HK1192761B - T细胞活化性双特异性抗原结合分子 - Google Patents

Description

T细胞活化性双特异性抗原结合分子

发明领域

本发明一般涉及用于活化T细胞的双特异性抗原结合分子。另外，本发明涉及编码这类双特异性抗原结合分子的多核苷酸，以及包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明双特异性抗原结合分子的方法，以及在疾病治疗中使用这些双特异性抗原结合分子的方法。

发明背景

在多种临床背景中经常期望选择性破坏个别细胞或特定细胞类型。例如，特异性破坏肿瘤细胞而使健康细胞和组织保持完整且未受损是癌症治疗的首要目的。

实现这点的一种有吸引力的方式是通过诱导针对肿瘤的免疫应答，使得免疫效应细胞如天然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击并破坏肿瘤细胞。CTL构成免疫系统最有力的效应细胞，然而它们不能通过由常规治疗性抗体的Fc域介导的效应器机制来激活。

在此方面，双特异性抗体在最近数年已变得感兴趣，其设计为用一个“臂”结合靶细胞上的表面抗原，而用第二个“臂”结合T细胞受体(TCR)复合物的活化性、不变的组分。这类抗体对其两种靶物的同时结合将迫使靶细胞与T细胞之间的暂时相互作用，从而导致任何细胞毒性T细胞的活化和靶细胞的随后裂解。因此，免疫应答被重定向(re-direction)于靶细胞，且并不依赖于靶细胞的肽抗原呈递或T细胞的特异性，如对于CTL的正常MHC限制性激活会相关的。在此背景中，CTL仅在靶细胞向其呈递双特异性抗体时被激活，即模拟免疫突触是至关重要的。特别期望的是不需要淋巴细胞预条件化或共刺激以引发靶细胞的有效裂解的双特异性抗体。

已开发出数种双特异性抗体形式并研究了其对研究的T细胞介导的免疫疗法的适宜性。其中，已非常好地表征了所谓的BiTE(双特异性T细胞衔接物(engager))分子，而且其在临床中已显示出一些前景(综述于Nagorsen和Exp Cell Res317,1255-1260(2011))。BiTE是串联scFv分子，其中两个scFv分子通过柔性接头融合。针对T细胞衔接评估的其他双特异性形式包括双抗体(Holliger等,Prot Eng9,299-305(1996))及其衍生物，如串联双抗体(Kipriyanov等,J Mol Biol293,41-66(1999))。一项最近的进展是所谓的DART(双重亲和力重新靶向)分子，其基于双抗体形式但特征在于实现额外的稳定化的C端二硫桥(Moore等,Blood117,4542-51(2011))。所谓的triomab(其为完整杂合小鼠/大鼠IgG分子且目前亦在临床试验中评估)代表了尺寸更大的形式(综述于Seimetz等,Cancer TreatRev36,458-467(2010))。

正在开发的多种形式显示免疫疗法中归因于T细胞重定向和活化的极大潜力。然而，生成对此合适的双特异性抗体的任务绝不是微不足道的，而是牵涉到许多必须满足的与抗体功效、毒性、适用性和生产能力有关的挑战。

小构建体如例如BiTE分子(尽管能够有效交联效应器和靶细胞)具有非常短的血清半衰期，从而需要通过连续输注对患者施用它们。在另一方面，IgG样形式(尽管具有长半衰期的极大益处)受制于与IgG分子固有的天然效应器功能有关的毒性。它们的免疫原性潜力构成了成功治疗性开发的IgG样双特异性抗体(特别是非人形式)的另一个不利特征。最后，双特异性抗体的一般开发中的一项主要挑战是以临床充足的量和纯度生产双特异性抗体构建体，这是由于具有不同特异性的抗体重链和轻链在共表达后的错配所致，其降低了正确装配的构建体的产率且导致许多无功能的副产物，而期望的双特异性抗体可能难以与之分离。

鉴于与目前可获得的双特异性抗体有关的关于T细胞介导的免疫疗法的难点和缺点，仍然存在对这类分子的新的改进形式的需要。本发明提供设计用于T细胞活化和重定向的双特异性抗原结合分子，其组合了良好的功效和生产能力与较低毒性和有利的药动学特性。

发明概述

在第一方面，本发明提供了一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含第一和第二抗原结合模块以及由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，所述抗原结合模块中一种是能够特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子，所述抗原结合模块中另一种是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子；其中所述第一抗原结合模块是(a)单链Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链由肽接头连接，或(b)交换(crossover)Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区是交换的。

在一个具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子中存在不超过一个能够特异性结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块(即T细胞活化性双特异性抗原结合分子提供对活化性T细胞抗原的单价结合)。在具体的实施方案中，第一抗原结合模块是交换Fab分子。在甚至更具体的实施方案中，第一抗原结合模块是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的恒定区是交换的。

在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的第一和第二抗原结合模块彼此融合，任选地经由肽接头融合。在一个这类实施方案中，第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端。在另一个这类实施方案中，第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端。在又一个这类实施方案中，第二抗原结合模块在Fab轻链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab轻链的N端。在其中第一抗原结合模块是交换Fab分子且其中(i)第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端或(ii)第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端的实施方案中，另外，第一抗原结合模块的Fab轻链和第二抗原结合模块的Fab轻链可以彼此融合，任选地经由肽接头融合。

在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。在另一个实施方案中，第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fc域的第一或第二亚基的N端。

在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的第一和第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至所述Fc域的亚基之一的N端。

在某些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含第三抗原结合模块，其为能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子。在一个这类实施方案中，所述第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个具体的实施方案中，所述活化性T细胞抗原结合分子的第二和第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至所述Fc域的亚基之一的N端，且所述第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述第二抗原结合模块的Fab重链的N端。在另一个具体的实施方案中，所述活化性T细胞抗原结合分子的第一和第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至所述Fc域的亚基之一的N端，且所述第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述第一抗原结合模块的Fab重链的N端。所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分可直接融合或经由合适的肽接头融合。在一个实施方案中，所述第二和第三抗原结合模块和Fc域是免疫球蛋白分子的一部分。在一个具体的实施方案中，所述免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更具体的实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG₁亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG₄亚类免疫球蛋白。

在一个具体的实施方案中，Fc域是IgG Fc域。在一个特定的实施方案中，所述Fc域是IgG₁Fc域。在另一个特定的实施方案中，所述Fc域是IgG₄Fc域。在一个甚至更特定的实施方案中，所述Fc域是IgG₄Fc域，其包含氨基酸取代S228P(Kabat编号)。在具体的实施方案中，所述Fc域是人Fc域。

在具体的实施方案中，所述Fc域包含促进第一和第二Fc域亚基联合的修饰。在一个特定的这类实施方案中，在所述Fc域的第一亚基的CH3域中，氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在所述第一亚基的CH3域内生成隆起，其可安置于所述第二亚基的CH3域内的空穴中，而且在所述Fc域的第二亚基的CH3域中，氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在所述第二亚基的CH3域内生成空穴，其中可安置所述第一亚基的CH3域内的隆起。

在一个具体的实施方案中，相比于天然IgG1Fc域，所述Fc域展现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在某些实施方案中，相比于非工程化Fc域，所述Fc域被工程化为具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个实施方案中，所述Fc域包含一处或多处氨基酸取代，其降低对Fc受体的结合和/或效应器功能。在一个实施方案中，所述Fc域中一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸取代在选自下组的一个或多个位置处：L234、L235和P329(Kabat编号方式)。在具体的实施方案中，所述Fc域的每个亚基包含三处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为L234A、L235A和P329G。在一个这类实施方案中，所述Fc域是IgG₁Fc域，具体为人IgG₁Fc域。在其他实施方案中，所述Fc域的每个亚基包含两处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为L235E和P329G。在一个这类实施方案中，所述Fc域是IgG₄Fc域，具体是人IgG₄Fc域。

在一个实施方案中，所述Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中，所述Fc受体是人FcγRIIa、FcγRI和/或FcγRIIIa。在一个实施方案中，所述效应器功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

在一个具体的实施方案中，双特异性抗原结合分子能够结合的活化性T细胞抗原是CD3。在其他实施方案中，双特异性抗原结合分子能够结合的靶细胞抗原是肿瘤细胞抗原。在一个实施方案中，所述靶细胞抗原选自下组：黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CD19、CD20和CD33。

依照本发明的另一个方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段。本发明还涵盖由本发明多核苷酸编码的多肽。本发明还提供包含本发明的分离的多核苷酸的表达载体，以及包含本发明的分离的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞，具体为哺乳动物细胞。

在另一个方面，提供一种生成本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，其包括以下步骤：a)在适合于表达所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞和b)回收所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子。本发明还涵盖由本发明的方法生成的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。

本发明进一步提供一种药物组合物，其包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和药学可接受载体。

本发明还涵盖使用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和药物组合物的方法。在一个方面，本发明提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或药物组合物，其用作药物。在一个方面，提供依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或药物组合物，其用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个特定的实施方案中，所述疾病是癌症。

还提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在制备用于治疗有此需要的个体中疾病的药物的用途；以及一种治疗个体中疾病的方法，包括对所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药学可接受形式的依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个特定的实施方案中，所述疾病是癌症。在任一个上文实施方案中，个体优选为哺乳动物，特别是人。

本发明还提供用于诱导靶细胞特别是肿瘤细胞裂解的方法，其包括在存在T细胞(特别是细胞毒性T细胞)的情况下使靶细胞与本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子接触。

附图简述

图1。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的例示性构造。(A)“1+1IgGscFab，1个臂”和(B)“1+1IgG scFab，1个臂倒转”分子的示图。在“1+1IgG scFab，1个臂”分子中，T细胞靶向性Fab的轻链通过接头融合至重链，而“1+1IgG scFab，1个臂倒转”分子具有在肿瘤靶向性Fab中的接头。(C)“2+1IgG scFab”分子的示图。(D)“1+1IgG scFab”分子的示图。(E)“1+1IgG Crossfab”分子的示图。(F)“2+1IgG Crossfab”分子的示图。(G)“2+1IgGCrossfab”分子的示图，其具有Crossfab和Fab组分(“倒转”)的交替(alternative)次序。(H)“1+1IgG Crossfab轻链(LC)融合”分子的示图。(I)“1+1CrossMab”分子的示图。(J)“2+1IgG Crossfab，连接的轻链”分子的示图。(K)“1+1IgG Crossfab，连接的轻链”分子的示图。(L)“2+1IgGCrossfab，倒转、连接的轻链”分子的示图。(M)“1+1IgG Crossfab，倒转、连接的轻链”分子的示图。黑点：Fc域中促进异二聚化的任选修饰。

图2。“1+1IgG scFab，1个臂”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO1,3,5)，非还原性(A)和还原性(B)，以及“1+1IgG scFab，1个臂倒转”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO7,9,11)，非还原性(C)和还原性(D)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。

图3。“1+1IgG scFab，1个臂”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO1,3,5)(A)和“1+1IgG scFab，1个臂倒转”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO7,9,11)(B)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare;2mMMOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl；注射50μg样品)。

图4。“1+1IgG scFab，1个臂”(抗EGFR/抗huCD3)(见SEQ ID NO43,45,57)，非还原性(A)和还原性(B)，以及“1+1IgG scFab，1个臂倒转”(抗EGFR/抗huCD3)(见SEQ ID NO11,49,51)，非还原性(C)和还原性(D)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。

图5。“1+1IgG scFab，1个臂”(抗EGFR/抗huCD3)(见SEQ ID NO43,45,47)(A)和“1+1IgG scFab，1个臂倒转”(抗EGFR/抗huCD3)(见SEQ ID NO11,49,51)(B)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare;2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl；注射50μg样品)。

图6。(A,B)“1+1IgG scFab，1个臂倒转”(抗FAP/抗huCD3)(见SEQ ID NO11,51,55)，非还原性(A)和还原性(B)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。(C)“1+1IgG scFab，1个臂倒转”(抗FAP/抗huCD3)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare;2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl；注射50μg样品)。

图7。(A)“2+1IgG scFab,P329G LALA”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO5,21,23)，非还原性(第2道)和还原性(第3道)；(B)“2+1IgG scFab，LALA”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQID NO5,17,19)，非还原性(第2道)和还原性(第3道)；(C)“2+1IgG scFab,wt”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO5,13,15)，非还原性(第2道)和还原性(第3道)；以及(D)“2+1IgGscFab,P329G LALA N297D”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO5,25,27)，非还原性(第2道)和还原性(第3道)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。

图8。(A)“2+1IgG scFab,P329G LALA”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO5,21,23)；(B)“2+1IgG scFab，LALA”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO5,17,19)；(C)“2+1IgG scFab,wt”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO5,13,15)；(D)“2+1IgG scFab,P329G LALA N297D”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO5,25,27)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GEHealthcare;2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl；注射50μg样品)。

图9。(A,B)“2+1IgG scFab,P329G LALA”(抗EGFR/抗huCD3)(见SEQ ID NO45,47,53)，非还原性(A)和还原性(B)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。(C)“2+1IgG scFab,P329G LALA”(抗EGFR/抗huCD3)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare;2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl；注射50μg样品)。

图10。(A,B)“2+1IgG scFab,P329G LALA”(抗FAP/抗huCD3)(见SEQ ID NO57,59,61)，非还原性(A)和还原性(B)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。(C)“2+1IgG scFab,P329G LALA”(抗FAP/抗huCD3)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare;2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl；注射50μg样品)。

图11。(A,B)“1+1IgG Crossfab,Fc(孔)P329G LALA/Fc(突出)wt”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO5,29,31,33)，非还原性(A)和还原性(B)的SDS PAGE(4-12%Tris-乙酸盐(A)或4-12%Bis/Tris(B)，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。(C)“1+1IgG Crossfab,Fc(孔)P329G LALA/Fc(突出)wt”(抗MCSP/抗huCD3)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GEHealthcare;2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl；注射50μg样品)。

图12。(A,B)“2+1IgG Crossfab”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO3,5,29,33)，非还原性(A)和还原性(B)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯蓝染色)。(C)“2+1IgG Crossfab”(抗MCSP/抗huCD3)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GLGE Healthcare;2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl；注射50μg样品)。

图13。(A,B)“2+1IgG Crossfab”(抗MCSP/抗cyCD3)(见SEQ ID NO3,5,35,37)，非还原性(A)和还原性(B)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris，NuPageInvitrogen，考马斯染色)。(C)“2+1IgG Crossfab”(抗MCSP/抗cyCD3)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GEHealthcare;2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl；注射50μg样品)。

图14。(A,B)“2+1IgG Crossfab，倒转的”(抗CEA/抗huCD3)(见SEQ IDNO33,63,65,67)，非还原性(A)和还原性(B)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。(C)“2+1IgG Crossfab，倒转的”(抗CEA/抗huCD3)的分析性大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare;2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl；注射50μg样品)。

图15。(A)“(scFv)₂-Fc”和“(dsscFv)₂-Fc”(抗MCSP(LC007)/抗huCD3(V9))的热稳定性。动态光散射，其在25-75℃以0.05℃/min爬升的温度中测量。黑色曲线：“(scFv)₂-Fc”；灰色曲线：“(dsscFv)₂-Fc”。(B)“2+1IgG scFab”(见SEQID NO5,21,23)和“2+1IgGCrossfab”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO3,5,29,33)的热稳定性。动态光散射，其在25-75℃以0.05℃/min爬升的温度中测量。黑色曲线：“2+1IgG scFab”；灰色曲线：“2+1IgGCrossfab”。

图16。用于(A)测定各种Fc突变体与人FcγRIIIa的相互作用，以及用于(B)T细胞双特异性构建体与肿瘤靶物和人CD3γ(G₄S)₅CD3ε-AcTev-Fc(突出)-Avi/Fc(孔)的同时结合的Biacore测定设置。

图17。T细胞双特异性构建体对人MCSP的D3域和人CD3γ(G₄S)₅CD3ε-AcTev-Fc(突出)-Avi/Fc(孔)的同时结合。(A)“2+1IgGCrossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)，(B)“2+1IgGscFab”(见SEQ ID NO5,21,23)。

图18。T细胞双特异性构建体对人EGFR和人CD3γ(G₄S)₅CD3ε-AcTev-Fc(突出)-Avi/Fc(孔)的同时结合。(A)“2+1IgGscFab”(见SEQ ID NO45,47,53),(B)“1+1IgG scFab，1个臂”(见SEQ ID NO 43,45,47),(C)“1+1IgG scFab，1个臂倒转”(见SEQ ID NO11,49,51)，和(D)“1+1IgG scFab”(见SEQ ID NO47,53,213)。

图19。通过FACS测量的“(scFv)₂”分子(50nM)对Jurkat细胞上表达的CD3(A)或Colo-38细胞上的MCSP(B)的结合。绘出了相比于未处理细胞和仅用二抗染色的细胞的均值荧光强度。

图20。通过FACS测量的“2+1IgG scFab，LALA”(见SEQ ID NO5,17,19)构建体(50nM)对Jurkat细胞上表达的CD3(A)或Colo-38细胞上的MCSP(B)的结合。绘出了相比于用参照抗CD3IgG(如指示的)处理的细胞、未处理细胞和仅用二抗染色的细胞的均值荧光强度。

图21。通过FACS测量的“1+1IgG scFab，1个臂”(见SEQ ID NO1,3,5)和“1+1IgGscFab，1个臂倒转”(见SEQ ID NO7,9,11)构建体(50nM)对Jurkat细胞上表达的CD3(A)或Colo-38细胞上的MCSP(B)的结合。绘出了相比于用参照抗CD3或抗MCSP IgG(如指示的)处理的细胞、未处理细胞和仅用二抗染色的细胞的均值荧光强度。

图22。“2+1IgG scFab，LALA”(见SEQ ID NO5,17,19)双特异性构建体和相应的抗MCSP IgG对Colo-38细胞上MCSP的剂量依赖性结合，如通过FACS测量的。

图23。在存在或缺乏Colo-38肿瘤靶细胞(如指示的(PBMC与肿瘤细胞的E:T比率=10:1))的情况下在与1nM“2+1IgG scFab，LALA”(见SEQ ID NO5,17,19)或“(scFv)₂”CD3-MCSP双特异性构建体温育后，人T细胞上不同活化标志物的表面表达水平。绘出的是分别在15或24小时温育后，CD8⁺T细胞上早期活化标志物CD69(A)或后期活化标志物CD25(B)的表达水平。

图24。在存在或缺乏Colo-38肿瘤靶细胞(如指示的(E:T比率=5:1))的情况下在与1nM“2+1IgG scFab，LALA”(见SEQ ID NO5,17,19)或“(scFv)₂”CD3-MCSP双特异性构建体温育后，人T细胞上后期活化标志物CD25的表面表达水平。绘出的是在5天温育后，CD8⁺T细胞(A)或CD4⁺T细胞(B)上后期活化标志物CD25的表达水平。

图25。在存在或缺乏人MCSP表达MV-3肿瘤靶细胞(E:T比率=3:1)的情况下在与指定浓度的“2+1IgG Crossfab”双特异性构建体(靶向猕猴CD3和人MCSP；见SEQ ID NO3,5,35,37)温育43小时后，来自两只不同动物(cyno Nestor，cyno Nobu)的猕猴CD8⁺T细胞上后期活化标志物CD25的表面表达水平。作为对照，使用参照IgG(抗猕猴CD3IgG、抗人MCSPIgG)或非生理(unphysiologic)刺激物PHA-M。

图26。由人泛T细胞分泌的IFN-γ水平，所述人泛T细胞在U87MG肿瘤细胞(E:T比率=5:1)的存在下通过“2+1IgG scFab，LALA”CD3-MCSP双特异性构建体(见SEQ ID NO5,17,19)活化18.5小时。作为对照，施用相应的抗CD3和抗MCSP IgG。

图27。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养并通过不同浓度的“2+1IgGscFab”(见SEQ ID NO5,21,23)、“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)和“(scFv)₂”双特异性分子和相应IgG活化20小时后对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图28。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养并通过不同浓度的双特异性构建体和相应IgG活化20小时后对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。比较其Fc域有所不同(具有野生型Fc域(见SEQ ID NO5,13,15)，或经过突变以消除(NK)效应细胞功能的Fc域：P329G LALA(见SEQ ID NO5,21,23)、P329G LALA N297D(见SEQ ID NO5,25,27))的“2+1IgG scFab”构建体和“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)构建体。

图29。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，用CD3-MCSP双特异性“2+1IgGscFab，LALA”(见SEQ ID NO5,17,19)构建体、“(scFv)₂”分子或相应IgG 处理18.5小时后对Colo-38肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图30。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，用CD3-MCSP双特异性“2+1IgGscFab，LALA”(见SEQ ID NO5,17,19)构建体、“(scFv)₂”分子或相应IgG 处理18小时后对Colo-38肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图31。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，并通过不同浓度的CD3-MCSP双特异性“2+1IgG scFab，LALA”(见SEQ ID NO5,17,19)构建体、“(scFv)₂”分子或相应IgG活化23.5小时后对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图32。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，并通过不同浓度的CD3-MCSP双特异性“1+1IgG scFab，1个臂”(见SEQ ID NO1,3,5)、“1+1IgG scFab，1个臂倒转”(见SEQ IDNO7,9,11)或“(scFv)₂”构建体或相应IgG活化19小时后对Colo-38肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图33。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，用“1+1IgG scFab”CD3-MCSP双特异性构建体(见SEQ ID NO5,21,213)或“(scFv)₂”分子处理20小时后对Colo-38肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图34。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，并通过不同浓度的双特异性构建体和相应IgG活化21小时后对MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。比较CD3-MCSP双特异性“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO 3,5,29,33)和“1+1IgG Crossfab”(见SEQID NO5,29,31,33)构建体、“(scFv)₂”分子和相应IgG。

图35。通过用135ng/ml或1.35ng/ml“2+1IgG Crossfab”CD3-MCSP双特异性构建体(见SEQ ID NO3,5,29,33)(E:T比率=25:1)活化人T细胞诱导的对不同靶细胞(MCSP阳性Colo-38肿瘤靶细胞、源自骨髓或脂肪组织的间充质干细胞、或来自胎盘的周细胞；如指示的)的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图36。在与人PBMC和不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgGscFab，LALA”(见SEQID NO5,17,19)和“(scFv)₂”)或糖工程化抗MCSP IgG(GlycoMab)共培养后，在过夜温育21h后测量的对Colo-38肿瘤靶细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。效应细胞与靶细胞比率固定在25:1(A)，或如绘出的那样变化(B)。PBMC自新鲜血液(A)或血沉棕黄层(Buffy Coat)(B)分离。

图37。靶向猕猴CD3和人MCSP的“2+1IgG Crossfab”构建体(见SEQ ID NO3,5,35,37)的时间依赖性细胞毒性效应。绘出的是在与原代猕猴PBMC(E:T比率=3:1)共培养24h或43h后来自表达MCSP的人MV-3细胞的LDH释放。作为对照，以相同的摩尔浓度使用参照IgG(抗猕猴CD3IgG和抗人MCSP IgG)。PHA-M充当(非生理)T细胞活化的对照。

图38。在与人PBMC(E:T比率=10:1)共培养，并用不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)和“(scFv)₂”)处理约26小时后对huMCSP阳性MV-3黑素瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图39。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，并用不同CD3-EGFR双特异性构建体(“2+1IgG scFab”(见SEQ ID NO45,47,53)、“1+1IgG scFab”(见SEQ ID NO47,53,213)和“(scFv)₂”)或参照IgG处理18小时后对EGFR阳性LS-174T肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图40。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，并用不同CD3-EGFR双特异性构建体(“1+1IgG scFab，1个臂”(见SEQ ID NO43,45,47)、“1+1IgG scFab，1个臂倒转”(见SEQ IDNO11,49,51)、“1+1IgG scFab”(见SEQ ID NO47,53,213)和“(scFv)₂”)或参照IgG处理21小时后对EGFR阳性LS-174T肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图41。在与人泛T细胞(A)或人未处理T细胞(B)共培养，并用不同CD3-EGFR双特异性构建体(“1+1IgG scFab，1个臂”(见SEQ ID NO43,45,47)、“1+1IgG scFab，1个臂倒转”(见SEQ ID NO11,49,51)和“(scFv)₂”)或参照IgG处理16小时后对EGFR阳性LS-174T肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。效应细胞与靶细胞比率为5:1。

图42。在与人泛T细胞(E:T比率=5:1)共培养，并用不同CD3-FAP双特异性构建体(“1+1IgG scFab，1个臂倒转”(见SEQ ID NO11,51,55)、“1+1IgGscFab”(见SEQ ID NO57,61,213)、“2+1IgG scFab”(见SEQ ID NO57,59,61)和“(scFv)₂”)处理约18小时后对FAP阳性GM05389成纤维细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图43。对已经在存在(A)或缺乏(B)靶细胞的情况下用不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgG scFab，LALA”(见SEQ ID NO5,17,19)和“(scFv)₂”)或相应对照IgG处理6h的CD8⁺T细胞中CD107a/b表达水平以及穿孔蛋白(perforin)水平的流式细胞术分析。在存在或缺乏Colo-38肿瘤靶细胞的情况下将人泛T细胞与9.43nM不同分子以5:1的效应器与靶物比率温育。在温育第1小时后加入莫能菌素(Monensin)以通过阻止蛋白质运输来提高胞内蛋白质水平。对所有CD107a/b阳性、穿孔蛋白阳性或双重阳性细胞设置门，如绘出的。

图44。在存在或缺乏Colo-38肿瘤靶细胞的情况下在与1nM不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgG scFab，LALA”(见SEQ ID NO5,17,19)或“(scFv)₂”)或相应对照IgG以5:1的效应细胞与靶细胞比率温育后CD8⁺(A)或CD4⁺(B)人T细胞的相对增殖。通过FACS表征经CFSE标记的人泛T细胞。相对增殖水平通过围绕非增殖细胞设门并相对于总测量细胞数使用该门的细胞数作为参照来测定。

图45。在存在(A)或缺乏(B)Colo-38肿瘤靶细胞的情况下在用1nM不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgG scFab，LALA”(见SEQ ID NO5,17,19)或“(scFv)₂”)或相应对照IgG处理24小时后，人PBMC上清液中测量的不同细胞因子水平。效应细胞与靶细胞比率为10:1。

图46。在存在(A，B)或缺乏(C，D)Colo-38肿瘤细胞的情况下在用1nM不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgG scFab”、“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)或“(scFv)₂”)或相应对照IgG处理24小时后，全血上清液中测量的不同细胞因子水平。双特异性构建体中有不同的“2+1IgG scFab”构建体，其具有野生型域(见SEQ ID NO5,13,15)，或经突变以消除(NK)效应细胞功能的Fc域(LALA(见SEQ ID NO5,17,19)、P329G LALA(见SEQID NO5,2,23)和P329G LALA N297D(见SEQ ID NO5,25,27))。

图47。CE-SDS分析。显示为2+1IgG Crossfab，连接的轻链(见SEQ ID NO 3,5,29,179)的SDS PAGE的电泳图(第1道：还原性，第2道：非还原性)。

图48。2+1IgG Crossfab，连接的轻链(见SEQ ID NO3,5,29,179)(终产物)的分析性大小排阻层析。注射20μg样品。

图49。在通过人PBMC(E:T比率=10:1)共培养，并用不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)和“2+1IgGCrossfab，连接的LC”(见SEQ IDNO3,5,29,179))处理约44小时后对MCSP阳性MV-3肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。人PBMC自健康志愿者的新鲜血液分离。

图50。在通过人PBMC(E:T比率=10:1)共培养，并用不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)和“2+1IgGCrossfab，连接的LC”(见SEQ IDNO3,5,29,179))处理约22小时后对MCSP阳性Colo-38肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。人PBMC自健康志愿者的新鲜血液分离。

图51。在通过人PBMC(E:T比率=10:1)共培养，并用不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)和“2+1IgGCrossfab，连接的LC”(见SEQ IDNO3,5,29,179))处理约22小时后对MCSP阳性Colo-38肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。人PBMC自健康志愿者的新鲜血液分离。

图52。在通过人PBMC(E:T比率=10:1)共培养，并用不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)和“2+1IgG Crossfab，连接的LC”(见SEQ IDNO3,5,29,179))处理约22小时后对MCSP阳性WM266-4细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。人PBMC自健康志愿者的新鲜血液分离。

图53。在存在或缺乏表达MCSP的人Colo-38肿瘤靶细胞(E:T比率=10:1)的情况下在与10nM、80pM或3pM的不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgG Crossfab”(见SEQ IDNO3,5,29,33)和“2+1IgG Crossfab，连接的LC”(见SEQ ID NO3,5,29,179))温育22小时后人CD8⁺T细胞上早期活化标志物CD69(A)和后期活化标志物CD25(B)的表面表达水平。

图54。CE-SDS分析。(A)显示为1+1IgG Crossfab；VL/VH交换(LC007/V9)(见SEQ IDNO5,29,33,181)的SDS-PAGE的电泳图：a)非还原性，b)还原性。(B)显示为1+1CrossMab；CL/CH1交换(LC007/V9)(见SEQ ID NO5,23,183,185)的SDS-PAGE的电泳图：a)还原性，b)非还原性。(C)显示为2+1IgGCrossfab，倒转的；CL/CH1交换(LC007/V9)(见SEQ ID NO5,23,183,187)的SDS-PAGE的电泳图：a)还原性，b)非还原性。(D)显示为2+1IgG Crossfab；VL/VH交换(M4-3ML2/V9)(见SEQ ID NO33,189,191,193)的SDS-PAGE的电泳图：a)还原性，b)非还原性。(E)显示为2+1IgG Crossfab；CL/CH1交换(M4-3ML2/V9)(见SEQ ID NO183,189,193,195)的SDS-PAGE的电泳图：a)还原性，b)非还原性。(F)显示为2+1IgG Crossfab，倒转的；CL/CH1交换(CH1A1A/V9)(见SEQ ID NO65,67,183,197)的SDS-PAGE的电泳图：a)还原性，b)非还原性。(G)显示为2+1IgG Crossfab；CL/CH1交换(M4-3ML2/H2C)(见SEQ ID NO189,193,199,201)的SDS-PAGE的电泳图：a)还原性，b)非还原性。(H)显示为2+1IgG Crossfab，倒转的；CL/CH1交换(431/26/V9)(见SEQ ID NO183,203,205,207)的SDS-PAGE的电泳图：a)还原性，b)非还原性。(I)显示为“2+1IgG Crossfab轻链融合”(CH1A1A/V9)(见SEQ ID NO183,209,211,213)的SDS-PAGE的电泳图：a)还原性，b)非还原性。(J)“2+1IgGCrossfab”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO5,23,215,217)，非还原性(左)和还原性(右)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)。(K)显示为“2+1IgG Crossfab，倒转的”(抗MCSP/抗huCD3)(见SEQ ID NO5,23,215,219)的SDS-PAGE的电泳图：a)还原性，b)非还原性。(L)“1+1IgG Crossfab”(抗CD33/抗huCD3)(见SEQ ID NO33,213,221,223)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)，还原性(左)和非还原性(右)。(M)“2+1IgG Crossfab”(抗CD33/抗huCD3)(见SEQ ID NO33,221,223,225)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)，还原性(左)和非还原性(右)。(N)“2+1IgGCrossfab”(抗CD20/抗huCD3)(见SEQ ID NO 33,227,229,231)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris，NuPage Invitrogen，考马斯染色)，非还原性。

图55。双特异性构建体(CEA/CD3“2+1IgG Crossfab，倒转的(VL/VH)”(见SEQ IDNO33,63,65,67)和“2+1IgG Crossfab，倒转的(CL/CH1)2(见SEQ ID NO65,67,183,197))对由Jurkat细胞表达的人CD3(A)，或由LS-174T细胞表达的人CEA(B)的结合，如通过FACS测定的。作为对照，亦评估等同最大浓度的参照IgG和由于经标记二抗(缀合有FITC的山羊抗人AffiniPure F(ab’)2片段，Fcγ片段特异性，Jackson Immuno Research Lab#109-096-098)所致的背景染色。

图56。双特异性构建体(MCSP/CD3“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)和“2+1IgG Crossfab，倒转的”(见SEQ ID NO5,23,183,187))对由Jurkat细胞表达的人CD3(A)，或由WM266-4肿瘤细胞表达的人MCSP(B)的结合，如通过FACS测定的。

图57。“1+1IgG Crossfab轻链融合”(见SEQ ID NO183,209,211,213)对由Jurkat细胞表达的人CD3(A)，或由LS-174T细胞表达的人CEA(B)的结合，如通过FACS测定的。

图58。“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO5,23,215,217)和“2+1IgGCrossfab，倒转的”(见SEQ ID NO5,23,215,219)构建体对由Jurkat细胞表达的人CD3(A)，或由WM266-4肿瘤细胞表达的人MCSP(B)的结合，如通过FACS测定的。

图59。在与指定浓度的CD3/MCSP“1+1CrossMab”(见SEQ ID NO5,23,183,185)、“1+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO5,29,33,181)和“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)构建体温育24小时后人CD4⁺或CD8⁺T细胞上早期活化标志物CD69(A)或后期活化标志物CD25(B)的表面表达水平。该测定法在存在或缺乏MV-3靶细胞的情况下进行，如指示的。

图60。在存在或缺乏huMCSP阳性MV-3肿瘤细胞的情况下与猕猴PBMC(E:T比率=3:1，相对于CD3⁺数目标准化)共培养，并用“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO5,23,215,217)和“2+1IgG Crossfab，倒转的”(见SEQ ID NO5,23,215,219)温育约41小时后，来自两只不同猕猴(A和B)的CD4⁺或CD8⁺T细胞上早期活化标志物CD25的表面表达水平。

图61。在与人PBMC(E:T比率=10:1)共培养并通过不同浓度的“2+1IgG Crossfab，倒转的(VL/VH)”(见SEQ ID NO33,63,65,67)或“2+1IgG Crossfab，倒转的(CL/CH1)”(见SEQ ID NO65,67,183,197)构建体活化28小时后，对MKN-45(A)或LS-174T(B)肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图62。在与人PBMC(E:T比率=10:1)共培养并通过不同浓度的“2+1IgG Crossfab(VL/VH)”(见SEQ ID NO33,189,191,193)或“2+1IgG Crossfab(CL/CH1)”(见SEQ IDNO183,189,193,195)构建体活化26小时后，对WM266-4肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图63。在与人PBMC(E:T比率=10:1)共培养并通过不同浓度的“2+1IgG Crossfab(VH/VL)”(见SEQ ID NO33,189,191,193)或“2+1IgG Crossfab(CL/CH1)”(见SEQ IDNO183,189,193,195)构建体活化27小时后，对MV-3肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图64。在与人PBMC(E:T比率=10:1)共培养并通过不同浓度的“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)、“1+1CrossMab”(见SEQ ID NO5,23,183,185)和“1+1IgGCrossfab”(见SEQ ID NO5,29,33,181)活化21小时后，对人MCSP阳性WM266-4(A)或MV-3(B)肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)，如指示的。

图65。在与人PBMC(E:T比率=10:1)共培养并通过不同浓度“1+1IgG Crossfab LC融合”(见SEQ ID NO183,209,211,213)活化28小时后，对MKN-45(A)或LS-174T(B)肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图66。在与人PBMC(E:T比率=10:1)共培养并通过不同浓度的“1+1IgG CrossfabLC融合”(见SEQ ID NO183,209,211,213)或非靶向性“2+1IgG Crossfab”参照活化24小时后，对MC38-huCEA肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

图67。在与人PBMC(E:T比率=10:1)共培养，并用“2+1IgG Crossfab(V9)”(见SEQID NO3,5,29,33)和“2+1IgG Crossfab，倒转的(V9)”(见SEQ ID NO 5,23,183,187)、“2+1IgG Crossfab(抗CD3)”(见SEQ ID NO5,23,215,217)和“2+1IgG Crossfab，倒转的(抗CD3)”(见SEQ ID NO5,23,215,219)构建体处理后，对人MCSP阳性MV-3(A)或WM266-4(B)肿瘤细胞的杀伤(如通过LDH释放测量)。

发明详述

定义

除非在下文另外定义，术语在本文中如本领域中一般使用的那样使用。

如本文中使用的，术语“抗原结合分子”在其最广义上指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是免疫球蛋白及其衍生物，例如片段。

术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原性决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两种抗原结合位点，其中每种特异于不同的抗原性决定簇。在某些实施方案中，所述双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇，特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。

如本文中使用的，术语“价”指抗原结合分子中规定数目的抗原结合位点的存在。因而，术语“对抗原的单价结合”指抗原结合分子中一个(且不超过一个)特异于抗原的抗原结合位点的存在。

“抗原结合位点”指抗原结合分子上提供与抗原相互作用的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基。天然的免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab分子通常具有单个抗原结合位点。

如本文中使用的，术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原性决定簇的多肽分子。在一个实施方案中，抗原结合模块能够将与其附接的实体(例如第二抗原结合模块)引导至靶部位，例如至特定类型的肿瘤细胞或携有抗原性决定簇的肿瘤基质。在另一个实施方案中，抗原结合模块能够经由其靶抗原例如T细胞受体复合物抗原来激活信号传导。抗原结合模块包括如本文中另外定义的抗体及其片段。具体的抗原结合模块包括抗体的抗原结合域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中，抗原结合模块可以包含抗体恒定区，如本文中另外定义和本领域中已知的。可用的重链恒定区包括以下5种同种型中的任意一种：α、δ、ε、γ或μ。可用的轻链恒定区包括以下2种同种型中的任意一种：κ和λ。

如本文中使用的，术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且指多肽大分子上与抗原结合模块结合，从而形成抗原结合模块-抗原复合物的位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区构成的构象性构造)。可用的抗原性决定簇可以在例如肿瘤细胞表面上、病毒感染的细胞的表面上、其它患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、游离在血液血清中和/或在胞外基质(ECM)中找到。除非另外指示，本文中称为抗原的蛋白质(例如MCSP、FAP、CEA、EGFR、CD33、CD3)可以是来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然形式蛋白质。在一个具体的实施方案中，抗原是人蛋白。在对本文中的特定蛋白质进行提述的情况下，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质以及起因于细胞中加工的蛋白质的任何形式。该术语还涵盖蛋白质的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。可用作抗原的例示性人蛋白包括但不限于：黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，亦称为硫酸软骨素蛋白聚糖4(UniProt no.Q6UVK1(版本70)，NCBI RefSeq no.NP_001888.2)；成纤维细胞活化蛋白(FAP)，亦称为Seprase(Uni Protno.Q12884、Q86Z29、Q99998，NCBI登录号NP_004451)；癌胚抗原(CEA)，亦称为癌胚抗原相关细胞粘着分子5(UniProt no.P06731(版本119)，NCBI RefSeq no.NP_004354.2)；CD33，亦称为gp67或Siglec-3(UniProt no.P20138，NCBI登录号NP_001076087、NP_001171079)；表皮生长因子受体(EGFR)，亦称为ErbB-1或Her1(UniProt no.P0053，NCBI登录号NP_958439、NP_958440)，和CD3，特别是D3的ε亚基(对于人序列，参见UniProt no.P07766(版本130)、NCBI RefSeq no.NP_000724.1、SEQ ID NO:265；或对于猕猴[食蟹猴(Macacafascicularis)]序列，参见UniProt no.Q95LI5(版本49)、NCBI GenBank no.BAB71849.1、SEQ ID NO:266)。在某些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合在来自不同物种的活化性T细胞抗原或靶抗原间保守的活化性T细胞抗原或靶细胞抗原的表位。

“特异性结合”意指结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。抗原结合模块结合特定抗原性决定簇的能力能经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面等离振子共振技术(在BIAcore仪上分析)(Liljeblad等,Glyco J17,323-329(2000))，以及传统的结合测定法(Heeley,EndocrRes28,217-229(2002))来测量。在一个实施方案中，抗原结合模块对无关蛋白的结合程度是该抗原结合模块对抗原结合的小于约10%，如例如通过SPR测量的。在某些实施方案中，结合抗原的抗原结合模块，或包含该抗原结合模块的抗原结合分子具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10^-8M以下，例如10^-8M至10^-13M，例如10^{- 9}M至10^-13M)的解离常数(K_D)。

“亲和力”指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗原结合模块和抗原，或受体及其配体)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数(K_D)来表述，其为解离与结合速率常数(分别为K_解离和K_结合)的比率。如此，相等的亲和力可能包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的确立方法来测量，包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的一种具体方法是表面等离振子共振(SPR)。

“降低的结合”，例如降低的对Fc受体的结合，指相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为了清楚，该术语还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限)，即完全消除相互作用。相反，“升高的结合”指相应相互作用的亲和力升高。

如本文中使用的，“活化性T细胞抗原”指在T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的表面上表达的抗原性决定簇，其在与抗原结合分子相互作用后能诱导T细胞活化。特定地，抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可诱导T细胞活化，其通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联进行。在一个具体的实施方案中，所述活化性T细胞抗原是CD3。

如本文中使用的，“T细胞活化”指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答，其选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够诱导T细胞活化。合适的测量T细胞活化的测定法是本文中所述技术领域中已知的。

如本文中使用的，“靶细胞抗原”指靶细胞表面上呈现的抗原性决定簇，所述靶细胞例如肿瘤中的细胞如癌细胞或肿瘤基质的细胞。

如本文中使用的，术语“第一”和“第二”就抗原结合模块等而言为了在有超过一个每类模块时便于区分而使用。除非明确如此陈述，这些术语的使用不意图赋予T细胞活化性双特异性抗原结合分子的特定次序或取向。

“Fab分子”指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL域组成的蛋白质。

“融合”意指组分(例如Fab分子和Fc域亚基)直接地或经由一种或多种肽接头通过肽键连接。

如本文中使用的，术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在某些实施方案中，抗原结合模块之一是单链Fab分子，即其中通过肽接头连接Fab轻链和Fab重链以形成单一肽链的Fab分子。在一个具体的这类实施方案中，在单链Fab分子中Fab轻链的C端连接于Fab重链的N端。

“交换”Fab分子(亦称为“Crossfab”)意指其中交换Fab重链和轻链的可变区或恒定区的Fab分子，即交换Fab分子包含由轻链可变区和重链恒定区构成的肽链，和由重链可变区和轻链恒定区构成的肽链。为了清楚，在其中交换Fab轻链和Fab重链的可变区的Fab分子中，包含重链恒定区的肽链在本文中称为交换Fab分子的“重链”。相反，在其中交换Fab轻链和Fab重链的恒定区的Fab分子中，包含重链可变区的肽链在本文中称为交换Fab分子的“重链”。

术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重域或重链可变域，接着是3个恒定域(CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻域或轻链可变域，接着是恒定轻(CL)域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)的5类之一，其中一些可以进一步分成亚类，例如γ₁(IgG₁)、γ₂(IgG₂)、γ₃(IgG₃)、γ₄(IgG₄)、α₁(IgA₁)和α₂(IgA₂)。基于其恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以归入称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc域组成。

术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。

“抗体片段”指完整抗体外的分子，其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)、和单域抗体。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等,NatMed9,129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见例如Plückthun,于The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；亦参见WO93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)₂片段的论述，参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如EP404,097;WO1993/01161;Hudson等,Nat Med9,129-134(2003)；和Hollinger等,Proc Natl Acad Sci USA90,6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat Med9,129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域、或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA;参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可以通过各种技术来制备抗体片段，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中描述的。

术语“抗原结合域”指包含特异性结合部分或整个抗原且与其互补的区域的抗体部分。抗原结合域可由例如一个或多个抗体可变域(也称为抗体可变区)提供。具体地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。

术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见例如Kindt等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freemanand Co.,第91页(2007)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。

如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中序列中高度可变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。通常，天然的四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。除了VH中CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为“互补性决定区”(CDR)，并且在述及形成抗原结合区的可变区部分时，这些术语在本文中可交换使用。此特定区域已由Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1983)及由Chothia等,J Mol Biol196:901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一种定义来指抗体或其变体的CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每篇参考文献定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下表1中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基数将随着CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定CDR。

表1：CDR定义¹

CDR	Kabat	Chothia
					31-35	26-32	26-35
	50-65	52-58	50-58
					95-102	95-102	95-102
	24-34	26-32	24-34
					50-56	50-52	50-56
	89-97	91-96	89-97

¹表1中所有CDR定义的编号方式依照由Kabat等提出的编号惯例(见下文)。

²如表1中使用的具有小写字母“b”的“AbM”指由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。

Kabat等还定义针对可变区序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员可以明确地将此“Kabat编号”系统归入任何可变区序列，不依赖于序列本身外的任何实验数据。如本文中使用的，“Kabat编号方式”指由Kabat等,U.S.Dept.of Health andHuman Services,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)提出的编号系统。除非另外说明，提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号方式依照Kabat编号系统。

序列表的多肽序列(即SEQ ID NO:1,3,5,7,9,11,13,15等)并不依照Kabat编号系统编号。然而，本领域中普通技术人员完全能将序列表的序列编号方式转变成Kabat编号方式。

“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR一般由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因而，HVR和FR序列一般以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

抗体或免疫球蛋白的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种主要的类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中数种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

本文中术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，可以存在或不存在Fc区的C端赖氨酸(Lys447)。除非本文中另外指定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，也称为EU索引，如记载于Kabat等,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991的。如本文中使用的，Fc域的“亚基”指形成二聚体Fc域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如，IgG Fc域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。

“促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰”是降低或防止包含Fc域亚基的多肽与相同多肽联合以形成同二聚体的肽主链操作或Fc域亚基的翻译后修饰。如本文中使用的，具体地，促进联合的修饰包括对期望联合的两个Fc域亚基(即Fc域的第一和第二亚基)中的每一个进行的分开的修饰，其中所述修饰彼此互补，从而促进两个Fc域亚基的联合。例如，促进联合的修饰可以改变一种或两种Fc域亚基的结构或电荷，从而在立体或静电上分别促进它们的联合。如此，异二聚化在包含第一Fc域亚基的多肽和包含第二Fc域亚基的多肽之间发生，其在融合至每个亚基的别的组分(例如抗原结合模块)不同这一意义上讲可能是不相同的。在一些实施方案中，促进联合的修饰包含在Fc域中的氨基酸突变，具体为氨基酸取代。在一个具体的实施方案中，促进联合的修饰包含Fc域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变，具体为氨基酸取代。

术语“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞活化。

如本文中使用的，术语“工程化”视为包括对肽主链的任意操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列、糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰，以及这些办法的组合。

如本文中使用的，术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任意组合来实现最终构建体，只要最终构建体拥有期望的特性，例如降低的对Fc受体的结合，或与另一种肽的增加的联合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸插入。具体的氨基酸突变是氨基酸取代。为了改变例如Fc区的结合特征，特别优选非保守性的氨基酸取代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸取代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变、PCR、基因合成等。通过与遗传工程化不同的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能可用。本文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。例如，从Fc域第329位脯氨酸到甘氨酸的取代可指示为329G、G329、G₃₂₉、P329G或Pro329Gly。

如本文中使用的，术语“多肽”指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指具有两个或更多个氨基酸的任意链，并且不指特定长度的产物。如此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或任何其它用于指具有两个或更多个氨基酸的链的术语均包括在“多肽”的定义中，而且术语“多肽”可以代替这些术语中任一个或与其交换使用。术语“多肽”还意图指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰化、通过已知的保护性/封闭性基团衍生化、蛋白水解切割、或通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可以自天然的生物学来源衍生或通过重组技术生成，但不必从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式来生成，包括通过化学合成。本发明的多肽大小可以是约3个以上、5个以上、10个以上、20个以上、25个以上、50个以上、75个以上、100个以上、200个以上、500个以上、1,000个以上、或2,000个以上的氨基酸。多肽可以具有限定的三维结构，尽管它们不必具有这类结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠的，而不具有限定的三维结构而可以采用大量不同构象的多肽被称为未折叠的。

“分离的”多肽或其变体或衍生物意图为不处于其天然环境中的多肽。不需要特定水平的纯化。例如，分离的多肽可以是从其天然或自然环境中取出。就本发明而言，在宿主细胞中表达的重组生成的多肽和蛋白质被视为分离的，已通过任何合适的技术分开、分级、或部分或基本上纯化的天然的或重组的多肽也是如此。

关于参照多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测定百分比氨基酸序列同一性目的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括在比较序列的全长里获得最大比对需要的任何算法。然而，就本文中目的而言，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成%氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创作，并且源代码已与用户文档一起提交到美国版权局(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.，20559，其在美国版权注册No.TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，South San Francisco，California公开获得，或可从源代码汇编。ALIGN-2程序应当汇编用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且不改变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定的氨基酸序列A对/与/相对给定的氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或其可以用短语表示为对/与/相对给定的氨基酸序列B具有或包含特定%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y的100倍

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在所述程序对A和B的比对中评为相同匹配的氨基酸残基数，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。会领会的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的%氨基酸序列同一性将不等于B对A的%氨基酸序列同一性。除非另外明确说明，本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值如在上一段中描述的那样使用ALIGN-2计算机程序获得。

术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒衍生的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如酰胺键，如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸分子”指任何一种或多种存在于多核苷酸中的核酸区段，例如DNA或RNA片段。

“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，就本发明而言，包含在载体中的编码多肽的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中保持的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括在普遍含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子，但该多核苷酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录本，以及正链和负链形式、和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成生成的这类分子。另外，多核苷酸或核酸可以为或可以包括调节元件如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。

与本发明的参照核苷酸序列具有至少例如95%“相同的”核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，只不过按照参照核苷酸序列的每100个核苷酸，该多核苷酸序列可以包含多达5处点突变。换言之，为了获得与参照核苷酸序列具有至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以删除或用另一种核苷酸取代参照序列中高达5%的核苷酸，或者可以将参照序列中占总核苷酸的高达5%的数目的核苷酸插入到参照序列中。参照序列的这些变更可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任意地方，个别分散在参照序列中的残基中或分散在参照序列内的一或多个连续组中。作为一个实际问题，可以使用已知的计算机程序，如上文针对多肽论述的程序(例如ALIGN-2)来常规确定任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列为至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。

术语“表达盒”指重组或合成生成的，具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件的多核苷酸。可以将重组表达盒掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包含要转录的核酸序列和启动子等。在某些实施方案中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。

术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”同义，并指用于在靶细胞中导入与其可操作联合的特定基因及指导表达的DNA分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入到已经接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达盒允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体在靶细胞内，就通过细胞转录和/或翻译装置生成基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中，本发明的表达载体包含表达盒，其包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成用于本发明的双特异性抗原结合分子的任意类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞等，而且还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。

“激活Fc受体”是一种在抗体的Fc域衔接后，引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。人激活Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是一种导致通过免疫效应器细胞对抗体包被的靶细胞裂解的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其衍生物一般经由Fc区的N端的蛋白质部分特异性结合的细胞。如本文中使用的，术语“降低的ADCC”定义为通过上文定义的ADCC机制，以靶细胞周围介质中给定浓度的抗体，在给定的时间内裂解的靶细胞数目的降低，和/或通过ADCC机制，实现给定时间内给定数目的靶细胞裂解需要的靶细胞周围介质中抗体浓度的增加。ADCC的降低相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和贮存方法(其是本领域技术人员已知的)、由同一类型的宿主细胞生成但尚未工程化改造的相同抗体介导的ADCC。例如，由在其Fc域包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体所介导的ADCC中的降低，是相对于由在Fc域中无此氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC而言。测量ADCC的合适测定法是本领域中公知的(参见例如PCT公开文本no.WO2006/082515或PCT专利申请no.PCT/EP2012/055393)。

药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化必需的量。

药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指有效实现期望的治疗或预防结果的量(以必要的剂量且持续必要的时间)。治疗有效量的药剂例如消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良作用。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如人和非人灵长类如猴)、家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，所述个体或受试者是人。

术语“药物组合物”指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。

“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展率、改善或减轻疾病状态、及消退或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。在一些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。

术语“包装插页”用于指治疗产品的商业化包装中通常含有的说明书，其含有关于适应症、使用、剂量、施用、组合疗法、禁忌症的信息和/或关于使用这类治疗产品的警告。

实施方案的详细描述

在第一个方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含第一和第二抗原结合模块以及由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，所述抗原结合模块中一种是能够特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子，所述抗原结合模块中另一种是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子；

其中所述第一抗原结合模块是

(a)单链Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链由肽接头连接，或

(b)交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区是交换的。

T细胞活化性双特异性抗原结合分子形式

T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分可以以多种构造彼此融合。例示性的构造绘于图1中。

在一些实施方案中，所述第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fc域的第一或第二亚基的N端。

在一个具体的这类实施方案中，第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个特定的这类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本由以下组成：第一和第二抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的Fc域和任选地一个或多个肽接头，其中所述第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第二抗原结合模块的Fab重链的N端，而第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个甚至更特定的实施方案中，所述第一抗原结合模块是单链Fab分子。或者，在一个具体的实施方案中，所述第一抗原结合模块是交换Fab分子。任选地，如果第一抗原结合模块是交换Fab分子，那么第一抗原结合模块的Fab轻链和第二抗原结合模块的Fab轻链可以另外彼此融合。

在一个备选的这类实施方案中，第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个特定的这类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本由以下组成：第一和第二抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的Fc域和任选地一个或多个肽接头，其中所述第一和第二抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至所述Fc域的亚基之一的N端。在一个甚至更特定的实施方案中，所述第一抗原结合模块是单链Fab分子。或者，在一个具体的实施方案中，所述第一抗原结合模块是交换Fab分子。

在又一个这类实施方案中，所述第二抗原结合模块在Fab轻链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab轻链的N端。在一个特定的这类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本由以下组成：第一和第二抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的Fc域和任选地一个或多个肽接头，其中所述第一抗原结合模块在Fab轻链的N端融合至第二抗原结合模块的Fab轻链的C端，而第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个甚至更特定的实施方案中，所述第一抗原结合模块是交换Fab分子。

在其他实施方案中，第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fc域的第一或第二亚基的N端。

在一个具体的这类实施方案中，第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个特定的这类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本由以下组成：第一和第二抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的Fc域和任选地一个或多个肽接头，其中所述第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端，而第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个甚至更特定的实施方案中，所述第一抗原结合模块是交换Fab分子。任选地，第一抗原结合模块的Fab轻链和第二抗原结合模块的Fab轻链可以另外彼此融合。

在具体的这些实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合活化性T细胞抗原。在其他实施方案中，第一抗原结合模块能够特异性结合靶细胞抗原。

抗原结合模块可以直接地或经由肽接头融合至Fc域或彼此融合，所述肽接头包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知且本文中记载的。合适的、非免疫原性的接头肽包括例如(G₄S)_n、(SG₄)_n、(G₄S)_n或G₄(SG₄)_n肽接头。“n”一般是介于1和10之间的数字，通常介于2和4之间。特别适用于将第一和第二抗原结合模块的Fab轻链彼此融合的肽接头是(G₄S)₂。适用于连接第一和第二抗原结合模块的Fab重链的例示性肽接头是EPKSC(D)-(G₄S)₂(SEQ ID NO150和151)。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的部分)。尤其当抗原结合模块融合至Fc域亚基的N端时，其可以用或不用另外的肽接头经由免疫球蛋白铰链区或其部分融合。

具有能够特异性结合靶细胞抗原的单一抗原结合模块的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(例如如图1A、1B、1D、1E、1H、1I、1K或1M中显示的)是有用的，特别是在高亲和力抗原结合模块结合后会预期靶细胞抗原内在化的情况中。在这类情况中，存在超过一个特异于靶细胞抗原的抗原结合模块可能增强靶细胞抗原的内在化，由此降低其利用度。

然而，在许多其它情况中，会有利的是具有包含两个或更多个特异于靶细胞抗原的抗原结合模块的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(见显示于图1C、1F、1G、1J或1L的例子)，从而例如优化对靶部位的靶向或允许靶细胞抗原的交联。

因而，在某些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含第三抗原结合模块，其为能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子。在一个实施方案中，所述第三抗原结合模块能够与第一或第二抗原结合模块特异性结合相同的靶细胞抗原。在一个具体的实施方案中，所述第一抗原结合模块能够特异性结合活化性T细胞抗原，而第二和第三抗原结合模块能够特异性结合靶细胞抗原。

在一个实施方案中，所述第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个具体的实施方案中，所述第二和第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至所述Fc域的亚基之一的N端，且所述第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述第二抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个这类实施方案中，所述第一抗原结合模块是单链Fab分子。在一个具体的这类实施方案中，所述第一抗原结合模块是交换Fab分子。任选地，如果第一抗原结合模块是交换Fab分子，那么第一抗原结合模块的Fab轻链和第二抗原结合模块的Fab轻链可以另外彼此融合。

第二和第三抗原结合模块可以直接或经由肽接头融合至Fc域。在一个具体的实施方案中，第二和第三抗原结合模块各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个特定的实施方案中，所述免疫球蛋白铰链区是人IgG₁铰链区。在一个实施方案中，所述第二和第三抗原结合模块和Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个具体的实施方案中，所述免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更具体的实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG₁亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG₄亚类免疫球蛋白。在一个别的具体的实施方案中，所述免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其他实施方案中，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本由以下组成：能够特异性结合靶细胞抗原的免疫球蛋白分子，和能够特异性结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块，其中所述抗原结合模块是融合至免疫球蛋白重链之一(任选地经由肽接头)的N端的单链Fab分子或交换Fab分子，特别是交换Fab分子。

在一个备选的实施方案中，所述第一和第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至所述Fc域的亚基之一的N端，且所述第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述第一抗原结合模块的Fab重链的N端。在一个特定的这类实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本由以下组成：第一、第二和第三抗原结合模块，由第一和第二亚基构成的Fc域和任选地一个或多个肽接头，其中所述第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至第一抗原结合模块的Fab重链的N端，而第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fc域的第一亚基的N端，且其中第三抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述Fc域的第二亚基的N端。在一个具体的这类实施方案中，所述第一抗原结合模块是交换Fab分子。任选地，第一抗原结合模块的Fab轻链和第二抗原结合模块的Fab轻链可以另外彼此融合。

在本发明的一些T细胞活化性双特异性抗原结合分子中，第一抗原结合模块的Fab轻链和第二抗原结合模块的Fab轻链彼此融合，任选地经由接头肽融合。根据第一和第二抗原结合模块的构造，第一抗原结合模块的Fab轻链可在其C端融合至第二抗原结合模块的Fab轻链的N端，或者第二抗原结合模块的Fab轻链可在其C端融合至第一抗原结合模块的Fab轻链的N端。第一和第二抗原结合模块的Fab轻链的融合进一步降低不匹配的Fab重链和轻链的错误配对，并且还降低表达本发明的一些T细胞活化性双特异性抗原结合分子需要的质粒数。

在某些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第一Fab轻链与肽接头共享羧基末端肽键，所述肽接头继而与第一Fab重链共享羧基末端肽键，所述第一Fab重链继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VL-CL-接头-VH-CH1-CH2-CH2(-CH4))，和其中的第二Fab重链与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含第二Fab轻链多肽(VL-CL)。在某些实施方案中，所述多肽共价连接，例如通过二硫键进行。

在一些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含如下的多肽，其中第一Fab轻链与肽接头共享羧基末端肽键，所述肽接头继而与第一Fab重链共享羧基末端肽键，所述第一Fab重链继而与第二Fab重链共享羧基末端肽键，所述第二Fab重链继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键(VL-CL-接头-VH-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在这些实施方案之一中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含第二Fab轻链多肽(VL-CL)。依照这些实施方案的T细胞活化性双特异性抗原结合分子还可以包含(i)Fc域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中的第三Fab重链与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))和第三Fab轻链多肽(VL-CL)。在某些实施方案中，所述多肽共价连接，例如通过二硫键进行。

在某些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第一Fab轻链可变区与第一Fab重链恒定区(即交换Fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)共享羧基末端肽键)，所述第一Fab重链恒定区继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VL-CH1-CH2-CH2(-CH4)，和其中的第二Fab重链与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含其中的Fab重链可变区与Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH-CL)和Fab轻链多肽(VL-CL)。在某些实施方案中，所述多肽共价连接，例如通过二硫键进行。

在备选的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第一Fab重链可变区与第一Fab轻链恒定区(即交换Fab重链，其中重链恒定区用轻链恒定区替换)共享羧基末端肽键)，所述第一Fab轻链恒定区继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH-CL-CH2-CH2(-CH4))，和其中的第二Fab重链与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含其中的Fab轻链可变区与Fab重链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL-CH1)和Fab轻链多肽(VL-CL)。在某些实施方案中，所述多肽共价连接，例如通过二硫键进行。

在一些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第一Fab轻链可变区与第一Fab重链恒定区(即交换Fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)共享羧基末端肽键，所述第一Fab重链恒定区继而与第二Fab重链共享羧基末端肽键，所述第二Fab重链继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第一Fab重链可变区与第一Fab轻链恒定区(即交换Fab重链，其中重链恒定区用轻链恒定区替换)共享羧基末端肽键，所述第一Fab轻链恒定区继而与第二Fab重链共享羧基末端肽键，所述第二Fab重链继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH-CL-VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))。仍在其他实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第二Fab重链与第一Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，所述第一Fab轻链可变区继而与第一Fab重链恒定区(即交换Fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)共享羧基末端肽键，所述第一Fab重链恒定区继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第二Fab重链与第一Fab重链可变区共享羧基末端肽键，所述第一Fab重链可变继而与第一Fab轻链恒定区(即交换Fab重链，其中重链恒定区用轻链恒定区替换)共享羧基末端肽键，所述第一Fab轻链恒定区继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3(-CH4))。

在这些中的一些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含交换Fab轻链多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH-CL)，和Fab轻链多肽(VL-CL)。在这些中其他实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含交换Fab轻链多肽，其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL-CH1)，和Fab轻链多肽(VL-CL)。仍在这些中其他实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子还包含其中的Fab轻链可变区与Fab重链恒定区共享羧基末端肽键，所述Fab重链恒定区继而与Fab轻链多肽共享羧基末端肽键的多肽(VL-CH1-VL-CL)，其中的Fab重链可变区与Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键，所述Fab轻链恒定区继而与Fab轻链多肽共享羧基末端肽键的多肽(VH-CL-VL-CL)，其中的Fab轻链多肽与Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，所述Fab轻链可变区继而与Fab重链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL-CL-VL-CH1)，或其中的Fab轻链多肽与Fab重链可变区共享羧基末端肽键，所述Fab重链可变区继而与Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL-CL-VH-CL)。

依照这些实施方案的T细胞活化性双特异性抗原结合分子还可以包含(i)Fc域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中的第三Fab重链与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))和第三Fab轻链多肽(VL-CL)。在某些实施方案中，所述多肽共价连接，例如通过二硫键连接。

在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第二Fab轻链与第一Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，所述第一Fab轻链可变区继而与第一Fab重链恒定区(即交换Fab轻链，其中轻链恒定区用重链恒定区替换)共享羧基末端肽键的多肽(VL-CL-VL-CH1)，其中的第二Fab重链与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))，和其中的第一Fab重链可变区与第一Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH-CL)。在另一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第二Fab轻链与第一Fab重链可变区共享羧基末端肽键，所述第一Fab重链可变区继而与第一Fab轻链恒定区(即交换Fab轻链，其中轻链可变区用重链可变区替换)共享羧基末端肽键的多肽(VL-CL-VH-CL)，其中的第二Fab重链与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))，和其中的第一Fab轻链可变区与第一Fab重链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL-CH1)。依照这些实施方案的T细胞活化性双特异性抗原结合分子还可包含(i)Fc域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中的第三Fab重链与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH-CH1-CH2-CH3(-CH4))和第三Fab轻链多肽(VL-CL)。在某些实施方案中，所述多肽共价连接，例如通过二硫键连接。

依照任一个上文实施方案，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分(例如抗原结合模块、Fc域)可直接地或经由本文中描述或本领域已知的各种接头，特别是包含一个或多个氨基酸(通常约2-20个氨基酸)的肽接头融合。合适的、非免疫原性的肽接头包括例如(G₄S)_n、(SG₄)_n、(G₄S)_n或G₄(SG₄)_n肽接头，其中n一般是介于1和10之间的数字，通常介于2和4之间。

Fc域

T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域由一对包含免疫球蛋白分子重链域的多肽组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体，其每个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。在一个实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不超过一个Fc域。

在依照本发明的一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域是IgG Fc域。在一个具体的实施方案中，Fc域是IgG₁Fc域。在另一个实施方案中，Fc域是IgG₄Fc域。在一个更特定的实施方案中，Fc域是包含位置S228(Kabat编号方式)处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P的IgG₄Fc域。此氨基酸取代降低I_gG₄抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等,Drug Metabolism and Disposition38,84-91(2010))。在一个别的具体的实施方案中，Fc域是人的。人IgG₁Fc区的一个例示性序列在SEQ ID NO:149中给出。

促进异二聚化的Fc域修饰

依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不同的抗原结合模块，其融合至Fc域的两个亚基之一个或另一个，如此Fc域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后二聚化导致两种多肽的数种可能组合。为了改进重组生产中T细胞活化性双特异性抗原结合分子的产率和纯度，如此在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域中引入促进期望多肽联合的修饰将是有利的。

因而，在具体的实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人IgG Fc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此，在一个实施方案中，所述修饰在Fc域的CH3域中。

在一个特定的实施方案中，所述修饰是所谓的“突出-入-孔”修饰，其包含在Fc域的两个亚基之一中的“突出”修饰和在Fc域的两个亚基的另一个中的“孔”修饰。

突出-入-孔技术记载于例如US5,731,168;US7,695,936;Ridgway等,Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth248,7-15(2001)。一般地，该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“突出”)并在第二多肽的界面中引入相应的穴(“孔”)，使得隆起可以置于穴中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性穴，其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换得到。

因而，在一个具体的实施方案中，在T细胞活化性双特异性抗原结合分子Fc域的第一亚基的CH3域中，氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在所述第一亚基的CH3域内生成突出，其可安置于所述第二亚基的CH3域内的空穴中，而且在Fc域的第二亚基的CH3域中，氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在所述第二亚基的CH3域内生成空穴，其中可安置所述第一亚基的CH3域内的突出。

可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点专一诱变或通过肽合成来制备隆起和穴。

在一个特定的实施方案中，在Fc域第一亚基的CH3域中，第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W)，而在Fc域第二亚基的CH3域中，第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施方案中，在Fc域第二亚基中，另外，第366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)。

在又一个实施方案中，在Fc域的第一亚基中，另外，第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)，且在Fc域的第二亚基中，另外，第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在Fc域的两个亚基之间形成二硫桥，进一步稳定了二聚体(Carter,J Immunol Methods248,7-15(2001))。

在一个具体的实施方案中，将能够结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块融合(任选地经由能够结合靶细胞抗原的抗原结合模块)至Fc域的第一亚基(其包含“突出”修饰)。不希望受理论束缚，能够结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块与Fc域的含突出的亚基的融合将(进一步)使包含两个能够结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块的抗原结合分子的生成最小化(两条含突出的多肽的空间碰撞)。

在一个备选的实施方案中，促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰包含介导静电操纵效应(electrostatic steering effect)的修饰，例如如记载于PCT公开文本WO2009/089004的。一般地，此方法涉及将在两个Fc域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而在静电上不利于同二聚体形成而在静电上有利于异二聚化。

降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰

Fc域赋予T细胞活化性双特异性抗原结合分子以有利的药动学特性，包括长血清半衰期，其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而，同时它可能导致不想要的T细胞活化性双特异性抗原结合分子对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。此外，Fc受体信号传导途径的共激活可能导致细胞因子释放，其与抗原结合分子的T细胞活化性特性以及长半衰期组合，在系统性施用后引起细胞因子受体的过度激活和严重的副作用。(携带Fc受体的)免疫细胞而非T细胞的活化甚至会降低T细胞活化性双特异性抗原结合分子的功效，原因是例如通过NK细胞对T细胞的潜在破坏。

因而，在具体的实施方案中，相比于天然IgG₁Fc域，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域展现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个这类实施方案中，所述Fc域(或包含所述Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)相比于天然IgG₁Fc域(或包含所述天然IgG₁Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)展现出低于50%，优选低于20%，更优选低于10%且最优选低于5%的对Fc受体的结合亲和力，和/或相比于天然IgG₁Fc域(或包含所述天然IgG₁Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)展现出低于50%，优选低于20%，更优选低于10%且最优选低于5%的效应器功能。在一个实施方案中，所述Fc域(或包含所述Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)不实质性结合Fc受体和/或诱导效应器功能。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中，所述Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地为人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体为人FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应器功能是选自下组的一种或多种：CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中，所述效应器功能是ADCC。在一个实施方案中，相比于天然IgG₁Fc域，所述Fc域展现出基本类似的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc域(或包含所述Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)展现出超过约70%，具体为超过约80%，更具体超过约90%的天然IgG₁Fc域(或包含天然IgG₁Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力时实现基本类似的对FcRn的结合。

在某些实施方案中，相比于非工程化Fc域，Fc域工程化改造为具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在具体的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常，Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变降低Fc域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，所述氨基酸突变将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍、或至少10倍。在有超过一处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍、或甚至至少50倍。在一个实施方案中，包含工程化Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子相比于包含非工程化Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子展现出低于20%，特别是低于10%，更特别地低于5%的对Fc受体的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中，所述Fc受体是人Fc受体。在一些实施方案中，Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中，Fc受体是活化性人Fcγ受体，更特定地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定地是人FcγRIIIa。优选地，对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些实施方案中，对补体成分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc域(或包含所述Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)展现出Fc域的非工程化形式(或包含所述Fc域的非工程化形式的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的超过约70%时实现基本类似的对FcRn的结合，即保留该Fc域对所述受体的结合亲和力。Fc域或包含所述Fc域的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以展现出高于约80%和甚至高于约90%的这类亲和力。在某些实施方案中，相比于非工程化Fc域，Fc域工程化改造为具有降低的效应器功能。所述降低的效应器功能可包括但不限于下列一种或多种：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、降低的细胞因子分泌、降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、降低的对NK细胞的结合、降低的对巨噬细胞的结合、降低的对单核细胞的结合、降低的对多形核细胞的结合、降低的诱导凋亡的直接信号传导、降低的靶物结合的抗体的交联、降低的树突细胞成熟或降低的T细胞启动。在一个实施方案中，所述降低的效应器功能是选自下组的一项或多项：降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和降低的细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中，所述降低的效应器功能是降低的ADCC。在一个实施方案中，所述降低的ADCC小于由非工程化Fc域(或包含非工程化Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)诱导的ADCC的20%。

在一个实施方案中，所述降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施方案中，Fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸取代：E233、L234、L235、N297、P331和P329。在一个更特定的实施方案中，Fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸取代：L234、L235和P329。在一些实施方案中，Fc域包含氨基酸取代L234A和L235A。在一个这类实施方案中，Fc域是IgG₁Fc域，具体是人IgG₁Fc域。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸取代。在一个更特定的实施方案中，氨基酸取代是P329A或P329G，特别是P329G。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸取代和另一个在选自以下位置处的氨基酸取代：E233、L234、L235、N297和P331。在一个更特定的实施方案中，另外的氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在具体的实施方案中，所述Fc域包含在位置P329、L234和L235处的氨基酸取代。在更具体的实施方案中，Fc域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329GLALA”)。在一个这类实施方案中，Fc域是IgG₁Fc域，具体是人IgG₁Fc域。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG₁Fc域的Fcγ受体结合，如记载于PCT专利申请no。PCT/EP2012/055393的，其通过提述完整并入本文。PCT/EP2012/055393还描述了制备这类突变体Fc域的方法和用于测定其特性如Fc受体结合或效应器功能的方法。

相比于IgG₁抗体，IgG₄抗体展现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因此，在一些实施方案中，本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域是IgG₄Fc域，具体是人IgG₄Fc域。在一个实施方案中，所述IgG₄Fc域包含在位置S228处的氨基酸取代，具体为氨基酸取代S228P。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应器功能，在一个实施方案中，所述IgG₄Fc域包含在位置L235处的氨基酸取代，具体为氨基酸取代L235E。在另一个实施方案中，所述IgG₄Fc域包含在位置P329处的氨基酸取代，具体为氨基酸取代P329G。在一个具体的实施方案中，所述IgG₄Fc域包含在位置S228、L235和P329处的氨基酸取代，具体为氨基酸取代S228P、L235E和P329G。这类IgG₄Fc域突变体及其Fcγ受体结合特性记载于PCT专利申请no.PCT/EP2012/055393，其通过提述完整并入本文。

在一个具体的实施方案中，相比于天然IgG₁Fc域展现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能的Fc域是包含氨基酸取代L234A、L235A和任选地P329G的人IgG₁Fc域，或包含氨基酸取代S228P、L235E和任选地P329G的人IgG₄Fc域。

在某些实施方案中，已消除Fc域的N-糖基化。在一个这类实施方案中，所述Fc域包含在位置N297处的氨基酸突变，特别是通过丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸取代。

除了上文和PCT专利申请no.PCT/EP2012/055393中描述的Fc域外，具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有Fc域残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的Fc域(美国专利No.6,737,056)。这类Fc突变体包括具有在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个处的取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其具有残基265和297到丙氨酸的取代(美国专利No.7,332,581)。

可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变体Fc区。遗传方法可以包括编码DNA序列的位点专一性诱变、PCR、基因合成等。正确的核苷酸变化可以通过例如测序来验证。

可以容易地测定对Fc受体的结合，例如通过ELISA或通过使用标准仪器如BIAcore仪(GE Healthcare)的表面等离振子共振(SPR)进行，并且Fc受体诸如可通过重组表达获得。本文中描述了合适的这类结合测定法。或者，可使用已知表达特定Fc受体的细胞系，如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来估测Fc域或包含Fc域的细胞活化性双特异性抗原结合分子对Fc受体的的结合亲和力。

可通过本领域中已知的方法来测量Fc域或包含Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的效应器功能。本文中描述了用于测量ADCC的合适的测定法。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其他例子记载于美国专利No.5,500,362;Hellstrom等，ProcNatl Acad Sci USA83,7059-7063(1986)和Hellstrom等,Proc Natl Acad Sci USA82,1499-1502(1985);美国专利No.5,821,337;Bruggemann等,J Exp Med166,1351-1361(1987)。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。对于这类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，如披露于Clynes等,Proc Natl Acad Sci USA95,652-656(1998)的。

在一些实施方案中，Fc域对补体成分，特别是对C1q的结合是降低的。因而，在其中Fc域工程化为具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可实施C1q结合测定法来测定T细胞活化性双特异性抗原结合分子是否能结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro等,J ImmunolMethods202,163(1996);Cragg等,Blood101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie,Blood103,2738-2743(2004))。

抗原结合模块

本发明的抗原结合分子是双特异性的，即它包含至少两种能够特异性结合两种不同抗原性决定簇的抗原结合模块。依照本发明，所述抗原结合模块是Fab分子(即由各自包含可变区和恒定区的重链和轻链构成的抗原结合域)。在一个实施方案中，所述Fab分子是人的。在另一个实施方案中，所述Fab分子是人源化的。在再一个实施方案中，所述Fab分子包含人重链和轻链恒定区。

至少一个抗原结合模块是单链Fab分子或交换Fab分子。这类修饰防止来自不同Fab分子的重链和轻链的错误配对，由此改进了重组生产中本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的产率和纯度。在可用于本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的具体的单链Fab分子中，Fab轻链的C端通过肽接头连接于Fab重链的N端。所述肽接头允许Fab重链和轻链的排列以形成功能性抗原结合模块。适用于连接Fab重链和轻链的肽接头包括例如(G₄S)₆-GG(SEQ ID NO:152)或(SG₃)₂-(SEG₃)₄-(SG₃)-SG(SEQ ID NO:153)。在可用于本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的具体的交换Fab分子中，Fab轻链和Fab重链的恒定区是交换的。在可用于本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子的另一种交换Fab分子中，Fab轻链和Fab重链的可变区是交换的。

在依照本发明的一个具体的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够同时结合靶细胞抗原(特别是肿瘤细胞抗原)和活化性T细胞抗原。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够通过同时结合靶细胞抗原和活化性T细胞抗原来交联T细胞和靶细胞。在一个甚至更具体的实施方案中，这类同时结合导致靶细胞特别是肿瘤细胞的裂解。在一个实施方案中，这类同时结合导致T细胞的活化。在其他实施方案中，这类同时结合导致T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的细胞应答，其选自下组：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子对活化性T细胞抗原的结合而不同时结合靶细胞抗原不导致T细胞活化。

在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够将T细胞的细胞毒性活性重定向于靶细胞。在一个具体的实施方案中，所述重定向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。

具体地，依照本发明任一实施方案的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是CD4⁺或CD8⁺T细胞，具体为CD8⁺T细胞。

活化性T细胞抗原结合模块

本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个能够结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块(本文中亦称为“活化性T细胞抗原结合模块”)。在一个具体的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不超过一个能够特异性结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子提供对活化性T细胞抗原的单价结合。所述活化性T细胞抗原结合模块可以是常规Fab分子或经修饰的Fab分子，即单链或交换Fab分子。在其中有T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含的超过一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块的实施方案中，能够特异性结合活化性T细胞抗原的抗原结合模块优选为经修饰的Fab分子。

在一个具体的实施方案中，所述活化性T细胞抗原是CD3，具体是人CD3(SEQ IDNO:265)或猕猴CD3(SEQ ID NO:266)，最特别是人CD3。在一个具体的实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块对于人和猕猴CD3是交叉反应性的(即特异性结合)。在一些实施方案中，所述活化性T细胞抗原是CD3的ε亚基。

在一个实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块能与单克隆抗体H2C(记载于PCT公开文本no.WO2008/119567)竞争对CD3表位的结合。在另一个实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块能与单克隆抗体V9(记载于Rodrigues等,Int J Cancer Suppl7,45-50(1992)和美国专利no.6,054,297)竞争对CD3表位的结合。在再一个实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块能与单克隆抗体FN18(记载于Nooij等,Eur J Immunol19,981-984(1986))竞争对CD3表位的结合。在一个具体的实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块能与单克隆抗体抗体SP34(记载于Pessano等,EMBO J4,337-340(1985))竞争对CD3表位的结合。在一个实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块与单克隆抗体SP34结合相同的CD3表位。在一个实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块包含SEQ ID NO:163的重链CDR1、SEQ ID NO:165的重链CDR2、SEQ ID NO:167的重链CDR3、SEQ ID NO:171的轻链CDR1、SEQ ID NO:173的轻链CDR2和SEQ ID NO:175的轻链CDR3。在一个别的实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块包含与SEQ ID NO:169至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列，和与SEQ ID NO:177至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。

在一个具体的实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块包含SEQ ID NO:249的重链CDR1、SEQ ID NO:251的重链CDR2、SEQ ID NO:253的重链CDR3、SEQ ID NO:257的轻链CDR1、SEQ ID NO:259的轻链CDR2和SEQ ID NO:261的轻链CDR3。在一个实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块能与包含如下的抗原结合模块竞争对CD3表位的结合，所述抗原结合模块包含SEQ ID NO:249的重链CDR1、SEQ ID NO:251的重链CDR2、SEQ ID NO:253的重链CDR3、SEQID NO:257的轻链CDR1、SEQ ID NO:259的轻链CDR2和SEQ ID NO:261的轻链CDR3。在一个实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块与如下的抗原结合模块结合相同的CD3表位，所述抗原结合模块包含SEQ ID NO:249的重链CDR1、SEQ ID NO:251的重链CDR2、SEQ ID NO:253的重链CDR3、SEQ ID NO:257的轻链CDR1、SEQ ID NO:259的轻链CDR2和SEQ ID NO:261的轻链CDR3。在一个别的实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块包含与SEQ ID NO:255至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列，和与SEQ ID NO:263至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块能与如下的抗原结合模块竞争对CD3表位的结合，所述抗原结合模块包含SEQ ID NO:255的重链可变区序列和SEQ ID NO:263的轻链可变区序列。在一个实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块结合与如下的抗原结合模块结合相同的CD3表位，所述抗原结合模块包含SEQ ID NO:255的重链可变区序列和SEQ ID NO:263的轻链可变区序列。在另一个实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块包含SEQ ID NO:255的重链可变区序列的人源化型式和SEQ ID NO:263的轻链可变区序列的人源化型式。在一个实施方案中，活化性T细胞抗原结合模块包含SEQ ID NO:249的重链CDR1、SEQ ID NO:251的重链CDR2、SEQ ID NO:253的重链CDR3、SEQ ID NO:257的轻链CDR1、SEQID NO:259的轻链CDR2和SEQ ID NO:261的轻链CDR3，以及人重链和轻链可变区框架序列。

靶细胞抗原结合模块

本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个能够结合靶细胞抗原的抗原结合模块(本文中亦称为“靶细胞抗原结合模块”)。在某些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含两个能够结合靶细胞抗原的抗原结合模块。在一个具体的这类实施方案中，这些抗原结合模块中的每一个特异性结合相同抗原性决定簇。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含能够特异性结合靶细胞抗原的免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不超过两个能够结合靶细胞抗原的抗原结合模块。

所述靶细胞抗原结合模块通常是结合特定的抗原性决定簇且能够将T细胞活化性双特异性抗原结合分子引导至靶部位，例如携带抗原性决定簇的特定类型肿瘤细胞的Fab分子。

在某些实施方案中，所述靶细胞抗原结合模块针对与病理学状况有关的抗原，如肿瘤细胞或病毒感染细胞上呈现的抗原。合适的抗原是细胞表面抗原，例如但不限于细胞表面受体。在具体的实施方案中，所述抗原是人抗原。在一个特定的实施方案中，所述靶细胞抗原选自下组：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20和CD33。

在具体的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个特异于黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)的抗原结合模块。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个，通常两个或更多个能与单克隆抗体LC007(见SEQ ID NO75和83，和欧洲专利申请no.EP11178393.2，其通过提述完整并入本文)竞争对MCSP表位的结合的抗原结合模块。在一个实施方案中，所述特异于MCSP的抗原结合模块包含SEQ ID NO:69的重链CDR1、SEQ ID NO:71的重链CDR2、SEQ ID NO:73的重链CDR3、SEQID NO:77的轻链CDR1、SEQ ID NO:79的轻链CDR2和SEQ ID NO:81的轻链CDR3。在一个别的实施方案中，所述特异于MCSP的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:75至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:83至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。在具体的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个，通常两个或更多个能与单克隆抗体M4-3ML2(见SEQ ID NO239和247，和欧洲专利申请no.EP11178393.2，其通过提述完整并入本文)竞争对MCSP表位的结合的抗原结合模块。在一个实施方案中，所述特异于MCSP的抗原结合模块与单克隆抗体M4-3ML2结合相同的MCSP表位。在一个实施方案中，所述特异于MCSP的抗原结合模块包含SEQ ID NO:233的重链CDR1、SEQ ID NO:235的重链CDR2、SEQ ID NO:237的重链CDR3、SEQ ID NO:241的轻链CDR1、SEQ ID NO:243的轻链CDR2和SEQ ID NO:245的轻链CDR3。在一个别的实施方案中，所述特异于MCSP的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:239至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，特别是约98%、99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:247至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，特别是约98%、99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述特异于MCSP的抗原结合模块包含单克隆抗体M4-3ML2的亲和力成熟型式的重链和轻链可变区序列。在一个实施方案中，所述特异于MCSP的抗原结合模块包含SEQID NO:239的重链可变区序列及1处、2处、3处、4处、5处、6处或7处，特别是2处、3处、4处或5处氨基酸取代；和SEQ ID NO:247的轻链可变区序列及1处、2处、3处、4处、5处、6处或7处，特别是2处、3处、4处或5处氨基酸取代。可变区序列内的任何氨基酸残基均可用不同的氨基酸取代，包括在CDR区内的氨基酸残基，只要保留对MCSP，特别是人MCSP的结合。优选的变体是具有的对MCSP的结合亲和力至少等于(或强于)包含未取代可变区序列的抗原结合模块的结合亲和力的那些变体。

在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:1的多肽序列、SEQ ID NO:3的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个别的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:7的多肽序列、SEQ ID NO:9的多肽序列和SEQ ID NO:11的多肽序列，或其保留功能性的变体。在又一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:13的多肽序列、SEQ ID NO:15的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序列，或其保留功能性的变体。在再一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:17的多肽序列、SEQ IDNO:19的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:21的多肽序列、SEQ ID NO:23的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序列，或其保留功能性的变体。仍在另一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:25的多肽序列、SEQ ID NO:27的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:29的多肽序列、SEQ ID NO:31的多肽序列、SEQ ID NO:33的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:29的多肽序列、SEQ ID NO:3的多肽序列、SEQ ID NO:33的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ IDNO:35的多肽序列、SEQ ID NO:3的多肽序列、SEQ ID NO:37的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:39的多肽序列、SEQ ID NO:3的多肽序列、SEQ ID NO:41的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序列，或其保留功能性的变体。在又一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:29的多肽序列、SEQ ID NO:3的多肽序列、SEQ IDNO:5的多肽序列和SEQ ID NO:179的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:5的多肽序列、SEQ ID NO:29的多肽序列、SEQ ID NO:33的多肽序列和SEQ ID NO:181的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:5的多肽序列、SEQ ID NO:23的多肽序列、SEQ ID NO:183的多肽序列和SEQ ID NO:185的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:5的多肽序列、SEQ ID NO:23的多肽序列、SEQ ID NO:183的多肽序列和SEQ IDNO:187的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:33的多肽序列、SEQ ID NO:189的多肽序列、SEQ ID NO:191的多肽序列和SEQ ID NO:193的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:183的多肽序列、SEQ ID NO:189的多肽序列、SEQ ID NO:193的多肽序列和SEQ ID NO:195的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:189的多肽序列、SEQ ID NO:193的多肽序列、SEQ ID NO:199的多肽序列和SEQ ID NO:201的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:5的多肽序列、SEQ ID NO:23的多肽序列、SEQ ID NO:215的多肽序列和SEQ ID NO:217的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:5的多肽序列、SEQ ID NO:23的多肽序列、SEQ IDNO:215的多肽序列和SEQ ID NO:219的多肽序列，或其保留功能性的变体。

在一个特定的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同：SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:82,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:234,SEQ IDNO:236,SEQ ID NO:238,SEQ ID NO:240,SEQ ID NO:242,SEQ ID NO:244,SEQ ID NO:246,SEQ ID NO:248,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ IDNO:34,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:180,SEQID NO:182,SEQ ID NO:184,SEQ ID NO:186,SEQ ID NO:188,SEQ ID NO:190,SEQ ID NO:192,SEQ ID NO:194,SEQ ID NO:196,SEQ ID NO:200,SEQ ID NO:202,SEQ ID NO:216,SEQID NO:218和SEQ ID NO:220。

在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个特异于表皮生长因子受体(EGFR)的抗原结合模块。在另一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个，通常两个或更多个能与单克隆抗体GA201竞争对EGFR表位的结合的抗原结合模块。参见PCT公开文本WO2006/082515，其通过提述完整并入本文。在一个实施方案中，所述特异于EGFR的抗原结合模块包含SEQ ID NO:85的重链CDR1、SEQ IDNO:87的重链CDR2、SEQ ID NO:89的重链CDR3、SEQ ID NO:93的轻链CDR1、SEQ ID NO:95的轻链CDR2和SEQ ID NO:97的轻链CDR3。在一个别的实施方案中，所述特异于EGFR的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:91至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:99至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。

在又一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:43的多肽序列、SEQ ID NO:45的多肽序列和SEQ ID NO:47的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个别的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:49的多肽序列、SEQ ID NO:51的多肽序列和SEQ ID NO:11的多肽序列，或其保留功能性的变体。在又一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:53的多肽序列、SEQ ID NO:45的多肽序列和SEQ ID NO:47的多肽序列，或其保留功能性的变体。

在一个特定的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同：SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:44,SEQ IDNO:46,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:12。

在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个特异于成纤维细胞活化蛋白(FAP)的抗原结合模块。在另一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个，通常两个或更多个能与单克隆抗体3F2竞争对FAP表位的结合的抗原结合模块。参见PCT公开文本WO WO2012/020006，其通过提述完整并入本文。在一个实施方案中，所述特异于FAP的抗原结合模块包含SEQ ID NO:101的重链CDR1、SEQID NO:103的重链CDR2、SEQ ID NO:105的重链CDR3、SEQ ID NO:109的轻链CDR1、SEQ IDNO:111的轻链CDR2和SEQ ID NO:113的轻链CDR3。在一个别的实施方案中，所述特异于FAP的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:107至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:115至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留有功能性的变体。

在又一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:55的多肽序列、SEQ ID NO:51的多肽序列和SEQ ID NO:11的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个别的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:57的多肽序列、SEQ ID NO:59的多肽序列和SEQ ID NO:61的多肽序列，或其保留功能性的变体。

在一个特定的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同：SEQ IDNO:102,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:114,SEQ ID NO:116,SEQ ID NO:56,SEQID NO:58,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:12。

在具体的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个特异于癌胚抗原(CEA)的抗原结合模块。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个，通常两个或更多个能与单克隆抗体BW431/26(记载于欧洲专利no.EP160897和Bosslet等,Int J Cancer36,75-84(1985))竞争对CEA表位的结合的抗原结合模块。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个，通常两个或更多个能与单克隆抗体CH1A1A(见SEQ ID NO123和131)竞争对CEA表位的结合的抗原结合模块。参见PCT专利公开号WO2011/023787，其通过提述完整并入本文。在一个实施方案中，所述特异于CEA的抗原结合模块与单克隆抗体CH1A1A结合相同的CEA表位。在一个实施方案中，所述特异于CEA的抗原结合模块包含SEQ ID NO:117的重链CDR1、SEQ ID NO:119的重链CDR2、SEQ ID NO:121的重链CDR3、SEQ ID NO:125的轻链CDR1、SEQ ID NO:127的轻链CDR2和SEQ ID NO:129的轻链CDR3。在一个别的实施方案中，所述特异于CEA的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:123至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同，特别是约98%、99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:131至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同，特别是约98%、99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述特异于CEA的抗原结合模块包含单克隆抗体CH1A1A的亲和力成熟型式的重链和轻链可变区序列。在一个实施方案中，所述特异于CEA的抗原结合模块包含SEQ ID NO:123的重链可变区序列且具有1处、2处、3处、4处、5处、6处或7处，特别是2处、3处、4处或5处氨基酸取代；和SEQ ID NO:131的轻链可变区序列且具有1处、2处、3处、4处、5处、6处或7处，特别是2处、3处、4处或5处氨基酸取代。可变区序列内的任何氨基酸残基均可被不同的氨基酸取代，这包括在CDR区内的氨基酸残基，只要保留对CEA，特别是人CEA的结合。优选的变体是具有的对CEA的结合亲和力至少等于(或强于)包含未取代可变区序列的抗原结合模块的结合亲和力的那些变体。

在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:63的多肽序列、SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ ID NO:67的多肽序列和SEQ ID NO:33的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ ID NO:67的多肽序列、SEQ ID NO:183的多肽序列和SEQ ID NO:197的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:183的多肽序列、SEQ ID NO:203的多肽序列、SEQID NO:205的多肽序列和SEQ ID NO:207的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:183的多肽序列、SEQ IDNO:209的多肽序列、SEQ ID NO:211的多肽序列和SEQ ID NO:213的多肽序列，或其保留功能性的变体。

在一个特定的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同：SEQ ID NO:118,SEQ ID NO:120,SEQ ID NO:122,SEQ IDNO:124,SEQ ID NO:126,SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:132,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:184,SEQ ID NO:198,SEQ ID NO:204,SEQ ID NO:206,SEQ ID NO:208,SEQ ID NO:210,SEQ ID NO:212和SEQ ID NO:214。

在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个特异于CD33的抗原结合模块。在一个实施方案中，所述特异于CD33的抗原结合模块包含SEQ IDNO:133的重链CDR1、SEQ ID NO:135的重链CDR2、SEQ ID NO:137的重链CDR3、SEQ ID NO:141的轻链CDR1、SEQ ID NO:143的轻链CDR2和SEQ ID NO:145的轻链CDR3。在一个别的实施方案中，所述特异于CD33的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:139至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:147至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。

在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:33的多肽序列、SEQ ID NO:213的多肽序列、SEQ ID NO:221的多肽序列和SEQ ID NO:223的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:33的多肽序列、SEQ ID NO:221的多肽序列、SEQ ID NO:223的多肽序列和SEQ ID NO:225的多肽序列，或其保留功能性的变体。

在一个特定的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同：SEQ ID NO:134,SEQ ID NO:136,SEQ ID NO:138,SEQ IDNO:140,SEQ ID NO:142,SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:146,SEQ ID NO:148,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:214,SEQ ID NO:222,SEQ ID NO:224和SEQ ID NO:226。

多核苷酸

本发明还提供分离的多核苷酸，其编码如本文中描述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段。

本发明的多核苷酸包括那些与以下所列序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多核苷酸：SEQ ID NO2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,78,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,100,102,104,106,108,110,112,114,116,118,120,122,124,126,128,130,132,134,136,138,140,142,144,146,148,164,166,168,170,172,174,176,178,180,182,184,186,188,190,192,194,196,198,200,202,204,206,208,210,212,214,216,218,220,222,224,226,228,230,232,234,236,238,240,242,244,246,248,250,252,254,256,258,260,262和264，包括其功能性片段或变体。

可以将编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸以编码完整T细胞活化性双特异性抗原结合分子的单一多核苷酸表达，或以共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性T细胞活化性双特异性抗原结合分子。例如，抗原结合模块的轻链部分可与T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含抗原结合模块重链部分、Fc域亚基和任选地(部分的)另一个抗原结合模块的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽联合以形成抗原结合模块。在另一个例子中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含两个Fc域亚基之一和任选地(部分的)一个或多个抗原结合模块的部分可与T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含两个Fc域亚基中另一个和任选地(部分的)抗原结合模块的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，所述Fc域亚基将联合以形成Fc域。

在某些实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的片段，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含第一和第二抗原结合模块，和由两个亚基组成的Fc域，其中第一抗原结合模块是单链Fab分子。在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码第一抗原结合模块和Fc域的亚基。在一个更特定的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码如下的多肽，其中单链Fab分子与Fc域亚基共享羧基端肽键。在另一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码第二抗原结合模块的重链和Fc域的亚基。在更具体的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab重链与Fc域亚基共享羧基端肽键。在又一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码第一抗原结合模块、第二抗原结合模块的重链和Fc域的亚基。在一个更特定的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中单链Fab分子与Fab重链共享羧基端肽键，所述Fab重链继而与Fc域亚基共享羧基端肽键。

在某些实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的片段，该T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含第一和第二抗原结合模块，和由两个亚基组成的Fc域，其中第一抗原结合模块是交换Fab分子。在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码第一抗原结合模块的重链和Fc域的亚基。在一个更特定的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab重链恒定区继而与Fc域亚基共享羧基端肽键。在另一个特定的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab轻链恒定区继而与Fc域亚基共享羧基端肽键。在另一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码第二抗原结合模块的重链和Fc域的亚基。在一个更特定的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab重链与Fc域亚基共享羧基端肽键。在又一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码第一抗原结合模块的重链、第二抗原结合模块的重链和Fc域的亚基。在一个更特定的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab重链恒定区继而与Fab重链共享羧基端肽键，所述Fab重链继而与Fc域亚基共享羧基端肽键。在另一个特定的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab轻链恒定区继而与Fab重链共享羧基端肽键，所述Fab重链继而与Fc域亚基共享羧基端肽键。在再一个特定的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab重链与Fab轻链可变区共享羧基端肽键，所述Fab轻链可变区继而与Fab重链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab重链恒定区继而与Fc域亚基共享羧基端肽键。仍在另一个特定的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab重链与Fab重链可变区共享羧基端肽键，所述Fab重链可变区继而与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab轻链恒定区继而与Fc域亚基共享羧基端肽键。

在别的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码第三抗原结合模块的重链和Fc域的亚基。在一个更特定的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab重链与Fc域亚基共享羧基端肽键。

在别的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码抗原结合模块轻链。在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定区共享羧基端肽键。在其他实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键。仍在其他实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码第一抗原结合模块的轻链和第二抗原结合模块的轻链。在一个更特定的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab重链可变区与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab轻链恒定区继而与Fab轻链共享羧基端肽键。在另一个特定的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab轻链与Fab重链可变区共享羧基端肽键，所述Fab重链可变区继而与Fab轻链恒定区共享羧基端肽键。在再一个特定的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab轻链可变区与Fab重链恒定区共享羧基端肽键，所述Fab重链恒定区继而与Fab轻链共享羧基端肽键。在又一个特定的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码多肽，其中Fab轻链与Fab轻链可变区共享羧基端肽键，所述Fab轻链可变区继而与Fab重链恒定区共享羧基端肽键。

在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如以下显示的可变区序列的序列：SEQ ID NO75,83,91,99,107,115,123,131,139,147,169,177,239,247,255和263.在另一个实施方案中，本发明涉及编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如以下显示的多肽序列的序列：SEQ ID NO1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,179,181,183,185,187,189,191,193,195,197,199,201,203,205,207,209,211,213,215,217,219,221,223,225,227,229和231。在另一个实施方案中，本发明进一步涉及编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与以下显示的核苷酸序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%相同的序列：SEQ ID NO2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,78,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,100,102,104,106,108,110,112,114,116,118,120,122,124,126,128,130,132,134,136,138,140,142,144,146,148,164,166,168,170,172,174,176,178,180,182,184,186,188,190,192,194,196,198,200,202,204,206,208,210,212,214,216,218,220,222,224,226,228,230,232,234,236,238,240,242,244,246,248,250,252,254,256,258,260,262或264。在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含以下显示的核酸序列：SEQ ID NO2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,78,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,100,102,104,106,108,110,112,114,116,118,120,122,124,126,128,130,132,134,136,138,140,142,144,146,148,164,166,168,170,172,174,176,178,180,182,184,186,188,190,192,194,196,198,200,202,204,206,208,210,212,214,216,218,220,222,224,226,228,230,232,234,236,238,240,242,244,246,248,250,252,254,256,258,260,262或264。在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与以下的氨基酸序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%相同的可变区序列：SEQ ID NO75,83,91,99,107,115,123,131,139,147,169,177,239,247,255或263。在另一个实施方案中，本发明涉及编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与以下的氨基酸序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%相同的多肽序列的序列：SEQ ID NO1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,179,181,183,185,187,189,191,193,195,197,199,201,203,205,207,209,211,213,215,217,219,221,223,225,227,229或231。本发明涵盖编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO75,83,91,99,107,115,123,131,139,147,169,177,239,247,255或263的可变区序列及保守性氨基酸取代的序列。本发明还涵盖编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码以下多肽序列及保守性氨基酸取代的序列：SEQ ID NO1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,179,181,183,185,187,189,191,193,195,197,199,201,203,205,207,209,211,213,215,217,219,221,223,225,227,229或231。

在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。

重组方法

可以获得本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，例如通过固相肽合成(例如Merrifield固相肽合成)或重组生成进行。对于重组生成，分离一种或多种编码所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸(例如如上文描述的)，并将其插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易分离并测序这类多核苷酸。在一个实施方案中，提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体(优选为表达载体)。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如记载于Maniatis等,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989);和Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associatesand Wiley Interscience,N.Y(1989)的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒，其中在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中克隆编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸(即编码区)。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但可将其视为编码区的一部分(若存在的话)，但任何侧翼序列例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5’和3’非翻译区等，不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中(例如单一载体上)，或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋白质。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊化的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得该基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制下时，即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mRNA的转录并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导该基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(如多肽编码区和与其联合的启动子)为“可操作联合的”。如此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么该启动子区将是与该核酸可操作联合。所述启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预先确定的细胞中指导DNA的实质性转录。除启动子以外，其它转录控制元件例如增强子、操纵基因、阻遏物和转录终止信号能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子，以及内含子-A)、猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和家兔β球蛋白衍生的，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及自病毒系统衍生的元件(具体地，内部核糖体进入位点或IRES，亦称为CITE序列)。表达盒还可以包含其它特征，如复制起点和/或染色体整合元件，如逆转录病毒长末端重复(LTR)或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。

本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子，那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的核酸上游。依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生长的蛋白质链跨越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌性或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。分泌性信号肽的例示性氨基酸和多核苷酸序列在SEQ ID NO154-162给出。

可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记T细胞活化性双特异性抗原结合分子的短蛋白序列的DNA纳入T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)编码多核苷酸内或其末端。

在一个别的实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个这类实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已用该载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子(的部分)的多核苷酸。如本文中使用的，术语“宿主细胞”指任何能工程化以生成本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的细胞系统种类。适用于复制并支持T细胞活化性双特异性抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时，可用特定的表达载体转染或转导这类细胞，并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成多肽，尤其在不需要糖基化时。在表达后，可以将多肽在可溶性级分中从细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合编码多肽的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化模式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,NatBiotech22,1409-1414(2004)，和Li等,Nat Biotech24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如记载于Graham等,J Gen Virol36,59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如记载于Mather,Biol Reprod23,243-251(1980)的)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、猕猴肾细胞(MDCK)，buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如例如记载于Mather等,Annals N.Y.Acad Sci383,44-68(1982)的)、MRC5细胞和FS4细胞。其它可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等,Proc Natl Acad Sci USA77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选为哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。

本领域中已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含抗原结合域如抗体的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一抗体链，从而使得表达的产物是具有重链和轻链两者的抗体。

在一个实施方案中，提供了生成依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，其中所述方法包括在适合于所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子表达的条件下培养包含编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸的宿主细胞(如本文中提供的)，并从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子。

所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分彼此遗传融合。T细胞活化性双特异性抗原结合分子可设计为使其组分直接彼此融合或经由接头序列间接融合。可依照本领域中公知的方法测定接头的组成和长度，并可以测试功效。T细胞活化性双特异性抗原结合分子不同组分之间的接头序列的例子见于本文中提供的序列。还包含另外的序列以纳入切割位点来分开融合的各个组分(若期望的话)，例如内肽酶识别序列。

在某些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个或多个抗原结合模块至少包含能结合抗原性决定簇的抗体可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分和自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域中公知的(参见例如Harlow和Lane,“Antibodies,a laboratory manual”,Cold Spring HarborLaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成构建生成，可以重组生成(例如如记载于美国专利No.4,186,567的)或可通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合库获得(参见例如McCafferty的美国专利No.5,969,108)。

可以将抗体、抗体片段、抗原结合域或可变区的任何动物种类用于本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。可用于本发明的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合域或可变区可以是鼠、灵长类或人起源的。如果T细胞活化性双特异性抗原结合分子意图供人使用，那么可以使用嵌合形式的抗体，其中抗体的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上，保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上，或(c)移植完整的非人可变域，但通过替换表面残基用人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化的抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson,Front Biosci13,1619-1633(2008)，并且还记载于例如Riechmann等,Nature332,323-329(1988);Queen等,Proc Natl Acad Sci USA86,10029-10033(1989);美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409;Jones等,Nature321,522-525(1986);Morrison等,Proc Natl Acad Sci81,6851-6855(1984);Morrison和Oi,AdvImmunol44,65-92(1988);Verhoeyen等,Science239,1534-1536(1988);Padlan,MolecImmun31(3),169-217(1994);Kashmiri等,Methods36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接);Padlan,MolImmunol28,489-498(1991)(描述“表面重建”);Dall’Acqua等,Methods36,43-60(2005)(描述“FR改组”);和Osbourn等,Methods36,61-68(2005)以及Klimka等,Br JCancer83,252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”办法)。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体和人可变区。人抗体一般记载于van Dijk和van de Winkel,CurrOpin Pharmacol5,368-74(2001)以及Lonberg,Curr Opin Immunol20,450-459(2008)。人可变区能形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分和自其衍生(参见例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,New York,1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变区，所述转基因动物已经过修饰以应答抗原激发而生成完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如Lonberg,Nat Biotech23,1117-1125(2005)。还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示库的Fv克隆可变区序列来生成人抗体和人可变区(参见例如Hoogenboom等，于Methods in Molecular Biology178,1-37(O’Brien等编,人Press,Totowa,NJ,2001);和McCafferty等,Nature348,552-554;Clackson等,Nature352,624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。

在某些实施方案中，将可用于本发明的抗原结合模块工程化改造为具有增强的结合亲和力，其依照例如公开于美国专利申请公开文本No.2004/0132066的方法进行，其完整内容通过提述据此并入。可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术来测量本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合特定抗原性决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离振子共振技术(在BIACORE T100系统上分析)(Liljeblad等,Glyco J17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))。可以使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争对特定抗原的结合的抗体、抗体片段、抗原结合域或可变域，例如与V9抗体竞争对CD3的结合的抗体。在某些实施方案中，这类竞争性抗体结合由参照抗体结合的相同表位(例如线性或构象性表位)。用于定位抗体结合的表位的详细的例示性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”于Methodsin Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中，将固定化的抗原(例如CD3)在溶液中温育，所述溶液包含结合该抗原的第一标记抗体(例如V9抗体)和测试其与第一抗体竞争对抗原的结合的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含第一标记抗体但没有第二未标记抗体。在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果与固定化抗原联合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质性降低，那么这指示第二抗体在与第一抗体竞争对抗原的结合。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。

可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，所述技术如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于因素，如净电荷、疏水性、亲水性等，而且对于本领域中的技术人员将是明显的。对于亲和层析纯化，能使用T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以使用连续的蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析来分离T细胞活化性双特异性抗原结合分子，基本如实施例中描述的。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定T细胞活化性双特异性抗原结合分子的纯度，包括凝胶电泳、高压液相层析等。例如，如实施例中所描述的那样表达的重链融合蛋白显示为完整且正确装配的，如通过还原性SDS-PAGE证明的(见例如图2)。在约Mr25,000,Mr50,000和Mr75,000处解析出三条条带，其对应于预测的T细胞活化性双特异性抗原结合分子轻链、重链和重链/轻链融合蛋白的分子量。

测定法

通过本领域中已知的各种测定法，可以鉴定、筛选或表征本文中提供的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的物理/化学特性和/或生物学活性。

亲和力测定法

可以依照实施例中提出的方法使用标准的仪器如BIAcore仪(GE Healthcare)通过表面等离振子共振(SPR)测定T细胞活化性双特异性抗原结合分子对Fc受体或靶抗原的亲和力，而且可以诸如通过重组表达获得受体或靶蛋白。或者，可以例如通过流式细胞术(FACS)，使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估T细胞活化性双特异性抗原结合分子对不同受体或靶抗原的结合。一个用于测量结合亲和力的特定的说明性和例示性实施方案记载于下文和下文实施例。

依照一个实施方案，通过表面等离振子共振使用 T100仪(GEHealthcare)于25℃测量K_D。

为了分析Fc部分与Fc受体之间的相互作用，通过固定化于CM5芯片上的抗五His抗体(Qiagen)来捕捉带His标签的重组Fc受体并将双特异性构建体用作分析物。简言之，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GEHealthcare)依照供应商说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗五His抗体用10mM醋酸钠pH5.0稀释至40μg/ml，接着以5μl/分钟的流速注射以实现约6500响应单位(RU)的偶联蛋白。在注射配体后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。然后，在4或10nM捕捉Fc受体60秒。对于动力学测量，将双特异性构建体的4倍连续稀释液(范围为约500nM至4000nM)在HBS-EP(GE Healthcare,10mMHEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05%表面活性剂P20,pH7.4)中于25℃以约30μl/分钟的流速注射120秒。

为了测定对靶抗原的亲和力，通过固定化于活化CM5传感器芯片表面上的抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare)来捕捉双特异性构建体，如对于抗五-His抗体所描述的。偶联蛋白质的最终量为约12000RU。双特异性构建体在300nM捕捉90秒。使靶抗原在从250至1000nM的浓度范围以30μl/min的流速通过流动池达180秒。监测解离达180秒。

通过扣除在参照流动池上获得的响应来校正批量折射率(bulkrefractiveindex)差异。使用稳定态响应通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合来导出解离常数K_D。使用简单的1对1Langmuir结合模型( T100评估软件版本1.1.1)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(k结合)和解离速率(k_解离)。平衡解离常数(K_D)计算为比率k_解离/k_结合。参见例如Chen等,J Mol Biol293,865-881(1999)。

活性测定法

可以通过各种测定法来测量本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的生物学活性，如实施例中描述的。生物学活性可例如包括诱导T细胞的增殖、诱导T细胞中的信号传导、诱导T细胞中活化标志物的表达、诱导通过T细胞的细胞因子分泌、诱导靶细胞如肿瘤细胞的裂解、和诱导肿瘤消退和/或改善存活。

组合物、配制剂和施用路径

在一个别的方面，本发明提供包含本文中提供的任意一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子的药物组合物，例如用于以下任一种治疗方法。在一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子以及药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子以及至少一种另外的治疗剂，例如如下文描述的。

还提供以适于体内施用的形式生成本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括(a)获得依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，并(b)将所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子与至少一种药学可接受载体配制在一起，由此配制成用于体内施用的T细胞活化性双特异性抗原结合分子制剂。

本发明的药物组合物包含治疗有效量的在药学可接受载体中溶解或分散的一种或多种T细胞活化性双特异性抗原结合分子。短语“药学或药理学可接受的”指在所采用的剂量和浓度一般对接受者无毒性，即在适当时对动物如例如人施用时不产生不利、变应性或其它不当反应的分子实体和组合物。根据本公开，制备含有至少一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子以及任选地另外的活性成分的药物组合物将是本领域技术人员已知的，如由Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990例示的，其通过提述并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，会理解制剂应当满足FDA生物标准部门(FDA Office of Biological Standards)或其它国家的相应机构要求的无菌性、热原性(pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干配制剂或水性溶液。如本文中使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲剂、分散介质、涂料材料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延缓剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂(disintegrationagent)、润滑剂、甜味剂、芳香剂、染料、这类类似的材料及其组合，如本领域普通技术人员将已知的(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack PrintingCompany,1990,pp.1289-1329，通过提述并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，涵盖其在治疗或药物组合物中的使用。

所述组合物可以包含不同类型的载体，这取决于其要以固体、液体还是气雾剂形式施用，以及其对于这类施用路径如注射是否需要是无菌的。可以静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、损伤内、颅内、关节内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肿瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊泡内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、表面(topically)、局部(locally)、通过吸入(例如气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、直接浸洗靶细胞的局部灌注、经由导管、经由灌洗、以乳剂、以液体组合物(例如脂质体)、或通过其它方法或前述项的任意组合施用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(以及任何另外的治疗剂)，如本领域中普通技术人员会知晓的(参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990，通过提述并入本文)。胃肠外施用，特别是静脉内注射，最常用于施用多肽分子如本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。

胃肠外组合物包括那些设计用于通过注射施用，例如皮下、皮内、损伤内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的组合物。对于注射，可以将本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在水性溶液，优选地在生理学相容的缓冲液中配制，所述生理学相容的缓冲液如汉克(Hanks)氏溶液、林格(Ringer)氏溶液或生理学盐水缓冲液。溶液可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以为粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水构成。根据需要，通过将本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以需要的量掺入到具有下文列举的各种其它成分的合适溶剂中来制备无菌可注射溶液。可以容易地实现无菌，例如通过过滤流过无菌过滤膜进行。一般地，通过将各种无菌活性成分掺入到无菌媒介物中来制备分散剂，所述无菌媒介物含有基础分散介质和/或其它成分。在制备无菌可注射溶液、悬液或乳剂的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥或冻冻干燥技术，其将活性成分以及任何另外的期望成分的粉末从其先前无菌过滤的液体介质产生。液体介质在必要时应当是适当缓冲的，并且在用充足的盐水或葡萄糖注射前首先使液体稀释液等张。组合物在制备和贮存条件下必须是稳定的，并且针对微生物如细菌和真菌的污染作用提供保护。会领会的是，应当将内毒素污染最少保持于安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学可接受载体包括但不限于：缓冲剂如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵(hexamethonium chloride)；氯化苯甲烃铵(benzalkonium chloride)；氯化苄乙铵(benzethonium chloride)；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬液可以含有提高悬液粘度的化合物，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。另外，可以将活性化合物的悬液制备为合适的油性注射悬液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯，如乙基cleats或甘油三酯或脂质体。

可以将活性成分在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合作用制备的微囊剂，例如羟甲基纤维素或明胶微囊剂和聚-(甲基丙烯酸酯)微囊剂中，在胶体药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液(macroemulsion)中包载。这类技术披露于Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack PrintingCompany,1990)。可以制备持续释放的制剂。合适的持续释放制剂的例子包括含多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品例如膜或微囊剂的形式。在具体的实施方案中，可以通过在组合物中使用吸收延迟剂如例如单硬脂酸铝、明胶或其组合，来产生可注射组合物的延长吸收。

在先前描述的组合物外，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还可以配制为贮存(depot)制剂。可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用这类长效配制剂。如此，例如所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以用合适的聚合或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶性衍生物，例如微溶性盐。

可以通过常规的混合、溶解、乳化、包囊、包载或冻干过程来制备包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的药物组合物。可以以常规方式配制药物组合物，其使用一种或多种有助于将蛋白质加工成可药学使用的制剂的生理学可接受载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂。合适的配制剂依赖于选择的施用路径。

可以将T细胞活化性双特异性抗原结合分子以游离酸或碱、中性或盐形式配制成组合物。药学可接受盐是基本保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐(acidaddition salt)，例如与蛋白质性组合物的游离氨基基团形成的那些，或与无机酸(如例如氢氯酸或磷酸)或与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基基团形成的盐还可以自无机碱如例如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁；或有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因(procaine)衍生。药用盐倾向于比相应的游离碱形式更可溶于水性溶剂和其它质子溶剂中。

治疗方法和组合物

可以将本文中提供的任一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子用在治疗方法中。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可用作免疫治疗剂，例如在癌症的治疗中。

对于在治疗方法中的使用，将以与优良医学实践一致的方式配制、给药和施用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在此背景中考虑的因素包括治疗的特定病症、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、药剂的投递部位、施用方法、施用时间安排以及医学从业人员已知的其它因素。

在一个方面，提供用作药物的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在别的方面，提供用于治疗疾病的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，本发明提供如本文中描述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，用于治疗有此需要的个体中的疾病。在某些实施方案中，本发明提供T细胞活化性双特异性抗原结合分子，用于治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括对所述个体施用治疗有效量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。在别的实施方案中，本发明提供如本文中描述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。在某些实施方案中，本发明提供T细胞活化性双特异性抗原结合分子，用于在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法，该方法包括对该个体施用有效量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞的裂解。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。

在一个别的方面，本发明提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个别的实施方案中，所述药物用于治疗疾病的方法，该方法包括对患疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在一个实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。在一个别的实施方案中，所述药物用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。仍在别的实施方案中，所述药物用于在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法，所述方法包括对该个体施用有效量的药物以诱导靶细胞的裂解。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。

在一个别的方面，本发明提供用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对患有这类疾病的个体施用治疗有效量的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，对所述个体施用组合物，其包含药学可接受的形式的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。

在一个别的方面，本发明提供一种用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在存在T细胞，特别是细胞毒性T细胞的情况下使靶细胞与本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子接触。在一个别的方面，提供一种用于在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个这类实施方案中，所述方法包括对个体施用有效量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞裂解。在一个实施方案中，“个体”是人。

在某些实施方案中，所述待治疗的疾病是增殖性病症，特别是癌症。癌症的非限制性例子包括膀胱癌、脑癌、头和颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血液癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。其它可使用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子治疗的细胞增殖病症包括但不限于位于下列各项中的新生物：腹部、骨、乳房、消化系统、肝、胰、腹膜、内分泌腺(肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸区、和泌尿生殖系统。还包括癌症前期状况或损伤以及癌症转移。在某些实施方案中，癌症选自下组：肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌、头和颈癌。熟练技术人员容易地认可在许多情况下，T细胞活化性双特异性抗原结合分子可能不提供治愈而仅可以提供部分益处。在一些实施方案中，具有一些益处的生理学变化也被视为治疗有益的。如此，在一些实施方案中，提供生理学变化的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常为哺乳动物，更特定地为人。

在一些实施方案中，对细胞施用有效量的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在其它实施方案中，对个体施用治疗有效量的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以治疗疾病。

为了预防或治疗疾病，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的合适剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用路径、患者的体重、T细胞活化性双特异性抗原结合分子的类型、疾病的严重程度和进程、施用T细胞活化性双特异性抗原结合分子是为了预防还是治疗目的、先前或同时的治疗干预、患者的临床史和对T细胞活化性双特异性抗原结合分子的响应、以及主治医师的判断。负责施用的从业人员将在任何事件中确定组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。本文中涵盖各种给药方案，包括但不限于在各个时间点的单次或多次施用、推注施用、和脉冲输注。

所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子适宜地在一次或一系列治疗里对患者施用。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以是用于对患者施用的起始候选剂量，不管是例如通过一次或多次分开的施用，还是通过连续输注进行。根据上文提及的因素，一种典型的每日剂量的范围可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在数天或更长里的重复施用，根据状况，治疗一般将持续直至发生对疾病症状的期望的抑制。T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一种例示性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其它非限制性例子中，剂量还可包括每次施用从约1微克/kg体重、约5微克/kg体重、约10微克/kg体重、约50微克/kg体重、约100微克/kg体重、约200微克/kg体重、约350微克/kg体重、约500微克/kg体重、约1毫克/kg体重、约5毫克/kg体重、约10毫克/kg体重、约50毫克/kg体重、约100毫克/kg体重、约200毫克/kg体重、约350毫克/kg体重、约500毫克/kg体重，至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可导出的任何范围。在从本文列出的数量可导出的范围的非限制性例子中，基于上文描述的数目，可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重的范围，约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重的范围等。如此，可以对患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。可以间歇地施用这类剂量，例如每周或每3周(例如使得患者接受约2至约20、或例如约6剂的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)。可以施用起始较高的加载剂量，继之以一剂或多剂较低剂量。然而，可以使用其它剂量方案。通过常规技术和测定法容易监测该疗法的进行。

本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子一般将以对于实现意图的目的有效的量使用。对于治疗或预防疾病状况的用途，以治疗有效量施用或应用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子、或其药物组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力以内，尤其根据本文中提供的详细公开内容。

对于系统性施用，能从体外测定法如细胞培养测定法初步估算出治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包含如在细胞培养中测定的IC₅₀的循环浓度范围。可以将此类信息用于更准确地确定人中的可用剂量。

使用本领域中公知的技术，还能从体外数据例如动物模型估算出初始剂量。本领域中的普通技术人员能容易地基于动物数据优化对人的施用。

可以分别调整剂量量和时间间隔以提供足以维持治疗效果的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的血浆水平。通过注射施用的可用患者剂量的范围为从约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。可以通过每日施用多剂实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆中的水平。

在局部施用或选择性摄取的情况中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员会能够在无需过度实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。

本文中描述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的治疗有效剂量一般将提供治疗益处，而不导致实质性毒性。可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学规程来测定T细胞活化性双特异性抗原结合分子的毒性和治疗功效。可以使用细胞培养测定法和动物研究来测定LD₅₀(对50%的群体致命的剂量)和ED₅₀(在50%的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率为治疗指数，其可以表达为LD₅₀/ED₅₀比。优选展现出较大治疗指数的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子展现出高治疗指数。可以将从细胞培养测定法和动物研究获得的数据用来制定适用于人的剂量范围。优选地，剂量处于具有很小或无毒性的循环浓度(包含ED₅₀)的范围内。剂量在此范围内可以随多种因素，例如采用的剂量形式、利用的施用路径、受试者的状况等而变化。鉴于患者的状况，各个内科医生可以选择确切的配制剂、施用路径和剂量(参见例如Fingl等,1975，于：The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1,p.1,通过提述完整并入本文)。

用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子治疗的患者的主治内科医生将知晓如何及何时终止、中断或调整施用(由于毒性、器官功能障碍等)。相反，如果临床应答不适当(排除毒性)，主治内科医生还将知晓如何将治疗调整至更高水平。在感兴趣的病症的管理中的施用剂量的量级将随待治疗状况的严重程度、施用路径等而变化。可以例如部分地通过标准的预后评估方法来评估状况的严重程度。另外，剂量以及可能的给药频率也将随个体患者的年龄、体重和应答而变化。

其它药剂和治疗

本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以与一种或多种其它药剂在疗法中组合施用。例如，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以与治疗至少一种另外的治疗剂共施用。术语“治疗剂”涵盖施用以治疗需要此类治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。这类另外的治疗剂可以包含任何适用于所治疗的特定适应征的任何活性成分，优选地具有不会彼此不利影响的互补活性的那些活性成分。在某些实施方案中，另外的治疗剂是免疫调控剂、细胞抑制剂、细胞粘着的抑制剂、细胞毒剂、细胞凋亡的激活剂、或提高细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂。在一个具体的实施方案中，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏物、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡的激活剂、或抗血管生成剂。

这类其它药剂以对意图目的有效的量适宜地组合存在。这类其它药剂的有效量取决于使用的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的量、病症或治疗的类型以及上文所述其它因素。所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子一般以与本文中描述的相同的剂量和施用路径、或以本文中描述的剂量的约1至99%、或通过凭经验/临床上确定为合适的任何剂量和任何路径使用。

上文记载的这类组合疗法涵盖组合施用(其中在同一组合物或分别的组合物中包含两种或更多种治疗剂)和分开施用，在该情况中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的施用可以在施用另外的治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后发生。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子还可以与放射疗法组合使用。

制品

在本发明的另一个方面，提供含有可用于治疗、预防和/或诊断上文描述的病症的材料的制品。所述制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可从多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器容纳组合物，其自身或与其它组合物组合对于治疗、预防和/或诊断状况是有效的，并且可以具有无菌的存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中至少一种活性成分是本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的状况。此外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性或其它方面治疗剂。本发明的这一实施方案中的制品还可以包含包装插页，其指示该组合物可用于治疗特定状况。或者/另外，所述制品还可以包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。

实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。应理解鉴于上文提供的一般性描述，可以实践各种其他实施方案。

通用方法

重组DNA技术

使用标准方法操作DNA，如Sambrook等,Molecular cloning:A laboratorymanual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中描述的。依照制造商的用法说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白的轻链和重链核苷酸序列的一般信息参见：Kabat,E.A.等,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,NIH Publication No91-3242。

DNA测序

通过双链测序来测定DNA序列。

基因合成

在需要的情况下，期望的基因片段通过使用合适的模板进行PCR来生成或由Geneart AG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成从合成的寡核苷酸和PCR产物合成。在确切基因序列不可得的情况下，基于来自最近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并通过RT-PCR从源自合适组织的RNA分离基因。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆到标准的克隆/测序载体中。从经转化的细菌纯化质粒DNA，并通过UV分光术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。基因片段设计为具有合适的限制性位点以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计为具有编码前导肽的5’端DNA序列，该前导肽在真核细胞中将蛋白质靶向分泌。SEQ ID NO154-162分别给出了例示性前导肽和其编码多核苷酸序列。

从PBMC分离原代人泛T细胞

通过Histopaque密度离心从富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)制备外周血单个核细胞(PBMC)，所述制备物自当地血库或来自健康人供体的新鲜血液获得。简言之，将血液用无菌PBS稀释并小心在Histopaque梯度(Sigma,H8889)上铺层。在室温以450x g离心30分钟后(关闭制动器)，弃去含PBMC界面上的血浆部分。将PBMC转移至新的50ml Falcon管并将管用PBS补充至总体积50ml。将混合物在室温以400x g离心10分钟(关闭制动器)。弃去上清液并将PBMC团粒用无菌PBS清洗2次(离心步骤为在4℃以350x g10分钟)。将所得PBMC群体自动计数(ViCell)并在37℃、5%CO₂在培养箱中在RPMI1640培养基(含有10%FCS和1%L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom,K0302))中贮存直至测定开始。

使用泛T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec#130-091-156)，依照制造商说明书实施从PBMC富集T细胞。简言之，将细胞团粒以每1千万个细胞40μl冷缓冲液(有0.5%BSA、2mM EDTA的PBS，无菌过滤)稀释并与每1千万个细胞10μl生物素-抗体混合物在4℃温育10分钟。每1千万个细胞加入30μl冷缓冲液和20μl抗生物素磁珠，并将混合物在4℃再温育15分钟。通过添加当前体积的10-20倍和在300x g持续10分钟的随后离心步骤来清洗细胞。将高达1亿个细胞重悬于500μl缓冲液。使用LS柱(Miltenyi Biotec#130-042-401)，依照制造商说明书实施未标记人泛T细胞的磁性分离。将所得T细胞群体自动计数(ViCell)并在37℃、5%CO₂在培养箱中于AIM-V培养基中贮存直至测定开始(不超过24h)。

从PBMC分离原代人初始性T细胞

通过Histopaque密度离心从富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)制备外周血单个核细胞(PBMC)，所述制备物(血沉棕黄层)自当地血库或来自健康人供体的新鲜血液获得。使用来自Miltenyi Biotec的初始性CD8⁺T细胞分离试剂盒(#130-093-244)，依照制造商说明书实施从PBMC富集T细胞，但跳过最后一个CD8⁺T细胞的分离步骤(亦见关于分离原代人泛T细胞的描述)。

从脾细胞分离鼠泛T细胞

从C57BL/6小鼠分离脾，转移到含MACS缓冲液(PBS+0.5%BSA+2mM EDTA)的GentleMACS C管(Miltenyi Biotech#130-093-237)中，并依照制造商说明书用GentleMACS分离器分离以获得单细胞悬液。使细胞悬液通过预分离滤器以除去剩余未分离的组织颗粒。在4℃以400x g离心4分钟后，加入ACK裂解缓冲液以裂解红血球(在室温温育5分钟)。将剩余细胞用MACS缓冲液清洗2次，计数并用于分离鼠泛T细胞。使用来自Miltenyi Biotec的泛T细胞分离试剂盒(#130-090-861)，依照制造商说明书实施负(磁性)选择。将所得T细胞群体自动计数(ViCell)并立即用于进一步测定。

从肝素化血液分离原代猕猴PBMC

如下通过密度离心从来自健康猕猴供体的新鲜血液制备外周血单个核细胞(PBMC)：将肝素化血液用无菌PBS以1:3稀释，并将Lymphoprep培养基(Axon Lab#1114545)用无菌PBS稀释至90%。将2份体积的稀释血液在1份体积的稀释密度梯度上分层，并通过在室温以520x g离心30分钟(无制动)来分离PBMC级分。将PBMC带转移至新的50ml Falcon管中并通过在4℃以400xg离心10分钟用无菌PBS清洗。实施一次低速度离心以除去血小板(150x g15分钟，4℃)，将所得PBMC群体自动计数(ViCell)并立即用于进一步测定。

靶细胞

对于MCSP靶向性双特异性抗原结合分子的评估，使用下列肿瘤细胞系：人黑素瘤细胞系WM266-4(ATCC#CRL-1676)，其源自恶性黑素瘤的转移性部位且表达高水平的人MCSP；和人黑素瘤细胞系MV-3(来自Radboud大学Nijmegen医学中心的友情赠礼)，其表达中等水平的人MCSP。

对于CEA靶向性双特异性抗原结合分子的评估，使用下列肿瘤细胞系：人胃癌细胞系MKN45(DSMZ#ACC409)，其表达非常高水平的人CEA；人女性高加索人结肠腺癌细胞系LS-174T(ECACC#87060401)，其表达中等至低水平的人CEA；人上皮状胰腺癌细胞系Panc-1(ATCC#CRL-1469)，其表达(非常)低水平的人CEA；和鼠结肠癌细胞系MC38-huCEA，其内部工程化以稳定表达人CEA。

另外，使用人T细胞白血病细胞系Jurkat(ATCC#TIB-152)来评估不同双特异性构建体对细胞上人CD3的结合。

实施例1：双特异性抗原结合分子的制备、纯化和表征

将重链和轻链可变区序列与预先插入相应接受哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链以符合阅读框方式亚克隆。抗体表达受MPSV启动子驱动且合成的多聚A信号序列位于CDS的3’端。另外，每个载体含有EBV OriP序列。

通过用哺乳动物表达载体共转染HEK293EBNA细胞来生成该分子。使用磷酸钙方法转染指数生长的HEK293EBNA细胞。或者，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染在悬液中生长的HEK293EBNA细胞。对于“1+1IgG scFab，1个臂/1个臂倒转”构建体的制备，将细胞用相应的表达载体以1:1:1比率(“载体重链”:“载体轻链”:“载体重链-scFab”)转染。对于“2+1IgGscFab”构建体的制备，将细胞用相应的表达载体以1:2:1比率(“载体重链”:“载体轻链”:“载体重链-scFab”)转染。对于“1+1IgG Crossfab”构建体的制备，将细胞用相应的表达载体以1:1:1:1比率(“载体第二重链”:“载体第一轻链”:“载体轻链Crossfab”:“载体第一重链-重链Crossfab”)转染。对于“2+1IgG Crossfab”构建体的制备，将细胞用相应的表达载体以1:2:1:1比率(“载体第二重链”:“载体轻链”:“载体第一重链-重链Crossfab”:“载体轻链Crossfab”)转染。对于“2+1IgG Crossfab，连接的轻链”构建体的制备，将细胞用相应的表达载体以1:1:1:1比率(“载体重链”:“载体轻链”:“载体重链(CrossFab-Fab-Fc)”:“载体连接的轻链”)转染。对于“1+1CrossMab”构建体的制备，将细胞用相应的表达载体以1:1:1:1比率(“载体第一重链”:载体第二重链”:“载体第一轻链”:“载体第二轻链”)转染。对于“1+1IgG Crossfab轻链融合”构建体的制备，将细胞用相应的表达载体以1:1:1:1比率(“载体第一重链”:“载体第二重链”:“载体轻链Crossfab”:“载体第二轻链”)转染。

对于使用磷酸钙的转染，使用补充有10%(v/v)FCS的DMEM培养基，将细胞在T烧瓶中以粘着单层培养物培养，并当其介于50和80%之间汇合时进行转染。对于T150烧瓶的转染，在转染前24小时将1500万个细胞接种于25ml补充有FCS(最终为10%v/v)的DMEM培养基中，并将细胞于37℃在具有5%CO₂气氛的培养箱中放置过夜。对于要转染的每个T150烧瓶，制备DNA、CaCl₂和水的溶液，其通过以相应比率混合分开的94μg总质粒载体DNA、至终体积469μl的水和469μl1M CaCl₂溶液进行。向此溶液添加938μl50mMHEPES、280mM NaCl、1.5mMNa₂HPO₄溶液pH7.05，立即混合10秒并于室温保持静置20秒。将悬浮液用10ml补充有2%(v/v)FCS的DMEM稀释，并添加到T150替换现有培养基。然后，添加额外的13ml转染培养基。将细胞于37℃、5%CO₂温育约17至20小时，然后将培养基用25ml DMEM、10%FCS替换。在培养基更换后约7天通过以210xg离心15分钟收获条件化培养基，将溶液无菌过滤(0.22um滤器)，并补充叠氮化钠至终浓度0.01%(w/v)，并于4℃保持。

对于使用聚乙烯亚胺(PEI)的转染，将HEK293EBNA细胞在无血清CD CHO培养基中在悬液中培养。对于在500ml摇瓶中的生产，在转染前24小时将4亿个HEK293EBNA细胞接种。对于转染，将细胞以210x g离心5分钟，并将上清液用20ml预热的CD CHO培养基替换。将表达载体在20ml CD CHO培养基中混合至最终量为200μg DNA。在添加540μl PEI后，将混合物涡旋振荡15秒，然后在室温温育10分钟。接着，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶，并于37℃在具有5%CO₂气氛的培养箱中温育3小时。在温育时间后，加入160ml F17培养基并将细胞培养24小时。在转染后一天，加入1mM丙戊酸和7%Feed1(Lonza)。在培养7天后，收集上清液以通过在210x g离心15分钟来纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，补充叠氮化钠至终浓度0.01%w/v，并于4℃保持。

从细胞培养上清纯化分泌性蛋白质，其通过蛋白A亲和层析，继之以大小排阻层析步骤进行。

对于亲和层析，将上清液加载到用25ml20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠，pH7.5或40ml20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠，pH7.5平衡的HiTrap蛋白A HP柱(CV=5ml,GEHealthcare)上。将未结合的蛋白质通过用至少10个柱体积的20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠，pH7.5清洗，继之以使用6个柱体积的10mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠，pH5.45的额外清洗步骤清洗来除去。然后，将柱用20ml10mM MES、100mM氯化钠，pH5.0清洗，并将靶蛋白在6个柱体积的20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸，pH3.0中洗脱。或者，使用在20个柱体积里从20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠，pH7.5至20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠，pH2.5的梯度将靶蛋白洗脱。将蛋白质溶液通过添加1/10的0.5M磷酸钠pH8中和。将靶蛋白浓缩并过滤，接着加载到用25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸溶液pH6.7平衡的HiLoad Superdex200柱(GE Healthcare)上。对于1+1IgG Crossfab的纯化，将柱用20mM组氨酸、140mM氯化钠溶液pH6.0平衡。

纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度通过测量在280nm处的光密度(OD)来测定，其使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数进行。依照制造商说明书使用预制凝胶系统(Invitrogen,USA)(4-12%Tris-醋酸盐凝胶或4-12%Bis-Tris)，通过在存在和缺乏还原剂(5mM1,4-二硫苏糖醇)情况下的SDS-PAGE并用考马斯(来自Invitrogen的SimpleBlue^TMSafeStain)染色来分析双特异性构建体的纯度和分子量。或者，依照制造商说明书使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper Lifescience)，在存在或缺乏还原剂的情况下通过CE-SDS分析来分析分子的纯度和分子量。

使用Superdex20010/300GL分析性大小排阻层析柱(GE Healthcare)在2mM MOPS、150mM NaCl、0.02%(w/v)NaN₃，pH7.3运行缓冲液中于25℃分析蛋白质样品的聚集物含量。或者，使用TSKgel G3000SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mM K₂HPO₄、125mM NaCl、200mM L-精氨酸一氢氯化物(L-arginine monohydrocloride)、0.02%(w/v)NaN₃，pH6.7运行缓冲液中于25℃分析抗体样品的聚集物含量。

图2-14显示SDS PAGE和分析性大小排阻层析的结果，而表2A显示产率、蛋白A后的聚集物含量和不同双特异性构建体制备物的最终单体含量。

图47显示抗CD3/抗MCSP双特异性“2+1IgG Crossfab，连接的轻链”构建体(见SEQID NO3、5、29和179)的CE-SDS分析结果。将2μg样品用于分析。图48显示终产物的分析性大小排阻层析的结果(注射20μg样品)。

图54显示各种构建体的CE-SDS和SDS PAGE分析结果，而表2A显示产率、蛋白A后的聚集物含量和不同双特异性构建体制备物的最终单体含量。

表2A。产率、蛋白A后的聚集物含量和最终单体含量。

作为对照，在现有技术串联scFv形式(“(scFv)₂”)中并且通过将串联scFv融合至Fc域(“(scFv)₂-Fc”)生成双特异性抗原结合分子。该分子在HEK293-EBNA细胞中生成且通过蛋白A亲和层析，继之以大小排阻层析步骤，以与上文对本发明双特异性抗原结合分子所描述的类似的方式纯化。由于高聚集物形成，一些样品不得不进行进一步纯化，其通过将来自HiLoad Superdex200柱(GE Healthcare)的洗脱并浓缩的样品施加到用20mM组氨酸、140mM氯化钠，pH6.7平衡的Superdex10/300GL柱(GE Healthcare)以获得具有高单体含量的蛋白质。然后，如上文描述的那样测定蛋白质浓度、纯度和分子量、和聚集物含量。

对照分子的产率、第一纯化步骤后的聚集物含量和最终单体含量显示于表2B。第一纯化步骤(蛋白A)后聚集物含量的比较指示IgG Crossfab和IgG scFab构建体相比于“(scFv)₂-Fc”和二硫键稳定化的“(dsscFv)₂-Fc”分子的卓越稳定性。

表2B。产率、蛋白A后的聚集物含量和最终单体含量。

通过动态光散射(DLS)来监测蛋白质的热稳定性。将具有1mg/ml蛋白质浓度的30g过滤后蛋白质样品一式两份地应用于Dynapro读板仪(Wyatt Technology Corporation;USA)。温度从25至75℃以0.05℃/min上升，收集半径和总散射强度。结果显示于图15和表2C。对于“(scFv)2-Fc”(抗MCSP/抗huCD3)分子，于49℃和68℃观察到两个聚集点。“(dsscFv)₂-Fc”构建体具有升高的聚集温度(57℃)，其为引入的二硫桥的结果(图15A，表2C)。“2+1IgGscFab”和“2+1IgG Crossfab”构建体两者均于高于60℃的温度聚集，这证明其相比于“(scFv)₂-Fc”和“(dsscFv)₂-Fc”形式卓越的热稳定性(图15B，表2C)。

表2C。通过动态光散射测定的热稳定性。

构建体
		2+1IgG scFab(LC007/V9)	68
2+1IgG Crossfab(LC007/V9)	65
		Fc-(scFv)2(LC007/V9)	49/68
Fc-(dsscFv)2(LC007/V9)	57

实施例2：对Fc受体和靶抗原结合的表面等离振子共振分析

方法

所有表面等离振子共振(SPR)实验均在Biacore T100上于25℃用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005%表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)进行。

不同Fc变体的FcR结合的分析

测定法设置在图16A中显示。对于不同Fc变体与人FcγRIIIa-V158和鼠FcγRIV相互作用的分析，6,500左右个共振单位(RU)的抗五His抗体(Qiagen)的直接偶联在CM5芯片上在pH5.0使用标准胺偶联试剂盒(Biacore,Freiburg/Germany)进行。将HuFcγRIIIa-V158-K6H6和muFcγRIV-aviHis-生物素分别以4和10nM捕捉60秒。

将具有不同Fc突变的构建体在1000nM的浓度以30μl/min的流速通过流动池120秒。监测解离达220秒。通过减去在参照流动池中获得的响应来校正批量折射率差异。这里，使Fc变体在具有固定化的抗五His抗体但是其上注射有HBS-EP而非HuFcγRIIIa-V158-K6H6或muFcγRIV-aviHis-生物素的表面上流动。使用500-4000nM的浓度范围对野生型Fc测定对人FcγRIIIa-V158和鼠FcγRIV的亲和力。

使用稳定态响应通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合来导出解离常数KD。使用Biacore T100评估软件(vAA,Biacore AB,Uppsala/Sweden)，以通过数字积分拟合1:1Langmuir结合的速率方程来导出动力学常数。

结果

通过表面等离振子共振监测Fc变体与人FcγRIIIa和鼠FcγRIV的相互作用。相比于具有野生型(wt)Fc域的构建体，对于所有分析的Fc突变体，对捕获的huFcγRIIIa-V158-K6H6和muFcγRIV-aviHis-生物素的结合显著降低。

具有对人Fcγ受体的最低结合的Fc突变体为P329G L234A L235A(LALA)和P329GLALA N297D。单独的LALA突变不足以消除对huFcγRIIIa-V158-K6H6的结合。仅携带LALA突变的Fc变体具有2.100nM的对人FcγRIIIa的残留结合亲和力，而wt Fc以600nM的亲和力结合人FcγRIIIa受体(表3)。两个K_D值均使用单一浓度通过1:1结合模型导出。

仅可以对wt Fc分析对人FcγRIIIa-V158和鼠FcγRIV的亲和力。K_D值列于表3。对于所有分析的Fc突变体，对鼠FcγRIV的结合几乎完全消除。

表3。Fc变体对人FcγRIIIa-V158和鼠FcγRIV的亲和力。

*使用1个浓度(1000nM)测定

分析对肿瘤抗原和CD3的同时结合

实施T细胞双特异性构建体对肿瘤抗原和人CD3ε的同时结合的分析，其通过使用标准偶联规程将1650个共振单位(RU)的MCSP生物素化D3域直接偶联到传感器芯片SA上进行。使用标准氨基偶联规程将人EGFR固定化。将8000RU在pH5.5固定化于CM5传感器芯片上。测定法设置显示于图16B。

将不同的T细胞双特异性构建体在200nM捕捉60秒。然后，将人CD3γ(G₄S)₅CD3ε-AcTev-Fc(突出)-Avi/Fc(孔)在2000nM的浓度并以40μl/min的流速通过60秒。通过减去在参照流动池上获得的响应来校正批量折射率差异，在参照流动池中重组CD3ε在具有固定化的MCSP D3域或EGFR而无捕获的T细胞双特异性构建体的表面上流动。

结果

通过表面等离振子共振来分析对肿瘤抗原和人CD3ε两者的同时结合(图17、图18)。所有构建体均能同时结合肿瘤抗原和CD3。对于大多数构建体，注射人CD3ε后的结合水平(RU)高于仅注射构建体后实现的结合水平，其反映了肿瘤抗原和人CD3ε均结合构建体。

实施例3：双特异性构建体对细胞上相应靶抗原的结合

通过FACS测定不同双特异性构建体对Jurkat细胞(ATCC#TIB-152)上CD3和靶细胞上相应肿瘤抗原的结合。简言之，对细胞收获、计数并检查存活性。将每孔15-20万个细胞(在含有0.1%BSA的PBS中；90μl)在圆底96孔板中分配并与指定浓度的双特异性构建体和相应IgG对照(10μl)在4℃温育30分钟。为了更好的比较，相对于相同的摩尔浓度标准化所有构建体和IgG对照。温育后，将细胞离心(5min,350x g)，用150μl含有0.1%BSA的PBS清洗，重悬并在4℃与12μl/孔缀合有FITC或PE的二抗再温育30分钟。使用FACSCantoII(SoftwareFACS Diva)检测结合的构建体。使用缀合FITC的抗His抗体(Lucerna,#RHIS-45F-Z)检测“(scFv)₂”分子。对于所有其他分子，使用缀合有FITC或PE的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcγ片段特异性(分别为Jackson Immuno Research Lab#109-096-098/工作溶液1:20，或#109-116-170/工作溶液1:80)。通过添加120μl/孔含0.1%BSA的PBS并以350xg离心5分钟来清洗细胞。第二清洗步骤使用150μl/孔含0.1%BSA的PBS进行。除非另外指示，将细胞用100μl/孔固定缓冲液(BD#554655)在4℃于黑暗中固定15分钟，以400x g离心6分钟并保持在200μl/孔含0.1%BSA的PBS中直至用FACS CantoII测量样品。EC50值使用GraphPadPrism软件计算。

在第一个实验中，通过流式细胞术分析靶向人MCSP和人CD3的不同双特异性构建体对人T细胞白血病细胞Jurkat上表达的人CD3、或对Colo-38人黑素瘤细胞上人MCSP的结合。

结果呈现于图19-21，其显示与双特异性分子、对照IgG、仅二抗温育或保持未处理的细胞的均值荧光强度。

如图19中显示的，对于“(scFv)₂”分子的两个抗原结合模块，即CD3(图191A)和MCSP(图19B)，相比于对照样品，观察到清楚的结合信号。

“2+1IgG scFab”分子(SEQ ID NO5、17、19)显示对Colo-38细胞上huMCSP的较好结合(图20A)。CD3模块比参照抗人CD3IgG略好地结合CD3(图20B)。

如图21A中绘出的，两种“1+1”构建体显示相当的对细胞上人CD3的结合信号。参照抗人CD3IgG给出稍弱的信号。另外，测试的两种构建体(“1+1IgG scFab，一臂”(SEQ IDNO1,3,5)和“1+1IgG scFab，一臂倒转”(SEQ ID NO7,9,11))显示相当的对细胞上人MCSP的结合(图21B)。用参照抗人MCSP IgG获得的结合信号稍弱。

在另一项实验中，通过流式细胞术分析纯化的“2+1IgG scFab”双特异性构建体(SEQ ID NO5,17,19)和相应的抗人MCSP IgG对Colo-38人黑素瘤细胞上人MCSP的剂量依赖性结合，以确定双特异性构建体是否经由其一个或两个“臂”来结合MCSP。如图22绘出的，“2+1IgG scFab”构建体显示与MCSP IgG相同的结合模式。

在再一个实验中，评估在Crossfab片段中具有VL/VH(见SEQ ID NO33,63,65,67)或CL/CH1交换(见SEQ ID NO66,67,183,197)的CD3/CEA“2+1IgG Crossfab，倒转的”双特异性构建体对由Jurkat细胞表达的人CD3，或对由LS-174T细胞表达的人CEA的结合。作为对照，还评估等同最大浓度的相应IgG和由于经标记二抗(缀合有FITC的山羊抗人AffiniPureF(ab’)2片段,Fcγ片段特异性,Jackson Immuno Research Lab#109-096-098)所致的背景染色。如图55中示意的，两种构建体均显示对人CEA以及细胞上人CD3的较好结合。对于“2+1IgG Crossfab，倒转的(VL/VH)”和“2+1IgG Crossfab，倒转的(CL/CH1)”构建体，计算的EC50值分别为4.6和3.9nM(CD3)，以及9.3和6.7nM(CEA)。

在另一项实验中，评估CD3/MCSP“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)和“2+1IgG Crossfab，倒转的”(见SEQ ID NO5,23,183,187)构建体对由Jurkat细胞表达的人CD3，或对由WM266-4细胞表达的人MCSP的结合。图56显示，尽管两种构建体对细胞上MCSP的结合是好得相当的，但“倒转的”构建体对CD3的结合相比于其他构建体降低。对于“2+1IgGCrossfab，倒转的”和“2+1IgG Crossfab”构建体，计算的EC50值分别为6.1和1.66nM(CD3)，以及0.57和0.95nM(MCSP)。

在又一个实验中，测定“1+1IgG Crossfab轻链(LC)融合”构建体(SEQ ID NO183,209,211,213)对由Jurkat细胞表达的人CD3，或对由LS-174T细胞表达的人CEA的结合。作为对照，还评估相等最大浓度的相应抗CD3和抗CEAIgG以及由于经标记二抗(缀合有FITC的山羊抗人AffiniPure F(ab’)2片段,Fcγ片段特异性,Jackson Immuno Research Lab#109-096-098)所致的背景染色。如图57绘出的，“1+1IgG Crossfab LC融合”对CEA的结合似乎极大降低，而对CD3的结合至少与参照IgG相当。

在最后一个实验中，测定“2+1IgG Crossfab”(SEQ ID NO5,23,215,217)和“2+1IgG Crossfab，倒转的”(SEQ ID NO5,23,215,219)构建体对由Jurkat细胞表达的人CD3，或对由WM266-4肿瘤细胞表达的人MCSP的结合。如图58绘出的，相比于其他构建体，对于“2+1IgG Crossfab，倒转的”，对人CD3的结合降低，但对人MCSP的结合是好得相当的。对于“2+1IgG Crossfab”和“2+1IgG Crossfab，倒转的”构建体，计算的EC50值分别为10.3和32.0nM(CD3)，以及3.1和3.4nM(MCSP)。

实施例4:双特异性构建体衔接后原代人T细胞上表面活化标志物的FACS分析

通过流式细胞术测试纯化的huMCSP-huCD3靶向性双特异性“2+1IgGscFab”(SEQID NO5,17,19)和“(scFv)₂”分子在存在人MCSP表达肿瘤细胞的情况下上调CD8⁺T细胞上早期表面活化标志物CD69或后期活化标志物CD25的潜力。

简言之，用细胞解离缓冲液收获MCSP阳性Colo-38细胞，计数并检查存活性。将细胞在AIM-V培养基中调整为每ml0.3x10⁶个(活)细胞，将每孔100μl的此细胞悬液移液到圆底96孔板(如指示的)。将50μl(稀释的)双特异性构建体添加到含细胞的孔以获得1nM的终浓度。人PBMC效应细胞自健康供体的新鲜血液分离且在AIM-V培养基中调整为每ml6x10⁶个(活)细胞。将50μl的此细胞悬液添加到测定板(见上文)的每个孔以获得最终10:1的E:T比率。为了分析双特异性构建体是否仅在存在表达肿瘤抗原huMCSP的靶细胞的情况下活化T细胞，纳入含有1nM相应双特异性分子以及PBMC但无靶细胞的孔。

在37℃、5%CO₂温育15h(CD69)或24h(CD25)后，将细胞离心(5min,350x g)并用150μl/孔含0.1%BSA的PBS清洗2次。针对CD8(小鼠IgG1，κ；克隆HIT8a；BD#555635)、CD69(小鼠IgG1；克隆L78；BD#340560)和CD25(小鼠IgG1，κ；克隆M-A251；BD#555434)的表面染色依照供应商建议在4℃进行30分钟。将细胞用150μl/孔含0.1%BSA的PBS清洗2次，并使用100μl/孔固定缓冲液(BD#554655)在4℃固定15分钟。离心后，将样品重悬于200μl/孔具有0.1%BSA的PBS，并使用FACS CantoII仪(Software FACS Diva)分析。

图23绘出了在分别温育15小时或24小时后，CD8⁺T细胞上早期活化标志物CD69(A)或后期活化标志物CD25(B)的表达水平。两种构建体均仅在存在靶细胞的情况下诱导两种活化标志物的上调。“(scFv)₂”分子在此测定法中似乎比“2+1IgG scFab”构建体稍具活性。

通过流式细胞术进一步测试纯化的huMCSP-huCD3靶向性双特异性“2+1IgGscFab”和“(scFv)₂”分子在存在人MCSP表达肿瘤细胞的情况下上调CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞上后期活化标志物CD25的潜力。实验规程如上文所述，其以5:1的E:T比率使用人泛T效应细胞和温育时间5天进行。

图24显示两种构建体均仅在存在靶细胞的情况下在CD8⁺(A)以及CD4⁺(B)T细胞两者上诱导CD25的上调。在此测定法中，“2+1IgG scFab”构建体似乎比“(scFv)₂”分子诱导更少的CD25上调。一般而言，CD25的上调在CD8⁺上比在CD4⁺T细胞上更明显。

在另一项实验中，分析纯化的靶向猕猴CD3和人MCSP的“2+1IgGCrossfab”(SEQ IDNO3,5,35,37)在存在肿瘤靶细胞的情况下上调CD8⁺T细胞上表面活化标志物CD25的潜力。简言之，用细胞解离缓冲液收获人MCSP表达MV-3肿瘤靶细胞，清洗并重悬于含2%FCS和1%GlutaMax的DMEM中。将每孔30000个细胞在圆底96孔板中分配，并以指定浓度添加相应的抗体稀释液(图25)。将双特异性构建体和不同IgG对照调整为相同摩尔浓度。添加从两只健康动物的血液分离的猕猴PBMC效应细胞以获得3:1的最终E:T比率。在37℃、5%CO₂温育43h后，将细胞以350x g离心5分钟并用含0.1%BSA的PBS清洗2次。依照供应商建议实施对CD8(Miltenyi Biotech#130-080-601)和CD25(BD#557138)的表面染色。将细胞用150μl/孔含0.1%BSA的PBS清洗2次，并使用100μl/孔固定缓冲液(BD#554655)在4℃固定15分钟。离心后，将样品重悬于200μl/孔具有0.1%BSA的PBS，并使用FACS CantoII仪(SoftwareFACSDiva)分析。

如绘于图25的，所述双特异性构建体仅在存在靶细胞的情况下诱导CD8⁺T细胞上CD25的浓度依赖性上调。抗猕猴CD3IgG(克隆FN-18)也能够在不被交联的情况中诱导CD8⁺T细胞上CD25的上调(见用Cyno Nestor获得的数据)。用最大浓度的双特异性构建体(在缺乏靶细胞的情况下)没有对猕猴T细胞的过度活化。

在另一项实验中，将CD3-MCSP“2+1IgG Crossfab，连接的轻链”(见SEQID NO3,5,29,179)与CD3-MCSP“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)比较其在存在肿瘤靶细胞的情况下上调CD8⁺T细胞上早期活化标志物CD69或后期活化标志物CD25的潜力。在存在或缺乏MCSP阳性Colo38靶细胞的情况下将原代人PBMC(如上文描述的那样分离)与指定浓度的双特异性构建体温育至少22h。简言之，将30万个原代人PBMC对含有MCSP阳性靶细胞(或培养基)的平底96孔板的每个孔分配。最终效应细胞对靶细胞(E:T)比率为10:1。将细胞与指定浓度的双特异性构建体和对照在37℃、5%CO₂温育达指定温育时间。将效应细胞针对CD8、和CD69、或CD25染色并通过FACSCantoII分析。

图53显示该实验的结果。在两种2+1IgG CrossFab分子(有或无连接的轻链)之间对CD69(A)或CD25上调(B)没有检测到显著差异。

在再一个实验中，将CD3/MCSP“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)和“1+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO5,29,33,181)构建体与“1+1CrossMab”构建体(见SEQ IDNO5,23,183,185)比较其在存在肿瘤靶细胞的情况下上调CD4⁺或CD8⁺T细胞上CD69或CD25的潜力。将该测定法在存在或缺乏人MCSP表达MV-3肿瘤细胞的情况下如上文所述的那样进行，温育时间为24h。

如图59中显示的，“1+1IgG Crossfab”和“2+1IgG Crossfab”构建体比“1+1CrossMab”分子诱导更明显的活化标志物上调。

在最后一项实验中，评估CD3/MCSP“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO5,23,215,217)和“2+1IgG Crossfab，倒转的”(见SEQ ID NO5,23,215,219)构建体在存在肿瘤靶细胞的情况下上调来自两只不同猕猴的CD4⁺或CD8⁺T细胞上CD25的潜力。在存在或缺乏人MCSP表达MV-3肿瘤细胞的情况下将该测定法如上文所述的那样进行，E:T比率为3:1，温育时间为约41h。

如图60中显示的，两种构建体均能以浓度依赖性方式上调CD4⁺和CD8⁺T细胞上的CD25，在这两种形式之间没有显著差异。没有抗体且没有靶细胞的对照样品与有抗体但无靶物的样品产生相当的信号(未显示)。

实施例5:在用CD3双特异性构建体活化人泛T细胞后的干扰素-γ分泌

分析纯化的靶向人MCSP和人CD3的“2+1IgG scFab”(SEQ ID NO5,17,19)在存在人MCSP阳性U-87MG细胞的情况下诱导T细胞活化的潜力，这通过人干扰素(IFN)-γ到上清液中的释放来测量。作为对照，使用调整至相同摩尔浓度的抗人MCSP和抗人CD3IgG。简言之，用细胞解离缓冲液收获表达huMCSP的U-87MG成胶质细胞瘤星形细胞瘤靶细胞(ECACC89081402)，清洗并重悬于AIM-V培养基(Invitrogen#12055-091)中。将每孔20000个细胞在圆底96孔板中分配并添加相应的抗体稀释液以获得1nM的最终浓度。添加从血沉棕黄层分离的人泛T效应器细胞以获得5:1的最终E:T比率。在37℃、5%CO₂过夜温育18.5h后，将测定板以350x g离心5分钟并将上清液转移至新96孔板中。通过ELISA依照制造商说明书(来自Becton Dickinson的BD OptEIA人IFN-γELISA试剂盒，#550612)测量上清液中的人IFN-γ水平。

如图26中绘出的，参照IgG显示无到微弱的IFN-γ分泌诱导，而“2+1IgG scFab”构建体能活化人T细胞以分泌IFN-γ。

实施例6:由靶向T细胞上CD3和肿瘤细胞上MCSP或EGFR的交联双特异性构建体介导的重定向的T细胞细胞毒性(LDH释放测定法)

在第一组实验中，对靶向CD3和MCSP的双特异性构建体分析其在经由抗原结合模块对其在细胞上相应靶抗原的结合来交联构建体后诱导肿瘤靶细胞中T细胞介导的细胞凋亡的潜力(图27-38)。

在一项实验中，比较纯化的靶向人CD3和人MCSP的“2+1IgG scFab”(SEQ ID NO5,21,23)和“2+1IgG Crossfab”(SEQ ID NO3,5,29,33)构建体和相应的“(scFv)₂”分子。简言之，用细胞解离缓冲液收获表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤靶细胞，清洗并重悬于AIM-V培养基(Invitrogen#12055-091)中。将每孔30000个细胞在圆底96孔板中分配，并以指定浓度添加相应的抗体稀释液。将所有构建体和相应的对照IgG对照调整为相同摩尔浓度。添加人泛T效应细胞以获得5:1的最终E:T比率。作为对人泛T细胞活化的阳性对照，使用1μg/mlPHA-M(Sigma#L8902；自菜豆(Phaseolus vulgaris)分离的异凝集素的混合物)。对于标准化，对靶细胞的最大裂解(=100%)通过将靶细胞与终浓度1%Triton X-100温育来测定。最小裂解(=0%)指与效应细胞共温育但无任何构建体或抗体的靶细胞。在37℃、5%CO₂过夜温育20h后，用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science,#11644793001)依照制造商说明书测量凋亡/坏死的靶细胞释放到上清液中的LDH。

如图27中绘出的，两种“2+1”构建体均诱导与“(scFv)₂”分子相当的靶细胞凋亡。

另外，比较纯化的在其Fc域中不同的“2+1IgG Crossfab”(SEQ ID NO3,5,29,33)和“2+1IgG scFab”构建体以及“(scFv)₂”分子。Fc域中的不同突变(L234A+L235A(LALA)，P329G和/或N297D，如指示的)降低或消除了由含野生型(wt)Fc域的构建体诱导的(NK)效应细胞功能。实验规程如上文所述。

图28显示所有构建体均诱导与“(scFv)₂”分子相当的靶细胞凋亡。

图29显示对纯化的“2+1IgG scFab”(SEQ ID NO5,17,19)和“(scFv)₂”分子比较其诱导肿瘤靶细胞中T细胞介导的凋亡的潜力的结果。实验规程如上文所述，其以5:1的E:T比率使用表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细胞，和过夜温育18.5h进行。如图中绘出的，“2+1IgG scFab”构建体显示与“(scFv)₂”分子相当的细胞毒性活性。

类似地，图30显示比较纯化的“2+1IgG scFab”构建体(SEQ ID NO5,17,19)和“(scFv)₂”分子的结果，其以5:1的E:T比率使用表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细胞和过夜温育18h进行。如图中绘出的，“2+1IgG scFab”构建体显示与(scFv)₂分子相当的细胞毒性活性。

图31显示比较纯化的“2+1IgG scFab”构建体(SEQ ID NO5,17,19)和“(scFv)₂”分子的结果，其以5:1的E:T比率使用表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤靶细胞和过夜温育23.5h进行。如图中绘出的，该构建体诱导与“(scFv)₂”分子相当的靶细胞凋亡。“2+1IgGscFab”构建体在最高浓度显示降低的功效。

此外，对对于两种靶物，即人CD3和人MCSP均为单价的不同双特异性构建体以及相应的“(scFv)₂”分子分析其诱导T细胞介导的凋亡的潜力。图32显示“1+1IgG scFab，一臂”(SEQ ID NO1,3,5)和“1+1IgG scFab，一臂倒转”(SEQ ID NO7,9,11)构建体的结果，其以5:1的E:T比率使用表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细胞和温育时间19h进行。如图中绘出的，两种“1+1”构建体比“(scFv)₂”分子活性低，其中在该测定法中“1+1IgG scFab，一臂”分子优于“1+1IgG scFab，一臂倒转”分子。

图33显示“1+1IgG scFab”构建体(SEQ ID NO5,21,213)的结果，其以5:1的E:T比率使用表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细胞和温育时间20h进行。如图中绘出的，“1+1IgGscFab”构建体比“(scFv)₂”分子细胞毒性低。

在一个别的实验中，对纯化的“2+1IgG Crossfab”(SEQ ID NO3,5,29,33)、“1+1IgG Crossfab”(SEQ ID NO5,29,31,33)和“(scFv)₂”分子分析其经由对细胞上两种靶抗原CD3和MCSP的结合而交联构建体后诱导肿瘤靶细胞中T细胞介导的凋亡的潜力。将表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤细胞用作靶细胞，E:T比率为5:1，且温育时间为20h。结果显示于图34。“2+1IgGCrossfab”构建体与“(scFv)₂”分子相当地诱导靶细胞的凋亡。单价和二价“IgGCrossfab”形式的比较清楚地显示二价形式要有效力得多。

在又一个实验中，对纯化的“2+1IgG Crossfab”(SEQ ID NO3,5,29,33)构建体分析其在不同(肿瘤)靶细胞中诱导T细胞介导的凋亡的潜力。简言之，用细胞解离缓冲液收获指示的MCSP阳性Colo-38肿瘤靶细胞、间充质干细胞(源自骨髓，Lonza#PT-2501或脂肪组织，Invitrogen#R7788-115)或周细胞(来自胎盘；PromoCell#C-12980)，清洗并在AIM-V培养基(Invitrogen#12055-091)中重悬。将每孔30000个细胞在圆底96孔板中分配，并以指定浓度添加相应的抗体稀释液。添加从健康供体的新鲜血液分离的人PBMC效应细胞以获得25:1的最终E:T比率。在37℃、5%CO₂温育4h后，用LDH检测试剂盒(RocheApplied Science,#11644793001)依照制造商说明书测量凋亡/坏死的靶细胞释放到上清液中的LDH。

如图35中绘出的，仅用Colo-38细胞能观察到显著的T细胞介导的细胞毒性。此结果与表达相当大水平的MCSP的Colo-38细胞一致，而间充质干细胞和周细胞仅非常弱地表达MCSP。

还将纯化的“2+1IgG scFab”(SEQ ID NO5,17,19)构建体和“(scFv)₂”分子与糖工程化抗人MCSP IgG抗体相比较，该抗体在其Fc域中具有降低的岩藻糖基化N-聚糖比例(MCSP GlycoMab)。对于此实验，以25:1的固定E:T比率(图36A)或从20:1至1:10的不同E:T比率(图36B)使用表达huMCSP的Colo-38人黑素瘤靶细胞和人PBMC效应细胞。不同的分子以图36A中指示的浓度，或以1667pM(图36B)的固定浓度使用。温育21h后进行读出。如图36A和B中绘出的，两种双特异性构建体均比MSCP GlycoMab显示更高的效力。

在另一项实验中，分析纯化的靶向猕猴CD3和人MCSP的“2+1IgG Crossfab”(SEQID NO3,5,35,37)。简言之，用细胞解离缓冲液收获人MCSP表达MV-3肿瘤靶细胞，清洗并重悬于含2%FCS和1%GlutaMax的DMEM。将每孔30000个细胞在圆底96孔板中分配，并以指定的浓度添加构建体或参照IgG的相应稀释液。将双特异性构建体和不同IgG对照调整至相同的摩尔浓度。添加从健康猕猴的血液分离的猕猴PBMC效应细胞以获得3:1的最终E:T比率。在37℃、5%CO₂温育24h或43h后，用LDH检测试剂盒(Roche AppliedScience,#11644793001)依照制造商说明书测量凋亡/坏死的靶细胞释放到上清液中的LDH。

如图37中绘出的，双特异性构建体诱导来自靶细胞的浓度依赖性LDH释放。效果在43h后强于在24h后。抗cynoCD3IgG(克隆FN-18)也能够在不被交联的情况下诱导靶细胞的LDH释放。

图38显示比较纯化的“2+1IgG Crossfab”(SEQ ID NO3,5,29,33)和“(scFv)₂”构建体的结果，其以10:1的E:T比率使用MCSP表达人黑素瘤细胞系(MV-3)作为靶细胞和人PBMC作为效应细胞和温育时间为26h进行。如图中绘出的，“2+1IgG Crossfab”构建体就EC50而言比“(scFv)₂”分子更有力。

在第二组实验中，对靶向CD3和EGFR的双特异性构建体分析其经由抗原结合模块对其在细胞上的相应靶抗原的结合而交联构建体后诱导肿瘤靶细胞中T细胞介导的凋亡的潜力(图39-41)。

在一个实验中，比较纯化的靶向CD3和EGFR的“2+1IgG scFab”(SEQ ID NO45,47,53)和“1+1IgG scFab”(SEQ ID NO47,53,213)构建体和相应的“(scFv)₂”分子。简言之，用胰蛋白酶收获人EGFR表达LS-174T肿瘤靶细胞，清洗并重悬于AIM-V培养基(Invitrogen#12055-091)。将每孔30000个细胞在圆底96孔板中分配，并以指定的浓度添加相应的抗体稀释液。将所有构建体和对照调整至相同的摩尔浓度。添加人泛T效应细胞以获得5:1的最终E:T比率。作为人泛T细胞活化的阳性对照，使用1μg/ml PHA-M(Sigma#L8902)。对于标准化，对靶细胞的最大裂解(=100%)通过将靶细胞与终浓度1%的Triton X-100温育来测定。最小裂解(=0%)指与效应细胞共温育但无任何构建体或抗体的靶细胞。在37℃、5%CO₂过夜温育18h后，用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science,#11644793001)依照制造商说明书测量凋亡/坏死的靶细胞释放到上清液中的LDH。

如图39中绘出的，“2+1IgG scFab”构建体与“(scFv)₂”分子显示相当的细胞毒性活性，而“1+1IgG scFab”构建体活性更低。

在另一项实验中，比较纯化的“1+1IgG scFab，一臂”(SEQ ID NO43,45,47)、“1+1IgG scFab，一臂倒转”(SEQ ID NO11,49,51)、“1+1IgG scFab”(SEQ ID NO47,53,213)和“(scFv)₂”分子。实验条件如上文所述，只不过温育时间为21h。

如图40中绘出的，在此测定法中，“1+1IgG scFab”构建体比“(scFv)₂”分子显示稍低的细胞毒性活性。两种“1+1IgG scFab，一臂(倒转)”构建体明显比“(scFv)₂”分子活性低。

在又一个实验中，比较纯化的“1+1IgG scFab，一臂”(SEQ ID NO43,45,47)和“1+1IgG scFab，一臂倒转”(SEQ ID NO11,49,51)构建体和“(scFv)₂”分子。此实验中的温育时间为16h，且结果绘于图41。与人泛T细胞温育，两种“1+1IgG scFab，一臂(倒转)”构建体均比“(scFv)₂”分子活性低，但显示LDH来自靶细胞的浓度依赖性释放(图41A)。在将LS-174T肿瘤细胞与自PBMC分离的未免疫T细胞共培养后，构建体仅具有基础活性：它们中最具活性的是“(scFv)₂”分子(图41B)。

在一个别的实验中，对纯化的靶向CD3和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的“1+1IgGscFab，一臂倒转”(SEQ ID NO11,51,55)、“1+1IgG scFab”(57,61,213)和“2+1IgG scFab”(57,59,61)以及相应的“(scFv)₂”分子分析其在经由两种抗原结合模块对其在细胞上相应靶抗原的结合而交联构建体后诱导人FAP表达成纤维细胞GM05389细胞中T细胞介导的凋亡的潜力。简言之，在前一天用胰蛋白酶收获人GM05389靶细胞，清洗并重悬于AIM-V培养基(Invitrogen#12055-091)。将每孔30000个细胞在圆底96孔板中分配，并以37℃、5%CO₂过夜温育以允许细胞恢复和粘着。次日，将细胞离心，弃去上清液，并以指定浓度添加新鲜培养基和构建体或参照IgG的相应稀释液。将所有构建体和对照均调整至相同的摩尔浓度。添加人泛T效应器细胞以获得5:1的最终E:T比率。作为人泛T细胞活化的阳性对照，使用5μg/mlPHA-M(Sigma#L8902)。对于标准化，对靶细胞的最大裂解(=100%)通过将靶细胞与终浓度1%的Triton X-100温育来测定。最小裂解(=0%)指与效应细胞共温育但无任何构建体或抗体的靶细胞。在37℃、5%CO₂再过夜温育18h后，用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science,#11644793001)依照制造商说明书测量凋亡/坏死的靶细胞释放到上清液中的LDH。

如图42中绘出的，“2+1IgG scFab”构建体就EC50值而言与“(scFv)₂”分子显示相当的细胞毒性活性。“1+1IgG scFab，一臂倒转”构建体比此测定法中测试的其他构建体活性低。

在另一组实验中，将CD3/MCSP“2+1IgG Crossfab，连接的轻链”(见SEQID NO3,5,29,179)与CD3/MCSP“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)比较。简言之，在测定当日用细胞解离缓冲液(或在开始测定前一天用胰蛋白酶)收获靶细胞(人Colo-38、人MV-3或WM266-4黑素瘤细胞)，清洗并重悬于适宜的细胞培养基(RPMI1640，包含2%FCS和1%Glutamax)中。将每孔20000-30000个细胞在平底96孔板中分配，并如指示的那样添加相应的抗体稀释液(一式三份)。添加作为效应细胞的PBMC以获得10:1的最终效应细胞与靶细胞(E:T)比率。将所有构建体和对照均调整至相同的摩尔浓度，温育时间为22h。如上文描述的那样进行对LDH释放的检测和标准化。

图49至52显示用MV-3黑素瘤细胞(图49)、Colo-38细胞(图50和51)或WM266-4细胞(图52)进行的4个测定法的结果。如图49中显示的，在用MV-3细胞作为靶细胞的测定法中，具有连接轻链的构建体比没有连接轻链的构建体效力要低。如图50和51中显示的，在用高MCSP表达Colo-38细胞作为靶细胞的测定法中，具有连接轻链的构建体比没有连接轻链的构建体效力更高。最后，如图52中显示的，当使用高MCSP表达WM266-4细胞作为靶细胞时，在两种构建体之间没有显著差异。

在另一项实验中，比较两种CEA靶向性“2+1IgG Crossfab，倒转”构建体，其中在Crossfab片段中，V区(VL/VH，见SEQ ID NO33,63,65,67)或C区(CL/CH1，见SEQ ID NO65,67,183,197)是交换的。如上文所述的那样进行测定法，其使用人PBMC作为效应细胞和人CEA表达靶细胞。用胰蛋白酶-EDTA(LuBiosciences#25300-096)收获靶细胞(MKN-45或LS-174T肿瘤细胞)，清洗并重悬于包含1%Glutamax(LuBiosciences#35050087)和2%FCS的RPMI1640(Invitrogen#42404042)中。将每孔30000个细胞在圆底96孔板中分配，并以指定的浓度添加双特异性构建体。将所有构建体和对照均调整至相同的摩尔浓度。添加人PBMC效应细胞以获得10:1的最终E:T比率，温育时间为28h。使用GraphPad Prism5软件计算EC50值。

如图61中显示的，具有CL/CH1交换的构建体比具有VL/VH交换的构建体对这两种靶细胞系显示略好的活性。对于CL/CH1交换构建体和VL/VH交换构建体，计算出的EC50值分别为115和243pM(对MKN-45细胞)，以及673和955pM(对LS-174T细胞)。

类似地，比较两种MCSP靶向性“2+1IgG Crossfab”构建体，其中在Crossfab片段中，V区(VL/VH，见SEQ ID NO33,189,191,193)或C区(CL/CH1，见SEQ ID NO183,189,193,195)是交换的。如上文描述的那样实施测定法，其使用人PBMC作为效应细胞和人MCSP表达靶细胞进行。用细胞解离缓冲液(LuBiosciences#13151014)收获靶细胞(WM266-4)，清洗并重悬于包含1%Glutamax(LuBiosciences#35050087)和2%FCS的RPMI1640(Invitrogen#42404042)。将每孔30000个细胞在圆底96孔板中分配，并以指定的浓度添加构建体。将所有构建体和对照均调整至相同的摩尔浓度。添加人PBMC效应细胞以获得10:1的最终E:T比率，温育时间为26h。使用GraphPad Prism5软件计算EC50值。

如图62中绘出的，两种构建体显示相当的活性，具有CL/CH1交换的构建体具有稍低的EC50值(相比于对于VL/VH交换构建体为16.8pM，CL/CH1交换构建体为12.9pM)。

图63显示类似测定法的结果，其用人MCSP表达MV-3靶细胞进行。此外，两种构建体都显示相当的活性，具有CL/CH1交换的构建体具有稍低的EC50值(相比于对于VL/VH交换构建体为约82.2pM，CL/CH1交换构建体为约11.7pM)。未能计算出确切的EC50值，因为杀伤曲线在高化合物浓度处未达到平稳期(plateau)。

在一个别的实验中，将CD3/MCSP“2+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO3,5,29,33)和“1+1IgG Crossfab”(见SEQ ID NO5,29,33,181)构建体与CD3/MCSP“1+1CrossMab”(见SEQID NO5,23,183,185)比较。如上文描述的那样进行测定，其使用人PBMC作为效应细胞和WM266-4或MV-3靶细胞(E:T比率=10:1)和温育时间21h进行。

如图64中显示的，“2+1IgG Crossfab”构建体在此测定法中是最有力的分子，接着是“1+1IgG Crossfab”和“1+1CrossMab”。这一排序对于表达中等水平MCSP的MV-3细胞甚至比高MCSP表达WM266-4细胞更明显。对于“2+1IgG Crossfab”、“1+1IgG Crossfab”和“1+1CrossMab”，计算出的EC50值在MV-3细胞上分别为9.2、40.9和88.4pM，在WM266-4细胞上分别为33.1、28.4和53.9pM。

在一个别的实验中，测试不同浓度的“1+1IgG Crossfab LC融合”构建体(SEQ IDNO183,209,211,213)，其以10:1的E:T比率使用MKN-45或LS-174T肿瘤靶细胞和人PBMC效应细胞和温育时间28小时进行。如图65中显示的，“1+1IgG Crossfab LC融合”构建体诱导MKN-45靶细胞凋亡，计算出的EC50为213pM，而在LS-174T细胞的情况中，计算出的EC50为1.56nM，这显示了不同肿瘤抗原表达水平在某个时间段内对双特异性构建体的效力的影响。

在又一个实验中，将“1+1IgG Crossfab LC融合”构建体(SEQ ID NO183,209,211,213)与非靶向性“2+1IgG Crossfab”分子比较。使用MC38-huCEA肿瘤细胞和人PBMC(E:T比率=10:1)和24小时的温育时间。如图66中显示的，“1+1IgG Crossfab LC融合”构建体以浓度依赖性方式诱导靶细胞的凋亡，计算出的EC50值为约3.2nM。相比之下，非靶向性“2+1IgGCrossfab”仅在最高浓度显示对靶细胞的抗原依赖性T细胞介导的杀伤。

在最后一项实验中，比较“2+1IgG Crossfab(V9)”(SEQ ID NO3,5,29,33)、“2+1IgG Crossfab，倒转(V9)”(SEQ ID NO5,23,183,187)、“2+1IgG Crossfab(抗CD3)”(SEQID NO5,23,215,217)、“2+1IgG Crossfab，倒转(抗CD3)”(SEQ ID NO5,23,215,219)，其使用人MCSP阳性MV-3或WM266-4肿瘤细胞和人PBMC(E:T比率=10:1)，和约24小时的温育时间进行。如图67中绘出的，对于两种CD3结合剂，“2+1IgG Crossfab，倒转”构建体的T细胞介导的杀伤似乎比由“2+1IgG Crossfabt”构建体诱导的杀伤稍强或至少相等。计算出的EC50值如下：

实施例7:CD107a/b测定法

通过流式细胞术对纯化的都靶向人MCSP和人CD3的“2+1IgG scFab”构建体(SEQID NO5,17,19)和“(scFv)₂”分子测试其在存在或缺乏人MCSP表达肿瘤细胞的情况下上调CD107a和胞内穿孔蛋白水平的潜力。

简言之，在第1天，将每孔30000个Colo-38肿瘤靶细胞在圆底96孔板中分配，并以37℃、5%CO₂过夜温育以让其粘着。在第1天或第2天从血沉棕黄层分离原代人泛T细胞，如描述的。

在第2天，添加每孔15万个效应细胞以获得5:1的最终E:T比率。加入缀合有FITC的CD107a/b抗体以及不同的双特异性构建体和对照。将不同双特异性分子和抗体调整至相同的摩尔浓度以获得9.43nM的终浓度。在37℃、5%CO₂的1h温育步骤之后，添加莫能菌素以抑制分泌以及还中和内体和溶酶体内的pH。在再5h的温育时间后，将细胞针对表面CD8表达在4℃染色30min。将细胞用染色缓冲液(PBS/0.1%BSA)清洗，固定并透化20min，其使用具有BD高尔基停止(Golgi Stop)的BD Cytofix/Cytoperm Plus试剂盒(BD Biosciences #554715)进行。将细胞用1倍BD Perm/Wash缓冲液清洗2次，并在4℃进行针对穿孔蛋白的胞内染色达30分钟。在使用1x BD Perm/清洗缓冲液的最终清洗步骤后，将细胞重悬于PBS/0.1%BSA中并在FACS CantoII上分析(所有抗体均购自BD Biosciences或BioLegend)。

对所有CD107a/b阳性、穿孔蛋白阳性或双重阳性细胞设置门，如指示的(图43)。“2+1IgG scFab”构建体能活化T细胞并仅在存在靶细胞的情况下上调CD107a/b和胞内穿孔蛋白水平(图43A)，而“(scFv)₂”分子在缺乏靶细胞的情况下也显示(微弱的)T细胞活化诱导(图43B)。二价参照抗CD3IgG比“(scFv)₂”分子或其他双特异性构建体产生更低的活化水平。

实施例8:增殖测定法

通过流式细胞术对纯化的靶向人MCSP和人CD3的“2+1IgG scFab”(SEQ ID NO5,17,19)和“(scFv)₂”分子测试其在存在或缺乏人MCSP表达肿瘤细胞的情况下诱导CD8⁺或CD4⁺T细胞增殖的潜力。

简言之，将新鲜分离的人泛T细胞调整至在温PBS中每ml100万个细胞，并在室温用1μM CFSE染色10分钟。通过加入含有10%FCS和1%GlutaMax的RPMI1640培养基将染色体积加倍。在室温再温育20分钟后，将细胞用预热的培养基清洗3次以除去剩余CFSE。用细胞解离缓冲液收获MCSP阳性Colo-38细胞，计数并检查存活性。将细胞在AIM-V培养基中调整至每ml0.2x10⁶个(活)细胞，将每孔100μl此细胞悬液移液到圆底96孔板中(如指示的)。将50μl(稀释)双特异性构建体添加到含细胞的孔以获得1nM的终浓度。将经CFSE染色的人泛T效应细胞在AIM-V培养基中调整至每ml2x10⁶个(活)细胞。对测定板(见上文)的每孔添加50μl此细胞悬液以获得5:1的最终E:T比率。为了分析双特异性构建体是否仅能在存在表达肿瘤抗原huMCSP的靶细胞的情况下活化T细胞，纳入含有1nM相应双特异性分子以及PBMC但无靶细胞的孔。在37℃、5%CO₂温育5天后，将细胞离心(5min,350x g)并用150μl/孔含0.1%BSA的PBS清洗2次。针对CD8(小鼠IgG1，κ；克隆HIT8a；BD#555635)、CD4(小鼠IgG1，κ；克隆RPA-T4；BD#560649)、或CD25(小鼠IgG1，κ；克隆M-A251；BD#555434)的表面染色依照供应商建议在4℃进行30分钟。将细胞用150μl/孔含0.1%BSA的PBS清洗2次，重悬于200μl/孔具有0.1%BSA的PBS，并使用FACS CantoII仪(Software FACS Diva)分析。相对增殖水平通过围绕非增殖细胞设门并使用该门的细胞数相对于总测量细胞数作为参照来确定。

图44显示与“(scFv)₂”分子相当，所有构建体均仅在存在靶细胞的情况下诱导CD8⁺T细胞(A)或CD4⁺T细胞(B)的增殖。一般而言，活化的CD8⁺T细胞在此测定法中比活化的CD4⁺T细胞增殖更多。

实施例9:细胞因子释放测定法

对纯化的都靶向人MCSP和人CD3的“2+1IgG scFab”构建体(SEQ ID NO5,17,19)和“(scFv)₂”分子分析其在存在或缺乏肿瘤靶细胞的情况下诱导T细胞介导的细胞因子从头分泌的能力。

简言之，自血沉棕黄层分离人PBMC，并对每孔将30万个细胞分配入圆底96孔板中。添加表达MCSP的人Colo-38肿瘤靶细胞以获得10:1的最终E:T比率。以1nM的终浓度添加双特异性构建体和IgG对照，并将细胞在37℃、5%CO₂温育24h。次日，将细胞以350x g离心5min并将上清液转移至新的深孔96孔板中用于后续分析。使用人Th1/Th2细胞因子试剂盒II(BD#551809)依照制造商对FACS CantoII的说明书进行CBA分析。

图45显示在上清液中测量的不同细胞因子的水平。在存在靶细胞的情况下，在T细胞活化后分泌的主要细胞因子是IFN-γ。“(scFv)₂”分子比“2+1IgGscFab”构建体诱导稍高的IFN-γ水平。对于人TNF可以发现相同的趋势，但该细胞因子的总体水平比IFN-γ低得多。在存在(或缺乏)靶细胞的情况下活化T细胞后没有显著的Th2细胞因子(IL-10和IL-4)分泌。在缺乏Colo-38靶细胞的情况下，仅观察到非常弱的TNF分泌诱导，其在用“(scFv)₂”分子处理的样品中最高。

在第二项实验中，分析纯化的下列靶向人MCSP和人CD3的双特异性构建体：“2+1IgG Crossfab”构建体(SEQ ID NO3,5,29,33)、“(scFv)₂”分子以及包含野生型或突变(LALA、P329G和/或N297D，如指示的)Fc域的不同“2+1IgG scFab”分子。简言之，将来自健康供体的280μl全血对深孔96孔板的每孔分配。将30000个表达人MCSP的Colo-38肿瘤靶细胞以及不同的双特异性构建体和IgG对照以1nM最终浓度添加。将细胞在37℃、5%CO₂温育24h，然后将细胞以350x g离心5min。将上清液转移至新的深孔96孔板中用于后续分析。使用下列CBA Flex Set的组合依照制造商对FACS CantoII的说明书进行CBA分析：人粒酶B(BD#560304)、人IFN-γFlex Set(BD#558269)、人TNF Flex Set(BD#558273)、人IL-10Flex Set(BD#558274)、人IL-6Flex Set(BD #558276)、人IL-4Flex Set(BD#558272)、人IL-2FlexSet(BD#558270)。

图46显示在上清液中测量的不同细胞因子的水平。在存在Colo-38肿瘤细胞的情况下分泌的主要细胞因子是IL-6，其次是IFN-γ。另外，粒酶B的水平在存在靶细胞的情况下活化T细胞后也强烈升高。一般而言，“(scFv)₂”分子在存在靶细胞的情况下诱导较高的细胞因子分泌水平(图46，A和B)。在存在(或缺乏)靶细胞的情况下活化T细胞后没有显著的Th2细胞因子(IL-10和IL-4)分泌。

在此测定法中，存在由不同“2+1IgG scFab”构建体诱导的IFN-γ的较弱分泌，即使在缺乏靶细胞的情况下(图46，C和D)。在这些条件下，在具有野生型或突变Fc域的“2+1IgG scFab”构建体之间未能观察到显著差异。

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尽管为了理解清楚已通过例示和实施例相当详细地描述了前述发明，但该描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容均通过提述完整明确收录。

Claims (25)

1.一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其基本上由第一抗原结合模块、第二抗原结合模块、第三抗原结合模块、由能够稳定联合的第一亚基和第二亚基构成的Fc域、及任选的一个或多个肽接头组成，其中

(i)所述第一抗原结合模块是能够特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子，而所述第二抗原结合模块和所述第三抗原结合模块各自是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子；

(ii)所述第一抗原结合模块是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区任一是交换的，使得交换Fab分子包含由轻链可变区和重链恒定区构成的肽链和由重链可变区和轻链恒定区构成的肽链；且

(iii)所述第二抗原结合模块和所述第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至所述Fc域的亚基之一的N端，且所述第一抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述第二抗原结合模块的Fab重链的N端，或

所述第一抗原结合模块和所述第三抗原结合模块各自在Fab重链的C端融合至所述Fc域的亚基之一的N端，且所述第二抗原结合模块在Fab重链的C端融合至所述第一抗原结合模块的Fab重链的N端。

2.权利要求1的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述Fc域是IgG Fc域。

3.权利要求2的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述Fc域是IgG₁Fc域或IgG₄Fc域。

4.前述权利要求中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述Fc域是人Fc域。

5.前述权利要求中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述Fc域包含促进所述Fc域的第一亚基和第二亚基联合的修饰。

6.权利要求5的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中在所述Fc域的第一亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3域内生成可安置于第二亚基的CH3域内的空穴中的隆起，且在所述Fc域的第二亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3域内生成可安置第一亚基的CH3域内的隆起的空穴。

7.前述权利要求中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中相比于天然IgG1Fc域，所述Fc域展现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。

8.前述权利要求中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述Fc域包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸取代。

9.权利要求8的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述一处或多处氨基酸取代在选自下组的一个或多个位置处：依照EU编号方式的L234、L235和P329。

10.权利要求9的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述Fc域的每个亚基包含三处降低对活化性Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为依照EU编号方式的L234A、L235A和P329G。

11.权利要求7至10中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述Fc受体是Fcγ受体。

12.权利要求7至10中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述效应器功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

13.前述权利要求中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述活化性T细胞抗原是CD3。

14.前述权利要求中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述靶细胞抗原选自下组：黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、CD19、CD20、CD33、癌胚抗原(CEA)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。

15.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至14中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。

16.一种包含权利要求15的分离的多核苷酸的载体。

17.权利要求16的载体，其中所述载体是表达载体。

18.一种宿主细胞，其包含权利要求15的分离的多核苷酸或权利要求16或17的载体。

19.一种生成权利要求1至14中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，其包括以下步骤：

a)在适合于表达所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的条件下培养权利要求18的宿主细胞，并

b)回收所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子。

20.一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其由权利要求19的方法生成。

21.一种药物组合物，其包含权利要求1至14中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和药学可接受载体。

22.权利要求1至14中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其用于诱导靶细胞裂解。

23.权利要求1至14中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子制备用于治疗有此需要的个体中疾病的药物的用途。

24.权利要求23的用途，其中所述疾病是癌症。

25.权利要求1至14中任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子制备用于诱导靶细胞裂解的药物的用途，其中在存在T细胞的情况下使靶细胞与所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子接触。