HK1204341B - Aptamer-based multiplexed assays - Google Patents

Claims (20)

1. Verfahren, umfassend:

   Bereitstellen eines Aptamers, das auf einem ersten festen Träger immobilisiert ist, wobei das Aptamer eine spezifische Bindungsaffinität zu dem Zielmolekül aufweist und eine erste Markierung trägt, die eine Affinität zu einem ersten Fangelement aufweist, wobei der erste feste Träger ein erstes Fangelement umfasst und die erste Markierung mit dem ersten Fangelement assoziiert ist, um das Aptamer auf dem ersten festen Träger zu immobilisieren,

   wobei der erste feste Träger mit einer oder mehreren Lösungen gewaschen wurde, die aggregierte Aptamere dissoziieren;

   Kontaktieren des immobilisierten Aptamers mit der Testprobe, wobei ein Aptamer-Ziel-Affinitätskomplex ausgebildet wird, wenn das Zielmolekül in der Testprobe vorhanden ist;

   Entfernen einer oder mehrerer Komponenten des Gemischs, die nicht mit dem ersten festen Träger assoziiert sind;

   Binden einer zweiten Markierung mit einer Affinität zu einem zweiten Fangelement an das Zielmolekül in dem Aptamer-Ziel-Affinitätskomplex;

   Freisetzen des Aptamer-Ziel-Affinitätskomplexes von dem ersten festen Träger;

   Aussetzen des freigesetzten Aptamer-Ziel-Affinitätskomplexes gegenüber einem zweiten festen Träger, der ein zweites Fangelement umfasst, und das Zulassen der Assoziierung der zweiten Markierung mit dem zweiten Fangelement;

   Entfernen jeglicher Komponenten des Gemischs, die nicht mit dem zweiten festen Träger assoziiert sind; und

   Eluieren von Aptameren von dem zweiten festen Träger mit einer oder mehreren Lösungen, die ein chaotropes Salz umfassen, das Aptamer/Analyt-Wechselwirkungen unterbricht.
2. Verfahren zum Detektieren der Gegenwart von oder Bestimmen der Menge eines Zielmoleküls in einer Probe, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

   Bereitstellen einer Vielzahl von immobilisierten Aptameren, wobei jedes der Aptamere spezifisch für ein Zielmolekül ist und wobei jedes der Vielzahl von Aptameren eine erste abspaltbare Fangmarkierung umfasst, wobei die Aptamere auf einem festen Träger immobilisiert werden, auf dessen Oberfläche Sonden haften, wobei die Sonden an die erste Markierung binden, sodass die Aptamere auf dem festen Träger durch Binden der ersten Markierung und der Sonde immobilisiert werden;

   Kontaktieren der immobilisierten Aptamere mit einer Zielmoleküle enthaltenden Probe, um ein Gemisch zu bilden, das an den festen Träger gebundene Aptamer-Zielmolekül-Komplexe enthält;

   Trennen der an den festen Träger gebundenen Aptamer-Zielmolekül-Komplexe von dem Rest des Gemischs;

   Einführen einer zweiten Fangmarkierung zu der Zielmolekülkomponente des Aptamer-Zielmolekül-Komplexes;

   Dissoziieren des Aptamer-Zielmolekül-Komplexes von der Oberfläche des festen Trägers durch Abspalten der ersten abspaltbaren Fangmarkierung;

   Bereitstellen eines zweiten festen Trägers, an dessen Oberfläche Sonden haften, wobei die Sonden in der Lage sind, an die zweite Fangmarkierung auf Zielmolekülen zu binden;

   Kontaktieren des dissoziierten Aptamer-Zielmolekül-Komplexes mit dem zweiten festen Träger, sodass die Aptamer-Zielmolekül-Komplexe durch Binden der zweiten Fangmarkierung und der Sonde an den zweiten Träger gebunden werden;

   Eluieren von Aptameren von dem zweiten festen Träger mit einer oder mehreren Pufferlösungen, die ein chaotropes Salz umfassen, das Aptamer/Analyt-Wechselwirkungen unterbricht, aber Aptamer/Aptamer-Wechselwirkungen und DNA-Hybridisierung unterstützt;

   Dissoziieren des Aptamer-Zielmoleküls;

   Detektieren der freien Aptamere.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Aptamer zumindest ein C-5-modifiziertes Nucleotid umfasst.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Aptamer zumindest eine chemische Modifikation umfasst, die eine chemische Substitution an einer oder mehreren Positionen umfasst, die unabhängig voneinander aus einer Riboseposition, einer Desoxyriboseposition, einer Phosphatposition und einer Basenposition ausgewählt sind, wobei die chemische Modifikation gegebenenfalls unabhängig aus der aus einer 2'-Position-Zuckermodifikation, einer 2'-Amino- (2'-NH₂-), einer 2'-Fluor- (2'-F-), einer 2'-O-Methyl- (2'-OMe-), einer 5-Position-Pyrimidin-Modifikation, einer 8-Position-Purin-Modifikation, einer Modifikation an einem exozyklischen Cytosinamin, einer Substitution von 5-Bromuracil, einer Substitution von 5-Bromdesoxyuridin, einer Substitution von 5-Bromdesoxycytidin, einer Hauptkettenmodifikation, Methylierung, einer 3'-Verkappung und einer 5'-Verkappung bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiters umfassend das Einführen einer kinetischen Exposition.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Aptamer-Ziel-Affinitätskomplex eine langsame Dissoziationsrate aufweist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Dissoziationsrate des Aptamer-Ziel-Affinitätskomplexes (t_1/2):

   (a) größer oder gleich 30 Minuten;

   (b) zwischen etwa 30 Minuten und etwa 240 Minuten; oder

   (c) aus der aus ≥ 30 Minuten, ≥ 60 Minuten, ≥ 90 Minuten, ≥ 120 Minuten, ≥ 150 Minuten, ≥ 180 Minuten, ≥ 210 Minuten und ≥ 240 Minuten bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein oder mehrere der Pufferlösungen ein organisches Lösungsmittel, gegebenenfalls Glycerin, umfassen.
9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das chaotrope Salz aus der aus Natriumperchlorat, Lithiumchlorid, Magnesiumchlorid und Natriumchlorid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Aptamer unter Verwendung eines Verfahrens detektiert und gegebenenfalls quantifiziert wird, das aus der aus Q-PCR, MS, "Next Generation"-Sequenzieren und -Hybridisieren bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei die Q-PCR gegebenenfalls unter Verwendung von TaqMan®-PCR, eines interkalierenden fluoreszierenden Farbstoffs während des PCR-Verfahrens oder eines molekularen Leuchtsignals während des PCR-Verfahrens durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Aptamer eine detektierbare Gruppierung umfasst, wobei die detektierbare Gruppierung gegebenenfalls aus der aus einem Farbstoff, einem Quantenpunkt, einer Radiomarkierung, einer elektrochemischen funktionellen Gruppe und einem Enzym plus einem detektierbaren Enzymsubstrat bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei der Farbstoff vorzugsweise ein fluoreszierender Farbstoff ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Aptamer eine einsträngige Nucleinsäure oder eine doppelsträngige Nucleinsäure ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Aptamer DNA, RNA oder sowohl DNA als auch RNA umfasst.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Zielmolekül aus der aus einem Protein, einem Peptid, einem Kohlenhydrat, einem Polysaccharid, einem Glykoprotein, einem Hormon, einem Rezeptor, einem Antigen, einem Antikörper, einem Virus, einem Substrat, einem Metaboliten, einem Übergangszustandsanalogon, einem Cofaktor, einem Hemmer, einem Arzneimittel, einem Farbstoff, einem Nährstoff, einem Wachstumsfaktor, einem Gewebe und einem Betäubungsmittel bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei das Zielmolekül vorzugsweise ein Protein oder ein Peptid ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Testprobe aus der aus einer biologischen Probe, einer Umweltprobe, einer chemischen Probe, einer pharmazeutischen Probe, einer Nahrungsmittelprobe, einer landwirtschaftlichen Probe und einer Veterinärprobe bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei die biologische Probe gegebenenfalls aus der aus Blut, Vollblut, Leukozyten, mononukleären Zellen des peripheren Blutes, Plasma, Serum, Sputum, Atem, Urin, Sperma, Speichel, Meningealflüssigkeit, Fruchtwasser, Drüsenflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Brustwarzenaspirat, Bronchialaspirat, Synovialflüssigkeit, Gelenksaspirat, Zellen, einem zellulären Extrakt, Stuhl, Gewebe, einem Gewebeextrakt, einer Gewebebiopsie und Cerebrospinalflüssigkeit bestehenden Gruppe, vorzugsweise Plasma oder Serum, ausgewählt ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die erste Markierung und die zweite Markierung, das erste Fangelement und das zweite Fangelement jeweils zumindest eine Komponente umfassen, die unabhängig aus der aus einem Polynucleotid, einem Polypeptid, einer Peptidnucleinsäure, einer Locked-Nucleinsäure, einem Oligosaccharid, einem Polysaccharid, einem Antikörper, einem Affibody, einem Antikörpermimetikum, einem Zellrezeptor, einem Liganden, einem Lipid, Biotin, Avidin, Streptavidin, Extravidin, Neutravidin, Traptavidin, einem Metall, Histidin und einem beliebigen Teil einer dieser Strukturen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
17. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste Markierung eine freisetzbare Gruppierung umfasst, wobei die freisetzbare Gruppierung vorzugsweise eine lichtspaltbare Gruppierung umfasst.
18. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste feste Träger und der zweite feste Träger jeweils unabhängig voneinander aus der aus einem Polymerkügelchen, einem Agarosekügelchen, einem Polystyrolkügelchen, einem Acrylamidkügelchen, einem Kügelchen mit festem Kern, einem porösen Kügelchen, einem paramagnetischen Kügelchen, einem Glaskügelchen, einem Kügelchen mit kontrollierten Poren, einem Mikrotiter-Well, einem Cycloolefin-Copolymersubstrat, einer Membran, einem Kunststoffsubstrat, Nylon, einer Langmuir-Blodgett-Schicht, Glas, einem Germaniumsubstrat, einem Siliciumsubstrat, einem Silicium-Waferchip, einem Durchfluss-Chip, einem Mikrokügelchen, einem Nanopartikel, einem Polytetrafluorethylensubstrat, einem Polystyrolsubstrat, einem Galliumarsenidsubstrat, einem Goldsubstrat und einem Silbersubstrat bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
19. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, weiters umfassend das Quantifizieren des Ziels durch Quantifizieren des Aptamers.
20. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Detektion des Aptamers Hybridisierung des Aptamers an einen dritten festen Träger umfasst, wobei der dritte feste Träger eine Vielzahl von adressierbaren Merkmalen umfasst und wobei zumindest eines der Merkmale zumindest ein darauf angeordnetes Fangelement umfasst, das komplementär zu jeglicher innerhalb des Aptamers enthaltenen Sequenz ist, und/oder weiters den Schritt des Detektierens des Zielmoleküls durch Detektieren des Aptamerteils des Aptamer-Ziel-Affinitätskomplexes umfasst.