HK1262035A1 - Polynucleotide enrichment and amplification using argonaute systems - Google Patents

Claims (15)

1. Ein Verfahren zum Amplifizieren einer doppelsträngigen Zielnukleinsäure, beinhaltend:

   (a) Bereitstellen eines Systems, das Folgendes aufweist:

   eine 5'-phosphorylierte einzelsträngige Nukleinsäure oder ein Derivat davon und

   ein Argonautenprotein oder eine Variante davon,

   wobei die 5'-phosphorylierte einzelsträngige Nukleinsäure oder das Derivat davon eine zielspezifische Nukleotidregion enthält, die zu einer Region eines ersten Strangs der doppelsträngigen Zielnukleinsäure komplementär ist;

   (b) In-Kontakt-Bringen der doppelsträngigen Zielnukleinsäure mit dem System, um einen Komplex zu bilden;

   (c) Hybridisieren eines Primers an einen zweiten Strang der doppelsträngigen Zielnukleinsäure, wobei der Primer eine Sequenz enthält, die zu einer Region des zweiten Strangs der doppelsträngigen Zielnukleinsäure komplementär ist, und

   (d) Verlängern einer Nukleinsäure, die zu dem zweiten Strang der doppelsträngigen Zielnukleinsäure komplementär ist, ab dem Primer unter Verwendung einer Polymerase.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, ferner beinhaltend das einmalige oder mehrmalige Wiederholen von Schritt (a) bis Schritt (d).
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die doppelsträngige Zielnukleinsäure linear amplifiziert oder exponentiell amplifiziert wird.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zielnukleinsäure eine doppelsträngige DNA (dsDNA) oder eine doppelsträngige RNA (dsRNA) ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Argonautenprotein Natronobacterium gregoryi Argonaute (Ng-Argonaute) ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die 5'-phosphorylierte einzelsträngige Nukleinsäure eine einzelsträngige DNA oder eine einzelsträngige DNA mit weniger als 25 Nukleotiden ist.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der erste Strang der doppelsträngigen Zielnukleinsäure eine universelle Sequenz enthält und wobei die 5'-phosphorylierte einzelsträngige Nukleinsäure oder das Derivat davon eine Sequenz enthält, die zu einer Region der universellen Sequenz komplementär ist, wobei optional der Primer eine Sequenz einer Region der universellen Sequenz enthält.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Polymerase eine strangverdrängende Polymerase ist, wobei optional die Polymerase aus einer Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Bst, Bsu und Phi29.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1, das ferner Folgendes beinhaltet:

   Zuführen mindestens einer Transposase und mindestens einer Transposonendzusammensetzung, enthaltend einen transferierten Strang, zu einer eine Zielnukleinsäure enthaltenden Probe unter Bedingungen, bei denen die Zielnukleinsäure und die Transposonendzusammensetzung eine Transpositionsreaktion eingehen, um eine Mischung zu erzeugen, wobei die Zielnukleinsäure fragmentiert wird, um eine Vielzahl von Zielnukleinsäurefragmenten zu erzeugen, und

   Inkorporieren einer universellen Primersequenz in jedes der Vielzahl von Zielnukleinsäurefragmenten,

   wobei die 5'-phosphorylierte einzelsträngige Nukleinsäure oder das Derivat davon eine zielspezifische Nukleotidregion enthält, die zu einer Region des universellen Primers komplementär ist.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei A) der universelle Primer durch eine PCR-Reaktion in die Vielzahl von Zielnukleinsäurefragmenten inkorporiert wird oder B) zwei universelle Primer in zwei Enden von jedem der Vielzahl von Zielnukleinsäurefragmenten inkorporiert werden.
11. Ein Verfahren zum Amplifizieren einer doppelsträngigen Zielnukleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei das System ein erstes und ein zweites System beinhaltet, wobei das Verfahren Folgendes beinhaltet:

    (a) Bereitstellen eines ersten Systems, das Folgendes aufweist:

    eine erste 5'-phosphorylierte einzelsträngige Nukleinsäure oder ein Derivat davon und

    ein erstes Argonautenprotein oder eine Variante davon,

    wobei die erste 5'-phosphorylierte einzelsträngige Nukleinsäure oder das Derivat davon eine zielspezifische Nukleotidregion enthält, die zu einer Region eines ersten Strangs der doppelsträngigen Zielnukleinsäure komplementär ist;

    (b) Bereitstellen eines zweiten Systems, das Folgendes aufweist:

    eine zweite 5'-phosphorylierte einzelsträngige Nukleinsäure oder ein Derivat davon und

    ein zweites Argonautenprotein oder eine Variante davon,

    wobei die zweite 5'-phosphorylierte einzelsträngige Nukleinsäure oder das Derivat davon eine zielspezifische Nukleotidregion enthält, die zu einer Region eines zweiten Strangs der doppelsträngigen Zielnukleinsäure komplementär ist;

    (c) In-Kontakt-Bringen der doppelsträngigen Zielnukleinsäure mit dem ersten System und dem zweiten System;

    (d) Hybridisieren eines ersten Primers an einen zweiten Strang der doppelsträngigen Zielnukleinsäure, wobei der erste Primer eine Sequenz enthält, die zu einer Region des zweiten Strangs der doppelsträngigen Zielnukleinsäure komplementär ist, und Hybridisieren eines zweiten Primers an einen ersten Strang der doppelsträngigen Zielnukleinsäure, wobei der zweite Primer eine Sequenz enthält, die zu einer Region des ersten Strangs der doppelsträngigen Zielnukleinsäure komplementär ist, und

    (e) Verlängern des 3'-Endes des ersten Primers und des zweiten Primers mit einer oder mehreren Polymerasen, um eine erste und eine zweite doppelsträngige Zielnukleinsäure zu erzeugen.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11,

    i) ferner beinhaltend das einmalige oder mehrmalige Wiederholen von Schritt (a) bis Schritt (e) oder

    ii) wobei die Zielnukleinsäure eine doppelsträngige DNA (dsDNA) ist oder

    iii) wobei die Zielnukleinsäure eine doppelsträngige RNA (dsRNA) ist oder

    iv) wobei das erste und das zweite Argonautenprotein Natronobacterium gregoryi Argonauten (Ng-Argonauten) sind oder

    v) wobei die erste und die zweite 5'-phosphorylierte einzelsträngige Nukleinsäure einzelsträngige DNAs sind oder

    vi) wobei die erste und die zweite 5'-phosphorylierte einzelsträngige Nukleinsäure einzelsträngige DNAs mit weniger als 25 Nukleotiden sind oder

    vii) wobei:

    der erste Strang der doppelsträngigen Zielnukleinsäure eine erste universelle Sequenz enthält und wobei die erste 5'-phosphorylierte einzelsträngige Nukleinsäure oder das Derivat davon des ersten Systems eine Sequenz enthält,

    die zu einer Region der ersten universellen Sequenz komplementär ist, und

    der zweite Strang der doppelsträngigen Zielnukleinsäure eine zweite universelle Sequenz enthält oder wobei die zweite 5'-phosphorylierte einzelsträngige Nukleinsäure oder das Derivat davon des zweiten Systems eine Sequenz enthält, die zu einer Region der zweiten universellen Sequenz komplementär ist, oder

    viii) wobei der erste Primer eine Sequenz einer Region der ersten universellen Sequenz enthält und der zweite Primer eine Sequenz einer Region der zweiten universellen Sequenz enthält oder

    ix) wobei die Polymerase eine strangverdrängende Polymerase ist, wobei optional die Polymerase aus einer Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Bst, Bsu und Phi29.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-12, wobei die Zielnukleinsäure genomische DNA ist.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-12, wobei die Zielnukleinsäure chromosomale DNA oder ein Fragment davon enthält.
15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-12, wobei die Zielnukleinsäure ein Genom oder ein Teilgenom beinhaltet.