HK1191673B - Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof - Google Patents

Claims (23)

1. Autoaktivierendes Proelastaseprotein, umfassend (i) eine Propeptidsequenz, welche eine Elastaseaktivierungspeptidsequenz umfasst, die Aminosäuren, bezeichnet mit P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1, von denen die Aminosäuren P3-P2-P1 technisch verändert sind, um eine Elastaseerkennungssequenz zu bilden, umfasst, in funktionsfähiger Verknüpfung mit (ii) einer Aminosäuresequenz einer reifen Typ I-Elastase, deren drei N-terminale Aminosäuren mit P1'-P2'-P3' bezeichnet sind, wobei

   (a) die Propeptidsequenz für die reife Typ I-Elastase nicht nativ ist, und

   (b) wenn sie Autoaktivierungsbedingungen unterworfen wird, eine reife Typ I-Elastase produziert wird.
2. Autoaktivierendes Proelastaseprotein gemäß Anspruch 1, worin:

   (a) die Elastaseerkennungssequenz einen an Position P2 liegenden Prolinrest aufweist;

   (b) die Aminosäuren P3 bis P1 aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 oder SEQ ID NO: 93 bestehen;

   (c) die Aminosäuren P5 bis P3' aus den Aminosäuren von SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 oder SEQ ID NO: 60 bestehen; oder

   (d) die Aminosäuren P10 bis P1 aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 oder SEQ ID NO: 80 bestehen.
3. Autoaktivierendes Proelastaseprotein gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei:

   (a) das autoaktivierende Proelastaseprotein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 66 oder SEQ ID NO: 68 umfasst;

   (b) die reife Typ I-Elastase eine reife humane Typ I-Elastase ist, welche optional eine Aminosäuresequenz umfasst, die aufweist:

   (i) wenigstens 85% Sequenzidentität, wenigstens 95% Sequenzidentität, wenigstens 98% Sequenzidentität, wenigstens 99% Sequenzidentität oder 100% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 78 oder SEQ ID NO: 84; oder

   (ii) nicht mehr als 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 konservative Aminosäuresubstitution(en) im Vergleich zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 84 und/oder nicht mehr als 5, 4, 3, 2 oder 1 nicht-konservative Aminosäuresubstitution(en) im Vergleich zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 78 oder SEQ ID NO: 84; oder

   (c) die reife Typ I-Elastase eine reife porcine Typ I-Elastase ist, welche optional eine Aminosäuresequenz umfasst, die aufweist:

   (i) wenigstens 85% Sequenzidentität, wenigstens 95% Sequenzidentität, wenigstens 98% Sequenzidentität, wenigstens 99% Sequenzidentität oder 100% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 39; oder

   (ii) nicht mehr als 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 konservative Aminosäuresubstitution(en) im Vergleich zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 39 und/oder nicht mehr als 5, 4, 3, 2 oder 1 nicht-konservative Aminosäuresubstitution(en) im Vergleich zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 39.
4. Autoaktivierendes Proelastaseprotein gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, welche(s,m):

   (a) eine Signalsequenz fehlt;

   (b) eine Signalsequenz umfasst, die optional:

   (i) eine Signalsequenz ist, die in Pichia pastoris funktionsfähig ist, die optional eine Hefe-α-Faktor-Signalsequenz ist und/oder die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 34 umfasst; oder

   (ii) eine Säugetier-Sekretionssignalsequenz ist, die optional eine humane Typ 1-Elastasesignalsequenz oder eine porcine Typ 1-Elastasesignalsequenz ist;

   (c) ein Hefe-Alphafaktor-Polypeptid umfasst;

   (d) eine oder mehrere Spacer-Sequenzen umfasst, wobei optional wenigstens eine Spacer-Sequenz eine Kex2-Sequenz und/oder eine STE13-Sequenz ist;

   (e) ein N-terminaler Methioninrest fehlt; oder

   (f) einen N-terminalen Methioninrest umfasst.
5. Zellkulturüberstand, welcher das autoaktivierende Typ I-Pankreas-Proelastaseprotein gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
6. Nukleinsäuremolekül, welches das autoaktivierende Proelastaseprotein gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
7. Vektor, welcher das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 6 umfasst, wobei optional:

   (a) die das autoaktivierende Proelastaseprotein codierende Sequenz multimerisiert ist;

   (b) die das autoaktivierende Proelastaseprotein codierende Sequenz Codons verwendet, die vorzugsweise in Pichia pastoris verwendet werden; oder

   (c) der Vektor ein selektierbares Markergen für Zeocin-Resistenz umfasst.
8. Wirtszelle, welche:

   (a) gentechnisch verändert ist, um das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 6 zu exprimieren, wobei optional:

   (i) eine Kopie der Nukleinsäure in das Wirtszellgenom integriert ist; oder

   (ii) mehr als eine Kopie der Nukleinsäure in das Wirtszellgenom integriert ist, wobei optional 2-5 Kopien, 2 Kopien oder 3 Kopien der Nukleinsäure in das Wirtszellgenom integriert sind;

   oder

   (b) den Vektor gemäß Anspruch 7 umfasst, wobei optional:

   (i) eine Kopie des Vektors in das Wirtszellgenom integriert ist; oder

   (ii) mehr als eine Kopie des Vektors in das Wirtszellgenom integriert ist, wobei optional 2-5 Kopien, 2 Kopien oder 3 Kopien des Vektors in das Wirtszellgenom integriert sind.
9. Wirtszelle gemäß Anspruch 8, wobei die Expression des autoaktivierenden Proelastaseproteins unter der Kontrolle eines Methanol-induzierbaren Promotors ist und/oder wobei die Wirtszelle eine Pichia pastoris-Wirtszelle ist.
10. Verfahren zum Produzieren eines autoaktivierenden Proelastaseproteins, welches das Kultivieren der Wirtszelle gemäß Anspruch 8 oder Anspruch 9 unter Bedingungen, die zur Produktion des autoaktivierenden Proelastaseproteins führen, und das Gewinnen des autoaktivierenden Proelastaseproteins umfasst, wobei optional:

    (a) die Wirtszelle in komplexem Medium kultiviert wird, welches optional gepuffertes Methanol-komplexes Medium oder gepuffertes Glycerol-komplexes Medium ist; und/oder

    (b) die Expression des autoaktivierenden Proelastaseproteins unter der Kontrolle eines Methanol-induzierbaren Promotors ist und wobei die Kulturbedingungen eine Zeitdauer der Methanolinduzierung einschließen; und/oder

    (c) die Wirtszelle in Gegenwart einer Citrat-, Succinat- oder Acetatverbindung kultiviert wird, wobei optional:

    (i) die Citrat-, Succinat- oder Acetatverbindung Natriumcitrat, Natriumsuccinat bzw. Natriumacetat ist; und/oder

    (ii) wenigstens eine Citrat-, Succinat- oder Acetatverbindung in der Kultur in einer Konzentration von 5-50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 mM, 50-200 mM, 100-150 mM, 75-125 mM oder 90-110 mM vorliegt; und/oder

    (d) die Wirtszelle eine Pichia pastoris-Wirtszelle ist und wobei die Kulturbedingungen eine Zeitdauer von Wachstum oder Induzierung einschließen:

    (i) bei einer Temperatur von 22-28°C; oder

    (ii) bei einem pH-Wert von 2-6; und/oder

    (e) die Wirtszelle in komplexem Medium kultiviert wird und der Schritt des Gewinnens des autoaktivierenden Proelastaseproteins das Gewinnen von Überstand aus der Wirtszellkultur umfasst und optional weiterhin das Gewinnen des autoaktivierenden Proelastaseproteins aus dem Überstand umfasst.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, welches weiterhin das Unterwerfen des gewonnenen autoaktivierenden Proelastaseproteins an Aktivierungsbedingungen umfasst, so dass das reife Typ I-Elastaseprotein produziert wird, wobei optional:

    (a) die Aktivierungsbedingungen das Einstellen des pH-Wertes einer Lösung, die das autoaktivierende Proelastaseprotein enthält, auf einen basischen pH-Wert, einen pH-Wert von 7-9 oder einen pH-Wert von 8, bis ein reifes Typ I-Elastaseprotein produziert wird, umfassen, und optional:

    (i) Aufrechterhalten des pH-Wertes für eine Zeitdauer von 0,5-8 Stunden, 2-7 Stunden oder 6 Stunden;

    (ii) die Exposition an einen basischen pH-Wert bei einer Temperatur von 22°C-28°C oder einer Temperatur von 26°C durchgeführt wird; und/oder

    (iii) die Konzentration des gewonnenen autoaktivierenden Proelastaseproteins in der Lösung weniger als 10 mg/ml, weniger als 5 mg/ml, weniger als 2 mg/ml, weniger als 1 mg/ml, weniger als 0,5 mg/ml, weniger als 0,25 mg/ml und/oder wenigstens 0,1 mg/ml oder wenigstens 0,2 mg/ml beträgt; und/oder

    (b) die Aktivierungsbedingungen die Zugabe einer katalytischen Menge an Elastase zu der Lösung, die das autoaktivierende Proelastaseprotein enthält, umfassen; und/oder

    (c) die Autoaktivierung in der Gegenwart von Tris-Base bei einer Konzentration von 50-200 mM, 75-175 mM, 100-150 mM, 75-125 mM durchgeführt wird; und/oder

    (d) die Aktivierungsbedingungen aufrechterhalten werden, bis N-terminale Varianten auf einen Bereich von 0-2% reduziert wurden.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei:

    (a) der Autoaktivierungsschritt nach der Aufreinigung des autoaktivierenden Proelastaseproteins durchgeführt wird; oder

    (b) der Autoaktivierungsschritt in dem Überstand durchgeführt wird.
13. Verfahren gemäß Anspruch 11 oder Anspruch 12, welches weiterhin den Schritt des Isolierens des reifen Typ I-Elastaseproteins umfasst, wobei optional:

    (a) das reife Typ I-Elastaseprotein durch Säulenchromatographie isoliert wird, wobei optional die Chromatographie Kationenaustauschchromatographie einschließt; und/oder

    (b) glycosylierte Formen des reifen Typ I-Elastaseproteins entfernt werden.
14. Verfahren zum Produzieren einer Formulierung von reifem Typ I-Elastaseprotein, wobei das Verfahren umfasst:

    (a) Unterwerfen des autoaktivierenden Proelastaseproteins gemäß irgendeinem der Ansprüche

    1 bis 4 an autoaktivierende Bedingungen, so dass ein reifes Typ I-Elastaseprotein produziert wird;

    (b) optional Aufreinigen der reifen Typ I-Elastase; und

    (c) Formulieren des reifen Typ I-Elastaseproteins;

    dadurch Produzieren einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die das reife Typ I-Elastaseprotein umfasst.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, welches das Aufreinigen der reifen Typ I-Elastase durch Säulenchromatographie, optional Kationenaustauschchromatographie, umfasst.
16. Verfahren gemäß Anspruch 14 oder Anspruch 15, wobei das Formulieren des reifen Typ I-Elastaseproteins das Lyophilisieren der reifen Typ I-Elastase umfasst und optional weiterhin das Mischen des reifen Typ I-Elastaseproteins mit einem oder mehreren Puffer-Inhaltsstoffen vor oder nach der Lyophilisierung umfasst.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche:

    (a) ein reifes Typ I-Elastaseprotein umfasst, das eine Aktivität von 20 bis 50 U/mg Protein, quantifiziert unter Verwendung eines kolorimetrischen N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-pNitroanilid- (SLAP-) Hydrolyseassays, aufweist, wobei die Obergrenze von Trypsin in der pharmazeutischen Zusammensetzung weniger als 25 ng Trypsin pro 1 mg reifes Typ I-Elastaseprotein beträgt, und wobei:

    (i) die reife Typ I-Elastase eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85% Sequenzidentität, wenigstens 95% Sequenzidentität, wenigstens 98% Sequenzidentität oder wenigstens 99% Sequenzidentität umfasst oder 100% Sequenzidentität umfasst, zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 78 oder SEQ ID NO: 84; oder

    (ii) das reife Typ I-Elastaseprotein eine Aminosäuresequenz umfasst, die nicht mehr als 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 konservative Aminosäuresubstitution(en) und/oder nicht mehr als 5, 4, 3, 2 oder 1 nicht-konservative Aminosäuresubstitution(en) im Vergleich zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 78 oder SEQ ID NO: 84 aufweist; oder

    (b) ein reifes Typ I-Elastaseprotein umfasst, das eine Aktivität von 20 bis 100 U/mg Protein, quantifiziert unter Verwendung eines kolorimetrischen N-Succinyl-Ala-Ala-AlapNitroanilid- (SLAP-) Hydrolyseassays, aufweist, wobei die Obergrenze von Trypsin in der pharmazeutischen Zusammensetzung weniger als 25 ng Trypsin pro 1 mg reifes Typ I-Elastaseprotein beträgt und wobei optional:

    (i) die reife Typ I-Elastase eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85% Sequenzidentität, wenigstens 95% Sequenzidentität, wenigstens 98% Sequenzidentität oder wenigstens 99% Sequenzidentität umfasst oder 100% Sequenzidentität umfasst, zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 39; oder

    (ii) das reife Typ I-Elastaseprotein eine Aminosäuresequenz umfasst, die nicht mehr als 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 konservative Aminosäuresubstitution(en) und/oder nicht mehr als 5, 4, 3, 2 oder 1 nicht-konservative Aminosäuresubstitution(en) im Vergleich zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 39 aufweist.
18. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei:

    (a) die Obergrenze von Trypsin in der Zusammensetzung weniger als 4, 3, 2 oder 1,56 ng pro 1 mg reifes Typ I-Elastaseprotein beträgt, wobei optional die Obergrenze von Trypsinaktivität in der Zusammensetzung unter Verwendung eines N-Benzoyl-Phe-Val-Arg-pNitroanilid- (BENZ-) kolorimetrischen Trypsinaktivitätsassays quantifiziert wird;

    (b) die pharmazeutische Zusammensetzung frei von Trypsin ist; und/oder

    (c) die pharmazeutische Zusammensetzung durch eines oder mehrere der folgenden gekennzeichnet ist:

    (i) die pharmazeutische Zusammensetzung frei von bakteriellen Proteinen ist;

    (ii) die pharmazeutische Zusammensetzung frei von anderen Säugetierproteinen als dem reifen Elastaseprotein ist;

    (iii) die Menge an Endotoxin in der pharmazeutischen Zusammensetzung eine pharmazeutisch akzeptable Menge nicht überschreitet, nicht 10 EU pro Gramm Typ I-Elastase überschreitet oder nicht 5 EU pro Gramm Typ I-Elastase überschreitet;

    (iv) die pharmazeutische Zusammensetzung in Form einer Einheitsdosis ist, die 0,0033 mg-200 mg des reifen Elastaseproteins umfasst;

    (v) die pharmazeutische Zusammensetzung Polysorbat-80 umfasst;

    (vi) die pharmazeutische Zusammensetzung Dextran umfasst;

    (vii) die pharmazeutische Zusammensetzung Natriumionen, Kaliumionen, Phosphationen, Chloridionen und Polysorbat 80 umfasst;

    (viii) die pharmazeutische Zusammensetzung Natriumionen, Kaliumionen, Phosphationen, Chloridionen und Dextran umfasst;

    (ix) die pharmazeutische Zusammensetzung Natriumionen, Kaliumionen, Phosphationen, Chloridionen, Polysorbat-80 und Dextran umfasst;

    (x) die pharmazeutische Zusammensetzung Trehalose umfasst;

    (xi) die pharmazeutische Zusammensetzung Mannitol umfasst;

    (xii) das reife Elastaseprotein in der pharmazeutischen Zusammensetzung nach wenigstens einem Monat der Lagerung bei 4°C, nach wenigstens drei Monaten der Lagerung bei 4°C oder nach wenigstens sechs Monaten der Lagerung bei 4°C 60% bis 100% seiner spezifischen Aktivität aufrechterhält.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 17(a), welche:

    (a) weniger als 0,5 Gewichts-% eines Proteins, bestehend aus SEQ ID NO: 2, und/oder weniger als 0,5 Gewichts-% eines Proteins, bestehend aus SEQ ID NO: 3, enthält und optional frei oder im Wesentlichen frei von einem Protein von SEQ ID NO: 2 und von einem Protein, bestehend aus SEQ ID NO: 3, ist; und/oder

    (b) frei oder im Wesentlichen frei von irgendeinem Protein, bestehend aus SEQ ID NOs: 70 und 71, ist; und optional

    (c) frei oder im Wesentlichen frei von einem oder mehreren Proteinen, bestehend aus irgendeiner von SEQ ID NO: 37, 38, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107 und 108, bevorzugt frei oder im Wesentlichen frei von irgendeinem Protein, bestehend aus irgendeiner von SEQ ID NO: 37, 38, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107 oder 108, ist.
20. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 17 bis 19, welche eine lyophilisierte pharmazeutische Zusammensetzung ist.
21. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 17 bis 19, welche ein flüssige pharmazeutische Zusammensetzung ist, und optional:

    (a) Natriumchlorid umfasst;

    (b) phosphatgepufferte Kochsalzlösung umfasst;

    (c) einen Phosphatpuffer umfasst;

    (d) Mannitol in einer Konzentration von 2-10 Gewichts-% pro Volumen oder 2,5-4 Gewichts-% pro Volumen umfasst;

    (e) Polysorbat-80 in einer Konzentration von 0,001-5 Gewichts-% pro Volumen oder 0,01 Gewichts-% pro Volumen umfasst;

    (f) eine Osmolalität von 125-500 mOsm/kg oder 275-325 mOsm/kg hat; oder

    (g) eine Konzentration von reifer Typ I-Elastase von 0,1 mg/ml-50 mg/ml hat.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 21, welche:

    (a) 137 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumphosphat, 10 mM Natriumphosphat umfasst, einen pH-Wert von 7,4 hat, wobei optional:

    (i) die pharmazeutische Zusammensetzung 0,01% Polysorbat-80 umfasst und wobei optional die Konzentration von reifem Typ I-Elastaseprotein in der pharmazeutischen Zusammensetzung 0,001-50 mg/ml beträgt;

    (ii) die Konzentration von reifem Typ I-Elastaseprotein in der pharmazeutischen Zusammensetzung 0,001-50 mg/ml beträgt und die pharmazeutische Zusammensetzung 5-10% oder 6-9% eines Hilfsstoffs, ausgewählt aus Dextrose, Lactose, Mannitol, Saccharose, Trehalose, Dextran-70, Glycerin, Arginin, Glycin, Dextran-44 oder Dextran-18, umfasst; oder

    (iii) die Konzentration von reifem Typ I-Elastaseprotein in der pharmazeutischen Zusammensetzung 0,001-50 mg/ml beträgt und die Zusammensetzung weiterhin 8% Dextran-18 und optional 0,1% Polysorbat-80 umfasst; oder

    (b) eines oder mehrere von Dextrose, Lactose, Mannitol, Saccharose, Trehalose, Dextran-70, Glycerin, Arginin, Glycin, Dextran-44 und Dextran-18 in einer Aggregatkonzentration von 2-10% w/v, 2,5-8% w/v oder 4-6% w/v umfasst.
23. Pharmazeutische Zusammensetzung, wie in irgendeinem der Ansprüche 17 bis 22 definiert, zur Verwendung in einem Verfahren zur:

    (a) Behandlung oder Prävention einer Erkrankung biologischer Kanäle durch Verabreichen der pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten, welcher derer bedarf, wobei optional:

    (i) die pharmazeutische Zusammensetzung parenteral verabreicht wird;

    (ii) die pharmazeutische Zusammensetzung direkt an eine Blutgefäßwand verabreicht wird;

    (iii) die pharmazeutische Zusammensetzung direkt an die äußere Adventitiaoberfläche eines chirurgisch freigelegten Gefäßes verabreicht wird; oder

    (iv) die pharmazeutische Zusammensetzung unter Verwendung eines Arzneimittelzuführungskatheters an eine Gefäßwand verabreicht wird;

    (b) therapeutischen Steigerung des Durchmessers einer Arterie oder Vene in einem menschlichen Subjekt, welches derer bedarf, durch lokales Verabreichen der pharmazeutischen Zusammensetzung an die Wand der Arterie oder Vene in dem menschlichen Subjekt;

    (c) Prävention von Vasospasmus einer Arterie oder Vene in einem menschlichen Subjekt, welches derer bedarf, durch lokales Verabreichen der pharmazeutischen Zusammensetzung an die Wand der Arterie oder Vene in dem menschlichen Subjekt;

    (d) Behandlung einer verstopften Arterie oder Vene in einem menschlichen Subjekt, welches einer solchen Behandlung bedarf, durch lokales Verabreichen der pharmazeutischen Zusammensetzung an die Wand der Arterie oder Vene in dem menschlichen Subjekt, wobei die Zusammensetzung zur Proteolyse von Elastin in der Wand der Arterie oder Vene führt, was zur Vergrößerung des Durchmessers der Arterie oder Vene führt;

    (e) Behandlung einer Arterie oder Vene, die mit einem arteriovenösen Hämodialyse-Transplantat oder einer arteriovenösen Fistel in einem menschlichen Subjekt, welches einer solchen Behandlung bedarf, verbunden ist, durch lokales Verabreichen der pharmazeutischen Zusammensetzung an die Wand der Arterie oder Vene in dem menschlichen Subjekt, wobei die Verabreichung zur Proteolyse von Elastin in der Wand der Arterie oder Vene führt, was zur Vergrößerung des Durchmessers der Arterie oder Vene führt; oder

    (f) Behandlung einer Vene in einem menschlichen Subjekt zur Verwendung in der Hämodialyse durch lokales Verabreichen der pharmazeutischen Zusammensetzung an die Wand der Vene in dem menschlichen Subjekt, wobei die Verabreichung zur Proteolyse von Elastin in der Wand der Vene führt, was zur Vergrößerung des Durchmessers der Vene führt.