HK1228951B - Method for producing retinal pigment epithelial cells - Google Patents

Claims (16)

1. Procédé pour produire une cellule épithéliale pigmentaire rétinienne, comprenant

   (1) une première étape de soumission de cellules souches pluripotentes à une culture flottante dans un milieu sans sérum pour former un agrégat de cellules souches pluripotentes,

   (2) une deuxième étape de soumission de l'agrégat formé à l'étape (1) à une culture flottante dans un milieu sans sérum ou un milieu contenant du sérum, chacun de ces milieux étant exempt d'une substance qui peut amplifier la transduction de signal médiée par Sonic hedgehog et contenant une substance qui peut amplifier la voie de transduction de signal médiée par BMP, obtenant ainsi un agrégat contenant des cellules progénitrices rétiniennes, et

   (3) une troisième étape de soumission de l'agrégat obtenu dans l'étape (2) à une culture flottante dans un milieu sans sérum ou un milieu contenant du sérum, chacun de ces milieux étant exempt d'une substance qui peut amplifier la transduction de signal médiée par Sonic hedgehog et d'une substance qui peut amplifier la voie de transduction de signal médiée par BMP et contenant une substance qui peut amplifier la transduction de signal médiée par Wnt, obtenant ainsi un agrégat contenant des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes.
2. Procédé pour produire un feuillet de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes, comprenant

   (1) une première étape de soumission de cellules souches pluripotentes à une culture flottante dans un milieu sans sérum pour former un agrégat de cellules souches pluripotentes,

   (2) une deuxième étape de soumission de l'agrégat formé dans l'étape (1) à une culture flottante dans un milieu sans sérum ou un milieu contenant du sérum, chacun de ces milieux étant exempt d'une substance qui peut amplifier la transduction de signal médiée par Sonic hedgehog et contenant une substance qui peut amplifier la voie de transduction de signal médiée par BMP, obtenant ainsi un agrégat contenant des cellules progénitrices rétiniennes,

   (3) une troisième étape de soumission de l'agrégat obtenu dans l'étape (2) à une culture flottante dans un milieu sans sérum ou un milieu contenant du sérum, chacun de ces milieux étant exempt d'une substance qui peut amplifier la transduction de signal médiée par Sonic hedgehog et d'une substance qui peut amplifier la voie de transduction de signal médiée par BMP et contenant une substance qui peut amplifier la transduction de signal médiée par Wnt, ce qui donne ainsi un agrégat contenant des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes, et

   (4) une quatrième étape de dispersion de l'agrégat obtenu dans l'étape (3) et de soumission des cellules résultantes à une culture par adhésion.
3. Procédé de production selon la revendication 2, dans lequel

   (a) la culture par adhésion est effectuée en présence d'un substitut de sérum dans ladite étape (4) ; et/ou

   (b) la culture par adhésion est effectuée en présence d'une substance inhibitrice de ROCK dans ladite étape (4).
4. Procédé de production selon la revendication 2 ou 3, dans lequel la culture par adhésion est effectuée dans un milieu sans sérum ou un milieu contenant du sérum et comprenant en outre une ou plusieurs substances choisies dans le groupe constitué par une substance qui peut amplifier la transduction de signal médiée par Wnt, une substance inhibant la voie de signalisation de FGF, une substance capable d'amplifier un signal médiée par l'activine et une substance qui peut amplifier la voie de transduction de signal médiée par BMP, dans ladite étape (4).
5. Procédé de production selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel la culture par adhésion est effectuée sur un matériau de récipient de culture ayant une surface traitée avec un substrat de culture, dans ladite étape (4).
6. Procédé de production selon la revendication 5, dans lequel

   (a) ledit substrat de culture est un substrat de culture synthétique ; ou

   (b) ledit substrat de culture est la laminine.
7. Procédé de production selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel

   (a) les cellules souches pluripotentes sont des cellules souches pluripotentes de primate ; ou

   (b) les cellules souches pluripotentes sont des cellules souches pluripotentes humaines.
8. Procédé de production selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel l'étape (1) et l'étape (2) sont effectuées en présence d'un substitut de sérum.
9. Procédé de production selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la culture flottante est effectuée en l'absence d'une préparation de membrane basale.
10. Procédé de production selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel la substance qui peut amplifier la voie de transduction de signal médiée par BMP est une ou plusieurs protéines choisies dans le groupe constitué par BMP2, BMP4, BMP7 et GDF7.
11. Procédé de production selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel le milieu sans sérum ou le milieu contenant du sérum, chacun étant exempt d'une substance qui peut amplifier la transduction de signal médiée par Sonic hedgehog et d'une substance qui peut amplifier la voie de transduction de signal médiée par BMP et contenant une substance qui peut amplifier la transduction de signal médiée par Wnt dans l'étape (3) comprend en outre une substance inhibant la voie de signalisation de FGF.
12. Procédé de production selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel la substance qui peut amplifier la transduction de signal médiée par Wnt est choisie dans le groupe constitué par les protéines appartenant à la famille Wnt, un agoniste de récepteur de Wnt, et un inhibiteur de GSK3β.
13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel la protéine appartenant à la famille Wnt est Wnt1, Wnt3a ou Wnt7a, et dans lequel l'inhibiteur de GSK3β est la 6-bromoindirubine-3'-oxime (BIO), CHIR99021 ou la kenpaullone.
14. Procédé de production selon l'une quelconque des revendications 4 à 13, dans lequel la substance inhibant la voie de signalisation de FGF est choisie dans le groupe constitué par un récepteur de FGF, un inhibiteur de récepteur de FGF, une substance inhibitrice de la cascade de MAP kinase, un inhibiteur de PI3 kinase et un inhibiteur d'Akt.
15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel l'inhibiteur de récepteur de FGF est SU-5402, AZD4547 ou BGJ398, et dans lequel la substance inhibitrice de la cascade de MAP kinase est un inhibiteur de MEK, un inhibiteur de MAPK ou un inhibiteur d'ERK.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 15, dans lequel la substance capable d'amplifier un signal médié par l'activine est choisie dans le groupe constitué par les protéines appartenant à la famille de l'activine, un récepteur d'activine, et un agoniste de récepteur d'activine.