HK1249360B - Non-human animal exhibiting diminished upper and lower motor neuron function and sensory perception - Google Patents

Claims (18)

1. Gentechnisch verändertes Nagetier, das in seinem Genom einen modifizierten endogenen DR6-Locus aufweist, der (i) eine Deletion der gesamten für DR6 kodierenden Region oder eines Teils davon umfasst und (ii) eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die für ein funktionelles DR6-Signalpeptid kodiert, das operabel an eine Transmembran-Domäne fusioniert ist, wobei das Transmembran-Protein operabel an ein Reporterprotein fusioniert ist, wobei die Nucleinsäuresequenz operabel an eine endogene DR6-Transkriptionsregulationssequenz gebunden ist, wobei einem beliebigen Polypeptid, für das der endogene DR6-Locus kodiert, eine funktionelle zytoplasmatische DR6-Domäne fehlt und wobei das Nagetier (a) eine Dysfunktion eines Motoneurons und/oder (b) eine verminderte Nozizeption im Vergleich mit Kontrollnagetieren entwickelt.
2. Gentechnisch verändertes Nagetier nach Anspruch 1, wobei die Dysfunktion eines Motoneurons und/oder die verminderte Nozizeption im Vergleich mit Kontrollnagetieren bei der Geburt noch nicht wahrnehmbar ist, sondern sich nach einem Alter von 8 Wochen entwickelt.
3. Genetisch modifiziertes Nagetier nach Anspruch 1, wobei:

   (a) das funktionelle DR6-Signalpeptid ein endogenes DR6-Signalpeptid ist;

   (b) die Transmembran-Domäne keine endogene DR6-Transmembran-Domäne ist;

   (c) die Transmembran-Domäne eine ROR1-Transmembran-Domäne ist; und/oder

   (d) das Reporterprotein β-Galactosidase ist.
4. Genetisch modifiziertes Nagetier nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei:

   (a) das genetisch modifizierte Nagetier für den modifizierten endogenen DR6-Locus heterozygot ist; und

   (b) wenn das Nagetier eine Dysfunktion eines Motoneurons zeigt, das Motoneuron vorzugsweise ein oberes Motoneuron oder ein unteres Motoneuron ist, wobei die Dysfunktion eines Motoneurons noch bevorzugter in einem neurologischen Blind-Bewertungstest, einem Rotarod-Test, einem Catwalk-Test, einem Open-Field-Test und bei einer Gewichtsmessung nicht wahrnehmbar ist, bis das Nagetier älter als 4 Wochen ist.
5. Genetisch modifiziertes Nagetier nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Nagetier eine Ratte oder eine Maus ist.
6. Genetisch modifiziertes Nagetier nach Anspruch 5, wobei das Nagetier eine Maus ist und wobei der endogene DR6-Mauslocus eine Nucleinsäure umfasst, die an zumindest eine endogene DR6-Transkriptionsregulationssequenz operabel gebunden ist und für ein DR6-Signalpeptid kodiert, das operabel an eine ROR1-Transmembran-Domäne fusioniert ist, die operabel an β-Galactosidase fusioniert ist.
7. Zelle oder Gewebe, die oder das von einem genetisch modifizierten Nagetier nach einem der Ansprüche 1 bis 6 stammt, wobei die Zelle vorzugsweise ein Motoneuron oder eine embryonale Stammzelle ist.
8. Verfahren zur Erzeugung eines genetisch modifizierten Nagetiers nach Anspruch 1, das den Schritt des Ersetzens einer endogenen Nucleotidsequenz, die für ein endogenes reifes DR6-Protein voller Länge kodiert, durch eine Nucleinsäuresequenz, die für eine Transmembran-Domäne kodiert, die operabel an ein Reportergen gebunden ist, umfasst, wobei die Nucleinsäure mit einer endogenen DR6-Transkriptionsregulationssequenz und einer Signalpeptidsequenz operabel verbunden ist und wobei einem beliebigen Polypeptid, für das der endogene DR6-Locus kodiert, eine funktionelle zytoplasmatische DR6-Domäne fehlt.
9. Verfahren zur Erzeugung einer Population von Motoneuronen, die im Vergleich mit Kontrollmotoneuronenzellen eine erhöhte oxidative Belastung aufweisen, wobei das Verfahren das Bilden von Embryoidkörpern aus embryonalen Stammzellen der inneren Zellmasse, die aus einem Nagetier nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einem durch ein Verfahren nach Anspruch 8 erzeugten Nagetier isoliert wurden, und das Differenzieren der Embryoidkörper in die Population von Motoneuronen umfasst.
10. Verfahren zum Screenen eines möglichen Mittels zur Modulation einer Motoneuronendysfunktion, das Folgendes umfasst:

    (a) Verabreichen eines möglichen Mittels an ein Nagetier nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder an ein durch ein Verfahren nach Anspruch 8 erzeugtes Nagetier; und

    (b) Bestimmen von beliebigen Modulationswirkungen des möglichen Mittels auf zumindest ein Symptom der Motoneuronendysfunktion bei dem Nagetier im Vergleich zu einem Testkontrollnagetier;

    wobei die Gegenwart einer Modulationswirkung auf zumindest ein Symptom der Motoneuronendysfunktion bei dem Nagetier im Vergleich zu dem Testkontrollnagetier anzeigt, dass das mögliche Mittel zur Modulation einer Motoneuronendysfunktion von Nutzen ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei:

    (a) das Mittel vor der Detektion des Symptoms durch einen neurologischen ALS-TDI-Blind-Bewertungstest, einen Rotarod-Test, einen Catwalk-Test, einen Open-Field-Test, eine Gewichtsmessung oder das Bestimmen der Latenz als Reaktion auf einen schmerzhaften Stimulus verabreicht wird;

    (b) das Mittel nach der Detektion des Symptoms durch einen oder mehrere aus einem neurologischen ALS-TDI-Blind-Bewertungstest, einem Rotarod-Test, einem Catwalk-Test, einem Open-Field-Test, einer Gewichtsmessung oder dem Bestimmen der Latenz als Reaktion auf einen schmerzhaften Stimulus verabreicht wird;

    (c) das Mittel zu zwei oder mehr unterschiedlichen Zeitpunkten verabreicht wird;

    (d) das zumindest eine Symptom aus Kyphose, abnormem Verschränken der Hinterbeine, defizienter motorischer Koordination, defizienter motorischer Lernfähigkeit, Gewichtsverlust und defizienter Sinneswahrnehmung im Vergleich zu einem Kontrollnagetier ausgewählt ist, das einen zu dem Nagetier identischen Stamm aufweist, aber nicht die Nucleinsäure in seinem Genom umfasst;

    (e) das zumindest eine Symptom aus einer Dysfunktion der oberen Motoneuronen resultiert, wobei das zumindest eine Symptom vorzugsweise aus der aus Zittern, spastischer Paralyse (Steifheit), abnormen Reflexen und einer Kombination daraus bestehenden Gruppe ausgewählt ist;

    (f) das zumindest eine Symptom aus einer Dysfunktion der unteren Motoneuronen resultiert, wobei das zumindest eine Symptom vorzugsweise aus der aus Muskelschwäche und Muskelschwund, Faszikulationen und Kombinationen daraus bestehenden Gruppe ausgewählt ist;

    (g) das zumindest eine Symptom für Motoneuronendysfunktion eine verringerte Gewichtszunahme ist; und/oder

    (h) das zumindest eine Symptom für Motoneuronendysfunktion eine verminderte Nozizeption ist.
12. Verfahren zum Screenen eines möglichen Mittels zur Verringerung der oxidativen Belastung in einem Motoneuron, das Folgendes umfasst:

    (a) Kultivieren von Motoneuronen, die von einem Nagetier nach einem der Ansprüche 1 bis 6 stammen, in Gegenwart oder Abwesenheit eines Mittels;

    (b) Bestimmen, ob das Mittel die oxidative Belastung in den Motoneuronen im Vergleich zu Kontrollmotoneuronen, die von dem Nagetier stammen, aber in Abwesenheit des Mittels kultiviert wurden, verhindert, hemmt und/oder verringert; wobei die Prävention, Hemmung und/oder Verringerung der oxidativen Belastung in den Motoneuronen ein mögliches Mittel zur Verringerung der oxidativen Belastung in einem Motoneuron anzeigt.
13. Nucleinsäure, die Folgendes in einer operablen Bindung und von 5' zu 3' umfasst: eine erste Nucleinsäuresequenz, die für ein DR6-Signalpeptid kodiert, eine zweite Nucleinsäure, die für eine Transmembran-Domäne kodiert, und eine dritte Nucleinsäure, die für ein Reportergen kodiert, und gegebenenfalls eine vierte Nucleinsäure, die für eine Arzneimittelselektionskassette kodiert, wobei einem beliebigen Polypeptid, für das die Nucleinsäure kodiert, eine funktionelle zytoplasmatische DR6-Domäne fehlt.
14. Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 13,

    (a) wobei die erste Nucleinsäuresequenz als SEQ ID NO: 6 dargelegt ist, die zweite Nucleinsäuresequenz als SEQ ID NO: 7 dargelegt ist und die dritte Nucleinsäuresequenz als SEQ ID NO: 8 dargelegt ist und/oder die vierte Nucleinsäure als SEQ ID NO: 3 dargelegt ist; und/oder

    (b) die außerdem einen ersten Abzielarm und einen zweiten Abzielarm umfasst, wobei der erste Abzielarm 5' der ersten, zweiten und/oder dritten Nucleinsäuresequenz ist und mit diesen operabel verbunden ist, wobei der zweite Abzielarm 3' der ersten, zweiten und/oder dritten Nucleinsäuresequenz ist und mit diesen operabel verbunden ist und wobei der erste und der zweite Abzielarm zum Abzielen der Nucleinsäure zur Insertion in einen endogenen DR6-Locus eines nicht menschlichen Tiers dienen, der mit zumindest einem endogenen Regulationselement eines nicht menschlichen Tiers operabel verbunden ist.
15. Nucleinsäure nach Anspruch 14, wobei:

    (a) das nicht menschliche Tier ein Nagetier ist, wobei das Nagetier vorzugsweise eine Maus ist; und/oder

    (b) das Nagetier eine Maus ist und die Nucleinsäure eine Sequenz umfasst, die als SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 17 dargelegt ist.
16. Nagetierzelle, die eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 13 bis 15 umfasst.
17. Nagetierzelle nach Anspruch 16, wobei die Nagetierzelle eine embryonale Stammzelle ist.
18. Nagetierzelle nach Anspruch 16, wobei die Nagetierzelle ein Motoneuron ist.