HK1247961B - Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation - Google Patents

Claims (29)

1. Zusammensetzung, umfassend ein CRISPR-(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats)-System, wobei das CRISPR-System umfasst:

   - ein Cas9-Protein, umfassend eine oder mehrere Kernokalisierungssequenzen (NLS);

   - eine Führungssequenz, verknüpft mit einer tracr-Mate-Sequenz, und

   - eine tracr-Sequenz, die 30 oder mehr Nukleotide lang ist;

   wobei die Führungssequenz sequenzspezifische Bindung eines CRISPR-Komplexes an eine Zielsequenz in einer eukaryotischen Zelle lenkt.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Führungssequenz, tracr-Mate- und tracr-Sequenz innerhalb einer chimären RNA umfasst sind.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Cas9 Spaltung eines oder zweier Stränge am Ort der Zielsequenz lenkt.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das Cas9 in Bezug auf ein entsprechendes Wildtyp-Enzym so mutiert ist, dass dem mutierten Cas9 die Fähigkeit fehlt, einen oder beide Stränge eines Ziel-Polynukleotids, das eine Zielsequenz enthält, zu spalten.
5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Cas9 eine Mutation umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus D10A, H840A, N854A und N863A, in Bezug auf die Positionsnummerierung eines Streptococcus pyogenes Cas9-(SpCas9-)Proteins.
6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Cas9 eine oder mehrere NLS am Amino-Terminus umfasst, oder eine oder mehrere NLS am Carboxy-Terminus, oder eine Kombination von diesen.
7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Cas9-Zusammensetzung mindestens zwei NLS umfasst.
8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Cas9 S. pyogenes oder S. thermophilus Cas9 ist.
9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die tracr-Sequenz 50 oder mehr Nukleotide lang ist.
10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die tracr-Sequenz eine Wildtyp-tracr-Sequenz umfasst.
11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Cas9 eine oder mehrere heterologe Proteindomänen einschließt.
12. CRISPR-(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats) Cas-(CRISPR-assoziiertes) (CRISPR-Cas-)Vektorsystem, umfassend einen oder mehrere Vektoren, umfassend:

    a) ein erstes regulatorisches Element, funktionell verknüpft mit einem oder mehreren Elementen eines Typ-II-CRISPR-Systems, umfassend Sequenzen, codierend:

    1) eine Führungssequenz, verknüpft mit einer tracr-Mate-Sequenz,

    2) eine tracr-Sequenz,

    b) ein zweites regulatorisches Element, funktionell verknüpft mit einer proteincodierenden Sequenz, codierend ein Cas9-Protein, umfassend eine oder mehrere Kernlokalisierungssequenzen (NLS);

    wobei sich Komponenten (a) und (b) auf dem gleichen oder auf verschiedenen Vektoren des Systems befinden, und wobei Hybridisierung zwischen einer Zielsequenz und einer Führungssequenz die Bildung eines CRISPR-Komplexes in einer eukaryotischen Zelle fördert.
13. Vektorsystem nach Anspruch 12, wobei sich Komponenten (a) und (b) auf dem gleichen Vektor befinden.
14. Vektorsystem nach einem der Ansprüche 12 oder 13, wobei das Cas9-Protein mindestens zwei NLS umfasst.
15. Vektorsystem nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die tracr-Sequenz 30 oder mehr Nukleotide lang ist, wahlweise die tracr-Sequenz 50 oder mehr Nukleotide lang ist.
16. Vektorsystem nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die tracr-Sequenz und die tracr-Mate-Sequenz innerhalb eines einzigen Transkripts enthalten sind, so dass Hybridisierung zwischen den beiden eine sekundäre Struktur hervorbringt, die eine Haarnadel ist.
17. Vektorsystem nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei das Vektorsystem zwei oder mehr Führungssequenzen codiert, wobei, wenn exprimiert, jede der zwei oder mehr Führungssequenzen sequenzspezifische Bindung eines CRISPR-Komplexes an eine andere Zielsequenz in einer eukaryotischen Zelle lenkt.
18. Vektorsystem nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei der Vektor ein viraler Vektor ist.
19. Vektorsystem nach Anspruch 18, wobei der virale Vektor ein Retrovirus-, Lentivirus-, Adenovirus-, Adeno-assoziiertes-Virus- oder Herpes-simplex-Virus-Vektor ist.
20. Vektorsystem nach einem der Ansprüche 12 bis 19, umfassend einen oder mehrere Pol-III-Promoter.
21. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder Vektorsystem nach einem der Ansprüche 12 bis 20, zur Verwendung in der Therapie.
22. Zusammensetzung oder Vektorsystem zur Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Therapie Gentherapie ist.
23. Zusammensetzung oder Vektorsystem nach Anspruch 22, zur Verwendung beim Modifizieren eines Ziel-Polynukleotids in einer eukaryotischen Zelle, wobei das Verfahren Bindenlassen eines CRISPR-Komplexes an das Ziel-Polynukleotid umfasst, um Spaltung des Ziel-Polynukleotids zu bewirken, wodurch das Ziel-Polynukleotid modifiziert wird.
24. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder des Vektorsystems nach einem der Ansprüche 12 bis 20, in der Produktion eines genetisch modifizierten nichtmenschlichen Tieres, mit der Maßgabe, dass die Verwendung kein Verfahren zur Behandlung des Tierkörpers durch Therapie ist.
25. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder des Vektorsystems nach einem der Ansprüche 12 bis 20, in der Produktion eines nichtmenschlichen transgenen Tieres oder einer transgenen Pflanze.
26. Verfahren zum Modifizieren eines Ziel-Polynukleotids in einer eukaryotischen Zelle, wobei das Verfahren Ermöglichen umfasst, dass ein CRISPR-Komplex das Ziel-Polynukleotid bindet, um Spaltung des Ziel-Polynukleotids zu bewirken, wodurch das Ziel-Polynukleotid modifiziert wird, wobei der CRISPR-Komplex ein Cas9-Protein mit einer oder mehreren Kernlokalisierungssequenzen (NLS) umfasst, komplexiert mit einer Führungssequenz, hybridisiert an eine Zielsequenz innerhalb des Ziel-Polynukleotids, wobei die Führungssequenz mit einer tracr-Mate-Sequenz verknüpft ist, die wiederum an eine tracr-Sequenz hybridisiert, die 30 oder mehr Nukleotide lang ist, wobei das Verfahren kein Verfahren zur Behandlung durch Therapie des menschlichen oder tierischen Körpers ist, und wobei das Verfahren kein Prozess zum Modifizieren der genetischen Identität der Keimbahn von Menschen ist.
27. Eukaryotische Wirtszelle, umfassend den einen oder die mehreren Vektoren des Vektorsystems nach einem der Ansprüche 12 bis 20.
28. Ex-vivo- oder In-vitro-Verfahren zum Modifizieren eines Ziel-Polynukleotids in einer eukaryotischen Zelle, wobei das Verfahren Bindenlassen eines CRISPR-Komplexes an das Ziel-Polynukleotid umfasst, um Spaltung des Ziel-Polynukleotids zu bewirken, wodurch das Ziel-Polynukleotid modifiziert wird, wobei der CRISPR-Komplex ein Cas9-Protein mit einer oder mehreren Kernlokalisierungssequenzen (NLS) umfasst, komplexiert mit einer Führungssequenz, hybridisiert an eine Zielsequenz innerhalb des Ziel-Polynukleotids, wobei die Führungssequenz mit einer tracr-Mate-Sequenz verknüpft ist, die wiederum an eine tracr-Sequenz hybridisiert, die 30 oder mehr Nukleotide lang ist, wobei das Verfahren kein Prozess zum Modifizieren der genetischen Identität der Keimbahn von Menschen ist.
29. CRISPR-Komplex zur Verwendung beim Modifizieren eines Ziel-Polynukleotids in einer eukaryotischen Zelle in einem Verfahren zur Gentherapie, wobei das Verfahren Bindenlassen eines CRISPR-Komplexes an das Ziel-Polynukleotid umfasst, um Spaltung des Ziel-Polynukleotids zu bewirken, wodurch das Ziel-Polynukleotid modifiziert wird, wobei der CRISPR-Komplex ein Cas9-Protein mit einer oder mehreren Kernlokalisierungssequenzen (NLS) umfasst, komplexiert mit einer Führungssequenz, hybridisiert an eine Zielsequenz innerhalb des Ziel-Polynukleotids, wobei die Führungssequenz mit einer tracr-Mate-Sequenz verknüpft ist, die wiederum an eine tracr-Sequenz hybridisiert, die 30 oder mehr Nukleotide lang ist.