HK1219761B - High throughput detection of molecular markers based on restriction fragments - Google Patents

Claims (19)

1. Méthode d'identification de la présence ou de l'absence de fragments de restriction dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à :

   (a) utiliser deux acides nucléiques échantillons ou plus ;

   (b) digérer chaque acide nucléique échantillon avec au moins une endonucléase de restriction pour obtenir un ensemble de fragments de restriction ;

   (c) utiliser des adaptateurs synthétiques double brin comprenant

   - une section d'identifiant spécifique à l'échantillon,

   - au moins une extrémité qui peut être ligaturée à l'extrémité franche ou saillante d'un fragment de restriction ;

   (d) ligaturer les adaptateurs synthétiques double brin aux fragments de restriction dans l'ensemble, pour fournir un ensemble de fragments de restriction ligaturés à des adaptateurs ;

   (e) déterminer la séquence d'au moins la section d'identifiant spécifique à un échantillon et d'une partie de la séquence du fragment de restriction situé en position adjacente à la séquence dérivée des adaptateurs ;

   (f) comparer deux échantillons ou plus pour la présence ou l'absence de fragments de restriction ligaturés à des adaptateurs ;

   (g) identifier la présence ou l'absence de fragments de restriction ligaturés à des adaptateurs dans l'échantillon.
2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle les fragments de restriction sont un marqueur moléculaire.
3. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle le marqueur moléculaire est un marqueur AFLP.
4. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle deux échantillons ou plus sont combinés dans un pool après l'étape de ligature des adaptateurs.
5. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle les fragments de restriction ligaturés à des adaptateurs obtenus dans l'étape (d) sont amplifiés en utilisant des amorces avant le séquençage de l'étape (e).
6. Méthode selon la revendication 4, dans laquelle pour chaque échantillon du pool, un identifiant spécifique à l'échantillon est utilisé qui diffère des identifiants spécifiques aux autres échantillons dans le pool.
7. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle les amorces contiennent un ou plusieurs nucléotides sélectifs à l'extrémité 3'.
8. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle l'endonucléase de restriction est une endonucléase de restriction de type II.
9. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle l'endonucléase de restriction est une endonucléase de restriction de type IIs.
10. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle deux endonucléases de restriction ou plus sont utilisées.
11. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le séquençage est réalisé par le biais d'un séquençage à haut débit.
12. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle le séquençage à haut débit est réalisé sur un support solide.
13. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle le séquençage à haut débit est basé sur un séquençage par synthèse.
14. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle le séquençage à haut débit comprend les étapes consistant à :

    - hybrider les amplicons ou les fragments de restriction ligaturés à des adaptateurs à des billes, chaque bille étant hybridée avec un amplicon ou un fragment de restriction ligaturé à des adaptateurs unique ;

    - émulsifier les billes dans des microréacteurs de type eau-dans-l'huile, chaque microréacteur de type eau-dans-l'huile comprenant une bille unique ;

    - réaliser une PCR en émulsion pour amplifier les amplicons ou les fragments de restriction ligaturés à des adaptateurs ;

    - facultativement sélectionner/enrichir les billes contenant les amplicons amplifiés ;

    - charger les billes dans des puits, chaque puits comprenant une bille unique ; et

    - générer un signal pyrophosphate.
15. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle le séquençage à haut débit comprend les étapes consistant à :

    - hybrider les amplicons ou les fragments de restriction ligaturés à des adaptateurs à une surface contenant une première et une seconde amorce d'amplification de pont ou une séquence de liaison des première et seconde amorces respectivement,

    - réaliser une amplification de pont pour fournir des blocs de fragments de restriction ligaturés à des adaptateurs amplifiés ou d'amplicons amplifiés,

    - déterminer la séquence nucléotidique des fragments de restriction ligaturés à des adaptateurs amplifiés ou des amplicons amplifiés en utilisant des nucléotides terminateurs réversibles marqués.
16. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle l'identifiant est de 4 à 16 bp, de préférence de 4 à 10 pb, plus préférablement de 4 à 8 bp, de manière préférée entre toutes de 4 à 6 bp.
17. Méthode selon la revendication 16, dans laquelle l'identifiant ne contient pas 2 bases consécutives identiques ou plus.
18. Méthode selon la revendication 16, dans laquelle pour deux échantillons ou plus, les identifiants correspondants contiennent au moins deux nucléotides différents.
19. Utilisation de la méthode telle que définie selon les revendications 1 à 18 pour l'identification de marqueurs moléculaires, pour le génotypage, l'analyse de ségrégants en mélange, le mappage génétique, le rétrocroisement assisté par un marqueur, le mappage de locus à caractère quantitatif, le mappage de déséquilibre de liaison.