement une séquence cible distincte.
4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'ensemble de sondes comprend au moins 10 000 sondes qui reconnaissent chacune spécifiquement une séquence cible distincte.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les produits de ligature sont des produits de double ligature, comprenant chacun des première et seconde jonctions de ligature.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les étapes de comptage sont effectuées en séparant les molécules de produit d'amplification par cercle roulant individuelles les unes des autres et en comptant le nombre de molécules de produit d'amplification par cercle roulant individuelles dans une zone ou un volume défini.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape de comptage est effectuée par :

   i. hybridation d'un oligonucléotide marqué aux molécules de produit RCA, ledit oligonucléotide marqué s'hybridant à une séquence qui est répétée dans le produit RCA, produisant ainsi une pluralité de complexes qui comprennent chacun un seul produit RCA et une pluralité d'oligonucléotides marqués qui sont hybridés au produit RCA ; et

   ii. comptage du nombre de complexes marqués.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les produits d'amplification par cercle roulant (RCA) sont comptés individuellement par :

   (a) obtention d'un substrat comprenant une pluralité de complexes répartis sur la surface du substrat, chacun des complexes comprenant un seul produit RCA et une pluralité de sondes oligonucléotidiques marquées qui sont hybridées au produit RCA, lesdits complexes correspondant aux premiers produits d'amplification par cercle roulant et lesdits complexes correspondant aux seconds produits d'amplification par cercle roulant étant marqués de façon reconnaissable ; et

   (b) comptage du nombre de premiers produits RCA et, indépendamment, comptage du nombre de seconds produits RCA, qui sont présents dans une zone du substrat.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les produits de ligature sont des cercles d'acide nucléique comprenant les séquences cibles.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le chromosome est un chromosome fragmenté.
11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel l'échantillon est une digestion par enzyme de restriction d'acide nucléique et la séquence cible est un fragment de restriction.
12. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les sondes comprennent chacune un oligonucléotide de ciblage qui est plus long que le fragment cible et contient une séquence complémentaire cible interne, de sorte que l'hybridation entre l'oligonucléotide de ciblage et le fragment cible forme une séquence double brin située entre les séquences flanquantes en amont et en aval de l'oligonucléotide de ciblage, et des séquences de tête et de queue possédant des extrémités libres 5' et 3' respectivement, lesdites séquences de tête et de queue étant complémentaires aux séquences flanquantes en amont et en aval respectivement, où dans les conditions d'hybridation et de ligature, les séquences de tête et de queue s'hybridant aux séquences flanquantes et le fragment cible, s'il est présent, s'hybridant à la séquence complémentaire cible, positionnant ainsi les extrémités du fragment cible en juxtaposition avec l'extrémité 5' de la séquence de tête et l'extrémité 3' de la séquence de queue, ladite extrémité 3' du fragment cible étant ligaturée à l'extrémité 5' de la séquence de tête pour former une première jonction de ligature, et l'extrémité 5' du fragment cible étant ligaturé à l'extrémité 3' de la séquence de queue pour former une seconde jonction de ligature, produisant un produit de double ligature comprenant un brin continu d'acide nucléique comprenant les séquences de tête et de queue et le fragment cible, ledit brin continu étant un cercle.