HK1218931B - Photoreceptors and photoreceptor progenitors produced from pluripotent stem cells - Google Patents

Claims (15)

1. Präparation von Zellen, umfassend:

   (a) eine Mehrzahl von Zellen, wobei mehr als 90 Prozent der Zellen in der Präparation Photorezeptor-Progenitorzellen sind, die immunzytochemisch PAX6⁺ und CHX10^- und mRNA-Transkript positiv für MASH1 sind, wie durch qPCR detektiert, und

   (b) ein Medium, das für den Erhalt der Lebensfähigkeit der Photorezeptor-Progenitorzellen geeignet ist.
2. Präparation nach Anspruch 1, wobei die Photorezeptor-Progenitorzellen im Wesentlichen frei von pluripotenten Stammzellen, retinalen Ganglienzellen, ausgereiften Photorezeptoren, Amakrinzellen oder einer Kombination davon sind.
3. Präparation nach Anspruch 1, wobei die Präparation eine pharmazeutische Präparation ist, die zur Verwendung in einem Säuger-Patienten geeignet ist, und wobei das Medium ein pharmazeutisch akzeptabler Träger zur Transplantation in einen Säuger-Patienten ist.
4. Präparation nach Anspruch 1, wobei die Präparation eine Kryogenzellen-Präparation ist, die wenigstens 10⁹ Photorezeptor-Progenitorzellen (PRPC) umfasst, und wobei die Kryogenzellen-Präparation ein kryopräservatives System umfasst, das mit der Lebensfähigkeit der Photorezeptor-Progenitorzellen bei Tau kompatibel ist.
5. Präparation nach Anspruch 1, wobei die Photorezeptor-Progenitorzellen von pluripotenten Stammzellen abgeleitet sind, bevorzugt wobei die pluripotenten Stammzellen aus der Gruppe bestehend aus menschlichen embryonalen Stammzellen und induzierten pluripotenten Stammzellen ausgewählt sind, und/oder wobei die Photorezeptor-Progenitorzellen menschliche Zellen sind und/oder wobei ein Großteil der Photorezeptor-Progenitorzellen mRNA-Transkript positiv für Nr2e3, Trβ2, RORβ und NRO, wie von qPCR detektiert, sind.
6. Präparation nach Anspruch 1, wobei die Photorezeptor-Progenitorzellen wenigstens 2-fach mehr, relativ zu retinalen neuralen Progenitorzellen, von einem oder mehreren Markern exprimieren, die aus uPA, Tenascin-C, CXCL16, CX3CL1 und Chitinase 3-Like 1 ausgewählt sind, wie durch Immunoassay von abgesonderten Proteinen oder mRNA-Transkript-Levels durch qPCR detektiert.
7. Präparation nach Anspruch 1, wobei die Photorezeptor-Progenitorzellen eine replikative Kapazität aufweisen, um wenigstens 20 Populationsverdopplungen in Zellkultur zu durchlaufen, wobei weniger als 25 Prozent der Zellen den Zelltod erfahren, altern oder sich in phenotypisch nicht-Photorezeptorzellen zur 20. Dopplung differenzieren, und/oder

   wobei die Photorezeptor-Progenitorzellen Transferrin-Protein und/oder Transferrin-mRNA-Levels aufweisen, die jeweils wenigstens 25 Prozent geringer sind als Glycerinaldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenaseprotein oder mRNA-Levels, und/oder

   wobei die Photorezeptor-Progenitorzellen HLA-genotypisch identisch sind, und/oder

   wobei die Photorezeptor-Progenitorzellen genomisch identisch sind, und/oder

   wobei die Photorezeptor-Progenitorzellen eine Mean Terminal Restriction Fragment Length (TRF) aufweisen, die länger als 8kb ist.
8. Präparation von Zellen, umfassend:

   (a) aus pluripotenten Stammzellen abgeleitete Photorezeptorzellen, wobei mehr als 90 Prozent der Zellen immunzytochemisch PAX6⁺, CHX10^- und Rhodopsin⁺ und/oder Opsin⁺ sind; und

   (b) ein Medium, das für den Erhalt der Lebensfähigkeit der aus Stammzellen abgeleiteten Photorezeptorzellen geeignet ist, optional wobei das Medium ein pharmazeutisch akzteptabler Träger zum Erhalt der Lebensfähigkeit der Photorezeptorzellen zur Transplantation in einen Säuger-Patienten ist.
9. Präparation von Photorezeptor-Progenitorzellen nach Anspruch 3 zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit oder Störung, die durch einen Verlust von Photorezeptoren in einem Patienten verursacht wird.
10. Präparation von Photorezeptorzellen nach Anspruch 8 zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit oder Störung, die durch einen Verlust von Photorezeptoren in einem Patienten verursacht wird.
11. Verfahren zur Herstellung von Photorezeptor-Progenitorzellen, umfassend die Schritte des Kultivierens von Augenfeld-Progenitorzellen unter Kulturbedingungen, die zwischen Bedingungen mit geringer Adhäsion oder ohne Adhäsion über einen Zeitraum alternieren, der ausreicht, um individuelle Zellsphären zu bilden, und dann Adhäsionsbedingungen, welche alternierenden Kulturbedingungen fortgesetzt werden, bis ein Großteil der Zellen Photorezeptor-Progenitorzellen sind, wobei Photorezeptor-Progenitorzellen des Großteils als PAX6⁺, CHX10^- und mRNA-Transkript positiv für MASH1, wie durch qPCR detektiert, gekennzeichnet sind.
12. Verfahren nach Anspruch 11, umfassend die Schritte des

    (a) Kultivierens von Augenfeld-Progenitorzellen als Zellcluster und unter Bedingungen mit geringer Adhäsion oder ohne Adhäsion, in einem neuralen Differenzierungsmedium über einen Zeitraum, der ausreicht, damit die Zellcluster individuelle Zellsphären bilden, wobei die Augenfeld-Progenitorzellen gekennzeichnet sind als PAX6⁺, RX1⁺, OCT4^- und NANOG^-, und bevorzugt auch gekennzeichnet sind als SIX3⁺, SIX6⁺, LHX2⁺, TBX3⁺, SOX2⁺ und Nestin⁺, wie durch Immunfärbung und/oder Durchflusszytometrie bestimmt;

    (b) Kultivierens der Zellsphären in einem neuralen Differenzierungsmedium unter Adhäsionsbedingungen auf einem Biomaterialträger, wie beispielsweise Gelatine, Alginat, Kollagen Typ 1, Matrigel^™, Polyglykolid, Kollagen, Fibrin oder selbstorganisierende Peptide, bis ein Großteil von Zellen in der Kultur retinale neurale Progenitorzellen sind, die als PAX6⁺, CHX10⁺ und SOX2^- gekennzeichnet sind;

    (c) anschließend, Alternieren von Kulturbedingungen ein Mal oder mehrere Male zwischen Bedingungen mit geringer Adhäsion oder ohne Adhäsion über einen Zeitraum, der ausreicht, damit die retinalen neuralen Progenitorzellen individuelle Zellsphären bilden, und anschließend Kultivieren der retinalen neuralen Progenitorzelle, die Zellsphären enthält, unter Adhäsionsbedingungen, welche alternierenden Kulturbedingungen fortgesetzt werden, bis ein Großteil der Zellen Photorezeptor-Progenitorzellen ist, wobei Photorezeptor-Progenitorzellen des Großteils als PAX6⁺, CHX10^- und mRNA-Transkript positiv für MASH1, wie durch qPCR detektiert, gekennzeichnet sind, und wobei die Photorezeptor-Progenitorzellen dazu fähig sind, bei Behandlung mit Retinsäure in Photorezeptorzellen zu differenzieren.
13. Verfahren zur Präparation von von pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Photorezeptor-Progenitorzellen, umfassend:

    (a) Kultivieren von pluripotenten Stammzellen in einem Kulturmedium für retinale Induktion und Erzeugen von einer oder mehreren Augenfeld-Progenitorzellen;

    (b) Kultivieren der einen oder der mehreren Augenfeld-Progenitorzellen unter Bedingungen mit geringer Adhäsion oder ohneAdhäsion in einem neuralen Differenzierungsmedium zur Bildung von Zellsphären;

    (c) Plattieren der Zellsphären unter Adhäsionsbedingungen zur Bildung von anhaftenden Zellen;

    (d) Dissoziieren der anhaftenden Zellen und Kultivieren der Zellen unter Bedingungen mit geringer Adhäsion oder ohne Adhäsion, wie in Schritt (b) definiert, zur Bildung von weiteren Zellsphären;

    (e) Plattieren der weiteren Zellsphären unter Adhäsionsbedingungen, wie in Schritt (c) definiert, zur Bildung von weiteren anhaftenden Zellen,

    dadurch Erhalten einer Population von Photorezeptor-Progenitorzellen.
14. Verfahren nach Anspruch 13, ferner umfassend ein Wiederholen der Schritte (d) und (e) wenigstens ein zusätzliches Mal.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Kulturmedium für retinale Induktion Noggin umfasst und das neurale Differenzierungsmedium nicht Noggin umfasst.