HK1262121B - Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas - Google Patents

Claims (29)

1. Procédé de génération de protéines de liaison à un antigène contre un antigène d'intérêt humain, comprenant les étapes consistant à :

   (a) fabriquer une souris génétiquement modifiée avec une tolérance réduite d'un antigène d'intérêt humain, comprenant :

   (i) une introduction dans un embryon de souris au stade unicellulaire ou une cellule souche embryonnaire (ES) de souris :

   (I) d'une protéine Cas9 ou un acide nucléique codant pour la protéine Cas9, dans lequel la protéine Cas9 présente une activité d'induction de rupture à double brin ;

   (II) d'un premier ARN guide ou d'un ADN codant pour le premier ARN guide, dans lequel le premier ARN guide s'hybride à une première séquence de reconnaissance d'ARN guide à l'intérieur d'un locus génomique cible, dans lequel le locus génomique cible comprend tout ou partie d'un gène codant pour un auto-antigène homologue à ou partageant un épitope d'intérêt avec l'antigène d'intérêt humain ; et

   (III) un deuxième ARN guide ou un ADN codant pour le deuxième ARN guide, dans lequel le deuxième ARN guide s'hybride à une deuxième séquence de reconnaissance d'ARN guide à l'intérieur du locus génomique cible ;

   dans lequel les ARN guides créent des ruptures à double brin appariées à différents sites dans le locus génomique cible, et

   dans lequel l'embryon de souris au stade unicellulaire et la cellule ES de souris proviennent d'une souche de souris qui est constituée de 50 % de BALB/c, 25 % de C57BL/6 et 25 % de129 ;

   (ii) une identification d'un embryon de souris modifié au stade unicellulaire ou d'une cellule ES de souris modifiée avec une modification biallélique au niveau du locus génomique cible, dans lequel l'expression de l'auto-antigène est éliminée ; et

   (iii) la production d'une souris de génération F0 génétiquement modifiée à partir de l'embryon de souris modifié au stade unicellulaire ou de la cellule ES de souris modifiée, dans lequel le locus génomique cible est modifié dans la paire de premier et second chromosomes correspondants chez la souris de génération F0 génétiquement modifiée de telle sorte que l'expression de l'auto-antigène est éliminée ;

   (b) immuniser la souris de génération F0 génétiquement modifiée produite à l'étape (a) avec l'antigène d'intérêt humain ; et

   (c) maintenir la souris de génération F0 génétiquement modifiée dans des conditions suffisantes pour initier une réponse immunitaire à l'antigène d'intérêt humain, dans lequel la souris de génération F0 génétiquement modifiée produit des protéines de liaison à un antigène contre l'antigène d'intérêt humain.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel :

   (I) la cellule ou l'embryon à l'étape (a)(i) est l'embryon de souris au stade unicellulaire, et la production de la souris de génération F0 génétiquement modifiée à l'étape (a)(iii) comprend une implantation et une gestation de l'embryon de souris modifié au stade unicellulaire chez une mère porteuse afin de produire la souris de génération F0 génétiquement modifiée dans laquelle le locus génomique cible est modifié dans la paire de premier et second chromosomes correspondants de telle sorte que l'expression de l'auto-antigène est éliminée, ou

   (II) la cellule ou l'embryon à l'étape (a)(i) est la cellule ES de souris, et la production de la souris de génération F0 génétiquement modifiée à l'étape (a)(iii) comprend une introduction de la cellule ES de souris modifiée dans un embryon hôte, et une implantation et une gestation de l'embryon hôte chez une mère porteuse afin de produire la souris de génération F0 génétiquement modifiée dans laquelle le locus génomique cible est modifié dans la paire de premier et second chromosomes correspondants de telle sorte que l'expression de l'auto-antigène est éliminée.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant en outre la fabrication d'un hybridome à partir de cellules B isolées à partir de la souris de génération F0 génétiquement modifiée immunisée.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en outre l'obtention à partir de la souris de génération F0 génétiquement modifiée immunisée d'une première séquence d'acide nucléique codant pour un domaine variable à chaîne lourde d'immunoglobuline de l'une des protéines de liaison à un antigène contre l'antigène d'intérêt humain et/ou d'une deuxième séquence d'acide nucléique codant pour un domaine variable à chaîne légère d'immunoglobuline de l'une des protéines de liaison à un antigène contre l'antigène d'intérêt humain,

   facultativement dans lequel la première séquence d'acide nucléique et/ou la deuxième séquence d'acide nucléique sont obtenues à partir d'un lymphocyte de la souris de génération F0 génétiquement modifiée ou à partir d'un hybridome produit à partir du lymphocyte, et

   facultativement dans lequel la souris de génération F0 génétiquement modifiée comprend un locus d'immunoglobuline humanisée, et dans lequel la première séquence d'acide nucléique code pour un domaine variable de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine, et la deuxième séquence d'acide nucléique code pour un domaine variable de chaîne légère d'immunoglobuline humaine.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la première séquence de reconnaissance d'ARN guide est 5' de la deuxième séquence de reconnaissance d'ARN guide dans le locus génomique cible, et dans lequel l'étape (a)(ii) comprend la réalisation d'un test de rétention pour déterminer que le nombre de copies est de deux pour une région 5' et à moins d'environ 1 kb de la première séquence de reconnaissance d'ARN guide et/ou pour une région 3' et à moins d'environ 1 kb de la deuxième séquence de reconnaissance d'ARN guide.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l'antigène d'intérêt humain est un orthologue de l'auto-antigène.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le locus génomique cible est modifié pour comprendre une insertion d'un ou plusieurs nucléotides, une délétion d'un ou plusieurs nucléotides, ou un remplacement d'un ou plusieurs nucléotides.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le locus génomique cible est modifié pour comprendre une délétion d'un ou plusieurs nucléotides,

   facultativement dans lequel la délétion est une délétions précise sans insertion ni délétion aléatoires (indels), et

   facultativement dans lequel le locus génomique cible est modifié pour comprendre une délétion biallélique comprise entre environ 0,1 kb et environ 200 kb.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel :

   (I) la première séquence de reconnaissance d'ARN guide comprend le codon de départ pour le gène codant pour l'auto-antigène ou se trouve à au plus environ 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ou 1 000 nucléotides du codon de départ, et la deuxième séquence de reconnaissance d'ARN guide comprend le codon d'arrêt pour le gène codant pour l'auto-antigène ou se trouve à au plus environ 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ou 1 000 nucléotides du codon d'arrêt, et dans lequel la modification comprend une délétion biallélique de tout ou partie du gène codant pour l'auto-antigène ; ou

   (II) les première et deuxième séquences de reconnaissance d'ARN guide sont différentes, et chacune des première et deuxième séquences de reconnaissance d'ARN guide comprend le codon de départ pour le gène codant l'auto-antigène ou se trouve à au plus environ 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ou 1 000 nucléotides du codon de départ, et dans lequel la modification comprend une interruption biallélique du codon de départ du gène codant pour l'auto-antigène.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel l'étape d'introduction (a)(i) comprend en outre l'introduction dans la cellule ES de souris ou dans l'embryon de souris au stade unicellulaire :

    (IV) d'un troisième ARN guide ou d'un ADN codant pour le troisième ARN guide, dans lequel le troisième ARN guide s'hybride à une troisième séquence de reconnaissance d'ARN guide à l'intérieur du locus génomique cible ; et

    (V) d'un quatrième ARN guide ou d'un ADN codant pour le quatrième ARN guide, dans lequel le quatrième ARN guide s'hybride à une quatrième séquence de reconnaissance d'ARN guide à l'intérieur du locus génomique cible.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel :

    (I) la cellule ou l'embryon à l'étape (a)(i) est la cellule ES de souris, et l'étape (a)(i) comprend l'introduction d'un ADN codant pour la protéine Cas9, l'ADN codant pour le premier ARN guide et l'ADN codant pour le deuxième ARN guide, et facultativement dans lequel l'ADN codant pour la protéine Cas9, l'ADN codant pour le premier ARN guide et l'ADN codant pour le deuxième ARN guide sont chacun introduits dans la cellule ES de souris par électroporation ou nucléofection, ou

    (II) la cellule ou l'embryon à l'étape (a)(i) est l'embryon de souris au stade unicellulaire, et l'étape (a)(i) comprend l'introduction d'un ARN codant pour la protéine Cas9, le premier ARN guide et le deuxième ARN guide, et facultativement dans lequel l'ARN codant pour la protéine Cas9, le premier ARN guide et le deuxième ARN guide sont introduits dans l'embryon de souris au stade unicellulaire par injection pronucléaire ou injection cytoplasmique.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel une matrice de réparation exogène n'est pas introduite à l'étape (a)(i).
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel l'étape d'introduction (a)(i) comprend en outre une introduction dans la cellule ES de souris ou l'embryon de souris au stade unicellulaire d'une matrice de réparation exogène comprenant un bras d'homologie 5' qui s'hybride à une séquence cible 5' au niveau du locus génomique cible et un bras d'homologie 3' qui s'hybride à une séquence cible 3' au niveau du locus génomique cible, à condition que si la cellule ou l'embryon à l'étape (a)(i) est l'embryon de souris au stade unicellulaire, la matrice de réparation exogène ne dépasse pas environ 5 kb de longueur, et facultativement dans lequel le locus génomique cible est modifié pour comprendre une délétion d'un ou plusieurs nucléotides, et dans lequel la séquence d'acide nucléique délétée consiste en la séquence d'acide nucléique entre les séquences cibles 5' et 3'.
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la matrice de réparation exogène comprend en outre un insert d'acide nucléique flanqué du bras d'homologie 5' et du bras d'homologie 3', et facultativement dans lequel l'insert d'acide nucléique est homologue ou orthologue par rapport au locus génomique cible, le locus génomique cible est modifié pour comprendre une délétion d'un ou plusieurs nucléotides, et l'insert d'acide nucléique remplace la séquence d'acide nucléique délétée.
15. Procédé selon la revendication 13 ou 14, dans lequel la matrice de réparation exogène présente une longueur comprise entre environ 50 nucléotides et environ 1 kb, facultativement dans lequel la matrice de réparation exogène présente une longueur comprise entre environ 80 nucléotides et environ 200 nucléotides, et facultativement dans lequel la matrice de réparation exogène est un oligodésoxynucléotide simple brin.
16. Procédé selon la revendication 13 ou 14, dans lequel la cellule ou l'embryon à l'étape (a)(i) est la cellule ES de souris, et dans lequel :

    (a) la matrice de réparation exogène est un grand vecteur de ciblage (LTVEC) d'une longueur d'au moins 10 kb ; ou

    (b) la matrice de réparation exogène est un LTVEC, dans lequel la somme totale des bras d'homologie 5' et 3' du LTVEC est d'au moins 10 kb de longueur.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel la souris comprend un locus d'immunoglobuline humanisée.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, dans lequel l'haplotype MHC de la souris est MHC^b/d.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans lequel la souris comprend dans sa lignée germinale des segments de gène de région variable non réagencés humains insérés à un locus d'immunoglobuline de souris endogène, dans lequel les segments de gène de région variable non réagencés humains sont des segments de gène de chaîne lourde, et le locus d'immunoglobuline de souris est un locus de chaîne lourde, et/ou dans lequel les segments de gène de région variable non réagencés humains sont des segments de chaîne légère kappa ou lambda, et le locus d'immunoglobuline de souris est un locus de chaîne légère.
20. Procédé selon la revendication 19, dans lequel la souris comprend dans sa lignée germinale des segments de gène de région variable non réagencés humains liés de manière opérationnelle à un gène de région constante de souris, dans lequel la souris est dépourvue d'un gène de région constante humain, et dans lequel le gène de région constante de souris se trouve à un locus d'immunoglobuline de souris endogène, et

    facultativement dans lequel la souris comprend :

    (I) un locus de chaîne lourde hybride comprenant une insertion de segments de gène V, D et J de chaîne lourde d'immunoglobuline humains, dans lequel les segments de gène V, D et J de chaîne lourde d'immunoglobuline humains sont liés de manière opérationnelle à un gène de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris, dans lequel le gène de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris est au niveau d'un locus d'immunoglobuline de souris endogène ; et

    (II) un locus de chaîne légère hybride comprenant une insertion de segments de gène V et J de chaîne légère d'immunoglobuline humains, dans lequel les segments de gène V et J humains sont liés de manière opérationnelle à une séquence de gène de région constante de chaîne légère d'immunoglobuline de souris ;

    dans lequel (I) se réagence pour former une séquence de chaîne lourde hybride comprenant une région variable humaine liée de manière opérationnelle à une région constante de souris, et (II) se réagence pour former une séquence de chaîne légèrehybride comprenant une région variable humaine liée de manière opérationnelle à une région constante de souris, et dans lequel la souris est incapable de former un anticorps qui comprend une région variable humaine et une région constante humaine.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, dans lequel la souris comprend dans sa lignée germinale un locus variable de chaîne légère d'immunoglobuline humanisée ne comprenant pas plus d'une ou pas plus de deux séquences V/J de chaîne légère humaine réarrangées liées de manière opérationnelle à une région constante de chaîne légère de souris, et dans lequel la souris comprend en outre un locus variable de chaîne lourde d'immunoglobuline humanisée comprenant au moins un segment V humain non réagencé, au moins un segment D humain non réagencé et au moins un segment J humain non réagencé liés de manière opérationnelle à un gène de région constante de chaîne lourde de souris, et facultativement dans lequel la souris comprend un locus variable d'immunoglobuline de chaîne lourde humanisée et un locus variable d'immunoglobuline de chaîne légère humanisée, dans lequel la souris exprime une chaîne légère unique.
22. Procédé selon la revendication 21, dans lequel la souris comprend :

    (a) une région variable de chaîne légère d'immunoglobuline humaine réagencée unique (V_L/J_L) qui code pour un domaine V_L humain d'une chaîne légère d'immunoglobuline, dans lequel la région V_L/J_L humaine réagencée unique est choisie parmi un segment de gène Vκ1-39/Jκ5 humain ou un segment de gène Vκ3-20/Jκ1 humain ; et

    (b) un remplacement de segments de gène variable de chaîne lourde endogène (V_H) par un ou plusieurs segments de gène V_H humain, dans lequel les segments de gène V_H humain sont liés de manière opérationnelle à un gène de région de constante de chaîne lourde endogène (C_H), et les segments de gène V_H humain sont capables de se réagencer et de former un gène de chaîne lourde chimérique humain/de souris.
23. Procédé selon la revendication 21, dans lequel la souris exprime une population d'anticorps, et la lignée germinale de la souris n'inclut qu'un gène de région variable de chaîne légère kappa d'immunoglobuline unique qui est un gène de région variable de chaîne légère kappa de lignée germinale humaine réarrangé, dans lequel la souris est soit hétérozygote pour le gène de région variable de chaîne légère kappa d'immunoglobuline unique en ce sens qu'elle ne contient qu'une seule copie, soit homozygote pour le gène de région variable de chaîne légère kappa d'immunoglobuline unique en ce sens qu'elle contient deux copies, la souris étant caractérisée par une maturation d'affinité active de sorte que :

    (a) chaque chaîne légère kappa d'immunoglobuline de la population comprend un domaine variable de chaîne légère qui est codé par le gène de région variable de chaîne légère kappa de lignée germinale humaine réarrangés, ou par un variant à mutation somatique de celui-ci ;

    (b) la population inclut des anticorps comprenant les chaînes légères kappa d'immunoglobuline dont le domaine variable de chaîne légère est codé par le gène de région variable de chaîne légère kappa de lignée germinale humaine réagencés et des anticorps comprenant les chaînes légères kappa d'immunoglobuline dont le domaine variable de chaîne légère est codé par ses variants à mutation somatique ; et

    (c) la souris génère une collection diversifiée de chaînes lourdes de haute affinité à mutation somatique qui s'associent avec succès aux chaînes légères kappa d'immunoglobuline pour former les anticorps de la population.
24. Procédé selon la revendication 21, dans lequel la souris est hétérozygote ou homozygote dans sa lignée germinale pour :

    (a) une insertion au niveau d'un locus de région variable de chaîne légère d'immunoglobuline κ de souris endogène d'une séquence réagencée Vκ/Jκ comprenant :

    (i) une séquence Yκ de lignée germinale humaine unique, laquelle séquence Yκ de lignée germinale humaine unique est présente dans SEQ ID NO : 148 ou SEQ ID NO : 149 ; et

    (ii) une séquence Jκ de lignée germinale humaine unique, dans laquelle la séquence Vκ/Jκ réagencée est liée de manière opérationnelle à la région constante κ de souris endogène ; et

    (b) une insertion au niveau d'un locus de région variable de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris endogène d'une pluralité de segments de gène de région variable de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine, dans lequel les segments de gène de région variable de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine sont liés de manière opérationnelle à une région constante de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris endogène, et les segments de gène de région variable de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine sont capables de se réagencer et de former un gène de chaîne lourde d'immunoglobuline chimérique réarrangé humain/de souris.
25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 24, dans lequel la souris comprend une modification d'un locus de chaîne lourde d'immunoglobuline, dans lequel la modification réduit ou élimine la fonction ADAM6 endogène,

    dans lequel la souris comprend une séquence d'acide nucléique ectopique codant pour une protéine ADAM6 de souris, dans lequel la protéine ADAM6 est fonctionnelle chez une souris mâle, et

    dans lequel la séquence d'acide nucléique ectopique codant pour la protéine ADAM6 de souris est présente au niveau du locus de région variable de chaîne lourde humaine.
26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 25, dans lequel la souris comprend un locus d'immunoglobuline humanisée, dans lequel l'antigène d'intérêt humain est tout ou partie d'une protéine humaine qui est orthologue à l'auto-antigène, et dans lequel :

    (I) la première séquence de reconnaissance d'ARN guide comprend le codon de départ pour le gène codant pour l'auto-antigène ou se trouve au plus à environ 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ou 1 000 nucléotides du codon de départ, et la seconde séquence de reconnaissance d'ARN guide comprend le codon d'arrêt pour le gène codant pour l'auto-antigène ou se trouve au plus à environ 10, 20,30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ou 1 000 nucléotides du codon d'arrêt, et la modification comprend une délétion biallélique de tout ou partie du gène codant pour l'auto-antigène, moyennant quoi l'expression de l'auto-antigène est éliminée ; ou

    (II) les première et deuxième séquences de reconnaissance d'ARN guide sont différentes et chacune comprend le codon de départ pour le gène codant pour l'auto-antigène ou est au plus à environ 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ou 1 000 nucléotides du codon de départ, et la modification comprend une interruption biallélique du codon de départ pour le gène codant pour l'auto-antigène, moyennant quoi l'expression de l'auto-antigène est éliminée.
27. Procédé selon la revendication 26, dans lequel la souris comprend :

    (a) une séquence d'acide nucléique ectopique codant pour une protéine ADAM6 de souris, dans lequel la protéine ADAM6 est fonctionnelle chez une souris mâle ;

    (b) un locus de chaîne lourde hybride comprenant une insertion de segments de gène V, D et J de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine, dans lequel les segments de gène V, D et J de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine ont liés de manière opérationnelle à un gène de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris, dans lequel le gène de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris est à un locus d'immunoglobuline de souris endogène ; et

    (c) un locus de chaîne légère hybride comprenant une insertion de segments de gène V et J de chaîne légère d'immunoglobuline humaine, dans lequel les segments de gène V et J humains sont liés de manière opérationnelle à une séquence de gène de région constante de chaîne légère d'immunoglobuline de souris ;

    dans lequel (b) se réagence pour former une séquence de chaîne lourde hybride comprenant une région variable humaine liée de manière opérationnelle à une région constante de souris, et (c) se réagence pour former une séquence de chaîne légère hybride comprenant une région variable humaine liée de manière opérationnelle à une région constante de souris, et dans lequel la souris est incapable de former un anticorps qui comprend une région variable humaine et une région constante humaine.
28. Procédé selon la revendication 26, dans lequel la souris est hétérozygote ou homozygote dans sa lignée germinale pour :

    (a) une séquence d'acide nucléique ectopique codant pour une protéine ADAM6 de souris, dans lequel la protéine ADAM6 est fonctionnelle chez une souris mâle ;

    (b) une insertion au niveau d'un locus de région variable de chaîne légère d'immunoglobuline κ de souris endogène d'une séquence Vκ/Jκ réagencée comprenant :

    (i) une séquence Vκ de lignée germinale humaine unique, laquelle séquence Vκ de lignée germinale humaine unique est présente dans SEQ ID NO : 148 ou SEQ ID NO : 149 ; et

    (ii) une séquence Jκ de lignée germinale humaine unique, dans laquelle la séquence Vκ/Jκ réagencée est liée de manière opérationnelle à la région constante κ de souris endogène ; et

    (c) une insertion au niveau d'un locus de région variable de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris endogène d'une pluralité de segments de gène de région variable de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine, dans lequel les segments de gène de région variable de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine sont liés de manière opérationnelle à une région constante de chaîne lourde d'immunoglobuline de souris endogène, et les segments de gène de région variable de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine sont capables de se réagencer et de former un gène de chaîne lourde d'immunoglobuline chimérique réarrangé humain/de souris.
29. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 28, dans lequel la cellule ES de souris est une cellule hybride ou l'embryon de souris au stade unicellulaire est un embryon hybride au stade unicellulaire, et dans lequel le procédé comprend en outre les étapes consistant à :

    (a') comparer la séquence de la paire de premier et second chromosomes correspondants à l'intérieur du locus génomique cible, et sélectionner une région cible à l'intérieur du locus génomique cible avant l'étape de mise en contact (a) sur la basede la région cible présentant un pourcentage plus élevé d'identité de séquence entre la paire de premier et second chromosomes correspondants par rapport à tout ou partie du reste du locus génomique cible, dans lequel la région cible comprend :

    la première séquence de reconnaissance d'ARN guide et au moins 10 pb, 20 pb, 30 pb, 40 pb, 50 pb, 100 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb ou 10 kb de séquence flanquante du côté 5', du côté 3' ou de chaque côté de la première séquence de reconnaissance d'ARN guide, et/ou

    la deuxième séquence de reconnaissance d'ARN guide et au moins 10 pb, 20 pb, 30 pb, 40 pb, 50 pb, 100 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb ou 10 kb de séquence flanquante du côté 5', du côté 3' ou de chaque côté de la deuxième séquence de reconnaissance d'ARN guide,

    facultativement dans lequel la région cible présente un pourcentage plus élevé d'identité de séquence entre la paire de premier et second chromosomes correspondants par rapport au reste du locus génomique cible, et

    facultativement dans lequel la région cible présente au moins 99,9% d'identité de séquence entre la paire de premier et second chromosomes correspondants, et le reste du locus génomique cible n'a pas plus de 99,8% d'identité de séquence entre la paire de premier et second chromosomes correspondants.