HK1209581B - Production of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells - Google Patents

Claims (20)

1. Extrahiertes Pflanzenlipid, das Fettsäuren in einer veresterten Form umfasst, wobei die Fettsäuren Oleinsäure, Palmitinsäure, ω6-Fettsäuren, welche Linolsäure (LA) umfassen, ω3-Fettsäuren, welche α-Linolensäure (ALA) und Docosahexaensäure (DHA) umfassen, und gegebenenfalls eine oder mehrere von Stearidonsäure (SDA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosapentaensäure (DPA) und Eicosatetraensäure (ETA) umfassen, wobei der Spiegel von DHA in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids 7% bis 20% beträgt und wobei der Spiegel von Palmitinsäure in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids zwischen 2% und 16% liegt und wobei der Spiegel von Myristinsäure (C14:0) in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids weniger als 1% beträgt.
2. Das Lipid nach Anspruch 1, welches eines oder mehrere oder alle der folgenden Merkmale aufweist

   i. der Spiegel von Palmitinsäure in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids liegt zwischen 2% und 15%,

   ii. der Spiegel von Oleinsäure in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids liegt zwischen 3% und 30%,

   iii. der Spiegel von Linolsäure (LA) in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids liegt zwischen 4% und 35%,

   iv. der Spiegel von α-Linolensäure (ALA) in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids liegt zwischen 7% und 40%,

   v. der Spiegel von y-Linolensäure (GLA) in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids beträgt weniger als 4%,

   vi. der Spiegel von Stearidonsäure (SDA) in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids beträgt weniger als 4%,

   vii. der Spiegel von Eicosatetraensäure (ETA) in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids beträgt weniger als 4%,

   viii. der Spiegel von Eicosatriensäure (ETrA) in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids beträgt weniger als 4%,

   ix. der Spiegel von Eicosapentaensäure (EPA) in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids beträgt weniger als 4%,

   x. der Spiegel von Docosapentaensäure (DPA) in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids beträgt weniger als 4%,

   xi. der Spiegel von DHA in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids liegt zwischen 11% und 20%,

   xii. der Spiegel der gesamten gesättigten Fettsäuren in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids liegt zwischen 4% und 25%,

   xiii. der Spiegel der gesamten einfach ungesättigten Fettsäuren in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids liegt zwischen 4% und 35%,

   xiv. der Spiegel der gesamten mehrfach ungesättigten Fettsäuren in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids liegt zwischen 20% und 75%,

   xv. der Spiegel der gesamten ω6-Fettsäuren in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids beträgt weniger als 20%,

   xvi. der Spiegel von neuen ω6-Fettsäuren in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids beträgt weniger als 10%,

   xvii. der Spiegel der gesamten ω3-Fettsäuren in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids liegt zwischen 40% und 60%,

   xviii. der Spiegel von neuen ω3-Fettsäuren in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids liegt zwischen 9% und 33%,

   xix. das Verhältnis der gesamten ω6-Fettsäuren : den gesamten ω3-Fettsäuren in dem Fettsäuregehalt des extrahierten Lipids liegt zwischen 1,0 und 3,0,

   xx. das Verhältnis von neuen ω6-Fettsäuren : neuen ω3-Fettsäuren in dem Fettsäuregehalt des extrahierten Lipids liegt zwischen 1,0 und 3,0,

   xxi. die Fettsäurezusammensetzung des Lipids basiert auf einer Effizienz der Umwandlung von Oleinsäure zu DHA von mindestens 10%,

   xxii. die Fettsäurezusammensetzung des Lipids basiert auf einer Effizienz der Umwandlung von LA zu DHA von mindestens 15%,

   xxiii. die Fettsäurezusammensetzung des Lipids basiert auf einer Effizienz der Umwandlung von ALA zu DHA von mindestens 17%,

   xxiv. die gesamte Fettsäure in dem extrahierten Lipid weist weniger als 1% C20:1 auf, xxv. der Triacylglycerol (TAG)-Gehalt des Lipids beträgt mindestens 70%,

   xxvi. das Lipid umfasst Diacylglycerol (DAG),

   xxvii. das Lipid umfasst weniger als 10% freie (nicht veresterte) Fettsäuren und/oder Phospholipid oder weniger als 0,5% freie (nicht veresterte) Fettsäuren und/oder Phospholipid,

   xxviii. mindestens 70% des DHA, die in der Form von TAG verestert sind, befinden sich an der sn-1- oder sn-3-Position des TAG,

   xxix. das Lipid umfasst Tri-DHA-TAG (TAG 66:18).
3. Das Lipid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, welches weiterhin ein oder mehrere Sterole umfasst und/oder welches in der Form eines Öls vorliegt und welches weniger als 10 mg Sterole/g an Öl, weniger als 7 mg Sterole/g an Öl, zwischen 1,5 mg und 10 mg Sterole/g an Öl oder zwischen 1,5 mg und 7 mg Sterole/g an Öl umfasst.
4. Das Lipid gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Lipid Brassica sp.-Öl oder Camelina sativa-Öl ist.
5. Ein Verfahren zur Herstellung von extrahiertem Pflanzenlipid, welches die folgenden Schritte umfasst

   i) Erhalten eines Pflanzenteils, das Lipid umfasst, wobei das Lipid Fettsäuren in einer veresterten Form umfasst, wobei die Fettsäuren Oleinsäure, Palmitinsäure, ω6-Fettsäuren, welche Linolsäure (LA) und y-Linolensäure (GLA) umfassen, ω3-Fettsäuren, welche α-Linolensäure (ALA), Stearidonsäure (SDA), Docosapentaensäure (DPA) und Docosahexaensäure (DHA) umfassen, und wahlweise eine oder mehrere von Eicosapentaensäure (EPA) und Eicosatetraensäure (ETA) umfassen, wobei der Spiegel von DHA in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids in dem Pflanzenteil 7% bis 20% beträgt und wobei der Spiegel von Palmitinsäure in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids zwischen 2% und 16% liegt und wobei der Spiegel von Myristinsäure (C14:0) in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids weniger als 1% beträgt, und

   ii) Extrahieren von Lipid aus dem Pflanzenteil,

   wobei der Spiegel von DHA in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids 7% bis 20% beträgt und wobei der Spiegel von Palmitinsäure in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids zwischen 2% und 16% liegt und wobei der Spiegel von Myristinsäure (C14:0) in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids weniger als 1% beträgt.
6. Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das extrahierte Lipid eines oder mehrere der in den Ansprüchen 2 bis 4 definierten Merkmale aufweist.
7. Das Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei der Pflanzenteil exogene Polynukleotide umfasst, die eine Δ12-Desaturase, eine ω3-Desaturase oder eine Δ15-Desaturase, eine Δ6-Desaturase, eine Δ5-Desaturase, eine Δ4-Desaturase, eine A6-Elongase und eine Δ5-Elongase kodieren, und wobei jedes Polynukleotid funktionsfähig mit einem oder mehreren Promotoren verknüpft ist, die in der Lage sind, die Expression dieser Polynukleotide in einer Zelle des Pflanzenteils zu lenken.
8. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Pflanzenteil eines oder mehrere oder alle der folgenden Merkmale aufweist

   i) die Δ12-Desaturase wandelt in einer oder mehreren Zellen der Pflanze mit einer Effizienz von mindestens 60% Oleinsäure in Linolsäure um,

   ii) die ω3-Desaturase wandelt in einer oder mehreren Zellen der Pflanze mit einer Effizienz von mindestens 65% ω6-Fettsäuren in ω3-Fettsäuren um,

   iii) die Δ6-Desaturase wandelt in einer oder mehreren Zellen der Pflanze mit einer Effizienz von mindestens 30% ALA in SDA um,

   iv) die Δ6-Desaturase wandelt in einer oder mehreren Zellen der Pflanze mit einer Effizienz von weniger als 5% Linolsäure in γ-Linolensäure um,

   v) die Δ6-Elongase wandelt in einer oder mehreren Zellen der Pflanze mit einer Effizienz von mindestens 60% SDA in ETA um,

   vi) die Δ5-Desaturase wandelt in einer oder mehreren Zellen der Pflanze mit einer Effizienz von mindestens 60% ETA in EPA um,

   vii) die Δ5-Elongase wandelt in einer oder mehreren Zellen der Pflanze mit einer Effizienz von mindestens 80% EPA in DPA um,

   viii) die Δ4-Desaturase wandelt in einer oder mehreren Zellen der Pflanze mit einer Effizienz von mindestens 80% DPA in DHA um,

   ix) die Effizienz der Umwandlung von Oleinsäure in DHA in einer oder mehreren Zellen des Pflanzenteils beträgt mindestens 10%,

   x) die Effizienz der Umwandlung von LA in DHA in einer oder mehreren Zellen des Pflanzenteils beträgt mindestens 15%,

   xi) die Effizienz der Umwandlung von ALA in DHA in einer oder mehreren Zellen des Pflanzenteils beträgt mindestens 17%,

   xii) eine oder mehrere Zellen des Pflanzenteils umfassen mindestens 15% mehr ω3-Fettsäuren als entsprechende Zellen, denen die exogenen Polynukleotide fehlen,

   xiii) die Δ6-Desaturase entsättigt vorzugsweise α-Linolensäure (ALA) in Bezug auf Linolsäure (LA),

   xiv) die Δ6-Elongase hat ebenfalls Δ9-Elongaseaktivität,

   xv) die Δ12-Desaturase hat ebenfalls Δ15-Desaturaseaktivität,

   xvi) die Δ6-Desaturase hat ebenfalls Δ8-Desaturaseaktivität,

   xvii) die ω3-Desaturase hat ebenfalls Δ15-Desaturaseaktivität bei LA,

   xviii) die ω3-Desaturase entsättigt sowohl LA auch und/oder GLA,

   xix) die ω3-Desaturase entsättigt vorzugsweise GLA in Bezug auf LA,

   xx) der Spiegel von DHA in dem Pflanzenteil basiert auf einer Effizienz der Umwandlung von Oleinsäure in DHA in dem Pflanzenteil von mindestens 10%,

   xxi) der Spiegel von DHA in dem Pflanzenteil basiert auf einer Effizienz der Umwandlung von LA in DHA in dem Pflanzenteil von mindestens 15%,

   xxii) der Spiegel von DHA in dem Pflanzenteil basiert auf einer Effizienz der Umwandlung von ALA in DHA in dem Pflanzenteil von mindestens 17%,

   xxiii) eine oder mehrere oder alle der Desaturasen weisen eine größere Aktivität an einem Acyl-CoA-Substrat als einem entsprechenden Acyl-PC-Substrat auf,

   xxiv) die Δ6-Desaturase weist eine größere Δ6-Desaturaseaktivität an ALA als an LA als Fettsäuresubstrat auf,

   xxv) die Δ6-Desaturase weist eine größere Δ6-Desaturaseaktivität an ALA-CoA als Fettsäuresubstrat als an ALA, die mit der sn-2-Position von PC verbunden ist, als Fettsäuresubstrat auf,

   xxvi) die Δ6-Desaturase weist eine mindestens 2fach größere Δ6-Desaturaseaktivität an ALA als einem Substrat im Vergleich zu LA auf,

   xxvii) die Δ6-Desaturase weist eine größere Aktivität an ALA-CoA als Fettsäuresubstrat als an ALA, die mit der sn-2-Position von PC verbunden ist, als Fettsäuresubstrat auf,

   xxviii) die Δ6-Desaturase weist eine mindestens 5fach größere Δ6-Desaturaseaktivität an ALA-CoA als Fettsäuresubstrat als an ALA, die mit der sn-2-Position von PC verbunden ist, als Fettsäuresubstrat auf,

   xxix) die Desaturase ist eine Front-End-Desaturase,

   xxx) die Δ6-Desaturase weist keine nachweisbare Δ5-Desaturaseaktivität an ETA auf.
9. Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 5 bis 8, wobei eines oder mehrere der folgenden Merkmale zutreffen:

   i) die exogenen Polynukleotide sind kovalent in einem DNA-Molekül, vorzugsweise einem T-DNA-Molekül, verknüpft, das in das Genom von Zellen des Pflanzenteils integriert ist, und wobei vorzugsweise die Anzahl solcher DNA-Moleküle, die in das Genom der Zellen des Pflanzenteils integriert sind, nicht mehr als eins, zwei oder drei beträgt oder zwei oder drei ist,

   ii) der Gesamtölgehalt des Pflanzenteils, das die exogenen Polynukleotide umfasst, beträgt mindestens 40% des Gesamtölgehalts eines entsprechenden Pflanzenteils, dem die exogenen Polynukleotide fehlen,

   iii) das Lipid liegt in der Form eines Öls, vorzugsweise eines Samenöls aus einer Ölsaat vor, und wobei mindestens 90 Gewichts-% des Lipids Triacylglycerole sind,

   iv) das Verfahren umfasst weiterhin das Behandeln des Lipids, um den Spiegel von DHA als einem Prozentsatz des Gesamtfettsäuregehalts zu erhöhen, wobei die Behandlung vorzugsweise eine Umesterung ist.
10. Eine Wirtszelle, die exogene Polynukleotide umfasst, welche eine der folgenden Gruppen von Enzymen kodieren:

    i) eine Δ12-Desaturase, eine ω3-Desaturase oder eine Δ15-Desaturase, eine Δ6-Desaturase, eine Δ5-Desaturase, eine Δ4-Desaturase, eine A6-Elongase und eine Δ5-Elongase,

    ii) eine ω3-Desaturase, eine Δ6-Desaturase, eine Δ5-Desaturase, eine Δ4-Desaturase, eine Δ6-Elongase und eine Δ5-Elongase,

    iii) eine Δ15-Desaturasen, eine Δ6-Desaturase, eine Δ5-Desaturase, eine Δ4-Desaturase, eine Δ6-Elongase und eine Δ5-Elongase,

    iv) eine Δ12-Desaturase, eine Δ6-Desaturase, eine Δ5-Desaturase, eine Δ4-Desaturase, eine Δ6-Elongase und eine Δ5-Elongase,

    v) eine ω3-Desaturase, eine Δ8-Desaturase, eine Δ5-Desaturase, eine Δ4-Desaturase, eine Δ9-Elongase und eine Δ5-Elongase,

    vi) eine Δ15-Desaturase, eine Δ8-Desaturase, eine Δ5-Desaturase, eine Δ4-Desaturase, eine Δ9-Elongase und eine Δ5-Elongase,

    vii) eine Δ12-Desaturase, eine Δ8-Desaturase, eine Δ5-Desaturase, eine Δ4-Desaturase, eine Δ9-Elongase und eine Δ5-Elongase oder

    viii) eine Δ12-Desaturase, eine ω3-Desaturase oder eine Δ15-Desaturase, eine Δ8-Desaturase, eine Δ5-Desaturase, eine Δ4-Desaturase, eine Δ9-Elongase und eine Δ5-Elongase,

    wobei jedes Polynukleotid funktionsfähig mit einem oder mehreren Promotoren verknüpft ist, die in der Lage sind, die Expression der Polynukleotide in der Zelle zu lenken, und wobei die Zelle Lipid wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 definiert umfasst.
11. Eine transgene Pflanze, welche eine Zelle nach Anspruch 10 umfasst.
12. Eine Ölsaatpflanze, umfassend

    a) Lipid in ihrem Samen, wobei das Lipid Fettsäuren in einer veresterten Form umfasst, und

    b) exogene Polynukleotide, die eine der folgenden Gruppen von Enzymen kodieren:

    i) eine Δ12-Desaturase, eine pilzliche ω3-Desaturase und/oder pilzliche Δ15-Desaturase, eine Δ6-Desaturase, eine Δ5-Desaturase, eine Δ4-Desaturase, eine Δ6-Elongase und eine Δ5-Elongase, oder

    ii) eine Δ12-Desaturase, eine pilzliche ω3-Desaturase und/oder pilzliche Δ15-Desaturase, eine Δ8-Desaturase, eine Δ5-Desaturase, eine Δ4-Desaturase, eine Δ9-Elongase und eine Δ5-Elongase,

    wobei jedes Polynukleotid funktionsfähig mit einem oder mehreren samenspezifischen Promotoren verknüpft ist, die in der Lage sind, die Expression dieser Polynukleotide im entwickelnden Samen der Pflanze zu lenken, wobei die Fettsäuren Oleinsäure, Palmitinsäure, ω6-Fettsäuren, welche Linolsäure (LA) und γ-Linolensäure (GLA) umfassen, ω3-Fettsäuren, welche α-Linolensäure (ALA), Stearidonsäure (SDA), Docosapentaensäure (DPA) und Docosahexaensäure (DHA) umfassen, und wahlweise Eicosapentaensäure (EPA) und/oder Eicosatetraensäure (ETA) umfassen, und wobei der Spiegel von DHA in dem Gesamtfettsäuregehalt des Lipids 7% bis 20% beträgt und wobei der Spiegel von Palmitinsäure in dem Gesamtfettsäuregehalt des Lipids zwischen 2% und 16% liegt und wobei der Spiegel von Myristinsäure (C14:0) in dem Gesamtfettsäuregehalt des Lipids weniger als 1% beträgt.
13. Die Pflanze nach Anspruch 12, wobei eines oder mehrere der folgenden Merkmale zutreffen:

    i) die Pflanze ist eine Raps-, Glycine max-, Camelina sativa- oder Arabidopsis thaliana-Pflanze,

    ii) eine oder mehrere der Desaturasen sind in der Lage, ein Acyl-CoA-Substrat zu verwenden,

    iii) reife, geerntete Samen der Pflanze weisen einen DHA-Gehalt von mindestens 28 mg pro Gramm Samen auf.
14. Ein Pflanzenteil, welcher eines oder mehrere der folgenden Merkmale aufweist

    i) umfasst Lipid wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 definiert,

    ii) stammt von einer Pflanze gemäß irgendeinem der Ansprüche 11 bis 13 oder

    iii) kann in einem Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 5 bis 9 verwendet werden.
15. Der Pflanzenteil nach Anspruch 14, welcher ein Samen ist.
16. Ein Verfahren zur Herstellung von Samen, wobei das Verfahren umfasst

    a) Kultivieren einer Pflanze, welche einen Teil wie in Anspruch 14 oder Anspruch 15 definiert erzeugt, oder einer Pflanze gemäß irgendeinem der Ansprüche 11 bis 13,

    b) Ernten von Samen aus der Pflanze oder den Pflanzen und

    c) wahlweise Extrahieren von Lipid aus dem Samen, vorzugsweise um Öl mit einer Gesamt-DHA-Ausbeute von mindestens 60 kg DHA/Hektar zu erzeugen.
17. Samenmehl, das aus dem Samen nach Anspruch 15 erhalten wird.
18. Ein Verfahren zur Herstellung eines Nahrungsmittels zum Verzehr durch Menschen oder Tiere, wobei das Verfahren das Mischen von einem oder mehreren des Lipids oder Öls gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, der Zelle nach Anspruch 10, der transgenen Pflanze nach Anspruch 11, der Ölsaatpflanze nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, dem Pflanzenteil nach Anspruch 14 oder Anspruch 15 oder dem Samenmehl nach Anspruch 17 mit wenigstens einem anderen Nahrungsbestandteil umfasst.
19. Eines oder mehrere des Lipids oder Öls gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, der Zelle nach Anspruch 10, der transgenen Pflanze nach Anspruch 11, der Ölsaatpflanze nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, dem Pflanzenteil nach Anspruch 14 oder Anspruch 15 oder dem Samenmehl nach Anspruch 17 zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention eines medizinischen Zustands, welcher von einem PUFA profitieren würde, wobei der Zustand Herzrhythmusstörung, Angioplastie, Entzündung, Asthma, Psoriasis, Osteoporose, Nierensteine, AIDS, multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, Crohn's Krankheit, Schizophrenie, Krebs, Alkoholembryopathie, Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung, zystische Fibrose, Phenylketonurie, unipolare Depression, aggressive Feindlichkeit, Adrenoleukodystrophie, koronare Herzerkrankung, Hypertonie, Diabetes, Adipositas, Alzheimer-Krankheit, chronisch obstruktive Lungenerkrankung, ulzerative Kolitis, Restenose nach Angioplastie, Ekzem, hoher Blutdruck, Plättchenaggregation, Gastrointestinalblutung, Endometriose, prämenstruales Syndrom, myalgische Enzephalomyelitis, chronische Müdigkeit nach Virusinfektionen oder eine Augenkrankheit ist.
20. Ein Verfahren zur Herstellung von Ethylestern von mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wobei das Verfahren das Umestern von Triacylglycerolen in extrahiertem Pflanzenlipid umfasst, wobei das extrahierte Pflanzenlipid Fettsäuren umfasst, die in der Form verestert sind, dass die Fettsäuren Oleinsäure, Palmitinsäure, ω6-Fettsäuren, welche Linolsäure (LA) umfassen, ω3-Fettsäuren, welche α-Linolensäure (ALA) und Docosahexaensäure (DHA) umfassen, und gegebenenfalls eine oder mehrere von Stearidonsäure (SDA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosapentaensäure (DPA) und Eicosatetraensäure (ETA) umfassen, wobei der Spiegel von DHA in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids 7% bis 20% beträgt und wobei der Spiegel von Palmitinsäure in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids zwischen 2% und 16% liegt und wobei der Spiegel von Myristinsäure (C14:0) in dem Gesamtfettsäuregehalt des extrahierten Lipids weniger als 1% beträgt, wodurch die Ethylester hergestellt werden.