HK1261562B - Virus purification - Google Patents

Claims (14)

1. Verwendung von Protaminsulfat zur Trennung infektiöser Chikungunyaviruspartikel von nicht-infektiösen Chikungunyaviruspartikeln.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Protaminsulfat auch die Trennung von infektiösen Chikungunyaviruspartikeln von Wirtszellproteinen und/oder niedermolekularen Materialien erleichtert.
3. Verfahren zur Reinigung von infektiösen Chikungunyaviruspartikeln, umfassend die folgenden Schritte

   a) Bereitstellen einer Rohernte (a), die Chikungunyaviruspartikel und Verunreinigungen umfasst, wobei die Verunreinigungen durch Züchten der Chikungunyaviruspartikel auf einem Zellsubstrat erzeugt werden;

   b) Reduzieren von Verunreinigungen in der Rohernte (a) durch Ausfällen mit Protaminsulfat zur Trennung infektiöser Chikungunyaviruspartikel von nicht-infektiösen Chikungunyaviruspartikeln, um ein Chikungunyaviruspräparat (b) zu erhalten; und

   c) weiteres Reinigen des Chikungunyaviruspräparats (b) unter Verwendung eines oder mehrerer Größenausschluss-Reinigungsschritte, ausgewählt aus:

   i) einer Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation,

   ii) einer Festphasenmatrix, die in eine Säule gepackt ist, umfassend einen Liganden-aktivierten Kern und eine Poren umfassende inaktive Schale, wobei die Molekulargewichtsgrenze der Poren die Viruspartikel daran hindert, in den Liganden-aktivierten Kern einzudringen, und wobei ein Molekül, das kleiner ist als die Molekulargewichtsgrenze der Poren, in den Liganden-aktivierten Kern eindringen kann, und Sammeln der Viruspartikel, und

   iii) Größenausschlusschromatografie,

   um ein Chikungunyaviruspräparat (c) zu erhalten, das infektiöse Chikungunyaviruspartikel umfasst, wobei die restliche Wirtszell-DNA des Viruspräparats (c) weniger als 100 ng/ml und das restliche Wirtszellprotein und die restlichen Aggregate infektiöser Viruspartikel des endgültigen Viruspräparats (c) weniger als 1 µg/ml betragen.
4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 oder das Verfahren nach Anspruch 3, wobei die infektiösen Chikungunyaviruspartikel abgeschwächte Chikungunyaviruspartikel sind.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation drei Schichten von Saccharoselösungen mit etwa 50 %, etwa 35 % und etwa 15 % (w/w) Saccharose umfasst und die zu reinigende Chikungunyaviruszusammensetzung in etwa 10 % (w/w) Saccharose enthalten ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das restliche Protaminsulfat in dem Chikungunyaviruspräparat (c) weniger als 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 oder 200 ng/ml, vorzugsweise weniger als 100 ng/ml beträgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei der Restgehalt an Wirtszellen-DNA im Chikungunyaviruspräparat (c) weniger als 10 ng/ml beträgt und der Restgehalt an Wirtszellproteinen weniger als 100 ng/ml beträgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei die Rohernte (a), die Chikungunyaviruspartikel und Verunreinigungen umfasst, vor Schritt (b) einem oder mehreren Vorreinigungsschritt(en) unterzogen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der eine oder die mehreren Vorreinigungsschritt(e) ausgewählt sind aus

   a) Filtration unter Verwendung eines Filters mit einer Porengröße gleich oder kleiner als 0,2 µm,

   b) Verdau von genomischer Wirtszellen-DNA durch enzymatische Behandlung, und

   c) Ultra-/Diafiltration unter Verwendung einer Hohlfasermembran mit einer Porengröße gleich oder größer als 300 kDa, vorzugsweise gleich oder größer als 100 kDa.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, wobei die Konzentration des Protaminsulfats 0,5 bis 3 mg/ml, bevorzugter 1 bis 2 mg/ml, bevorzugter 1,2 bis 1,8 mg/ml, bevorzugter 1,4 bis 1,6 mg/ml, am meisten bevorzugt 1,6 mg/ml oder 2,0 mg/ml beträgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, wobei die Anreicherung von infektiösen Chikungunyaviruspartikeln in dem Chikungunyaviruspräparat (c) oder in einem endgültigen Viruspräparat relativ zu den gesamten Virusprodukten in der Rohernte (a) im Bereich von mindestens 50 % bis 95 %, vorzugsweise bei mindestens 80 % liegt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 11, wobei die Restverunreinigungen in dem Chikungunyaviruspräparat (c) weniger als 10 % betragen.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 12, wobei das Chikungunyavirus in einer Vero-Zelllinie vermehrt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 13, wobei das Chikungunyavirus ein abgeschwächtes Chikungunyavirus mit einer Deletionsmutation im Nicht-Strukturprotein 3 gemäß SEQ ID NO: 77 oder eine immunogene Variante davon ist.