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HK1115632B - Methods for the identification of zap-70 interacting molecules and for the purification of zap-70 - Google Patents

Methods for the identification of zap-70 interacting molecules and for the purification of zap-70 Download PDF

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Publication number
HK1115632B
HK1115632B HK08105785.0A HK08105785A HK1115632B HK 1115632 B HK1115632 B HK 1115632B HK 08105785 A HK08105785 A HK 08105785A HK 1115632 B HK1115632 B HK 1115632B
Authority
HK
Hong Kong
Prior art keywords
zap
naphthyridin
phenylamino
aminomethyl
methyl
Prior art date
Application number
HK08105785.0A
Other languages
English (en)
French (fr)
Chinese (zh)
Other versions
HK1115632A1 (en
Inventor
Ulrich Kruse
Nigel Ramsden
Gerard Drewes
Dirk Eberhard
Original Assignee
Cellzome Ag
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP06011409A external-priority patent/EP1862802B1/de
Application filed by Cellzome Ag filed Critical Cellzome Ag
Publication of HK1115632A1 publication Critical patent/HK1115632A1/en
Publication of HK1115632B publication Critical patent/HK1115632B/en

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Claims (25)

  1. Verfahren für die Identifizierung einer ZAP-70-interagierenden Verbindung, umfassend die Schritte
    a) Bereitstellen einer Proteinzubereitung enthaltend phosphoryliertes ZAP-70,
    b) Inkontaktbringen der Proteinzubereitung mit 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on, immobilisiert auf einem festen Träger unter Bedingungen, die die Bildung eines 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on - phosphorylierten ZAP-70 Komplexes erlauben,
    c) Inkubieren des 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on - phosphorylierten ZAP-70 Komplexes mit einer gegebenen Verbindung, und
    d) Bestimmen, ob die Verbindung in der Lage ist, phosphoryliertes ZAP-70 von dem immoblisierten 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on abzutrennen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt d) die Detektion von abgetrenntem, phosphoryliertem ZAP-70 oder die Bestimmung der Menge an abgetrenntem, phosphoryliertem ZAP-70 einschließt.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei abgetrenntes, phosphoryliertes ZAP-70 detektiert oder die Menge an abgetrenntem, phosporyliertem ZAP-70 durch Massenspektrometrie oder Immundetektionsverfahren bestimmt wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei abgetrenntes, phosphoryliertes ZAP-70 mit einem Antikörper, der gegen phosphoryliertes ZAP-70 gerichtet ist, detektiert wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei abgetrenntes, phosphoryliertes ZAP-70 mit einem Antikörper, der eine Phosphorylierung an Position 493 des phosphorylierten ZAP-70 erkennt, detektiert wird.
  6. Verfahren für die Identifizierung einer ZAP-70-interagierenden Verbindung, umfassend die Schritte
    a) Bereitstellen einer Proteinzubereitung enthaltend phosphoryliertes ZAP-70,
    b) Inkontaktbringen der Proteinzubereitung mit 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on, immobilisiert auf einem festen Träger und mit einer gegebenen Verbindung unter Bedingungen, die die Bildung eines 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on-phosphorylierten ZAP-70 Komplexes erlauben, und
    c) Detektieren des in Schritt b) gebildeten 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on - phosphorylierten ZAP-70 Komplexes.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei in Schritt c) das Detektieren durch Bestimmen der Menge des 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on - phosphorylierten ZAP-70 Komplexes durchgeführt wird.
  8. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 6 oder 7, wobei die Schritte a) bis c) mit mehreren Proteinzubereitungen durchgeführt werden, um unterschiedliche Verbindungen zu testen.
  9. Verfahren für die Identifizierung einer ZAP-70-interagierenden Verbindung, umfassend die Schritte
    a) Bereitstellen zweier Aliquots einer Proteinzubereitung enthaltend phosphoryliertes ZAP-70,
    b) Inkontaktbringen eines Aliquots mit 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on, immobilisiert auf einem festen Träger unter Bedingungen, die die Bildung eines 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on- phosphorylierten ZAP-70 Komplexes erlauben,
    c) Inkontaktbringen des anderen Aliquots mit 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on, immobilisiert auf einem festen Träger und mit einer gegebenen Verbindung unter Bedingungen, die die Bildung eines 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on-phosphorylierten ZAP-70 Komplexes erlauben, und
    d) Bestimmen der Menge des in den Schritten b) und c) gebildeten 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on - phosphorylierten ZAP-70 Komplexes.
  10. Verfahren für die Identifizierung einer ZAP-70-interagierenden Verbindung, umfassend die Schritte:
    a) Bereitstellen zweier Aliquots, von denen jedes mindestens eine Zelle umfasst, die phosphoryliertes ZAP-70 enthält,
    b) Inkubieren eines Aliquots mit einer gegebenen Verbindung,
    c) Ernten der Zellen eines jeden Aliquots,
    d) Lysieren der Zellen, um Proteinzubereitungen zu erhalten,
    e) Inkontaktbringen der Proteinzubereitungen mit 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on, immobilisiert auf einem festen Träger unter Bedingungen, die die Bildung eines 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on - phosphorylierten ZAP-70 Komplexes erlauben, und
    f) Bestimmen der Menge des in Schritt e) in jedem Aliquot gebildeten 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on - phosphorylierten ZAP-70 Komplexes.
  11. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 9 oder 10, wobei eine reduzierte Menge des 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on- phosphorylierten ZAP-70 Komplexes, die sich in dem mit der Verbindung inkubierten Aliquot im Vergleich zu dem mit der Verbindung nicht inkubierten Aliquot gebildet hat, darauf hinweist, dass ZAP-70 ein Ziel dieser Verbindung ist.
  12. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 7 bis 11, wobei die Menge des 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on - phosphorylierten ZAP-70 Komplexes durch Abtrennen des phosphorylierten ZAP-70 von dem immobilisierten 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on und anschließender Detektion des abgetrennten, phosphorylierten ZAP-70 oder anschließender Bestimmung der Menge des abgetrennten, phosphorylierten ZAP-70 bestimmt wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei phosphoryliertes ZAP-70 detektiert wird, oder die Menge an ZAP-70 durch Massenspektometrie oder Immundetektionsverfahren, vorzugsweise mit einem Antikörper, der gegen phosphoryliertes ZAP-70 gerichtet, vorzugsweise mit einem Antikörper, der eine Phosphorylierung an Position 493 des phosphorylierten ZAP-70 erkennt, bestimmt wird.
  14. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 13, durchgeführt als ein Mittel- oder Hochdurchsatzauswahlverfahren.
  15. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus synthetischen Verbindungen oder organisch synthetischen Wirkstoffen, besonders bevorzugt niedermolekularen organischen Wirkstoffen und natürlichen, niedermolekularen Verbindungen.
  16. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15, wobei die ZAP-70-interagierende Verbindung ein ZAP-70-Inhibitor ist.
  17. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 16, wobei der feste Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Agarose, modifizierter Agarose, Sepharose-Beads (z.B. NHS-aktivierte Sepharose), Latex, Cellulose und Ferro- oder ferrimagnetischen Partikeln.
  18. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 17, wobei das 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on kovalent an den festen Träger gekoppelt wird.
  19. Verfahren für die Reinigung von phosphoryliertem ZAP-70, umfassend die Schritte
    a) Bereitstellen einer Proteinzubereitung enthaltend phosphoryliertes ZAP-70,
    b) Inkontaktbringen der Proteinzubereitung mit 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on, immobilisiert auf einem festen Träger unter Bedingungen, die die Bildung eines 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on - phosphorylierten ZAP-70 Komplexes erlauben, und
    c) Abtrennen des phosphorylierten ZAP-70 von dem immobilisierten 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, des Weiteren umfassend nach Schritt c) die Identifizierung von Proteinen, die in der Lage sind, an phosphoryliertes ZAP-70 zu binden.
  21. Verfahren nach Anspruch 19, des Weiteren umfassend nach Schritt c) die Bestimmung von post-translationalen Modifikationen von phosphoryliertem ZAP-70.
  22. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 19 bis 21, wobei nach Schritt c) entweder das phosphorylierte ZAP-70 und/oder die Proteine, die in der Lage sind, an phosphoryliertes ZAP-70 zu binden, durch Massenspektometrie oder Immundetektionsverfahren charakterisiert werden.
  23. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Bereitstellung einer Proteinzubereitung die Schritte des Emtens mindestens einer Zelle, die phosphoryliertes ZAP-70 enthält, und Lysieren der Zelle einschließt.
  24. Verwendung des 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on für die Identifizierung von ZAP-70-interagierenden Verbindungen in vitro.
  25. Verwendung des 7-(4-Aminomethylphenylamino)-3-(2,6-dichlorphenyl)-1-methyl-1H-[1,6]naphthyridin-2-on für die Reinigung von phosphoryliertem ZAP-70.
HK08105785.0A 2008-05-23 Methods for the identification of zap-70 interacting molecules and for the purification of zap-70 HK1115632B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06011409A EP1862802B1 (de) 2006-06-01 2006-06-01 Verfahren zur Identifizierung von mit ZAP-70 wechselwirkenden Molekülen und zur ZAP-70-Reinigung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HK1115632A1 HK1115632A1 (en) 2008-12-05
HK1115632B true HK1115632B (en) 2009-07-10

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